JP2007527723A - Quality assurance system for detecting microorganisms - Google Patents
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Abstract
本発明は、ａ)国際薬局方、食品法、化粧品指令または通常の市販の間接法による標準条件下、８〜２４時間の培養に対応する一晩培養で試料中の微生物を増菌するためのシステムと、ｂ)ｉ)生存細胞の場合、特定の蛍光色素試薬との反応により検出可能な蛍光色素を放出する特定の酵素の生成を導く、誘導物質および蛍光試薬を含有する少なくとも一つの試薬と、ii)インサイチュハイブリダイゼーションにより微生物を検出するための、蛍光マーカーに固定された少なくとも一つの核酸プローブとを含有する、ろ過性および／または非ろ過性生産物中の生存、損傷または死んだ微生物を検出するためのキットとを含んでなり、増殖性微生物について＜１０ＣＦＵ／ｇの検出限界を達成する、増殖性微生物を検出するための品質保証システムに関する。また、本発明は、本発明の品質保証システムの使用、および本発明の品質保証システムを使用して、ろ過性および／または非ろ過性試料または生産物中の生存、損傷または死んだ微生物を検出するための方法に関する。The present invention is for a) enrichment of microorganisms in a sample by overnight culture corresponding to culture for 8 to 24 hours under standard conditions according to the international pharmacopoeia, food law, cosmetics directive or normal commercial indirect method. And b) i) in the case of viable cells, at least one reagent containing an inducer and a fluorescent reagent that leads to the production of a specific enzyme that releases a detectable fluorescent dye upon reaction with the specific fluorescent dye reagent; Ii) living, damaged or dead microorganisms in filterable and / or non-filterable products containing at least one nucleic acid probe immobilized on a fluorescent marker for detecting microorganisms by in situ hybridization A quality assurance system for detecting proliferating microorganisms, comprising a kit for detecting and achieving a detection limit of <10 CFU / g for proliferating microorganisms To. The present invention also uses the quality assurance system of the present invention and uses the quality assurance system of the present invention to detect live, damaged or dead microorganisms in filterable and / or non-filterable samples or products. On how to do.
Description
本発明は、一般に、微生物の検出、およびろ過性および／または非ろ過性生産物の品質制御、および生産工場の衛生状態の評価に関する。 The present invention generally relates to the detection of microorganisms, the quality control of filterable and / or non-filterable products, and the assessment of the hygiene of production plants.
長い間、生産物中の微生物の同定は、時間がかかる培養および付随する増幅によってのみ行うことができ、要求された結果は、１〜２週間後にのみ利用可能であった。例えば、細菌、真菌類および単細胞藻類について、培養は、各々の種について最も有利な栄養培地中で行われていた。
この同定方法は、どれ位多くの、およびどの微生物が単位体積当たりの最終生産物中に存在するかを確立する。増殖可能な生存微生物は、中間または最終生産物の望まれない汚染を生じさせ得るため、特に興味深い。
For a long time, identification of microorganisms in the product could only be done by time-consuming culture and attendant amplification, and the required results were only available after 1-2 weeks. For example, for bacteria, fungi and unicellular algae, the cultivation has been carried out in the most advantageous nutrient medium for each species.
This identification method establishes how many and which microorganisms are present in the final product per unit volume. Viable microorganisms that can grow are of particular interest because they can cause unwanted contamination of intermediate or end products.
標準的方法は、例えば、膜ろ過であり、ここで試料は培養およびろ過され、そして微生物は膜上に残る。該微生物を、膜上で増殖させ、そして同定する。他の方法は、スタンディング試験、および、ある程度、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)である。しかしながら、ポリメラーゼ連鎖反応は、「裸の」ＤＮＡでさえも陽性結果を与えるので、偽陽性結果は一般的である。
しかしながら、全てのこれらの方法は、試料の処理が非常に複雑であり、および結果が早くても数日間から数週間後にのみわかるという欠点を伴う。
A standard method is, for example, membrane filtration, where the sample is cultured and filtered and the microorganisms remain on the membrane. The microorganism is grown on the membrane and identified. Other methods are standing tests and, to some extent, polymerase chain reaction (PCR). However, false positive results are common because the polymerase chain reaction gives positive results even with "naked" DNA.
However, all these methods have the disadvantage that the processing of the sample is very complex and the results are only known after a few days to weeks at the earliest.
既知の方法のさらなる開発は、例えば、ＤＮＡに結合し、かくしてＲＮＡの合成を阻害する蛍光色素を細胞に導入し、および該細胞をエピ蛍光顕微鏡法によって検出する直接エピ蛍光フィルター技術(ＤＥＦＴ)(Kroll, R.；Methods in Molecular Biology；1995；46；１１３〜１２１頁)によって、ろ過性生産物(例えば、飲料)中の生存細胞を直接同定可能にする方法を導いている。欧州特許EP 386051およびDE 19841588は、例えば、誘導物質を使用して生存微生物中に特定の酵素を形成させ、続いて、形成された酵素と反応して蛍光を発することで検出され得る蛍光試薬を添加することによって、どのようにＤＥＦＴ方法を変形することができるかを記載する。しかしながら、この方法は、大腸菌または乳酸菌の検出についてのみ記載されている。さらに、ＤＥＦＴ方法の既知の変形のいずれも、ろ過性生産物についてしか使用できず、これが主な欠点である。さらに、この方法は、単位領域当たり除外される少なくとも１０〜１,０００個の微生物が存在しなければならないという検出限界の問題を伴う。しかしながら、このような試料中の非常に多くの微生物は、今日の衛生状態の要件を満たさない。したがって、迅速かつ多大な努力をせずに、試料中の少数の微生物を検出可能にするシステムの必要性が存在する。 Further developments of known methods include, for example, direct epifluorescence filter technology (DEFT), which introduces fluorescent dyes into cells that bind to DNA and thus inhibit RNA synthesis, and detect the cells by epifluorescence microscopy (DEFT) ( Kroll, R .; Methods in Molecular Biology; 1995; 46; pp. 113-121) lead to a method that allows direct identification of viable cells in filterable products (eg beverages). European patents EP 386051 and DE 19841588 describe, for example, fluorescent reagents that can be detected by using inducers to form specific enzymes in viable microorganisms and subsequently reacting with the formed enzymes to fluoresce. It describes how the DEFT method can be modified by addition. However, this method is only described for the detection of E. coli or lactic acid bacteria. Furthermore, any of the known variants of the DEFT process can only be used for filterable products, which is a major drawback. Furthermore, this method involves the problem of detection limits that there must be at least 10 to 1,000 microorganisms excluded per unit area. However, the vast number of microorganisms in such samples do not meet today's hygiene requirements. Thus, there is a need for a system that can detect a small number of microorganisms in a sample without rapid and extensive effort.
非ろ過性生産物について、蛍光核酸プローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションにより特異的微生物の検出を導く方法が存在する。この方法は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)として既知であり、細胞中の任意の種類の核酸を検出および位置決めするために使用される。この目的のために、標識ＲＮＡまたはＤＮＡプローブを使用して、染色体中に存在するＤＮＡ／ＲＮＡとの分子ハイブリダイゼーションを行う。(ＦＩＳＨ；Amann, R.L.、W. LudwigおよびK.-H. Schleifer、1995、Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.、Microbiol. Rev. 59、１４３〜１６９頁；独国特許DE 10160666参照)。該プローブの特異的ハイブリダイゼーションは、例えば、独国特許DE 19936875中に記載の蛍光顕微鏡法に基づく技術によって検出される。 For non-filterable products, there are methods that lead to the detection of specific microorganisms by in situ hybridization using fluorescent nucleic acid probes. This method is known as fluorescence in situ hybridization (FISH) and is used to detect and locate any type of nucleic acid in a cell. For this purpose, molecular hybridization with DNA / RNA present in the chromosome is performed using labeled RNA or DNA probes. (FISH; Amann, RL, W. Ludwig and K.-H. Schleifer, 1995, Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation., Microbiol. Rev. 59, 143-169; German patent DE 10160666 reference). Specific hybridization of the probe is detected, for example, by a technique based on fluorescence microscopy as described in DE 19936875.
ＦＩＳＨ技術は、それらの生体機能によって、進化の過程においてわずかに変異したに過ぎない特定の分子：１６Ｓおよび２３Ｓリボソームリボ核酸(ｒＲＮＳ)が細菌細胞中に存在するという事実に基づく。両者は、リボソーム(タンパク質生合成部位)の構成成分であり、およびそれらの偏在する分散、それらの大きさおよびそれらの構造的および官能性不変性によって特異的マーカーとして役に立つ。ｒＲＮＡデータバンクは、種-および属-特異的遺伝子プローブを構築するのに使用することができる。この目的のために、全ての利用可能なｒＲＮＡ配列は互いに比較され、および細菌の種、属または群を特異的に検出するプローブが製造される。
ＦＩＳＨ技術において、リボソームの標的配列上の特定領域に相補的であるこれらの遺伝子プローブを細胞中に導入する。該遺伝子プローブは、通常、小さく、１６〜２０塩基長の一本鎖デオキシリボ核酸フラグメントであり、および細菌の種または群に典型的である標的領域に向けられている。蛍光標識遺伝子プローブが細菌細胞中にその標的配列を見付けた場合、それはその配列に結合するので、それらの蛍光によって、該細胞を蛍光顕微鏡で検出することができる。
FISH technology is based on the fact that certain molecules: 16S and 23S ribosomal ribonucleic acid (rRNS), which are only slightly mutated in the course of evolution, exist in bacterial cells due to their biological functions. Both are components of the ribosome (protein biosynthesis site) and serve as specific markers by their ubiquitous dispersion, their size and their structural and functional invariance. The rRNA databank can be used to construct species- and genus-specific gene probes. For this purpose, all available rRNA sequences are compared to each other and probes are produced that specifically detect bacterial species, genera or groups.
