JP2008017704A

JP2008017704A - Method for measuring anticancer agent susceptibility and apparatus for measuring anticancer agent susceptibility

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Publication number: JP2008017704A
Application number: JP2006189527A
Authority: JP
Inventors: Akihiro Horii; 章弘堀井
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2006-07-10
Filing date: 2006-07-10
Publication date: 2008-01-31

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To efficiently measure the anticancer agent susceptibility from a small amount of a sample such as an endoscopic biopsy sample in a short time. <P>SOLUTION: The method for measuring the anticancer agent susceptibility comprises the following steps. a step S1 of extracting cancer cells from a biological tissue containing the cancer cells, a step S2 of seeding a three-dimensional scaffold with the cancer cells, a step S3 of proliferating the seeded cancer cells, a step S4 of feeding a drug to the cancer cells and a step S5 of measuring a survival parameter of the cancer cells. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

この発明は、抗癌剤感受性測定方法および抗癌剤感受性測定装置に関するものである。 The present invention relates to an anticancer agent sensitivity measuring method and an anticancer agent sensitivity measuring device.

従来、癌の特定の分子的機序をターゲットとし、分子薬剤の発展により高い奏効率を有する抗癌剤が市販されてきている。一方、特定の分子機序をターゲットとすることは、その機序が有効でない患者に対しても抗癌剤を投与することにもなり、分子薬剤の副作用の問題が注目されている。 Conventionally, anticancer agents that target specific molecular mechanisms of cancer and have a high response rate due to the development of molecular drugs have been marketed. On the other hand, targeting a specific molecular mechanism also means that an anticancer drug is administered to a patient whose mechanism is not effective, and the problem of side effects of molecular drugs has attracted attention.

一方、患者から得られた細胞を３次元的培養により生体中の細胞と同じような薬剤に対する感受性を得る方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
また、親水基と疎水基のアミノ酸の繰り返しからなるポリペプチドによって、細胞親和性の高いハイドロゲル（ペプチドマトリックス）を製造する方法も開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
また、細胞の有するＣＥＡなどの腫瘍マーカに対して蛍光を発する分子マーカも開示されている（例えば、特許文献３参照。）。
さらに、細胞中の酵素の活性度に応じて蛍光を発する分子色素も開示されている（例えば、特許文献４参照。）。
特許第２８７９９７８号明細書米国特許第５９５５３４３号明細書特表２００５−５０７６５９号公報国際公開第２００４／０７９３７０号パンフレット On the other hand, a method has been disclosed in which cells obtained from a patient are sensitized to a drug similar to cells in a living body by three-dimensional culture (see, for example, Patent Document 1).
In addition, a method for producing a hydrogel (peptide matrix) having high cell affinity using a polypeptide composed of repeating amino acids of a hydrophilic group and a hydrophobic group is also disclosed (for example, see Patent Document 2).
Further, a molecular marker that emits fluorescence with respect to a tumor marker such as CEA possessed by a cell is also disclosed (for example, see Patent Document 3).
Furthermore, a molecular dye that emits fluorescence according to the activity of an enzyme in a cell is also disclosed (see, for example, Patent Document 4).
Japanese Patent No. 2879978 US Pat. No. 5,955,343 JP 2005-507659 A International Publication No. 2004/079370 Pamphlet

上述した分子薬剤の副作用の問題を解決するために、患者個々のテーラーメイド医療を目指して、遺伝子多型（ＳＮＰｓ等）を用いた抗癌剤感受性予測の研究が行われている。しかしながら、この方法による場合には、抗癌剤の市販の後、多くの患者に使用され、その長期的予後の結果が出ることが必要で、恩恵を受けることができるまでに長時間を要するという問題がある。 In order to solve the above-mentioned problem of side effects of molecular drugs, research on anticancer drug susceptibility prediction using gene polymorphisms (SNPs and the like) has been conducted with the aim of tailor-made medical care for individual patients. However, this method has a problem in that it is used for many patients after the market of an anticancer drug, and the long-term prognostic result is required, and it takes a long time to receive the benefit. is there.

また、患者から得られた組織サンプルには癌細胞以外に繊維芽細胞等の他の多くの細胞が混入しているため、正確な結果を得るのが困難であるという問題もある。また、内視鏡下で得られる生検サンプル等の細胞数の絶対数が少ないものでは検査が困難であるという問題もある。 Another problem is that it is difficult to obtain accurate results because many other cells such as fibroblasts are mixed in the tissue sample obtained from the patient in addition to the cancer cells. In addition, there is also a problem that it is difficult to inspect a sample having a small absolute number of cells such as a biopsy sample obtained under an endoscope.

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、内視鏡生検サンプル等の少量のサンプルから、効率的に短時間で抗癌剤感受性を測定することができる抗癌剤感受性測定方法および抗癌剤感受性測定装置を提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and is an anticancer agent sensitivity measurement method and an anticancer agent sensitivity capable of efficiently measuring anticancer agent sensitivity from a small amount of sample such as an endoscopic biopsy sample in a short time. The object is to provide a measuring device.

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、癌細胞を含む生体組織から癌細胞を抽出するステップと、３次元スキャフォールドに癌細胞を播種するステップと、播種された癌細胞を増殖させるステップと、癌細胞に薬剤を供給するステップと、癌細胞の生存パラメータを測定するステップとを含む抗癌剤感受性測定方法を提供する。 In order to achieve the above object, the present invention provides the following means.
The present invention includes a step of extracting cancer cells from a biological tissue containing cancer cells, a step of seeding cancer cells in a three-dimensional scaffold, a step of growing the seeded cancer cells, and supplying a drug to the cancer cells There is provided a method for measuring sensitivity to an anticancer agent, comprising the steps of: measuring a survival parameter of a cancer cell.

本発明によれば、癌細胞を含む生体組織から癌細胞を抽出するので、生体組織内に含まれている繊維芽細胞等の他の細胞の影響を受けることなく正しい結果を得ることができる。また、３次元スキャフォールドに播種した癌細胞を用いるので、生体中の癌組織と同様の感受性を示す状態で測定を行うことができる。さらに、癌細胞を増殖させた後に測定するので少量のサンプルから測定を行うことができる。 According to the present invention, since cancer cells are extracted from a living tissue containing cancer cells, the correct result can be obtained without being influenced by other cells such as fibroblasts contained in the living tissue. Moreover, since the cancer cell seed | inoculated on the three-dimensional scaffold is used, it can measure in the state which shows the sensitivity similar to the cancer tissue in a biological body. Furthermore, since measurement is performed after cancer cells are grown, measurement can be performed from a small amount of sample.

上記発明においては、前記癌細胞抽出ステップが、癌細胞を含む生体組織に周期性のエネルギを加え、癌細胞を他の細胞から分離することとしてもよい。
この場合において、前記周期性のエネルギが、電気的エネルギであることとしてもよく、また、前記周期性のエネルギが、超音波エネルギであることとしてもよい。
このようにすることで、周期性のエネルギにより、生体組織から癌細胞を容易に分離することができる。 In the said invention, the said cancer cell extraction step is good also as adding a periodic energy to the biological tissue containing a cancer cell, and isolate | separating a cancer cell from another cell.
In this case, the periodic energy may be electrical energy, and the periodic energy may be ultrasonic energy.
By doing in this way, a cancer cell can be easily isolate | separated from a biological tissue with periodic energy.

また、上記発明においては、前記癌細胞抽出ステップおよび癌細胞播種ステップが、癌細胞を含む生体組織から細胞を分離し、親水基と疎水基のアミノ酸を繰り返したポリペプチドからなるハイドロゲルにより構成された３次元スキャフォールドの上面に、分離された細胞を播くことにより行われることとしてもよい。 In the above invention, the cancer cell extraction step and the cancer cell seeding step are constituted by a hydrogel comprising a polypeptide in which cells are separated from a biological tissue containing cancer cells and a hydrophilic group and a hydrophobic group of amino acids are repeated. Alternatively, it may be performed by seeding the separated cells on the upper surface of the three-dimensional scaffold.

癌細胞の浸食性と、他の正常細胞の浸食性の相違を利用して、癌細胞のみを選択的にハイドロゲルからなる３次元スキャフォールド内に浸食させることができ、これによって、癌細胞の抽出と癌細胞の３次元スキャフォールドへの播種とを同時に行うことができる。 By utilizing the difference between the erodibility of cancer cells and the erodibility of other normal cells, only cancer cells can be selectively eroded into a three-dimensional scaffold made of hydrogel, Extraction and seeding of cancer cells in a three-dimensional scaffold can be performed simultaneously.

