JP2007533742A - 癌治療のための薬剤併用療法 - Google Patents

Abstract

本発明は、スルビビンアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を、追加の抗癌剤の有効量と組み合わせて投与することを含む、患者における癌を治療する方法に関する。

Description

本発明は、抗癌剤による癌治療法に関する。より詳しくは、本発明は、化学療法剤の効果を向上するために、スルビビンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド治療剤の、化学療法剤と組み合わせた使用に関する。

スルビビンは、アポトーシスおよび細胞質***を制御するアポトーシス阻害剤（ＩＰＡ）群のタンパク質である。スルビビンは、多くの型の癌においてしばしば過剰に発現されるが、正常の隣接組織においては大部分が存在しない。その発現レベルは、腫瘍におけるアポトーシスの減少にしばしば相関している。現在のところ、スルビビンの過剰発現は、肺、結腸、膵臓、前立腺、乳腺、胃の腫瘍、及び非ホジキンリンパ腫ならびに神経芽細胞腫において検出されている（Ａｌｔｉｅｒｉ， Ｎａｔｕｒｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｖ．， ３： ４６−５４ （２００２）； Ａｄｉｄａら、Ｌａｎｃｅｔ ３５１：８８２−８８３ （１９９８）； Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３： ９１７−９２１ （１９９７）； Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：１８０８−１８１２ （１９９８））。

米国特許第６，０７７，７０９号及び第６，１６５，７８８号は、その全内容が本明細書に組み込まれているが、スルビビンの発現或いは過剰発現を調節するためのアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）及び方法を開示している。これらの化合物は、限定されるものではないが、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、胃癌を含む癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫及びケラチン細胞（角化細胞）或いは繊維芽細胞に関与する癌の治療に有用である。米国特許第６，３３５，１９４号は、その全容が本明細書に組み込まれているが、アンチセンス機構とは異なった機構によって作用する化学療法剤と組み合わせた、スルビビンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を開示している。

スルビビンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるスルビビン発現の妨害は、それ自身で或いは化学療法と組み合わせて、デフォルトの細胞死チェックポイントを回復し、選択的に癌細胞を排除して臨床的成果を向上する。

本発明は、感受性の腫瘍が、スルビビンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを追加の抗癌剤と組み合わせて用いる併用療法によって、有利に或いは卓越して治療され得るという発見を陳述する。

本発明は、限定されるものではないが、肝細胞癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、及びケラチン細胞或いは繊維芽細胞に関与する癌を含む癌の治療に有用な組成物及び方法を提供する。本発明の方法は、米国特許第５，４６４，８２６号に記載されているゲムシタビン塩酸塩と組み合わせた、スルビビンの発現或いは過剰発現を妨害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を包含する。本発明は、パクリタキセルと組み合わせた、スルビビンの発現或いは過剰発現を妨害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用をも包含する。本発明は、ドキソルビシン塩酸塩と組み合わせた、スルビビンの発現或いは過剰発現を妨害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用をも包含する。

驚くべきことに、我々は、スルビビンの発現或いは過剰発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを一定の追加の抗癌剤と併用すると、いずれかの試薬単独による治療と比較して、腫瘍容積の相加的以上の阻害をもたらすことを発見している。

本発明の組成物及び方法によって治療され得る癌のタイプは、以下のものを含む。中枢神経系の腫瘍：多形性神経膠芽腫、神経膠星状細胞腫、乏突起膠細胞腫瘍、脳室上皮及び脈絡叢腫瘍、松果体腫瘍、ニューロン腫瘍、髄芽細胞腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、髄膜肉腫；目の腫瘍：基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫；内分泌腺の腫瘍：下垂体腫瘍、甲状腺の腫瘍、副腎皮質の腫瘍、神経内分泌系の腫瘍、胃腸膵臓内分泌系の腫瘍、性腺の腫瘍；頭頸部の腫瘍：頭頚部癌、口腔、咽頭、喉頭、歯性腫瘍；胸部の腫瘍：大細胞肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胸部の腫瘍、悪性中皮腫、胸腺腫、胸部の原発性胚細胞腫瘍；消化管の腫瘍：食道の腫瘍、胃の腫瘍、肝臓の腫瘍、胆嚢の腫瘍、膵臓外分泌部の腫瘍、小腸、虫垂及び腹膜の腫瘍、結腸及び直腸の腺癌、肛門の腫瘍；尿生殖路の腫瘍：腎細胞癌、腎う及び尿管の腫瘍、膀胱の腫瘍、尿道の腫瘍、前立腺の腫瘍、陰茎の腫瘍、精巣の腫瘍；女性の生殖器官の腫瘍：外陰部及び膣の腫瘍、子宮頸管の腫瘍、子宮コーパスの腺癌、卵嚢癌、婦人科肉腫；胸部の腫瘍；皮膚の腫瘍：基底細胞癌、扁平上皮癌、皮幹線維肉腫、メルケル細胞腫瘍；悪性黒色腫；骨及び軟組織の腫瘍：骨原性肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原始神経外胚様性腫瘍、血管肉腫；細網内皮系の腫瘍：骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、ＨＴＬＶ−１及びＴ細胞白血病／リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病、ホジキン病、非ホジキンスリンパ腫、肥胖細胞性白血病；および、小児の腫瘍：急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、骨腫瘍、横紋筋肉腫、リンパ腫、腎臓腫瘍。

