JP2008022762A - Method, program and apparatus for evaluating high throughput function - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、高スループット機能性評価方法、プログラム、及び装置、特に、培養細胞系、食材成分系、バイオマーカーのごとき揺らぎの大きい生物系データを扱って、被検試料の生理活性機能を一度に評価する高スループット機能性評価方法、プログラム、及び装置に関するものである。 The present invention deals with high-throughput functionality evaluation methods, programs, and apparatuses, in particular, biological data with large fluctuations such as cultured cell systems, food ingredient systems, and biomarkers. The present invention relates to a high throughput functionality evaluation method, program, and apparatus to be evaluated.
高スループット機能性評価方法としては、すでに種々の提案がなされている。例えば、特許文献１は、生物系における改善された特性を有する化合物の組み合わせを系統的に選択する高スループットスクリーニング方法を開示している。特許文献２は、生物学的または化学的アッセイの同時実施に有用な高スループットアッセイシステムを開示している。特許文献３は、共通成分である医薬の性質と、追加成分である賦形剤の性質との観点から評価し、最適組み合わせを選択する高ハイスループット試験を開示している。特許文献４は、既知物質の遺伝子または蛋白質発現プロフィールと、未知物質の同プロフィールを比較して、未知物質の「毒性」を予測する方法を開示している。特許文献５は、既知物質の細胞によるバイオマーカー測定値と、被検物質のバイオマーカー測定値を比較して、被検物質の老化関連疾患や早期発現被検物質あるいは遺伝子を同定する方法を開示している。
しかしながら、特許文献１〜３の機能性評価方法は、基本的に被検試料の成分別、機能別個別試験方法に関するものである。個別評価系では、多成分を含む食材の多岐にわたる機能性を総合的に評価することは困難である。殊に、同一条件で同時に測定された個別データでないかぎり、個々の異なる測定データを集めても、信頼性の高い複合的機能、それらの相互作用の予測は不可能に近い。食材の評価として、モデル動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験は広く行われているが、ヒトとモデル動物とでは蛋白質や酵素の働きが微妙に異なる。このため、モデル動物試験の結果をヒトにそのまま適用できるとは限らない。最終的にヒトによる臨床試験が必要であるにしても、食材の機能性スクリーニングの段階から、すべてにわたりヒト臨床試験を実施するのは、安全性、効率、費用の点から実際的ではない。 However, the functionality evaluation methods of Patent Documents 1 to 3 basically relate to individual test methods for each component and each function of a test sample. In the individual evaluation system, it is difficult to comprehensively evaluate the wide variety of functionalities of foods containing multiple components. In particular, unless it is individual data measured simultaneously under the same conditions, it is almost impossible to predict reliable and complex functions and their interaction even if individual different measurement data are collected. In vivo tests using model animals have been widely used for evaluating food ingredients, but the functions of proteins and enzymes are slightly different between humans and model animals. For this reason, the results of model animal tests are not always applicable to humans. Even though human clinical trials are ultimately required, it is not practical from the viewpoint of safety, efficiency, and cost to carry out human clinical trials from the stage of food functional screening.
特許文献４〜５は、機能性既知材料の測定値と機能性未知材料の測定値を直接照合し、機能性未知材料の機能性を推定する方法を開示しているが、機能性既知試料及び機能性未知試料の調製に、ヒト培養細胞系のごとき評価培養細胞を使用していない。またトレーニングセットとして、機能性既知試料の蛋白質発現測定値と既知または個別評価系による機能性既知材料の機能性値との対応付けがなされていない。特に、生物系評価システム固有の課題、例えば多量の実験データ取得の困難性、データの揺らぎ等を解決する手段が示されていない。
本発明は、前記問題点を解消したもので、小数の測定値からでも生物系評価システム固有の変動の少ない高スループット機能性評価方法を提供することを目的としている。 The present invention solves the above-described problems, and an object of the present invention is to provide a high-throughput functionality evaluation method with little variation inherent in a biological system evaluation system even from a small number of measurement values.
前記目的を解決した本発明の高スループット機能性評価方法、プログラム、及び装置は、下記の発明を含む。
[第１発明]
機能性未知材料の複合的な機能性を評価する方法であって、
（１）評価培養細胞に機能性既知材料を付与して、機能性既知試料を調製するステップと、
（２）機能性評価機能が異なる複数の測定部位を備えた評価系に、機能性既知試料を付与し、機能性既知試料のバイオマーカー発現量を測定するステップと、
（３）機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と、既知または個別評価系による機能性既知材料の機能性値とを対応付けるステップと、
（４）対応付けられたデータセットからブートストラップ法により分布を合成し、合成した分布に従う仮想データセットを作成するステップと、
（５）評価培養細胞に機能性未知材料を付与して、機能性未知試料を調製するステップと、
（６）機能性評価機能が異なる複数の測定部位を備えた評価系に、機能性未知試料を付与し、機能性未知試料のバイオマーカー発現量を測定するステップと、
（７）機能性未知試料のバイオマーカー発現量測定値と仮想データセットとを照合し、機能性未知材料の機能性値を推定するステップと、
（８）推定された機能性値に基づき、機能性未知材料の機能性を総合評価するステップと、
を含むことを特徴とする高スループット機能性評価方法。
The high-throughput functionality evaluation method, program, and apparatus of the present invention that solves the above object include the following inventions.
[First invention]
A method for evaluating the combined functionality of functionally unknown materials,
(1) providing a functionally known material to an evaluation cultured cell to prepare a functionally known sample;
(2) providing a functionally known sample to an evaluation system having a plurality of measurement sites having different functionality evaluation functions, and measuring the biomarker expression level of the functionally known sample;
(3) associating the measured value of the biomarker expression level of a sample with known functionality with the functionality value of a known functional material with a known or individual evaluation system;
(4) synthesizing a distribution from the associated data set by a bootstrap method, and creating a virtual data set according to the synthesized distribution;
(5) providing functional unknown material to the cultured cells for evaluation and preparing a functional unknown sample;
(6) providing a functional unknown sample to an evaluation system including a plurality of measurement sites having different functional evaluation functions, and measuring a biomarker expression level of the functional unknown sample;
(7) collating the biomarker expression level measurement value of the unknown functional sample with the virtual data set, and estimating the functional value of the unknown functional material;
(8) A step of comprehensively evaluating the functionality of the functionally unknown material based on the estimated functionality value;
A high-throughput functionality evaluation method comprising:
[第２発明]
評価培養細胞がヒト由来培養細胞であることを特徴とする前記第１発明記載の方法。
[Second invention]
The method according to the first invention, wherein the cultured cells for evaluation are human-derived cultured cells.
[第３発明]
ステップ（７）の推定をニューラルネットワーク法により行うことを特徴とする前記第１発明記載の方法。
[Third invention]
The method according to the first invention, wherein the estimation in step (7) is performed by a neural network method.
[第４発明]
計算機を用いて、機能性未知材料の複合的な機能性を評価するプログラムであって、
（１）評価培養細胞に機能性既知材料を付与して、機能性既知試料を調製するステップと、
（２）機能性評価機能が異なる複数の測定部位を備えた評価系に、機能性既知試料を付与し、機能性既知試料のバイオマーカー発現量を測定するステップと、
（３）機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と、既知または個別評価系による機能性既知材料の機能性値とを対応付けるステップと、
（４）対応付けられたデータセットからブートストラップ法により分布を合成し、合成した分布に従う仮想データセットを作成するステップと、
（５）評価培養細胞に機能性未知材料を付与して、機能性未知試料を調製するステップと、
（６）機能性評価機能が異なる複数の測定部位を備えた評価系に、機能性未知試料を付与し、機能性未知試料のバイオマーカー発現量を測定するステップと、
（７）機能性未知試料のバイオマーカー発現量測定値と仮想データセットとを照合し、機能性未知材料の機能性値を推定するステップと、
（８）推定された機能性値に基づき、機能性未知材料の機能性を総合評価するステップと
を含むことを特徴とする計算機上で作動する高スループット機能性評価プログラム。
[Fourth Invention]
A program that evaluates the composite functionality of functionally unknown materials using a computer,
(1) providing a functionally known material to an evaluation cultured cell to prepare a functionally known sample;
(2) providing a functionally known sample to an evaluation system having a plurality of measurement sites having different functionality evaluation functions, and measuring the biomarker expression level of the functionally known sample;
(3) associating the measured value of the biomarker expression level of a sample with known functionality with the functionality value of a known functional material with a known or individual evaluation system;
(4) synthesizing a distribution from the associated data set by a bootstrap method, and creating a virtual data set according to the synthesized distribution;
(5) providing functional unknown material to the cultured cells for evaluation and preparing a functional unknown sample;
(6) providing a functional unknown sample to an evaluation system including a plurality of measurement sites having different functional evaluation functions, and measuring a biomarker expression level of the functional unknown sample;
(7) collating the biomarker expression level measurement value of the unknown functional sample with the virtual data set, and estimating the functional value of the unknown functional material;
(8) A high-throughput functionality evaluation program operating on a computer, comprising the step of comprehensively evaluating the functionality of a functionally unknown material based on the estimated functionality value.
[第５発明]
計算機を用いて、機能性未知材料の複合的な機能性を評価する装置であって、
（１）評価培養細胞に機能性既知材料を付与して、機能性既知試料を調製する手段と、
（２）機能性評価機能が異なる複数の測定部位を備えた評価系に、機能性既知試料を付与し、機能性既知試料のバイオマーカー発現量を測定する手段と、
（３）機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と、既知または個別評価系による機能性既知材料の機能性値とを対応付ける手段と、
（４）対応付けられたデータセットからブートストラップ法により分布を合成し、合成した分布に従う仮想データセットを作成する手段と、
（５）評価培養細胞に機能性未知材料を付与して、機能性未知試料を調製する手段と、
（６）機能性評価機能が異なる複数の測定部位を備えた評価系に、機能性未知試料を付与し、機能性未知試料のバイオマーカー発現量を測定する手段と、
（７）機能性未知試料のバイオマーカー発現量測定値と仮想データセットとを照合し、機能性未知材料の機能性値を推定する手段と、
（８）推定された機能性値に基づき、機能性未知材料の機能性を総合評価する手段と、
を含むことを特徴とする高スループット機能性評価装置。
[Fifth invention]
An apparatus for evaluating the composite functionality of functionally unknown materials using a computer,
(1) A means for preparing a known functional sample by imparting a known functional material to an evaluation cultured cell;
(2) means for providing a functionally known sample to an evaluation system comprising a plurality of measurement sites having different functional evaluation functions, and measuring the biomarker expression level of the functionally known sample;
(3) means for associating the biomarker expression level measurement value of a known functional sample with the functionality value of a known functional material by a known or individual evaluation system;
(4) means for synthesizing distributions from the associated data sets by a bootstrap method and creating a virtual data set according to the synthesized distributions;
(5) a means for preparing a functional unknown sample by imparting a functional unknown material to the cultured cells for evaluation;
(6) a means for assigning a functional unknown sample to an evaluation system including a plurality of measurement sites having different functional evaluation functions, and measuring a biomarker expression level of the functional unknown sample;
(7) means for comparing the biomarker expression level measurement value of the unknown functional sample with the virtual data set, and estimating the functional value of the unknown functional material;
(8) means for comprehensively evaluating the functionality of the unknown functional material based on the estimated functionality value;
A high-throughput functionality evaluation apparatus comprising:
本明細書において、次の用語は下記の意味で用いる。
（１）機能性既知材料とは、何らかの方法で機能性が明らかになっている機能性材料であって、本発明の高スループット機能性評価方法に供し、対応付けモデルを作成するために使用する材料をいう。
（２）機能性既知試料とは、機能性既知材料を評価培養細胞に与えて調製したもので、バイオマーカーによる測定に供する試料をいう。
（３）機能性未知材料とは、本発明の高スループット機能性評価方法に供する機能性未知の材料をいう。
（４）機能性未知試料とは、機能性未知材料を評価培養細胞に与えて調製したもので、バイオマーカーによる測定に供する試料をいう。
（５）食材の機能性とは、食材の三次機能、すなわち体調調節機能を含む生理活性機能をいう。
（６）対応付けデータセットとは、機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と、既知または個別評価系で測定された機能性既知材料の機能性値とを対応付けたデータベースをいう。
（７）仮想データセットとは、対応付けデータセットをブートストラップ法により、バイオマーカー発現量測定値と機能性既知材料の機能性値とが従うであろう分布を推定して合成したデータベースをいう。
In this specification, the following terms are used with the following meanings.