また、上記発明においては、前記癌細胞播種ステップが、粉状あるいは液状のスキャフォールド原料と癌細胞とを混合し、その後、スキャフォールドをゲル化させることとしてもよい。
このようにすることで、癌細胞を３次元スキャフォールドの内部に容易に播種することができる。 Moreover, in the said invention, the said cancer cell seeding | mixing step is good also as mixing a powdery or liquid scaffold raw material and a cancer cell, and gelatinizing a scaffold after that.
In this way, cancer cells can be easily seeded inside the three-dimensional scaffold.

また、上記発明においては、前記癌細胞の生存パラメータが、癌特異性のある指標であることが好ましい。この場合、前記癌細胞の生存パラメータが、細胞から発せられる蛍光量であることとしてもよく、前記蛍光量が、細胞内の癌特性の高い酵素量に相関するものであることとしてもよい。
このようにすることで、癌細胞と他の細胞とが混合されている状態であっても癌細胞を特異的に検出できる。したがって、癌細胞抽出ステップにおいて癌細胞のみを抽出しきれない場合であっても測定精度を向上することができる。 Moreover, in the said invention, it is preferable that the survival parameter of the said cancer cell is a parameter | index with cancer specificity. In this case, the survival parameter of the cancer cell may be the amount of fluorescence emitted from the cell, or the amount of fluorescence may be correlated with the amount of enzyme having high cancer characteristics in the cell.
In this way, cancer cells can be specifically detected even when cancer cells and other cells are mixed. Therefore, even when only cancer cells cannot be extracted in the cancer cell extraction step, measurement accuracy can be improved.

また、上記発明においては、前記癌細胞の生存パラメータが、細胞の活性を示す量であることとしてもよく、その場合、前記癌細胞の生存パラメータが、酸素消費量またはグルコース消費量であることとしてもよい。
このようにすることで、癌細胞の生存状態を簡易に測定することができる。この場合においては、癌細胞および他の細胞の生存状態が同時に測定されてしまうことになるので、癌細胞抽出ステップにおいて十分に他の細胞を排除しておくことが必要となる。 In the above invention, the survival parameter of the cancer cell may be an amount indicating cell activity. In this case, the survival parameter of the cancer cell is an oxygen consumption amount or a glucose consumption amount. Also good.
By doing in this way, the survival state of a cancer cell can be measured easily. In this case, since the survival state of the cancer cell and other cells will be measured simultaneously, it is necessary to exclude other cells sufficiently in the cancer cell extraction step.

また、上記発明においては、癌細胞の生存パラメータを測定するステップが、薬剤投与の前後において行われ、両ステップにおいて測定された生存パラメータを比較するステップを備えることとしてもよい。
このようにすることで、比較ステップの結果に基づいて、抗癌剤の感受性をより効率的に測定することができる。 Moreover, in the said invention, the step which measures the survival parameter of a cancer cell is performed before and after drug administration, It is good also as providing the step which compares the survival parameter measured in both steps.
By doing in this way, the sensitivity of an anticancer agent can be measured more efficiently based on the result of the comparison step.

また、上記発明においては、癌細胞に薬剤を供給するステップが、投与量を異ならせて複数回行われ、測定された生存パラメータを投与量ごとに比較するステップを備えることとしてもよい。
このようにすることで、比較ステップの結果に基づいて、抗癌剤の投与量に対する感受性をより効率的に測定することができる。 Moreover, in the said invention, the step which supplies a chemical | medical agent to a cancer cell is good also as providing the step which is performed in multiple doses differently and compares the measured survival parameter for every dose.
By doing in this way, the sensitivity with respect to the dosage of an anticancer agent can be measured more efficiently based on the result of a comparison step.

また、本発明は、癌細胞を含む生体組織から癌細胞を抽出する細胞分離手段と、３次元スキャフォールドに癌細胞を播種する細胞播種手段と、播種された癌細胞を増殖させる細胞培養手段と、癌細胞に薬剤を供給し蛍光を検出する蛍光検出手段と、検出された蛍光に基づいて癌細胞の生存パラメータを測定する分析手段とを備える抗癌剤感受性測定装置を提供する。 The present invention also provides a cell separation means for extracting cancer cells from a biological tissue containing cancer cells, a cell seeding means for seeding cancer cells on a three-dimensional scaffold, and a cell culture means for growing the seeded cancer cells; An anticancer agent sensitivity measuring apparatus comprising a fluorescence detection means for supplying a drug to a cancer cell and detecting fluorescence and an analysis means for measuring a survival parameter of the cancer cell based on the detected fluorescence is provided.

上記発明においては、前記細胞播種手段が、ハイドロゲルにより構成された３次元スキャフォールドの内部または上面に癌細胞を播種することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記ハイドロゲルが、親水基のアミノ酸と疎水基のアミノ酸とを繰り返したポリペプチドからなることとしてもよい。 In the said invention, the said cell seeding means is good also as seed | inoculating a cancer cell in the inside or upper surface of the three-dimensional scaffold comprised by hydrogel.
Moreover, in the said invention, the said hydrogel is good also as consisting of the polypeptide which repeated the amino acid of the hydrophilic group and the amino acid of the hydrophobic group.

また、上記発明においては、前記ハイドロゲルが、コラーゲン由来ペプチドを含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、前記ハイドロゲルが、アルギン酸を含むこととしてもよい。 In the above invention, the hydrogel may contain a collagen-derived peptide.
In the above invention, the hydrogel may contain alginic acid.

また、上記発明においては、前記細胞播種装置が、ハイドロゲル素材をプレート上に複数のスポットとして設けたものであることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記細胞播種装置が、ハイドロゲル素材と癌細胞とを混合する混合手段と、該混合手段による混合物をプレートにスポッティングするスポッティング手段と、スポッティングされた混合物をゲル化するゲル化手段とを備えることとしてもよい。 Moreover, in the said invention, the said cell seeding apparatus is good also as what provided the hydrogel raw material as a some spot on a plate.
In the above invention, the cell seeding device comprises a mixing means for mixing the hydrogel material and cancer cells, a spotting means for spotting a mixture by the mixing means on a plate, and a gel for gelling the spotted mixture. It is good also as providing a conversion means.

また、上記発明においては、前記細胞培養手段が、癌特異性のある指標を被検体に導入し、前記蛍光検出手段が、被検体からの蛍光量を検出することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記指標の投与および蛍光の検出が、被検体への薬剤投与の前後において行われることとしてもよい。 In the above invention, the cell culture means may introduce an index having cancer specificity into the subject, and the fluorescence detection means may detect the amount of fluorescence from the subject.
Moreover, in the said invention, administration of the said parameter | index and detection of fluorescence are good also as being performed before and after the chemical | medical agent administration to a subject.

また、上記発明においては、同一の薬剤投与条件が複数のスポットに対して適用されることとしてもよい。
また、上記発明においては、規定量の癌細胞数が存在しないスポットを検出し、検出されたスポットを評価から除外することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記分析手段が、被検体への薬剤投与の前後における蛍光量を統計的に解析することで、薬剤の感受性の優先順位付けを行うこととしてもよい。 In the above invention, the same drug administration condition may be applied to a plurality of spots.
Moreover, in the said invention, it is good also as detecting the spot where the defined amount of cancer cell number does not exist, and excluding the detected spot from evaluation.
Moreover, in the said invention, the said analysis means is good also as prioritizing the sensitivity of a chemical | medical agent by analyzing the fluorescence amount before and behind the chemical | medical agent administration to a test object statistically.

本発明によれば、内視鏡生検サンプル等の少量のサンプルから、効率的に短時間で抗癌剤感受性を測定することができるという効果を奏する。 According to the present invention, it is possible to efficiently measure anticancer drug sensitivity from a small amount of sample such as an endoscopic biopsy sample in a short time.

以下、本発明の第１の実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法および抗癌剤感受性測定装置について、図１〜図４を参照して説明する。
本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法は、図１および図３に示されるように、癌細胞１を含む生体組織２から癌細胞１を抽出する抽出ステップＳ１と、３次元スキャフォールドに癌細胞１を播種する播種ステップＳ２と、播種された癌細胞１を増殖させる培養ステップＳ３と、癌細胞１に薬剤を供給する投与ステップＳ４と、癌細胞１の生存パラメータを測定する測定ステップＳ５とを含んでいる。 Hereinafter, an anticancer agent sensitivity measuring method and an anticancer agent sensitivity measuring device according to a first embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS.
As shown in FIGS. 1 and 3, the method for measuring sensitivity to an anticancer drug according to the present embodiment includes an extraction step S <b> 1 for extracting cancer cells 1 from a biological tissue 2 containing cancer cells 1, and cancer cells 1 in a three-dimensional scaffold. A seeding step S2 for seeding, a culture step S3 for growing the seeded cancer cells 1, an administration step S4 for supplying a drug to the cancer cells 1, and a measuring step S5 for measuring a survival parameter of the cancer cells 1. It is out.

