JP2007534633A - Human alpha 1-antitrypsin preparation - Google Patents

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Abstract

本発明は、組み換えヒト・アルファＩ−アンチトリプシン（ｒＡＡＴ）乾燥粉末状組成物に関する。  The present invention relates to recombinant human alpha I-antitrypsin (rAAT) dry powder composition.

Description

本発明は、乾燥蛋白質製剤に関し、そして特にアルファ１−抗トリプシン（ＡＡＴ）に関する。   The present invention relates to dry protein formulations and in particular to alpha 1-antitrypsin (AAT).

ＡＡＴ及び組換えアルファ１−抗トリプシン（ｒＡＡＴ）は、多数の臨床適応症のための有効な治療剤である。ｒＡＡＴは、４４ｋＤの３９５アミノ酸蛋白質であって、非グリコシル化蛋白質であり、そしてアミノ末端のＮ−アセチルメチオニンを除いてヒト血漿タンパク質（ＡＡＴ）と一致するアミノ酸配列を有する。ＡＡＴ又はｒＡＡＴの乾燥、安定製剤であって、すぐに水中で再構成状態になって、即時使用できることが望まれる。   AAT and recombinant alpha 1-antitrypsin (rAAT) are effective therapeutic agents for a number of clinical indications. rAAT is a 44 kD 395 amino acid protein that is an aglycosylated protein and has an amino acid sequence that is identical to human plasma protein (AAT) except for the amino-terminal N-acetylmethionine. It is desirable that this is a dry, stable preparation of AAT or rAAT that can be immediately reconstituted in water and used immediately.

賦形剤は、主に、バッファー、糖類、及び界面活性剤を含む、乾燥した蛋白質製剤において、典型的に、使用した（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１０９−１３３，２００２を参照のこと）。他の有効な安定化賦形剤は、充填剤、キレート剤、酸化防止剤、還元剤、及びアミノ酸を含む。   Excipients were typically used in dry protein formulations, mainly including buffers, saccharides, and surfactants (see, eg, Carpenter et al, Pharm. Biotechnol. 13: 109-133, 2002). See Other effective stabilizing excipients include fillers, chelating agents, antioxidants, reducing agents, and amino acids.

米国特許第５７８００１Ａ号は、吸入による投与のための、ＡＡＴの乾燥粉末状製剤を記載する。様々な乾燥技術が提示される。   US Pat. No. 5,780,001A describes a dry powder formulation of AAT for administration by inhalation. Various drying techniques are presented.

プロラスチン（Ｂａｙｅｒ）は、ヒト血漿由来、グリコシル化ＡＡＴの凍結乾燥製剤である。滅菌水４０ｍＬに当り１ｇのアルファ１−抗トリプシン機能活性体で、指示通りに元に戻すとき、当該液体組成は、＞２０ｍｇ／ｍｌのＡＡＴ、１００〜２１０ｍＥｑ／ＬのＮａ、６０〜１８０ｍＥｑ／ＬのＣｌ、１５〜２５μＭのリン酸ナトリウム、＜５ｐｐｍのＰＥＧ、及び＜０．１％のスクロースを含む。当該凍結乾燥製剤は、冷凍下で保存すべきである。   Prolastin (Bayer) is a lyophilized formulation of glycosylated AAT derived from human plasma. With 1 g of alpha 1-antitrypsin functional active per 40 mL of sterile water, when reconstituted as directed, the liquid composition is> 20 mg / ml AAT, 100-210 mEq / L Na, 60-180 mEq / L Cl, 15-25 μM sodium phosphate, <5 ppm PEG, and <0.1% sucrose. The lyophilized formulation should be stored under freezing.

Ｖｅｍｕｒｉ ｅｔ ａｌは、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｒｕｇｓ：Ｃａｓｅ Ｈｉｓｔｏｒｉｅｓ，ｅｄ．Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｐｅａｒｌｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）の９章において、ｒＡＡＴの製剤、主に液体型を記載する。安定性は、例えばｐＨ７．５で、その塩類含有量の増加により促進される。しかしながら、塩は、そのガラス転移温度が下がるため、凍結乾燥製剤に不適当と一般的に考えられる。   Vemuri et al., Stability and Characterization of Protein and Peptide Drugs: Case History, ed. In Chapter 9 of Wang and Pearlman, Plenum Press, New York (1993), formulations of rAAT, mainly liquid forms, are described. Stability is promoted by increasing its salt content, for example at pH 7.5. However, salts are generally considered unsuitable for lyophilized formulations because of their lower glass transition temperature.