(1) Functionally known material is a functional material whose functionality has been clarified by any method, and is used for creating a correspondence model for the high-throughput functionality evaluation method of the present invention. Say material.
(2) The functionally known sample is a sample prepared by giving a functionally known material to an evaluation cultured cell, and is used for measurement with a biomarker.
(3) Functionally unknown material refers to a material with unknown functionality that is used in the high-throughput functionality evaluation method of the present invention.
(4) The functional unknown sample is a sample prepared by giving functional unknown material to evaluation cultured cells, and is used for measurement with a biomarker.
(5) The functionality of the food means a tertiary function of the food, that is, a physiologically active function including a physical condition adjusting function.
(6) The association data set refers to a database in which biomarker expression level measurement values of known functional samples are associated with functionality values of known functional materials measured by known or individual evaluation systems.
(7) The virtual data set is a database obtained by synthesizing the correspondence data set by estimating the distribution that the biomarker expression level measurement value and the functional value of the known functional material will follow by the bootstrap method. .
本発明の高スループット機能性評価方法によれば、下記の利点がある。 The high throughput functionality evaluation method of the present invention has the following advantages.
（１）複数のバイオマーカーを用いて一度に試験することにより、被検材料が食材のごとき多成分系物質であっても、個々のバイオマーカーに対する応答性に加えて、被検材料の多機能を迅速かつ総合的に評価できる。例えば、抗酸化作用、抗変異原作用、アポトーシス誘導作用、ウイルス増殖抑制作用、がん細胞増殖抑制作用、免疫調節作用など、多項目の評価結果を組み合わせて、被検材料の機能性を総合評価できる。 (1) By testing multiple biomarkers at once, even if the test material is a multi-component substance such as food, in addition to the responsiveness to individual biomarkers, the multi-function of the test material Can be evaluated quickly and comprehensively. For example, comprehensive evaluation of the functionality of the test material by combining the evaluation results of multiple items such as antioxidant action, antimutagenic action, apoptosis inducing action, virus growth inhibitory action, cancer cell growth inhibitory action, immunomodulatory action, etc. it can.
（２）生物系の評価システムにおいて、少ない試験回数で信頼性の高い機能性推定値を得ることができる。 (2) In a biological evaluation system, a highly reliable functional estimation value can be obtained with a small number of tests.
（３）評価培養細胞としてヒト培養細胞を用いる場合は、動物実験によるｉｎ ｖｉｖｏ試験とは異なり、ヒトを対象にした臨床試験にもっとも近いかたちでの安全で効率的な機能性の評価が可能になる。 (3) When human cultured cells are used as evaluation cultured cells, unlike in vivo studies based on animal experiments, it is possible to evaluate safe and efficient functionality in the form closest to clinical studies targeting humans. Become.
次に図面を参照して、本発明の実施の形態を詳述する。図１は本発明の好適な高スループット機能性評価方法を示すフローシートである。図１において、本発明は、評価培養細胞の培養、食材、医薬品、医薬品候補物質などからなる被検材料の細胞への供与、細胞抽出物、細胞分泌物などからなる被検試料の調製、統合型イムノアッセイ、及び機能性評価の順で実施し、最後にデータベース中の機能性評価データセットと比較照合して、被検試料の機能性を総合評価する。本発明では、この機能性評価データセットに、機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と機能性既知材料の機能性値とを対応付けたデータセットをさらにブートストラップ法で合成した分布に従う仮想データセットを用いる。各ステップの順序は、必要に応じて可変である。 Next, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. FIG. 1 is a flow sheet showing a preferred high-throughput functionality evaluation method of the present invention. In FIG. 1, the present invention relates to the culture of evaluation cultured cells, the supply of test materials comprising foods, pharmaceuticals, drug candidates, etc. to the cells, the preparation and integration of test samples comprising cell extracts, cell secretions, etc. This is performed in the order of type immunoassay and functional evaluation, and finally compared with the functional evaluation data set in the database to comprehensively evaluate the functionality of the test sample. In the present invention, a hypothesis according to a distribution obtained by further combining a data set in which the measurement value of biomarker expression of a sample with known functionality and the functionality value of a material with known functionality are combined with this functionality evaluation data set by the bootstrap method. Use a data set. The order of each step is variable as needed.
図１に示す評価培養細胞の培養段階において、好ましく使用することのできる評価培養細胞としては、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＬ−６０細胞、ＭＯＬＴ−４細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ａ４３１細胞、Ｓ１Ｔ細胞、Ｓｕ９Ｔ０１細胞、ＨＵＴ１０１細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ−５細胞、Ｌｉ９０細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＨＭＥＣ細胞、ＨＴ１７細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＭＨ１３４細胞、ｄＲＬｈ−８４細胞、ＲＬＮ−１０細胞、ＰＣ１２細胞、３Ｙ１細胞などヒト、マウス、ラットなど哺乳動物由来細胞株、またはこれらの細胞株から派生する細胞株を挙げることができる。その中で、ヒト白血病由来細胞、ヒト肝がん由来細胞が特に望ましい。ヒト白血病由来細胞には、Ｓ１Ｔ細胞、Ｓｕ９Ｔ０１細胞、ＨＵＴ１０１細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＬ−６０細胞などを挙げることができる。ヒト肝がん由来細胞には、ＰＬＣ／ＰＲＦ−５細胞、Ｌｉ９０細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＨｅｐＧ２細胞などを挙げることができる。 In the culture stage of the evaluation cultured cells shown in FIG. 1, evaluation cultured cells that can be preferably used include Jurkat cells, HL-60 cells, MOLT-4 cells, Huh-7 cells, HepG2 cells, Hep3B cells, Caco- 2 cells, HeLa cells, MCF-7 cells, A431 cells, S1T cells, Su9T01 cells, HUT101 cells, PLC / PRF-5 cells, Li90 cells, HUVEC cells, HMEC cells, HT17 cells, NIH-3T3 cells, 3T3-L1 Examples include cells derived from mammals such as cells, MH134 cells, dRLh-84 cells, RLN-10 cells, PC12 cells, and 3Y1 cells, mammals such as mice, rats, and cell lines derived from these cell lines. Among them, human leukemia-derived cells and human liver cancer-derived cells are particularly desirable. Examples of human leukemia-derived cells include S1T cells, Su9T01 cells, HUT101 cells, Jurkat cells, and HL-60 cells. Examples of human liver cancer-derived cells include PLC / PRF-5 cells, Li90 cells, Huh-7 cells, and HepG2 cells.
培養条件としては、温度は３７℃または通常の哺乳動物細胞が生育する温度とし、炭酸ガス濃度は５％または通常の哺乳動物細胞が生育する濃度が好ましい。酸化されやすい成分の場合は培養における酸素濃度を低くすることが望まれる。 The culture conditions are preferably a temperature of 37 ° C. or a temperature at which normal mammalian cells grow, and a carbon dioxide gas concentration of 5% or a concentration at which normal mammalian cells grow. In the case of components that are easily oxidized, it is desirable to reduce the oxygen concentration in the culture.
培地としては、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地、Ｆ−１０培地、Ｆ−１２培地、ＥＲＤＦ培地など、確立された哺乳動物細胞用培地、またはそれらを基本とした培地が好ましい。Ｊｕｒｋａｔ細胞やＨＬ−６０細胞などヒト白血病由来細胞にはＲＰＭＩ１６４０培地を、Ｈｕｈ−７細胞、ＨｅｐＧ２細胞などヒト肝がん由来細胞にはＤ−ＭＥＭ培地の使用が好適である。細胞の成長を促すためには、牛胎児血清を１０％または通常の哺乳動物細胞が生育する濃度で添加してもよい。必要に応じて、非必須アミノ酸、サイトカイン（ＦＧＦ，ＨＧＦ，ＶＥＧＦ，インターロイキン−２など）を添加することもできる。ただし、血清で増殖が抑制される細胞株では無血清培養を使用する。 Examples of the medium include D-MEM medium, MEM medium, RPMI 1640 medium, D-MEM / F-12 medium, F-10 medium, F-12 medium, ERDF medium and the like established medium for mammalian cells, or those A basic medium is preferred. It is preferable to use RPMI1640 medium for human leukemia-derived cells such as Jurkat cells and HL-60 cells, and D-MEM medium for human liver cancer-derived cells such as Huh-7 cells and HepG2 cells. In order to promote cell growth, fetal bovine serum may be added at a concentration at which 10% or normal mammalian cells grow. If necessary, non-essential amino acids and cytokines (FGF, HGF, VEGF, interleukin-2, etc.) can also be added. However, serum-free culture is used for cell lines whose growth is suppressed by serum.
培養には、使用する細胞に適した培他の選定に加えて、細胞数、細胞密度、細胞周期などの培養条件を選択するために、必要に応じて予備的な培養実験を実施することが推奨される。 For culturing, in addition to selection of culture and other suitable for the cells to be used, preliminary culture experiments may be performed as necessary to select the culture conditions such as the number of cells, cell density, cell cycle, etc. Recommended.
図１において、細胞への供与段階に使用する機能性未知の被検材料としては、食材、医薬品、医薬品候補物質など特に限定されないが、本発明は、農産物、林産物、畜産物、水産物等の生物資源およびそれらから調製された多成分系材料への適用で、優れた効果が期待できる。 In FIG. 1, test materials of unknown functionality used in the cell donation stage are not particularly limited to foods, pharmaceuticals, drug candidates, etc., but the present invention is a biological product such as agricultural products, forest products, livestock products, and marine products. Excellent effects can be expected when applied to resources and multi-component materials prepared from them.