上記の癌のうち、膵臓癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、及び非ホジキンリンパ腫のようなリンパ腫は、本発明の組成物ならびに方法によって治療される好ましい疾病である。本発明の組成物及び方法は、肝細胞癌、膀胱癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及び非ホジキンリンパ腫の治療に、より好ましい。本発明の組成物及び方法は、特に肝細胞癌の治療に有用である。

ここで、本発明は、スルビビンのＡＳＯ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）及び追加の抗癌剤の分別投与からなる感受性腫瘍の治療法に関する。

さらなる態様において、本発明は、スルビビンのＡＳＯ及び追加の抗癌剤の同時投与からなる感受性腫瘍の治療法に関する。

即ち、本発明は、感受性腫瘍の治療のためのスルビビンのＡＳＯ及び追加の抗癌剤の投与を提供する。

別の観点において、本発明は、上記の方法による感受性腫瘍の治療のための医薬品の製造における、追加の抗癌剤と組み合わせたスルビビンのＡＳＯの使用を提供する。

また、別の態様において、本発明は、スルビビンのＡＳＯ及び追加の抗癌剤からなる医薬組成物に関する。即ち、本発明は、治療に使用するスルビビンのＡＳＯ及び追加の抗癌剤からなる組成物を提供する。

発明の詳細な説明
本発明の方法において、標的ＲＮＡ、標的遺伝子、又は他の標的となるゲノムポリヌクレオチド領域は、スルビビンのＲＮＡ、遺伝子、又はゲノムポリヌクレオチド領域である。本明細書で使用されているように、「標的核酸」及び「スルビビンをコードする核酸」という用語は、スルビビンをコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体及びｍＲＮＡ或いはそれらの部分を含む）ならびにそのようなＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを包含する。あるオリゴマー化合物と、この標的核酸との特異的なハイブリダイズは、この核酸の正常機能を妨害する。標的核酸と特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能の調節は、一般に「アンチセンス」と呼ばれている。

「スルビビンのアンチセンスオリゴヌクレオチド（スルビビンＡＳＯ）」という用語は、以下の配列：５’−ＴＧＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＴ−３’と少なくとも７０％相同な、修飾又は非修飾の化合物を指す。好ましくは、上記修飾或いは非修飾の化合物は、以下の配列：５’−ＴＧＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＴ−３’と少なくとも８０％相同である。さらに好ましくは、上記修飾或いは非修飾の化合物は、以下の配列：５’−ＴＧＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＴ−３’と少なくとも９０％、より好ましくは９５％相同である。最も好ましくは、上記修飾或いは非修飾の化合物は、以下の配列：５’−ＴＧＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＴ−３’と少なくとも９９％相同である。より詳しくは、「スルビビンＡＳＯ」という用語は、すべてのヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート結合であり、上記配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％相同である修飾化合物を指す。より詳しくは、すべてのヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート結合であり、上記配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％相同である上記修飾化合物は、さらに５’末端の４塩基及び３’末端の４塩基において、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−メトキシエトキシ）修飾を含む。よりさらに詳しくは、上記修飾化合物のシチジン残基は５−メチル修飾を含む。「スルビビンＡＳＯ」という用語は、最も詳しくは、以下の配列、５’−ＴＧＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＴ−３’の化合物を指し、この配列においてすべてのヌクレオシド間の結合がホスホロチオエート結合であり、５’末端の４塩基が２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を含み、３’末端の４塩基が２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を含み、且つ５位及び１０位のシチジン残基が５−メチル修飾を含む。さらにより詳しくは、「スルビビンＡＳＯ」という用語は、上記修飾化合物のナトリウム塩を指す。最も好ましくは、「スルビビンＡＳＯ」という用語は、以下の化合物を指す。