前記抽出ステップＳ１は、図２に示されるように、例えば、内視鏡の生検鉗子等により採取された生検サンプル等の生体組織２から癌細胞１や正常細胞３を単離するステップＳ６と、単離された細胞１，３から癌細胞１のみを分離するステップＳ７とを備えている。 In the extraction step S1, as shown in FIG. 2, for example, a cancer cell 1 or a normal cell 3 is isolated from a biological tissue 2 such as a biopsy sample collected by an endoscopic biopsy forceps or the like. And step S7 for separating only the cancer cell 1 from the isolated cells 1 and 3.

細胞１，３を単離するステップＳ６は、図３に示されるように、例えば、コラゲナーゼ等の細胞外マトリクス分解酵素や、トリプシン等の細胞接着基の分解酵素を用いて行われる。生体組織２をこれらの分解酵素を含む溶液４中に浸漬して攪拌することにより、生体組織２から細胞１，３を単離することができる。 As shown in FIG. 3, step S6 for isolating cells 1 and 3 is performed using, for example, an extracellular matrix degrading enzyme such as collagenase, or a cell adhesion group degrading enzyme such as trypsin. The cells 1 and 3 can be isolated from the biological tissue 2 by immersing and stirring the biological tissue 2 in the solution 4 containing these degrading enzymes.

癌細胞１を分離するステップＳ７は、図４に示されるように、例えば、ＤＥＰ（Dielectrophoresis）技術を利用する（米国特許第６９３６１５１号明細書参照。）。すなわち、ＭＥＭＳ技術により作成したマイクロ電極５（図４（ａ）参照。）上に単離した細胞１，３を持つ細胞懸濁液を載せて（図４（ｂ）参照。）、周期的な電界エネルギを付与することにより、細胞１，３の電界に対する周波数応答性の違いを利用して癌細胞１のみを電極に付着させ、その他の細胞３を緩やかな緩衝液流で流すことで分離することができるようになっている。ＤＥＰ技術を用いることで、色素や磁気ビーズ等を細胞１，３に着脱する等の前処理が不要であり、一度に多量の細胞１，３を処理できるという利点がある。 Step S7 for separating the cancer cell 1 uses, for example, DEP (Dielectrophoresis) technology (see US Pat. No. 6,936,151) as shown in FIG. That is, the cell suspension having the isolated cells 1 and 3 is placed on the microelectrode 5 (see FIG. 4A) prepared by the MEMS technique (see FIG. 4B), and periodically. By applying the electric field energy, the cancer cells 1 are attached to the electrodes using the difference in frequency response to the electric fields of the cells 1 and 3, and the other cells 3 are separated by flowing with a gentle buffer solution. Be able to. By using the DEP technique, there is an advantage that a pretreatment such as attaching and detaching a dye or a magnetic bead to the cells 1 and 3 is unnecessary, and a large amount of cells 1 and 3 can be processed at a time.

細胞１，３の大きさ等に応じて分離するために必要とされる周波数が異なる。例えば、乳癌細胞１を分離するためには、２００ｋＨｚの周波数を電界を加えることが望ましい。
なお、ＤＥＰ技術に代えて、超音波エネルギにより癌細胞１を分離することとしてもよい。例えば、図５および図６に示されるようにピエゾ素子の間に、細胞１，３を持つ細胞懸濁液を載せ、例えば、１．２ＭＨｚ程度の超音波を発生させると、超音波の定常波に沿って細胞１，３が線状に分離して集合する。その細胞１，３を、例えば、MicroFluidicsで分取することにより、癌細胞１を分離できる。 The frequency required for separation differs depending on the size of the cells 1 and 3. For example, in order to separate the breast cancer cells 1, it is desirable to apply an electric field with a frequency of 200 kHz.
In place of the DEP technique, the cancer cells 1 may be separated by ultrasonic energy. For example, as shown in FIGS. 5 and 6, when a cell suspension having cells 1 and 3 is placed between piezo elements and an ultrasonic wave of about 1.2 MHz is generated, for example, an ultrasonic standing wave is generated. Along the cells 1 and 3, the cells 1 and 3 are separated and gathered in a line. The cancer cells 1 can be separated by sorting the cells 1 and 3 with, for example, MicroFluidics.

前記播種ステップＳ２は、３次元スキャフォールドを構成するスキャフォールド原料と、抽出された癌細胞１とを混合した後に、スキャフォールド原料をゲル化させることにより行われる。スキャフォールド原料としては、粉状または液状のものを使用することで、癌細胞１との混合を容易にし、ゲル化させた状態で３次元スキャフォールドの内部に均一に癌細胞１を分散させることができる。 The seeding step S2 is performed by mixing the scaffold raw material constituting the three-dimensional scaffold and the extracted cancer cells 1 and then gelling the scaffold raw material. As the scaffold material, powder or liquid material is used to facilitate mixing with cancer cells 1 and to uniformly disperse cancer cells 1 within the three-dimensional scaffold in a gelled state. Can do.

スキャフォールド原料としては、ペプチドマトリックス、コラーゲンまたはアルギン酸を挙げることができる。ペプチドマトリックスは、塩を含む培地を加えることにより、コラーゲンは昇温することにより、アルギン酸はカルシウムイオンを添加することによりそれぞれ容易にゲル化するので、癌細胞１を均一に含有する３次元スキャフォールドを容易に構成することができる。 Examples of the scaffold raw material include a peptide matrix, collagen, or alginic acid. The peptide matrix is easily gelled by adding a salt-containing medium, raising the temperature of collagen, and adding alginic acid by adding calcium ions, so that a three-dimensional scaffold containing cancer cells 1 uniformly. Can be configured easily.

前記培養ステップＳ３は、上記のようにして構成された癌細胞１を含む３次元スキャフォールドを所定の培養条件下に維持することにより、癌細胞１を増殖させるものである。これにより、内視鏡的に採取された生検サンプルのように細胞１，３の絶対数が少ないものであっても、増殖により必要細胞数まで増加させることができ、測定精度を向上することができる。
なお、培養ステップＳ３は、３次元スキャフォールドをマイクロウェルアレイに収容した状態で行うことが好ましい。 In the culturing step S3, the cancer cell 1 is propagated by maintaining the three-dimensional scaffold containing the cancer cell 1 configured as described above under predetermined culture conditions. As a result, even if the absolute number of cells 1 and 3 is small, such as a biopsy sample collected endoscopically, the number of cells can be increased by proliferation and the measurement accuracy can be improved. Can do.
In addition, it is preferable to perform culture | cultivation step S3 in the state which accommodated the three-dimensional scaffold in the microwell array.

前記投与ステップＳ４は、マイクロウェルアレイの各ウェルに収容された３次元スキャフォールドに対して、異種／異用量の抗癌剤を添加することにより行われる。
前記測定ステップＳ５は、例えば、細胞培養培地に、癌のマーカであるＣＥＡに対する抗体に蛍光色素を結合したものを添加し、一定時間の後に色素のない培地で洗浄する。これにより、細胞表面のマーカと抗体とが結合して、癌細胞が特異的に蛍光を発するようになる。あるいは、癌細胞１内部に多く存在するプロテアゾーム等の酵素の活性量に応じた蛍光を発する分子プローブを培地に添加し、一定の時間で酵素による反応を起こすことができる。これらのような分子プローブの抗癌剤投与前の蛍光量と、抗癌剤投与後の蛍光量とを測定する。そして、抗癌剤投与前後の蛍光量を比較することにより、抗癌剤投与による癌細胞１の数の変化を確認することができ、これによって、抗癌剤の感受性を測定することができる。 The administration step S4 is performed by adding different / different doses of anticancer agents to the three-dimensional scaffold accommodated in each well of the microwell array.
In the measurement step S5, for example, a cell culture medium is added with an antibody against CEA, which is a cancer marker, and a fluorescent dye bound thereto, and washed with a medium without the dye after a certain time. Thereby, the marker on the cell surface and the antibody bind to each other, and the cancer cell emits fluorescence specifically. Alternatively, a molecular probe that emits fluorescence in accordance with the amount of activity of an enzyme such as proteasome present in the cancer cell 1 in a large amount can be added to the medium, and the reaction by the enzyme can be caused in a certain time. The amount of fluorescence of these molecular probes before administration of the anticancer agent and the amount of fluorescence after administration of the anticancer agent are measured. And the change of the number of the cancer cells 1 by anticancer agent administration can be confirmed by comparing the fluorescence amount before and behind administration of an anticancer agent, and thereby the sensitivity of an anticancer agent can be measured.

