JP2007521315A - Crystalline tumor necrosis factor receptor 2 polypeptide - Google Patents

Abstract

本発明は、結晶性ポリペプチド、およびそれらを生成する方法；結晶性ポリペプチドを含む薬学的組成物；さらには、そのようなポリペプチドおよび組成物の治療的な使用に関する。本発明により、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃポリペプチドと結晶性エタナーセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）を含む、ＴＮＦＲ２ポリペプチドの結晶形態が提供される。本発明の１つの実施形態は、エタナーセプトの結晶である；特定の実施形態においては、エタナーセプトの結晶は、桿状の形態であり、そして／または０．５ミリメートルから１．５ミリメートルの間、もしくは０．０５ミリメートルから０．３ミリメートルの間の最大の長さを有する。The present invention relates to crystalline polypeptides and methods for producing them; pharmaceutical compositions comprising crystalline polypeptides; and further therapeutic uses of such polypeptides and compositions. The present invention provides a crystalline form of a TNFR2 polypeptide comprising a crystalline TNFR2: Fc polypeptide and a crystalline etanercept. One embodiment of the present invention is an etanercept crystal; in certain embodiments, the etanercept crystal is bowl-shaped and / or between 0.5 and 1.5 millimeters, or 0 It has a maximum length between .05 millimeters and 0.3 millimeters.

Description

本出願は、２００３年８月１日に出願した米国仮特許出願番号６０／４９１，８２７（これは、その全体が参考として本明細書中に援用される）に関する、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張する。   This application is related to U.S. Patent Act 119 (which relates to US Provisional Patent Application No. 60 / 491,827 filed Aug. 1, 2003, which is incorporated herein by reference in its entirety). Insist on a profit under paragraph e).

（発明の背景）
多くの治療用分子はポリペプチドであり、それらのいくつかは、変性、分解、および／または凝集しやすい。ポリペプチドの凝集は、それにより、免疫原性を生じる場合があるので、望ましくない（Ｃｌｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１０：３０７−３７７；およびＲｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３６：８３８−８４５）。ポリペプチドはまた、触媒を受けやすく、また、それらが投与される生物が生まれつき持っている生物学的プロセスによって不活性な形態へと変換されやすい。さらに、治療用ポリペプチドは、不均質な混合物の形態として生成される場合があり、それによって、グリコシル化の程度において、またはそれらの三次元立体構造の別の局面が変化する。 (Background of the Invention)
Many therapeutic molecules are polypeptides, some of which are prone to denaturation, degradation, and / or aggregation. Aggregation of polypeptides is undesirable as it may result in immunogenicity (Cleland et al., 1993, Crit Rev Therapeutic Drug Carrier Systems, 10: 307-377; and Robbins et al., Diabetes, 36: 838-845). Polypeptides are also susceptible to catalysis and are converted to an inactive form by the biological processes inherent in the organism to which they are administered. In addition, therapeutic polypeptides may be produced in the form of heterogeneous mixtures, thereby changing the degree of glycosylation or another aspect of their three-dimensional conformation.

治療用ポリペプチドの結晶化により、そのようなポリペプチドの安定であり、均質な処方物が生成されるという利点が提供される。具体的な結晶の利点としては、薬学的産物を調製することにおける治療用化合物の取り扱いがはるかに容易であること；分解、変性、および／または凝集が少なくなること；治療用ポリペプチドの徐放形態を生成でき、投与頻度を減少させることができる可能性が生じること；ならびに、非常に高濃度の治療用ポリペプチドを含む薬学的組成物を形成するために結晶性の治療用ポリペプチドを使用できることが挙げられる。さらに、結晶化方法により、処方物中に、より均質なポリペプチドの集団を生じることができる。なぜなら、同様の構造のポリペプチド分子の付加によってのみ、結晶の持続的な成長が行われるからである。ごく少量の種々の構造のポリペプチドが結晶格子に組み込まれると、結晶中に生じる構造の弱さによってそのさらなる成長が妨げられる。結晶形態への組み込みにより、より大きい割合のポリペプチドが活性な形態となり、少量の結晶性の治療用ペプチドの投与により、より多量のより不均質なポリペプチド処方物の投与と同等の治療効果を生じることができる。   Crystallization of therapeutic polypeptides provides the advantage that stable and homogeneous formulations of such polypeptides are produced. Specific crystal advantages include much easier handling of therapeutic compounds in preparing pharmaceutical products; less degradation, denaturation, and / or aggregation; slow release of therapeutic polypeptides The ability to generate forms and the possibility of reducing the frequency of administration; and using crystalline therapeutic polypeptides to form pharmaceutical compositions containing very high concentrations of therapeutic polypeptides What can be done. In addition, the crystallization method can produce a more homogeneous population of polypeptides in the formulation. This is because sustained growth of crystals can only occur by the addition of polypeptide molecules of similar structure. When very small amounts of various structured polypeptides are incorporated into the crystal lattice, their weak growth prevents their further growth. Incorporation into a crystalline form results in a greater proportion of the polypeptide in the active form, and administration of a small amount of crystalline therapeutic peptide provides a therapeutic effect equivalent to administration of a larger amount of a more heterogeneous polypeptide formulation. Can occur.

したがって、治療用ポリペプチドの結晶性処方物が必要とされている。   Accordingly, there is a need for crystalline formulations of therapeutic polypeptides.

本発明により、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃポリペプチドと結晶性エタナーセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）を含む、ＴＮＦＲ２ポリペプチドの結晶形態が提供される。本発明の１つの実施形態は、エタナーセプトの結晶である；特定の実施形態においては、エタナーセプトの結晶は、桿状の形態であり、そして／または０．５ミリメートルから１．５ミリメートルの間、もしくは０．０５ミリメートルから０．３ミリメートルの間の最大の長さを有する。   The present invention provides a crystalline form of a TNFR2 polypeptide comprising a crystalline TNFR2: Fc polypeptide and a crystalline etanercept. One embodiment of the present invention is an etanercept crystal; in certain embodiments, the etanercept crystal is bowl-shaped and / or between 0.5 and 1.5 millimeters, or 0 It has a maximum length between .05 millimeters and 0.3 millimeters.

本発明によって、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドまたはエタナーセプトのようなＴＮＦＲ２ポリペプチドの結晶を生成する方法もまた提供される。特定の実施形態においては、ＴＮＦＲ２ポリペプチドは単量体である；さらなる実施形態においては、ＴＮＦＲ２ポリペプチドは多量体であり、例えば、二量体、三量体、またはオリゴマーである。さらなる実施形態においては、ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸３９から１６２までの長さにわたって少なくとも９０％のアミノ酸同一性を共有する。   Also provided by the invention are methods of producing crystals of a TNFR2 polypeptide such as a TNFR2-Ig fusion polypeptide or etanercept. In certain embodiments, the TNFR2 polypeptide is monomeric; in further embodiments, the TNFR2 polypeptide is multimeric, eg, a dimer, trimer, or oligomer. In a further embodiment, the TNFR2 polypeptide shares at least 90% amino acid identity over the length of amino acids 39 to 162 of SEQ ID NO: 1.

本発明はまた、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃポリペプチドまたは結晶性エタナーセプトのような、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの、本明細書中で開示されるそれぞれの医学的障害の予防的処置または治療的処置のための医薬品の製造における使用にも関する。   The present invention also provides for the prophylactic treatment or therapeutic treatment of each of the medical disorders disclosed herein of the disclosed crystalline TNFR2 polypeptide, such as crystalline TNFR2: Fc polypeptide or crystalline etanercept. It also relates to use in the manufacture of a medicament for treatment.

本発明は、結晶形態のＴＮＦＲ２ポリペプチドに関し、そのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを生成し、使用するための方法に関する。結晶ポリペプチドは、結晶形態ではないポリペプチドよりもより長い時間保存することができ、より高い物理的な安定性と、生物学的活性の保持を、幅広い保存および取り扱い条件下で示すことができる点で、これらのポリペプチド結晶は有用である。   The present invention relates to crystalline forms of TNFR2 polypeptides and to methods for producing and using such crystalline TNFR2 polypeptides. Crystalline polypeptides can be stored for longer periods of time than polypeptides that are not in crystalline form, exhibiting higher physical stability and retention of biological activity under a wide range of storage and handling conditions In that respect, these polypeptide crystals are useful.

（定義）
「ポリペプチド」は、本明細書中では、通常は１０個を超えるアミノ酸を有する、自然界に存在している、合成の、および組み換えの、タンパク質またはペプチドとして定義される。「ポリペプチドリンカー」は、１アミノ酸長のような一連の短いアミノ酸によって形成されるポリペプチドであり得る。 (Definition)
A “polypeptide” is defined herein as a naturally occurring, synthetic, and recombinant protein or peptide, usually having more than 10 amino acids. A “polypeptide linker” can be a polypeptide formed by a series of short amino acids, such as one amino acid long.

「単離された」は、本明細書中で使用される場合は、それが自然界において存在している環境から取り出されているポリペプチドまたは他の分子をいう。   “Isolated”, as used herein, refers to a polypeptide or other molecule that has been removed from the environment in which it exists in nature.

「実質的に精製された」は、本明細書中で使用される場合は、それが自然界において存在しているか、またはそれが生成されている環境に存在している他のポリペプチドを実質的に含まないポリペプチドをいう；実質的に精製されたポリペプチドの調製物には、少なくとも９０重量％（または、少なくとも９５重量％、少なくとも９８重量％、または、少なくとも９９重量％）のポリペプチドが含まれている。ポリペプチドの重量には、任意の炭水化物、脂質、もしくはポリペプチドに共有結合している他の残基が含まれる。実質的に精製されたポリペプチド調製物には、グリコシル化または他の翻訳後修飾の程度および型に関して、あるいは、立体構造または多量体化の程度に関して、調製物中のポリペプチド分子にバリエーションが含まれている場合もある。   “Substantially purified” as used herein substantially refers to other polypeptides that exist in nature or in the environment in which they are produced. A substantially purified polypeptide preparation contains at least 90% (or at least 95%, at least 98%, or at least 99%) polypeptide by weight. include. The weight of the polypeptide includes any carbohydrate, lipid, or other residue that is covalently bound to the polypeptide. A substantially purified polypeptide preparation includes variations in the polypeptide molecules in the preparation with respect to the extent and type of glycosylation or other post-translational modification, or with respect to conformation or multimerization. Sometimes it is.

「精製されたポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合には、本質的に均質なポリペプチド調製物をいう；しかし、本質的に均質なポリペプチド調製物には、グリコシル化または他の翻訳後修飾の程度および型に関して、あるいは、立体構造または多量体化の程度に関して、調製物中のポリペプチド分子にバリエーションが含まれている場合もある。   “Purified polypeptide” as used herein refers to an essentially homogeneous polypeptide preparation; however, an essentially homogeneous polypeptide preparation includes glycosylation or Variations may be included in the polypeptide molecules in the preparation with respect to the degree and type of other post-translational modifications, or with respect to conformation or multimerization.

「全長」のポリペプチドは、最初に翻訳された場合にポリペプチドの一次アミノ酸配列全体を有するポリペプチドである；例えば、ヒトＴＮＦＲ２の全長の形態は配列番号１に示される。ポリペプチドの「成熟形態」は、プロドメインを除去するためのシグナル配列の切断またはタンパク質分解的切断のような翻訳後プロセシング工程を受けたポリペプチドをいう。特定の全長ポリペプチドの複数の成熟形態を、例えば、複数の部位でのシグナル配列の切断によって、またはポリペプチドを切断するプロテアーゼの種々の調節によって、生成することができる。このようなポリペプチドの成熟形態（単数または複数）は、全長のポリペプチドをコードする核酸分子の、適切な哺乳動物細胞または他の宿主細胞中での発現によって、得ることができる。成熟形態のポリペプチドの配列は、また、全長の形態のアミノ酸配列から、シグナル配列またはプロテアーゼ切断部位の同定を通じて、決定することもできる。特定の実施形態においては、ヒトＴＮＦＲ２ポリペプチドの成熟形態は、配列番号１のアミノ酸２３、２７、および２８からなる群より選択されるＮ末端アミノ酸残基を有するか、あるいは、配列番号１のアミノ酸１からアミノ酸３９の間のそれぞれのアミノ酸からなる群より選択されるＮ末端アミノ酸を有する。   A “full length” polypeptide is a polypeptide having the entire primary amino acid sequence of the polypeptide when first translated; for example, the full length form of human TNFR2 is shown in SEQ ID NO: 1. A “mature form” of a polypeptide refers to a polypeptide that has undergone a post-translational processing step such as cleavage of a signal sequence or proteolytic cleavage to remove the prodomain. Multiple mature forms of a particular full-length polypeptide can be generated, for example, by cleavage of a signal sequence at multiple sites or by various modulations of a protease that cleaves the polypeptide. Such mature form (s) of a polypeptide can be obtained by expression of a nucleic acid molecule encoding the full-length polypeptide in a suitable mammalian cell or other host cell. The sequence of the mature form of the polypeptide can also be determined from the full-length form of the amino acid sequence through the identification of a signal sequence or protease cleavage site. In certain embodiments, the mature form of the human TNFR2 polypeptide has an N-terminal amino acid residue selected from the group consisting of amino acids 23, 27, and 28 of SEQ ID NO: 1, or alternatively the amino acid of SEQ ID NO: 1 It has an N-terminal amino acid selected from the group consisting of each amino acid between 1 and amino acid 39.

２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、目視検査、および数学的な計算によって決定することができ、比較は、また、コンピュータープログラムを使用する配列情報の比較によって行うこともできる。同一性パーセントを決定することの最初の工程は、重複および同一性を最大にするように、一方で、アラインメント中のギャップを最少にするように、アミノ酸配列をアラインメントすることである。同一性パーセントを決定することの第２の工程は、アラインメントした配列の間の同一である数を計算し、アラインメントの中のアミノ酸の総数で割り算することである。アミノ酸配列が標的アミノ酸配列の「隅から隅までの長さ」を有するものについて同一性パーセントを決定する場合には、標的アミノ酸配列の長さが、アラインメントの中の塩基の総数の最小値である。例えば、配列番号Ｘのアミノ酸１から１００までの第２のアミノ酸配列の長さの「隅から隅までにわたる」５０アミノ酸の第１のアミノ酸配列の同一性パーセントを決定する場合には、第１のアミノ酸配列が配列番号Ｘのアミノ酸１から５０までと同一であれば、同一性パーセントは５０％となり、これは、５０個のアミノ酸の同一性をアラインメントの長さ全体（１００アミノ酸）で割り算したものである。アミノ酸配列をアラインメントし、同一性パーセントをコンピューターで計算するための例示的なコンピュータープログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅのウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉを通じて使用することができるＢＬＡＳＴＰプログラム、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ ２．０についての標準的なデフォルトパラメーター設定は、以下のインターネットサイトに記載されている：ｓａｐｉｅｎｓ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ．。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコアリングマトリックス、およびオプションのパラメーターが使用され、これらは、以下のように使用することができる：（Ａ）組成の複雑さが低い尋問配列のセグメント（Ｗｏｏｔｔｏｎ ａｎｄ ＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）によって決定される；Ｗｏｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｂｉａｓｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５５４−７１もまた参照のこと）、または短い周期的な内部反復から構成されるセグメント（Ｃｌａｖｅｒｉｅ ａｎｄ ＳｔａｔｅｓのＸＮＵプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）によって決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、ならびに（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的に有意な限界、すなわち、Ｅ−スコア（予想される適合の可能性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の確率論的モデルに従って、単に偶然見出される；適合と記載される統計学的有意性がこのＥ−スコアの限界値よりも大きい場合は、適合は報告されない。）；Ｅ−スコアの限界値は、０．５、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または、１ｅ−１００である。配列比較の分野の当業者によって使用される他のプログラムもまた、アミノ酸配列をアラインメントするために使用することができ、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラム、「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７）がその例である。「ＧＡＰ」プログラムについてのデフォルトパラメーターには、以下のものが含まれる：（１）ヌクレオチドについては、単項式比較マトリックスのＧＣＧ履行（一致については１を、不一致については０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｐｐ．３５３−３５８，１９７９に記載されているような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の重量アミノ酸比較マトリックス、；あるいは、他の同等の比較マトリックス；（２）アミノ酸配列については、それぞれのギャップについてのペナルティー ３０と、それぞれのギャップの中のそれぞれの記号についてのさらなるペナルティー １、あるいは、ヌクレオチド配列については、それぞれのギャップについてのペナルティー ５０と、それぞれのギャップの中のそれぞれの記号についてのさらなるペナルティー ３；（３）末端のギャップについてはペナルティーはなし；ならびに（４）長さのギャップについては最大ではないペナルティー。   The “percent identity” between two amino acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculations, and the comparison can also be made by comparing sequence information using a computer program. The first step in determining percent identity is to align amino acid sequences so as to maximize duplication and identity while minimizing gaps in the alignment. The second step in determining percent identity is to calculate the number that is identical between aligned sequences and divide by the total number of amino acids in the alignment. When determining percent identity for an amino acid sequence that has a “corner-to-corner length” of the target amino acid sequence, the length of the target amino acid sequence is the minimum of the total number of bases in the alignment . For example, when determining the percent identity of a first amino acid sequence of 50 amino acids “cross-to-corner” of the length of the second amino acid sequence from amino acids 1 to 100 of SEQ ID NO: X, If the amino acid sequence is identical to amino acids 1 to 50 of SEQ ID NO: X, the percent identity is 50%, which is the 50 amino acid identity divided by the total alignment length (100 amino acids). It is. An exemplary computer program for aligning amino acid sequences and calculating percent identity with a computer is the National Library of Medicine website ncbi. nlm. nih. gov / golf / wblast2. BLASTP program that can be used through cgi, or UW-BLAST 2.0 algorithm. Standard default parameter settings for UW-BLAST 2.0 are described at the following internet site: sapiens. Wustl. edu / blast / README. html. . In addition, the BLAST algorithm uses a BLOSUM62 amino acid scoring matrix, and optional parameters that can be used as follows: (A) A segment of interrogation sequence with low composition complexity (Woughton and Federhen) SEG program (Computers and Chemistry, 1993); Woton and Federhen, 1996, Analysis of compositionally biased regions in sequence data, 66: Meth. A segment composed of internal iterations (Claveri including a filter to mask the e and States XNU program (determined by Computers and Chemistry, 1993), and (B) statistically significant limits for reporting fits to database sequences, , E-score (the probability of the expected fit is simply found by chance according to the Karlin and Altschul (1990) probabilistic model; the statistical significance described as fit is the limit of this E-score. If greater than, no fit is reported.); E-score limits are 0.5, 0.25, 0.1, 0.05, 0.01, 0.001, 0.0001, 1e -5, 1e-10, 1e-15, 1e-20, 1e-25, 1e-30, 1e-40, 1e-50 1e-75, or a 1e-100. Other programs used by those skilled in the art of sequence comparison can also be used to align amino acid sequences, such as the Genetics Computer Group (GCG; Madison, WI) Wisconsin package version 10.0 program, An example is “GAP” (Devereux et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12: 387). The default parameters for the “GAP” program include: (1) For nucleotides, GCG fulfillment of the unary comparison matrix (contains a value of 1 for matches, 0 for mismatches), and Schwartz and Dayhoff, eds. , Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation pp. 353-358, 1979, Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986 by weight amino acid comparison matrix; or other equivalent comparison matrix; (2) For amino acid sequences, penalty 30 for each gap and further for each symbol in each gap Penalty 1 or for nucleotide sequences 50 penalty for each gap and 3 additional penalties for each symbol in each gap; (3) no penalty for terminal gaps; and (4) length There is no maximum penalty for the gap.