被検材料として使用する好ましい食材としては、ニガウリ、お茶、大豆、甘藷、エンドウ、小松菜、ほうれん草、白菜、キャベツ、レタス、たまねぎ、ピーマン、唐辛子、ミニトマト、なす、ズッキーニ、キュウリ、トウモロコシ、カボチャ、ニンジン、ゴボウ、大根、ブルーベリー、キンカン、日向夏、ヘベズ、マンゴー、ソヨミズ、ウメ、スペアミント、スウィートバジル、イタリアンパセリ、ローズマリー、ステビア、カモミール、シソ、クローバー、ニンニク、シイタケ、ヒラタケ、ナメコ、マイタケ、ハタケシメジ、エリンギ、エノキダケ、米、サトイモ、イチゴ、ミズナ、ニラ、メロン、ペパーミント、レモンバームなど、及びこれらの食材の可食部に加え、葉、種子も含む。また、牛肉、牛乳、豚肉、鶏肉、卵などの動物資源、及びケフィア、ヨーグルト、納豆などの発酵食材、海産物、健康への効果が期待できる茶のような嗜好品を挙げることができる。 Preferred ingredients to be used as test materials include bitter melon, tea, soybeans, sweet potatoes, peas, Japanese mustard spinach, spinach, Chinese cabbage, cabbage, lettuce, onions, peppers, peppers, cherry tomatoes, eggplant, zucchini, cucumber, corn, pumpkin, Carrot, burdock, radish, blueberry, kumquat, summer sun, hevez, mango, soyworm, ume, spearmint, sweet basil, italian parsley, rosemary, stevia, chamomile, perilla, clover, garlic, shiitake, oyster mushroom, nameko, maitake, In addition to edible parts of hatake shimeji, eringi, enoki mushroom, rice, taro, strawberry, mizuna, leek, melon, peppermint, lemon balm, and the like, and leaves and seeds. In addition, animal resources such as beef, milk, pork, chicken, and eggs, fermented foods such as kefir, yogurt, and natto, marine products, and taste products such as tea that can be expected to have health effects can be listed.
食材中の好ましい被検材料としては、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）などを含むカテキン類、ダイゼイン、ダイジン、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、フォルモノネチンなどを含むイソフラボン類、シアニジン、ペラルゴニジン、デルフィニジンなどを含むアントシアニン類、ケルセチン、ミリセチン、ルチン、レスベラトロール、ケンフェロール、セサミン、クルクミン、リモニン、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、アスタキサンチン、ガランギン、シトラール、トリゴネリン塩酸塩、エラグ酸、キナ酸、サポニン、カプサイシン、ハイドロコルチゾン、オレイン酸、ベンジルイソチオシアネート、マンギフェリン、アピゲニン、ルテオリン、クロロゲン酸、リモネン、スクアレン、レチノール、ロズマリン酸、カフェ酸、リポ酸などの化学物資、カロテノイド類、アラキドン酸、リノレン酸などを含む多価不飽和脂肪酸、９c１１tＣＬＡ、１０ｔ１２ｃＣＬＡなどを含む共役リノール酸類、その他リバビリン、インターフェロン類など多様な化合物を挙げることができる。エピガロカテキンガレート、ゲニステイン、リポ酸など健康への効果が期待できるものは、特に好ましい。 Preferred test materials in food materials include catechins including catechin, epicatechin, epigallocatechin, gallocatechin, catechin gallate, epicatechin gallate, gallocatechin gallate, epigallocatechin gallate (EGCG), daidzein, daidzin, genistein , Genistin, glycitein, glycitin, formononetin and other isoflavones, cyanidin, pelargonidin, delphinidin and other anthocyanins, quercetin, myricetin, rutin, resveratrol, kaempferol, sesamin, curcumin, limonin, gamma-aminobutyric acid (GABA ), Astaxanthin, galangin, citral, trigonelline hydrochloride, ellagic acid, quinic acid, saponin, capsaicin, hydrocortisone, oleic acid, ben Chemical materials such as luisothiocyanate, mangiferin, apigenin, luteolin, chlorogenic acid, limonene, squalene, retinol, rosmarinic acid, caffeic acid, lipoic acid, polyunsaturated fatty acids including carotenoids, arachidonic acid, linolenic acid, 9c11tCLA Various compounds such as conjugated linoleic acids including 10t12cCLA, other ribavirins, and interferons can be exemplified. Those that can be expected to have health effects such as epigallocatechin gallate, genistein, and lipoic acid are particularly preferred.
被検材料の調製に際しては、生物資源、例えば食材、その凍結乾燥物などから抽出物を評価培養細胞に供与する。抽出溶媒には、水、エタノール、メタノール、酢酸エチル、ヘキサン、アセトン、あるいはこれらの二つ以上を混合した溶媒等を好適に用いる。抽出物は、必要に応じて、さらに高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、 オープンカラム等により分画、精製してもよい。 In preparing the test material, an extract from a biological resource such as a food material or a freeze-dried product thereof is donated to the evaluation cultured cells. As the extraction solvent, water, ethanol, methanol, ethyl acetate, hexane, acetone, a solvent obtained by mixing two or more of these, and the like are preferably used. If necessary, the extract may be further fractionated and purified by high performance liquid chromatography (HPLC), open column, or the like.
抽出物と細胞を作用させる混合時間は、作用開始時を０時間とし、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間などから検討する。２４時間以内で機能性を判定できる場合には、それ以上作用させるには及ばない。 The mixing time for allowing the extract and cells to act is 0 hour at the beginning of the action, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 6 hours, 9 hours, 12 hours, 18 hours, 24 hours, 36 hours, 48 hours, 72 hours. Consider from time. If the functionality can be determined within 24 hours, no further action is required.
細胞へ供与する抽出物の濃度は、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、７μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、７０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、５００μＭ、１０００μＭおよびこれらの濃度の１０００倍および１／１０００倍の濃度の中から、被検材料および評価培養細胞に適した濃度を選定する。通常、０．５μＭから１０００μＭの範囲が望ましい。さらに抽出物が、食材抽出物などのようにその濃度が不明な場合には、段階希釈法にて最適な実験結果が得られる濃度を決定してもよい。酸性または塩基性抽出物の場合は、中和してから添加するのが望ましい。 The concentration of the extract donated to the cells is 0.5 μM, 1 μM, 1.5 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 7 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 40 μM, 45 μM, 50 μM, 70 μM, 100 μM, From 200 μM, 300 μM, 500 μM, 1000 μM, and concentrations 1000 and 1/1000 times higher than these concentrations, a concentration suitable for the test material and evaluation cultured cells is selected. Usually, the range of 0.5 μM to 1000 μM is desirable. Further, when the concentration of the extract is unknown, such as a food extract, the concentration at which the optimum experimental result can be obtained by the serial dilution method may be determined. In the case of an acidic or basic extract, it is desirable to add after neutralization.
図１における被検試料の調製段階では、食材などからの抽出物を供した評価培養細胞が応答した後、浮遊細胞の場合は、遠心分離により細胞と細胞分泌物を分離する。接着細胞の場合は、ピペット操作で細胞と細胞分泌物を分離し、細胞分泌物はそのまま被検試料とする。必要に応じて、細胞破砕物は密度勾配遠心、連続遠心などにより、核、ミトコンドリア、小胞体などの特定の細胞小器官を採取し、さらなる細胞小器官抽出物としたものも被検試料とすることもある。細胞の破砕は、細胞破砕装置、例えばテフロン（登録商標）ホモジナイザー、ダウンスホモジナイザー、ポリトロンタイプホモジナイザー、超音波破砕装置、ビーズ破砕装置などによる破砕、または界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、ＣＨＡＰＳ、ＳＢ３−１０、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、ＣＡ−６３０、Ｔｗｅｅｎ２０などによる破砕、または細胞破砕装置と界面活性剤の併用による破砕から、任意に選択すればよい。必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤を加えても良い。破砕の後は、遠心分離装置により細胞抽出物および残さに分離し、細胞抽出物を被検試料とする。 In the preparation stage of the test sample in FIG. 1, after the evaluation cultured cells provided with the extract from the food or the like respond, in the case of floating cells, the cells and cell secretions are separated by centrifugation. In the case of adherent cells, the cell and cell secretion are separated by pipetting, and the cell secretion is used as a test sample as it is. If necessary, collect cell organelles by density gradient centrifugation, continuous centrifugation, etc. to collect specific organelles such as nuclei, mitochondria, and endoplasmic reticulum, and use them as further organelle extracts as test samples. Sometimes. Cell disruption is performed by cell disruption equipment such as a Teflon (registered trademark) homogenizer, Dounce homogenizer, polytron type homogenizer, ultrasonic disruption apparatus, bead disruption apparatus, or the like, or a surfactant such as Triton X-100 or Triton X-. 114, NP-40, CHAPS, SB3-10, sodium cholate, deoxycholic acid, CA-630, Tween 20 or the like, or disruption by using a cell disrupting device and a surfactant in combination. If necessary, a chelating agent such as EDTA may be added. After crushing, it is separated into a cell extract and a residue by a centrifuge, and the cell extract is used as a test sample.
図１における統合型イムノアッセイ段階では、イムノアッセイを基盤としたバイオマーカーに特異的な抗体を使用する。好適には、バイオマーカーとの抗原抗体反応を利用する。イムノアッセイには、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、抗体チップ（抗体アレイ）、ビーズアレイ、イムノクロマトなどを利用する。代表的なイムノアッセイであるＥＬＩＳＡには非特許文献１を、ウエスタンブロッティングには非特許文献２を、そしてイムノクロマトには非特許文献３を挙げることができる。測定部位として、ＥＬＩＳＡの場合は、マイクロプレート上での特異的抗体による検出を行う。マイクロプレートには、６，１２，２４，４８，９６，３８４、及び１５３６ウエルのプレートなどがあるが、９６ウエルが一般的である。ウエスタンブロッティングの場合は、膜上で特異的抗体による検出を行う。膜には、ＰＶＤＦ膜、ニトロセルロース膜などを使用できる。
同様に、イムノアッセイに抗体チップ（抗体アレイ）を用いる場合は、ＰＶＤＦ膜、ニトロセルロース膜などの膜、スライドグラスあるいは類似の基盤上で、特異的抗体による検出を行う。ビーズアレイの場合はビーズ上で、イムノクロマトの場合はスティック上で、特異的抗体による検出を行う。検出は、抗体（一次抗体、二次抗体）に標識した酵素の反応による発色法、化学発光法、化学蛍光法や抗体に直接蛍光色素を標識した蛍光法があり、簡便な発色法や感度が高く定量性の良い化学発光法が望ましい。酵素には、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼの使用が好適である。 Similarly, when an antibody chip (antibody array) is used for immunoassay, detection with a specific antibody is performed on a membrane such as a PVDF membrane or a nitrocellulose membrane, a slide glass, or a similar substrate. Detection with a specific antibody is performed on beads in the case of a bead array and on a stick in the case of immunochromatography. The detection includes a coloring method based on the reaction of an enzyme labeled with an antibody (primary antibody, secondary antibody), chemiluminescence method, chemifluorescence method, or fluorescence method in which a fluorescent dye is directly labeled on the antibody. A chemiluminescence method that is highly quantitative and good is desirable. As the enzyme, peroxidase or alkaline phosphatase is preferably used.