このように、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法によれば、抽出ステップＳ１によって生体組織２中の癌細胞１を選択的に抽出するので、他の正常細胞３の影響を受けることなく抗癌剤の感受性を精度よく測定することができる。
また、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法によれば、播種ステップＳ２によって、３次元スキャフォールド内に癌細胞１を均一に混合した状態に播種するので、細胞培養プレートなど、平面に播種・培養した場合と異なり、癌細胞１を生体内と同様の状態に保持することができ、抗癌剤の感受性をより正しく評価することができる。
また、この方法は、浮遊細胞や、神経細胞や肝細胞など、平面培養での維持が難しい細胞に対しても、同様に適用することができる。 Thus, according to the anticancer agent sensitivity measuring method according to the present embodiment, the cancer cell 1 in the biological tissue 2 is selectively extracted by the extraction step S1, so that the anticancer agent is not affected by other normal cells 3. Sensitivity can be accurately measured.
Moreover, according to the anticancer drug sensitivity measuring method according to the present embodiment, since the cancer cells 1 are seeded in a uniformly mixed state in the three-dimensional scaffold by the seeding step S2, sowing and culturing on a flat surface such as a cell culture plate. Unlike the case, the cancer cell 1 can be maintained in the same state as in the living body, and the sensitivity of the anticancer agent can be more correctly evaluated.
This method can also be applied to cells that are difficult to maintain in planar culture, such as floating cells, nerve cells, and hepatocytes.

また、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法によれば、培養ステップＳ３によって、３次元スキャフォールド内において癌細胞１を増殖させた後に、抗癌剤を投与するので、内視鏡による生検サンプルのように少量の生体組織２によっても、抗癌剤の感受性を正しく評価することが可能となる。 Moreover, according to the anticancer drug sensitivity measurement method according to the present embodiment, since the anticancer drug is administered after the cancer cells 1 are grown in the three-dimensional scaffold by the culture step S3, it is like a biopsy sample by an endoscope. Even with a small amount of living tissue 2, the sensitivity of the anticancer agent can be correctly evaluated.

さらに、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法によれば、測定ステップＳ５が、分子プローブのように、癌細胞１に特異的な指標を用いるので、抽出ステップＳ１によって分離しきれない正常細胞３が存在しても、精度よく抗癌剤の感受性を評価することができる。
したがって、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法によれば、少量のサンプルから、効率的に短時間で抗癌剤の感受性を測定することができるという効果がある。 Furthermore, according to the anticancer drug sensitivity measurement method according to the present embodiment, since the measurement step S5 uses an index specific to the cancer cell 1 like a molecular probe, normal cells 3 that cannot be separated by the extraction step S1 are detected. Even if it exists, it is possible to accurately evaluate the sensitivity of the anticancer agent.
Therefore, according to the anticancer drug sensitivity measurement method according to the present embodiment, there is an effect that the sensitivity of the anticancer drug can be efficiently measured in a short time from a small amount of sample.

なお、本実施形態においては、ＤＥＰ技術により、癌細胞１のみを分離抽出することとしたが、分子プローブによって抗癌剤の感受性を測定するので、抽出ステップＳ１を遠心分離による細胞分画の取得のような、さらに簡略な手法によって実施することとしてもよい。 In the present embodiment, only the cancer cell 1 is separated and extracted by the DEP technique. However, since the sensitivity of the anticancer agent is measured by the molecular probe, the extraction step S1 is performed by obtaining a cell fraction by centrifugation. Further, it may be performed by a simpler technique.

また、測定ステップＳ５として分子プローブのように癌細胞１に特異的な指標を用いたが、これに代えて、細胞１，３の活性を示す量の測定により、抗癌剤の感受性を評価することにしてもよい。細胞１，３の活性を示す量としては、例えば、細胞培養環境内における酸素消費量、グルコース消費量等を挙げることができる。酸素消費量については、培養培地中の酸素濃度から演算で求めることができる。また、細胞１，３の活性度に応じてＤＥＰ技術における周波数特性が変化することを利用して細胞１，３の活性度を測定してもよい。また、単純に細胞数を計数することにより細胞１，３の活性を測定してもよい。 In addition, as a measurement step S5, an index specific to the cancer cell 1 such as a molecular probe was used, but instead, the sensitivity of the anticancer agent was evaluated by measuring the amount of activity of the cells 1 and 3. May be. Examples of the amount showing the activity of the cells 1 and 3 include oxygen consumption and glucose consumption in the cell culture environment. The oxygen consumption can be obtained by calculation from the oxygen concentration in the culture medium. Moreover, you may measure the activity of the cells 1 and 3 using the change of the frequency characteristic in DEP technique according to the activity of the cells 1 and 3. Moreover, you may measure the activity of the cells 1 and 3 by simply counting the number of cells.

これらの場合には、癌細胞１のみならず正常細胞３の活性度も測定されてしまうので、抽出ステップＳ１において癌細胞１のみを抽出でき、他の正常細胞３等が含有されない状態で行うことが効果的である。 In these cases, the activity of not only the cancer cell 1 but also the normal cell 3 is measured, so that only the cancer cell 1 can be extracted in the extraction step S1, and other normal cells 3 and the like are not contained. Is effective.

図７に、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定装置１０を示す。
本実施形態に係る抗癌剤感受性測定装置１０は、細胞分離手段１１、細胞播種手段１２、培養手段１３、蛍光検出手段１４および分析手段１５を備えている。蛍光検出手段１４は、蛍光撮像装置１４ａと画像処理手段１４ｂとを備えている。 FIG. 7 shows an anticancer drug sensitivity measuring apparatus 10 according to this embodiment.
The anticancer drug sensitivity measuring apparatus 10 according to the present embodiment includes a cell separation unit 11, a cell seeding unit 12, a culture unit 13, a fluorescence detection unit 14, and an analysis unit 15. The fluorescence detection means 14 includes a fluorescence imaging device 14a and an image processing means 14b.

図８（ａ）〜（ｄ）に、本実施形態に係る抗癌剤感受性測定装置１０で用いられるマイクロアレイプレート１６の一例を示す。
図８（ａ）は、マイクロアレイプレート１６の平面図、図８（ｂ）は、図８（ａ）の矢印Ａ方向に見たＡ−Ａ断面図、図８（ｃ）は、図８（ａ）の矢印Ｂ方向に見たＢ−Ｂ断面図である。 FIGS. 8A to 8D show an example of the microarray plate 16 used in the anticancer drug sensitivity measuring apparatus 10 according to the present embodiment.
8A is a plan view of the microarray plate 16, FIG. 8B is a cross-sectional view taken along line AA in the direction of arrow A in FIG. 8A, and FIG. 8C is FIG. It is a BB sectional view seen in the direction of arrow B.

マイクロアレイプレート１６には、培地、洗浄用の緩衝液、抗癌剤溶液、蛍光分子イメージング色素溶液などを導入するためのウェル１７が設けられている。
各ウェル１７には、前述のハイドロゲルを設置するためのスポットＳＰ１〜ＳＰ５が設けられている。スポットＳＰ１〜ＳＰ５は、図８（ｂ）のようにゲルＧをウェル１７に設けられた穴に埋入してもよい。 The microarray plate 16 is provided with a well 17 for introducing a culture medium, a washing buffer solution, an anticancer agent solution, a fluorescent molecular imaging dye solution, and the like.
Each well 17 is provided with spots SP1 to SP5 for installing the aforementioned hydrogel. In the spots SP1 to SP5, the gel G may be embedded in a hole provided in the well 17 as shown in FIG.

図８（ｃ）に示されるように、ウェル１７内の複数のスポットＳＰ１〜ＳＰ５に対して、同一の抗癌剤など同条件で培地・薬剤等の溶液Ｃを供給できる。
また、初期培養・蛍光分子イメージングマーカを含んだ培地での培養時、洗浄時など、全体を同一の条件で培地等の溶液Ｃを提供したい場合には、図８（ｄ）に示されるように、マイクロアレイプレート１６の上部に設けられた培地受けに供給することもできる。これにより、簡便に一度に溶液Ｃの提供・交換を行うことができる。 As shown in FIG. 8C, a solution C such as a medium / drug can be supplied to the plurality of spots SP1 to SP5 in the well 17 under the same conditions such as the same anticancer drug.
Further, when it is desired to provide a solution C such as a medium under the same conditions such as initial culture and culture in a medium containing a fluorescent molecular imaging marker, or washing, as shown in FIG. In addition, it can be supplied to a medium receiver provided on the top of the microarray plate 16. Thereby, the solution C can be provided and exchanged easily at once.