本発明のＴＮＦＲ２ポリペプチドの「可溶性形態」には、これらのポリペプチドの特定の断片またはドメインが含まれる。可溶性ポリペプチドは、それらが発現される細胞から分泌され得るポリペプチドである。分泌された可溶性ポリペプチドは、培養培地から所望されるポリペプチドを発現する完全な細胞を、例えば、遠心分離によって、分離し、そして所望されるポリペプチドの存在について培地（上清）をアッセイすることによって同定することができる（そして、その不溶性の膜に結合した対応物と区別することができる）。培地中に所望されるポリペプチドが存在することは、ポリペプチドが細胞から分泌され、したがって、ポリペプチドがポリペプチドの可溶性の形態であることを示している。本発明のサイトカインポリペプチドの可溶性形態の使用は、多くの用途に有用である。組み換え宿主細胞からのポリペプチドの精製は、可溶性ポリペプチドが細胞から分泌されるので、容易である。さらに、可溶性ポリペプチドは、通常、非経口投与について、および多くの酵素的手順について、膜結合形態よりも適している。本発明の特定の実施形態においては、ＴＮＦＲ２ポリペプチドの成熟可溶性形態には、配列番号１のアミノ酸２５８から８７のような膜貫通ドメインまたは膜結合ドメインは含まれていないか、または、そのようなドメインの不十分な部分（例えば、１０アミノ酸もしくはそれ未満）しか含まれておらず、結果として、ポリペプチドは膜結合形態で保たれる。   “Soluble forms” of the TNFR2 polypeptides of the invention include specific fragments or domains of these polypeptides. Soluble polypeptides are polypeptides that can be secreted from the cell in which they are expressed. The secreted soluble polypeptide is separated from intact cells expressing the desired polypeptide from the culture medium, for example, by centrifugation, and the medium (supernatant) is assayed for the presence of the desired polypeptide. (And can be distinguished from the counterpart bound to the insoluble membrane). The presence of the desired polypeptide in the medium indicates that the polypeptide is secreted from the cell and is therefore a soluble form of the polypeptide. The use of soluble forms of the cytokine polypeptides of the invention is useful for many applications. Purification of the polypeptide from recombinant host cells is easy because soluble polypeptides are secreted from the cells. Moreover, soluble polypeptides are usually more suitable than membrane-bound forms for parenteral administration and for many enzymatic procedures. In certain embodiments of the invention, the mature soluble form of the TNFR2 polypeptide does not include a transmembrane domain or a membrane-binding domain, such as amino acids 258 to 87 of SEQ ID NO: 1, or such Only an insufficient portion of the domain (eg, 10 amino acids or less) is included, and as a result, the polypeptide remains in a membrane bound form.

「１つのアミノ酸配列から本質的になる単離されたポリペプチド」は、ポリペプチドが、状況に応じて、上記のアミノ酸配列に加えて、ポリペプチドのいずれかの末端、または両方の末端に共有結合されたさらなる物質を有することができることを意味している。上記のさらなる物質は、ポリペプチドのいずれかの末端、または両方の末端に共有結合された、１から１０，０００個のさらなるアミノ酸；または、ポリペプチドのいずれかの末端、または両方の末端に共有結合された、１から１，０００個のさらなるアミノ酸；あるいは、ポリペプチドのいずれかの末端、または両方の末端に共有結合された、１から１００個のさらなるアミノ酸である。本発明のポリペプチドのいずれかの末端、または両方の末端へのさらなるアミノ酸の共有結合により、自然界には存在しない組み合わせられたアミノ酸配列が得られる。   An “isolated polypeptide consisting essentially of one amino acid sequence” means that the polypeptide is shared at either or both ends of the polypeptide, in addition to the amino acid sequence described above, depending on the circumstances. It means that it can have further substances bound. The additional substance is 1 to 10,000 additional amino acids covalently linked to either end or both ends of the polypeptide; or shared to either end or both ends of the polypeptide. 1 to 1,000 additional amino acids linked; alternatively, 1 to 100 additional amino acids covalently linked to either or both ends of the polypeptide. Additional amino acid covalent linkages to either or both termini of the polypeptides of the invention result in a combined amino acid sequence that does not occur in nature.

（結晶化のためのＴＮＦＲ２ポリペプチド）
ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ＴＮＦＲ２（腫瘍壊死因子受容体２）ポリペプチドの少なくとも一部、またはその改変体の少なくとも一部を含むポリペプチドである。ＴＮＦＲ２ポリペプチドには、ＴＮＦＲ２融合ポリペプチド、例えば、以下に記載されるＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチド、ならびに、ＴＮＦＲ２：Ｆｃポリペプチド、エタナーセプト、ならびに、その改変体、単量体、または多量体形態、修飾されたバージョン、および結合体が含まれる。 (TNFR2 polypeptide for crystallization)
A TNFR2 polypeptide is a polypeptide comprising at least a portion of a TNFR2 (tumor necrosis factor receptor 2) polypeptide, or at least a portion thereof. TNFR2 polypeptides include TNFR2 fusion polypeptides, such as the TNFR2-Ig fusion polypeptides described below, and TNFR2: Fc polypeptides, etanercept, and variants, monomers, or multimeric forms thereof, Modified versions and conjugates are included.

ＴＮＦＲ２ポリペプチドはまた、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー１Ｂ）、ｐ７５、およびＣＤ１２０ｂとも呼ばれている；ＴＮＦＲ２ポリペプチドの全長のアミノ酸配列は、配列番号１に示されている（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｐ２０３３３もまた参照のこと）。別の関連しているが異なる腫瘍壊死因子受容体は、ＴＮＦＲ１であり、ＴＮＦＲＳＦ１Ａおよびｐ５５とも呼ばれている（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｐ１９４３８もまた参照のこと）。ＴＮＦＲ２およびＴＮＦＲ１は、多面的なサイトカイン腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α、または簡単に「ＴＮＦ」）に結合することが知られている。サイトカイン腫瘍壊死因子αは炎症に関係している。ＴＮＦ−αへの結合に加えて、ＴＮＦＲ２およびＴＮＦＲ１ポリペプチドは、ＴＮＦ−β（より一般的には、「リンホトキシン−α」またはＬＴ−αと呼ばれている）のホモ三量体の細胞への結合に介在する。ＴＮＦ−βは、炎症に関係している別のサイトカインであり、ＴＮＦ−αと構造上の類似性を共有する（例えば、Ｃｏｓｍａｎ，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７：５１−７７，１９９６を参照のこと）。本明細書中で使用される場合は、「ＴＮＦＲ」または「ＴＮＦＲポリペプチド」は、ＴＮＦ−αまたはＬＴ−αに結合することができるポリペプチドをいう；ＴＮＦＲポリペプチドの特異的な例は、ＴＮＦＲ２およびＴＮＦＲ１である。本明細書中で使用される場合は、「結合」または「リガンド結合」または「リガンド結合活性を有する」は、単量体形態の場合には、少なくとも１×１０^７Ｍ^−１の親和性で（すなわち、阻害定数すなわち、Ｋ_ｉで）、また、さらなる実施形態においては、単量体形態の場合には、少なくとも１×１０^８Ｍ^−１の親和性で、また、二量体もしくは三量体のような多量体の形態の場合には、少なくとも１×１０^９Ｍ^−１の親和性で、また、二量体もしくは三量体のような多量体の形態の場合には、少なくとも８×１０^９Ｍ^−１の親和性で、ＴＮＦ−αまたはＬＴ−αのようなリガンドに結合することを意味する。ＴＮＦＲ２ポリペプチドまたはその改変体のＴＮＦ−α結合親和性（阻害定数）は、以下の実施例６に記載されるような結合アッセイを使用して決定することができる（Ｍｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１：１５４８−１５６１およびＰｅｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７４：１４８３−１４８９もまた参照のこと）。同じように、同様のアッセイを使用して、ＴＬ−αまたは任意の他の可能性のあるリガンドに対する、ＴＮＦＲ２ポリペプチドまたはその改変体の結合親和性を決定することができる。「ＴＮＦＲに関係している」は、本明細書中で使用される場合は、ＴＮＦＲポリペプチドに対して、アミノ酸配列類似性、または三次元構造の類似性によって関係しているポリペプチドをいうが、ＴＮＦ−αまたはＬＴ−αに必ずしも結合する必要はない。ＴＮＦＲに関係しているポリペプチドの例は、ＣＤ４０（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｐ２５９４２）およびＯＸ４０（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｐ４３４８９）ポリペプチドである。 The TNFR2 polypeptide is also called TNFRSF1B (member 1B of the tumor necrosis factor receptor superfamily), p75, and CD120b; the full-length amino acid sequence of the TNFR2 polypeptide is shown in SEQ ID NO: 1 (Swiss -See also Prot Database Access Number P20333). Another related but different tumor necrosis factor receptor is TNFR1, also called TNFRSF1A and p55 (see also Swiss-Prot Database Accession Number P19438). TNFR2 and TNFR1 are known to bind to the pleiotropic cytokine tumor necrosis factor α (TNF-α, or simply “TNF”). The cytokine tumor necrosis factor α is associated with inflammation. In addition to binding to TNF-α, TNFR2 and TNFR1 polypeptides bind to homotrimeric cells of TNF-β (more commonly referred to as “lymphotoxin-α” or LT-α). Intervene in the binding. TNF-β is another cytokine involved in inflammation and shares structural similarities with TNF-α (see, eg, Cosman, Blood Cell Biochem 7: 51-77, 1996). As used herein, “TNFR” or “TNFR polypeptide” refers to a polypeptide capable of binding to TNF-α or LT-α; specific examples of TNFR polypeptides include TNFR2 and TNFR1. As used herein, “binding” or “ligand binding” or “having ligand binding activity” has an affinity of at least 1 × 10 ⁷ M ⁻¹ when in monomeric form. (Ie, with an inhibition constant, ie, K _i ), and in further embodiments, in the monomeric form, with an affinity of at least 1 × 10 ⁸ M ⁻¹ and also with dimers or trimers In the case of a multimeric form such as a body, with an affinity of at least 1 × 10 ⁹ M ⁻¹ , and in the case of a multimeric form such as a dimer or trimer, at least 8 × It means binding to a ligand such as TNF-α or LT-α with an affinity of 10 ⁹ M ⁻¹ . The TNF-α binding affinity (inhibition constant) of a TNFR2 polypeptide or variant thereof can be determined using a binding assay as described in Example 6 below (Mohler et al., 1993, See also J Immunol 151: 11548-1561 and Peppel et al., 1991, J Exp Med 174: 1483-1489). Similarly, similar assays can be used to determine the binding affinity of a TNFR2 polypeptide or variant thereof to TL-α or any other potential ligand. “Associated with TNFR” as used herein refers to a polypeptide that is related to a TNFR polypeptide by amino acid sequence similarity or three-dimensional structural similarity. , TNF-α or LT-α need not necessarily be bound. Examples of polypeptides related to TNFR are CD40 (Swiss-Prot Database Access Number P25942) and OX40 (Swiss-Prot Database Accession Number P43489) polypeptides.

ＴＮＦＲ１の三次元構造およびいくつかのＴＮＦＲに関係しているポリペプチドの三次元構造が決定されている；例えば、ｐ５５ ＴＮＦＲ１の細胞外ドメインは結晶化されており、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ，ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）に、１ＥＸＴの登録番号で提出されており、そのリガンドＬＴ−αと会合したｐ５５ ＴＮＦＲ１ポリペプチドは、ＰＤＢに１ＴＮＲとして提出されている。また、Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＳＣＯＰ，ｓｃｏｐ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ）においては、ＴＮＦＲとＴＮＦＲに関係しているポリペプチドを定義するＳＣＯＰ ＴＮＦ受容体様タンパク質の折り畳みは、それらが少なくとも３個の類似しているジスルフィドを多く含むドメインを有する細胞外ドメインを共有するという点で、構造的に関係している。例えば、配列番号１に示されているようなＴＮＦＲ２は４個のそのようなドメインを有しており、そのうちの最もＮ末端側の３個のドメインは、ジスルフィド結合の形成に関与している保存されているシステイン残基の特徴的なパターンを共有する。４個のジスルフィドを多く含むドメインは、配列番号１のアミノ酸３９から７６、アミノ酸７７から１１８、アミノ酸１１９から１６２、およびアミノ酸１６３から２０１である。ジスルフィド結合は、以下のアミノ酸位置のシステイン残基の対の間で形成される：４０と５３、５４と６７、５７と７５、７８と９３、９６と１１０、１００と１１８，１２０と１２６、１３４と１４３、１３７と１６１、および（４番目のドメイン中の）１６４と１７９；４番目のジスルフィド結合ドメインには、配列番号１のアミノ酸１８４および２００のシステイン残基の別の対もまた、含まれている。   The three-dimensional structure of TNFR1 and the three-dimensional structure of several TNFR-related polypeptides have been determined; for example, the extracellular domain of p55 TNFR1 has been crystallized, and Protein Data Bank (PDB, www. rcsb.org/pdb/), the p55 TNFR1 polypeptide associated with its ligand LT-α has been submitted as 1 TNR to the PDB. In the Structural Classification of Proteins Resource (SCOP, scop.berkeley.edu), the folds of SCOP TNF receptor-like proteins that define polypeptides related to TNFR and TNFR are at least three similar. Are structurally related in that they share an extracellular domain with a disulfide-rich domain. For example, TNFR2 as shown in SEQ ID NO: 1 has four such domains, of which the three most N-terminal domains are conserved in the formation of disulfide bonds. Share the characteristic pattern of cysteine residues that are The four disulfide rich domains are amino acids 39 to 76, amino acids 77 to 118, amino acids 119 to 162, and amino acids 163 to 201 of SEQ ID NO: 1. Disulfide bonds are formed between pairs of cysteine residues at the following amino acid positions: 40 and 53, 54 and 67, 57 and 75, 78 and 93, 96 and 110, 100 and 118, 120 and 126, 134. 143, 137 and 161, and 164 and 179 (in the fourth domain); the fourth disulfide binding domain also includes another pair of cysteine residues at amino acids 184 and 200 of SEQ ID NO: 1. ing.

ＴＮＦＲ２ポリペプチドおよびその改変体は、構造的に特徴付けられたＴＮＦＲポリペプチドおよびＴＮＦＲに関係しているポリペプチドと同様に、ＧｅｎｅＦｏｌｄ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｐｒｏｔ Ｓｃｉ ７：１４３１−１４４０）、尋問タンパク質配列をＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）の構造の典型に重ね合わせるタンパク質折り畳みプログラム（Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：２３５−２４２）のようなコンピュータープログラムを使用することによって、それらの三次元構造の類似性について分析することができる。ＴＮＦＲ２ポリペプチドまたはその改変体の構造を評価するためにＧｅｎｅＦｏｌｄを使用するためには、ポリペプチド配列をプログラムに入力し、これによって、ＧｅｎｅＦｏｌｄデータベース中に存在している既知のタンパク質構造（「鋳型」構造）にそれをいかにして折り畳むかを反映する確立スコアを割り当てる。スコアリングのために、ＧｅｎｅＦｏｌｄは、一次アミノ酸配列類似性、残基の埋没パターン、局所相互作用、および二次構造の比較を利用する。ＧｅｎｅＦｏｌｄプログラムでは、タンパク質の折り畳みに関するデータベース中の鋳型構造の全ての上でアミノ酸配列を折り畳む。これには、いくつかのヒトＴＮＦＲポリペプチド、例えば、ｐ５５ ＴＮＦＲ１（鋳型「１ｔｎｒＲ」）、およびＴＮＦＲに関係しているポリペプチドであるＣＤ４０（鋳型「１ｃｄｆ＿」）についての解明されている構造も含まれている。それぞれの比較のために、３個の異なるスコアが、（ｉ）配列のみ；（ｉｉ）配列と、局所的な立体構造の優先関係、および埋没の関係；ならびに（ｉｉｉ）配列と局所的な立体構造の優先関係、および埋没の関係と二次構造に基づいて計算される。そのそれぞれの場合において、このプログラムにより、最適なアラインメントが決定され、偶然生じるアラインメントのこの度合いである確立（Ｐ値）が計算され、スコアとしてＰ値の逆数が報告される。これらのスコアは、したがって、尋問ポリペプチド配列がＴＮＦＲポリペプチド構造のような種々の参照構造と適合する程度を反映する。ＧｅｎｅＦｏｌｄを、ＴＮＦＲ２ポリペプチドまたはその改変体（尋問ポリペプチド）を他のＴＮＦＲまたはＴＮＦＲに関係しているポリペプチドに対して比較するために使用する場合には、尋問ポリペプチドは、１ｃｄｆ＿、１ｔｎｒＲ、または別のＴＮＦＲ、またはＴＮＦＲに関係している鋳型に、３つのスコアリングカテゴリーのうちの１つにおいてもっともヒットするとして適合させられ、そして／また、少なくとも５００、または少なくとも７００、または少なくとも９００、または、少なくとも９９０、または９９９．９（最大スコア）のいずれかのスコアでＴＮＦＲ鋳型と適合する。ＴＮＦＲ２ポリペプチドまたはその改変体の分析のための別の方法は、尋問ポリペプチドの構造を、ＴＮＦＲまたはＴＮＦＲに関係しているタンパク質の構造と、相同性モデリングの周知のプロセスを通じてアラインメントすることである。相同性モデリングに使用することができる１つの有用なソフトウェアプログラムはＰｈａｍａｃｏｐｅｉａ Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）の関連子会社であるＡｃｃｅｌｒｙｓから入手することができる「Ｍｏｄｅｌｅｒ」プログラムである。   TNFR2 polypeptides and variants thereof, as well as structurally characterized TNFR polypeptides and polypeptides related to TNFR, GeneFold (Tripos, Inc., ST. Louis, MO; Jarozewski et al.,). 1998, Prot Sci 7: 1431-1440), a protein folding program (Berman et al., 2000, Nucleic Acids Res 28: 235-242) that superimposes the interrogated protein sequence to the typical structure of the Protein Data Bank (PDB). By using simple computer programs, it is possible to analyze the similarity of their three-dimensional structures. In order to use GeneFold to evaluate the structure of a TNFR2 polypeptide or variant thereof, the polypeptide sequence is entered into the program, thereby known protein structures (“templates”) present in the GeneFold database. Assign a probability score that reflects how the structure is folded. For scoring, GeneFold utilizes primary amino acid sequence similarity, residue buried patterns, local interactions, and secondary structure comparisons. The GeneFold program folds the amino acid sequence over all of the template structures in the database for protein folding. This includes elucidated structures for several human TNFR polypeptides, eg, p55 TNFR1 (template “1tnrR”), and CD40 (template “1cdf_”), a polypeptide related to TNFR. It is. For each comparison, three different scores are given: (i) sequence only; (ii) sequence and local conformational preference and buried relationship; and (iii) sequence and local stereo It is calculated based on the priority relationship of the structure, the relationship of the burial and the secondary structure. In each case, the program determines the optimal alignment, calculates the probability (P value) of this degree of alignment that happens by chance, and reports the reciprocal of the P value as a score. These scores thus reflect the extent to which the interrogating polypeptide sequence is compatible with various reference structures such as the TNFR polypeptide structure. When GeneFold is used to compare a TNFR2 polypeptide or a variant thereof (interrogation polypeptide) to other TNFR or TNFR related polypeptides, the interrogation polypeptide is 1cdf_, 1tnrR, Or another TNFR, or a template associated with TNFR, adapted as the best hit in one of three scoring categories and / or at least 500, or at least 700, or at least 900, or Match with a TNFR template with a score of either at least 990, or 999.9 (maximum score). Another method for analysis of a TNFR2 polypeptide or variant thereof is to align the structure of the interrogation polypeptide with the structure of the protein associated with TNFR or TNFR through the well-known process of homology modeling . One useful software program that can be used for homology modeling is Pharmacopeia Inc. The “Modeler” program available from Accelrys, an affiliate of (Princeton, NJ).