イムノアッセイとしては、多数の試料の同時解析、定量解析、分析装置の価格などを考慮した場合、ＥＬＩＳＡ法を用いることが特に好ましい。 As the immunoassay, it is particularly preferable to use the ELISA method in consideration of simultaneous analysis of a large number of samples, quantitative analysis, the price of an analyzer, and the like.
図１に示す機能性評価段階における評価の主たる機能性は、健康に関する機能性である。健康に関する機能性は、評価目的により異なるので必ずしも特定はできないが、食材の場合、抗酸化作用、抗変異原作用、アポトーシス誘導作用、がん細胞転移抑制作用、がん細胞増殖抑制作用、抗ストレス作用、免疫調節作用、抗ウイルス作用、ウイルス増殖抑制作用、動脈硬化抑制作用、血清脂質改善作用、高血圧予防作用、抗炎症作用、抗肥満など多様な機能を挙げることができる。特に、抗酸化作用、アポトーシス誘導作用、がん細胞増殖抑制作用など、がんの予防に関連する機能性の評価が期待されている。 The main functionality of the evaluation in the functionality evaluation stage shown in FIG. 1 is the functionality related to health. Functionality related to health varies depending on the purpose of evaluation and cannot necessarily be specified. However, in the case of foodstuffs, antioxidant, antimutagenic, apoptosis-inducing, cancer cell metastasis, cancer cell proliferation, antistress Various functions such as action, immunoregulatory action, antiviral action, viral growth inhibitory action, arteriosclerosis inhibitory action, serum lipid improving action, hypertension preventing action, anti-inflammatory action, anti-obesity can be mentioned. In particular, evaluation of functionality related to cancer prevention, such as an antioxidant action, an apoptosis-inducing action, and a cancer cell growth inhibitory action, is expected.
機能性評価に適用するバイオマーカーとしては、抗酸化作用、抗変異原作用、アポトーシス誘導作用、がん細胞増殖抑制作用、抗ストレス作用、免疫調節作用、抗ウイルス作用、ウイルス増殖抑制作用などの各機能性に関係がある蛋白質を挙げることが出来る。さらに、機能性に関わりその発現量が変化するバイオマーカーとともに、発現量がほとんど変化しないハウスキーピングタンパク質（Ｇ６ＰＤＨ、ＧＡＰＤＨ、ａｃｔｉｎなど）をコントロールマーカーとして取扱い、これらを含めてバイオマーカーとするのが望ましい。例えば、表１に示すタンパク質がこれらのバイオマーカー候補となり得る。 Biomarkers applied for functional evaluation include antioxidant, antimutagenic, apoptosis-inducing, cancer cell growth-inhibiting, anti-stress, immunoregulatory, antiviral, and virus growth-inhibiting Mention may be made of proteins related to functionality. Furthermore, it is desirable to treat a housekeeping protein (G6PDH, GAPDH, actin, etc.) whose expression level hardly changes as well as a biomarker related to functionality and change its expression level as a control marker, and to include these as biomarkers. . For example, the proteins shown in Table 1 can be candidates for these biomarkers.
バイオマーカーは、文献および公開データベース上の公知情報、プロテオーム解析、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）解析などの個別評価系による解析結果にから選定することができる。公開データベースには、米国ＮＣＢＩにあるＰｕｂＭｅｄを使用して検索できるデータベースおよびインターネットを通じて検索できるデータベースを挙げることができる。 The biomarker can be selected from known results in literature and public databases, analysis results by individual evaluation systems such as proteome analysis and DNA microarray (DNA chip) analysis. Public databases can include databases that can be searched using PubMed in NCBI and databases that can be searched through the Internet.
プロテオーム解析は、ＩＰＧストリップを使用した１次元目等電点電気泳動、２次元目ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる２次元電気泳動、電気泳動パターンの色素染色によるイメージ解析、タンパク質スポットの質量分析装置による解析及び同定により行うことができる。特に、定量性にすぐれた蛍光色素によるプレラベル標識による蛍光ディファレンシャル解析が望ましい。 Proteome analysis includes first-dimension isoelectric focusing using IPG strips, two-dimensional electrophoresis using second-dimensional SDS-PAGE, image analysis by dye staining of electrophoresis patterns, analysis and identification of protein spots by mass spectrometer Can be performed. In particular, fluorescence differential analysis by pre-label labeling with a fluorescent dye having excellent quantification is desirable.
ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）解析は、市販のＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、ＣｏｄｅＬｉｎｋ Ｂｉｏａｒｒａａｙ（アマシャム・バイオサイエンス社）およびこれらに類するものを使用することが出来るが、ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を使用することが好ましい。 For the DNA microarray (DNA chip) analysis, a commercially available DNA microarray (DNA chip) such as GeneChip probe array (Affymetrix), CodeLink Bioarray (Amersham Bioscience) and the like can be used, but GeneChip It is preferable to use a probe array (Affymetrix).
本発明に適用する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、リコンビナント抗体のいずれもバイオマーカーに対する特異性があれば使用可能であるが、モノクローナル抗体の使用が好ましい。モノクローナル抗体は、実験動物としてマウスを使用してバイオマーカーに対する抗原を免役した後、非特許文献５に記載された方法により調製する。抗原には、精製タンパク質、リコンビナントタンパク質、合成ペプチドなどを使用できる。
また抗体には、市販されているものであっても、バイオマーカーに対する特異性があれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、リコンビナント抗体のいずれの抗体も使用可能である。 Moreover, even if it is a commercially available antibody, any antibody such as a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, an antiserum, and a recombinant antibody can be used as long as it has specificity for a biomarker.
図１における最終段階としての機能性総合評価の一つは、機能性既知試料を評価して得られたバイオマーカー発現量パターンからなるデータベースと、機能性未知試料のバイオマーカー発現量パターンとの直接的な比較により行う方法を示しているが、後述するように機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と機能性既知材料の既知または個別評価系によって得られた機能性値とを対応付けたデータセットを作成する。次いで、ブートストラップ法によりバイオマーカー発現量測定値と機能性既知材料の機能性値とが従うであろう分布を推定・合成して、生物由来の変動、揺らぎを吸収した仮想データセットを作成する。本発明では、この仮想データセットによって、抗酸化作用、抗変異原作用、アポトーシス誘導作用、がん細胞増殖抑制作用、抗ストレス作用、免疫調節作用、抗ウイルス作用、ウイルス増殖抑制作用など、機能性未知材料の機能性値を定量的に推定する。本発明では、この推定を多変量解析によるデータベースの分類、統計処理により行う。具体的には、学習法、確率法、クラスタリング法などを挙げることができる One of the overall functional evaluations as the final stage in FIG. 1 is a direct database between a biomarker expression level pattern obtained by evaluating a functionally known sample and a biomarker expression level pattern of a functionally unknown sample. As shown below, the biomarker expression level measurement value of a known functional sample is associated with the functional value obtained by a known or individual evaluation system of a known functional material as described later. Create a dataset. Next, the bootstrap method estimates and synthesizes the distribution that the biomarker expression level measurement value and the functional value of a known functional material will follow, and creates a virtual data set that absorbs biological variation and fluctuations. . In the present invention, this virtual data set enables functionalities such as antioxidant action, antimutagenic action, apoptosis inducing action, cancer cell growth inhibitory action, antistress action, immunoregulatory action, antiviral action, and virus growth inhibitory action. Quantitatively estimate the functionality of unknown materials. In the present invention, this estimation is performed by database classification and statistical processing by multivariate analysis. Specific examples include learning methods, probability methods, and clustering methods.
さらに詳しくは、図１のデータベースには、先ずｉｎ ｖｉｖｏおよび評価培養細胞系で機能性が確認されている機能性既知材料のデータを蓄積する。データ取得には、ｉｎ ｖｉｖｏおよび培養細胞系で機能性が確認されている機能性既知材料を評価培養細胞に供与して応答した細胞抽出物及び／または分泌物を得、得られた細胞抽出物及び／または分泌物を機能性既知試料として、イムノアッセイによるバイオマーカー発現量を測定する。 More specifically, the database of FIG. 1 first accumulates data of known functional materials whose functionality has been confirmed in vivo and in the evaluation cultured cell system. For data acquisition, a cell extract and / or a secreted product obtained by supplying a functionally known material whose functionality has been confirmed in vivo and in a cultured cell system to an evaluation cultured cell and responding to the obtained cell extract In addition, the expression level of the biomarker by an immunoassay is measured using a secreted product as a functionally known sample.
図１における機能性総合評価方法では、先ず機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と機能性既知材料の機能性値とを対応付けしたデータセットを作成する。次いで、この対応付けデータセットからブートストラップ法により合成した分布からなる仮想データセットを作成する。ブートストラップ法の適用は、必ずしもこの順序によらず、対応付けデータセットの作成前に行うこともできる。次に、機能性未知の食材または食材成分を評価培養細胞に供与して、機能性未知材料に応答した細胞抽出物及び／または分泌物を得、得られた細胞抽出物及び／または分泌物を機能性未知試料とし、イムノアッセイによりバイオマーカーの発現量測定値を得る。本発明では、この機能性未知試料のバイオマーカー測定値と前記仮想データセットとを照合し、機能性未知材料の機能性値を推定する。この推定には、多変量解析によるデータベースの分類、例えば、学習法、確率法、クラスタリング法などによる統計処理を行う。 In the functional comprehensive evaluation method in FIG. 1, first, a data set in which a biomarker expression level measurement value of a functionally known sample is associated with a functional value of a functionally known material is created. Next, a virtual data set including a distribution synthesized from the association data set by the bootstrap method is created. The application of the bootstrap method is not necessarily performed in this order, and can be performed before the creation of the association data set. Next, a food ingredient or ingredient component with unknown function is provided to the evaluation cultured cells to obtain a cell extract and / or secretion in response to the function unknown material, and the obtained cell extract and / or secretion is Using a sample with unknown functionality, a measurement value of the expression level of the biomarker is obtained by immunoassay. In the present invention, the biomarker measurement value of the functional unknown sample is collated with the virtual data set to estimate the functional value of the functional unknown material. For this estimation, a database classification based on multivariate analysis, for example, statistical processing using a learning method, a probability method, a clustering method, or the like is performed.
本発明においては、健康に関するポジティブな機能性に加えて、副作用や毒性のごときネガティブな機能性に関しても、バイオマーカーの変化の方向、組合せなどから、総合的に判定できる。これにより、食材、医薬品、医薬品候補物質のポジティブな機能性の相互効果に加えて、ネガティブな機能性の相殺効果も併せて評価することができる。 In the present invention, in addition to positive functionality related to health, negative functionality such as side effects and toxicity can also be comprehensively determined from the direction and combination of changes in biomarkers. Thereby, in addition to the mutual effect of the positive functionality of foodstuffs, medicines, and drug candidate substances, the offset effect of negative functionality can also be evaluated.