In FISH technology, these gene probes that are complementary to specific regions on the target sequence of the ribosome are introduced into the cell. The gene probe is usually a small, single-stranded deoxyribonucleic acid fragment of 16-20 bases in length and is directed to a target region that is typical for bacterial species or groups. If a fluorescently labeled gene probe finds its target sequence in a bacterial cell, it binds to that sequence, so their fluorescence allows the cell to be detected with a fluorescence microscope.
しかしながら、研究は、大集団の変動に起因して、これらの方法がサンプリングレベルの統計的問題を伴うことを示した。また、検出限界も問題である。なぜなら、単位領域当たり除外される少なくとも１０〜１,０００個の微生物は、確実な結果を得るためにも必要であるからである。このような試料中の非常に多くの微生物は、今日の衛生状態の要件を満たさない。 However, studies have shown that these methods involve sampling level statistical problems due to large population variability. The detection limit is also a problem. This is because at least 10 to 1,000 microorganisms excluded per unit area are necessary to obtain reliable results. The vast number of microorganisms in such samples do not meet today's hygiene requirements.
国際薬局方(欧州薬局方)によれば、＜１００ＣＦＵ／ｇの検出限界は未だ許容されており、生産物の上市には十分であるけれども、今日、産業および消費者は、はるかにより低い検出限界を期待しており、また、今日、生産物が満たすことが期待される衛生標準はそのように高いので、＜１０ＣＦＵ／ｇの検出限界は不可避であり、および＜１ＣＦＵ／ｇの検出限界が標的とされるべきである。 According to the International Pharmacopoeia (European Pharmacopoeia), detection limits of <100 CFU / g are still acceptable and sufficient for the launch of products, but today, industry and consumers have much lower detection limits. And because today's hygiene standards that products are expected to meet are so high, a detection limit of <10 CFU / g is inevitable, and a detection limit of <1 CFU / g is targeted Should be.
微生物を検出および定量するための方法は、多くの異なる微生物について、迅速および高効率な検出方法、低検出限界および低コストの要求を満たすために、益々、より高感度およびユーザーフレンドリーとなることが必要である。それは、しばしば、第一工程として「非存在試験」(有(yes)／無(no)試験)を単に行い、微生物を分類学的に決定する前に、そもそも試料中に微生物が存在するかどうかを確かめるのに十分である。それは、種々の微生物について、多数の検出方法を適用しなければならないか、または市場において利用可能な最も効果的な種々の方法を選択しなければならないため、余りにも時間がかかり、および、余りに大きい研究室の収容能を必要とする。 Methods for detecting and quantifying microorganisms are increasingly becoming more sensitive and user friendly to meet the demands of fast and efficient detection methods, low detection limits and low cost for many different microorganisms. is necessary. It is often the case that the first step is simply a “absence test” (yes / no test) to determine whether microorganisms are present in the sample before taxonomically determining the microorganisms. Enough to make sure. It is too time consuming and too large because many detection methods have to be applied for different microorganisms or the most effective different methods available on the market must be selected Requires capacity in the laboratory.
したがって、本発明によって解決される問題は、ろ過性および非ろ過性試料および生産物の両方を分析することができ、および種々の微生物、生存および死んだ微生物の両方を迅速な方法により定量的に検出することができるシステムを提供することであった。該システムは、選択された量の試料において、＜１０ＣＦＵ／ｇの検出限界で微生物を検出可能にするであろう。該システムは、生物体に特に適用可能であるばかりでなく、試料および生産物中の微生物の一般的な検出も提供するであろう。該システムは、生産工場の衛生状態をモニターするのを可能にするであろう。 Thus, the problem solved by the present invention is that both filterable and non-filterable samples and products can be analyzed, and both various microorganisms, both living and dead microorganisms can be quantitatively analyzed in a rapid manner. It was to provide a system that can be detected. The system will enable detection of microorganisms in a selected amount of sample with a detection limit of <10 CFU / g. The system will not only be particularly applicable to organisms, but will also provide general detection of microorganisms in samples and products. The system will make it possible to monitor the hygiene of the production plant.
本発明は、ａ)国際薬局方(例えば欧州薬局方)、食品法、化粧品指令または市販の間接法(例えば、微生物の成長の間に形成されたＣＯ２を決定する間接方法など)による標準条件下、８〜２４時間の培養に対応する「一晩培養」で試料中の微生物を増菌するためのシステムと、
ｂ)ｉ)生存細胞によって、特定の蛍光試薬との反応により検出可能な蛍光色素を放出する特定の酵素の生成を導く、誘導物質および蛍光試薬を含有する少なくとも一つの試薬と、
ii)インサイチュハイブリダイゼーションにより微生物を検出するための、蛍光マーカーに固定された少なくとも一つの核酸プローブと
を含有する、ろ過性および／または非ろ過性生産物中の生存、損傷または死んだ微生物を検出するためのキットと
を含んでなり、
増殖性微生物について＜１０ＣＦＵ／ｇの検出限界を達成する、
増殖性微生物を検出するための品質保証システムに関する。
The present invention provides: a) standard conditions according to international pharmacopoeia (eg European pharmacopoeia), food law, cosmetic directive or commercially available indirect methods (eg indirect methods for determining CO 2 formed during the growth of microorganisms) Below, a system for increasing the number of microorganisms in the sample by “overnight culture” corresponding to 8-24 hours of culture,
b) i) at least one reagent containing an inducer and a fluorescent reagent that leads to the production of a specific enzyme that releases a detectable fluorescent dye by reaction with the specific fluorescent reagent by viable cells;
ii) Detecting living, damaged or dead microorganisms in filterable and / or non-filterable products containing at least one nucleic acid probe immobilized on a fluorescent marker for detecting microorganisms by in situ hybridization And a kit for
Achieve a detection limit of <10 CFU / g for proliferating microorganisms,
The present invention relates to a quality assurance system for detecting proliferating microorganisms.
従来の試験方法においては、０.１ｇのみ、および最大１ｇの試料を、通常、試験を行うために取る。これは、深刻な統計的問題を生じさせる。なぜなら、理想的には、できるだけ大きな試料体積を試験すべきであるからである。しかしながら、従来の試験方法では、上記の大きさの試料しか取ることができない。 In conventional test methods, only 0.1 g and up to 1 g of sample are usually taken for testing. This creates serious statistical problems. This is because ideally a sample volume as large as possible should be tested. However, the conventional test method can only take a sample of the above size.
一方、「一晩培養」における培養は、国際薬局方、食品法および化粧品指令に規定された標準的方法に対応する。一晩培養は、試料を８〜２４時間、好適には１０〜２０時間および特には１２〜１５時間培養することを特に意味する。標準培養条件は、該当する正文に記載されている。しかしながら、少しの逸脱、例えば、栄養培地の構成成分の濃度、標準培養方法の温度または他のパラメーターは、本発明の品質保証システムに包含されるべきである。同様に、該正文に対する如何なる補正も、本発明のシステムに適用可能であるべきである。しかしながら、該条件は、増殖性微生物についての検出限界を決定することができるように、記録されなければならない。したがって、使用される試料の量は、非常に重要である。 On the other hand, the culture in “overnight culture” corresponds to the standard method defined in the International Pharmacopoeia, Food Act and Cosmetic Directive. Overnight culture means in particular that the sample is cultured for 8 to 24 hours, preferably 10 to 20 hours and in particular 12 to 15 hours. Standard culture conditions are described in the appropriate text. However, minor deviations should be included in the quality assurance system of the present invention, such as nutrient medium component concentrations, standard culture method temperatures or other parameters. Similarly, any amendments to the text should be applicable to the system of the present invention. However, the conditions must be recorded so that the limit of detection for proliferating microorganisms can be determined. Therefore, the amount of sample used is very important.
本発明によれば、国際薬局方、食品法および化粧品指令からの方法に対して代替となる標準的方法として、市販の間接法も増菌に使用することができる。例えば、一つの間接方法は、インキュベーションチェンバーにおける膜への吸着および光度定量によって、微生物の成長の間に形成されたＣＯ２を決定する。この方法は、例えば、BacT/ALERT(登録商標)の名称のもとBioMerieux companyにより上市されている。この方法は、非常に感度がよく、および遅くとも一晩培養後の潜在的な汚染を示す。その結果、分析結果は、遅くとも２４時間後に利用可能である。 According to the present invention, a commercially available indirect method can also be used for enrichment as a standard method that is an alternative to the methods from the International Pharmacopoeia, Food Act and Cosmetic Directive. For example, one indirect method determines the CO 2 formed during microbial growth by adsorption onto a membrane and photometric determination in an incubation chamber. This method is marketed, for example, by the BioMerieux company under the name BacT / ALERT®. This method is very sensitive and shows potential contamination after overnight culture at the latest. As a result, the analysis results are available after 24 hours at the latest.