結晶化のためのＴＮＦＲ２ポリペプチドには、配列番号１のＴＮＦＲ２ポリペプチドの細胞外領域の少なくとも一部、またはその改変体が含まれる。特定の実施形態においては、ＴＮＦＲ２ポリペプチドの細胞外領域全体が、ＴＮＦＲ２ポリペプチド中に含まれる。特定の実施例としては、ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２８から２５７、またはアミノ酸２７から２５７、またはアミノ酸２３から２５７を含むこともできる。さらなる実施形態においては、ＴＮＦＲ２ポリペプチドの細胞外領域は、分子内ジスルフィド結合を有する３個の最もＮ末端側のドメインを完全なまま残しながら、少なくとも１つの可能性のあるＮ結合グリコシル化部位（例えば、配列番号１のアミノ酸１７１および１９３）、および／または、プロリンを多く含む領域（例えば、配列番号１のアミノ酸２４から３６、もしくは、配列番号１のアミノ酸２１７から２６１）を欠失させるように、短縮させられる。例えば、１つの実施形態においては、ＴＮＦＲ２ポリペプチドには、配列番号１のアミノ酸３９から１６２、または配列番号１のアミノ酸３９から１７９、または配列番号１のアミノ酸３９から２００、あるいは上記のいずれかの改変体が含まれる。   The TNFR2 polypeptide for crystallization includes at least a part of the extracellular region of the TNFR2 polypeptide of SEQ ID NO: 1, or a variant thereof. In certain embodiments, the entire extracellular region of a TNFR2 polypeptide is included in the TNFR2 polypeptide. As a specific example, a TNFR2 polypeptide can also include amino acids 28 to 257, or amino acids 27 to 257, or amino acids 23 to 257 of SEQ ID NO: 1. In a further embodiment, the extracellular region of the TNFR2 polypeptide has at least one potential N-linked glycosylation site (while leaving the three most N-terminal domains with intramolecular disulfide bonds intact). For example, amino acids 171 and 193 of SEQ ID NO: 1) and / or a region rich in proline (for example, amino acids 24 to 36 of SEQ ID NO: 1 or amino acids 217 to 261 of SEQ ID NO: 1) are deleted. , Shortened. For example, in one embodiment, the TNFR2 polypeptide includes amino acids 39 to 162 of SEQ ID NO: 1, or amino acids 39 to 179 of SEQ ID NO: 1, or amino acids 39 to 200 of SEQ ID NO: 1, or any of the above Variants are included.

本発明にしたがう結晶化のためのＴＮＦＲ２ポリペプチドとしては、配列番号１のＴＮＦＲ２ポリペプチドの長さの、少なくとも２０％（または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％）であるアミノ酸配列の長さを有しており、ＴＮＦＲ２ポリペプチドと少なくとも６０％（または少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％）の配列同一性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明には、また、ＴＮＦＲ２ポリペプチド、および配列番号１の少なくとも８０個、または少なくとも９０個、または少なくとも１００個、または少なくとも１１０個、または少なくとも１２０個、または少なくとも１３０個の連続しているアミノ酸を含むセグメントを含むポリペプチド断片、あるいはそれらの改変体も、含まれる。このようなポリペプチドおよびポリペプチド断片には、また、配列番号１のＴＮＦＲ２ポリペプチドと、少なくとも７０％（または少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％）の配列同一性を共有するセグメントも含まれる場合がある。   TNFR2 polypeptides for crystallization according to the present invention include at least 20% (or at least 25%, or at least 30%, or at least 35%, or at least 40%) of the length of the TNFR2 polypeptide of SEQ ID NO: 1. Or at least 50%) and has a length of at least 60% (or at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95) with a TNFR2 polypeptide. %, At least 97.5%, at least 99%, or at least 99.5%) polypeptides having sequence identity. The present invention also includes a TNFR2 polypeptide and at least 80, or at least 90, or at least 100, or at least 110, or at least 120, or at least 130 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 1. Also included are polypeptide fragments comprising a segment comprising, or variants thereof. Such polypeptides and polypeptide fragments also include at least 70% (or at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% of the TNFR2 polypeptide of SEQ ID NO: 1. %, At least 97.5%, at least 99%, or at least 99.5%) segments that share sequence identity may also be included.

結晶化させられるＴＮＦＲ２ポリペプチドのそのような改変体を生成する場合には、いくつかの検討材料を、当業者を、ＴＮＦ−α結合活性のような生物学的活性を保持している改変体を生成できるように導くために、使用することができる。特定の実施形態においては、配列番号１のＴＮＦＲ２ポリペプチドについての上記の、少なくとも３個のＮ末端ジスルフィド結合領域、または少なくとも４個全てのジスルフィド結合領域を保持していることが望ましい。さらに、Ｎ末端の３個のジスルフィド結合領域を含むＴＮＦＲ２の細胞外ドメインの部分を、４番目のジスルフィド結合領域の全てまたはその一部を含むように伸張することができる。また、特定の実施形態においては、４番目のジスルフィド結合領域のシステインが全く含まれないか、あるいは、システインの最初の対（配列番号１のアミノ酸１６４と１７９）を含む４番目のジスルフィド結合領域の領域が含まれ、そして／またはシステインの２番目の対（配列番号１のアミノ酸１８５と２００）を含む４番目のジスルフィド結合領域の領域が含まれる。したがって、本発明の範囲に含まれる改変体は、これらのドメインのジスルフィド結合を形成することに関与しているシステイン残基を保持しており、また、それらのシステインの間に適切な間隔（すなわち、一次アミノ酸配列の残基の数）も保持している。例えば、ジスルフィド結合を形成するシステイン対の間に５個を超えるアミノ酸が挿入されていないか、または欠失させられている改変体は、本発明の範囲に含まれ、したがって、そのようなシステインの間に４個を超えるアミノ酸が挿入されていないかまたは欠失させられている改変体が、本発明の範囲に含まれ、そのようなシステインの間に３個を超えるアミノ酸が挿入されていないかまたは欠失させられている改変体が、本発明の範囲に含まれ、そのようなシステインの間に２個を超えるアミノ酸が挿入されていないかまたは欠失させられている改変体が、本発明の範囲に含まれ、そのようなシステインの間に１個を超えるアミノ酸が挿入されていないかまたは欠失させられている改変体が、本発明の範囲に含まれる。   When generating such variants of a TNFR2 polypeptide to be crystallized, a number of considerations are given to those skilled in the art that variants possess biological activity such as TNF-α binding activity. Can be used to guide the generation of In certain embodiments, it is desirable to retain at least three N-terminal disulfide bond regions, or at least all four disulfide bond regions, as described above for the TNFR2 polypeptide of SEQ ID NO: 1. Furthermore, the portion of the extracellular domain of TNFR2 that contains the N-terminal three disulfide bond regions can be extended to include all or part of the fourth disulfide bond region. Also, in certain embodiments, the fourth disulfide bond region contains no cysteine at all, or the fourth disulfide bond region contains the first pair of cysteines (amino acids 164 and 179 of SEQ ID NO: 1). A region is included and / or a region of the fourth disulfide bond region that includes the second pair of cysteines (amino acids 185 and 200 of SEQ ID NO: 1). Thus, variants within the scope of the present invention retain cysteine residues that are involved in forming disulfide bonds in these domains and also have an appropriate spacing between them (ie , The number of residues in the primary amino acid sequence). For example, variants in which no more than 5 amino acids have been inserted or deleted between cysteine pairs that form disulfide bonds are within the scope of the invention, and thus Variants in which more than 4 amino acids are not inserted or deleted in the meantime are included in the scope of the present invention, and more than 3 amino acids are not inserted between such cysteines Alternatively, deleted variants are included within the scope of the present invention, and variants in which more than two amino acids are not inserted or deleted between such cysteines are included in the present invention. Within the scope of the present invention, variants in which more than one amino acid has not been inserted or deleted between such cysteines are included within the scope of the present invention.

当業者がＴＮＦＲ２ポリペプチドの改変体を生成できるように導く別の検討材料は、行われるアミノ酸置換の性質である；このような置換は保存的であり得、保存的置換とは、改変体中の特定の位置に存在しているアミノ酸が、変更されていないＴＮＦＲ２ポリペプチド中の対応している位置のアミノ酸と同じ化学的および／または大きさ特性を有することを意味する。表２に、類似する特性を有すると考えられるアミノ酸のグループをまとめる。したがって、表２の同じ並びにある別のアミノ酸での任意のアミノ酸の置換は、保存的置換である。特定の実施形態においては、ＴＮＦＲ２ポリペプチド改変体は、配列番号１のアミノ酸３９から１６２、または配列番号１のアミノ酸３９から１７９、または配列番号１のアミノ酸３９から２００の長さの隅々にわたって２０％またはそれ未満のアミノ酸置換（または１５％もしくはそれ未満、または１０％もしくはそれ未満、または７．５％もしくはそれ未満、または５％もしくはそれ未満、または２．５％もしくはそれ未満、または１％もしくはそれ未満）を有する。特定の実施形態においては、ＴＮＦＲ２ポリペプチド改変体は、配列番号１のアミノ酸３９から１６２、または配列番号１のアミノ酸３９から１７９、または配列番号１のアミノ酸３９から２００の長さの隅々にわたって、２０％またはそれ未満のアミノ酸置換（または１５％もしくはそれ未満、または１０％もしくはそれ未満、または７．５％もしくはそれ未満、または５％もしくはそれ未満、または２．５％もしくはそれ未満、または１％もしくはそれ未満）を有する。   Another consideration that will allow one of ordinary skill in the art to generate variants of the TNFR2 polypeptide is the nature of the amino acid substitutions made; such substitutions can be conservative and are conservative substitutions in the variant. Means that the amino acid present at that particular position has the same chemical and / or size characteristics as the amino acid at the corresponding position in the unaltered TNFR2 polypeptide. Table 2 summarizes the groups of amino acids that are considered to have similar properties. Thus, substitution of any amino acid with the same as well as some other amino acid in Table 2 is a conservative substitution. In certain embodiments, the TNFR2 polypeptide variant is 20 amino acids across the length of amino acids 39 to 162 of SEQ ID NO: 1, or amino acids 39 to 179 of SEQ ID NO: 1, or amino acids 39 to 200 of SEQ ID NO: 1. % Or less amino acid substitutions (or 15% or less, or 10% or less, or 7.5% or less, or 5% or less, or 2.5% or less, or 1% Or less). In certain embodiments, the TNFR2 polypeptide variant spans a length of amino acids 39 to 162 of SEQ ID NO: 1, or amino acids 39 to 179 of SEQ ID NO: 1, or amino acids 39 to 200 of SEQ ID NO: 1, 20% or less amino acid substitution (or 15% or less, or 10% or less, or 7.5% or less, or 5% or less, or 2.5% or less, or 1 % Or less).

特定の実施形態においては、結晶化させられるＴＮＦＲ２ポリペプチドまたはその改変体は、ＴＮＦ−α結合活性、および／またはＬＴ−α結合活性を有する。   In certain embodiments, the TNFR2 polypeptide or variant thereof that is crystallized has TNF-α binding activity and / or LT-α binding activity.

（表２）
（保存的アミノ酸置換） (Table 2)
(Conservative amino acid substitution)

（ＴＮＦＲ２融合タンパク質）
特定の実施形態においては、本発明の結晶化方法に使用されるＴＮＦＲ２ポリペプチドには、Ｉｇ（免疫グロブリン）ポリペプチドの一部またはその改変体に対して融合させられたＴＮＦＲ２ポリペプチドが含まれ、これは、状況に応じて、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドのＴＮＦＲ２部分とＩｇ部分との間にポリペプチドリンカーを有する。（任意のポリペプチドリンカーは、それがＴＮＦＲ２融合ポリペプチド中に存在する場合には、１アミノ酸長のような短いものであり得る。）免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチドは、アミノ酸配列によって関連付けられ、また、三次元構造によっても関連付けられる。ＳＣＯＰで定義されるような、ポリペプチドのＩｇスーパーファミリーは、通常は２つのシートに並べられる７本の鎖を有するとして記載される、タンパク質折り畳み「免疫グロブリン様βサンドイッチ」を有するタンパク質の１つのサブセットであるが、折り畳みのいくつかのメンバーはさらに鎖を有する。Ｉｇスーパーファミリーは以下の４個のタンパク質ドメインファミリーに分けられる：Ｖセットドメイン（抗体可変ドメイン様）；Ｃ１セットドメイン（抗体定常ドメイン様）；Ｃ２セットドメイン；およびＩセットドメイン。

(TNFR2 fusion protein)
In certain embodiments, the TNFR2 polypeptide used in the crystallization method of the invention includes a TNFR2 polypeptide fused to a portion of an Ig (immunoglobulin) polypeptide or a variant thereof. This has a polypeptide linker between the TNFR2 and Ig portions of the TNFR2-Ig fusion polypeptide, as appropriate. (Any polypeptide linker can be as short as 1 amino acid long if it is present in a TNFR2 fusion polypeptide.) An immunoglobulin (Ig) polypeptide is related by amino acid sequence, and Also related by three-dimensional structure. The Ig superfamily of polypeptides, as defined by SCOP, is one of the proteins with protein folding “immunoglobulin-like β sandwich”, described as having seven chains normally arranged in two sheets. Although a subset, some members of the fold also have chains. The Ig superfamily is divided into four protein domain families: V set domain (antibody variable domain-like); C1 set domain (antibody constant domain-like); C2 set domain; and I set domain.

ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドには、少なくともＩｇポリペプチドの一部が、例えば、Ｉｇポリペプチドの定常領域の少なくとも１０個の連続しているアミノ酸、またはＩｇポリペプチドの定常領域の少なくとも２０個の連続しているアミノ酸と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を共有する少なくとも１４アミノ酸長のポリペプチドが含まれる。本発明のＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドには、少なくとも１つの重鎖定常領域が含まれることが好ましく、特定の実施形態においては、少なくとも１つの軽鎖定常領域が含まれることが好ましい。   A TNFR2-Ig fusion polypeptide includes at least a portion of an Ig polypeptide, eg, at least 10 contiguous amino acids of an Ig polypeptide constant region, or at least 20 contiguous regions of an Ig polypeptide constant region. Polypeptides of at least 14 amino acids in length that share at least 70% amino acid sequence identity with the amino acids in question. The TNFR2-Ig fusion polypeptide of the invention preferably includes at least one heavy chain constant region, and in certain embodiments, preferably includes at least one light chain constant region.

特定の実施形態においては、Ｉｇポリペプチドには、ＩｇＧクラスの重鎖の定常領域、またはその断片および／もしくは改変体が含まれ、他の実施形態においては、他の免疫グロブリンイソ型の定常領域を、そのようなＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合体を生成するために使用することができる。例えば、ＩｇＭクラスの重鎖の定常領域、またはその断片および／もしくは改変体を含むＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドを、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドの１０価（ｄｅｃａｖａｌｅｎｔ）形態を生成するために使用することができる。配列番号２によって提供されるヒトＩｇＧ１クラスの重鎖定常ドメインの特異的な例を有する、免疫グロブリン重鎖の定常領域には、ＣＨ１ドメイン（配列番号２のアミノ酸１から９８）、ヒンジ領域（配列番号２のアミノ酸９９から１１０）、ＣＨ２ドメイン（配列番号２のアミノ酸１１１から２２３）、およびＣＨ３ドメイン（配列番号２のアミノ酸２２４から３３０）が含まれる。配列番号３によって、ＩｇＧ１クラスの重鎖定常ドメインの改変体の特異的な例が提供される。この中には、２つのアミノ酸置換が生成されている（２３９位でＧｌｕがＡｓｐで置換されており、２４１位でＭｅｔがＬｅｕで置換されている）。本発明の特定の実施形態には、配列番号２または配列番号３の全体またはそれらの一部に対して融合させられた、ＴＮＦＲ２ポリペプチドの細胞外ドメイン全体またはそれらの一部（配列番号１）を含む、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドが含まれる。これは、状況に応じて、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドのＴＮＦＲ２部分とＩｇ部分との間にリンカーポリペプチドを有する。本発明のさらなる実施形態においては、少なくともＣＨ_１の部分を含む重鎖定常領域が、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドのＩｇ部分である。特定の実施形態では、また、例えば、複数の重鎖の間にジスルフィド結合を提供するためにヒンジ領域のＣ末端側半分を含めることができる。本発明の特定の実施形態においては、ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、状況に応じてポリペプチドリンカーを介して、重鎖定常ドメインのＣＨ_１領域の少なくとも一部のＮ末端に対して共有結合させられて、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドが形成される。 In certain embodiments, an Ig polypeptide includes a constant region of an IgG class heavy chain, or fragments and / or variants thereof, and in other embodiments, a constant region of another immunoglobulin isoform. Can be used to generate such TNFR2-Ig fusions. For example, using a TNFR2-Ig fusion polypeptide comprising a constant region of an IgM class heavy chain, or a fragment and / or variant thereof, to generate a decavalent form of the TNFR2-Ig fusion polypeptide Can do. The constant region of an immunoglobulin heavy chain, which has a specific example of the human IgG1 class heavy chain constant domain provided by SEQ ID NO: 2, includes a CH1 domain (amino acids 1 to 98 of SEQ ID NO: 2), a hinge region (sequence 2 includes amino acids 99 to 110), a CH2 domain (amino acids 111 to 223 of SEQ ID NO: 2), and a CH3 domain (amino acids 224 to 330 of SEQ ID NO: 2). SEQ ID NO: 3 provides a specific example of a variant of the heavy chain constant domain of the IgG1 class. In this, two amino acid substitutions have been generated (Glu is replaced with Asp at position 239 and Met is replaced with Leu at position 241). Certain embodiments of the present invention include the entire extracellular domain of TNFR2 polypeptide or a portion thereof (SEQ ID NO: 1) fused to SEQ ID NO: 2 or all of SEQ ID NO: 3 or a portion thereof. A TNFR2-Ig fusion polypeptide is included. This has a linker polypeptide between the TNFR2 and Ig portions of the TNFR2-Ig fusion polypeptide, depending on the circumstances. In a further embodiment of the present invention, the heavy chain constant region comprising at least a portion of CH ₁ is a Ig portion of the TNFR2-Ig fusion polypeptide. In certain embodiments, the C-terminal half of the hinge region can also be included, for example, to provide a disulfide bond between multiple heavy chains. In certain embodiments of the invention, the TNFR2 polypeptide is covalently attached to the N-terminus of at least a portion of the CH ₁ region of the heavy chain constant domain via a polypeptide linker, as appropriate, to provide TNFR2 A -Ig fusion polypeptide is formed.

特定のさらなる実施形態においては、ヒンジ領域の少なくとも一部が、ＣＨ_１領域に結合させられる。１つの例としては、ＣＨ_１およびＣＨ_２が分子中に存在し、ヒンジ領域全体もまた存在する。別の例としては、ＣＨ_１は、ヒンジの最初の７個のアミノ酸（配列番号２または３のアミノ酸９９から１０５）とともに存在する。本発明のＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドが、例えば、単量体または二量体であり得ること、そして二量体ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドが望ましい場合には、複数の重鎖の間のジスルフィド結合の形成に関与しているヒンジ領域の部分（例えば、配列番号２または３のアミノ酸１０９を含む配列番号２または３のアミノ酸９９から１１０の部分）を含むことが重要であることは、当業者によって理解されるであろう。本発明のさらなる実施形態においては、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドは、Ｃ末端リジン残基（配列番号２または３のアミノ酸３３０）を含まないＣＨ３ドメインの部分を含むことができる。なぜなら、Ｃ末端リジン残基は、Ｉｇ重鎖ポリペプチドの翻訳後プロセシングにおいて除去されることが観察されているからである。 In certain further embodiments, at least a portion of the hinge region is attached to the CH ₁ region. As one example, CH ₁ and CH ₂ are present in the molecule, and the entire hinge region is also present. As another example, CH ₁ is present with the first 7 amino acids of the hinge (amino acids 99 to 105 of SEQ ID NO: 2 or 3). The TNFR2-Ig fusion polypeptide of the present invention can be, for example, monomeric or dimeric, and if a dimeric TNFR2-Ig fusion polypeptide is desired, a disulfide bond between multiple heavy chains It is important by those skilled in the art to include the portion of the hinge region that is involved in the formation of (for example, the portion of amino acids 99 to 110 of SEQ ID NO: 2 or 3 comprising amino acid 109 of SEQ ID NO: 2 or 3). Will be understood. In a further embodiment of the invention, the TNFR2-Ig fusion polypeptide can comprise a portion of the CH3 domain that does not include the C-terminal lysine residue (amino acid 330 of SEQ ID NO: 2 or 3). This is because it has been observed that the C-terminal lysine residue is removed during post-translational processing of the Ig heavy chain polypeptide.

（Ｆｃドメイン）
本明細書中で使用される場合は、Ｆｃドメインには、上記に記載したような重鎖のＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインの１つまたは全て、あるいは、それらの断片または改変体が含まれ得、これらは、Ｆｃドメインを含むＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドの構成要素によって決定した場合には、単量体、二量体、または多量体であり得る。 (Fc domain)
As used herein, an Fc domain includes one or all of the CH1 domain, hinge domain, CH2 domain, and CH3 domain of a heavy chain as described above, or fragments or modifications thereof. Bodies, which can be monomeric, dimeric, or multimeric as determined by the components of the TNFR2-Ig fusion polypeptide comprising the Fc domain.