なお、図９（ａ）〜（ｃ）に示されるように、ウェル１７内に直接ゲルＧを配置してもよい。この場合にはゲルＧの配置部分のみにガスプラズマ処理などによりハイドロゲルの接着性を向上させる加工を行うと、スポットＳＰ１〜ＳＰ５を安定に保持できる。このように構成しても、図９（ｂ）に示されるように、ウェル１７内の複数のスポットＳＰ１〜ＳＰ５に対して、同一の抗癌剤など同条件で培地・薬剤等の溶液Ｃを供給できる。また、初期培養・蛍光分子イメージングマーカを含んだ培地での培養時、洗浄時など、全体を同一の条件で培地等の溶液Ｃを提供したい場合には、図９（ｃ）に示されるように、ウェル１７の上部に設けられた培地受けに供給することもでき、これにより、簡便に一度に溶液Ｃの提供・交換を行うことができる。 Note that, as shown in FIGS. 9A to 9C, the gel G may be arranged directly in the well 17. In this case, the spots SP1 to SP5 can be stably held by performing processing for improving the adhesion of the hydrogel only by the gas plasma treatment or the like only on the portion where the gel G is disposed. Even if comprised in this way, as shown in FIG.9 (b), the solutions C, such as a culture medium and a chemical | medical agent, can be supplied with respect to several spot SP1-SP5 in the well 17 on the same conditions, such as the same anticancer agent. . Further, when it is desired to provide the solution C such as a medium under the same conditions, such as during initial culture / culture in a medium containing a fluorescent molecular imaging marker or during washing, as shown in FIG. The solution C can also be supplied to the medium receiver provided in the upper part of the well 17, whereby the solution C can be provided and exchanged easily at once.

前記細胞分離手段１１は、図１０に示されるように、組織洗浄手段１８と、組織破砕手段１９と、分離手段２０と、細胞数検出手段２１とを備えている。
組織洗浄手段１８は、組織を緩衝液などで洗浄を行う。組織破砕手段１９は、組織にコラゲナーゼなどの細胞外マトリクス分解酵素液を加え、回転刃などで組織を細分する。酵素分解に適した温度に一定時間保持する。 As shown in FIG. 10, the cell separation means 11 includes a tissue cleaning means 18, a tissue crushing means 19, a separation means 20, and a cell number detection means 21.
The tissue cleaning means 18 cleans the tissue with a buffer solution or the like. The tissue crushing means 19 adds an extracellular matrix degrading enzyme solution such as collagenase to the tissue, and subdivides the tissue with a rotary blade or the like. Hold at a temperature suitable for enzymatic degradation for a certain period of time.

分離手段２０は、図１１に示されるように、１０μｍ以上の穴を有するメッシュ２２ａを有するフィルタ２２と遠心チューブ２３と、図示しない遠心分離機とからなる。符号２４は蓋である。そして、図１２に示されるように、（ａ）フィルタ２２に組織分解液Ｄを導入し、（ｂ）組織繊維成分Ｅをフィルタ２２でろ過し、細胞成分を含む細胞濃縮液Ｆを遠心分離機で遠心チューブ２３に捉え、分離液Ｈを分離するようになっている。
細胞数検出手段２１は、細胞濃縮液Ｆ中の生細胞数または癌細胞数に対応する量を、蛍光量等により検出する。生細胞数は、Calcein AMなどで蛍光染色することで計測できる。癌細胞数は、前述の分子イメージングマーカを用いることができる。 As shown in FIG. 11, the separating means 20 includes a filter 22 having a mesh 22a having holes of 10 μm or more, a centrifugal tube 23, and a centrifuge not shown. Reference numeral 24 denotes a lid. Then, as shown in FIG. 12, (a) the tissue decomposition solution D is introduced into the filter 22, (b) the tissue fiber component E is filtered through the filter 22, and the cell concentrate F containing the cell components is centrifuged. In this way, the separation liquid H is separated by capturing in the centrifuge tube 23.
The cell number detection means 21 detects the amount corresponding to the number of living cells or cancer cells in the cell concentrate F by the amount of fluorescence or the like. The number of viable cells can be measured by fluorescent staining with Calcein AM or the like. The above-mentioned molecular imaging marker can be used for the number of cancer cells.

細胞播種手段１２は、図１３に示されるように、ハイドロゲル素材混合手段２５と、スポッティング手段２６と、ゲル化手段２７とを備えている。
ハイドロゲル素材混合手段２５は、細胞分離手段１１で得られた細胞濃縮液Ｆを、培地や、ショ糖等浸透圧溶液などの細胞保護液に再懸濁し、アルギン酸溶液、自己組織化ポリペプチド溶液などの高粘度ハイドロゲル素材と混合する。細胞濃度は、細胞分離手段の細胞数検出手段から得られた細胞数により一定の範囲に規格化される。 As shown in FIG. 13, the cell seeding means 12 includes a hydrogel material mixing means 25, a spotting means 26, and a gelling means 27.
The hydrogel material mixing means 25 resuspends the cell concentrate F obtained by the cell separation means 11 in a cell protection solution such as a medium or an osmotic solution such as sucrose, and then alginate solution or self-assembled polypeptide solution. Mix with high viscosity hydrogel material such as. The cell concentration is normalized to a certain range by the number of cells obtained from the cell number detection means of the cell separation means.

スポッティング手段２６は、ピエゾによるインクジェット機構などにより、ハイドロゲル素材細胞混合液をマイクロアレイプレート１６のウェル１７内の所定の位置にスポッティングする。
ゲル化手段２７は、ウェル１７に静かにゲル化溶液を導入し、スポットＳＰ１〜ＳＰ５をゲル化する。アルギン酸の場合カルシウムイオンの添加された培地を加える。自己組織化ポリペプチドの場合、塩を含む培地を加える。特に自己組織化ポリペプチドの場合、ペプチド溶液の酸性度が高いため、所定時間（例えば、３０分）後に、培地の交換を行うと、ゲルＧ自身のｐＨを早く中性に近づけることができる。 The spotting means 26 spots the hydrogel material cell mixed solution at a predetermined position in the well 17 of the microarray plate 16 by an inkjet mechanism using a piezo.
The gelling means 27 gently introduces a gelling solution into the well 17 and gels the spots SP1 to SP5. In the case of alginic acid, a medium supplemented with calcium ions is added. For self-assembling polypeptides, a medium containing salt is added. In particular, in the case of a self-assembled polypeptide, since the acidity of the peptide solution is high, the pH of the gel G itself can be brought close to neutral quickly by exchanging the medium after a predetermined time (for example, 30 minutes).

例えば、２ｍｍ程度の大きさの生検サンプルには、最大で２Ｘ１０７個程度の細胞が存在する。この内５％を癌細胞１として分離できるとすれば、１０６個程度の癌細胞１が得られる。検出方法によるが、各スポットＳＰ１〜ＳＰ５に１００個程度の癌細胞１を検出の下限とすれば、最大で１００００個のスポットＳＰ１〜ＳＰ５を作成することが可能である。 For example, in a biopsy sample with a size of about 2 mm, there are about 2 × 10 7 cells at the maximum. If 5% of these can be separated as cancer cells 1, about 106 cancer cells 1 are obtained. Depending on the detection method, if about 100 cancer cells 1 are used as the lower limit of detection in each of the spots SP1 to SP5, a maximum of 10,000 spots SP1 to SP5 can be created.

また、細胞をハイドロゲル素材に混合せず、ハイドロゲル素材のみでスポッティングし、ゲル化手段２７でゲル化した後、細胞縣濁液をウェル１７に導入して、細胞のゲルＧへ付着および進展させても良い。 In addition, the cells are spotted only with the hydrogel material without being mixed with the hydrogel material, and after gelation with the gelation means 27, the cell suspension is introduced into the well 17 to adhere and propagate to the gel G of the cell. You may let them.

図１４（ａ）に蛍光撮像装置１４ａの構成を示す。蛍光撮像装置１４ａは光源２８、光源２８の上方に設置されたマイクロアレイプレート１６からの蛍光を撮像する蛍光カメラ２９を備えている。光源２８は発光体２８ａと励起光の波長のみを通過させる励起光フィルタ２８ｂを備える。蛍光カメラ２９は、励起光の波長をカットする励起光カットフィルタ２９ａ、結像レンズ２９ｂ、蛍光波長に感度を持つＣＣＤなどの撮像素子２９ｃを備えている。 FIG. 14A shows the configuration of the fluorescence imaging device 14a. The fluorescence imaging device 14 a includes a light source 28 and a fluorescence camera 29 that images fluorescence from the microarray plate 16 installed above the light source 28. The light source 28 includes a light emitter 28a and an excitation light filter 28b that passes only the wavelength of the excitation light. The fluorescent camera 29 includes an excitation light cut filter 29a that cuts the wavelength of the excitation light, an imaging lens 29b, and an imaging element 29c such as a CCD that is sensitive to the fluorescence wavelength.