この方法において、(必要に応じて希釈された)分析する材料を、滅菌条件下、栄養培地のアンプル中に導入する。該アンプルを、加熱可能なインキュベーションチェンバー内部の試料セル中に置く。該アンプルは、検出チェンバーへと接続されたガス透過性膜を有する。検出チェンバー中には、細胞の成長の間に形成されたＣＯ２を膜を介して吸収し、およびその変化をインキュベーションチェンバー中で光度的に測定する指示器が存在する。得られたシグナルを、各試料セルについて電子的に記録し、および「成長曲線」(時間対ＣＯ２含量)に変換する。
この方法は、血液バンク試料、保存血液、骨、組織試料および他の医学関連材料の無菌制御のために、医薬において既に使用されている。
In this method, the material to be analyzed (diluted as needed) is introduced into an ampoule of nutrient medium under sterile conditions. The ampoule is placed in a sample cell inside a heatable incubation chamber. The ampoule has a gas permeable membrane connected to a detection chamber. In the detection chamber there is an indicator that absorbs the CO 2 formed during cell growth through the membrane and measures the change photometrically in the incubation chamber. The resulting signal is recorded electronically for each sample cell and converted to a “growth curve” (time versus CO 2 content).
This method is already used in medicine for aseptic control of blood bank samples, stored blood, bone, tissue samples and other medical related materials.
本発明の試料の微生物学的品質保証のための該方法の使用は、今のところ、本発明にしたがって、記載も試験もされていない。該方法は、全ての水混和性および水非混和性液体、およびエマルジョン、ワックス含有真珠光沢調製物、油、ペーストおよび固体に適当である。 The use of the method for microbiological quality assurance of the samples of the invention has not been described or tested so far according to the invention. The method is suitable for all water-miscible and water-immiscible liquids and emulsions, wax-containing pearlescent preparations, oils, pastes and solids.
所定量(通常１ｇ)の分析する試料を、滅菌条件下、液体チェンバー中に導入し、および１５〜４０℃(好適には３０℃)でインキュベートする。試料が微生物を含有する場合、それらはＣＯ２の発生を伴って増殖する。１ｍｌ当たり１〜１００個の微生物の蔓延レベルについて、約１０世代サイクル後および約２時間後、ガスの発生を記録することができる。陽性の場合、ｂｉ)またはｂii)からの試薬および対応する方法を使用して、材料を直ちにさらに分析することができる。
汚染の陽性指示が存在するや否や、汚染のタイプを検証することができる。
A predetermined amount (usually 1 g) of the sample to be analyzed is introduced into the liquid chamber under sterile conditions and incubated at 15-40 ° C (preferably 30 ° C). If the samples contain microorganisms, they grow with CO 2 evolution. For the prevalence level of 1 to 100 microorganisms per ml, gas evolution can be recorded after about 10 generation cycles and after about 2 hours. If positive, the material can be immediately further analyzed using reagents from bi) or bii) and corresponding methods.
As soon as there is a positive indication of contamination, the type of contamination can be verified.
本発明によれば、１〜１０ｇ(好適には５ｇ)の分析する試料または生産物を、１００〜１０００ｍｌの標準溶液に懸濁し、および一晩培養で増菌する。この処理は、しばしば必要である。なぜなら、幾つかの試料は、微生物に対して自己阻害効果を有し得るからである。それにもかかわらず、長期保存の場合に衛生状態要件に関連した生産物の所望の品質を破壊し得る非常に低い微生物集団を検出可能にするために、試料の希釈後になお微生物を検出することができる方法に対する必要性が存在する。しかしながら、これは、検出限界の問題を含む。なぜなら、ＤＥＦＴまたはＦＩＳＨ試験の迅速な適用のための微生物の総数は、希釈後、余りに少ないので、非存在試験を行うことができないからである。増殖性微生物についての非存在試験(すなわち、言い換えれば、増殖性微生物についての有／無試験)に関連した品質保証システムによって満足される第一の要件は、＜１０ＣＦＵ／ｇの検出限界が一晩培養によって達成されることを確実にすることである。より詳細には、＜１ＣＦＵ／ｇまたは＜１ＣＦＵ／５ｇの検出限界は、１００〜１０００ｍｌの標準溶液中の５〜１０ｇの試料の試料調製物によって達成される。これは、国際薬局方により規定された＜１００ＣＦＵ／ｇの最小検出限界をはるかに下回る。したがって、増殖性微生物の最小集団を迅速に検出可能にする品質保証システムが開発されたので、産業および消費者による多くの生産物についての今日の衛生標準要求は保持され得る。 According to the present invention, 1-10 g (preferably 5 g) of the sample or product to be analyzed is suspended in 100-1000 ml of standard solution and enriched by overnight culture. This process is often necessary. This is because some samples may have a self-inhibiting effect on microorganisms. Nevertheless, it is still possible to detect microorganisms after dilution of the sample in order to be able to detect very low microbial populations that can destroy the desired quality of the product associated with hygiene requirements in the case of long-term storage. There is a need for a way that can be done. However, this involves a detection limit problem. This is because the total number of microorganisms for rapid application of DEFT or FISH tests is too small after dilution, so that absence tests cannot be performed. The first requirement that is met by the quality assurance system associated with nonexistence testing for proliferating microorganisms (ie, presence / absence testing for proliferating microorganisms) is that a detection limit of <10 CFU / g overnight To ensure that it is achieved by culturing. More specifically, a detection limit of <1 CFU / g or <1 CFU / 5 g is achieved with a sample preparation of 5-10 g sample in a standard solution of 100-1000 ml. This is well below the minimum detection limit of <100 CFU / g as defined by the International Pharmacopoeia. Thus, today's hygiene standard requirements for many products by industry and consumers can be maintained as quality assurance systems have been developed that allow for the rapid detection of a minimal population of proliferating microorganisms.
１つのキットにおける２つの検出方法の組合せは、使用者が異なる試料、中間生産物および最終生産物を直接的におよび同時に試験することを可能にする。したがって、一貫性のある中間生産物は何でも、製造方法の任意の相にて微生物の存在について分析することができる。 The combination of the two detection methods in one kit allows the user to test different samples, intermediate products and final products directly and simultaneously. Thus, any consistent intermediate product can be analyzed for the presence of microorganisms at any phase of the manufacturing process.
一方で、本発明による微生物の検出は、望まれない微生物が分析する試料または生産物中に存在するかどうかの問題に答える「有／無」試験を含み、および他方では、試験下の試料または生産物に応じて、検出された微生物のその後の正確な同定を含む。提供される特定の証拠は、試料または生産物、したがって、使用する試薬および使用する核酸プローブの一貫性に依存する。 On the one hand, detection of microorganisms according to the present invention includes a “yes / no” test that answers the question of whether unwanted microorganisms are present in the sample or product being analyzed, and on the other hand, the sample under test or Depending on the product, it includes subsequent accurate identification of the detected microorganisms. The specific evidence provided depends on the consistency of the sample or product, and thus the reagents used and the nucleic acid probes used.
本発明において、用語「試料」および「生産物」は、中間生産物および最終生産物の両方を包含すると理解される。さらに、用語「試料」は、好適には所定の反応時間の後、特には製造方法全体をモニターするための、中間生産物または最終生産物の一部、例えば、異種の生産物または中間生産物の液体または固体部分を含むと解釈することができる。また、本発明において、「試料」は、例えば、生産工場に対して適用された洗浄工程の残渣も含むと理解される。最終生産物は、消費者用の最終生産物、ならびに販売するための、および消費者用の最終生産物の製造に使用される、粗生産物の両方を含むと理解される。また、試料は、殺菌後に有効性を試験するために、工業単位から生じ得る。工業単位は、蒸気または薬品(次亜塩素酸塩または過酸化水素)によって定期的に殺菌される。これまで、有効性試験は、仮にあったとしても、標準的方法によって行われていた。しかしながら、多くの場合、標準的方法は余りに複雑であることから、有効性は経験値に基づいていた。本発明のシステムおよび方法を使用することで、殺菌の成功を迅速かつ効果的に試験することができる。 In the present invention, the terms “sample” and “product” are understood to encompass both the intermediate product and the final product. Furthermore, the term “sample” preferably refers to an intermediate product or part of an end product, eg a heterogeneous product or an intermediate product, after a certain reaction time, in particular for monitoring the entire production process. Of liquid or solid parts. In the present invention, the “sample” is also understood to include, for example, a residue of a cleaning process applied to a production factory. The end product is understood to include both the end product for the consumer and the crude product for sale and used in the manufacture of the end product for the consumer. Samples can also originate from industrial units to test effectiveness after sterilization. Industrial units are periodically sterilized with steam or chemicals (hypochlorite or hydrogen peroxide). To date, efficacy tests have been performed by standard methods, if any. However, in many cases, standard methods are too complex and effectiveness was based on experience. By using the system and method of the present invention, the success of sterilization can be quickly and effectively tested.
本発明において、「ろ過性」試料または生産物は、試料または生産物が０.４５μｍの孔径を有するフィルターを通過することができることを意味する。したがって、油滴または固体粒子などは存在すべきでない。 In the present invention, “filterable” sample or product means that the sample or product can pass through a filter having a pore size of 0.45 μm. Thus, no oil droplets or solid particles should be present.