本発明による結晶化のために具体的に想定される特定のポリペプチドとしては、Ｆｃドメインの少なくとも一部を含むＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドが挙げられる。ヒトおよび他の哺乳動物の疾患の処置に適している好ましいＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ＴＮＦＲ２：Ｆｃであり、これは、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ部分に対して融合させられたＴＮＦＲ２ポリペプチドの細胞外ドメイン全体またはその一部、あるいはその改変体であって、状況に応じて、ＴＮＦＲ２：ＦｃポリペプチドのＴＮＦＲ２部分とＦｃ部分との間にポリペプチドリンカーを有するものを意味する。   Specific polypeptides specifically contemplated for crystallization according to the present invention include TNFR2-Ig fusion polypeptides that include at least a portion of an Fc domain. A preferred TNFR2 polypeptide suitable for the treatment of human and other mammalian diseases is TNFR2: Fc, which, as used herein, is fused to the Fc portion of an immunoglobulin polypeptide. An entire extracellular domain of TNFR2 polypeptide or a part thereof, or a variant thereof, and depending on the situation, a polypeptide linker between TNFR2 part and Fc part of TNFR2: Fc polypeptide means.

（他の多量体化ドメイン）
本発明の多量体としては、結晶化のためのＴＮＦＲ２ポリペプチドが挙げられ、ここでは、ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、二量体、三量体、十量体、または他の多量体形態である。本発明の多量体を調製するための別の方法としては、ロイシンジッパーの使用が挙げられる。ロイシンジッパードメインは、それらが見出されるポリペプチドのオリゴマー形成を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、いくつかのＤＮＡ結合ポリペプチドにおいて最初に同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９，１９８８）、それ以来、種々の様々なポリペプチドにおいて見出されてきた。特に、既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する、自然界に存在しているペプチドまたはその誘導体がある。ジッパードメイン（本明細書中では、多量体化ドメインまたは多量体形成ドメインとも呼ばれる）には、反復的な７個の繰り返しが含まれ、多くの場合には、これには、他のアミノ酸がちりばめられて組み込まれている４個または５個のロイシン残基が含まれている。ロイシンジッパーの使用と、ロイシンジッパーを用いた多量体の調製は当該分野で周知である。他の多量体化ドメインとしては、肺のサーファクタントタンパクＤに見られる三量体化ドメイン（Ｋｏｖａｃｓ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ ＮＭＲ ２４：８９−１０２）、および当該分野で公知の他のそのようなドメインが挙げられる。 (Other multimerization domains)
Multimers of the present invention include TNFR2 polypeptides for crystallization, where the TNFR2 polypeptide is a dimer, trimer, decamer, or other multimeric form. Another method for preparing the multimers of the present invention includes the use of leucine zippers. Leucine zipper domains are peptides that promote oligomerization of the polypeptides in which they are found. Leucine zippers were first identified in several DNA binding polypeptides (Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988) and have since been found in a variety of different polypeptides. In particular, among the known leucine zippers are naturally occurring peptides or derivatives thereof that dimerize or trimerize. A zipper domain (also referred to herein as a multimerization domain or multimerization domain) includes a repetitive seven repeat, which is often interspersed with other amino acids. 4 or 5 leucine residues incorporated into it. The use of leucine zippers and the preparation of multimers using leucine zippers are well known in the art. Other multimerization domains include the trimerization domain found in pulmonary surfactant protein D (Kovacs et al., 2002, J Biomol NMR 24: 89-102), and other such as known in the art. Domain.

（エタナーセプト）
１つの実施形態においては、結晶化されるＴＮＦＲ２ポリペプチドは「エタナーセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）」である。これは、ヒトＩｇＧ１の２３２位のアミノ酸位置に融合させられたＴＮＦＲ２ポリペプチドの細胞外部分に由来する２３５個のアミノ酸からそれぞれがなる、２つのポリペプチドの二量体である。エタナーセプトの単量体成分のアミノ酸配列は、配列番号４に示される。この分子の二量体形態においては、２つのこれらの融合ポリペプチド（または「単量体」）が、２つの単量体の免疫グロブリン部分の間で形成される３個のジスルフィド結合によって互いに結合している。したがって、エタナーセプト二量体は、９３４個のアミノ酸からなり、およそ１５０キロダルトンの見かけの分子量を有する（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，２００２，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．，ｐｐ．１７５２−１７５５）。エタナーセプトは、現在、商品名ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）として市販されている。 (Ethanercept)
In one embodiment, the TNFR2 polypeptide that is crystallized is “etanercept”. This is a dimer of two polypeptides each consisting of 235 amino acids derived from the extracellular portion of the TNFR2 polypeptide fused to amino acid position 232 of human IgG1. The amino acid sequence of the monomer component of etanercept is shown in SEQ ID NO: 4. In the dimeric form of this molecule, two of these fusion polypeptides (or “monomers”) are linked together by three disulfide bonds formed between the immunoglobulin portions of the two monomers. is doing. Thus, the etanercept dimer consists of 934 amino acids and has an apparent molecular weight of approximately 150 kilodaltons (Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc., pp. 1752-1755). Ethanercept is currently marketed under the trade name ENBREL® (Amgen Inc., Thousand Oaks, Calif.).

（グリコシル化および結合体）
本発明には、付随する自然なパターンのグリコシル化を伴っている、またはそれを伴っていない、本発明のＴＮＦＲ２ポリペプチドが含まれる。酵母または哺乳動物の発現系（例えば、ＣＯＳ−１またはＣＨＯ細胞）中で発現させられるポリペプチドは、分子量およびグリコシル化パターンにおいて、発現系の選択に応じて、自然界に存在しているヒトのポリペプチドと類似している場合も、またそれとは明らかに異なる場合もある。本発明のポリペプチドの細菌の発現系（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））での発現により、グリコシル化されていない分子が得られる。さらに、所定の調製物に、ポリペプチドの複数の様々にグリコシル化された種を含めることができる。グリコシル基は、従来の方法、具体的には、グリコペプチダーゼを利用する方法によって除去することができる。一般的には、本発明のグリコシル化ポリペプチドを、モル過剰量のグリコペプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とともにインキュベートすることができる。 (Glycosylation and conjugate)
The present invention includes TNFR2 polypeptides of the present invention, with or without the accompanying natural pattern of glycosylation. Polypeptides expressed in yeast or mammalian expression systems (eg, COS-1 or CHO cells) are naturally occurring human polymorphisms in molecular weight and glycosylation patterns, depending on the choice of expression system. It may be similar to a peptide or it may be distinctly different. Expression of the polypeptides of the present invention in bacterial expression systems (eg, E. coli) results in non-glycosylated molecules. In addition, a given preparation can include a plurality of various glycosylated species of the polypeptide. Glycosyl groups can be removed by conventional methods, specifically those utilizing glycopeptidases. In general, glycosylated polypeptides of the invention can be incubated with a molar excess of glycopeptidase (Boehringer Mannheim).

本明細書中に記載される結晶化のための、およびその治療における使用のためのＴＮＦＲ２ポリペプチドは、その血清半減期を延長させるため、またはタンパク質の送達を促進するために、ポリエチレングリコールと結合させられる（ペグ化）場合がある。ＴＮＦＲ ｐ５５から導かれたペグ化させられたＴＮＦＲポリペプチドの例は、組み換えのポリエチレングリコール結合可溶性ＴＮＦＲ ｐ５５（ＰＥＧ−ｓＴＮＦＲ Ｉ型）である。これは、ＴＮＦＲ ｐ５５の細胞外ドメインを含む。ＴＮＦＲ２ポリペプチドおよびその断片を同様の様式でポリエチレングリコールと結合と結合させることができる。ポリペプチドのペグ化のための試薬および方法は、例えば、ＷＯ９２／１６２２１；ＷＯ９９／１０２３３０；および米国特許第６，４２０，３３９号；同第６，４３３，１５８号；同第６，４４１，１３６号；同第６，４５１，９８６号；同第６，５４８，６４４号；および同第６，５５２，１７０号に記載されている。これらの全ては、引用により本明細書中に組み入れられる。   A TNFR2 polypeptide for crystallization described herein and for use in therapy thereof is conjugated with polyethylene glycol to increase its serum half-life or to facilitate protein delivery. There are cases where it is made (pegylation). An example of a PEGylated TNFR polypeptide derived from TNFR p55 is recombinant polyethylene glycol-linked soluble TNFR p55 (PEG-sTNFR type I). This includes the extracellular domain of TNFR p55. TNFR2 polypeptides and fragments thereof can be combined with polyethylene glycol in a similar manner. Reagents and methods for pegylation of polypeptides are described, for example, in WO 92/16221; WO 99/102330; and US Pat. Nos. 6,420,339; 6,433,158; 6,441,136. No. 6,451,986; No. 6,548,644; and No. 6,552,170. All of these are hereby incorporated by reference.

本発明には、また、細胞傷害性物質または蛍光物質に結合させられたＴＮＦＲ２ポリペプチドの結晶形態も含まれる。このような物質としては、マイタンシン誘導体（例えば、ＤＭ１）；腸毒素（例えば、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エントロトキシン）；他の毒性タンパク質および化合物（例えば、Ｒｉｃｉｎ−Ａ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）毒素、ジフテリア毒素、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、およびマイトマイシンＣ）；ヨウ素の同位元素（例えば、ヨウ素−１２５）；テクネチウムの同位元素（例えば、Ｔｃ−９９ｍ）；他の同位元素（^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１８６Ｒｅ、および^９０Ｙ）；シアニン蛍光色素（例えば、Ｃｙ５．５．１８）；ならびにリボソーム不活化ポリペプチド（例えば、ボーガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、ゲロニン、またはサポリン−Ｓ６）が挙げられる。 The invention also includes a crystalline form of a TNFR2 polypeptide conjugated to a cytotoxic or fluorescent substance. Such substances include maytansine derivatives (eg, DM1); enterotoxins (eg, Staphylococcal entroptoxins); other toxic proteins and compounds (eg, Ricin-A, Pseudomonas toxins, diphtheria toxins) , Daunorubicin, doxorubicin, methotrexate, and mitomycin C); iodine isotopes (eg, iodine-125); technetium isotopes (eg, Tc-99m); other isotopes ( ²¹² Bi, ¹³¹ I, ¹⁸⁶ Re, And ⁹⁰ Y); cyanine fluorescent dyes (eg, Cy5.5.18); and ribosome inactivating polypeptides (eg, bouganin, gelonin, or saporin-S6).

（結晶化のためのポリペプチドの生成および精製）
ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、ポリペプチドを生成するように遺伝子操作した宿主細胞のような、ポリペプチドを発現する生存している宿主細胞から生成させることができる。ポリペプチドを生成させるための細胞に対する遺伝子操作方法は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。このような方法には、ポリペプチドをコードし発現することができる核酸を生存している宿主細胞に導入することが含まれる。これらの宿主細胞は、培養液中で増殖させた細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または動物細胞であり得る。細菌宿主細胞としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞が挙げられるが、これに限定されない。適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の例としては、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、および外来ＤＮＡを切断することができない任意の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が挙げられる。使用することができる真菌宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる動物細胞株のいくつかの例は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、およびＷＩ３８である。新しい動物細胞株を、当業者に周知の方法を使用して（例えば、形質転換、ウイルス感染、および／または選択によって）確立することができる。状況に応じて、ポリペプチドを、宿主細胞から培地中に分泌させることができる。 (Production and purification of polypeptides for crystallization)
A TNFR2 polypeptide can be produced from a living host cell that expresses the polypeptide, such as a host cell that has been genetically engineered to produce the polypeptide. Methods for genetic manipulation of cells to produce polypeptides are well known in the art. For example, Ausubel et al. , Eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York). Such methods include introducing a nucleic acid capable of encoding and expressing the polypeptide into a living host cell. These host cells can be bacterial cells, fungal cells, insect cells, or animal cells grown in culture. Bacterial host cells include, but are not limited to, Escherichia coli cells. Examples of suitable E. coli strains include HB101, DH5α, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, and any E. coli strain that cannot cleave foreign DNA. Fungal host cells that can be used include, but are not limited to, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Aspergillus cells. Some examples of animal cell lines that can be used are CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, and WI38. New animal cell lines can be established (eg, by transformation, viral infection, and / or selection) using methods well known to those skilled in the art. Depending on the circumstances, the polypeptide can be secreted from the host cell into the medium.

発現されたＴＮＦＲ２ポリペプチドの精製は、任意の標準的な方法によって行うことができる。ＴＮＦＲ２ポリペプチドが細胞内で生成される場合は、特定の破片を、例えば、遠心分離または限外濾過によって、取り出すことができる。ポリペプチドが培地中に分泌される場合は、そのような発現系に由来する上清を、標準的なポリペプチド濃縮フィルターを使用して最初に濃縮することができる。プロテアーゼ阻害剤もまた、タンパク質分解を阻害するために添加することができ、抗生物質を、微生物の増殖を防ぐために含めることができる。ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、所望されるポリペプチドの立体構造を得るために、シャペロンまたはアクセサリータンパク質の存在下で生成させることができ、また、これを、再折り畳みを誘導するか、またはポリペプチドの立体構造の変化を誘導するために、生成後に酸化および／または還元条件のような条件に供することができる（例えば、ＷＯ０２／０６８４５５）。   Purification of the expressed TNFR2 polypeptide can be performed by any standard method. If TNFR2 polypeptide is produced intracellularly, certain debris can be removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration. If the polypeptide is secreted into the medium, the supernatant from such an expression system can be first concentrated using a standard polypeptide concentration filter. Protease inhibitors can also be added to inhibit proteolysis and antibiotics can be included to prevent microbial growth. A TNFR2 polypeptide can be generated in the presence of a chaperone or accessory protein to obtain the desired polypeptide conformation, and it can induce refolding or polypeptide conformation. Can be subjected to conditions such as oxidation and / or reduction conditions after production (eg WO 02/068455).

ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、例えば、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィー、および公知であるかまたはまだ発見されていない精製技術の任意の組み合わせを使用して、精製することができる。例えば、プロテインＡを、ＴＮＦＲ２−Ｉｇポリペプチドを精製するために使用することができる。これは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３）に基づく。ここでは、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ融合ポリペプチドのＩｇ部分には、プロテインＡへの結合に関与している定常ドメインの一部が含まれている。プロテインＧは、全てのマウスのイソ型、およびヒトのγ３について推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７−１５７５）。ＴＮＦＲ２ポリペプチドの精製のための他の技術を、必要に応じて利用することができ、イオン交換カラム上での分画、エタノールまたは他のアルコール類での沈殿、逆相ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴ（登録商標）上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，および硫酸アンモニウム沈殿を含むが、これらに限定されない他の技術もまた、必要に応じて利用することができる。   A TNFR2 polypeptide can be purified using, for example, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, and affinity chromatography, and any combination of known or undiscovered purification techniques. . For example, protein A can be used to purify TNFR2-Ig polypeptide. This is based on human γ1, γ2, or γ4 heavy chains (Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62: 1-13). Here, the Ig portion of the TNFR2-Ig fusion polypeptide contains a portion of the constant domain involved in binding to protein A. Protein G is recommended for all mouse isoforms and human γ3 (Guss et al., 1986, EMBO J. 5: 1567-1575). Other techniques for purification of TNFR2 polypeptide can be utilized as needed, fractionation on ion exchange columns, precipitation with ethanol or other alcohols, reverse phase HPLC, FPLC, on silica Chromatography on heparin SEPHARSET®, chromatography on anion or cation exchange resin (eg polyaspartic acid column), hydrophobic interaction chromatography, chromatographic fractionation, SDS Other techniques, including but not limited to PAGE, and ammonium sulfate precipitation may also be utilized as needed.

（結晶、結晶性処方物、および組成物の生成）
ポリペプチド結晶は、水溶液から、または有機溶媒もしくは添加物を含む水溶液からポリペプチドの制御された結晶化によって成長させることができる。制御することができる溶液の条件としては、例えば、溶媒、有機溶媒、または添加物の蒸発速度、適切な共溶質および緩衝液の存在、ｐＨ、ならびに温度が挙げられる。タンパク質の結晶化に影響を与える種々の要因の包括的な概要については、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，１９８５，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １１４：１１２−１２０によって公開されている。さらに、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，１９８８，Ｊ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ，９０：５１−５９には、結晶化させることができるポリペプチドについての蓄積された包括的なリスト、ならびにそれらを結晶化させる条件が含まれている。結晶、および結晶化の手法についての概要、さらには、解明されたタンパク質の構造の配位の包括は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９７７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２：５３５−５４２）によって保存されている。これらの参考文献は、適切なポリペプチドの結晶の形成のための前準備として、ポリペプチドの結晶化に必要な条件を決定するために使用することができ、これによって、他のポリペプチドについての結晶化方法を導くことができる。しかし、上記の参考文献のほとんどにおいて記載されている条件が、殆どの場合において、極少量の大きな回折の品質の結晶を得るために最適であることに注意しなければならない。したがって、これらの条件を、ポリペプチドの結晶の大量生成のための生成量の多いプロセスが得られるようにいくらかの程度調整することが必要であることが、当業者に明らかである。 (Crystal, Crystalline Formulation, and Composition Generation)
Polypeptide crystals can be grown by controlled crystallization of the polypeptide from an aqueous solution or from an aqueous solution containing an organic solvent or additive. Solution conditions that can be controlled include, for example, the rate of evaporation of solvents, organic solvents, or additives, the presence of appropriate co-solutes and buffers, pH, and temperature. A comprehensive overview of the various factors affecting protein crystallization is published by McPherson, 1985, Methods Enzymol 114: 112-120. In addition, McPherson and Gilland, 1988, J Crystal Growth, 90: 51-59, contains an accumulated comprehensive list of polypeptides that can be crystallized, as well as the conditions for crystallizing them. . An overview of crystallization and crystallization techniques, as well as the inclusion of elucidated protein structure coordination, is described in Brookhaven National Laboratory's Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb/; Bernstein et al., 1977). J. Mol. Biol., 112: 535-542). These references can be used to determine the conditions necessary for crystallization of a polypeptide as a preparation for the formation of appropriate polypeptide crystals, thereby A crystallization method can be guided. However, it should be noted that the conditions described in most of the above references are optimal in most cases to obtain very small amounts of large diffraction quality crystals. Thus, it will be apparent to those skilled in the art that these conditions need to be adjusted to some degree to obtain a high yield process for the bulk production of polypeptide crystals.