この蛍光撮像装置１４ａとしては、点光源および点蛍光検出装置を対向して設け、スポットＳＰ１〜ＳＰ５ごとに走査を行っても良い。また、ライン光源およびライン蛍光検出装置を設け、マイクロアレイプレート１６を一方向に走査しても良い。 As this fluorescence imaging device 14a, a point light source and a point fluorescence detection device may be provided facing each other, and scanning may be performed for each of the spots SP1 to SP5. Further, a line light source and a line fluorescence detection device may be provided to scan the microarray plate 16 in one direction.

図１４（ｂ）に撮像された蛍光画像例を示す。画像処理手段１４ｂにより、各スポット（ＳＰ１（Ａ）〜ＳＰ５（Ｅ））に対応する画素値を積算、平均して、各スポットＳＰ１（Ａ）〜ＳＰ５（Ｅ）の蛍光量を演算する。正確な蛍光分子イメージングマーカからの蛍光量を算出するために、蛍光分子イメージングマーカ投与前に蛍光画像を撮像し、バックグラウンドの蛍光量を測定しておくとより良い。 FIG. 14B shows an example of a captured fluorescence image. The image processing means 14b integrates and averages the pixel values corresponding to each spot (SP1 (A) to SP5 (E)), and calculates the fluorescence amount of each spot SP1 (A) to SP5 (E). In order to accurately calculate the fluorescence amount from the fluorescent molecule imaging marker, it is better to capture a fluorescence image and measure the background fluorescence amount before administration of the fluorescent molecule imaging marker.

培養手段１３、蛍光検出手段１４および分析手段１５による評価方法のフローを図１５に示す。
まず、増殖培地をマイクロアレイプレート１６に導入し、規定時間培養を行う（Ｓ１１）。次いで、蛍光分子イメージングマーカを含む培地マイクロアレイプレートに導入し、規定時間培養する（Ｓ１２）。 FIG. 15 shows a flow of an evaluation method using the culture means 13, the fluorescence detection means 14, and the analysis means 15.
First, the growth medium is introduced into the microarray plate 16 and cultured for a specified time (S11). Subsequently, it introduce | transduces into the culture medium microarray plate containing a fluorescent molecule imaging marker, and culture | cultivates for a defined time (S12).

そして、蛍光分子イメージングマーカを含まない緩衝液で洗浄し、分子イメージングマーカを含まない培地に変更する（Ｓ１３）。その後、蛍光検出手段でマイクロアレイプレートを観察する（Ｓ１４）。 And it wash | cleans with the buffer solution which does not contain a fluorescent molecular imaging marker, and changes to the culture medium which does not contain a molecular imaging marker (S13). Thereafter, the microarray plate is observed with the fluorescence detection means (S14).

蛍光により、規定以上の蛍光が得られたスポットが規定数以上になったかどうか確認し（Ｓ１５）、規定以上の蛍光が得られたスポットの番地（Ａ１等）を記録する（Ｓ１６）。その後、規定数以上のスポットに対して所定の抗癌剤を所定の濃度で添加した培地を添加する。このとき、同一の条件に対して、所定の複数のスポットを割り当てる。そして、番地と抗癌剤の種類・濃度の関係を記録する（Ｓ１７）。 It is confirmed whether or not the number of spots where fluorescence exceeding the specified level has been obtained by the fluorescence exceeds the specified number (S15), and the address (A1 etc.) of the spot where fluorescence exceeding the specified level is obtained is recorded (S16). Thereafter, a medium to which a predetermined anticancer agent is added at a predetermined concentration is added to a predetermined number of spots or more. At this time, a predetermined plurality of spots are assigned to the same condition. Then, the relationship between the address and the type / concentration of the anticancer agent is recorded (S17).

このステップＳ１７は、図８（ｂ）に示されるマイクロアレイに対し、表１に示されるように各ウェルに所定の抗癌剤を所定の濃度で添加することで行う。この時、各ウェルに対応するスポットＳＰ１〜ＳＰ５（図８（ｂ）では５個）の内、所定数（例えば、３個）が規定の蛍光値（ここでは５０とする。）に達しない場合、そのウェルは使用しない。 This step S17 is performed by adding a predetermined anticancer agent at a predetermined concentration to each well as shown in Table 1 with respect to the microarray shown in FIG. 8B. At this time, a predetermined number (for example, 3) of the spots SP1 to SP5 (five in FIG. 8B) corresponding to each well does not reach a prescribed fluorescence value (here, 50). Do not use the well.

次いで、所定時間抗癌剤を含む培地で培養した後、抗癌剤を含まない緩衝液で洗浄し、増殖培地で培養を行う（Ｓ１８）。
規定時間経過後、蛍光分子イメージングマーカを含む培地で規定時間培養する（Ｓ１９）。そして、蛍光分子イメージングマーカを含まない緩衝液で洗浄し、分子イメージングマーカを含まない培地に変更する（Ｓ２０）。 Next, after culturing in a medium containing an anticancer agent for a predetermined time, it is washed with a buffer solution not containing an anticancer agent and cultured in a growth medium (S18).
After the lapse of the specified time, the cells are cultured for a specified time in a medium containing a fluorescent molecular imaging marker (S19). And it wash | cleans with the buffer solution which does not contain a fluorescent molecular imaging marker, and changes to the culture medium which does not contain a molecular imaging marker (S20).

その後、蛍光でウェルを観察し、蛍光強度を記録する（Ｓ２１）。ステップＳ１７で記録された抗癌剤の種類・濃度の関係を基準としてステップＳ２１で記録された蛍光強度を評価する（Ｓ２２）。 Thereafter, the well is observed with fluorescence, and the fluorescence intensity is recorded (S21). The fluorescence intensity recorded in step S21 is evaluated based on the relationship between the type and concentration of the anticancer agent recorded in step S17 (S22).

ステップＳ１９〜Ｓ２２は、例えば、表２に示されるように実施される。 Steps S19 to S22 are performed as shown in Table 2, for example.

初期蛍光値が基準値５０以下の場合、そのデータは棄却され、同一条件の他のデータのみが統計的処理に用いられる。 If the initial fluorescence value is less than or equal to the reference value 50, the data is rejected and only other data with the same conditions is used for statistical processing.

そして、同一の条件に属するスポットのデータに対して、統計処理を行い、優先順位づけを行う（Ｓ１３）。
表３では、単純に蛍光値の比を増殖率とみなして、増殖率の小さいものを選択しているが、当然統計検定等を利用して、コントロールからの有意差を算出しても良い。 Then, statistical processing is performed on the spot data belonging to the same condition, and priorities are assigned (S13).
In Table 3, the ratio of fluorescence values is simply regarded as the growth rate, and the growth rate is small, but a significant difference from the control may be calculated using a statistical test or the like.

次に、本発明の第２の実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法について、図１６および図１７を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。 Next, the anticancer agent sensitivity measuring method according to the second embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS.
In the description of the present embodiment, the same reference numerals are assigned to portions having the same configuration as that of the first embodiment described above, and the description thereof is omitted.

本実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法は、図１６に示されるように、第１の実施形態における抽出ステップＳ１、播種ステップＳ２および培養ステップＳ３に代えて、抽出・播種・培養ステップＳ３０を備えている点で第１の実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法と相違している。
この抽出・播種・培養ステップＳ３０は、生検サンプル等の生体組織２から第１の実施形態と同様にして細胞１，３を単離した後に、図１７（ａ）に示されるように親水基と疎水基のアミノ酸の繰り返しからなるポリペプチドを用いて構成したペプチドマトリックスゲルＧをマイクロアレイプレート１６の各ウェル１７内に収容しておき、該ペプチドマトリックスゲルＧの上面に、単離された細胞１，３を載置することにより行われる。 As shown in FIG. 16, the anticancer drug sensitivity measurement method according to the present embodiment includes an extraction / seed / culture step S30 in place of the extraction step S1, the seeding step S2 and the culture step S3 in the first embodiment. This is different from the anticancer drug sensitivity measurement method according to the first embodiment.
In this extraction / seed / cultivation step S30, the cells 1 and 3 are isolated from the biological tissue 2 such as a biopsy sample in the same manner as in the first embodiment, and then the hydrophilic group as shown in FIG. And a peptide matrix gel G composed of a polypeptide consisting of repeating amino acids of a hydrophobic group is housed in each well 17 of the microarray plate 16, and the isolated cells 1 are formed on the upper surface of the peptide matrix gel G. , 3 is carried out.