ｒＡＡＴの安定化は、天然蛋白質と比較して、特定の問題がある。Ｔｒａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：４３８４−４３８９，１９８５）は、酵母由来のｒＡＡＴと天然血漿由来のＡＡＴの熱安定性の比較を記載する。当該非グリコシル化ｒＡＡＴの半減期であって、その熱ストレス応答活性に対するものは、その天然グリコシル化対応物の半減期よりかなり短くなる。   rAAT stabilization has certain problems compared to natural proteins. Travis et al. , (J. Biol. Chem. 260: 4384-4389, 1985) describe a comparison of the thermal stability of rAAT from yeast and AAT from natural plasma. The half-life of the non-glycosylated rAAT, which is against its heat stress response activity, is significantly shorter than the half-life of its natural glycosylated counterpart.

本発明の要約
本発明は、ｒＡＡＴの乾燥製剤の発見に基づき、ここで当該ｒＡＡＴは、ｒＡＡＴ及び塩の定義済みの濃度を有し、もし凍結乾燥しなくとも（すなわち、５℃又はそれ未満）、最長２年又はそれ以上の優れた安定性を有する。これは、他の所望の特性であって、例えば、素早い再構成及び不要なものを含まない合成溶液といったことを損なうことなく、達成可能である。賦形剤含有量、特に潜在的に微生物の増殖を促進し得る当該量は、最小化され、そして、未承認又は非公定書の薬品は避けられ得る。当該製剤は、嫌な匂いや味はない。その製剤は、便利な凍結乾燥のために修正可能である。 SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is based on the discovery of a dry formulation of rAAT, where the rAAT has a defined concentration of rAAT and salt, and if not lyophilized (ie, 5 ° C. or less) Excellent stability for up to 2 years or more. This can be achieved without compromising other desired properties, such as quick reconstitution and synthesis solutions that do not contain unwanted ones. Excipient content, particularly those that can potentially promote microbial growth, is minimized and unapproved or unofficial drugs can be avoided. The formulation does not have a bad smell or taste. The formulation can be modified for convenient lyophilization.

本発明に関する乾燥製剤は、少なくともｒＡＡＴ及び塩を含む。当該組成物の安定性に関する影響は相対的に小さいけれども、他の慣習的な成分は、含まれ得る。そのような成分は、還元剤であって、例えば、ジチオスレイトール、システイン、グルタチオン、又はＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を、例えば再構成上１０ｍＭまでの量において、含む。当該組成物は、抗酸化物質であって、例えば、アスコルビン酸又はＬ−Ｍｅｔを、例えば、再構成上１０ｍＭまでの量において、及び／又はバッファーであって、例えば、リン酸塩、クエン酸塩又はヒスチジンを、例えば、再構成上５〜５０ｍＭの量、好ましくは１０〜２０ｍＭにおいて、も含む。当該バッファーの量は、水中での当該組成物の再構成に関して、当該再構成溶液が、ｐＨ約６〜９、より好ましくは６．５〜８、さらにより好ましくは６．８〜７．０となるような量である。   The dry formulation according to the invention comprises at least rAAT and a salt. Other conventional ingredients may be included, although the impact on the stability of the composition is relatively small. Such components are reducing agents and include, for example, dithiothreitol, cysteine, glutathione, or N-acetylcysteine (NAC), for example, in an amount up to 10 mM reconstituted. The composition is an antioxidant, for example ascorbic acid or L-Met, eg in an amount up to 10 mM reconstituted and / or a buffer, eg phosphate, citrate Alternatively, histidine is also included, for example, in an amount of 5-50 mM, preferably 10-20 mM on reconstitution. The amount of the buffer is such that when the composition is reconstituted in water, the reconstitution solution has a pH of about 6-9, more preferably 6.5-8, and even more preferably 6.8-7.0. Is such an amount.