一般的には、結晶は、結晶化させられるポリペプチドを、適切な水性の溶媒または適切な結晶化試薬（例えば、塩または有機溶媒または添加物）を含む水性の溶媒と混合することによって生じさせられる。溶媒は、ポリペプチドと混合され、結晶化の誘導に適切であり、ポリペプチドの活性および安定性を維持できることが実験により決定された温度での攪拌に供することができる。溶媒には、状況に応じて、共溶質、例えば、二価の陽イオン、補因子、またはカオトロピック剤、さらには、ｐＨを制御するための緩衝液の種を含めることができる。結晶化のための「共溶質の手段」には、ポリペプチドの結晶化を促進するための共溶質を供給することができる化合物が含まれる。共溶質の手段の例として、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、フッ化アンモニウム、ギ酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カドミウム、硫酸カドミウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、塩化セシウム、塩化コバルト、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１５Ｎ（ＣＨ_３）_３ ^＋Ｂｒ⁻（ＣＴＡＢ）、クエン酸二アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二アンモニウム、酒石酸二アンモニウム、リン酸二カリウム、リン酸二ナトリウム、酒石酸二ナトリウム、ＤＬ−リンゴ酸、塩化第二鉄、Ｌ−プロリン、酢酸リチウム、塩化リチウム、硝酸リチウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、ギ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ニッケル、酢酸カリウム、臭化カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、フッ化カリウム、ギ酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム、酒石酸カリウムナトリウム、硫酸カリウム、チオシアン酸カリウム、酢酸ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、ギ酸ナトリウム、マロン酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、コハク酸、タクシメート（ｔａｃｓｉｍａｔｅ）、クエン酸三アンモニウム、クエン酸三リチウム、トリメチルアミンＮオキサイド、クエン酸三カリウム、クエン酸三ナトリウム、酢酸亜鉛、硫酸亜鉛、および共溶質を供給するように作用する他の化合物が挙げられる。「結晶化緩衝液の手段」としては、ポリペプチドの結晶化を促進するための所望の範囲に、溶液のｐＨを維持する化合物が挙げられる。結晶化緩衝液の手段の例としては、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルフォン酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルフォン酸）、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ（２，２−ビス−（ヒドロキシメチル）−２，２’、２’’−ニトリロトリエタノール）、ホウ酸、ＣＡＰＳ（３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパン−スルフォン酸）、ＥＰＰＳ（ＨＥＰＰＳ、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルフォン酸）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＮＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨＣＨ_２ＣＯＯＨ、グリシル−グリシン）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタン−スルフォン酸）、イミダゾール、ＭＥＳ（２−モルフォリノエタンスルフォン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルフォリノ）−プロパンスルフォン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルフォン酸））、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸一塩基ナトリウム（リン酸二水素ナトリウム）、ＴＡＰＳ（Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルフォン酸）、ＴＡＰＳＯ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルフォン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタン−スルフォン酸）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＲＩＺＭＡ（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）、および溶液を特定のｐＨまたはその付近に保つように作用する他の化合物が挙げられる。 In general, crystals are generated by mixing the polypeptide to be crystallized with an appropriate aqueous solvent or an aqueous solvent containing an appropriate crystallization reagent (eg, a salt or organic solvent or additive). It is done. The solvent can be mixed with the polypeptide, suitable for inducing crystallization, and subjected to stirring at a temperature determined experimentally to be able to maintain the activity and stability of the polypeptide. Depending on the circumstances, the solvent can include co-solutes, such as divalent cations, cofactors, or chaotropic agents, as well as buffer species for controlling pH. A “co-solute means” for crystallization includes compounds capable of providing a co-solute to facilitate crystallization of the polypeptide. Examples of co-solute means include ammonium acetate, ammonium chloride, ammonium fluoride, ammonium formate, ammonium nitrate, ammonium phosphate, ammonium sulfate, cadmium chloride, cadmium sulfate, calcium acetate, calcium chloride, cesium chloride, cobalt chloride, CH ₃ ( _{CH 2) 15 N (CH 3} ) 3 + Br - (CTAB), diammonium citrate, ammonium phosphate dibasic, diammonium phosphate, tartaric acid diammonium, dipotassium phosphate, disodium phosphate, sodium tartrate two DL-malic acid, ferric chloride, L-proline, lithium acetate, lithium chloride, lithium nitrate, lithium sulfate, magnesium acetate, magnesium chloride, magnesium formate, magnesium nitrate, magnesium sulfate, nickel chloride, vinegar Potassium acid, potassium bromide, potassium chloride, potassium citrate, potassium fluoride, potassium formate, potassium nitrate, potassium phosphate, potassium sodium tartrate, potassium sulfate, potassium thiocyanate, sodium acetate, sodium bromide, sodium chloride, citric acid Sodium, sodium fluoride, sodium formate, sodium malonate, sodium nitrate, sodium phosphate, sodium sulfate, sodium thiocyanate, succinic acid, tacsimate, triammonium citrate, trilithium citrate, trimethylamine N oxide, citrate Tripotassium acid, trisodium citrate, zinc acetate, zinc sulfate, and other compounds that act to provide a cosolute. “Means of crystallization buffer” include compounds that maintain the pH of the solution to the desired range to promote crystallization of the polypeptide. Examples of means for the crystallization buffer include ACES (N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid), BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid) , Bicine (N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine), BIS-TRIS (2,2-bis- (hydroxymethyl) -2,2 ′, 2 ″ -nitrilotriethanol), boric acid, CAPS ( 3- [cyclohexylamino] -1-propane-sulfonic acid), EPPS (HEPPS, 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-propanesulfonic acid), Gly-Gly (NH ₂ CH ₂ CONHCH ₂ COOH, glycyl- Glycine), HEPES (4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethane-sulfonic acid), imida , MES (2-morpholinoethanesulfonic acid), MOPS (3- (N-morpholino) -propanesulfonic acid), PIPES (piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)), sodium acetate, Sodium bicarbonate, monobasic sodium phosphate (sodium dihydrogen phosphate), TAPS (N- [tris- (hydroxymethyl) methyl] -3-aminopropanesulfonic acid), TAPSO (N- [tris (hydroxymethyl) methyl) ] -3-amino-2-hydroxypropane sulfonic acid), TES (N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -2-aminoethane-sulfonic acid), Tricine (N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine), Tris-HCl, TRIZMA (2-amino-2- (hydroxy) Methyl) -1,3-propanediol), and other compounds that act to maintain the solution to a particular pH or near thereof.

共溶質、緩衝液などの必要性と、それらの濃度は、結晶化を促進するように経験的に決定される。ポリペプチドについての適切な結晶化条件のいくつかの例は、実施例１、２、および３に以下に記載される。   The need for co-solutes, buffers, etc. and their concentrations are empirically determined to promote crystallization. Some examples of suitable crystallization conditions for polypeptides are described below in Examples 1, 2, and 3.

産業的規模での処理においては、結晶化を導く制御された沈殿は、ポリペプチド、沈殿物、共溶質、および状況に応じて、緩衝液を、バッチプロセスにおいて単純に混合することによって、最もよく行うことができる。別の見解としては、ポリペプチドは、出発材料としてポリペプチドの沈殿を使用すること（「種蒔き」）によって結晶化させることもできる。この場合は、ポリペプチドの沈殿を結晶化溶液に添加して、結晶が形成されるまでインキュベートする。透析または蒸気拡散のような別の研究室での結晶化方法もまた、適応することができる。ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、前出、およびＧｉｌｌｉｌａｎｄ、前出には、結晶化に関する文献のそれらの概要において、適切な条件についての包括的なリストが含まれている。時に、結晶化したポリペプチドが架橋される場合には、意図される架橋剤と結晶化媒体との間での不適合により、さらに適切な溶媒系へと結晶を移動させることが必要な場合もある。   For industrial scale processing, controlled precipitation leading to crystallization is best achieved by simply mixing the buffers in a batch process, depending on the polypeptide, precipitate, co-solute, and circumstances. It can be carried out. Alternatively, the polypeptide can be crystallized by using polypeptide precipitation as a starting material ("seeding"). In this case, the polypeptide precipitate is added to the crystallization solution and incubated until crystals are formed. Other laboratory crystallization methods such as dialysis or vapor diffusion can also be adapted. McPherson, supra, and Gilland, supra, contain a comprehensive list of suitable conditions in their overview of literature on crystallization. Sometimes, if the crystallized polypeptide is cross-linked, incompatibility between the intended cross-linking agent and the crystallization medium may require further transfer of the crystal to a suitable solvent system. .

本発明の１つの実施形態によれば、ポリペプチド結晶、結晶性処方物および組成物は、以下のプロセスによって調製される：最初に、ポリペプチドが結晶化される。次に、本明細書中に記載されている賦形剤または成分が母液に直接添加される。あるいは、母液が、最短で１時間、最長で２４時間かけて除去された後、結晶が、賦形剤または他の処方成分の溶液中に懸濁させられる。賦形剤の濃度は、通常、約０．０１から３０％Ｗ／Ｗの間であり、これは、それぞれ、９９．９９から７０％Ｗ／Ｗのポリペプチド結晶の濃度に対応する。１つの実施形態においては、賦形剤の濃度は、約０．１から１０％であり、これは、それぞれ、９９．９から９０％Ｗ／Ｗの結晶濃度に対応する。母液は、濾過または遠心分離のいずれかにより、結晶のスラリーから除去することができる。その後、結晶は、状況に応じて、５０から１００％の１つ以上の有機溶媒または添加物の溶液、例えば、エタノール、イソプロパノール、または酢酸エチルで、室温または２０℃から２５℃の間の温度のいずれかで、洗浄される。結晶は、窒素ガス、空気、または不活性ガスのいずれかの流れを結晶の上に流すことによって乾燥させられる。あるいは、結晶は、風乾によって、または凍結乾燥によって、または減圧乾燥によって乾燥させられる。乾燥は、洗浄後、最短で１時間から、最長で７２時間の間、最終産物の水分含有量が１０重量％未満、最も好ましくは、５重量％未満になるまで、行われる。最後に、結晶の微細化が、必要に応じて行われる。ポリペプチド結晶の乾燥は、水分、有機溶媒、または添加物、あるいは、液体高分子の、Ｎ_２、空気、または不活性ガスでの乾燥、減圧オーブンでの乾燥、凍結乾燥、揮発性有機溶媒もしくは添加物での洗浄、その後の溶媒の蒸発、あるいは、ドラフトでの蒸発を含む手段による除去である。通常は、乾燥は、結晶が自由に浮遊できる粉末になるまで行われる。乾燥は、湿った結晶の上に気体の流れを通過させることによって行うことができる。気体は、窒素、アルゴン、ヘリウム、二酸化炭素、空気、またはそれらの組み合わせからなる群より選択することができる。本発明のポリペプチド結晶は、さらに、所望の粒子の大きさの分布となるように、適切なミル、例えば、ジェットミルの中で微細化することによって、さらに処理することができる。粒子または粉末処方物の成分は、微細化の前に、または微細化の後に、混合することができる。得られる粒子の直径は、０．１から１００マイクロメートルの範囲、または０．２から１０マイクロメートルの範囲、または、１０から５０マイクロメートルの範囲、または、０．５から２マイクロメートルの範囲とすることができる。吸入により投与される処方物については、１つの実施形態において、ポリペプチド結晶から形成される粒子は、０．５から１マイクロメートルの範囲である。 According to one embodiment of the invention, polypeptide crystals, crystalline formulations and compositions are prepared by the following process: First, the polypeptide is crystallized. Next, the excipients or ingredients described herein are added directly to the mother liquor. Alternatively, after the mother liquor has been removed over a minimum of 1 hour and a maximum of 24 hours, the crystals are suspended in a solution of excipients or other formulation ingredients. The concentration of the excipient is usually between about 0.01 and 30% W / W, which corresponds to a concentration of polypeptide crystals of 99.99 to 70% W / W, respectively. In one embodiment, the excipient concentration is about 0.1 to 10%, which corresponds to a crystal concentration of 99.9 to 90% W / W, respectively. The mother liquor can be removed from the slurry of crystals by either filtration or centrifugation. Thereafter, the crystals are, depending on the situation, 50 to 100% of a solution of one or more organic solvents or additives, for example ethanol, isopropanol or ethyl acetate, at room temperature or between 20 ° C. and 25 ° C. Either is washed. The crystals are dried by flowing a stream of either nitrogen gas, air, or inert gas over the crystals. Alternatively, the crystals are dried by air drying or by freeze drying or by vacuum drying. Drying is carried out after washing for a minimum of 1 hour to a maximum of 72 hours until the water content of the final product is less than 10% by weight, most preferably less than 5% by weight. Finally, crystal refinement is performed as necessary. Polypeptide crystals can be dried by drying moisture, organic solvents, or additives, or liquid polymers with N ₂ , air, or inert gas, drying in a vacuum oven, lyophilization, volatile organic solvents or Removal by means including washing with additives, subsequent evaporation of the solvent, or evaporation in a fume hood. Usually, the drying is performed until the crystals become a powder that can float freely. Drying can be done by passing a gas stream over the wet crystals. The gas can be selected from the group consisting of nitrogen, argon, helium, carbon dioxide, air, or combinations thereof. The polypeptide crystals of the present invention can be further processed by refining in a suitable mill, such as a jet mill, to achieve the desired particle size distribution. The components of the particle or powder formulation can be mixed before or after refinement. The resulting particle diameter ranges from 0.1 to 100 micrometers, or from 0.2 to 10 micrometers, or from 10 to 50 micrometers, or from 0.5 to 2 micrometers. can do. For formulations administered by inhalation, in one embodiment, particles formed from polypeptide crystals range from 0.5 to 1 micrometer.

本発明の１つの実施形態によれば、タンパク質結晶、タンパク質結晶処方物または組成物を調製する際には、エンハンサー（例えば、界面活性剤）は結晶化の間には添加されない。賦形剤または成分は、結晶化後、母液に、約１〜１０％Ｗ／Ｗの濃度で、あるいは、約０．１〜２５％Ｗ／Ｗの濃度で、あるいは、約０．１〜５０％Ｗ／Ｗ／の濃度で添加される。これらの濃度は、それぞれ、９９〜９０％Ｗ／Ｗ、９９．９〜７５％Ｗ／Ｗ、および９９．９〜５０％Ｗ／Ｗの結晶濃度に対応する。賦形剤または成分は、約０．１〜３時間の間、母液中で結晶とともにインキュベートされる。あるいは、インキュベーションは、０．１〜１２時間行われるか、あるいは、インキュベーションは、０．１〜２４時間行われる。   According to one embodiment of the invention, when preparing protein crystals, protein crystal formulations or compositions, enhancers (eg, surfactants) are not added during crystallization. The excipient or ingredient is crystallized in the mother liquor at a concentration of about 1-10% W / W, or at a concentration of about 0.1-25% W / W, or about 0.1-50. It is added at a concentration of% W / W /. These concentrations correspond to crystal concentrations of 99-90% W / W, 99.9-75% W / W, and 99.9-50% W / W, respectively. The excipient or component is incubated with the crystals in the mother liquor for about 0.1-3 hours. Alternatively, the incubation is performed for 0.1 to 12 hours, or the incubation is performed for 0.1 to 24 hours.

本発明の別の実施形態においては、成分または賦形剤は、母液以外の溶液中に溶解させられ、タンパク質結晶が母液から取り出され、賦形剤または成分の溶液中に再懸濁させられる。成分または賦形剤の濃度と、インキュベーション時間は、上記と同じである。   In another embodiment of the invention, the component or excipient is dissolved in a solution other than the mother liquor and the protein crystals are removed from the mother liquor and resuspended in the solution of the excipient or component. Ingredient or excipient concentrations and incubation times are the same as above.

（ポリペプチド結晶）
本明細書中で使用される場合は、「結晶」または「結晶性」とは、物質の固体の状態の１つの形態をいう。これは、不定形固体の状態である第２の形態とは異なる。結晶は、格子構造、特徴的な形状、ならびに屈折率および副屈折のような光学的特性を含む、特徴的な性質を示す。結晶は、三次元において周期的に繰り返すパターンに配置された原子からなる（Ｃ．Ｓ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｅｔａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５２，ｐ．１）。対照的に、不定形物質は、物質の結晶化していない固体の形態であり、多くの場合、不定形沈殿と呼ばれる。このような沈殿は、結晶性の固体状態の特徴である分子の格子構造は持たず、結晶形態の物質の典型である副屈折または他の分光学的特性は示さない。 (Polypeptide crystal)
As used herein, “crystalline” or “crystalline” refers to one form of the solid state of matter. This is different from the second form, which is an amorphous solid state. Crystals exhibit characteristic properties, including lattice structures, characteristic shapes, and optical properties such as refractive index and sub-refraction. Crystals consist of atoms arranged in a pattern that repeats periodically in three dimensions (CS Barrett, Structure of Metal, 2nd ed., McGraw-Hill, New York, 1952, p. 1). In contrast, an amorphous material is an uncrystallized solid form of the material, often referred to as an amorphous precipitate. Such precipitates do not have the molecular lattice structure characteristic of a crystalline solid state and do not exhibit the secondary refraction or other spectroscopic properties typical of crystalline forms of material.

ポリペプチド結晶は、結晶格子に配置されたポリペプチド分子である。ポリペプチド結晶には、三次元において周期的に繰り返される特異的なポリペプチド−ポリペプチド相互作用のパターンが含まれている。本発明のポリペプチド結晶は、ポリペプチドの不定形の固体形態または沈殿、例えば、ポリペプチド溶液の凍結乾燥によって得られる形態とは区別される。   Polypeptide crystals are polypeptide molecules arranged in a crystal lattice. Polypeptide crystals contain a pattern of specific polypeptide-polypeptide interactions that repeat periodically in three dimensions. The polypeptide crystals of the present invention are distinguished from the amorphous solid form or precipitate of the polypeptide, eg, the form obtained by lyophilization of a polypeptide solution.

ポリペプチド結晶中では、ポリペプチド分子は、対称単位を形成するように互いに並んだ非対称の単位を形成する。ポリペプチド結晶の対称単位の幾何学的構造は、立方体、六方晶体、単斜晶、斜方晶形、正方晶、三斜晶、または三方晶形であり得る。それら全体の結晶の全体的な構造は、両錐、立方体、針状、板状、角柱、長斜方形、桿状、または球状の形態、あるいはそれらの組み合わせであり得る。「立方体」構造のクラスの結晶は、さらに具体的には、十八方晶（ｏｃｔａｄｅｃａｈｅｄｒａｌ）または十二方晶（ｄｏｄｅｃａｈｅｄｒａｌ）の結晶形態を有し得る。結晶の直径は、Ｍａｒｔｉｎの直径として定義される。これは、接眼目盛りに平行な線の長さとして測定され、ランダムな方向を向いている結晶を２つの同じように突出した面積に分割する。針状または桿状のような形態の結晶はまた、結晶の長さと本明細書中で呼ばれる最大寸法を有する。   In polypeptide crystals, polypeptide molecules form asymmetric units that are aligned with each other to form symmetrical units. The geometric structure of the symmetry unit of the polypeptide crystal can be cubic, hexagonal, monoclinic, orthorhombic, tetragonal, triclinic, or trigonal. The overall structure of these entire crystals can be bipyramidal, cubic, needle-like, plate-like, prismatic, rhombohedral, bowl-like, or spherical, or combinations thereof. Crystals of the “cubic” structure class may more specifically have an octadecahedral or dodecahedral crystalline form. The crystal diameter is defined as the Martin diameter. This is measured as the length of the line parallel to the eyepiece scale and divides a crystal facing a random direction into two equally projecting areas. Crystals in the form of needles or rods also have a maximum dimension referred to herein as the crystal length.

（治療的投与のための処方物）
本明細書中で使用される場合は、「組成物」は、少なくとも２つの成分を含む混合物を意味すると理解される。具体的には、本発明により、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを含むか、または結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを使用して調製された組成物が提供される。本発明の１つの実施形態においては、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを含むか、または結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを使用して調製された組成物または処方物が、その必要がある患者への注射および／または投与に適切であるように調製される。患者に対して薬学的目的のために投与される組成物は実質的に滅菌のものであり、これには、レシピエントに対して過度に毒性または感染性である試薬はいずれも含まれない。 (Formulation for therapeutic administration)
As used herein, “composition” is understood to mean a mixture comprising at least two components. Specifically, the present invention provides compositions comprising crystalline TNFR2 polypeptides or prepared using crystalline TNFR2 polypeptides. In one embodiment of the invention, a composition or formulation comprising or prepared using a crystalline TNFR2 polypeptide is injected into a patient in need thereof and / or Prepared to be suitable for administration. Compositions administered to a patient for pharmaceutical purposes are substantially sterile and do not include any reagents that are excessively toxic or infectious to the recipient.

本発明の１つの実施形態においては、結晶性エタナーセプトのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、生理学的に許容される組成物（本明細書中では、薬学的組成物、または薬学的処方物とも呼ばれる）の形態で投与され、これには、以下の１つ以上とともに処方される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドが含まれる：生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤。このような担体、賦形剤、または希釈剤は、使用される投与量および濃度では、レシピエントにとって非毒性である。通常は、このような組成物の調製には、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを１つ以上の以下のものと混合することが必然的に伴う：緩衝液、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量ポリペプチド（例えば、１０個未満のアミノ酸を有するもの）、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、またはデキストリン）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオン、ならびに他の安定化剤および賦形剤。液体の処方物においては、中性の緩衝化生理食塩水または非特異的血清アルブミンと混合された生理食塩水が、例示的な適切な希釈剤である。適切な産業的な基準によれば、ベンジルアルコールのような防腐剤もまた、添加することができる。薬学的組成物中で使用することができる成分のさらなる例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６^ｔｈＥｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８０、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎと、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎとによって一緒に出版されたＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓに示されている。 In one embodiment of the invention, the crystalline TNFR2 polypeptide, such as crystalline etanercept, is a physiologically acceptable composition (also referred to herein as a pharmaceutical composition or a pharmaceutical formulation). ), Which includes a crystalline TNFR2 polypeptide formulated with one or more of the following: a physiologically acceptable carrier, excipient, or diluent. Such carriers, excipients, or diluents are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations used. Usually, the preparation of such compositions entails mixing a crystalline TNFR2 polypeptide with one or more of the following: a buffer, an antioxidant (eg, ascorbic acid), low Molecular weight polypeptides (eg, having less than 10 amino acids), proteins, amino acids, carbohydrates (eg, glucose, sucrose, or dextrin), chelating agents (eg, EDTA), glutathione, and other stabilizing agents and Excipients. In liquid formulations, neutral buffered saline or saline mixed with non-specific serum albumin are exemplary suitable diluents. According to appropriate industrial standards, preservatives such as benzyl alcohol can also be added. Further examples of components that can be used in pharmaceutical compositions ^{is, Remington's Pharmceutical Sciences, 16 th} Ed. , Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980, and American Pharmaceutical Association, and the Handbook of the United States, published by the Pharmaceutical Society of Great Britain.