癌細胞１は、他の正常細胞３と比較して浸食性が高いため、図１７（ｂ）に示されるように、培養される間にペプチドマトリックスゲルＧ内に進展していく。一方、他の正常細胞３はペプチドマトリックスゲルＧの上面に残される。特に、ペプチドマトリックスゲルＧの場合、含水率が９９〜９９．５％と極めて高く柔らかいため、癌細胞１のペプチドマトリックスゲルＧ内部への進展が容易であり、十分に深部まで進展することができる。
その結果、癌細胞１のみがペプチドマトリックスゲルＧ内に進展して播種された状態の３次元スキャフォールドを構成することができ、他の細胞３を分離除去することができる。 Since the cancer cell 1 is more erodible than the other normal cells 3, as shown in FIG. 17 (b), it progresses into the peptide matrix gel G during the culture. On the other hand, other normal cells 3 remain on the upper surface of the peptide matrix gel G. In particular, in the case of the peptide matrix gel G, the moisture content is extremely high, 99 to 99.5%, so that it is easy to progress into the peptide matrix gel G of the cancer cells 1 and can sufficiently progress to the deep part. .
As a result, it is possible to form a three-dimensional scaffold in which only the cancer cells 1 are propagated and seeded in the peptide matrix gel G, and other cells 3 can be separated and removed.

このペプチドマトリックスゲル以外に、コラーゲンゲル、ゼラチンゲルやアルギン酸ゲルなどのゲルを用いても同様に実施できる。
また、第１の実施形態のように３次元的に播種した場合でも、ペプチドマトリックスゲル、ゼラチンゲルあるいはアルギン酸ゲルのような生物学的シグナルが少ないゲルを用いて培養した場合、マトリックスからの生物学的シグナルが必要な正常細胞に対して、癌細胞の増殖が相対的に高いために、同様な効果を得ることができる。 In addition to the peptide matrix gel, a gel such as collagen gel, gelatin gel or alginic acid gel can be used in the same manner.
Further, even when seeded three-dimensionally as in the first embodiment, when cultured using a gel having a low biological signal such as peptide matrix gel, gelatin gel, or alginic acid gel, biology from the matrix Similar effects can be obtained because the growth of cancer cells is relatively high compared to normal cells that require a specific signal.

このように本実施形態によれば、第１の実施形態における抽出ステップＳ１、播種ステップＳ２および培養ステップＳ３を同時に行うことができ、さらに簡易に抗癌剤の感受性の測定を行うことができるという利点がある。 As described above, according to this embodiment, the extraction step S1, the seeding step S2 and the culture step S3 in the first embodiment can be performed simultaneously, and the sensitivity of the anticancer agent can be easily measured. is there.

本発明の第１の実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the anticancer agent sensitivity measuring method which concerns on the 1st Embodiment of this invention. 図１の抗癌剤感受性測定方法の抽出ステップを示すブロック図である。It is a block diagram which shows the extraction step of the anticancer agent sensitivity measuring method of FIG. 図１の抗癌剤感受性測定方法の単離ステップを示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the isolation step of the anticancer agent sensitivity measuring method of FIG. 図１の抗癌剤感受性測定方法の分離ステップを示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the isolation | separation step of the anticancer agent sensitivity measuring method of FIG. 図４の分離ステップに代えて、超音波を利用した分離ステップを示す斜視図である。FIG. 5 is a perspective view showing a separation step using ultrasonic waves instead of the separation step of FIG. 4. 図５の分離ステップを示す平面図である。It is a top view which shows the isolation | separation step of FIG. 本発明の一実施形態に係る抗癌剤感受性測定装置を示すブロック図である。It is a block diagram which shows the anticancer agent sensitivity measuring apparatus which concerns on one Embodiment of this invention. 図７の抗癌剤感受性測定装置に用いられるマイクロアレイプレートを示す（ａ）平面図、（ｂ）Ａ−Ａ断面図、（ｃ）Ｂ−Ｂ断面図、（ｄ）溶液供給例である。It is (a) top view, (b) AA sectional view, (c) BB sectional view, (d) Solution supply example which shows the microarray plate used for the anticancer agent sensitivity measuring apparatus of FIG. 図８のマイクロアレイプレートの変形例を示す（ａ）Ａ−Ａ断面図、（ｂ）Ｂ−Ｂ断面図、（ｃ）溶液供給例である。FIG. 9A is a cross-sectional view taken along the line AA, FIG. 9B is a cross-sectional view taken along the line BB, and FIG. 図７の抗癌剤感受性測定装置の細胞分離手段を示すブロック図である。It is a block diagram which shows the cell separation means of the anticancer agent sensitivity measuring apparatus of FIG. 図１０の細胞分離手段を構成する分離手段の一例を模式的に示す縦断面図である。It is a longitudinal cross-sectional view which shows typically an example of the separation means which comprises the cell separation means of FIG. 図１１の分離手段による細胞分離方法を示す説明図である。It is explanatory drawing which shows the cell separation method by the isolation | separation means of FIG. 図７の抗癌剤感受性測定装置の細胞播種手段を示すブロック図である。It is a block diagram which shows the cell seed | inoculation means of the anticancer agent sensitivity measuring apparatus of FIG. 図７の抗癌剤感受性測定装置の蛍光検出手段を構成する（ａ）蛍光撮像装置、（ｂ）画像処理手段による画像例を模式的に示す説明図である。It is explanatory drawing which shows typically the example of an image by (a) fluorescence imaging device and (b) image processing means which comprise the fluorescence detection means of the anticancer agent sensitivity measuring apparatus of FIG. 図７の抗癌剤感受性測定装置の培養手段、蛍光検出手段および分析手段による評価方法を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the evaluation method by the culture | cultivation means, fluorescence detection means, and analysis means of the anticancer agent sensitivity measuring apparatus of FIG. 本発明の第２の実施形態に係る抗癌剤感受性測定方法を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the anticancer agent sensitivity measuring method which concerns on the 2nd Embodiment of this invention. 図１６の抗癌剤感受性測定方法の抽出・播種・培養ステップを説明する模式図である。FIG. 17 is a schematic diagram illustrating extraction, seeding, and culture steps of the anticancer drug sensitivity measurement method of FIG. 16.

符号の説明Explanation of symbols

Ｇハイドロゲル
Ｓ１抽出ステップ（癌細胞抽出ステップ）
Ｓ２播種ステップ
Ｓ３培養ステップ（増殖させるステップ）
Ｓ４投与ステップ（供給するステップ）
Ｓ５測定ステップ
ＳＰ１〜ＳＰ５スポット
１癌細胞
２生体組織
３正常細胞（他の細胞）
１１細胞分離手段
１３細胞培養手段
１４蛍光検出手段
１５分析手段
１０抗癌剤感受性測定装置
１６マイクロアレイプレート（プレート）
２１細胞播種手段
２５ハイドロゲル素材混合手段（混合手段）
２６スポッティング手段
２７ゲル化手段 G Hydrogel S1 extraction step (cancer cell extraction step)
S2 seeding step S3 culture step (proliferation step)
S4 administration step (supplying step)
S5 measurement step SP1 to SP5 Spot 1 Cancer cell 2 Biological tissue 3 Normal cell (other cells)
DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 Cell separation means 13 Cell culture means 14 Fluorescence detection means 15 Analysis means 10 Anticancer agent sensitivity measuring apparatus 16 Microarray plate (plate)
21 Cell seeding means 25 Hydrogel material mixing means (mixing means)
26 Spotting means 27 Gelling means

Claims

癌細胞を含む生体組織から癌細胞を抽出するステップと、
３次元スキャフォールドに癌細胞を播種するステップと、
播種された癌細胞を増殖させるステップと、
癌細胞に薬剤を供給するステップと、
癌細胞の生存パラメータを測定するステップとを含む抗癌剤感受性測定方法。 Extracting cancer cells from a biological tissue containing cancer cells;
Seeding cancer cells in a three-dimensional scaffold;
Growing the seeded cancer cells;
Supplying a drug to cancer cells;
Measuring a cancer cell survival parameter.

前記癌細胞抽出ステップが、癌細胞を含む生体組織に周期性のエネルギを加え、癌細胞を他の細胞から分離する請求項１に記載の抗癌剤感受性測定方法。 The anticancer agent susceptibility measuring method according to claim 1, wherein the cancer cell extraction step adds periodic energy to a biological tissue containing cancer cells to separate the cancer cells from other cells.

前記周期性のエネルギが、電気的エネルギである請求項２に記載の抗癌剤感受性測定方法。 The anticancer drug sensitivity measuring method according to claim 2, wherein the periodic energy is electrical energy.

前記周期性のエネルギが、超音波エネルギである請求項２に記載の抗癌剤感受性測定方法。 The anticancer drug sensitivity measuring method according to claim 2, wherein the periodic energy is ultrasonic energy.

前記癌細胞抽出ステップおよび癌細胞播種ステップが、
癌細胞を含む生体組織から細胞を分離し、
ハイドロゲルにより構成された３次元スキャフォールドの上面に、分離された細胞を播くことにより行われる請求項１から請求項４のいずれかに記載の抗癌剤感受性測定方法。 The cancer cell extraction step and the cancer cell seeding step include
Separating cells from living tissue containing cancer cells,
The method for measuring sensitivity to an anticancer agent according to any one of claims 1 to 4, which is performed by seeding the separated cells on the upper surface of a three-dimensional scaffold composed of a hydrogel.