他の典型的な組成物は、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はクエン酸塩）、及び界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン・ソルビタン）である。これらの組成物及びいずれかの他の組成物は、任意の組み合わせにおいて存在し得る。これらの追加成分は任意であり、そして、当該新規製剤は、必要なこれらの追加成分をほとんど含まないことが好ましい。   Other typical compositions are chelating agents (eg, EDTA or citrate) and surfactants (eg, polyoxyethylene sorbitan). These compositions and any other composition may be present in any combination. These additional ingredients are optional, and it is preferred that the new formulation contains little of these additional ingredients that are required.

本発明の乾燥粉末状組成物は、ウイルス不活性化を受けることを要しない。それは、典型的に、６０℃又は６５℃で加熱することにより実施される。   The dry powder composition of the present invention does not need to undergo virus inactivation. It is typically performed by heating at 60 ° C or 65 ° C.

本発明の乾燥粉末状組成物は、１０％未満の、より好ましくは５％未満の、最も好ましくは１％未満の蛋白質含有量のα１−抗キモトリプシンを、典型的に有する。当該組成物は、１０％未満の、より好ましくは５％未満の、最も好ましくは１％未満の蛋白質含有量のアルブミンも典型的に有する。より一般的には、蛋白質含有量は、通常１０％未満の、より好ましくは５％未満の、最も好ましくは１％未満のヒト蛋白質である。蛋白質含有量は、通常、９０％超、好ましくは９５％超のｒＡＡＴ、及び最も好ましくは９９％超のｒＡＡＴである。   The dry powder composition of the present invention typically has α1-antichymotrypsin with a protein content of less than 10%, more preferably less than 5%, most preferably less than 1%. The composition also typically has an albumin with a protein content of less than 10%, more preferably less than 5%, most preferably less than 1%. More generally, the protein content is usually less than 10% human protein, more preferably less than 5%, most preferably less than 1%. The protein content is usually more than 90%, preferably more than 95% rAAT, and most preferably more than 99% rAAT.

当該乾燥粉末状組成物は、ｒＡＡＴの１００ｍｇあたり１〜２０００ミリグラム当量、より好ましくは５０〜５００ミリグラム当量、最も好ましくは１００〜２００ミリグラム当量の塩をさらに含む。使用される塩は、典型的に、ＮａＣｌになるであろう。しかしながら、カチオンが異なっても（例えば、ＫＣｌ）又はアニオンが異なっても（例えば、ＮａＢｒ）又は両方異なっても、他の塩が、同じ効果を有し得ることは、いわゆる当業者により容易に理解されるであろう。   The dry powder composition further comprises 1 to 2000 milligram equivalents, more preferably 50 to 500 milligram equivalents, and most preferably 100 to 200 milligram equivalents of salt per 100 mg of rAAT. The salt used will typically be NaCl. However, it is readily understood by those skilled in the art that other salts can have the same effect whether the cations are different (eg, KCl) or the anions are different (eg, NaBr) or both. Will be done.

本発明の乾燥粉末状組成物は、糖を含有しないものとなり得る。それは、１％未満、及び好ましくは０．５％未満の水を通常含有する。   The dry powder composition of the present invention may be free of sugar. It usually contains less than 1% and preferably less than 0.5% water.

本発明の乾燥粉末状組成物は、５０℃で３ヶ月間又はそれに等価な条件下での保存の間、初期のｒＡＡＴ活性の少なくとも８０％、好ましくは＞９０％保持できる。当該組成物は、３ヶ月間、５０℃又はそれに等価な条件下での保存の間、少なくとも８０％の単量体ｒＡＡＴ、好ましくは＞９５％単量体で保持し得る。   The dry powder composition of the present invention can retain at least 80%, preferably> 90% of the initial rAAT activity during storage at 50 ° C. for 3 months or equivalent conditions. The composition may be retained with at least 80% monomeric rAAT, preferably> 95% monomer during storage at 50 ° C. or equivalent for 3 months.