１つの実施形態においては、本発明の処方物が、バルクの処方物に調製され、そのような場合には、薬学的組成物の成分は、それらが投与に必要とされるよりも高濃度になるように調整され、投与の前に適切に希釈されると想定される。   In one embodiment, the formulations of the invention are prepared in a bulk formulation, in which case the components of the pharmaceutical composition are at a higher concentration than they are required for administration. It is envisaged that it will be adjusted and appropriately diluted prior to administration.

本発明のポリペプチド結晶は、保存および取り扱いに適切な形態で、そして、吸入または肺への投与に適切な形態で、例えば、エアゾール処方物の調製については粉末の形態で、固体の結晶性または粉末状の処方物として処方することができる。さらなる実施形態においては、ポリペプチド結晶は、そのような結晶の液体の溶液に、またはそのような結晶のスラリーに処方することができる。別の実施形態においては、ポリペプチド結晶は、治療的な投与のための液体処方物、例えば、水性の処方物を調製するために使用される。   The polypeptide crystals of the invention are in a form suitable for storage and handling, and in a form suitable for inhalation or pulmonary administration, eg, in the form of a powder for the preparation of aerosol formulations, solid crystalline or It can be formulated as a powder formulation. In further embodiments, the polypeptide crystals can be formulated in a liquid solution of such crystals or in a slurry of such crystals. In another embodiment, the polypeptide crystals are used to prepare liquid formulations, eg, aqueous formulations, for therapeutic administration.

（固体の結晶性処方物）
結晶の固体処方物は、肺への投与に適していることが理想的である。これは、他の投与経路によって送達することが困難である生物学的高分子について特に有用である。（例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９６／３２１５２、同９５／２４１８３、および同ＷＯ９７／４１８３３を参照のこと）。 (Solid crystalline formulation)
Ideally, the crystalline solid formulation is suitable for pulmonary administration. This is particularly useful for biological macromolecules that are difficult to deliver by other routes of administration. (See, for example, PCT patent application numbers WO 96/32152, 95/24183, and WO 97/41833).

ポリペプチド結晶の固体処方物としては、液体の溶液から実質的に単離させられるか乾燥させられ、そして、遊離の結晶として、または例えば、粉末の形態で粒子として存在する結晶が挙げられる。本発明の状況においては、表現「粉末」は、本質的に乾燥した粒子のコレクション、すなわち、約１０重量％未満、または６重量％未満、または４重量％未満の水分含有量をいう。１つの実施形態においては、本発明により、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを乾燥粉末として含む結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの用量をエアゾール化し、エアゾールを形成するように気体の流れの中に一定量の乾燥粉末を分散させ、そしてその後の吸入のためのチャンバーにエアゾールを捕捉するための方法が提供される。   Solid formulations of polypeptide crystals include crystals that are substantially isolated from a liquid solution or dried and present as free crystals or, for example, as particles in the form of a powder. In the context of the present invention, the expression “powder” refers to a collection of essentially dry particles, ie a moisture content of less than about 10% by weight, or less than 6% by weight, or less than 4% by weight. In one embodiment, according to the present invention, a dose of crystalline TNFR2 polypeptide comprising crystalline TNFR2 polypeptide as a dry powder is aerosolized and an amount of dry powder is introduced into the gas stream to form an aerosol. A method is provided for dispersing and capturing the aerosol in a chamber for subsequent inhalation.

ポリペプチド結晶または粉末は、状況に応じて、担体または界面活性剤と混合することができる。適切な担体試薬としては、１）炭水化物、例えば、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ソルボースなどのような単糖；２）ラクトース、トレハロースなどのような二糖；３）ラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどのような多糖類；４）マンニトール、キシリトールなどのようなアルジトール；５）塩化ナトリウムなどのような無機塩；ならびに、６）クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどのような有機塩が挙げられる。特定の実施形態においては、担体は、トレハロース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、イノシトール、スクロース、塩化ナトリウム、およびクエン酸ナトリウムからなる群より選択される。界面活性剤は、脂肪酸の塩、胆汁酸塩、またはリン脂質からなる群より選択することができる。脂肪酸塩としては、Ｃ_{１０〜１４}脂肪酸、例えば、カプリン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、およびミリスチン酸ナトリウムが挙げられる。胆汁酸塩としては、ウルソデオキシコール酸、タウロコール酸、グリコール酸、およびタウロジヒドロフシジン酸の塩が挙げられる。１つの実施形態においては、界面活性剤はタウロコール酸ナトリウムのようなタウロコール酸の塩である。界面活性剤として使用することができるリン脂質としては、リソホファチジルコリンが挙げられる。本発明の粉末状処方物における結晶性ポリペプチドの界面活性剤に対する分子比は、例えば、９：１から１：９であり、また、５：１から１：５の間、または３：１から１：３の間である。 The polypeptide crystals or powder can be mixed with a carrier or surfactant, depending on the circumstances. Suitable carrier reagents include 1) carbohydrates such as monosaccharides such as fructose, galactose, glucose, sorbose; 2) disaccharides such as lactose, trehalose; 3) raffinose, maltodextrin, dextran, etc. 4) alditols such as mannitol and xylitol; 5) inorganic salts such as sodium chloride; and 6) organic salts such as sodium citrate and sodium ascorbate. In certain embodiments, the carrier is selected from the group consisting of trehalose, raffinose, mannitol, sorbitol, xylitol, inositol, sucrose, sodium chloride, and sodium citrate. The surfactant can be selected from the group consisting of fatty acid salts, bile salts, or phospholipids. Fatty acid salts include C _10-14 fatty acids such as sodium caprate, sodium laurate, and sodium myristate. Bile salts include ursodeoxycholic acid, taurocholic acid, glycolic acid, and taurodihydrofusidic acid salts. In one embodiment, the surfactant is a salt of taurocholic acid, such as sodium taurocholate. Phospholipids that can be used as surfactants include lysophosphatidylcholine. The molecular ratio of crystalline polypeptide to surfactant in the powder formulation of the present invention is, for example, from 9: 1 to 1: 9, and between 5: 1 and 1: 5, or from 3: 1. Between 1: 3.

（溶液またはスラリー状の結晶）
１つの実施形態においては、本発明により、ポリペプチドを、懸濁液中での保存に適している結晶にするための方法が提供される。この方法には、結晶化緩衝液（母液）を非水性の溶媒と置き換えることが含まれる。さらに別の実施形態においては、結晶性のスラリーは、最初の溶媒を遠心によって除去（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｏｕｔ）し、残っている結晶性の固体を第２の有機溶媒または添加物を使用する洗浄によって水を除去し、その後、非水性の溶媒を蒸発させることにより、固体にすることができる。結晶性の治療用タンパク質の非水性のスラリーは、皮下投与に特に有用である。 (Solution or slurry crystals)
In one embodiment, the present invention provides a method for making a polypeptide a crystal suitable for storage in suspension. This method involves replacing the crystallization buffer (mother liquor) with a non-aqueous solvent. In yet another embodiment, the crystalline slurry removes the first solvent by spinning out and the remaining crystalline solids are washed with water using a second organic solvent or additive. It can be made solid by removing and then evaporating the non-aqueous solvent. Non-aqueous slurries of crystalline therapeutic proteins are particularly useful for subcutaneous administration.

１つのこのような実施形態においては、本発明のポリペプチド結晶は、ポリペプチド結晶を安定化させるために、液体の有機添加物と混合させられる。このような混合物は、ｎ％の有機添加物（ｎは、１から９９の間である）とｍ％の水溶液（ｍは１００−ｎである）を含む水性の有機混合物として特徴付けられる。有機添加物の例としては、フェノール性化合物（例えば、ｍ−クレゾールまたはフェノール、またはそれらの混合物）、およびアセトン、メチルアルコール、メチルイソブチルケトン、クロロホルム、１−プロパノール、イソプロパノール、２−プロパノール、アセトニトリル、１−ブタノール、２−ブタノール、エチルアルコール、シクロロへキサン、ジオキサン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジクロロエタン、ヘキサン、イソオクタン、塩化メチレン、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、トルエン、四塩化炭素、あるいは、それらの組み合わせが挙げられる。   In one such embodiment, the polypeptide crystals of the present invention are mixed with a liquid organic additive to stabilize the polypeptide crystals. Such a mixture is characterized as an aqueous organic mixture comprising n% organic additive (n is between 1 and 99) and m% aqueous solution (m is 100-n). Examples of organic additives include phenolic compounds (eg, m-cresol or phenol, or mixtures thereof), and acetone, methyl alcohol, methyl isobutyl ketone, chloroform, 1-propanol, isopropanol, 2-propanol, acetonitrile, 1-butanol, 2-butanol, ethyl alcohol, cyclohexane, dioxane, ethyl acetate, dimethylformamide, dichloroethane, hexane, isooctane, methylene chloride, tert-butyl alcohol, toluene, carbon tetrachloride, or combinations thereof It is done.

（液体処方物）
本発明の１つの実施形態は、薬学的組成物の安定な長期保存が可能である水性の処方物に関する。ここでは、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、薬学的組成物の調製において使用される有用成分である。この処方物は、それが患者への使用により便利であるとの理由に一部基づいて、有用である。なぜなら、この処方物は、再水和のようなさらなる工程を全く必要としないからである。本明細書中で使用される場合は、溶液または液体処方物とは、適切な溶媒または互いに混和性の溶媒の混合物中に溶解させられた１つ以上の化学物質を含む液体調製物を意味する。 (Liquid formulation)
One embodiment of the present invention relates to an aqueous formulation that allows stable long-term storage of the pharmaceutical composition. Here, crystalline TNFR2 polypeptide is a useful ingredient used in the preparation of pharmaceutical compositions. This formulation is useful based in part on why it is more convenient for patient use. This is because this formulation does not require any further steps such as rehydration. As used herein, a solution or liquid formulation means a liquid preparation comprising one or more chemicals dissolved in a suitable solvent or a mixture of mutually miscible solvents. .

再構成は、適切な緩衝液または薬学的処方物中への、ポリペプチド結晶または結晶処方物または組成物の溶解である。   Reconstitution is the dissolution of a polypeptide crystal or crystal formulation or composition in an appropriate buffer or pharmaceutical formulation.

（薬学的処方物の成分）
本発明の薬学的組成物は、上記のような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドに加えて、１つ以上の以下のタイプの成分または以下の段落で列挙される賦形剤を混合することによって調製される。これらの多くまたは全ては、商業的な供給業者から入手することができる。当業者であれば、組成物中に含められる種々の成分の混合が、任意の適切な順序で行われ得ること、すなわち、緩衝液は、最初に、途中で、または最後に添加することができ、そして張度変更剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）は、最初に、途中で、または最後に添加することができることを理解するであろう。当業者であれば、また、これらの化合物のいくつかが、特定の組み合わせにおいては不適合であり得、したがって、関連する混合物と適合する類似している特性を有する異なる化合物で容易に置き換えることができることも、理解するであろう。例えば、薬学的組成物の保存のために使用される容器、および／または、治療的投与のために使用されるデバイス中に存在する、賦形剤および他の成分、または物質の種々の組み合わせの適切さに関する認識は、当該分野に存在している（例えば、Ａｋｅｒｓ，２００２，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９１：２２８３−２３００を参照のこと）。 (Ingredients of pharmaceutical formulations)
Pharmaceutical compositions of the invention are prepared by mixing one or more of the following types of ingredients or excipients listed in the following paragraphs in addition to the crystalline TNFR2 polypeptide as described above: . Many or all of these can be obtained from commercial suppliers. One skilled in the art can mix the various components included in the composition in any suitable order, i.e., the buffer can be added first, in the middle, or last. It will be appreciated that the tonicity modifier can be added first, in the middle, or last. One of ordinary skill in the art will also be aware that some of these compounds may be incompatible in certain combinations and can therefore be easily replaced with different compounds with similar properties that are compatible with the relevant mixture. Will also understand. For example, various combinations of excipients and other components, or substances present in containers used for storage of pharmaceutical compositions and / or devices used for therapeutic administration Appropriateness of appropriateness exists in the art (see, for example, Akers, 2002, J Pharm Sci 91: 2283-2300).

酸性化剤（「酸性化手段」）：酢酸、氷酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、希塩酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸、希リン酸、硫酸、酒石酸、および他の適切な酸。   Acidifying agents (“acidifying means”): acetic acid, glacial acetic acid, citric acid, fumaric acid, hydrochloric acid, dilute hydrochloric acid, malic acid, nitric acid, phosphoric acid, dilute phosphoric acid, sulfuric acid, tartaric acid, and other suitable acids.

有効成分：さらなる有効成分を、本発明に記載される組成物中に、例えば、注射部位の不快状態を取り除くために含めることができる。このような有効成分としては、適切な投与量の非ステロイド系抗炎症薬、例えば、トロメタミンが挙げられるが、これに限定されない。   Active ingredient: Additional active ingredients can be included in the compositions described in the present invention, for example, to eliminate discomfort at the injection site. Such active ingredients include, but are not limited to, an appropriate dose of a nonsteroidal anti-inflammatory drug, such as tromethamine.

エアゾール噴射剤（「推進手段」）：ブタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、イソブタン、プロパン、トリクロロモノフルオロメタン。   Aerosol propellant ("propulsion means"): butane, dichlorodifluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, isobutane, propane, trichloromonofluoromethane.

凝集阻害剤（「凝集阻害手段」）により、不適切な、または望ましくない三次または四次複合体へとポリペプチドが会合する傾向を低減させる。適切な凝集阻害剤としては、アミノ酸Ｌ−アルギニン、および／またはＬ−システインが挙げられる。これらは、Ｆｃドメインを含むポリペプチドの凝集を長期間、例えば、２年またはそれ以上の間減少させる。凝集阻害剤の処方物中での濃度は、約１ｍＭから１Ｍの間、または約１０ｍＭから約２００ｍＭの間、または約１０ｍＭから約１００ｍＭの間、または約１５ｍＭから約７５ｍＭの間、または約２５ｍＭであり得る。   Aggregation inhibitors (“aggregation inhibiting means”) reduce the tendency of the polypeptide to associate into inappropriate or undesirable tertiary or quaternary complexes. Suitable aggregation inhibitors include the amino acids L-arginine and / or L-cysteine. They reduce the aggregation of polypeptides comprising Fc domains for long periods of time, for example 2 years or more. The concentration of the aggregation inhibitor in the formulation is between about 1 mM and 1 M, or between about 10 mM and about 200 mM, or between about 10 mM and about 100 mM, or between about 15 mM and about 75 mM, or about 25 mM. possible.

アルコール変性剤（「変性手段」）：安息香酸デナトニウム、メチルイソブチルケトン、スクロースオクタセテート。   Alcohol modifier ("modification means"): denatonium benzoate, methyl isobutyl ketone, sucrose octacetate.

アルキル化剤（「アルキル化手段」）：強アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、水酸化カリウム、重炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トロラミン。   Alkylating agent (“alkylation means”): strong ammonia solution, ammonium carbonate, diethanolamine, diisopropanolamine, potassium hydroxide, sodium bicarbonate, sodium borate, sodium carbonate, sodium hydroxide, trolamine.

固化防止剤（「固化防止手段」）：ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、タルク。   Anti-caking agent ("anti-caking means"): calcium silicate, magnesium silicate, colloidal silicon dioxide, talc.

消泡剤（「消泡手段」）：ジメチコーン、シメチコーン。   Antifoaming agent (“antifoaming means”): dimethicone, simethicone.

酸化防止剤（「酸化防止手段」）を、本発明の処方物中に含めることができる。処方物の調製に使用することが想定される酸化防止剤としては、グリシンおよびリジンのようなアミノ酸、ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡのようなキレート化剤、およびソルビトールおよびマンニトールのようなフリーラジカルスカベンジャーが挙げられる。さらなる酸化防止剤としては、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、二酸化イオウ、トコフェロール、およびトコフェロール賦形剤が挙げられる。二酸化窒素または二酸化炭素の重層もまた、酸化を阻害することにおける使用が想定される。二酸化窒素または二酸化炭素の重層は、充填プロセスの間にバイアルまたは予め充填しておいた注射器の頭部空間に導入することができる。   Antioxidants (“antioxidant means”) can be included in the formulations of the present invention. Antioxidants envisioned for use in preparing the formulations include amino acids such as glycine and lysine, chelating agents such as EDTA and DTPA, and free radical scavengers such as sorbitol and mannitol. Further antioxidants include ascorbic acid, ascorbyl palmitate, butylated hydroxyanisole, butylated hydroxytoluene, hypophosphorous acid, monothioglycerol, propyl gallate, sodium bisulfite, sodium formaldehydesulfoxylate, metabisulfite Sodium, sodium thiosulfate, sulfur dioxide, tocopherol, and tocopherol excipients are included. Nitrogen dioxide or carbon dioxide overlays are also envisaged for use in inhibiting oxidation. Nitrogen dioxide or carbon dioxide overlay can be introduced into the vial or prefilled syringe head space during the filling process.

緩衝化剤（「処方物緩衝化手段」）は、薬学的処方物のｐＨを所望される範囲に維持する。薬学的組成物のｐＨが生理学的なレベルに、またはその付近に設定されると、投与の際の患者の痛みを最大に和らげることができる。具体的には、特定の実施形態においては、薬学的組成物のｐＨは、約４．０から８．４のｐＨ範囲、または約５．０から８．０のｐＨ範囲、または約５．８から７．４のｐＨ範囲、または約６．２から７．０のｐＨ範囲である。ｐＨを、必要である場合には、特定の処方物中でのポリペプチドの安定性および可溶性を最大にするように調節することもできることが理解され、例えば、生理学的範囲外のｐＨが、患者がなおも耐えられる場合には、本発明の範囲内である。本発明の薬学的組成物での使用に適している種々の緩衝液としては、ヒスチジン、アルカリ塩（リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム、あるいはそれらの水素または二水素塩）、クエン酸ナトリウム／クエン酸、酢酸ナトリウム／酢酸、クエン酸カリウム、マレイン酸、酢酸アンモニウム、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）、酢酸およびジエタノールアミンの種々の形態、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ホウ酸、乳酸、リン酸、メタリン酸カリウム、リン酸一塩基カリウム、乳酸ナトリウム溶液、ならびに、当該分野で公知である任意の他の薬学的に許容されるｐＨ緩衝化剤が挙げられる。塩酸、水酸化ナトリウム、またはそれらの塩のようなｐＨ調節剤もまた、所望されるｐＨを得るために含められる場合もある。１つの適切な緩衝液は、ｐＨ６．２またはその付近に薬学的組成物を維持するためのリン酸ナトリウムである。別の例においては、酢酸塩が、ｐＨ６よりもむしろｐＨ５の緩衝液により効果的であり、より少ない酢酸塩を、ｐＨ６よりもむしろｐＨ５の溶液に使用することができる。処方物中の緩衝液の濃度は、約１ｍＭから約１Ｍの間、または約１０ｍＭから約２００ｍＭの間であり得る。   Buffering agents (“formulation buffering means”) maintain the pH of the pharmaceutical formulation in the desired range. When the pH of the pharmaceutical composition is set at or near physiological levels, patient pain during administration can be reduced to a maximum. Specifically, in certain embodiments, the pH of the pharmaceutical composition is from about 4.0 to 8.4, or from about 5.0 to 8.0, or from about 5.8. PH range from 7.4 to 7.4, or from about 6.2 to 7.0. It is understood that the pH can be adjusted to maximize the stability and solubility of the polypeptide in a particular formulation, if necessary, eg, a pH outside the physiological range is Is still within the scope of the present invention. Various buffers suitable for use in the pharmaceutical composition of the present invention include histidine, alkali salts (sodium phosphate or potassium phosphate, or hydrogen or dihydrogen salts thereof), sodium citrate / citric acid. , Sodium acetate / acetic acid, potassium citrate, maleic acid, ammonium acetate, tris- (hydroxymethyl) -aminomethane (Tris), various forms of acetic acid and diethanolamine, ammonium carbonate, ammonium phosphate, boric acid, lactic acid, phosphorus Acids, potassium metaphosphate, monobasic potassium phosphate, sodium lactate solution, and any other pharmaceutically acceptable pH buffering agent known in the art. A pH adjusting agent such as hydrochloric acid, sodium hydroxide, or salts thereof may also be included to obtain the desired pH. One suitable buffer is sodium phosphate to maintain the pharmaceutical composition at or near pH 6.2. In another example, acetate is more effective in a pH 5 buffer rather than pH 6, and less acetate can be used in a pH 5 solution rather than pH 6. The concentration of the buffer in the formulation can be between about 1 mM and about 1 M, or between about 10 mM and about 200 mM.