パクリタキセルは、太平洋イチイの木であるセイヨウイチイ（Ｔａｘｉｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）から分離された化学療法剤であって、タキサン群のテルペンの一員である（Ｗａｎｉら、（１９７１） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ９３： ２３２５）。パクリタキセル誘導体の合成及び抗癌活性の概説は、Ｋｉｎｇｓｔｏｎら、Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２６， “Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８６，” Ａｔｔａｕｒ−Ｒａｈｍａｎ ａｎｄ Ｌｅ Ｑｕｅｓｎｅ， Ｅｄｓ． （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， １９８６） ｐａｇｅｓ ２１９−２３５に見られる。

ゲムシタビン塩酸塩は、抗癌活性を示すヌクレオシド類似体であるが、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジンモノヒドロクロリド（β−異性体）であり、２’，２’−ジフルオロ−２’−デオキシシチジンモノヒドロクロリド或いは１−（４−アミノ−２−オキソ−１Ｈ−ピリミジン−１−イル）−２−デスオキシ−２’，２’−ジフルオロリボースとしても知られている。その構造式を以下に示す。

ゲムシタビン塩酸塩は、米国特許第５，４６４，８２６号に記載されており、当該化合物の調製法、製剤化法及び当該化合物を使用する癌治療の開示は、本明細書に参照して組み込まれている。

ドキソルビシン塩酸塩は、抗腫瘍剤として広く用いられているアントラサイクリン系抗生物質である。この物質は、真菌 ストレプトミセス ペウセティウス ヴァル カエシウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｖａｒ． ｃａｅｓｉｕｓ）から単離される。ドキソルビシン塩酸塩は、当分野で周知の手順によって合成されてもよい。参考文献には、Ｈｅｎｒｙ， Ｄ．Ｗ．， ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｎｏ． ３０， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ （１９７６） １５−５７頁；及びＡｒｃａｍｏｎｅ， Ｆ．， Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ （１９８１） Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、が含まれる。

「活性成分」という用語は、本明細書に記載のスルビビンＡＳＯ化合物を指す。「活性成分」は、スルビビンＡＳＯ化合物と追加の抗癌剤との組合せを指すこともある。このような追加の抗癌剤の例には、限定されるものではないが、パクリタキセル、ドキソルビシン塩酸塩、及びゲムシタビン塩酸塩が含まれる。このように「活性成分」は、スルビビンＡＳＯとパクリタキセルとの組合せ、スルビビンＡＳＯとゲムシタビン塩酸塩との組合せ、或いはスルビビンＡＳＯとドキソルビシン塩酸塩との組合せを指す。

本明細書で使用されているように、「患者」という用語は、スルビビンの発現或いは過剰発現に関連する一つ以上の疾病に悩まされている哺乳動物を指す。最も好ましい患者がヒトであることは理解されよう。本発明が特に哺乳動物のスルビビンの発現或いは過剰発現の阻害に関することも理解されよう。

本明細書で使用されている用語「薬理学的に許容できる塩」は、本明細書に記載の化合物の塩のことである。本発明のいずれかの塩の一部を形成する特定の対イオンは、通常は、上記塩が全体として薬理学的に許容できるものである限り、また、上記対イオンが上記塩に全体として望ましくない性質を与えない限りにおいて、危険な性質のものではないことが理解されるべきである。

用語「治療」及び「治療する」は、本明細書に記載の疾病の進行の遅延、中断、阻止、制御或いは停止があり得るすべての手順を指すことを意図するものであるが、必ずしもすべての症状の完全な除去を指すものではない。

本明細書で使用されている用語「有効量」は、ある化合物の単数回或いは複数回投与における量或いは服用量を指し、単独でも別の抗癌剤と組み合わせてもよく、本明細書に記載の疾病の治療に有効なものである。

用語「治療有効期間」とは、（ａ）スルビビンＡＳＯ或いは（ｂ）追加の抗癌剤のいずれか一つを患者に投与する時に始まり、（ａ）及び（ｂ）併用の抗癌に有益な効果の限界で終わる期間のことである。