安定性基準（保持活性）及び変性は、本分野における、いわゆる当業者にしられた試験により実証される。活性試験は、Ｂｅａｔｔｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，３９３１ページ，１９８０により記載されるブタ膵エラスターゼ阻害試験に基づく。変性は、分子篩いクロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣ法における、凝集体形成、及び単量体の％として報告される非変性ｒＡＡＴの評価により調査される。与えられた条件と等価なことは、本分野における、いわゆる当業者により理解され得るであろう、すなわちアレニウスの式に基づく。   Stability criteria (retention activity) and denaturation are demonstrated in the art by so-called tests by those skilled in the art. The activity test was performed by Beatty et al, J Biol. Chem. 255, 3931, 1980, based on the porcine pancreatic elastase inhibition test. Denaturation is investigated by molecular sieve chromatography (SEC) HPLC method by aggregate formation and evaluation of unmodified rAAT reported as% of monomer. The equivalence of the given conditions can be understood by the so-called person skilled in the art, ie based on the Arrhenius equation.

本発明の製剤を製造するために、所望の成分を含む溶液又は他の組成物を乾燥した。乾燥の好適な方法は、凍結乾燥、スプレー乾燥、スプレー凍結乾燥、流動層技術、及び超臨界流体乾燥を非制限的に含む。   In order to produce the formulations of the present invention, solutions or other compositions containing the desired ingredients were dried. Suitable methods of drying include, but are not limited to, lyophilization, spray drying, spray lyophilization, fluidized bed technology, and supercritical fluid drying.

好ましい乾燥手順は、凍結乾燥及びスプレー乾燥である。両手順共に、本分野における、いわゆる当業者にしられる標準的技術により実施され得る。例えば、スプレー乾燥は、乾燥粒子形成をもたらす３つのステップ手順からなる。当該プロセスは、液体の原材料を霧化し、圧縮空気を使用して微細な滴のスプレーとすることにより始まり、そしてその後、当該滴からなる霧を蒸発させることにより当該滴を乾燥するために、媒質を加熱する。乾燥粉末の形成における最終的な粒子は、製品として収集される。当該気体及び余分な細塵は、除去される。これらのステップは、３つの構成部品：ノズル形状の噴霧器；乾燥室；及びサイクロンとポットとして知られる収集システム、を使用して実施される。   Preferred drying procedures are freeze drying and spray drying. Both procedures can be performed by standard techniques in the field known to those skilled in the art. For example, spray drying consists of a three step procedure that results in dry particle formation. The process begins by atomizing the liquid raw material and using compressed air to form a fine droplet spray, and then drying the droplets by evaporating the mist consisting of the droplets. Heat. The final particles in the formation of the dry powder are collected as a product. The gas and excess fine dust are removed. These steps are performed using three components: a nozzle-shaped sprayer; a drying chamber; and a collection system known as a cyclone and pot.

乾燥製剤又は、再構成後の液体組成物は、それを必要している患者への投与に適する。投与の好適な経路は、吸入、局所、皮下、そして静脈内デリバリーを非制限的に含む。   The dry formulation or reconstituted liquid composition is suitable for administration to a patient in need thereof. Suitable routes of administration include, but are not limited to, inhalation, topical, subcutaneous, and intravenous delivery.

以下の実施例は、本発明を例証したものである。   The following examples illustrate the invention.

以下の略語（前に未だ説明していないもの）：
・ＮａＰｉ：リン酸カルシウム
・Ｔｗ８０：Ｔｗｅｅｎ８０（Ｔｗｅｅｎは登録商標である。）
・ＦＴＩＲ：フーリエ変換赤外線
を使用する。 The following abbreviations (those not explained before):
NaPi: calcium phosphate Tw80: Tween80 (Tween is a registered trademark)
-FTIR: Fourier transform infrared is used.

実施例１ 凍結乾燥
表１に示した製剤を製造した。

Figure 2007534633
Example 1 Lyophilization The formulations shown in Table 1 were prepared.
Figure 2007534633