前記ハイドロゲルが、親水基と疎水基のアミノ酸を繰り返したポリペプチドからなる請求項５に記載の抗癌剤感受性測定方法。 6. The method for measuring sensitivity to an anticancer agent according to claim 5, wherein the hydrogel comprises a polypeptide in which amino acids having a hydrophilic group and a hydrophobic group are repeated.

前記ハイドロゲルが、コラーゲン由来ペプチドを含む請求項５に記載の抗癌剤感受性測定方法。 The anticancer agent sensitivity measuring method according to claim 5, wherein the hydrogel contains a collagen-derived peptide.

前記ハイドロゲルが、アルギン酸を含む請求項５に記載の抗癌剤感受性測定方法。 The anticancer drug sensitivity measuring method according to claim 5, wherein the hydrogel contains alginic acid.

前記癌細胞播種ステップが、混合し、その後、スキャフォールドをゲル化させる請求項１から請求項４のいずれかに記載の抗癌剤感受性測定方法。 The anticancer agent sensitivity measuring method according to any one of claims 1 to 4, wherein the cancer cell seeding step is mixed, and then the scaffold is gelled.

前記癌細胞の生存パラメータが、癌特異性のある指標である請求項１から請求項９のいずれかに記載の抗癌剤感受性測定方法。 The method for measuring sensitivity to an anticancer agent according to any one of claims 1 to 9, wherein the survival parameter of the cancer cell is an index having cancer specificity.

前記癌細胞の生存パラメータが、細胞から発せられる蛍光量である請求項１０に記載の抗癌剤感受性測定方法。 The method for measuring sensitivity to an anticancer agent according to claim 10, wherein the survival parameter of the cancer cell is a fluorescence amount emitted from the cell.

前記蛍光量が、細胞の保持する腫瘍マーカの量に相関するものである請求項１１に記載の抗癌剤感受性測定方法。 The method for measuring sensitivity to an anticancer agent according to claim 11, wherein the amount of fluorescence correlates with the amount of a tumor marker held by a cell.

前記蛍光量が、細胞内の癌特性の高い酵素量に相関するものである請求項１１に記載の抗癌剤感受性測定方法。 The method for measuring sensitivity to an anticancer agent according to claim 11, wherein the amount of fluorescence correlates with the amount of enzyme having high cancer characteristics in cells.

前記癌細胞の生存パラメータが、細胞の活性を示す量である請求項１から請求項９のいずれかに記載の抗癌剤感受性測定方法。 The method for measuring sensitivity to an anticancer agent according to any one of claims 1 to 9, wherein the survival parameter of the cancer cell is an amount indicating cell activity.

前記癌細胞の生存パラメータが、酸素消費量である請求項１４に記載の抗癌剤感受性測定方法。 The method for measuring sensitivity to an anticancer drug according to claim 14, wherein the survival parameter of the cancer cell is oxygen consumption.

前記癌細胞の生存パラメータが、グルコース消費量である請求項１４に記載の抗癌剤感受性測定方法。 The method for measuring sensitivity to an anticancer drug according to claim 14, wherein the survival parameter of the cancer cell is glucose consumption.

癌細胞の生存パラメータを測定するステップが、薬剤投与の前後において行われ、
両ステップにおいて測定された生存パラメータを比較するステップを備える請求項１から請求項１６のいずれかに記載の抗癌剤感受性測定方法。 Measuring the survival parameters of cancer cells is performed before and after drug administration,
The method for measuring sensitivity to an anticancer agent according to any one of claims 1 to 16, further comprising a step of comparing the survival parameters measured in both steps.

癌細胞に薬剤を供給するステップが、投与量を異ならせて複数回行われ、
測定された生存パラメータを投与量ごとに比較するステップを備える請求項１から請求項１７のいずれかに記載の抗癌剤感受性測定方法。 The step of supplying the drug to the cancer cells is performed multiple times at different doses,
The method for measuring sensitivity to an anticancer agent according to any one of claims 1 to 17, further comprising a step of comparing the measured survival parameter for each dose.

癌細胞を含む生体組織から癌細胞を抽出する細胞分離手段と、
３次元スキャフォールドに癌細胞を播種する細胞播種手段と、
播種された癌細胞を増殖させる細胞培養手段と、
癌細胞に薬剤を供給し蛍光を検出する蛍光検出手段と、
検出された蛍光に基づいて癌細胞の生存パラメータを測定する分析手段とを備える抗癌剤感受性測定装置。 A cell separation means for extracting cancer cells from a biological tissue containing cancer cells;
Cell seeding means for seeding cancer cells in a three-dimensional scaffold;
Cell culture means for growing the seeded cancer cells;
A fluorescence detection means for supplying a drug to cancer cells and detecting fluorescence;
An anticancer agent sensitivity measuring apparatus comprising: an analyzing means for measuring a survival parameter of a cancer cell based on the detected fluorescence.

前記細胞播種手段が、ハイドロゲルにより構成された３次元スキャフォールドの内部または上面に癌細胞を播種する請求項１９に記載の抗癌剤感受性測定装置。 The anticancer agent sensitivity measuring apparatus according to claim 19, wherein the cell seeding means seeds cancer cells inside or on an upper surface of a three-dimensional scaffold made of hydrogel.

前記ハイドロゲルが、親水基のアミノ酸と疎水基のアミノ酸とを繰り返したポリペプチドからなる請求項２０に記載の抗癌剤感受性測定装置。 21. The anticancer drug sensitivity measuring apparatus according to claim 20, wherein the hydrogel comprises a polypeptide in which a hydrophilic amino acid and a hydrophobic amino acid are repeated.

前記ハイドロゲルが、コラーゲン由来ペプチドを含む請求項２０に記載の抗癌剤感受性測定装置。 The anticancer agent sensitivity measuring apparatus according to claim 20, wherein the hydrogel contains a collagen-derived peptide.

前記ハイドロゲルが、アルギン酸を含む請求項２０に記載の抗癌剤感受性測定装置。 The anticancer drug sensitivity measuring apparatus according to claim 20, wherein the hydrogel contains alginic acid.

前記細胞播種装置が、ハイドロゲル素材をプレート上に複数のスポットとして設けたものである請求項１９に記載の抗癌剤感受性測定装置。 20. The anticancer agent sensitivity measuring apparatus according to claim 19, wherein the cell seeding apparatus is provided with a hydrogel material as a plurality of spots on a plate.

前記細胞播種装置が、ハイドロゲル素材と癌細胞とを混合する混合手段と、該混合手段による混合物をプレートへスポッティングするスポッティング手段と、スポッティングされた混合物をゲル化させるゲル化手段とを備える請求項２４に記載の抗癌剤感受性測定装置。 The cell seeding device comprises a mixing means for mixing a hydrogel material and cancer cells, spotting means for spotting a mixture by the mixing means to a plate, and gelling means for gelling the spotted mixture. The anticancer drug sensitivity measuring apparatus according to 24.

前記細胞培養手段が、癌特異性のある指標を被検体に導入し、
前記蛍光検出手段が、被検体からの蛍光量を検出する請求項１９に記載の抗癌剤感受性測定装置。 The cell culture means introduces a cancer-specific index into the subject,
The anticancer agent sensitivity measuring apparatus according to claim 19, wherein the fluorescence detection means detects the amount of fluorescence from a subject.

前記指標の導入および蛍光量の検出が、被検体への薬剤投与の前後において行われる請求項２６に記載の抗癌剤感受性測定装置。 27. The anticancer drug sensitivity measuring apparatus according to claim 26, wherein the introduction of the index and the detection of the fluorescence amount are performed before and after the drug administration to the subject.

同一の薬剤投与条件が複数のスポットに対して適用される請求項２４に記載の抗癌剤感受性測定装置。 The anticancer drug sensitivity measuring apparatus according to claim 24, wherein the same drug administration condition is applied to a plurality of spots.

規定量の癌細胞数が存在しないスポットを検出し、検出されたスポットを評価から除外する請求項２４に記載の抗癌剤感受性測定装置。 25. The anticancer agent sensitivity measuring apparatus according to claim 24, wherein a spot where a prescribed amount of cancer cells does not exist is detected, and the detected spot is excluded from the evaluation.

前記分析手段が、被検体への薬剤投与の前後における蛍光量を統計的に解析することで、薬剤の感受性の優先順位付けを行う請求項１９に記載の抗癌剤感受性測定装置。 20. The anticancer drug sensitivity measuring apparatus according to claim 19, wherein the analysis means statistically analyzes fluorescence amounts before and after drug administration to a subject to prioritize drug sensitivity.