キレート化剤（「キレート化手段」、金属イオン封鎖剤とも呼ばれる）：エデト酸２ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸およびその塩、エデト酸。   Chelating agents ("chelating means", also called sequestering agents): disodium edetate, ethylenediaminetetraacetic acid and its salts, edetic acid.

コーティング剤（「コーティング手段」）：カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、ゼラチン、薬学的な釉薬、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルフタル酸メチルセルロース、メタクリル酸コポリマー、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、酢酸フタル酸ポリビニル、シェラック、スクロース、二酸化チタン、カルナワロウ、微結晶ロウ、ゼイン。   Coating agent (“Coating means”): sodium carboxymethylcellulose, cellulose acetate, cellulose acetate phthalate, ethylcellulose, gelatin, pharmaceutical glaze, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylphthalate methylcellulose, methacrylic acid copolymer, methylcellulose, Polyethylene glycol, polyvinyl acetate phthalate, shellac, sucrose, titanium dioxide, carnauba wax, microcrystalline wax, zein.

着色剤（「着色手段」）：キャラメル；エリスロシン（ＦＤ＆Ｃ 赤色Ｎｏ．３）；ＦＤ＆Ｃ 赤色Ｎｏ．４０；ＦＤ＆Ｃ 黄色Ｎｏ．５；ＦＤ＆Ｃ 黄色Ｎｏ．６；ＦＤ＆Ｃ 青色Ｎｏ．１；赤色、黄色、黒色、青色、または混合；酸化鉄。   Colorant ("coloring means"): caramel; erythrosin (FD & C red No. 3); FD & C red No. 40; FD & C yellow no. 5; FD & C Yellow No. 5 6; FD & C Blue No. 6 1; red, yellow, black, blue, or mixed; iron oxide.

錯化剤（「錯体形成手段」）：エチレンジアミン四酢酸およびその塩（ＥＤＴＡ）、エデト酸、ゲンチシン酸エタノールアミド、硫酸オキシキノリン。   Complexing agent (“complex forming means”): ethylenediaminetetraacetic acid and its salt (EDTA), edetic acid, gentisic acid ethanolamide, oxyquinoline sulfate.

乾燥剤（「乾燥手段」）：塩化カルシウム、硫酸カルシウム、二酸化ケイ素。   Desiccant ("drying means"): calcium chloride, calcium sulfate, silicon dioxide.

濾過補助剤（「濾過手段」）：粉末状セルロース、精製されたケイ土。   Filter aid (“filter means”): powdered cellulose, purified silica.

矯味矯臭剤および香料（「風味付け手段」）：アネトール、アニス油、ベンズアルデヒド、桂皮油、ココア、エチルバニリン、メントール、サリチル酸メチル、グルタミン酸一ナトリウム、オレンジ花油、オレンジ油、ペッパーミント、ペッパーミント油、ハッカ精、ローズオイル、ローズ水、チモール、トルーバルサムチンキ剤、バニラ、バニラチンキ剤、バニリン。   Flavoring and flavoring ("flavoring means"): anethole, anise oil, benzaldehyde, cinnamon oil, cocoa, ethyl vanillin, menthol, methyl salicylate, monosodium glutamate, orange flower oil, orange oil, peppermint, peppermint oil , Mint, rose oil, rose water, thymol, traumatic thumb tincture, vanilla, vanilla tincture, vanillin.

保湿剤（「水分保持手段」）：グリセリン、ヘキシレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール。   Moisturizer ("moisture retention means"): glycerin, hexylene glycol, propylene glycol, sorbitol.

軟膏基剤（「軟膏手段」）：ラノリン、無水ラノリン、親水性軟膏、白色軟膏、黄色軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、ワセリン、親水性ワセリン、白色ワセリン、ローズ水軟膏、スクワラン。   Ointment base ("ointment means"): lanolin, anhydrous lanolin, hydrophilic ointment, white ointment, yellow ointment, polyethylene glycol ointment, petrolatum, hydrophilic petrolatum, white petrolatum, rose water ointment, squalane.

流動化剤（「流動化手段」）：ヒマシ油、ジアセチル化モノグリセリド、フタル酸ジエチル、グリセリン、モノアセチル化およびジアセチル化モノグリセリド、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トリアセチン、クエン酸トリエチル。   Fluidizer (“fluidizing means”): castor oil, diacetylated monoglyceride, diethyl phthalate, glycerin, monoacetylated and diacetylated monoglyceride, polyethylene glycol, propylene glycol, triacetin, triethyl citrate.

高分子膜：酢酸セルロース。   Polymer membrane: cellulose acetate.

高分子担体（「担体手段」）は、生物学的送達を含む、ポリペプチドの送達のためのポリペプチド結晶のカプセル化に使用される高分子である。このような高分子としては、生体適合性ポリマーおよび生体分解性高分子が挙げられる。高分子担体は、１つの高分子型である場合も、また、複数の高分子型の混合物からなる場合もある。高分子担体として有用である高分子としては、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、例えば、ポリ（乳酸）すなわちＰＬＡ、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）すなわちＰＬＧＡ、ポリ（Ｂ−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）およびポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、マレイン酸無水物−アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ）、アルブミン、自然界に存在しているポリペプチドおよび合成のポリペプチド、アルギン酸塩、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖類、グリコアミノグリカン、硫化多糖類、あるいは、ポリペプチド結晶をカプセル化できる任意の便利な材料が挙げられる。   A polymeric carrier (“carrier means”) is a polymer used to encapsulate polypeptide crystals for the delivery of polypeptides, including biological delivery. Such polymers include biocompatible polymers and biodegradable polymers. The polymer carrier may be one polymer type or may be a mixture of a plurality of polymer types. Polymers that are useful as polymer carriers include, for example, poly (acrylic acid), poly (cyanoacrylate), poly (amino acid), poly (anhydride), poly (depsipeptide), poly (ester), poly (Lactic acid) or PLA, poly (lactic acid-co-glycolic acid) or PLGA, poly (B-hydroxybutyrate), poly (caprolactone) and poly (dioxanone); poly (ethylene glycol), poly ((hydroxypropyl) methacryl Amide), poly [(organo) phosphazene], poly (orthoester), poly (vinyl alcohol), poly (vinyl pyrrolidone), maleic anhydride-alkyl vinyl ether copolymer, pluronic polyol, albumin, present in nature do it Polypeptides and synthetic polypeptides, alginate, cellulose and cellulose derivatives, collagen, fibrin, gelatin, hyaluronic acid, oligosaccharides, glycoaminoglycans, sulfurized polysaccharides, or any convenient that can encapsulate polypeptide crystals Materials.

保存剤（または「保存手段」）、例えば、抗菌性保存剤。本発明の処方物、例えば、多用量処方物中での使用が想定されるものとしては、例えば、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズアルコニウム溶液、塩化ベンゼルトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラベン、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、クレゾール、デヒドロ酢酸、エチルパラベン、メチルパラベン、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、プロピルパラベン、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チメロサール、およびチモールが挙げられる。含まれる保存剤の量は、０％から２％（ｗ／ｖ）の範囲、または約１％（ｗ／ｖ）である。   Preservatives (or “preservation means”), for example antimicrobial preservatives. Contemplated for use in the formulations of the present invention, eg, multi-dose formulations, include, for example, benzalkonium chloride, benzalkonium chloride solution, benzethonium chloride, benzoic acid, benzyl alcohol, butylparaben, Cetylpyridinium chloride, chlorobutanol, chlorocresol, cresol, dehydroacetic acid, ethylparaben, methylparaben, methylparaben sodium, phenol, phenylethyl alcohol, phenylmercuric acetate, phenylmercuric nitrate, potassium benzoate, potassium sorbate, propylparaben, propylparaben Examples include sodium, sodium benzoate, sodium dehydroacetate, sodium propionate, sorbic acid, thimerosal, and thymol. The amount of preservative included is in the range of 0% to 2% (w / v), or about 1% (w / v).

可溶化剤および安定化剤（「可溶化手段」または「安定化手段」、乳化剤、共溶質、または共−溶媒とも呼ばれる）。これは、ポリペプチドの可溶性を増大させ、そして／またはポリペプチドを安定化させ、溶液中で（または乾燥形態もしくは凍結形態で）、薬学的組成物に添加することもできる。可溶化剤および安定化剤の例としては、糖／ポリオール：例えば、スクロース、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、トレハロース、グルコース；高分子、例えば、血清アルブミン（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒトＳＡ（ＨＳＡ）、または組み換えＨＡ）、デキストラン、ＰＶＡ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）；非水性溶媒、例えば：多価アルコール（例えば、ＰＥＧ、エチレングリコール、およびグリセロール）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）；アミノ酸、例えば、プロリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、グルタミン酸ナトリウム、アラニン、グリシン、リジン塩酸塩、サルコシン、およびγ−アミノ酪酸；界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＳＤＳ、ポリソルビン酸、ポリオキシエチレンコポリマー；およびその他の雑多な安定化剤賦形剤、例えば：リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、トリメチルアミンＮ−オキサイド、ベタイン、金属イオン（例えば、亜鉛、銅、カルシウム、マンガン、およびマグネシウム）、ＣＨＡＰＳ、モノラウリン酸塩、２−Ｏ−β−マンノグリセレート；あるいは、以下のいずれか：アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン（添加物）、モノステアリン酸グリセリン、ラノリンアルコール、レシチン、モノグリセリドおよびジグリセリド、モノエタノールアミン（添加物）、オレイン酸（添加物）、オレイルアルコール（安定化剤）、ポロキサマー、ステアリン酸ポリオキシエチレン５０、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル４０水素化ヒマシ油、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコールジアセテート、プロピレングリコールモノステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテート、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トロラミン、乳化ろう；湿潤剤、および／または安定化剤、例えば、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズトニウム、塩化セチルピリジニウム、ドキュセートナトリウム、ノノキシノール９、ノノキシノール１０、オクトキシノール９、ポリオキシル５０ステアレート、チロキサポール；あるいは、上記の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方物中の可溶化剤／安定化剤の濃度は、約０．００１から５重量パーセント、または約０．１から２重量パーセントである。１つの実施形態においては、安定化剤は、ソルビタンモノ−９−オクタデセノエートポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）誘導体から選択される。これには、ポリソルベート８０、またはポリソルベート２０が含まれるが、これらに限定されない。この実施形態において使用されるポリソルベート２０または８０の量は、１回の使用の処方物において、または多用量の処方物において、０．００１％から０．１％（ｗ／ｖ）の範囲内であり、例えば、０．００５％（ｗ／ｖ）である。別の実施形態においては、０．０５ｍＭから５０ｍＭの範囲内の遊離のＬ−メチオニンが処方物中に含まれる。遊離のＬ−メチオニンの量は、１回使用の処方物については、０．０５ｍＭから５ｍＭであり、多用量の処方物については１ｍＭから１０ｍＭである。   Solubilizers and stabilizers (also referred to as “solubilizing means” or “stabilizing means”, emulsifiers, co-solutes, or co-solvents). This can also increase the solubility of the polypeptide and / or stabilize the polypeptide and add it to the pharmaceutical composition in solution (or in dry or frozen form). Examples of solubilizers and stabilizers include sugars / polyols such as sucrose, lactose, glycerol, xylitol, sorbitol, mannitol, maltose, inositol, trehalose, glucose; macromolecules such as serum albumin (bovine serum albumin ( BSA), human SA (HSA), or recombinant HA), dextran, PVA, hydroxypropyl methylcellulose (HPMC), polyethyleneimine, gelatin, polyvinylpyrrolidone (PVP), hydroxyethylcellulose (HEC); non-aqueous solvents such as: multivalent Alcohols (eg, PEG, ethylene glycol, and glycerol), dimethyl sulfoxide (DMSO), and dimethylformamide (DMF); amino acids such as proline, L- Thionine, L-serine, sodium glutamate, alanine, glycine, lysine hydrochloride, sarcosine, and γ-aminobutyric acid; surfactants such as Tween-80, Tween-20, SDS, polysorbic acid, polyoxyethylene copolymers; and Other miscellaneous stabilizer excipients such as: potassium phosphate, sodium acetate, ammonium sulfate, magnesium sulfate, sodium sulfate, trimethylamine N-oxide, betaine, metal ions (eg, zinc, copper, calcium, manganese, and magnesium) ), CHAPS, monolaurate, 2-O-β-mannoglycerate; or one of the following: acacia, cholesterol, diethanolamine (additive), glyceryl monostearate, lanolin alcohol, lecithin , Monoglyceride and diglyceride, monoethanolamine (additive), oleic acid (additive), oleyl alcohol (stabilizer), poloxamer, polyoxyethylene 50 stearate, polyoxyl 35 castor oil, polyoxyl 40 hydrogenated castor oil, polyoxyl 10 oleyl ether, polyoxyl 20 cetostearyl ether, polyoxyl 40 stearate, polysorbate 20, polysorbate 40, polysorbate 60, polysorbate 80, propylene glycol diacetate, propylene glycol monostearic acid, sodium lauryl sulfate, sodium stearate, sorbitan monolaurate , Sorbitan monooleate, sorbitan monopalmitate, sorbitan monostearate, stearic acid, trolami Emulsifying wax; wetting agents and / or stabilizers such as benzalkonium chloride, benztonium chloride, cetylpyridinium chloride, docusate sodium, nonoxynol 9, nonoxynol 10, octoxynol 9, polyoxyl 50 stearate, tyloxapol; Alternatively, any combination of the above may be mentioned, but not limited thereto. The concentration of solubilizer / stabilizer in the formulation is about 0.001 to 5 weight percent, or about 0.1 to 2 weight percent. In one embodiment, the stabilizer is selected from sorbitan mono-9-octadecenoate poly (oxy-1,2-ethanediyl) derivatives. This includes, but is not limited to, polysorbate 80 or polysorbate 20. The amount of polysorbate 20 or 80 used in this embodiment is in the range of 0.001% to 0.1% (w / v) in a single use formulation or in a multidose formulation. Yes, for example, 0.005% (w / v). In another embodiment, free L-methionine in the range of 0.05 mM to 50 mM is included in the formulation. The amount of free L-methionine is 0.05 mM to 5 mM for single use formulations and 1 mM to 10 mM for multi-dose formulations.

溶媒（「溶解させるための手段」）：アセトン、アルコール、希釈されたアルコール、アミレン水和物、安息香酸ベンジル、ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロホルム、コーン油、綿実油、酢酸エチル、グリセリン、ヘキシレングリコール、イソプロピルアルコール、メチルアルコール、塩化メチレン、メチルイソブチルケトン、鉱油、ピーナッツ油、ポリエチレングリコール、プロピレンカーボネート、プロピレングリコール、ゴマ油、注射用の水、注射用の滅菌水、洗浄用の滅菌水、精製水。   Solvent ("Means for dissolving"): acetone, alcohol, diluted alcohol, amylene hydrate, benzyl benzoate, butyl alcohol, carbon tetrachloride, chloroform, corn oil, cottonseed oil, ethyl acetate, glycerin, hexylene Glycol, isopropyl alcohol, methyl alcohol, methylene chloride, methyl isobutyl ketone, mineral oil, peanut oil, polyethylene glycol, propylene carbonate, propylene glycol, sesame oil, water for injection, sterile water for injection, sterile water for cleaning, purified water .

吸着剤（吸湿剤とも呼ばれる、「吸着手段」）：粉末状セルロース、炭、精製されたケイ土；および二酸化炭素吸着剤：水酸化バリウム石灰、石灰ソーダ。   Adsorbents (also referred to as “absorbers”, also referred to as hygroscopic agents): powdered cellulose, charcoal, purified silica, and carbon dioxide adsorbents: barium hydroxide lime, lime soda.

硬化剤（「硬化手段」）：水素化ヒマシ油、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、セチルエステルワックス、固い脂肪、パラフィン、ポリエチレン賦形剤、ステアリルアルコール、乳化ろう、白ろう、黄ろう。   Curing agent ("curing means"): hydrogenated castor oil, cetostearyl alcohol, cetyl alcohol, cetyl ester wax, hard fat, paraffin, polyethylene excipient, stearyl alcohol, emulsifying wax, white wax, yellow wax.

坐剤基剤（「坐剤手段」）：ココアバター、固い脂肪、ポリエチレングリコール。   Suppository base ("suppository means"): cocoa butter, hard fat, polyethylene glycol.

懸濁剤および／または粘性増加剤（「粘性増加手段」）：アカシア、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、精製されたベントナイト、マグマベントナイト、カルボマー９３４ｐ、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム１２、カラギーナン、微結晶性およびカルボキシメチルセルロースセルロースナトリウム、デキストリン、ゼラチン、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マグネシウムケイ酸アルミニウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、キサンタンガム。   Suspending and / or viscosity increasing agents (“viscosity increasing means”): acacia, agar, alginic acid, aluminum monostearate, bentonite, purified bentonite, magma bentonite, carbomer 934p, carboxymethylcellulose calcium, carboxymethylcellulose sodium, carboxy Sodium methylcellulose 12, carrageenan, microcrystalline and sodium carboxymethylcellulose cellulose, dextrin, gelatin, guar gum, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, magnesium aluminum silicate, methylcellulose, pectin, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, povidone, alginic acid Propylene glycol, dioxide Lee arsenide, colloidal silicon dioxide, sodium alginate, tragacanth, xanthan gum.

甘味剤（「甘味手段」）：アスパルテーム、デキストレート、デキストロース、賦形剤デキストロース、フルクトース、マンニトール、サッカリン、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ソルビトール、ソルビトール溶液、スクロース、圧縮糖、菓子用の糖、シロップ。   Sweetener ("sweet means"): aspartame, dextrate, dextrose, excipient dextrose, fructose, mannitol, saccharin, saccharin calcium, saccharin sodium, sorbitol, sorbitol solution, sucrose, compressed sugar, confectionery sugar, syrup.

錠剤の結合剤（「錠剤の結合手段」）：アカシア、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶性セルロース、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、グアーガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレンオキサイド、ポビドン、予めゼラチン状にしたデンプン、シロップ。   Tablet binder ("tablet binding means"): acacia, alginic acid, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, dextrin, ethylcellulose, gelatin, liquid glucose, guar gum, hydroxypropylmethylcellulose, methylcellulose, polyethylene oxide, povidone, pre-gelatin Shaped starch, syrup.

錠剤および／またはカプセル剤用の希釈剤（「希釈手段」）：炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、三塩基性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、粉末状セルロース、デキストレート、デキストリン、デキストロース賦形剤、フルクトース、カオリン、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、予めゼラチン状にしたデンプン、スクロース、圧縮糖、菓子用の糖。   Diluent for tablets and / or capsules ("dilution means"): calcium carbonate, dibasic calcium phosphate, tribasic calcium phosphate, calcium sulfate, microcrystalline cellulose, powdered cellulose, dextrate, dextrin, dextrose shaping Agents, fructose, kaolin, lactose, mannitol, sorbitol, starch, pregelatinized starch, sucrose, compressed sugar, confectionery sugar.

錠剤崩壊物質（「錠剤崩壊手段」）：アルギン酸、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、コルスポビドン、ポラクリリンカリウム、グリコール酸ナトリウムスターチ、デンプン、予めゼラチン状にしたデンプン。   Tablet disintegrating material (“tablet disintegrating means”): alginic acid, microcrystalline cellulose, croscarmellose sodium, corspovidone, polacrilin potassium, sodium glycolate starch, starch, starch previously gelatinized.