本発明における機能性既知材料の機能性データには、既知の機能性値に加えて、個別の機能性測定法による機能性測定結果を利用することもできる。機能性測定法としては、レプリコンアッセイ、ＴＣＩＤ50法などの抗ウイルス作用、ＭＴＴアッセイ、ＷＳＴ８アッセイなどのがん細胞増殖抑制作用、ＤＰＰＨラジカル消去活性測定、レポータージーンアッセイなどの抗酸化作用、硫酸転移酵素を用いたＡｍｅｓ変法、Ａｍｅｓ法、小核試験法、Ｒｅｃアッセイなどの抗変異原性、コルチコステロン、ＧＯＴ試験などの抗ストレス作用、ＴＵＮＥＬ法、ＡＮＮＥＸＩＮ Ｖ法、ＤＮＡラダー法、カスパーゼ活性測定法などのアポトーシスアッセイ等を挙げることができる。 In addition to the known functionality value, the functionality measurement result obtained by an individual functionality measurement method can be used as the functionality data of the material with known functionality in the present invention. Functionality measurement methods include antiviral activity such as replicon assay and TCID 50 method, cancer cell growth inhibitory activity such as MTT assay and WST8 assay, antioxidant activity such as measurement of DPPH radical scavenging activity and reporter gene assay, sulfotransferase Ames modified method, Ames method, micronucleus test method, anti-mutagenicity such as Rec assay, anti-stress action such as corticosterone, GOT test, TUNEL method, ANNEXIN V method, DNA ladder method, caspase activity measurement An apoptosis assay such as a method can be mentioned.
図２は、本発明の食材機能性推定方法を実行するためのコンピュータシステムの構成を示すブロック図である。図２において、計算機２１は入出力インターフェース２１ａ、中央演算装置２１ｂ、主記憶装置２１ｃを備えている。入出力インターフェース２１ａには計算機２１が他のコンピュータシステム（図示せず）と通信回線を介してデータ、プログラムを交換するためのネットワーク装置２２が接続されている。また、入出力インターフェース２１ａには、入力装置であるキーボード２３およびマウス２４と、出力装置であるモニタ２５およびプリンタ２６が接続されている。さらに、入出力インターフェース２１ａには、ハードディスク、フラッシュメモリ、磁気テープ装置、光磁気ディスク装置等の補助記憶装置２７が接続されていてもよい。
FIG. 2 is a block diagram showing the configuration of a computer system for executing the food functionality estimation method of the present invention. In FIG. 2, the
中央演算装置２１ｂは、コンピュータシステムを制御・統括すると同時に、機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値とその機能性値間の学習と汎化、機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値に対応付けられる機能性値の発現確率の導出、機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値のクラスタリング、及び各クラスと機能性値間の対応付け、並びにブートストラップ法によるバイオマーカー発現量測定値が従うであろう分布の推定、合成などを行う。中央演算装置２１ｂによる一時的、または最終的な演算結果は、たとえばＤＲＡＭからなる主記憶装置２１ｃまたは補助記憶装置２７に記録される。主記憶装置２１ｃにはコンピュータシステムを制御するプログラムも格納する。
The central processing unit 21b controls and supervises the computer system, and at the same time, learns and generalizes the biomarker expression level measurement value of the functionally known sample and its functional value, and sets the biomarker expression level measurement value of the functionally known sample. Derivation of expression probability of functional value to be correlated, clustering of biomarker expression level measurement value of samples with known functionality, association between each class and functional value, and biomarker expression level measurement value by bootstrap method Estimate and synthesize distributions that will follow. The temporary or final calculation result by the central processing unit 21b is recorded in the
演算に用いられるデータ、およびコンピュータシステムを制御するコマンドは、キーボード２３またはマウス２４を通じてコンピュータシステムに入力することができる。これらのデータおよびコマンドはネットワーク装置２２を通じて接続されている他のコンピュータシステム（図示せず）を介して入力することもできる。
Data used for the calculation and commands for controlling the computer system can be input to the computer system through the
機能性未知材料が持つ機能性の推定結果は、モニタ２５またはプリンタ２６に表示することができる。これらの結果は、ネットワーク装置２２を通じて接続している他のコンピュータシステム（図示せず）を通じて出力することもできる。
The estimation result of the functionality of the functionally unknown material can be displayed on the
図２のコンピュータシステム２１において、学習法により機能性未知材料の機能性値を推定する手順は、およそ以下の通りである。すなわち、入力手段を介して入力された機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と機能性値は不揮発性記憶である補助記憶装置２７に格納されており、これらを一旦主記憶装置２１ｃに格納する。次に中央演算装置２１ｂにより機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と機能性既知材料の機能性値間の関係を学習する。学習により獲得されたバイオマーカー発現量測定値と機能性値間の対応付けデータセットは、主記憶装置２１ｃまたは補助記憶装置２７に格納される。本発明では、このときブートストラップ法によりバイオマーカー発現量測定値と機能性既知材料の機能性値とが従うであろう分布から合成した仮想データセットをあわせて作成し、同様に格納する。機能性未知試料によるバイオマーカー発現量測定値が入力手段を介して入力されたとき、中央演算装置２１ｂは主記憶装置２１ｃまたは補助記憶装置２７に格納された機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と機能性既知材料の機能性値とからなる仮想データセットから、機能性未知材料の機能性値を推定し、出力装置を介して出力する。
In the
図３は、学習法を用いるときの本発明の好適な機能性推定法を示すフローシートである。学習法による本発明の実施は、機能性既知試料の調製を行うステップ１、調製した機能性既知試料のバイオマーカー発現量を測定するステップ２、機能性値を測定するステップ３、バイオマーカー発現量と機能性値の関係を対応付けしたデータセットを作成するステップ４、対応付けデータセットからブートストラップ法により合成した分布に従う仮想データセットを作成するステップ５、機能性未知試料の調製を行うステップ６、機能性未知試料のバイオマーカー発現量を測定するステップ７、仮想データセットを汎化して、機能性未知材料の機能性値を推定するステップ８、推定された機能性値をもとに機能性未知材料の機能性を総合評価するステップ９、総合評価結果を表示するステップ１０からなる。
FIG. 3 is a flow sheet showing a preferred functionality estimation method of the present invention when using a learning method. The implementation of the present invention by the learning method is as follows: Step 1 for preparing a sample with known functionality, Step 2 for measuring the amount of biomarker expression of the prepared sample with known functionality, Step 3 for measuring the functionality value, Level of expression of
図４は、学習をニューラルネットワークで行う方法を示す。図４においては、補助記憶装置２7に格納されている機能性既知試料のバイオマーカー発現量と機能性既知材料の機能性値を主記憶装置２１ｃに読み込んだのち、バイオマーカー発現量を入力信号、機能性値を教師信号とした学習サンプルとし、階層型ニューラルネットワーク上で誤差逆伝播学習法により、ニューラルネットワークの出力と機能性値間の誤差が極小となるように重み４２を調節する。ニューラルネットワークおよび誤差逆伝播学習法には、非特許文献６を挙げることができる。
生物系の評価システムでは、バイオマーカー発現量と機能性値の組み合わせからなる学習サンプル数が、使用するニューラルネットワークの規模に比べて相対的に少ない傾向にある。本発明では、ブートストラップ法を用いることにより、その数を適宜増やすことができる。一般的に、細胞に被検材料を接触させてバイオマーカーや機能性の測定値を得る場合には、被検材料の濃度等が厳密に一致していても、生きた細胞を実験に用いることに伴う測定値の変動、ゆらぎは避けられない。さらに、これに測定時の誤差が加わりことを考慮すると、細胞を用いたデータ測定を基礎とする有効なデータベースの構築には、非常に多くのサンプル（実験回数）が必要となる。したがって、実験や測定に非常に多くの時間と手間を要し、高スループットでの評価は実質的に困難となる。しかし、細胞を用いたバイオマーカーや機能性の測定といえども自然現象の観測である。厳密に同一環境での実験であれば同一の測定値が得られるであろうことが期待でき、測定に伴う誤差は正規分布に従うことが多い。そこで、本発明では、ブートストラップ法を用いて、少数の測定データから，測定値が従うであろう分布を推定して合成し、この分布に従う評価用の仮想データセットを構築する。これにより、本発明では、少数の実験回数からでも高スループットでの機能性の推定が高い確度で可能となる。ブートストラップ法は、前述の学習法のニューラルネットワーク法に限らず、確立法、クラスタリング法等にも適用可能である。
機能性未知試料の機能性の推定値は、機能性未知試料によるバイオマーカー発現量測定値がニューラルネットワークに入力されたとき、ニューラルネットワーク上に記憶された機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と機能性既知材料の機能性値の関係を汎化するとともに、ブートストラップ法により推定、合成された仮想データセットから求める。 The estimated value of the functionality of the unknown functional sample is the measured value of the biomarker expression of the known functional sample stored on the neural network when the measured value of the biomarker expression from the unknown functional sample is input to the neural network. And generalization of the relationship between functional values of known functional materials and a virtual data set estimated and synthesized by the bootstrap method.
機能性の推定値は、図２のモニタ装置２５、プリンタ２６、またはネットワークを介して接続した他のコンピュータ（図示せず）上に表示する。
The estimated value of functionality is displayed on the
（機能性既知試料のバイオマーカー発現量と機能性既知材料の機能性値との学習結果及びブートストラップ法により推定、合成した分布からなる仮想データセットから、機能性未知試料のバイオマーカー発現量から機能性未知材料の機能値を推定し、総合評価する例） (From learning results of biomarker expression levels of known functional samples and functional values of known functional materials and from virtual data sets consisting of distributions estimated and synthesized by the bootstrap method, from biomarker expression levels of unknown functional samples Example of estimating and comprehensively evaluating the functional values of functionally unknown materials)
バイオマーカー発現量測定及びがん細胞増殖抑制試験の評価培養細胞として、ヒトＴ細胞白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた。細胞は、１０％牛胎児血清(ＦＣＳ)含有ＰＲＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２ガスで平衡化したＣＯ２インキュベータ内で培養した。対数増殖期にあるＪｕｒｋａｔ細胞を3×105cells/mlの細胞密度でプラスティックシャーレに接種し、次いで学習用の機能性既知材料及び機能性未知材料を添加した。 Evaluation of Biomarker Expression Level and Cancer Cell Growth Inhibition Test Human T cell leukemia cell line Jurkat cells were used as cultured cells. The cells were cultured in a CO 2 incubator equilibrated with 37%, 5% CO 2 gas using 10% fetal calf serum (FCS) -containing RPMI1640 medium. Jurkat cells in the logarithmic growth phase were inoculated into a plastic petri dish at a cell density of 3 × 10 5 cells / ml, and then a functionally known material and a functionally unknown material for learning were added.