乾燥状態中のｒＡＡＴの構造的安定性を評価するために、ＦＴＩＲスペクトルをこれらの製剤に関して収集した。固形における天然構造の保持力は、乾燥蛋白質の長期保存性を予測され得ることが示されている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ，２００２，ｓｕｐｒａ）。図１は、９１７−１製剤における液体及び固体のｒＡＡＴのＦＴＩＲを示す。ここで留意すべきは、アミドＩ領域（１７００〜１６００ｃｍ-1）は、二次構造における変化に敏感であること、及び二次導関数スペクトルにおける全ピークは、負であることである。アミドＩ領域における各ピークは、異なる二次構造型に相当する。凍結乾燥の前と後のｒＡＡＴの立体構造に明らかな摂動がある。１６５５ｃｍ-1付近のピークは、αへリックス構造に相当し、１６３５ｃｍ-1付近のバンドは、βシート構造に相当し、そして１６８８ｃｍ-1のピークは、拡張βストランド構造又はβシートに起因する。ランダムコイル構造は、１６４４ｃｍ-1付近のバンドに割り当てられる。 FTIR spectra were collected for these formulations to assess the structural stability of rAAT in the dry state. It has been shown that the retention of the native structure in the solid can predict the long-term storage stability of the dried protein (Carpenter et al, 2002, supra). FIG. 1 shows the FTIR of liquid and solid rAAT in the 917-1 formulation. It should be noted here that the amide I region (1700-1600 cm −1 ) is sensitive to changes in the secondary structure and that all peaks in the second derivative spectrum are negative. Each peak in the amide I region corresponds to a different secondary structure type. There is a clear perturbation in the rAAT conformation before and after lyophilization. The peak near 1655 cm −1 corresponds to the α helix structure, the band near 1635 cm −1 corresponds to the β sheet structure, and the peak at 1688 cm −1 is attributed to the extended β strand structure or β sheet. The random coil structure is assigned to a band around 1644 cm −1 .

天然の構造を表す液体サンプルは、βシート及びαへリックス構造のかなりの量を示す。凍結乾燥に関して、もし安定剤がなければ（９１７−１１製剤）、図２に示すように重要な構造的摂動がある。当該αへリックスバンドは、ほぼ完全に消滅し、一方、１６８０ｃｍ-1超のバンドにおいて、著しい増加があり、拡張及びループ構造に相当する。図３は、固形状態におけるｒＡＡＴに関する塩の影響を示す。９１７−１、−３及び−４製剤は、それぞれ、１７５ｍＭ、１００ｍＭ、及び５０ｍＭのＮａＣｌを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸塩、２．５ｍＭのＮＡＣ、及び３ｍＭのＬ−Ｍｅｔに加えて含む。 Liquid samples representing the natural structure exhibit a significant amount of beta sheet and alpha helix structure. With respect to lyophilization, if there is no stabilizer (917-11 formulation), there is an important structural perturbation as shown in FIG. The α-helix band disappears almost completely, while there is a significant increase in the band above 1680 cm −1 , corresponding to an expanded and loop structure. FIG. 3 shows the effect of salt on rAAT in the solid state. The 917-1, -3, and -4 formulations added 175 mM, 100 mM, and 50 mM NaCl to 20 mM sodium phosphate, 5 mM citrate, 2.5 mM NAC, and 3 mM L-Met, respectively. Included.

より低い塩濃度である製剤３及び４は、構造的摂動の最も大きな度合いを有しているように見え、そして、全ての３つの製剤は、安定剤が無いときよりも、少ない摂動である。結局、凍結乾燥は、天然構造と比較されるいくつかの構造的摂動を引き起こすように思われる。変化の度合いは、塩を含む賦形剤の追加により最小化される。５０ｍＭ超のＮａＣｌ濃度は、より天然様構造を引き起こすように思われ、５０〜１００ｍＭが最適条件である。当該結果は、予期しないものであり、というのは、糖は、乾燥状態における天然蛋白質構造を維持するために、通常、要求され又は使用されるからである。これらの製剤の構造安定性が、乾燥状態中でのｒＡＡＴ構造間の微妙な差を明らかとするために、ＦＴＩＲにより評価された。図４は、糖ベース製剤（１００８−１）及び塩ベース製剤（１００８−２）において処方されたｒＡＡＴのＦＴＩＲスペクトルを示す。これら両製剤におけるｒＡＡＴの二次構造は、重ね合わせることができる。塩が高濃度で蛋白質と同程度の安定性を達成できる事実は、注目すべきであり、自明ではない。再構成の間、当該元々のｒＡＡＴ二次構造は、図５に示すように保持されている。   The lower salt concentrations, formulations 3 and 4, appear to have the greatest degree of structural perturbation, and all three formulations are less perturbed than without the stabilizer. Eventually, lyophilization appears to cause some structural perturbations compared to the natural structure. The degree of change is minimized by the addition of excipients containing salt. NaCl concentrations above 50 mM appear to cause more natural-like structures, with 50-100 mM being the optimal condition. The results are unexpected because sugars are usually required or used to maintain the native protein structure in the dry state. The structural stability of these formulations was evaluated by FTIR to reveal subtle differences between rAAT structures in the dry state. FIG. 4 shows FTIR spectra of rAAT formulated in sugar-based formulation (1008-1) and salt-based formulation (1008-2). The secondary structure of rAAT in both these formulations can be superimposed. The fact that salt can achieve the same level of stability as protein at high concentrations is remarkable and not obvious. During reconfiguration, the original rAAT secondary structure is retained as shown in FIG.