本発明の特定の一実施態様において、本発明のキットのｂｉ)からの試薬は、分析するろ過性液体試料および生産物、または該試料および生産物のろ過性液体成分について、生存微生物を検出するために使用される。また、死んだ微生物は、このようにして間接的に検出することができる。この検出方法は、特定の物質の取込みを通じて、酵素の誘導から形成までの代謝経路を調査する。誘導は、誘導物質および蛍光試薬を含有する試薬によって行われる。該試薬は、細胞膜を通過することができ、その後、誘導された酵素は、高度に蛍光性の化合物の細胞内形成を可能にする。無傷の細胞膜または活性な代謝を有しない細胞は、蛍光反応生成物を形成することができず、および如何なる蛍光も示さない。誘導された酵素を通じての反応が存在することができないため、死んだ細胞中に蓄積する別の着色試薬を使用することで、死んだ細胞と生存細胞との間の区別をすることができる。蛍光反応生成物の形成を通じての酵素の検出のみが、この代謝経路が作用していることの保証を与えるので、作用する代謝および増殖能は、それらの細胞に起因すると考えることができる。結果は、１時間後にのみ利用可能になる。薄膜フィルター、特には０.２〜１.２０μｍ(好適には０.４５μｍ)の細孔の大きさを有するポリカーボネートフィルターは、好適には、ろ過性試料または生産物から細胞を分離するために使用される。また、可能であれば、分析する試料および生産物は、適当に液化することができる。標的酵素の誘導物質を、この試料に添加し、続いて、誘導された標的酵素との反応後にのみ蛍光を発する蛍光試薬を添加する。 In one particular embodiment of the invention, the reagent from bi) of the kit of the invention detects viable microorganisms for the filterable liquid sample and product to be analyzed, or the filterable liquid component of the sample and product. Used for. Also, dead microorganisms can be indirectly detected in this way. This detection method investigates the metabolic pathway from induction of an enzyme to formation through the uptake of a specific substance. Induction is performed by a reagent containing an inducer and a fluorescent reagent. The reagent can pass through the cell membrane, after which the derivatized enzyme allows the intracellular formation of highly fluorescent compounds. Intact cell membranes or cells that do not have active metabolism are unable to form fluorescent reaction products and do not show any fluorescence. Since there can be no reaction through the induced enzyme, another colored reagent that accumulates in dead cells can be used to distinguish between dead and live cells. Since only the detection of the enzyme through the formation of a fluorescent reaction product provides assurance that this metabolic pathway is working, the working metabolic and proliferative capacity can be attributed to those cells. The result will be available only after 1 hour. A membrane filter, in particular a polycarbonate filter having a pore size of 0.2 to 1.20 μm (preferably 0.45 μm), is preferably used to separate cells from a filterable sample or product. Is done. If possible, the sample and product to be analyzed can be appropriately liquefied. A target enzyme inducer is added to the sample, followed by a fluorescent reagent that fluoresces only after reaction with the induced target enzyme.
これらの特定の蛍光試薬としては、例えば、誘導物質としてガラクトースにより誘導されるガラクトシダーゼを検出するための蛍光性ジガラクトシドが挙げられる。乳酸菌および大腸菌、例えば、エスケリキア・コリ(Escherichia coli)、エロモナス菌(Aeromonas)、シトロバクター菌(Citrobacter)、エンテロバクター菌(Enterobacter)、クレブシエラ菌(Klebsiella)、シュードモナス菌(Pseudomonads)および他のプロセス水関連微生物は、この誘導物質および蛍光試薬で検出することができる。 Examples of these specific fluorescent reagents include fluorescent digalactoside for detecting galactosidase induced by galactose as an inducer. Lactic acid bacteria and E. coli, such as Escherichia coli, Aeromonas, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonads and other process waters Related microorganisms can be detected with this inducer and fluorescent reagent.
本発明によれば、蛍光試薬としては、特定の酵素に対して特異的に誘導体化された４-メチルウンベリフェロン誘導体が挙げられる。例えば、４-メチルウンベリフェロンヘプタノエートは、リパーゼまたはエステラーゼを検出するために使用される。また、４-メチルウンベリフェロン-β-Ｄ-ガラクトシドは、ガラクトシダーゼを検出するために使用することができる。溶液を、上記マイクロフィルターを通じてろ過し、およびエピ蛍光顕微鏡を使用して蛍光-光学的に試験する。 According to the present invention, the fluorescent reagent includes a 4-methylumbelliferone derivative derivatized specifically with respect to a specific enzyme. For example, 4-methylumbelliferone heptanoate is used to detect lipase or esterase. 4-Methylumbelliferone-β-D-galactoside can also be used to detect galactosidase. The solution is filtered through the microfilter and examined fluorescence-optically using an epifluorescence microscope.
別の適用形態において、誘導物質および蛍光試薬をフィルター上の残渣に添加する。
別の実施態様において、該キットのｂii)からの核酸プローブを、ろ過性液体試料および生産物および非ろ過性試料および生産物の両方、ならびにろ過性および非ろ過性試料および生産物の混合物について、生存微生物を検出するために使用する。
In another application form, inducers and fluorescent reagents are added to the residue on the filter.
In another embodiment, the nucleic acid probe from bii) of the kit is used for both filterable liquid samples and products and non-filterable samples and products, and mixtures of filterable and non-filterable samples and products, Used to detect viable microorganisms.
本発明によれば、核酸プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブであり得る。これは、通常、１２個と１０００個の間、好適には１２個と５００個の間、より好適には１２個と２００個の間、最も好適には１２個と５０個の間、および１５個と４０個の間のヌクレオチドを含み、最も特に好適な実施態様において、１７個と２５個の間のヌクレオチドを含む。核酸プローブは、相補的配列が検出する微生物中に存在するかどうかに基づいて選択される。所定の配列の選択を通じて、細菌の種、属または群全体を検出することができる。１５個のヌクレオチドのプローブに関して、相補性は、配列の１００％に渡って存在すべきである。１５個よりも多くのヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドに関して、１つの誤対合部位から数個の誤対合部位が許容される。 According to the present invention, the nucleic acid probe can be a DNA or RNA probe. This is usually between 12 and 1000, preferably between 12 and 500, more preferably between 12 and 200, most preferably between 12 and 50, and 15 Between between 40 and 40 nucleotides, and in the most particularly preferred embodiment between 17 and 25 nucleotides. The nucleic acid probe is selected based on whether a complementary sequence is present in the microorganism to be detected. Through selection of a given sequence, bacterial species, genera or entire groups can be detected. For a 15 nucleotide probe, complementarity should exist over 100% of the sequence. For oligonucleotides comprising more than 15 nucleotides, one to several mismatched sites are allowed.
本発明のキットからの核酸プローブは、非特異的核酸プローブを通じて、微生物を非特異的に検出することができる。これは、しばしば、微生物を正確に特徴付けることなく、望まれない微生物が試料または生産物中に存在するかどうかの問いを明らかにすることができる。 The nucleic acid probe from the kit of the present invention can non-specifically detect a microorganism through a non-specific nucleic acid probe. This can often reveal the question of whether unwanted microorganisms are present in a sample or product without accurately characterizing the microorganisms.
分析する生産物および試料に応じて、ハイブリダイゼーション条件およびハイブリダイゼーション時間を核酸プローブに基づいて適合させる。 Depending on the product and sample to be analyzed, hybridization conditions and hybridization times are adapted based on the nucleic acid probe.
核酸プローブのための適当な検出可能マーカーは、例えば、蛍光基、例えば、CY2(Amersham Life Sciences, Inc.(アーリントンハイツ、米国)から入手可能)、CY3(同様にAmersham Life Sciencesから入手可能)、CY5(同様にAmersham Life Sciencesから入手可能)、FITC(Molecular Probes, Inc.(ユージーン、米国))、FLUOS(Roche Diagnostics GmbH(マンハイム、独国)から入手可能)、TRITC(Molecular Probes, Inc.(ユージーン、米国)から入手可能)、6-FAMまたはFLUOS-PRIMEなどである。 Suitable detectable markers for nucleic acid probes are, for example, fluorescent groups such as CY2 (available from Amersham Life Sciences, Inc. (Arlington Heights, USA)), CY3 (also available from Amersham Life Sciences), CY5 (also available from Amersham Life Sciences), FITC (Molecular Probes, Inc. (Eugene, USA)), FLUOS (available from Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Germany)), TRITC (Molecular Probes, Inc. Available from Eugene, USA), 6-FAM or FLUOS-PRIME.
本発明の品質保証システムは、グラム陽性および／またはグラム陰性細菌および／または酵母および／またはカビおよび／または藻類を検出するために使用することができる。 The quality assurance system of the present invention can be used to detect gram positive and / or gram negative bacteria and / or yeast and / or mold and / or algae.
また、環境関連種に加えて、グラム陽性細菌としては、医学関連微生物、例えば、ブドウ球菌、連鎖球菌、炭疽菌、破傷風菌、乳酸菌、ジフテリア菌、豚丹毒菌および枯草菌などが挙げられる。また、グラム陰性細菌としては、環境関連および医学関連微生物の両方、例えば、淋菌、髄膜炎菌、レジオネラ菌、大腸菌、チフス菌、Rur菌およびペスト菌が挙げられる。環境関連およびヒト関連微生物としては、とりわけ、プロセス水特異的微生物、例えば、シュードモナス種、バークホルデリア種、ラオウルテラ種、クレブシエラ種、コリネバクテリア種およびバチルス種が挙げられる。 In addition to environment-related species, Gram-positive bacteria include medically relevant microorganisms such as staphylococci, streptococci, anthrax, tetanus, lactic acid bacteria, diphtheria, swine gonococci and Bacillus subtilis. Gram-negative bacteria also include both environmentally and medically related microorganisms such as Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Legionella, Escherichia coli, Salmonella typhi, Rur, and plague. Environment-related and human-related microorganisms include, among others, process water-specific microorganisms such as Pseudomonas species, Burkholderia species, Laurterella species, Klebsiella species, Corynebacterium species and Bacillus species.