学習用の機能性既知材料としては、EGCG、ゲニステイン、リポ酸、アラキドン酸、クルクミン、ダイゼイン、ケルセチン、シアニジン、レスベラトロール、トランス10シス12共役リノール酸（10t,12c-CLA）を用いた。これらの各化合物を表２に示す終濃度になるように細胞に添加した。機能性未知材料としては、カプサイシン及びブルーベリー葉抽出物を用いた。Jurkat細胞を24時間培養した後に、細胞を回収して4℃のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、細胞数を計測した。これらの細胞数をコントロールの細胞数で除すことでがん細胞増殖抑制作用を示した。結果を表３に示す。 As functionally known materials for learning, EGCG, genistein, lipoic acid, arachidonic acid, curcumin, daidzein, quercetin, cyanidin, resveratrol, trans-10 cis 12 conjugated linoleic acid (10t, 12c-CLA) were used. Each of these compounds was added to the cells at the final concentrations shown in Table 2. Capsaicin and blueberry leaf extract were used as functionally unknown materials. After culturing Jurkat cells for 24 hours, the cells were collected, washed with 4 ° C. phosphate buffered saline (PBS), and the number of cells was counted. By dividing the number of these cells by the number of control cells, the cancer cell proliferation inhibitory effect was shown. The results are shown in Table 3.
細胞数が1×107 cells/mlとなるように細胞溶解緩衝液（1 mM EDTA, 0.005% Tween20, 0.5% Triton X-100を含有するPBS）を加え、穏やかに撹拌した後にプロテアーゼ阻害剤を加え、その上清を各被検試料とした。 Add cell lysis buffer (PBS containing 1 mM EDTA, 0.005% Tween20, 0.5% Triton X-100) so that the number of cells becomes 1 × 10 7 cells / ml, and gently agitate the protease inhibitor. In addition, the supernatant was used as each test sample.
各被検試料中に含まれる各バイオマーカー量の測定は、ELISAによって行った。バイオマーカーとしては、thioredoxin, survivin, heat shock protein 70（HSP70）, X-linked inhibitor of apoptosis protein（XIAP）, Fas-associated death domain protein（FADD）, thioredoxin reductase 1（TXNRD1）, heat shock protein 90（HSP90）, IFN-inducible antiviral protein Mx（MxA）, tumor-associated hydroquinone oxidase（tNOX）の９種類について測定した。またサンプルを標準化する際に用いるglycelaldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）についても測定した。 The amount of each biomarker contained in each test sample was measured by ELISA. Biomarkers include thioredoxin, survivin, heat shock protein 70 (HSP70), X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP), Fas-associated death domain protein (FADD), thioredoxin reductase 1 (TXNRD1), heat shock protein 90 ( Nine types of HSP90), IFN-inducible antiviral protein Mx (MxA), and tumor-associated hydroquinone oxidase (tNOX) were measured. Moreover, it measured also about the glycelaldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) used when standardizing a sample.
一例として、thioredoxinの測定について説明する。以下の操作の温度は全て37℃で行った。抗ヒトthioredoxinマウス抗体（500 ng/ml：50 mM炭酸緩衝液、pH9.6）を96穴マイクロプレートの各穴に100μlずつ添加し、２時間静置してプレートに固定化した。0.05% Tween20含有PBS（TPBS）で各穴を１回洗浄した後、1% BSA含有PBSを各穴に300μlずつ添加し、２時間静置しブロッキングを行った。各穴をTPBSで３回洗浄した後、10倍に希釈した細胞抽出液を各穴に100μlずつ添加し、２時間反応させた。各穴をTPBSで３回洗浄した後、検出抗体として抗ヒトthioredoxinヤギ抗体（100 ng/ml：1% BSA含有PBS）を各穴に100μlずつ添加し、さらに１時間反応させた。各穴をTPBSで３回洗浄した後、二次抗体として西洋わさびパーオキシダーゼ（HRP）で標識されている抗ヤギIgGマウス抗体（200 ng/ml：1% BSA含有PBS）を100μl添加し、さらに１時間反応させた。最後にTPBSで４回洗浄して基質溶液(0.3 mg ABTS (p-2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt))と0.03% H2O2含有0.1 Mクエン酸緩衝液, pH4）を100μlずつ添加し、10分間反応させ、405-490 nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。他のバイオマーカーについても概略は同様に行い、使用した抗体類の一覧を表４に示した。 As an example, measurement of thioredoxin will be described. The temperature of the following operations was all performed at 37 ° C. 100 μl of anti-human thioredoxin mouse antibody (500 ng / ml: 50 mM carbonate buffer, pH 9.6) was added to each well of a 96-well microplate and allowed to stand for 2 hours to be immobilized on the plate. After each well was washed once with PBS containing 0.05% Tween 20 (TPBS), 300 μl of PBS containing 1% BSA was added to each well and allowed to stand for 2 hours for blocking. After washing each well 3 times with TPBS, 100 μl of a cell extract diluted 10-fold was added to each well and allowed to react for 2 hours. After each well was washed 3 times with TPBS, 100 μl of anti-human thioredoxin goat antibody (100 ng / ml: 1% BSA-containing PBS) was added as a detection antibody to each well and allowed to react for another hour. After washing each well three times with TPBS, 100 μl of anti-goat IgG mouse antibody (200 ng / ml: PBS containing 1% BSA) labeled with horseradish peroxidase (HRP) as a secondary antibody was added, and The reaction was carried out for 1 hour. Finally, it was washed 4 times with TPBS, and the substrate solution (0.3 mg ABTS (p-2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)) and 0.03% H 2 O 2 contained 0.1 M citrate buffer (pH 4) was added in an amount of 100 μl, reacted for 10 minutes, and the absorbance at 405-490 nm was measured with a microplate reader. The other biomarkers were outlined in the same manner, and a list of antibodies used was shown in Table 4.
吸光度として得られた各バイオマーカー発現量のデータを標準化するために、それぞれの吸光度をGAPDHの吸光度で除し、単位ＧＡＰＤＨ発現量当たりのバイオマーカー発現量とした。さらに、これらの値をコントロール被検試料のバイオマーカー発現量で除すことで、試験群のバイオマーカー発現量をコントロールに対する相対値として得た。一例として、学習用既知材料をJurkat細胞に添加した際のバイオマーカー発現量を表５に示す。また機能性未知試料の発現量を表６に示す。 In order to standardize the data on the expression level of each biomarker obtained as the absorbance, each absorbance was divided by the absorbance of GAPDH to obtain the biomarker expression level per unit GAPDH expression level. Furthermore, by dividing these values by the biomarker expression level of the control test sample, the biomarker expression level of the test group was obtained as a relative value to the control. As an example, Table 5 shows biomarker expression levels when a known learning material is added to Jurkat cells. In addition, Table 6 shows the expression levels of samples with unknown functionality.
レプリコン細胞の調製：HCVのゲノムRNAは、ウイルス粒子を構成するコアとエンベロープの構造タンパク質翻訳領域、ウイルスゲノム複製などに機能する非構造タンパク質翻訳領域とに大別される。この構造タンパク質翻訳領域をルシフェラーゼ翻訳領域・EMCV IRES（脳心筋ウイルス内部リボゾーム結合配列）・ネオマイシン耐性遺伝子に置換したサブゲノムレプリコンRNAを作成し、得られたRNAをヒト肝がん細胞Huh-7の細胞質に導入する。サブゲノムレプリコンRNAが導入されたHuh-7は、同時にネオマイシン耐性能を有するので、Geneticin (G418)による選択が可能となる。このようにして得られた細胞を、HCVレプリコンRNAの産生量の評価に供試する。なお、HCVレプリコンRNAの産生量は下記に説明するルシフェラーゼアッセイ法により測定する。この細胞の継体には、DMEM10（GIBCO社のGlutaMAX Media Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM)(1×),liquid (High glucose,contains sodium pyruvate)）にFBS（Hyclone社）10%、Penicillin-Streptomycin（GIBCO社）、およびGeneticin（invitrogen社）を添加した培地を用いる。アッセイを行なう際のアッセイ培地には、DMEM10にFBSを5%、およびPenicillin-Streptomycinを添加したもの（但し、Geneticinは加えない。）を用いる。 Preparation of replicon cells : Genomic RNA of HCV is roughly classified into a core and envelope structural protein translation region constituting a virus particle, and a nonstructural protein translation region functioning for viral genome replication. Subgenomic replicon RNA was created by substituting this structural protein translation region with a luciferase translation region, EMCV IRES (brain myocardial virus internal ribosome binding sequence), and a neomycin resistance gene, and the resulting RNA was transformed into human hepatoma cell Huh-7. Introduce into the cytoplasm. Since Huh-7 into which the subgenomic replicon RNA has been introduced has neomycin resistance at the same time, selection by Geneticin (G418) becomes possible. The cells thus obtained are used for evaluation of the production amount of HCV replicon RNA. The production amount of HCV replicon RNA is measured by the luciferase assay method described below. This cell passage includes DMEM10 (GIBCO GlutaMAX Media Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1 ×), liquid (High glucose, contains sodium pyruvate)) FBS (Hyclone) 10%, Penicillin-Streptomycin (GIBCO) and a medium supplemented with Geneticin (invitrogen) are used. The assay medium used for the assay is DMEM10 supplemented with 5% FBS and Penicillin-Streptomycin (however, Geneticin is not added).
ルシフェラーゼアッセイ法：マグネシウム存在下で、ルシフェリンとATPから酸化ルシフェリンとAMPを作る反応をルシフェラーゼが触媒する。ルシフェラーゼアッセイ法は、この時発生する光を発光検出器で検出して、得られた光量に基づいてルシフェラーゼ活性を評価する方法である。本発明では便宜上、この光量をHCVレプリコンRNA量とする。 Luciferase assay : Luciferase catalyzes the reaction of luciferin and ATP to produce oxidized luciferin and AMP in the presence of magnesium. The luciferase assay method is a method in which light generated at this time is detected by a luminescence detector, and luciferase activity is evaluated based on the obtained light quantity. In the present invention, for the sake of convenience, this light amount is defined as the amount of HCV replicon RNA.
HCVレプリコンRNA産生抑制試験
白色の96wellプレートに被検細胞（レプリコン細胞）の懸濁液（2.5×104 cells/ml）を90μlずつ加え、37℃、5％CO２存在下、相対湿度100%の条件で24時間培養した。食材成分及び／または食材抽出物である被検材料を調製し、既知材料としては、EGCG、ゲニステイン、リポ酸、アラキドン酸、クルクミン、ダイゼイン、ケルセチン、シアニジン、レスベラトロール、10t,12c-CLAを用いた。表１記載の終濃度に従い上記96wellプレートに添加した。この後、さらに72時間培養し、室温で30分以上静置後、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega社製、Steady-GloTM Luciferase Assay System）を100μl/well加えて、よくピペッティングした。5分以上放置してから発光検出器（ベックマンコールター社製、DTX800）で発光測定を行った。コントロールとして、上記被検材料の代わりにDMSOを用いて上記と同様にして調製した反応液について、同様に発光量を測定した。
HCV replicon RNA production inhibition test 90 μl each of suspension of test cells (replicon cells) (2.5 × 10 4 cells / ml) was added to a white 96-well plate at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . The cells were cultured for 24 hours under conditions of 100% relative humidity. Prepare a test material that is a food ingredient and / or a food extract, and known materials include EGCG, genistein, lipoic acid, arachidonic acid, curcumin, daidzein, quercetin, cyanidin, resveratrol, 10t, 12c-CLA Using. In accordance with the final concentrations described in Table 1, they were added to the 96 well plate. Thereafter, the cells were further cultured for 72 hours, allowed to stand at room temperature for 30 minutes or more, and then luciferase assay reagent (Promega, Steady-Glo ™ Luciferase Assay System) was added at 100 μl / well and well pipetted. After leaving it to stand for 5 minutes or more, luminescence measurement was performed with a luminescence detector (Beckman Coulter, DTX800). As a control, the amount of luminescence was measured in the same manner for a reaction solution prepared in the same manner as described above using DMSO instead of the test material.
