JP2007528004A - 癌診断のための自己抗体検出 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 生体サンプルにおける抗ECPKA自己抗体の検出のための組成物および方法、ならびにヒトおよび非ヒト哺乳動物における癌の診断におけるこのような組成物および方法の使用を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は、生体サンプルにおける抗ECPKA自己抗体の検出のための組成物および方法、ならびにヒトおよび非ヒト哺乳動物における癌の診断におけるこのような組成物および方法の使用に関する。
本願は、米国特許出願番号60/550,348(2004年3月8日出願)、および60/551,776(2004年3月11日出願)に対して優先権を主張するものであり、これらの出願は参照することによりその全てが本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所のNCI内部研究プログラムCCRから資金援助を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
腫瘍マーカーは、悪性細胞により合成され、血流中に放出される。このようなマーカーはまた、浸潤に応答してまたは腫瘍誘導代謝性変化の結果として、宿主組織により産生され得る。血液または組織液中の腫瘍マーカーのレベルは、腫瘍の進行または退縮の診断、スクリーニング、および監視に役立つ。理想的な腫瘍マーカーは、簡単な血液検査で癌を検出することができ、そのレベルは腫瘍進行の段階と相関するであろう。しかしながら、感度および特異性の欠如により、一般の健康集団または最も危険度の高い集団における単独マーカーはこれまでに確立されていない。癌診断における腫瘍マーカーの使用については、(Sluss, P. M. et al. [2004]" ESTABLISHMENT OF A CENTRAL LABORATORY SERUM TUMOR MARKER SERVICE ON A CONSOLIDATED IMMUNODIAGNOSTIC PLATFORM: DEVELOPMENT OF PRACTICE STANDARDS, SERVICE IMPROVEMENTS, AND OPERATIONAL EFFICIENCY, " Clin Leadersh Manag Rev. 18[1]:25-31; Gion, M. [2000]"SERUM TUMOUR MARKERS: FROM QUALITY CONTROL TO TOTAL QUALITY MANAGEMENT," Breast 9 [6]:306-11;. Wiesner,A. [2004] "DETECTION OF TUMOR MARKERS WITH PROTEINCHIP(登録商標) TECHNOLOGY," Curr Pharm Biotechnol. Feb;5[l]: 45-67; Crawford, N.P. et al.[2003] "TUMOR MARKERS AND COLORECTAL CANCER: UTILITY IN MANAGEMENT," J Surg Oncol.84 [4]: 239-48; Agnantis, N.J. et al.[2003] "TUMOR MARKERS. AN UPDATE APPROACH FOR THEIR PROGNOSTIC SIGNIFICANCE. PART I. IN VIVO," 17 [6]: 609-18; Riley, R. D. et al. [2004] "A SYSTEMATIC REVIEW OF MOLECULAR AND BIOLOGICAL TUMOR MARKERS IN NEUROBLASTOMA," Clin Cancer Res. 10 [1 Pt 1]: 4-12; Given, M. et al. [2000] "THE PREDICTIVE OF TUMOUR MARKERS CA 15-3, TPS AND CEA IN BREAST CANCER RECURRENCE,"Breast. 9 [5]: 277-80)に詳述されている。
本発明は、細胞外プロテインキナーゼA(ECPKA)に対するIgG抗体を測定するための高感度酵素イムノアッセイ(EIA)に関する。様々なタイプの癌の295患者および癌でない100個人由来の血清を検査した。抗ECPKA IgG抗体の度数は、癌ではないもの(14%)に比し癌患者(92%)において有意に高いということを見出した。EIAにより測定された抗ECPKA IgG抗体とPKA酵素的アッセイにより測定されたECPKA抗原との間には有意な相関関係はなく、抗ECPKA IgG抗体−EIA法は、ECPKA酵素的アッセイよりもより優れた感度および特異性をもたらした。これらの結果は、従来の抗原解析よりもむしろ自己抗体解析のアプローチが、癌診断に対する有用なアプローチを提供するということを立証している。
(a)生体サンプルを抗ECPKA自己抗体に特異的な抗原と接触させるステップ、該接触はサンプル中に存在するならば抗ECPKA自己抗体が抗原と結合し、抗原−抗ECPKA自己抗体複合体を形成するのに十分な条件下でなされる;
(b)形成した抗原−抗ECPKA自己抗体複合体を抗ECPKA自己抗体結合分子と接触させるステップ、該接触は抗ECPKA自己抗体結合分子が形成した抗原−抗ECPKA自己抗体複合体の抗ECPKA自己抗体と結合し、拡大した複合体を形成するのに十分な条件下でなされる;および
(c)形成した拡大した複合体の存在または濃度を測定することにより、生体サンプルにおける抗ECPKA自己抗体の存在または濃度を測定するステップ
を含む。