最終生産物の微生物学的解放において、選択的に接種した生産物中の微生物の再発率は、該キットのｂｉ)からの試薬を使用する本発明の方法によって決定することができる。また、細菌に加えて、酵母およびカビも本発明の方法を適用することによって検出することができる。選択的接種に通常使用される標準微生物(これらの幾つかは、国際薬局方中に指名されている)として使用および検出し得る微生物としては、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、エスケリキア・コリ、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)、サルモネラ菌(Salmonella)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)が挙げられる。 In the microbiological release of the final product, the relapse rate of microorganisms in the selectively inoculated product can be determined by the method of the invention using the reagents from bi) of the kit. In addition to bacteria, yeast and mold can also be detected by applying the method of the present invention. Microorganisms that can be used and detected as standard microorganisms commonly used for selective inoculation (some of which are designated in the International Pharmacopoeia) include Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Entero Examples include Bacter cloacae, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Aspergillus niger, Salmonella, and Bacillus subtilis.
また、本発明は、微生物を検出するための、およびろ過性および／または非ろ過性試料または生産物を品質評価するための、および生産工場の衛生状態を評価するための、本発明の品質保証システムの使用に関する。分析するろ過性および／または非ろ過性試料または生産物は、粗生産物、化粧品、医薬品、食品、補助食品、繊維助剤、洗浄剤および洗剤、並びに染料およびラッカーからなる群から選択される。 The present invention also relates to the quality assurance of the present invention for detecting microorganisms, for assessing the quality of filterable and / or non-filterable samples or products, and for assessing the hygiene of production plants. Regarding the use of the system. The filterable and / or non-filterable samples or products to be analyzed are selected from the group consisting of crude products, cosmetics, pharmaceuticals, foods, food supplements, textile aids, detergents and detergents, and dyes and lacquers.
本発明において、粗生産物は、消費者用の最終生産物の製造に使用される生産物であると理解される。このような生産物は、界面活性剤、油成分、乳化剤、真珠色化ワックス、稠度因子、増粘剤、過脂肪剤、安定剤、ポリマー、シリコーン化合物、脂肪、ワックス、レシチン、リン脂質、ＵＶ保護因子、抗酸化剤、脱臭剤、制汗剤、ふけ防止剤、塗膜形成剤、膨張剤、防虫剤、セルフ・タンニング調製物、チロシナーゼ阻害剤(脱色剤)、ヒドロトロープ剤、可溶化剤、防腐剤、香油、非ろ過性ｏ／ｗおよびｗ／ｏエマルジョンであり得る。プロセス水も粗生産物とみなされる。 In the present invention, a crude product is understood to be a product that is used in the production of a consumer end product. Such products include surfactants, oil components, emulsifiers, pearlizing waxes, consistency factors, thickeners, overfat agents, stabilizers, polymers, silicone compounds, fats, waxes, lecithins, phospholipids, UV Protective factors, antioxidants, deodorants, antiperspirants, anti-dandruff agents, film-forming agents, swelling agents, insect repellents, self-tanning preparations, tyrosinase inhibitors (decolorants), hydrotropes, solubilizers Preservatives, perfume oils, non-filterable o / w and w / o emulsions. Process water is also considered a crude product.
化粧品は、例えば、軟膏、クリーム、ローション、シャンプー、コンディショナー、シャワーゲル、バス添加剤、装飾用化粧品、例えば、メーキャップ、アイシャドー、口紅、マニキュア液などであり得る。医薬品は、ジュース、クリーム、軟膏、ローション、懸濁物、チンキ剤、ドロップなどの形態で存在し得る。 Cosmetics can be, for example, ointments, creams, lotions, shampoos, conditioners, shower gels, bath additives, decorative cosmetics such as makeup, eye shadows, lipsticks, nail polishes and the like. The medicinal product may be present in the form of juice, cream, ointment, lotion, suspension, tincture, drop and the like.
食品は、好適には牛乳または乳生産物、菓子および肉生産物、飲料、例えば、ミネラルウォーター、ビール、レモネードまたは果汁である。補助食品は、好適にはビタミン溶液、不飽和脂肪酸、特には共役リノール酸、防腐剤または抗酸化剤である。 The food is preferably milk or milk products, confectionery and meat products, beverages such as mineral water, beer, lemonade or fruit juice. The supplement is preferably a vitamin solution, an unsaturated fatty acid, in particular conjugated linoleic acid, a preservative or an antioxidant.
また、本発明は、ろ過性および／または非ろ過性生産物中の微生物を検出するための方法であって、本発明の品質保証システムを、
ａ)微生物を増菌するため、国際薬局方、食品法または化粧品指令による標準条件下、８〜２４時間の培養に対応する「一晩培養」で、試料を培養し、
ｂ)ろ過性および／または非ろ過性生産物中の生存、損傷または死んだ微生物を検出するためのキットを、
ｉ)該細胞中で特定の酵素の生成を誘導し、および該工程において、蛍光試薬から蛍光化合物が形成されることを可能にする、誘導物質および蛍光試薬を含有する試薬と共に、該増菌試料をインキュベートし、および／または
ii)細菌を固定後、ハイブリダイゼーションを誘導するため、蛍光マーカーを備えた核酸プローブと共に、それらをインキュベートする
ことによって使用し、および
ｃ)該試料の蛍光を検出し、該結果と細胞数とを相関させる(ここで細胞数は決定可能であり、ｂ)ｉ)を使用する場合、死んだ細胞と生存細胞とは互いに区別することができる)
ことによって使用する、方法に関する。
The present invention also provides a method for detecting microorganisms in a filterable and / or non-filterable product comprising the quality assurance system of the present invention,
a) In order to increase the number of microorganisms, the sample is cultured in an “overnight culture” corresponding to a culture for 8 to 24 hours under standard conditions according to the International Pharmacopoeia, Food Act or Cosmetic Directive,
b) a kit for detecting living, damaged or dead microorganisms in filterable and / or non-filterable products;
i) the enrichment sample together with an inducer and a reagent containing a fluorescent reagent that induces the production of a specific enzyme in the cell and allows a fluorescent compound to be formed from the fluorescent reagent in the step And / or
ii) After fixing the bacteria, to incubate hybridization, use them by incubating them with a nucleic acid probe with a fluorescent marker, and c) detect the fluorescence of the sample and determine the result and cell number Correlate (where the number of cells can be determined, b) when using i), dead and viable cells can be distinguished from each other)
It is related to the method used.
本発明において、細菌の「固定」は、細菌のエンベロープが核酸プローブに対して透過性になる処理であると理解される。メタノール、アルコールの混合物、低い百分率のパラホルムアルデヒド溶液または希釈ホルムアルデヒド溶液、酵素的処理なども使用することができるが、エタノールが通常固定に使用される。 In the present invention, “immobilization” of a bacterium is understood as a treatment in which the bacterium's envelope becomes permeable to the nucleic acid probe. Ethanol is usually used for immobilization, although methanol, a mixture of alcohols, a low percentage paraformaldehyde solution or diluted formaldehyde solution, enzymatic treatment, etc. can be used.
「ハイブリダイゼーション」に関して、固定化細菌を、蛍光標識核酸プローブと共にインキュベートする。これらの核酸プローブは、オリゴヌクレオチドおよびそれに固定化されたマーカーからなり、細胞エンベロープに侵入することができ、および細胞内部の該核酸プローブに対応する標的配列にそれ自身結合することができる。本発明の核酸プローブは、種々のハイブリダイゼーション溶液と共に使用することができる。種々の有機溶媒は、０〜８０％の範囲の濃度で使用することができる。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件を維持することは、核酸プローブが標的配列と実際にハイブリダイズすることを確実にする。本発明における穏やかな条件は、例えば、以下に記載のハイブリダイゼーション緩衝液中の０％のホルムアミドである。本発明におけるストリンジェント条件は、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液中の２０〜８０％のホルムアミドである。 For “hybridization”, immobilized bacteria are incubated with a fluorescently labeled nucleic acid probe. These nucleic acid probes consist of an oligonucleotide and a marker immobilized thereon, can enter the cell envelope, and can bind themselves to a target sequence corresponding to the nucleic acid probe inside the cell. The nucleic acid probe of the present invention can be used with various hybridization solutions. Various organic solvents can be used at concentrations ranging from 0-80%. Maintaining stringent hybridization conditions ensures that the nucleic acid probe actually hybridizes to the target sequence. Mild conditions in the present invention are, for example, 0% formamide in the hybridization buffer described below. The stringent condition in the present invention is, for example, 20 to 80% formamide in a hybridization buffer.