本発明の実施で用いられる用語「治療に有効な組合せ」は、（ａ）スルビビンＡＳＯ及び（ｂ）追加の抗癌剤の、あらゆる順序における、同時或いは分別投与を意味する。このように、用語「治療に有効な組合せ」は、（ａ）スルビビンＡＳＯ及び（ｂ）ゲムシタビン塩酸塩のあらゆる順序における、同時或いは分別投与を指す。用語「治療に有効な組合せ」はさらに、（ａ）スルビビンＡＳＯ及び（ｂ）パクリタキセルのあらゆる順序における、同時或いは分別投与を指す。用語「治療に有効な組合せ」はさらに、（ａ）スルビビンＡＳＯ及び（ｂ）ドキソルビシン塩酸塩の、あらゆる順序における、同時或いは分別投与を指す。

分別投与される場合、上記スルビビンＡＳＯ及び上記追加の抗癌剤は、異なった投与計画で投与されてもよい。両投与間の時間が治療有効期間内におさまる限り、いずれか一方を他方の前に投与してもよい。スルビビンＡＳＯ及び追加の抗癌剤の投与方法は異なってもよい。このため、一方の薬剤は経口投与され、他方の薬剤は静脈内投与されてもよい。製品の一方が連続注入液として投与され、一方、他の製品は別個の剤形で提供されることも可能である。上記抗癌剤は、その機能を最適にすることが知られている方法で投与されることが特に重要である。

抗癌剤は一般に担体と混和されるが、この担体は、希釈剤又は賦形剤として作用し得る。抗癌剤は、錠剤、丸剤、粉末、トローチ剤、小袋包装剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液、シロップ又はエアロゾル剤の形で投与されてもよい。無菌注射用溶液も使用してよい。

本発明の組成物及び方法で用いられるスルビビンＡＳＯ及び追加の抗癌剤は、しばしば塩誘導体の形で有利に使用され、これは本発明の別の態様である。本発明の化合物が酸性基或いは他の反応基を有する場合、酸型である親化合物より水溶性のある又は生理学的に適切な塩が形成され得る。代表的な薬理学的に許容できる塩には、限定されるものではないが、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等のアルカリ及びアルカリ土類塩が含まれる。

ナトリウム塩は、本明細書に記載のスルビビンＡＳＯ化合物の特に好ましい形である。塩は、遊離の酸から、溶液状態の酸型を塩基で処理するか、前記酸をイオン交換樹脂にさらすことによって、簡便に調製される。好ましくは、スルビビンＡＳＯは、始めに溶液状態のアンモニウム塩として調製される。続いて、アンモニウム塩をイオン交換或いは逆相クロマトグラフィを介して、又は限外濾過膜上でナトリウム塩との透析濾過法によって、ナトリウム塩に転換される。

薬理学的に許容できる塩の定義の中には、例えばアンモニウム、四級アンモニウムといった本発明の化合物の比較的無毒な無機及び有機の塩基の付加塩、及び本発明の化合物と塩を形成するのに十分な塩基性を持つ含窒素塩基から誘導されたアミン陽イオンの付加塩が含まれる（例えば、Ｓ． Ｍ． Ｂｅｒｇｅら、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，” Ｊ． Ｐｈａｒ． Ｓｃｉ．， ６６： １−１９ （１９７７））。本発明の一定の化合物は、一個以上のキラル中心を有してもよく、これにより光学活性形で存在してよい。このような立体異性体ならびにそれらの混合物は、すべて本発明に包含される。もし特定の立体異性体が望ましいならば、当分野で周知の方法、例えば、不斉中心を含み既に分割されている出発物質との立体特異的反応を用い、或いは別法として立体異性体の混合物を結果として得る方法及び既知の方法による分割を続いて行うことによって、調製できる。例えば、ラセミ混合物を、ある他の化合物の単一の鏡像異性体と反応させてもよい。この反応は、ラセミ形をジアステレオマーの混合物に変換する。次いで、ジアステレオマーは、異なった融点、異なった沸点、及び異なった溶解度を有するので、再結晶のような従来からの手段によって分離できる。