ステップ(a)において、生体サンプルは第1の多孔質担体との接触下におかれ、該第1の多孔質担体は抗ECPKA自己抗体に特異的な非固定化、標識抗原を含む;
ステップ(b)において、形成した抗原−抗ECPKA自己抗体複合体は第2の多孔質担体との接触下におかれ、該第2の多孔質担体は該第1の多孔質担体と連通しており、固定化抗ECPKA自己抗体結合分子を含む;および
ステップ(c)において、生体サンプルにおける抗ECPKA自己抗体の存在または濃度が、該第2の多孔質担体において抗ECPKA自己抗体に特異的な標識抗原の存在を検出することにより測定される。
第1の多孔質担体は非固定化、標識PKA CαまたはCαフラグメントを含み;および
第2の多孔質担体はヒトIgGに結合する固定化、非標識抗体を含む。
本発明は、生体サンプルにおける抗ECPKA自己抗体の検出のための組成物および方法、ならびにヒトおよび非ヒト哺乳動物(特にイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、およびウマの哺乳動物)における癌の診断におけるこのような組成物および方法の使用に関する。
ヒトの癌診断における抗ECPKA自己抗体イムノアッセイとPKA酵素的アッセイの比較評価
対象:血清サンプルを、様々な癌細胞タイプの295ヒト患者および癌でない100個人から採取した。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA):癌患者および健常人の血清における抗ECPKA IgG自己抗体を、固相ELISAアッセイにより測定した。このようなアッセイのために、丸底塩化ビニルマイクロタイタープレート(round-bottom polyvinyl chloride microtiter plates)(Thermolab System, Helsinki, Finland)を、100μlの希釈(PBSで50μg/mlの濃度)精製した組換えヒトPKA Cα抗原(材料および方法、PKA Cαの精製を参照)でコートした。プレートを室温で1時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液(20 mM Hepes, 0.9%NaCl, 30 mM スクロース−0.1 % ウシ血清アルブミン [BSA], pH 7.0)で1回洗浄し、各ウェルを水に溶解した(4 g/400 ml)100μlのBlockace(Serotec, http://www.serotec.com)で室温で2時間ブロックし、次いでプレートをクエン酸ナトリウム洗浄液(50 mM Na citrate, 0.15 M NaCl, 0.1 % モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン Tween(登録商標)20, pH 5.0-5.2)で2回洗浄した。血清サンプルをサンプル希釈緩衝液(PBS pH 7.4, 0.25% BSA [fatty acid free fraction V], 0.05% Tween 20)で25,000倍に希釈し、100μlの希釈したサンプルを各ウェルに添加し、次いで37℃で1時間インキュベートした。クエン酸ナトリウム洗浄液で3回洗浄した後、100μlのPBS中の20,000倍希釈した抗ヒトIgG−HRP抗体−酵素コンジュゲート(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)、1% BSAをウェルに添加し、その後プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートをクエン酸ナトリウム洗浄液で5回洗浄した後、100μ1のTMB基質を添加した。反応を100μlの0.45 M H2S04試薬で停止し、その後450 nmでの吸光度をELISAリーダー (BioRad [Hercules, CA] microplate reader benchmark)に記録した。ELISA特異度は、1 mg/mLの最終濃度の上述の抗原と室温で1時間インキュベートした血清サンプルで、阻害検査を同時に行うことにより確定した。
PKA Cαの精製:OT1529-Cαプラスミド由来の組換えヒトPKA Cα (1.1 kb)(Cho, Y.S. et al. [2000] "EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A AS A CANCER BIOMARKER: ITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSAL BY A MYRISTATE-LACKING CALPHA AND RIIBETA SUBUNIT OVEREXPRESSION," Proc Natl Acad Sci USA. 97[2]: 835-40)をpQE31 DNAに注入し、pQE-Cαを産生した(Hong,S.H. Seoul National University, Seoul, Korea, unpublished)。pQE-Cαプラスミドを大腸菌で発現させ、天然PKA Cαタンパク質の精製を行った(Paragon, Baltimore MD)。