典型的なハイブリダイゼーション溶液は、０〜８０％のホルムアミド、好適には２０〜６０％のホルムアミドおよび特には３５％のホルムアミドを含有する。さらに、それは、０.１モル／ｌ〜１.５モル／ｌ、好適には０.５モル／ｌ〜１.０モル／ｌ、より好適には０.７モル／ｌ〜０.９モル／ｌおよび最も好適には０.９モル／ｌの濃度の塩を有する。該塩は、好適には塩化ナトリウムである。また、ハイブリダイゼーション溶液は、典型的には洗剤(例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ))を、例えば、０.００１〜０.２％の濃度、好適には０.００５〜０.０５％の濃度、より好適には０.０１〜０.０３％の濃度および最も好適には０.０１％の濃度で含有する。種々の化合物(例えば、トリス-ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ)は、ハイブリダイゼーション溶液を、典型的には０.０１〜０.１モル／ｌの濃度(好適には０.０１〜０.０８モル／ｌの濃度)で、６.０〜９.０(好適には７.０〜８.０)のｐＨ範囲に渡って、緩衝化するために使用することができる。本発明のハイブリダイゼーション溶液の特に好適な実施態様は、０.０２モル／ｌのトリス-ＨＣｌを含有する(ｐＨ８.０)。 A typical hybridization solution contains 0-80% formamide, preferably 20-60% formamide and especially 35% formamide. Further, it may be from 0.1 mol / l to 1.5 mol / l, preferably from 0.5 mol / l to 1.0 mol / l, more preferably from 0.7 mol / l to 0.9 mol. / L and most preferably has a salt concentration of 0.9 mol / l. The salt is preferably sodium chloride. The hybridization solution is typically a detergent (eg, sodium dodecyl sulfate (SDS)) at a concentration of, for example, 0.001 to 0.2%, preferably 0.005 to 0.05%. More preferably in a concentration of 0.01 to 0.03% and most preferably in a concentration of 0.01%. Various compounds (eg, Tris-HCl, sodium citrate, PIPES or HEPES) can be used to form a hybridization solution, typically at a concentration of 0.01 to 0.1 mol / l (preferably 0.01 to 0). (Concentration of 0.08 mol / l) can be used to buffer over a pH range of 6.0 to 9.0 (preferably 7.0 to 8.0). A particularly preferred embodiment of the hybridization solution according to the invention contains 0.02 mol / l Tris-HCl (pH 8.0).
該プローブの濃度は、期待された標的構造の標識化および数にしたがってかなり変動し得る。迅速かつ効率的なハイブリダイゼーションを達成するため、プローブ量は、標的構造の数を数桁超えるべきである。しかしながら、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)の場合、過剰量の蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブは、背景の蛍光の増大を導くことに留意することが重要である。したがって、プローブ量は、０.５ｎｇ／ｌ〜５００ｎｇ／ｌの範囲、好適には１.０ｎｇ／ｌ〜１００ｎｇ／ｌの範囲、特には１.０ｎｇ／ｌ〜５０ｎｇ／ｌの範囲であるべきである。 The concentration of the probe can vary considerably according to the expected labeling and number of target structures. In order to achieve rapid and efficient hybridization, the amount of probe should exceed the number of target structures by several orders of magnitude. However, it is important to note that in the case of fluorescence in situ hybridization (FISH), an excessive amount of fluorescently labeled hybridization probe leads to an increase in background fluorescence. Accordingly, the probe amount should be in the range of 0.5 ng / l to 500 ng / l, preferably in the range of 1.0 ng / l to 100 ng / l, especially in the range of 1.0 ng / l to 50 ng / l. is there.
ハイブリダイゼーション時間は、典型的には１０分と１２時間の間、好適には約１.５時間である。ハイブリダイゼーション温度は、好適には４４℃と４８℃の間、より好適には４６℃である。ハイブリダイゼーション温度ならびにハイブリダイゼーション溶液中の塩および洗剤の濃度のパラメーターは、核酸プローブ、特にはそれらの長さおよび検出する細胞中の標的配列に対する相補性の程度に基づいて最適化することができる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズされなかったおよび余分の核酸プローブ分子を、標準洗浄溶液を用いて除去または洗い流す。所望の場合、この洗浄溶液は、０.００１〜０.１％(好適には０.０１％)の洗剤(例えば、ＳＤＳ)、および０.００１〜０.１モル／ｌ、好適には０.０１〜０.０５モル／ｌおよび特には０.０２モル／ｌの濃度のトリス-ＨＣｌを含有することができる。また、洗浄溶液は、要求された厳しさに応じて、典型的には０.００３モル／ｌ〜０.９モル／ｌおよび好適には０.０１モル／ｌ〜０.９モル／ｌの濃度のＮａＣｌを含有する。また、洗浄溶液は、０.０１モル／ｌまでの濃度、好適には０.００５モル／ｌの濃度でＥＤＴＡを含有することができる。さらに、より低い塩濃度のハイブリダイゼーション緩衝液に対応する緩衝液は、該洗浄溶液に添加される。 The hybridization time is typically between 10 minutes and 12 hours, preferably about 1.5 hours. The hybridization temperature is preferably between 44 ° C and 48 ° C, more preferably 46 ° C. The parameters of hybridization temperature and salt and detergent concentrations in the hybridization solution can be optimized based on the length of the nucleic acid probes, in particular their length and the degree of complementarity to the target sequence in the cells to be detected. After hybridization, unhybridized and excess nucleic acid probe molecules are removed or washed away using a standard wash solution. If desired, the wash solution may contain 0.001 to 0.1% (preferably 0.01%) detergent (eg, SDS), and 0.001 to 0.1 mol / l, preferably 0. It may contain Tris-HCl at a concentration of 0.01 to 0.05 mol / l and in particular 0.02 mol / l. Also, the cleaning solution is typically from 0.003 mol / l to 0.9 mol / l and preferably from 0.01 mol / l to 0.9 mol / l, depending on the severity required. Contain a concentration of NaCl. The cleaning solution can also contain EDTA at a concentration of up to 0.01 mol / l, preferably at a concentration of 0.005 mol / l. In addition, a buffer corresponding to the lower salt concentration hybridization buffer is added to the wash solution.
非固定化核酸プローブ分子の洗浄による除去は、通常、３０℃〜５０℃の温度、好適には４４℃〜５０℃の温度および特には４６℃の温度にて、１０〜４０分間(好適には１５分間)に亘って行う。本発明のキットを使用する場合、結果は、２４〜４８時間後に利用可能である。蛍光試薬または蛍光マーカーで処理された特定の試料または生産物は、顕微鏡(好適にはエピ蛍光顕微鏡)を使用して光学的に検出される。 Removal of the non-immobilized nucleic acid probe molecules by washing is usually performed at a temperature of 30 ° C. to 50 ° C., preferably at a temperature of 44 ° C. to 50 ° C. and particularly at a temperature of 46 ° C. For 15 minutes). When using the kit of the present invention, the results are available after 24-48 hours. A particular sample or product that has been treated with a fluorescent reagent or fluorescent marker is optically detected using a microscope (preferably an epifluorescence microscope).
〔実施例１：上記方法の組合せを使用するろ過性生産物の品質分析〕
分析期間は、通常、１０〜２４時間である。
１．試料調製
全ての操作は、滅菌／無菌条件下で行う必要がある。
欧州薬局方2.6.12.または2.6.13.にしたがって、分析する試料(１０ｇ)を、滅菌条件下で重量測定し、そしてＴＨＬＣｌブイヨン(９０ｍｌ)中に均質に混合した。該溶液を、薄膜フィルター(０.４５μｌ)を通じて滅菌ろ過し、そして、ろ液を捨てた。該フィルターを滅菌緩衝液(２００ｍｌ)ですすいだ。該生産物(１０ｇ)中に存在し得る全ての微生物は、フィルター上に留まった。
次いで、該フィルターを外し、２０ｍｌのＣＡＳＯブイヨン(細菌増菌用)またはSabouraudブイヨン(酵母およびカビの増菌用)(標準一晩培養)を含有する滅菌容器に、またはBacT/ALERT(登録商標)瓶(２０ｍｌの特定のブイヨンを含有するライム瓶)に完全に移す。BacT/ALERT(登録商標)システムは、微生物的相互作用の存在なしで、自己触媒的にＣＯ２を放出する傾向を有することが既知である該試料について適当ではない。これは、大抵の化粧品および工業的に使用される原材料に関する場合ではない。
かくして製造された試料を、３０±５℃で一晩インキュベートする。ゆっくり成長する生物による任意の汚染の疑念が存在する場合、８時間の予備増菌を、２４時間までさえも延長することができる。
Example 1: Quality analysis of filterable products using a combination of the above methods
The analysis period is usually 10 to 24 hours.
1. Sample preparation All manipulations should be performed under sterile / sterile conditions.
According to European Pharmacopoeia 2.6.12. Or 2.6.13. Samples to be analyzed (10 g) were weighed under sterile conditions and mixed homogeneously in THLC1 broth (90 ml). The solution was sterile filtered through a membrane filter (0.45 μl) and the filtrate was discarded. The filter was rinsed with sterile buffer (200 ml). All microorganisms that could be present in the product (10 g) remained on the filter.
The filter is then removed and placed in a sterile container containing 20 ml of CASO broth (for bacterial enrichment) or Sabouraud broth (for yeast and mold enrichment) (standard overnight culture) or BacT / ALERT® Transfer completely into a jar (lime bottle containing 20 ml of specific bouillon). The BacT / ALERT® system is not suitable for such samples that are known to have a tendency to autocatalytically release CO 2 in the absence of microbial interactions. This is not the case with most cosmetics and raw materials used industrially.
The sample thus produced is incubated overnight at 30 ± 5 ° C. If there is any suspicion of contamination by slowly growing organisms, the 8 hour pre-enrichment can be extended even up to 24 hours.