本発明の組成物は、本明細書に記載のスルビビンＡＳＯの治療有効量と、本明細書に記載の抗癌剤の治療有効量との組合せを含む。上記組成物は、多様な経路によって投与できる。本明細書に記載の疾病に苦しむ患者の治療を行うにあたっては、本発明の組成物は、経口及び非経口経路を含む、活性成分が有効量で生物学的に利用できるあらゆる形態或いは様式で投与できる。例えば、本発明の組成物は、経口的に、吸入により、或いは皮下、筋肉内、静脈内，経皮、経鼻、直腸、眼球、局所、舌下，口腔又は他の経路によって投与できる。本明細書に記載の疾病の治療には、一般的に経口投与が好ましい。しかしながら、経口投与が好ましい唯一の経路ではない。例えば、便宜のため或いは経口投与に関連する可能性のある合併症を回避するために、静脈内経路が好ましい場合がある。組成物が静脈内経路を介して投与される場合、静脈内大量瞬時注入又は緩慢注入が好ましい。

活性成分の有効量は、当事者としての担当診断医により、既知の技法を用い、類似の状況下で得られた結果を遵守することによって、容易に決定できる。投与される化合物の有効量或いは用量の決定においては、限定されるものではないが、哺乳動物の種類、その大きさ、年齢及び全般的な健康状態、関与する特異的腫瘍、腫瘍の程度又は複雑事態或いは重症度、患者個人の反応、投与される特異化合物、投与様式、投与される調製品の生物学的利用率の特徴、選択された投与計画、共存薬剤の使用、及びその他の関連性のある状況を含む多数の要因が担当診断医によって考慮される。

至適薬用量は活性成分の相対的力価に依存して変動してよい。一般に薬用量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００μｇの範囲であって、日に、週に、月に或いは年に一回以上与えられてもよい。当事者は、活性成分の体液或いは組織中の滞留時間及び濃度を測定し、それに基づいて投薬の頻度を決定できる。単回投与による治療に続いて、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、その場合、活性成分は体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００μｇの範囲の維持用量を投与され、日に、週に、月に或いは年に一回以上与えられてもよい。

以下の実施例は、本発明の方法ならびに本発明の原理を説明するために採用された化合物及び組成物を例証するものである。試薬及び出発原料は当事者には容易に入手可能なものである。これらの実施例は、例証となることのみを意図するものであって、本発明の範囲を決して限定するものではない。

実施例１
以下の化合物は、本発明の方法及び組成物に有用なスルビビンＡＳＯ化合物及び追加の抗癌剤を代表するものである。これらの化合物は、例証となることのみを意図するものであって、いかなる状況下にあっても本発明の方法を決して限定するものではない。
化合物Ｉ（スルビビンＡＳＯ）

化合物Ｉは、スルビビンＡＳＯであって、スルビビンの発現或いは過剰発現の阻害に有用である。化合物Ｉは、米国特許第６，０７７，７０９号、第６，１６５，７８８号及び第６，３３５，１９４号に記載の承認された一般的手順に従って調製されてもよく、その全内容が本明細書に全体として組み込まれている。

化合物ＩＩ（ゲムシタビン塩酸塩）
２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジンモノヒドロクロリド（β−異性体）、又は、２’，２’−ジフルオロ−２’−デオキシシチジンモノヒドロクロリド、或いは１−（４−アミノ−２−オキソ−１Ｈ−ピリミジン−１−イル）−２−デスオキシ−２’，２’−ジフルオロリボース

ゲムシタビン塩酸塩は米国特許第５，４６４，８２６号に記載されており、同化合物の調製法、同化合物の製剤化法、及び同化合物を使用する癌治療の開示が、参照して本明細書に組み込まれている。

化合物ＩＩＩ（パクリタキセル）
（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−ベンゾイル−３−フェニルイソセリンとの５β，２０−エポキシ−１，２α，４，７β，１０β，１３α−ヘキサヒドロキシタキ−１１−セン−９−オン ４，１０−二酢酸 ２−安息香酸 １３エステル

パクリタキセルは、米国特許第５，４９６，８０４号、第５，６４１，８０３号、第５，６７０，５３７号、及び第６，５１０，３９８号に開示されており、それらは各々、合成、製剤化、及び感受性腫瘍の治療のための本剤の使用法について参照して本明細書に組み込まれている。パクリタキセルは、シグマ−アルドリッチ社から市販で入手することもできる。

化合物ＩＶ（ドキソルビシン塩酸塩）
５，１２−ナフアセンジオン，１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リクソ−ヘキソピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−，塩酸塩