発光測定値から、コントロールに対する百分率を求め、被検材料の各濃度における被検細胞の相対ルシフェラーゼ活性（%）を算出した。前述するように、当該相対ルシフェラーゼ活性（％）はHCVレプリコンRNA量を反映している。得られた結果は、表７に示した。 From the luminescence measurement value, the percentage with respect to the control was obtained, and the relative luciferase activity (%) of the test cells at each concentration of the test material was calculated. As described above, the relative luciferase activity (%) reflects the amount of HCV replicon RNA. The results obtained are shown in Table 7.
機能性未知試料のバイオマーカー発現量測定値から相対ルシフェラーゼ活性を予測するため、ニューラルネットワークを構築した。表５に示した濃度の機能性既知材料を与えたとき、表７に示した相対ルシフェラーゼ活性値を出力するようニューラルネットワークを学習させた。ニューラルネットワークの出力は最大値が１であるので、表７に示した相対ルシフェラーゼ活性値の値を測定で得られた最大値2.27で除し、これをニューラルネットワークの学習時の教師信号とした。ニューラルネットワークの学習には誤差逆伝播学習法を用いた。 A neural network was constructed in order to predict relative luciferase activity from biomarker expression measurement values of unknown functional samples. When the functionally known materials having the concentrations shown in Table 5 were given, the neural network was trained to output the relative luciferase activity values shown in Table 7. Since the maximum value of the output of the neural network is 1, the value of the relative luciferase activity value shown in Table 7 is divided by the maximum value 2.27 obtained by the measurement, and this is used as a teacher signal when learning the neural network. The back propagation learning method was used for neural network learning.
ニューラルネットワークの学習の成否を判定するため、表５、表７に示した学習用データセットからダイゼイン70μM、レスベラトロール100μMの２つを除いて学習を行った。 In order to determine the success or failure of the neural network learning, learning was performed by removing two of daidzein 70 μM and resveratrol 100 μM from the learning data sets shown in Tables 5 and 7.
ニューラルネットワークは入力ニューロン９、中間ニューロン４、出力ニューロン１とし、閾値調整のため中間ニューロン、出力ニューロンには常に−１を出力するニューロンからの入力を与えた。ニューラルネットワーク中の重みの初期値は−２．０から２．０までの間の乱数とし、学習係数は０．７、慣性係数は０．４に設定し、学習回数が１データ当たり４０，０００回に達するか、すべてのデータで推定誤差が０．１以下になったときに学習を停止させ、対応付けデータセットを得た。
The neural network is an input neuron 9, an
対応付けデータセットの有効性を確認のために除いたダイゼイン70μM、レスベラトロール100μMの２つのデータを学習済みのニューラルネットワークに入力したとき、表８に示したニューラルネットワークの出力（推定値）が得られた。表８には推定精度を示すために当該物質の相対ルシフェラーゼ活性の測定値（実測値）と推定誤差の絶対値も同時に示しており、これらの値は相対ルシフェラーゼ活性測定実験で得られた最大値2.27で除した後の値である。表８に示したとおり、ダイゼイン70μMでは基準値以下の推定誤差絶対値で相対ルシフェラーゼ活性を推定することが可能であったが、レスベラトール100μMでは推定誤差の絶対値が大きく推定ができていない。 When two types of data, daidzein 70 μM and resveratrol 100 μM, which are excluded to confirm the validity of the mapping data set, are input to the learned neural network, the output (estimated value) of the neural network shown in Table 8 is Obtained. Table 8 shows the measured value (actual value) of the relative luciferase activity of the substance and the absolute value of the estimation error at the same time to show the estimation accuracy, and these values are the maximum values obtained in the relative luciferase activity measurement experiment. The value after dividing by 2.27. As shown in Table 8, with daidzein 70 μM, it was possible to estimate the relative luciferase activity with the absolute value of the estimation error below the reference value, but with resveratrol 100 μM, the absolute value of the estimation error was large and could not be estimated.
表８では、学習用の機能性既知試料のバイオマーカー測定値と機能性既知材料の機能性値の実験データ数はｎ＝１である。このため、これらの測定値が従うであろう分布をブートストラップ法で推定、合成し、ｎ＝１０とした仮想データセットを構築した。この仮想データセットを用いて、表８と同じ推定を行った結果を表９に示す。 In Table 8, the number of experimental data of the biomarker measurement value of the functionally known sample for learning and the functionality value of the functionally known material is n = 1. Therefore, a virtual data set with n = 10 was constructed by estimating and synthesizing the distribution that these measured values would follow by the bootstrap method. Table 9 shows the results of the same estimation as in Table 8 using this virtual data set.
表９から、ブートストラップ法による仮想データセットを用いて機能性未知試料の機能性値を推定すると、少量の実験データでも、生物系固有のデータの揺らぎが吸収されて、より精度の高い推定値が得られることが分かった。 From Table 9, when the functional value of a sample with unknown functionality is estimated using a virtual data set by the bootstrap method, even a small amount of experimental data absorbs fluctuations in data unique to biological systems, and a more accurate estimated value Was found to be obtained.
表５、表７に示した学習データからダイゼイン70μM、レスベラトロール100μMを除いて学習を行ったニューラルネットワークに対し、表６に示した学習に用いていない材料（機能性未知材料に相当）によるバイオマーカー発現量を提示して相対ルシフェラーゼ活性値の推定を行った。表６に示したバイオマーカー発現量を仮想データセットによる学習を行ったニューラルネットワークに提示したときの相対ルシフェラーゼ活性の推定値とその実測値を表１０に示す。なお、相対ルシフェラーゼ活性の実測値は１回のみの測定であり、ダイゼイン70μM、レスベラトロール100μMの推定時と同じく相対ルシフェラーゼ活性測定実験で得られた最大値2.27で除した後の値である。表１０に示したとおり、ブルーベリー葉抽出物50μg/mlの相対ルシフェラーゼ活性については規定誤差以下で推定に成功しており、カプサイシン10μMについても１回目は、規定誤差以下での推定に成功した。 For the neural network in which learning was performed by removing daidzein 70 μM and resveratrol 100 μM from the learning data shown in Tables 5 and 7, the materials used in the learning shown in Table 6 (corresponding to functional unknown materials) The amount of biomarker expression was presented and the relative luciferase activity value was estimated. Table 10 shows the estimated value of the relative luciferase activity when the biomarker expression level shown in Table 6 is presented to a neural network that has been trained using a virtual data set, and the measured value thereof. In addition, the actual measurement value of relative luciferase activity is a measurement only once, and is a value obtained by dividing by the maximum value 2.27 obtained in the relative luciferase activity measurement experiment in the same manner as in the estimation of daidzein 70 μM and resveratrol 100 μM. As shown in Table 10, the relative luciferase activity of the blueberry leaf extract 50 μg / ml was successfully estimated with a specified error or less, and capsaicin 10 μM was successfully estimated with the specified error within the first time.
相対ルシフェラーゼ活性と同様に、がん細胞増殖抑制についてもブートストラップ法で合成した仮想データセットをニューラルネットワークで学習させて推定を行った。学習には表５に示したバイオマーカー発現量を入力、表３に示したがん細胞増殖抑制の（２）の平均値を教師信号とした。ニューラルネットワークの最大出力が１であるので、教師信号の値は表３の（２）の平均値を1.20で除した値とした。ニューラルネットワークの構成、及び学習に用いたパラメータは相対ルシフェラーゼ活性推定時と同じである。ダイゼイン７０μM、レスベラトール100μMを除いて学習を行った後、これら２つの化合物によるバイオマーカー発現量をニューラルネットワークに与えたとき、表１１の出力が得られた。表１１には推定精度を示すために当該物質のがん細胞増殖抑制作用の測定値（実測値）と推定誤差の絶対値も同時に示しており、これらの値はがん細胞増殖抑制作用測定実験で得られた最大値1.20で除した後の値である。表１１に示したとおり、学習に用いていない濃度でのがん細胞増殖抑制作用を規定誤差以下で推定することが可能であることが示された。 Similar to the relative luciferase activity, the suppression of cancer cell growth was estimated by learning a virtual data set synthesized by the bootstrap method using a neural network. In the learning, the expression level of the biomarker shown in Table 5 was input, and the average value of (2) of cancer cell growth inhibition shown in Table 3 was used as a teacher signal. Since the maximum output of the neural network is 1, the value of the teacher signal is a value obtained by dividing the average value of (2) in Table 3 by 1.20. The configuration of the neural network and the parameters used for learning are the same as those when estimating the relative luciferase activity. After learning with the exception of daidzein 70 μM and resveratrol 100 μM, when the biomarker expression levels of these two compounds were given to the neural network, the output of Table 11 was obtained. Table 11 shows the measured value (actual value) of the cancer cell growth inhibitory effect of the substance and the absolute value of the estimation error at the same time to show the estimation accuracy. It is a value after dividing by the maximum value 1.20 obtained in (1). As shown in Table 11, it was shown that the cancer cell proliferation inhibitory effect at a concentration not used for learning can be estimated with a specified error or less.
表３、表５に示した学習データからダイゼイン70μM、レスベラトロール100μMを除いた仮想データセットを学習したニューラルネットワークに対し、表６に示した学習に用いていない材料（機能性値未知材料に相当）によるバイオマーカー発現量を提示してがん細胞増殖抑制作用値の推定を行った。表６に示したバイオマーカー発現量を学習済みニューラルネットワークに提示したときのがん細胞増殖抑制作用の推定値とその実測値を表１２に示す。なお、がん細胞増殖抑制作用の実測値は１回のみの測定であり、ダイゼイン70μM、レスベラトロール100μMの推定時と同じくがん細胞増殖抑制作用測定実験で得られた最大値1.20で除した後の値である。表１２に示したとおり、ブルーベリー葉抽出物50μg/mlのがん細胞増殖抑制作用について２回目は規定誤差以下で推定に成功し、１回目と平均値についてもほぼ規定誤差での推定に成功した。カプサイシン10μMについてはすべて規定誤差以下での推定に成功した。 For the neural network that learned the virtual data set excluding daidzein 70μM and resveratrol 100μM from the learning data shown in Table 3 and Table 5, the materials not used in the learning shown in Table 6 (function value unknown materials) The amount of expression of the biomarker by the equivalent) was presented and the cancer cell growth inhibitory action value was estimated. Table 12 shows the estimated value of the cancer cell proliferation inhibitory effect when the biomarker expression level shown in Table 6 is presented to the learned neural network and the actual measurement value thereof. In addition, the measured value of the cancer cell growth inhibitory effect is a single measurement, and divided by the maximum value of 1.20 obtained in the cancer cell growth inhibitory effect measurement experiment as in the estimation of daidzein 70 μM and resveratrol 100 μM. It is a later value. As shown in Table 12, the cancer cell growth inhibitory effect of the blueberry leaf extract 50 μg / ml was successfully estimated at the second time with a specified error or less, and the first time and the average value were also successfully estimated with a specified error. . For capsaicin 10 μM, all estimations were made within the specified error.