２．増菌培養物の光学的試験またはBacT/ALERTシステムの評価
増菌ブイヨンが微生物成長によって濁る場合、またはＣＯ２の発生をBacT/ALERT(登録商標)システムにおいて測定できる場合、試料をＦＩＳＨ技術によってさらに分析し、グラム陽性およびグラム陰性生物に大きく分類する。場合によっては、細菌種(実施例２：非ろ過性生産物参照)の範囲までさえも分類する。増菌における成長の非存在下、またはBacT/ALERT(登録商標)システムにおける任意のＣＯ２発生の非存在下、結果は、ＤＥＦＴ方法によって検証する。
2. Optical test of enrichment culture or evaluation of the BacT / ALERT system If the enrichment broth becomes turbid due to microbial growth, or if CO 2 evolution can be measured in the BacT / ALERT® system, the sample can be further analyzed by FISH technology. Analyze and classify broadly into Gram positive and Gram negative organisms. In some cases, even a range of bacterial species (see Example 2: non-filterable product) is classified. In the absence of growth in enrichment or in the absence of any CO 2 generation in the BacT / ALERT® system, the results are verified by the DEFT method.
３．微生物の存在についてのＤＥＦＴ試験
１０ｍｌの増菌培養物(５ｇの出発生産物の量に対応する)を、滅菌シリンジで除去し、そして０.４５μｍのポリカーボネートフィルターを通してろ過する。増菌細胞が存在するポリカーボネートフィルターを、蛍光色素を含有するＤＥＦＴ ＰＡＤ上に置き、および湿潤チェンバー中で２０〜３７℃にて８〜１５分間インキュベートする。
該色素を、ポリカーボネートフィルターの背景を着色しないようにして該ＰＡＤから該細胞上に渡す。インキュベーション後、フィルターを該パッドから放し、スライド上に置く。次いで、着色反応を固定液体で停止する。
次いで、蛍光顕微鏡を１００倍の倍率で使用して、該調製物を着色細胞の存在について試験し、該フィルターを完全に走査する。フィルターの背景は、暗くなければならない。陽性および陰性コントロールは、明白な結果を与えなければならない。
3. DEFT test for the presence of microorganisms 10 ml of enrichment culture (corresponding to an amount of 5 g of starting product) is removed with a sterile syringe and filtered through a 0.45 μm polycarbonate filter. The polycarbonate filter in which enriched cells are present is placed on a DEFT PAD containing a fluorescent dye and incubated for 8-15 minutes at 20-37 ° C. in a humid chamber.
The dye is passed from the PAD onto the cells without coloring the background of the polycarbonate filter. After incubation, the filter is released from the pad and placed on a slide. The coloring reaction is then stopped with a fixed liquid.
The preparation is then tested for the presence of colored cells using a fluorescence microscope at 100 × magnification and the filter is scanned thoroughly. The background of the filter must be dark. Positive and negative controls should give unambiguous results.
４．結果
赤色細胞が検出される場合、既に死んだ細胞が該調製物に添加された。一般に、このような細胞は、環境に由来し、調製物の品質に関係しない。非経口投与用の生産物は、除外される。それらの場合、該調製物は、赤色蛍光細胞も緑色蛍光細胞も含有するべきではない。
緑色細胞が検出される場合、増殖可能な細胞が生産物中に存在する。該生産物は、微生物学的に汚染されたと分類されなければならない。
先の増菌工程からの緑色細胞の存在は、出発生産物中の微生物数に関して引き出されたものからの如何なる結論も妨げるので、該方法は、有／無として、または(対応する統計的データに基づいて)半定量的として、分類しなければならない。これは、通常、品質評価について十分である。なぜなら、主目的は、「増殖性微生物が存在しないことを検出する」ことであるからである。
4). Results If red cells were detected, already dead cells were added to the preparation. In general, such cells are derived from the environment and are not related to the quality of the preparation. Products for parenteral administration are excluded. In those cases, the preparation should not contain red or green fluorescent cells.
If green cells are detected, proliferating cells are present in the product. The product must be classified as microbiologically contaminated.
The presence of green cells from the previous enrichment step precludes any conclusions from those drawn on the number of microorganisms in the starting product, so the method can be used as yes / no or (in the corresponding statistical data Must be classified as semi-quantitative). This is usually sufficient for quality assessment. This is because the main purpose is to “detect the absence of proliferating microorganisms”.
３．ＤＥＦＴ方法による保存微生物についての試験
・項目１に記載された試料調製を行い(生産物試料Texapon NSO、IMQ 418935)、
・使用した増菌培地の陰性コントロールを携え、
・生産物(２０ｍｌの試料溶液への０.２ｍｌの微生物保存溶液の添加(１０〜１００ＣＦＵ／１０ｍｌに対応する希釈))、生産物または陰性コントロールの存在下、保存微生物を検出するための一連の試料を使用し、および均質に混合し、
・ろ過による標準微生物数の決定(ＨＩＰＣＯ方法)のための１０ｍｌおよび該フィルターをＣＡＳＯ培地上で３０〜３５℃にて３〜５日間インキュベートし、
・残りの量を増菌およびＤＥＦＴ(２４時間)に使用し、
・増菌および項目１に記載の試験の評価を行う。
・成長で誘導された濁りまたはＣＯ２形成なし-ＤＥＦＴ試験
3. Test for stored microorganisms by DEFT method ・ Preparation of the sample described in item 1 (product sample Texapon NSO, IMQ 418935),
・ With negative control of the enrichment medium used,
A series of products to detect stored microorganisms in the presence of product (addition of 0.2 ml of microorganism stock solution to 20 ml sample solution (dilution corresponding to 10-100 CFU / 10 ml)), product or negative control Use the sample and mix homogeneously,
10 ml for determination of the standard number of microorganisms by filtration (HIPCO method) and the filter are incubated on CASO medium at 30-35 ° C. for 3-5 days,
Use the remaining amount for enrichment and DEFT (24 hours)
・ Evaluate the test described in item 1 and enrichment.
No growth-induced turbidity or CO 2 formation-DEFT test
〔実施例２：上記方法の組合せを使用する非ろ過性生産物の品質分析〕
１．試料調製
全ての操作は、滅菌／無菌条件下で行う必要がある。
分析する試料(１０ｇ)を、滅菌条件下で重量測定し、および欧州薬局方2.6.12.または2.6.13.にしたがって適当な補助機(好適には市販のストマッカー混合機)を用いて９０ｍｌのＴＨＬＣ１ブイヨン中に均質に混合した。１０ｍｌのこの懸濁物(１ｇの分析する試料に対応する)を、１００ｍｌのＣＡＳＯまたはSabouraudブイヨン中にピペットで取った。
また、自己触媒的にＣＯ２を放出する如何なる傾向も示さない試料の場合、１０ｍｌの懸濁物をBacT/ALERT(登録商標)瓶(２０ｍｌの特定のブイヨンを含有するライム瓶)に移し、次いで、これをBacT/ALERT(登録商標)システム中に置くこともできる。
該試料を、３０〜３５℃にて一晩(最大２４時間まで)インキュベートして微生物成長させる。
Example 2: Quality analysis of non-filterable products using a combination of the above methods
1. Sample preparation All manipulations should be performed under sterile / sterile conditions.
A sample (10 g) to be analyzed is weighed under sterile conditions and 90 ml of the sample is added using a suitable auxiliary machine (preferably a commercial stomacher mixer) according to European Pharmacopoeia 2.6.12. Or 2.6.13. Intimately mixed in THLC 1 broth. 10 ml of this suspension (corresponding to 1 g of sample to be analyzed) was pipetted into 100 ml of CASO or Sabouraud broth.
Alternatively, for samples that do not show any tendency to autocatalytically release CO 2 , transfer 10 ml of the suspension to a BacT / ALERT® bottle (lime bottle containing 20 ml of specific broth), then It can also be placed in a BacT / ALERT® system.
The sample is incubated at 30-35 ° C. overnight (up to 24 hours) for microbial growth.
２．増菌培養物の光学的試験またはBacT/ALERT(登録商標)システムの評価
増菌が微生物汚染(ブイヨン濁りまたはBacT/ALERT(登録商標)システムにおけるＣＯ２の発生)を示す場合、定性的ＦＩＳＨ試験を行う。グラム陽性細菌は、それ自身が汚染源の初期兆候を与えるグラム陰性細菌から区別される。微生物種は、選択培地上へのストリークプレーティングか、またはＰＣＲ方法のどちらかによってさらに区別される。
2. Optical test of enrichment culture or evaluation of the BacT / ALERT® system Qualitative FISH test if enrichment indicates microbial contamination (bouillon turbidity or CO 2 generation in the BacT / ALERT® system) I do. Gram-positive bacteria are distinguished from gram-negative bacteria that themselves provide an early indication of the source of contamination. Microbial species are further distinguished by either streak plating on selective media or by PCR methods.