ドキソルビシン塩酸塩は、当分野で周知の手順によって調製されてもよい。ドキソルビシン塩酸塩は、シグマ−アルドリッチ社から市販で入手することもできる。

アッセイ例１
本明細書に記載された細胞系カスパーゼ３アッセイ法は、抗癌剤の評価に一般に使用されており、既に記載されている（Ｃａｒｒａｓｃｏら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ （２００３） ３４：１０６４−１０６７）。同アッセイは下記のように行われる。

方法
ヒーラ細胞をバージニア州マナサスのＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手し、１０％のウシ胎仔血清（ハイクローン社）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸及び１ｍＭのピルビン酸塩（ギブコ／インビトロゲン社）を補充したＬ−グルタミン培地を含むＤＭＥＭ（ダルベッコーの修飾イーグル培地）で培養する。カスパーゼ３アッセイのために、９６−ウエルの培養板に１ウエル当り１Ｘ１０４個の細胞を播種する。リポフェクチン（ギブコ／インビトロゲン社）トランスフェクション試薬を、ＯＰＴＩＭＥＭ還元血清培地（ギブコ／インビトロゲン社）／１００ｎＭ化合物Ｉの３μＬ／ｍＬ濃度で使用する。リポフェクチン試薬を、化合物Ｉの添加前にＯＰＴＩＭＥＭ培地と３０分間インキュベートする。５０ｎＭの化合物Ｉ或いはミスマッチコントロール（ＭＭコントロール）オリゴヌクレオチドを加えて混合する。細胞を１Ｘリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、次いでＯＰＴＩＭＥＭに溶解した化合物Ｉ／リポフェクチン混合物で処理する。４時間の培養後、ＯＰＴＩＭＥＭ培地を完全増殖培地で置換する。２４時間のトランスフェクション後、１０ｎＭのゲムシタビン塩酸塩又は１．２５ｎＭのパクリタキセルを添加してさらに４８時間インキュベートする。インキュベーション期間の終結時に、カスパーゼ３の基質であるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（バイオモル社）１５０μＭを含む３Ｘ溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、４５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２ｍＭ ＥＧＴＡ、１．５％ ＮＰ４０、０．３％ＣＨＡＰＳ、３０％スクロース、３０ｍＭ ＤＴＴ、及び３．０ｍＭ ＰＭＳＦ）を各ウエルに添加して（５０μＬ／ウエル）、３７℃で１時間インキュベートする。カスパーゼ３の活性は、タンパク質分解によってＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ基質から遊離された蛍光物質を、プレート読み取り蛍光光度計を用いて３６０ｎｍで励起し、４６０ｎｍの発光で測定する。プレートのバックグラウンドを差し引いた後、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を未処理の対照と比較して、カスパーゼ３活性におけるパーセント増加として表す。

結果
スルビビン発現ダウンレギュレーションがヒーラ細胞を化学療法に対して感作するか否かを調査するために、化合物Ｉと、ゲムシタビン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、又はパクリタキセルによる併合治療を評価する。ヒーラ細胞を、化合物Ｉ或いはＭＭコントロールオリゴヌクレオチドと２４時間トランスフェクトし、次いで１０ｎＭのゲムシタビン塩酸塩又は１．２５ｎＭのパクリタキセルでさらに４８時間処理する。インキュベーション期間の終わりに、カスパーゼ３活性を測定する。表１のデータは、ゲムシタビン塩酸塩又はパクリタキセルと併用して化合物Ｉで処理された腫瘍細胞が、いずれか一方の試薬単独の処理と比較して、相加的以上のカスパーゼ３酵素活性を生じることを示している。データは未処理の対照と比較してカスパーゼ３活性の百分率で表現されている。「Ｓ．Ｅ．Ｍ．」は平均値の標準誤差を指す。ＭＭコントロールヌクレオチド処理は、ゲムシタビン塩酸塩又はパクリタキセルのいずれに対しても腫瘍細胞を感作しない。

アッセイ例２
ヒトの異種移植腫瘍モデルの使用は、既に記載されており、当分野では周知のことである。以下の腫瘍タイプを使用して、下記のアッセイを行うことができる。Ｕ−８７ＭＧヒト神経膠芽細胞腫は、ＡＴＣＣ（米国バージニア州マナサス）から入手する（Ｋｉａｒｉｓら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ （２０００） ２（３）：２４２−５０）。