高濃度のＮａＣｌを含む冷凍乾燥されたｒＡＡＴ製剤の驚くべき観察に基づいて、安定性分析を、凍結乾燥蛋白質製剤中の共通の安定剤の追加が、ｒＡＡＴの構造安定性及び急性安定性（６０℃で３ヶ月）を促進するかどうか体系的に評価するために行った。糖は、恐らくは、凍結乾燥の間、当該蛋白質周辺の水分子の、水素結合の置換、その後の除去により当該分子を安定するために、蛋白質製剤において共通に使用される。糖は、乾燥状態における非結晶質環境であって、当該蛋白質の構造的安定性を促進することも提示し、そして、乾燥する間、除去される水和反応の水を効果的に置換する。界面活性剤もまた、蛋白製剤に、しばしば使用され、当該蛋白質を損傷し得る表面吸着を低減させる。ｒＡＡＴの可能な投与経路は、エアロゾル化を経る肺のデリバリーなので、界面活性剤の効果は、特に着目すべきである。それ故、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）のようなポリオキシエチレン・ソルビタンの役割は、様々な濃度で、評価もされる。これらの製剤を表ＩＩに示す。   Based on the surprising observation of freeze-dried rAAT formulations containing a high concentration of NaCl, the stability analysis has shown that the addition of a common stabilizer in the lyophilized protein formulation is the structural stability and acute stability of rAAT (60 To systematically evaluate whether to promote 3 months at ℃. Saccharides are commonly used in protein formulations to stabilize the molecules, possibly by hydrogen bond replacement and subsequent removal of water molecules around the protein during lyophilization. Sugar is also shown to be a non-crystalline environment in the dry state, promoting the structural stability of the protein, and effectively replaces the water of hydration that is removed during drying. Surfactants are also often used in protein formulations to reduce surface adsorption that can damage the protein. Since the possible route of administration of rAAT is pulmonary delivery via aerosolization, the effect of surfactants should be particularly noted. Therefore, the role of polyoxyethylene sorbitan such as polysorbate 80 (Tween 80) is also evaluated at various concentrations. These formulations are shown in Table II.

Figure 2007534633
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凍結乾燥製剤について、６０℃での促進保存条件下、短期の安定性（１及び３ヶ月間）を評価した。この保存温度は、蛋白質の安定性を評価するためには特に厳しく、そして、特に高いガラス転移温度（Ｔg）を有するトレハロース・ベース製剤に対する結果に影響を及ぼし得る。この温度を選択した論理的根拠は、より短い枠でｒＡＡＴの安定性を評価した先の安定性試験に基づいた。再構成された活性及び単量体パーセンテージを、６０℃で最大３ヶ月間の保存に渡って測定し、表ＩＩＩ及び表ＩＶにそれぞれ示した。 The lyophilized formulations were evaluated for short-term stability (1 and 3 months) under accelerated storage conditions at 60 ° C. This storage temperature is particularly stringent for assessing protein stability and can affect the results for trehalose-based formulations with a particularly high glass transition temperature (T g ). The rationale for choosing this temperature was based on previous stability tests that evaluated the stability of rAAT in a shorter frame. Reconstituted activity and monomer percentages were measured over a maximum of 3 months storage at 60 ° C. and are shown in Tables III and IV, respectively.