このように、本発明によれば、機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と機能性既知材料の機能性値を組にしたデータセットから、さらにブートストラップ法により推定、合成した分布をもつ仮想データセットを用いることにより、少ない実験回数でも生物系固有の変動、揺らぎを吸収し、高い精度で機能性未知試料のバイオマーカー発現量測定値から機能性未知材料の機能性値を定量的に推定することができる。 As described above, according to the present invention, a distribution estimated and synthesized by the bootstrap method from the data set in which the biomarker expression level measurement value of the functionally known sample and the functional value of the functionally known material are combined. By using a virtual data set, the fluctuations and fluctuations inherent in biological systems can be absorbed even with a small number of experiments, and the functional values of functionally unknown materials can be quantitatively determined from the measured values of biomarker expression of functionally unknown samples with high accuracy. Can be estimated.
本発明の高スループット機能性評価方法は、食材、医薬、医薬候補物質等の評価に利用できる。特に食材のような多成分系物質の機能性を総合的に評価するのに適し、機能性食材開発、特定保健用食材の開発に当たり、動物実験によるｉｎ ｖｉｖｏ評価試験を行う前の予備試験、あるいはヒトを対象にした臨床試験前の予備試験などに好適に利用できる。加えて、農水林産のごとき生物資源生産物出荷前の機能性評価試験、家畜、人工飼育魚介類等の農水産栽培試料及び同出荷物の機能性評価試験等にも利用できる。特に、生物系の評価システムのような少ない実験回数で高い確度の推定値を得たい分野への適用可能性がある。 The high-throughput functionality evaluation method of the present invention can be used for evaluation of foodstuffs, medicines, drug candidate substances and the like. Especially suitable for comprehensive evaluation of the functionality of multi-component substances such as foods. Preliminary tests before conducting in vivo evaluation tests by animal experiments in developing functional foods and foods for specified health use, or It can be suitably used for a preliminary test before a clinical test for humans. In addition, it can also be used for functionality evaluation tests before shipment of biological resources products such as agricultural and forestry products, functionality evaluation tests of agricultural and fishery samples such as livestock and artificially reared seafood, and the same shipments. In particular, there is a possibility of application to a field where it is desired to obtain a highly accurate estimate with a small number of experiments such as a biological evaluation system.
２１ 計算機
２１ａ 入出力インターフェース
２１ｂ 中央演算装置
２１ｃ 主記憶装置
２２ ネットワーク装置
２３ キーボード
２４ マウス
２５ モニタ
２６ プリンタ
２７ 補助記憶装置
４１ ニューロン
４２ 重み
４３ 結合リンク
21
Claims (5)
（１）評価培養細胞に機能性既知材料を付与して、機能性既知試料を調製するステップと、
（２）機能性評価機能が異なる複数の測定部位を備えた評価系に、機能性既知試料を付与し、機能性既知試料のバイオマーカー発現量を測定するステップと、
（３）機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と、既知または個別評価系による機能性既知材料の機能性値とを対応付けるステップと、
（４）対応付けられたデータセットからブートストラップ法により分布を合成し、合成した分布に従う仮想データセットを作成するステップと、
（５）評価培養細胞に機能性未知材料を付与して、機能性未知試料を調製するステップと、
（６）機能性評価機能が異なる複数の測定部位を備えた評価系に、機能性未知試料を付与し、機能性未知試料のバイオマーカー発現量を測定するステップと、
（７）機能性未知試料のバイオマーカー発現量測定値と仮想データセットとを照合し、機能性未知材料の機能性値を推定するステップと、
（８）推定された機能性値に基づき、機能性未知材料の機能性を総合評価するステップと、
を含むことを特徴とする高スループット機能性評価方法。 A method for evaluating the combined functionality of functionally unknown materials,
(1) providing a functionally known material to an evaluation cultured cell to prepare a functionally known sample;
(2) providing a functionally known sample to an evaluation system having a plurality of measurement sites having different functionality evaluation functions, and measuring the biomarker expression level of the functionally known sample;
(3) associating the measured value of the biomarker expression level of a sample with known functionality with the functionality value of a known functional material with a known or individual evaluation system;
(4) synthesizing a distribution from the associated data set by a bootstrap method, and creating a virtual data set according to the synthesized distribution;
(5) providing functional unknown material to the cultured cells for evaluation and preparing a functional unknown sample;
(6) providing a functional unknown sample to an evaluation system including a plurality of measurement sites having different functional evaluation functions, and measuring a biomarker expression level of the functional unknown sample;
(7) collating the biomarker expression level measurement value of the unknown functional sample with the virtual data set, and estimating the functional value of the unknown functional material;
(8) A step of comprehensively evaluating the functionality of the functionally unknown material based on the estimated functionality value;
A high-throughput functionality evaluation method comprising:
（１）評価培養細胞に機能性既知材料を付与して、機能性既知試料を調製するステップと、
（２）機能性評価機能が異なる複数の測定部位を備えた評価系に、機能性既知試料を付与し、機能性既知試料のバイオマーカー発現量を測定するステップと、
（３）機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と、既知または個別評価系による機能性既知材料の機能性値とを対応付けるステップと、
（４）対応付けられたデータセットからブートストラップ法により分布を合成し、合成した分布に従う仮想データセットを作成するステップと、
（５）評価培養細胞に機能性未知材料を付与して、機能性未知試料を調製するステップと、
（６）機能性評価機能が異なる複数の測定部位を備えた評価系に、機能性未知試料を付与し、機能性未知試料のバイオマーカー発現量を測定するステップと、
（７）機能性未知試料のバイオマーカー発現量測定値と仮想データセットとを照合し、機能性未知材料の機能性値を推定するステップと、
（８）推定された機能性値に基づき、機能性未知材料の機能性を総合評価するステップと
を含むことを特徴とする計算機上で作動する高スループット機能性評価プログラム。 A program that evaluates the composite functionality of functionally unknown materials using a computer,
(1) providing a functionally known material to an evaluation cultured cell to prepare a functionally known sample;
(2) providing a functionally known sample to an evaluation system having a plurality of measurement sites having different functionality evaluation functions, and measuring the biomarker expression level of the functionally known sample;
(3) associating the measured value of the biomarker expression level of a sample with known functionality with the functionality value of a known functional material with a known or individual evaluation system;
(4) synthesizing a distribution from the associated data set by a bootstrap method, and creating a virtual data set according to the synthesized distribution;
(5) providing functional unknown material to the cultured cells for evaluation and preparing a functional unknown sample;
(6) providing a functional unknown sample to an evaluation system including a plurality of measurement sites having different functional evaluation functions, and measuring a biomarker expression level of the functional unknown sample;
(7) collating the biomarker expression level measurement value of the unknown functional sample with the virtual data set, and estimating the functional value of the unknown functional material;
(8) A high-throughput functionality evaluation program operating on a computer, comprising the step of comprehensively evaluating the functionality of a functionally unknown material based on the estimated functionality value.
（１）評価培養細胞に機能性既知材料を付与して、機能性既知試料を調製する手段と、
（２）機能性評価機能が異なる複数の測定部位を備えた評価系に、機能性既知試料を付与し、機能性既知試料のバイオマーカー発現量を測定する手段と、
（３）機能性既知試料のバイオマーカー発現量測定値と、既知または個別評価系による機能性既知材料の機能性値とを対応付ける手段と、
（４）対応付けられたデータセットからブートストラップ法により分布を合成し、合成した分布に従う仮想データセットを作成する手段と、
（５）評価培養細胞に機能性未知材料を付与して、機能性未知試料を調製する手段と、
（６）機能性評価機能が異なる複数の測定部位を備えた評価系に、機能性未知試料を付与し、機能性未知試料のバイオマーカー発現量を測定する手段と、
（７）機能性未知試料のバイオマーカー発現量測定値と仮想データセットとを照合し、機能性未知材料の機能性値を推定する手段と、
（８）推定された機能性値に基づき、機能性未知材料の機能性を総合評価する手段と、
を含むことを特徴とする高スループット機能性評価装置。
An apparatus for evaluating the composite functionality of functionally unknown materials using a computer,
(1) A means for preparing a known functional sample by imparting a known functional material to an evaluation cultured cell;
(2) means for providing a functionally known sample to an evaluation system comprising a plurality of measurement sites having different functional evaluation functions, and measuring the biomarker expression level of the functionally known sample;
(3) means for associating the biomarker expression level measurement value of a known functional sample with the functionality value of a known functional material by a known or individual evaluation system;
(4) means for synthesizing distributions from the associated data sets by a bootstrap method and creating a virtual data set according to the synthesized distributions;
(5) a means for preparing a functional unknown sample by imparting a functional unknown material to the cultured cells for evaluation;
(6) a means for assigning a functional unknown sample to an evaluation system including a plurality of measurement sites having different functional evaluation functions, and measuring the biomarker expression level of the functional unknown sample;
(7) means for comparing the biomarker expression level measurement value of the unknown functional sample with the virtual data set, and estimating the functional value of the unknown functional material;
(8) means for comprehensively evaluating the functionality of the unknown functional material based on the estimated functionality value;
A high-throughput functionality evaluation apparatus comprising:
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2006198145A JP2008022762A (en) | 2006-07-20 | 2006-07-20 | Method, program and apparatus for evaluating high throughput function |
Applications Claiming Priority (1)
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020025471A (en) * | 2018-08-09 | 2020-02-20 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Toxicity learning device, toxicity learning method, learned model, toxicity prediction device, and program |
| CN113777292A (en) * | 2021-08-31 | 2021-12-10 | 哈尔滨工业大学（深圳） | Method for detecting and evaluating tetracycline environmental risk by using paramecium biomarker and IBR (intermediate bulk density receptor) |
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-
2006
- 2006-07-20 JP JP2006198145A patent/JP2008022762A/en active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN113777291A (en) * | 2021-08-31 | 2021-12-10 | 哈尔滨工业大学（深圳） | Method for detecting and evaluating environmental risk of levofloxacin by using paramecium biomarker and IBR (intermediate bulk density receptor) |
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| CN113777291B (en) * | 2021-08-31 | 2023-09-05 | 哈尔滨工业大学（深圳） | Method for detecting and evaluating environmental risk of levofloxacin by using paramecium biomarkers and IBR (intermediate frequency response) |
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