PKAアッセイ:PKAの酵素活性を、Rohlff, C. et al. (1993)の方法("8-Cl-cAMP INDUCES TRUNCATION AND DOWN-REGULATION OF THE RI ALPHA SUBUNIT AND UP-REGULATION OF THE RII BETA SUBUNIT OF CAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE LEADING TO TYPE II HOLOENZYME-DEPENDENT GROWTH INHIBITION AND DIFFERENTIATION OF HL-60 LEUKEMIA CELLS, "J Biol Chem. 268: 5774-82)により測定した。血清ECPKA活性の測定のために、アッセイ(全量、50μ1)を、反応混合物中(50mM Tris HCl [pH 7.5], 1mM DTT, 10mM MgCl2, 5μM Kemptide [PKAに対する合成基質;GIBCO/BRL], 1.2μM [γ-32P]ATP [25 Ci/mmol; ICN] 5μM cAMPおよび5μM PKI 有りまたは無し、を含有)および10μ1の血清中で37℃で20分実行した。インキュベーションの後、反応混合物をホスホセルロースディスク (GIBCO/BRL)上にスポットし、0.5% リン酸中で3回洗浄した。フィルターを風乾し、液体シンチレーションカウンターによりカウントした。PKA活性の1ユニットは、標準アッセイ系において37℃で1分間に1 pmolの32Pを(γ-32P)ATPから回収タンパク質に移行した酵素の量と定義した。LDH活性を、市販のキット(Sigma)を用いることにより測定した。
ヒト患者および正常対照個人の血清を、上述のELISAを用いて検査し、正常対照血清の平均吸光度との比として抗ECPKA自己抗体力価を適宜表した。正常対照の抗ECPKA自己抗体力価より、1.0より大きい比をポジティブと見なした。
ヒトの癌における抗ECPKA自己抗体イムノアッセイおよびその使用に関する結論
Claims (19)
- 哺乳動物の生体サンプルにおいて抗ECPKA自己抗体の存在または濃度を測定するイムノアッセイであって、ステップ:
(a)生体サンプルを抗ECPKA自己抗体に特異的な抗原と接触させるステップ、接触はサンプル中に存在するならば抗ECPKA自己抗体が抗原と結合し、抗原−抗ECPKA自己抗体複合体を形成するのに十分な条件下でなされる;
(b)形成した抗原−抗ECPKA自己抗体複合体を抗ECPKA自己抗体結合分子と接触させるステップ、接触は抗ECPKA自己抗体結合分子が形成した抗原−抗ECPKA自己抗体複合体の抗ECPKA自己抗体と結合し、拡大した複合体を形成するのに十分な条件下でなされる;および
(c)形成した拡大した複合体の存在または濃度を測定することにより生体サンプルにおける抗ECPKA自己抗体の存在または濃度を測定するステップ
を含むイムノアッセイ。 - 抗ECPKA自己抗体に特異的な抗原が細胞外PKAタンパク質である、請求項1のイムノアッセイ。
- 抗ECPKA自己抗体が該哺乳動物のとは異なる哺乳動物の種の抗体であり、該哺乳動物により産生された抗体に特異的である、請求項1のイムノアッセイ。
- 哺乳動物がヒトであり、抗ECPKA自己抗体がヒトIgG抗体である、請求項3のイムノアッセイ。
- 抗ECPKA自己抗体結合分子が検出可能な程度に標識されている、請求項1のイムノアッセイ。
- 検出可能な標識が化学標識である、請求項5のイムノアッセイ。
- ステップ(a)において、抗ECPKA自己抗体に特異的な抗原が生体サンプルとの接触の前に固体支持体に固定化される、請求項1のイムノアッセイ。
- ステップ(a)において、抗ECPKA自己抗体に特異的な抗原が生体サンプルとの接触の後に固体支持体に固定化される、請求項1のイムノアッセイ。
- イムノアッセイが免疫クロマトグラフィーイムノアッセイであり、ここで:
ステップ(a)において、生体サンプルは第1の多孔質担体との接触下におかれ、第1の多孔質担体は抗ECPKA自己抗体に特異的な非固定化、標識抗原を含む;
ステップ(b)において、形成した抗原−抗ECPKA自己抗体複合体は第2の多孔質担体との接触下におかれ、第2の多孔質担体は第1の多孔質担体と連通しており、固定化抗ECPKA自己抗体結合分子を含む;および
ステップ(c)において、生体サンプルにおける抗ECPKA自己抗体の存在または濃度が、第2の多孔質担体における抗ECPKA自己抗体に特異的な標識抗原の存在を検出することにより測定される、
請求項1のイムノアッセイ。 - 抗ECPKA自己抗体に結合する抗ECPKA自己抗体に特異的な抗原を含む免疫複合体であって、抗ECPKA自己抗体がさらに抗ECPKA自己抗体結合分子に結合する免疫複合体。
- 抗ECPKA自己抗体に特異的な抗原が細胞外PKAタンパク質である、請求項10の免疫複合体。
- 抗ECPKA自己抗体結合分子が検出可能な程度に標識されている、請求項10の免疫複合体。
- 検出可能な標識が化学標識である、請求項12の免疫複合体。
- 抗ECPKA自己抗体結合分子が免疫分子である、請求項10の免疫複合体。
- 抗ECPKA自己抗体がヒト自己抗体であり、抗ECPKA自己抗体結合分子が抗ヒトIgG抗体である、請求項14の免疫複合体。
- 哺乳動物の生体サンプルにおける抗ECPKA自己抗体の存在または濃度を測定するためのキットであって、キットは多層フィルターシステム、ならびに第1および第2の多孔質担体を含む中空のケースを含み、そこで第2の多孔質担体は第1の多孔質担体と連通しており、第1の多孔質担体は多層フィルターシステムと連通しており、その一部は該ケースから到達可能である;ここで:
第1の多孔質担体は非固定化、標識PKA CαまたはCαフラグメントを含み;および
第2の多孔質担体はヒトIgGに結合する固定化、非標識抗体を含む。 - 標識PKA CαがECPKAである、請求項16のキット。
- 標識PKA Cαの標識が化学標識である、請求項16のキット。
- キットがヒト抗ECPKA自己抗体を検出し、ヒトIgGに結合する抗体が非ヒト哺乳動物の抗体である、請求項16のキット。
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