方法
異種移植検討のために、動物を移植直前に照射し（４５０ＴＢＩ（全身照射））、細胞をマトリゲル（１：１）に混入される。０．２ｍＬ容の総数６×１０^６個のＵ−８７ＭＧ腫瘍細胞を左側後方脇腹に皮下注射する。化合物Ｉ或いはＭＭコントロールオリゴヌクレオチドのそれぞれ５０ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量を用いて、腫瘍の大きさがほぼ１００ｍｇに達した時点で、治療を開始する。化合物Ｉ或いはＭＭコントロールオリゴヌクレオチドのその後の静脈内用量（２５ｍｇ／ｋｇ）を、すべて１日おきに投与する。ゲムシタビン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、又はパクリタキセルの次善用量による治療を、上記負荷用量後１日おいて開始する。ゲムシタビン塩酸塩を、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で３日おきに総計４用量腹腔内投与する。パクリタキセルを、１ｍｇ／ｋｇの用量で４日おきに総計４用量静脈内投与する。

二次元測定を週に２回行い、腫瘍容積を次式：（腫瘍容積）＝［（長さ）（幅２）（П／６）］に基づいて計算す。腫瘍容積を対数目盛に変換し、時間及び治療群にわたる変動を均等化する。データは、ＳＡＳ ＰＲＯＣ ＭＩＸＥＤソフトウエア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、キャリー、ノースカロライナ）を用いて、時間及び治療により二元配置分散分析を使用して分析する。反復測定用の好ましい相関モデルは、ＡＲ（次数１の自己回帰モデル）である。

治療群を各時点で比較する。時間に対する各治療群について平均値及び標準誤差として、データをプロットする。併用治療における相乗作用の存在を、腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）スケール上で評価する。特定の腫瘍の大きさ（本検討においては、１５００又は２０００又は２５００ｍｇ）に到達する時間を、各動物について決定する。上記の大きさに達しない腫瘍は、右側打ち切り値として本分析に含める。ワイブル分布を仮定する最尤分析を用いて、各治療群について平均時間及び標準誤差を計算する。腫瘍増殖遅延は、それぞれの治療群と対照群との間の平均時間の差である。ある併用治療は、その腫瘍増殖遅延時間が薬物の個別投与による治療に対する腫瘍増殖遅延時間の合計よりも有意に大きければ、相乗効果を有するものと決定される。

結果
表２のデータは、化合物Ｉのゲムシタビン塩酸塩との併用効果を示している。両者の併用は、いずれか一方の化合物単独投与と比較して、腫瘍増殖における統計的に有意な（ｐ＝０．００９２）遅延を引き起こしている。このように、化合物Ｉとゲムシタビン塩酸塩との組合せは、３日〜４．６日という相加的腫瘍増殖遅延以上の結果をもたらしている。

Claims (13)

1. 有効量のスルビビンアンチセンスオリゴヌクレオチドと有効量のゲムシタビン塩酸塩とを含有する医薬組成物。
2. 前記スルビビンアンチセンスオリゴヌクレオチドが化合物Ｉである、請求項１記載の組成物。
3. 患者における癌治療のための医薬品の製造における、スルビビンアンチセンスオリゴヌクレオチド及びゲムシタビン塩酸塩を含有する組成物の使用。
4. スルビビンアンチセンスオリゴヌクレオチド及びゲムシタビン塩酸塩の治療に有効な組合せを患者に投与することを含む、前記患者における癌の治療方法。
5. 前記スルビビンアンチセンスオリゴヌクレオチド及びゲムシタビン塩酸塩が治療有効期間内に分別投与される、請求項４記載の方法。
6. 前記スルビビンアンチセンスオリゴヌクレオチドが化合物Ｉである、請求項５記載の方法。
7. 前記癌が膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肝細胞癌、結腸直腸癌及びリンパ腫からなる群より選ばれる、請求項５又は６記載の方法。
8. 前記癌が肝細胞癌である、請求項７記載の方法。
9. 患者における癌の治療のための、スルビビンアンチセンスオリゴヌクレオチド及びゲムシタビン塩酸塩の治療に有効な組合せの使用。
10. 前記スルビビンアンチセンスオリゴヌクレオチド及びゲムシタビン塩酸塩が治療有効期間内に分別投与される、請求項９記載の使用。
11. 前記スルビビンアンチセンスオリゴヌクレオチドが化合物Ｉである、請求項１０記載の使用。
12. 前記癌が膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肝細胞癌、結腸直腸癌及びリンパ腫からなる群より選ばれる、請求項１０又は１１記載の使用。
13. 前記癌が肝細胞癌である、請求項１２記載の使用。