Figure 2007534633
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１ヵ月後試験した製剤のいずれにおいても、重大な違いは観察されず、糖含有、及び糖を含有しない製剤の双方共に同程度の安定性を示すことが提示された。６０℃で３ヵ月間の保存後の安定性データは、より広範な結果を示した。糖及び塩の双方を含む製剤は、糖又は塩のどちらか一方を含む場合より、より安定する分析結果となった。これらのデータは、これらの製剤の型における二次構造の保持の高い程度を示すＦＴＩＲ試験と一致する。１００８−２製剤において見られた低い特異的活性は、当該製剤における含水率に起因し得、他の選択された製剤において測定された場合より約１％高い含水率であった。この事は、安定した凍結乾燥ｒＡＡＴ製剤は、好ましくは、１％未満の含水率を有すべきであることを提示する。   No significant differences were observed in any of the formulations tested after 1 month, suggesting that both sugar-containing and sugar-free formulations show comparable stability. Stability data after 3 months storage at 60 ° C. showed more extensive results. Formulations containing both sugar and salt resulted in a more stable analytical result than when either sugar or salt was included. These data are consistent with the FTIR test showing a high degree of secondary structure retention in these formulation types. The low specific activity seen in the 1008-2 formulation could be attributed to the moisture content in the formulation, which was about 1% higher than that measured in the other selected formulations. This suggests that a stable lyophilized rAAT formulation should preferably have a moisture content of less than 1%.

これらの結果により、ｒＡＡＴは、相対的に安定した蛋白質であり、凍結乾燥状態中の安定化のために糖を必要としないようであることが提示される。   These results suggest that rAAT is a relatively stable protein and does not appear to require sugars for stabilization in the lyophilized state.

実施例２ スプレー乾燥
組換えアルファ１−抗トリプシン（ｒＡＡＴ）を、様々な配合及び条件においてスプレー乾燥させた。結果物である乾燥粉末の活性を、乾燥後のｒＡＡＴ有効性を評価するために試験した。表ＶＩＩに配合を、表ＶＩＩＩにこれらの試験のデータを示す。 Example 2 Spray dried recombinant alpha 1-antitrypsin (rAAT) was spray dried in various formulations and conditions. The activity of the resulting dry powder was tested to assess rAAT effectiveness after drying. Table VII shows the formulation and Table VIII shows the data for these tests.

Figure 2007534633
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上記の特徴は、網羅的なものではなかった。他の態様は、本発明の範囲に含まれる。   The above features were not exhaustive. Other embodiments are within the scope of the present invention.

前述の参考資料を本願明細書中に援用する。   The aforementioned reference materials are incorporated herein by reference.

図１は、本発明の製剤における液体及び固体ｒＡＡＴのＦＴＩＲスペクトル走査である。FIG. 1 is an FTIR spectral scan of liquid and solid rAAT in the formulations of the present invention. 図２は、液体及び固体状態中の製剤されていないｒＡＡＴのＦＴＩＲスペクトル走査である。FIG. 2 is an FTIR spectral scan of unformulated rAAT in liquid and solid state. 図３は、塩の異なる濃度を含む製剤中のｒＡＡＴのＦＴＩＲスペクトル走査である。FIG. 3 is an FTIR spectral scan of rAAT in a formulation containing different concentrations of salt. 図４は、本発明の糖ベースの製剤及び塩ベースの製剤中のｒＡＡＴの二次構造を示す。FIG. 4 shows the secondary structure of rAAT in the sugar-based and salt-based formulations of the present invention. 図５は、１００ｍＭのＮａＣｌ製剤中の凍結乾燥された蛋白質の再構成の間、その元々の構造へのｒＡＡＴの二次構造の可逆性を示す。FIG. 5 shows the reversibility of the secondary structure of rAAT to its original structure during reconstitution of lyophilized protein in a 100 mM NaCl formulation.

Claims (21)