３．グラム陽性およびグラム陰性微生物の存在についてのＦＩＳＨ試験の実施(製造業者明細書による)
〔試料調製〕
・１００μｌの試料をエッペンドルフ型容器中にピペットで取り、
・４滴の溶液Ｂ２を添加し、そして試料と混合し(＝固定)、
・１０μｌの固定化試料を５つの反応チェンバー(領域１、２、３および陽性および陰性コントロール領域)中のスライド上にピペットで取り、
・スライドを３５〜３７℃にて３０〜６０分間インキュベート(乾燥)し、
・２４μｌのブレイカー溶液を反応領域３上にピペットで取り、そして室温にて５〜１０分間インキュベートし、
・１滴のブレイカー４を領域３に、および１滴のブレイカー２を領域２にピペットで取り、そして室温にて５〜１０分間インキュベートし、
・ＶＩＴ反応器に脱塩水を満たし、およびスライドを洗浄し、
・スライドを３５〜３７℃にて３０〜６０分間インキュベート(乾燥)し、
・１滴の溶液Ｂ２を添加し、
・スライドを３５〜３７℃にて３０〜６０分間インキュベートする。
3. Perform FISH test for the presence of Gram positive and Gram negative microorganisms (according to manufacturer's specification)
[Sample preparation]
• Pipette 100 μl of sample into an Eppendorf container,
Add 4 drops of solution B2 and mix with sample (= fixed)
Pipette 10 μl of immobilized sample onto slides in 5 reaction chambers (areas 1, 2, 3 and positive and negative control areas)
Incubate (dry) the slide for 30-60 minutes at 35-37 ° C.
Pipet 24 μl of breaker solution onto reaction area 3 and incubate at room temperature for 5-10 minutes,
Pipette 1 drop breaker 4 into area 3 and 1 drop breaker 2 into area 2 and incubate at room temperature for 5-10 minutes,
Fill the VIT reactor with demineralized water and wash the slides
Incubate (dry) the slide for 30-60 minutes at 35-37 ° C.
Add 1 drop of solution B2,
Incubate slides at 35-37 ° C. for 30-60 minutes.
〔プローブとの接触〕
・１滴の「陽性コントロール」を領域１、２および３に添加し、
・１滴の「陰性コントロール」を陰性コントロール領域に添加し、
・１滴の「陽性コントロールＧ」を陽性コントロール領域に添加し、
・スライドをＶＩＴ反応器に挿入し、および４４〜４６℃にて１.５〜２時間インキュベートする。
[Contact with probe]
Add 1 drop of “positive control” to areas 1, 2 and 3;
Add 1 drop of “negative control” to the negative control area,
Add 1 drop of “Positive Control G” to the positive control area,
Insert slide into VIT reactor and incubate at 44-46 ° C. for 1.5-2 hours.
〔洗浄〕
・反応器からスライドを除き、
・反応器に温洗浄緩衝液を満たし、スライドを挿入し、４４〜４６℃にて１５〜３０分間洗浄し、
・洗浄緩衝液を廃棄し、
・反応器に脱塩水を満たし、そしてスライドを洗浄し、
・スライドを４４〜４６℃にて１５〜１２０分間乾燥する。
〔Washing〕
・ Remove the slide from the reactor,
Fill the reactor with warm wash buffer, insert slides and wash at 44-46 ° C. for 15-30 minutes,
-Discard the wash buffer
Fill the reactor with demineralized water and wash the slides
Dry the slide at 44-46 ° C. for 15-120 minutes.
〔顕微鏡的評価〕
・固定化液体(仕上げ剤)で反応を停止させ、
・ガラス製カバーを付与し、および蛍光灯中１００倍の倍率の顕微鏡によって走査する。
・背景は暗くなければならず、陽性および陰性コントロールは明白な結果を与えなければならず、発光赤色細胞は生存細菌と解釈される。
[Microscopic evaluation]
・ Stop the reaction with immobilized liquid (finishing agent),
Apply a glass cover and scan with a microscope at 100X magnification in a fluorescent lamp.
• The background must be dark, positive and negative controls should give obvious results, and luminescent red cells are interpreted as viable bacteria.
〔結果〕
領域１＝赤色細胞の検出＝グラム陰性微生物(例えば、シュードモナス属、エンテロバクター属)
領域２＝赤色細胞の検出＝グラム陽性微生物(例えば、ラクトバチルス属、バチルス属、リステリア(Listeria)属)
領域３＝赤色細胞の検出＝グラム陽性微生物(例えば、スタフィロコッカス属)
自己蛍光が試料中に現れる場合、手順を繰り返さなければならず、および陽性コントロールＤを添加しなければならない。次いで、細胞は緑色になるか、そうでなければ変化しないと予測される。
結果の表示は、生産物-特異的制限にしたがって１ｇの生産物当たりで算出した。
〔result〕
Region 1 = Detection of red cells = Gram-negative microorganism (eg, Pseudomonas, Enterobacter)
Region 2 = Detection of red cells = Gram positive microorganism (eg, Lactobacillus, Bacillus, Listeria)
Region 3 = Detection of red cells = Gram positive microorganism (eg, Staphylococcus)
If autofluorescence appears in the sample, the procedure must be repeated and a positive control D must be added. The cells are then predicted to turn green or otherwise not change.
The resulting display was calculated per gram of product according to product-specific limits.
４．ＦＩＳＨ方法による保存微生物の検出
・項目１のように試料調製を行い(生産物試料：コンパウンドIMQ 322015)、
・生産物(１００ｍｌのＣＡＳＯブイヨンへの細菌保存溶液の添加(１０〜１００ＣＦＵ／１ｇ生産物に対応する細菌の希釈))、生産物試料または陰性コントロールの存在下、保存細菌を検出するための一連の試料を使用し、および均質に混合し、
・増菌および項目２のような試験評価を行う。
4). Detection of preserved microorganisms by FISH method ・ Preparation of sample as in item 1 (Product sample: Compound IMQ 322015)
A series for detecting stored bacteria in the presence of product (addition of bacterial stock solution to 100 ml CASO broth (dilution of bacteria corresponding to 10-100 CFU / 1 g product)), product sample or negative control Sample and mix homogeneously,
• Perform test evaluation such as enrichment and item 2.
５．評価
先の増菌工程からの細胞の存在は、出発生産物中の微生物数に関して引き出されるものからの如何なる結論も妨げるので、方法は「有／無」として分類しなければならない。これは、通常、品質評価について十分である。なぜなら、主目的は、「増殖性微生物が存在しないことを検出する」ことであるからである。
5). The method must be classified as “presence / absence” because the presence of cells from the prior enrichment process prevents any conclusions from being drawn on the number of microorganisms in the starting product. This is usually sufficient for quality assessment. This is because the main purpose is to “detect the absence of proliferating microorganisms”.
Claims (8)
ｂ)ｉ)生存細胞によって、特定の蛍光試薬との反応により検出可能な蛍光色素を放出する特定の酵素の生成を導く、誘導物質および蛍光試薬を含有する少なくとも一つの試薬と、
ii)インサイチュハイブリダイゼーションにより微生物を検出するための、蛍光マーカーに固定された少なくとも一つの核酸プローブと
を含有する、ろ過性および／または非ろ過性生産物中の生存、損傷または死んだ微生物を検出するためのキットと
を含んでなり、
増殖性微生物について＜１０ＣＦＵ／ｇの検出限界を達成する、
増殖性微生物を検出するための品質保証システム。 a) Increase the number of microorganisms in the sample by “overnight culture” corresponding to 8-24 hours of culture under standard conditions according to international pharmacopoeia (eg European pharmacopoeia), food law, cosmetics directive or other commercially available indirect methods A system for fungi,
b) i) at least one reagent containing an inducer and a fluorescent reagent that leads to the production of a specific enzyme that releases a detectable fluorescent dye by reaction with the specific fluorescent reagent by viable cells;
ii) Detecting living, damaged or dead microorganisms in filterable and / or non-filterable products containing at least one nucleic acid probe immobilized on a fluorescent marker for detecting microorganisms by in situ hybridization And a kit for
Achieve a detection limit of <10 CFU / g for proliferating microorganisms,
A quality assurance system for detecting proliferating microorganisms.
ａ)微生物を増菌するため、国際薬局方(例えば欧州薬局方)、食品法、化粧品指令または市販の間接法による標準条件下、８〜２４時間の培養に対応する「一晩培養」で、試料を培養し、
ｂ)ろ過性および／または非ろ過性生産物中の生存、損傷または死んだ微生物を検出するためのキットを、
ｉ)該細胞中で特定の酵素の生成を誘導し、および該工程において、蛍光試薬から蛍光化合物が形成されることを可能にする、誘導物質および蛍光試薬を含有する試薬と共に、該増菌試料をインキュベートし、および／または
ii)細菌を固定後、ハイブリダイゼーションを誘導するため、蛍光マーカーを備えた核酸プローブと共に、それらをインキュベートする
ことによって使用し、および
ｃ)該試料の蛍光を検出し、該結果と細胞数とを相関させる(ここで細胞数は決定可能であり、ｂ)ｉ)を使用する場合、死んだ細胞と生存細胞とは互いに区別することができる)
ことによって使用する、方法。 A method for detecting microorganisms in a filterable and / or non-filterable product comprising the quality assurance system according to any of claims 1-5.
a) In order to increase the number of microorganisms, in an “overnight culture” corresponding to a culture of 8 to 24 hours under standard conditions according to international pharmacopoeia (eg European pharmacopoeia), food law, cosmetics directive or commercially available indirect method, Incubate the sample,
b) a kit for detecting living, damaged or dead microorganisms in filterable and / or non-filterable products;
i) the enrichment sample together with an inducer and a reagent containing a fluorescent reagent that induces the production of a specific enzyme in the cell and allows a fluorescent compound to be formed from the fluorescent reagent in the step And / or
ii) After fixing the bacteria, to incubate hybridization, use them by incubating them with a nucleic acid probe with a fluorescent marker, and c) detect the fluorescence of the sample and determine the result and cell number Correlate (where the number of cells can be determined, b) when using i), dead and viable cells can be distinguished from each other)
The method you use.
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