組み換えヒト・アルファ１−抗トリプシン（ｒＡＡＴ）を含む乾燥粉末状組成物。   A dry powder composition comprising recombinant human alpha 1-antitrypsin (rAAT). ウイルス不活性化を受けていない、請求項１に記載の乾燥粉末状組成物。   2. The dry powder composition of claim 1 that has not been virus inactivated. 前記組成物の蛋白質含有量が１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満のα１−抗キモトリプシンである、請求項１又は２に記載の乾燥粉末状組成物。   3. A dry powder composition according to claim 1 or 2, wherein the composition is [alpha] 1-antichymotrypsin with a protein content of less than 10%, more preferably less than 5%, most preferably less than 1%. 前記組成物の蛋白質含有量が１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満のアルブミンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   The dry powder composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the protein content of the composition is albumin of less than 10%, more preferably less than 5%, most preferably less than 1%. 前記組成物の蛋白質含有量が１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満のヒト蛋白質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   The dry powder composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the protein content of the composition is human protein of less than 10%, more preferably less than 5%, most preferably less than 1%. 前記組成物の蛋白質含有量が９０％超のｒＡＡＴである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   The dry powder composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the protein content of the composition is rAAT of more than 90%. 前記組成物の蛋白質含有量が９５％超のｒＡＡＴである、請求項６に記載の乾燥粉末状組成物。   The dry powder composition according to claim 6, wherein the protein content of the composition is rAAT of more than 95%. 前記組成物の蛋白質含有量が９９％超のｒＡＡＴである、請求項６に記載の乾燥粉末状組成物。   The dry powder composition according to claim 6, wherein the protein content of the composition is rAAT of more than 99%. ｒＡＡＴの１００ｍｇ当り１〜２０００ミリグラム当量、より好ましくは５０〜５００ミリグラム当量、最も好ましくは１００〜２００ミリグラム当量の塩をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   9. The dry powder composition of any one of claims 1 to 8, further comprising 1 to 2000 milligram equivalents, more preferably 50 to 500 milligram equivalents, most preferably 100 to 200 milligram equivalents of salt per 100 mg of rAAT. object. 糖を含有しない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   The dry powder composition according to any one of claims 1 to 9, which contains no sugar. １％未満の水を含有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   The dry powder composition according to any one of claims 1 to 10, comprising less than 1% water. ０．５％未満の水を含有する、請求項１１に記載の乾燥粉末状組成物。   12. A dry powder composition according to claim 11 containing less than 0.5% water. ５０℃で３ヶ月間又はこれに等価な条件下での保存の間、初期のｒＡＡＴ活性の少なくとも８０％、好ましくは９０％超を保持する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   13. Retaining at least 80%, preferably more than 90% of the initial rAAT activity during storage at 50 ° C. for 3 months or equivalent conditions. Dry powder composition. ５０℃で３ヶ月間又はこれに等価な条件下での保存の間、少なくとも８０％の単量体のｒＡＡＴ、好ましくは＞９５％の単量体を保持する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   14. Retaining at least 80% monomeric rAAT, preferably> 95% monomer, during storage at 50 ° C. for 3 months or equivalent conditions. 2. The dry powder composition according to item 1. グルタチオン、システイン、ジチオスレイトール又はＮ−アセチルシステインの如き還元剤をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   The dry powder composition according to any one of claims 1 to 14, further comprising a reducing agent such as glutathione, cysteine, dithiothreitol or N-acetylcysteine. アスコルビン酸又はＬ−メチオニンの如き抗酸化物質をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   The dry powder composition according to any one of claims 1 to 15, further comprising an antioxidant such as ascorbic acid or L-methionine. ヒスチジン、リン酸塩又はクエン酸塩の如き、バッファーをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   The dry powder composition according to any one of claims 1 to 16, further comprising a buffer, such as histidine, phosphate or citrate. 前記バッファーは、水中の前記組成物の再構成の間、当該再構成された溶液が、約６〜９、より好ましくは６．５〜８、さらにより好ましくは６．８〜７．０のｐＨをもつようなバッファーである、請求項１７に記載の乾燥粉末状組成物。   The buffer has a pH of about 6-9, more preferably 6.5-8, and even more preferably 6.8-7.0 during reconstitution of the composition in water. The dry powder composition according to claim 17, which is a buffer having ＥＤＴＡ又はクエン酸塩の如き、キレート剤をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   19. A dry powder composition according to any one of claims 1 to 18, further comprising a chelating agent, such as EDTA or citrate. ポリオキシエチレン・ソルビタン・オレアートの如き、界面活性剤をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の乾燥粉末状組成物。   The dry powder composition according to any one of claims 1 to 19, further comprising a surfactant such as polyoxyethylene sorbitan oleate. ｒＡＡＴ、並びに請求項９、１５、１６、１７、１９、及び２０に記載の成分のみから本質的に成る、請求項１に記載の乾燥粉末状組成物。   The dry powder composition of claim 1 consisting essentially of rAAT and only the components of claims 9, 15, 16, 17, 19, and 20.
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