錠剤および／またはカプセル剤用の潤滑剤（「潤滑手段」）：ステアリン酸カルシウム、ベヘン酸グリセリル、ステアリン酸マグネシウム、軽油、ポリエチレングリコール、フマル酸ナトリウムステアリル、ステアリン酸、精製されたステアリン酸、タルク、水素化植物油、ステアリン酸亜鉛。   Lubricants for tablets and / or capsules ("lubricating means"): calcium stearate, glyceryl behenate, magnesium stearate, light oil, polyethylene glycol, sodium stearyl fumarate, stearic acid, purified stearic acid, talc, hydrogen Chemical vegetable oil, zinc stearate.

張度変更剤（「張度を変化させる手段」）は、溶液の浸透圧に関係する分子と理解される。薬学的組成物の浸透圧は、好ましくは、有効成分の安定性を最大にし、そしてまた、投与の際の患者の不快状態を最少にするように、調節される。血清は、およそ３００＋／−５０ミリオスモル／キログラムである。通常は、薬学的組成物が血清と等張性であること、すなわち、同じであるか類似の浸透圧を有することが好ましい。これは、張度変更剤の添加によって行われ、したがって、浸透圧が約１８０から約４２０ミリオスモルまでであることが意図されるが、特異的な条件が必要である場合には、浸透圧がさらに高いか、またはさらに低いかのいずれかであり得ることが理解される。浸透圧を変化させるために適切な張度変更剤の例としては、アミノ酸（例えば、アルギニン、システイン、ヒスチジン、およびグリシン）、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびクエン酸ナトリウム）、ならびに／または糖類（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、グリセリン、およびマンニトール）が挙げられるが、これらに限定されない。処方物中での張度変更剤の濃度は、約１ｍＭから１Ｍの間、または約１０ｍＭから約２００ｍＭの間であり得る。１つの実施形態においては、張度変更剤は、０ｍＭから２００ｍＭの濃度範囲の塩化ナトリウムである。別の実施形態においては、張度変更剤は、ソルビトールまたはトレハロースであり、塩化ナトリウムは存在しない。   Tonicity modifiers (“means for changing tonicity”) are understood to be molecules that are related to the osmotic pressure of a solution. The osmotic pressure of the pharmaceutical composition is preferably adjusted to maximize the stability of the active ingredient and also to minimize patient discomfort upon administration. Serum is approximately 300 +/− 50 milliosmol / kilogram. Usually, it is preferred that the pharmaceutical composition be isotonic with serum, that is, have the same or similar osmotic pressure. This is done by the addition of a tonicity modifier and is therefore intended to have an osmotic pressure from about 180 to about 420 milliosmoles, but if specific conditions are required, the osmotic pressure is further increased. It is understood that it can be either high or even lower. Examples of suitable tonicity modifying agents for altering osmotic pressure include amino acids (eg, arginine, cysteine, histidine, and glycine), salts (eg, sodium chloride, potassium chloride, and sodium citrate), and / or Or sugars such as, but not limited to, sucrose, glucose, dextrose, glycerin, and mannitol. The concentration of tonicity modifying agent in the formulation can be between about 1 mM and 1 M, or between about 10 mM and about 200 mM. In one embodiment, the tonicity modifying agent is sodium chloride in a concentration range of 0 mM to 200 mM. In another embodiment, the tonicity modifying agent is sorbitol or trehalose and no sodium chloride is present.

ビヒクル（「ビヒクル手段」）：香味付けされた、そして／または甘味付けされたもの（芳香族エリキシル、化合物ベンズアルデヒドエリキシル、イソ−アルコール性エリキシル、ペッパーミント水、ソルビトール溶液、シロップ、トルーバルサムシロップ）；油性のもの（アーモンド油、コーン油、菜種油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱油、軽油、ミリスチルアルコール、オクチルドデカノール、オリーブ油、ピーナッツ油、杏仁油、ゴマ油、大豆油、スクワラン）；糖球のような固体の担体；滅菌のもの（静菌性の注射用水、静菌性塩化ナトリウム注入液）。   Vehicle (“Vehicle Means”): flavored and / or sweetened (aromatic elixir, compound benzaldehyde elixir, iso-alcoholic elixir, peppermint water, sorbitol solution, syrup, trough sam syrup); Oily (almond oil, corn oil, rapeseed oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, isopropyl palmitate, mineral oil, light oil, myristyl alcohol, octyldodecanol, olive oil, peanut oil, apricot oil, sesame oil, soybean oil, squalane) Solid carrier such as sugar spheres; sterile (bacteriostatic water for injection, bacteriostatic sodium chloride infusion).

撥水剤（「撥水手段」）：シクロメチコン、ジメチコン、シメチコン。   Water repellent ("water repellent means"): cyclomethicone, dimethicone, simethicone.

特定の実施形態においては、薬学的組成物には、以下から選択される化合物、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる：１）アミノ酸（例えば、グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、プロリンの塩：２）炭水化物、例えば、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボース）の塩；３）二糖（例えば、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロース）の塩；４）多糖（例えば、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲン）の塩；５）アルジトール（例えば、マンニトール、キシリトール、ラクチトール、ソルビトール）の塩；６）グルクロン酸、ガラクツロン酸の塩；７）シクロデキストリン（例えば、メチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）の塩；８）無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、ホウ酸アンモニウム、炭酸、ならびにリン酸アンモニウム）；９）有機塩（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩）；１０）乳化剤または可溶化剤（例えば、アカシア、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリン、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、ソルビタンモノラウレート、モノステアリン酸ソルビタン、および他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、ろう、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン誘導体）；１１）粘度増化剤（例えば、寒天、アルギン酸およびその塩、グアーガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、セルロースおよびその誘導体、プロピレンカーボネート、ポリエチレングリコール、へキシレングリコール、チロキサポール）；ならびに１２）特定の成分（例えば、スクロース、トレハロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、イノシトール、酢酸、リン酸、クエン酸、ホウ酸などのナトリウム塩およびカリウム塩、グリシン、アルギニン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、へキシレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン。   In certain embodiments, the pharmaceutical composition includes a compound selected from: or any combination thereof: 1) amino acids (eg, glycine, arginine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, asparagine, Glutamine, proline salts: 2) Carbohydrates, eg monosaccharides (eg glucose, fructose, galactose, mannose, arabinose, xylose, ribose); 3) disaccharides (eg lactose, trehalose, maltose, sucrose) 4) Salts of polysaccharides (eg maltodextrin, dextran, starch, glycogen); 5) Salts of alditol (eg mannitol, xylitol, lactitol, sorbitol); 6) Salts of glucuronic acid, galacturonic acid; 7) Cyclo Dextri Salts such as methylcyclodextrin, hydroxypropyl-β-cyclodextrin, etc .; 8) inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, sodium phosphate and potassium phosphate, ammonium borate, carbonic acid, and 9) organic salts (eg acetate, citrate, ascorbate, lactate); 10) emulsifiers or solubilizers (eg acacia, diethanolamine, glyceryl monostearate, lecithin, monoethanol) Amine, oleic acid, oleyl alcohol, poloxamer, polysorbate, sodium lauryl sulfate, stearic acid, sorbitan monolaurate, sorbitan monostearate, and other sorbitan derivatives, polyoxyl derivatives, waxes, polyoxyesters 11) Viscosity increasing agents (eg, agar, alginic acid and its salts, guar gum, pectin, polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, cellulose and its derivatives, propylene carbonate, polyethylene glycol, hexylene glycol, and tyloxapol) And 12) certain ingredients (eg, sucrose, trehalose, lactose, sorbitol, lactitol, inositol, sodium and potassium salts such as acetic acid, phosphoric acid, citric acid, boric acid, glycine, arginine, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, Polyethylene glycol, hexylene glycol, methoxypolyethylene glycol, gelatin, hydroxypropyl-β-cyclodextrin.

（徐放形態）
本発明の１つの好ましい実施形態においては、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの徐放形態（「制御放出」形態とも呼ばれる）が使用される。これには、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃの徐放形態が含まれる。徐放形態または制御放出形態には、結晶性ポリペプチドと、結晶性ポリペプチドの物理的放出または生物学的有用性を所望される期間に延長するための物質（「徐放手段」）が含まれる。開示される方法での使用に適している徐放形態としては、ゆっくりと溶解する生分解性高分子（例えば、本明細書中に記載される高分子担体、米国特許第６，０３６，９７８号に記載されているアルギン酸微粒子、または米国特許第６，０８３，５３４号に記載されているポリエチレン−ビニル酢酸およびポリ（乳酸−グリコール酸（ｇｌｕｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ））組成物）のような徐放手段の中にカプセル化されているもの、そのような高分子（局所塗布されるヒドロゲルを含む）とともに投与されるもの、および／または生体適合性の半透性の移植物の中に入れられているものである、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。本発明のさらなる実施形態として、高分子微粒子（ここでは、有効成分と、高分子（例えば、ＰＬＧＡ）のような徐放手段の混合物が、連続相の中に分散させられており、得られる分散物が、水および有機溶媒または添加物を除去するために直接凍結乾燥させられ、上記の微粒子が形成される（米国特許第６，０２０，００４号））；アルギン酸エステルのような生体分解性陰イオン性多糖類、ポリペプチド、および少なくとも１つの結合させられた多価金属イオンを含む注射することができるゲル組成物（米国特許第６，４３２，４４９号）；逆相熱ゲル化特性を有しており、状況に応じてｐＨ反応性ゲル化／脱ゲル化特性を有する、注射することができる生分解性高分子状マトリックス（米国特許第６，５４１，０３３号、および同第６，４５１，３４６号）；約１５重量％から約３０重量％までの範囲のポリオールを含む懸濁物のような、生体適合性ポリオール：油懸濁物（米国特許第６，２４５，７４０号）のようなさらなる徐放形態が挙げられる。このような徐放形態は、デポー製剤の形態での投与を通じてのポリペプチドの持続的な投与に適している。ここでは、デポー製剤は、移植物であり得るか、または、注射することができるマイクロスフェア、ナノスフェア、またはゲルの形態であることもできる。上記に列挙された米国特許（米国特許第６，０３６，９７８号、同第６，０８３，５３４号、同第６，０２０，００４号、同第６，４３２，４４９号、同第６，５４１，０３３号、同第６，４５１，３４６号、および同第６，２４５，７４０号）は、それらの全体が、本明細書中に引用によって組み込まれる。さらに、本発明の結晶性ポリペプチドの徐放形態または制御放出形態には、Ｋｉｍ，Ｃ．，２０００，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍ Ｄｅｓｉｇｎ”，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ＰＡに記載されている手段のようなタイプの徐放手段が含まれる。これには、以下が含まれている：自然界に存在している高分子（ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、アラビアガム、またはキトサン）、半合成の高分子またはセルロース誘導体（メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸プロピオン酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、またはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、および合成高分子（イオン交換樹脂（メタクリル酸、スルフォン化ポリスチレン／ジビニルベンゼン）、ポリアクリル酸（カルボポール）、ポリ（ＭＭＡ／ＭＡＡ）、ポリ（ＭＭＡ／ＤＥＡＭＡ）、ポリ（ＭＭＡ／ＥＡ）、ポリ（フタル酸酢酸ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸／グリコール酸）、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリ（ジメチルシリコン）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレン／ビニル酢酸）、ポリ（エチレン／ビニルアルコール）、ポリブタジエン、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（グルタミン酸））。 (Slow release form)
In one preferred embodiment of the invention, a sustained release form of crystalline TNFR2 polypeptide (also referred to as a “controlled release” form) is used. This includes a sustained release form of crystalline TNFR2: Fc. Sustained release forms or controlled release forms include crystalline polypeptides and substances ("sustained release means") to extend the physical release or biological utility of the crystalline polypeptide to a desired period of time. It is. Slow release forms suitable for use in the disclosed methods include biodegradable polymers that dissolve slowly (eg, polymeric carriers described herein, US Pat. No. 6,036,978). Or in sustained release means such as the alginate microparticles described in US Pat. No. 6,083,534 or the polyethylene-vinylacetic acid and poly (lactic-glycolic acid composition) described in US Pat. No. 6,083,534 Encapsulated in, encapsulated in such macromolecules (including topically applied hydrogels), and / or encased in biocompatible semipermeable implants Certain crystalline TNFR2 polypeptides include, but are not limited to. As a further embodiment of the invention, a mixture of polymer microparticles (here an active ingredient and a sustained release means such as a polymer (eg PLGA) is dispersed in a continuous phase and the resulting dispersion The product is directly lyophilized to remove water and organic solvents or additives to form the microparticles described above (US Pat. No. 6,020,004)); biodegradable shades such as alginate An injectable gel composition comprising an ionic polysaccharide, a polypeptide, and at least one conjugated polyvalent metal ion (US Pat. No. 6,432,449); has reverse phase thermal gelling properties An injectable biodegradable polymeric matrix (US Pat. Nos. 6,541,033, and 6) having pH-responsive gelling / degelling properties as appropriate. Of biocompatible polyol: oil suspensions (US Pat. No. 6,245,740), such as suspensions containing polyols ranging from about 15% to about 30% by weight. Such additional sustained release forms. Such sustained release forms are suitable for sustained administration of the polypeptide through administration in the form of a depot preparation. Here, the depot formulation can be an implant or it can be in the form of microspheres, nanospheres or gels that can be injected. US patents listed above (US Pat. Nos. 6,036,978, 6,083,534, 6,020,004, 6,432,449, 6,541) , 033, 6,451,346, and 6,245,740) are incorporated herein by reference in their entirety. Further, sustained or controlled release forms of crystalline polypeptides of the present invention include Kim, C. et al. , 2000, “Controlled Release Dosage Form Design”, Technological Publishing Co. , Sustained release means of the type such as those described in Lancaster PA. This includes the following: natural polymers (gelatin, sodium alginate, xanthan gum, gum arabic, or chitosan), semi-synthetic polymers or cellulose derivatives (methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, hydroxyethylmethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, cellulose acetate, cellulose acetate butyrate, cellulose acetate propionate, cellulose acetate phthalate, or hydroxypropylmethylcellulose phthalate), and synthetic polymers (ion exchange resins ( Methacrylic acid, sulfonated polystyrene / divinylbenzene), polyacrylic acid (carbopol), poly (MMA / MAA) Poly (MMA / DEAMA), poly (MMA / EA), poly (vinyl acetate phthalate), poly (vinyl alcohol), poly (vinyl pyrrolidone), poly (lactic acid), poly (glycolic acid), poly (lactic acid / glycol) Acid), polyethylene glycol, polyethylene oxide, poly (dimethylsilicone), poly (hydroxyethyl methacrylate), poly (ethylene / vinyl acetate), poly (ethylene / vinyl alcohol), polybutadiene, poly (anhydride), poly (orthoester) ), And poly (glutamic acid)).

本発明のさらなる実施形態として、その全体が本明細書中に引用によって組み込まれる米国特許第６，５４１，６０６号に記載されているような、それらの本来備わっている生物学的に活性な三次構造を保存するために、高分子担体のマトリックス中へのカプセル化によってマイクロスフェアを形成するように少なくとも１つの高分子担体中にカプセル化させられた、ＴＮＦＲ２ポリペプチド結晶が挙げられる。カプセル化されるＴＮＦＲ２ポリペプチド結晶またはその処方物は、ＰＬＧＡのような高分子担体中に懸濁させられ、これは、有機溶媒または添加物中に溶解させられる。このようなカプセル化されたＴＮＦＲ２ポリペプチド結晶は、同等の条件下で保存された場合に、溶液中のＴＮＦＲ２ポリペプチドよりも長い期間にわたってＴＮＦＲ２ポリペプチドの生物学的活性を維持する。   As a further embodiment of the present invention, their native biologically active tertiary, as described in US Pat. No. 6,541,606, which is incorporated herein by reference in its entirety. In order to preserve structure, TNFR2 polypeptide crystals encapsulated in at least one polymeric carrier to form microspheres by encapsulating the polymeric carrier in a matrix. The encapsulated TNFR2 polypeptide crystal or formulation thereof is suspended in a polymeric carrier such as PLGA, which is dissolved in an organic solvent or additive. Such encapsulated TNFR2 polypeptide crystals maintain the biological activity of the TNFR2 polypeptide for a longer period of time than TNFR2 polypeptides in solution when stored under equivalent conditions.

（例示的な実施形態）
処方物には、約２５から約５０ｍｇのＴＮＦＲ２ポリペプチドまたはエタナーセプトを含めることができる。ここでは、ＴＮＦＲ２ポリペプチドまたはエタナーセプトは、結晶形態、約１０ｍＭから約１００ｍＭのＬ−アルギニン、約１０ｍＭから約５０ｍＭのリン酸ナトリウム、約０．７５％から約１．２５％のスクロース、約５０ｍＭから約１５０ｍＭのＮａＣｌから、約ｐＨ６．０から約ｐＨ７．０で再構成される。別の実施形態では、処方物中で、Ｌ−アルギニンをＬ−システイン（約１から約５００μモル）で置き換えることができる。別の実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ７．０である。別の実施形態においては、薬学的組成物には、２５ｍｇ／ｍＬの結晶性ＴＮＦＲ２、約２５ｍＭのＬ−アルギニン、約２５ｍＭのリン酸ナトリウム、約９８ｍＭの塩化ナトリウム、および約１％のスクロースが、ｐＨ６．２で含まれる。別の実施形態においては、ここでは、結晶性のエタナーセプトまたは結晶形態から再構成されたエタナーセプトは、結晶化していないエタナーセプト調製物よりも、エタナーセプト１単位当たりの生物学的活性についてより高い活性レベルを有しており、処方物には、約１０から約５０ｍｇの結晶性エタナーセプトまたは結晶形態から再構成されたエタナーセプトを、あるいは、約１５から約２５ｍｇの結晶性エタナーセプトまたは結晶形態から再構成されたエタナーセプトを含めることができる。 Exemplary Embodiment
The formulation can include about 25 to about 50 mg of TNFR2 polypeptide or etanercept. Here, the TNFR2 polypeptide or etanercept is in crystalline form, from about 10 mM to about 100 mM L-arginine, from about 10 mM to about 50 mM sodium phosphate, from about 0.75% to about 1.25% sucrose, from about 50 mM. Reconstituted from about 150 mM NaCl at about pH 6.0 to about pH 7.0. In another embodiment, L-arginine can be replaced with L-cysteine (about 1 to about 500 μmol) in the formulation. In another embodiment, the pH is about pH 7.0. In another embodiment, the pharmaceutical composition comprises 25 mg / mL crystalline TNFR2, about 25 mM L-arginine, about 25 mM sodium phosphate, about 98 mM sodium chloride, and about 1% sucrose. Included at pH 6.2. In another embodiment, here, crystalline etanercept or etanercept reconstituted from a crystalline form has a higher activity level for biological activity per unit of etanercept than uncrystallized etanercept preparations. And about 10 to about 50 mg of crystalline etanercept or reconstituted from crystalline form, or about 15 to about 25 mg of etanercept or reconstituted from crystalline form. Can be included.

（ポリペプチドの安定性および生物学的活性についての処方物の試験）
さらに別の実施形態においては、本発明により、本発明の薬学的組成物中の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの安定性についての早い安定性試験のための方法が提供される。この方法には、保存前、すなわち、時間０の本発明に従って処方されたポリペプチドの活性を試験する工程；３７℃で１ヶ月、組成物を保存しポリペプチドの安定性を測定する工程；ならびに、時間０と１ヶ月の時点での安定性を比較する工程が含まれる。この情報は、最初に良好な安定性を有するように見えても長期間うまく保存することができないバッチまたはロットの早期の廃棄を手助けする。 (Testing formulations for polypeptide stability and biological activity)
In yet another embodiment, the present invention provides a method for rapid stability testing for the stability of crystalline TNFR2 polypeptides in the pharmaceutical compositions of the invention. This method comprises the steps of testing the activity of a polypeptide formulated according to the invention before storage, ie at time 0; storing the composition for 1 month at 37 ° C. and measuring the stability of the polypeptide; and , Comparing the stability at time 0 and 1 month. This information helps early disposal of batches or lots that initially appear to have good stability but cannot be stored well over time.

さらに、本発明の薬学的組成物により、改善された長期保存が提供され、その結果、有効成分、例えば、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、液体または凍結された状態のいずれかで長期保存の間中安定である。本明細書中で使用される場合は、語句「長期間」の保存は、薬学的組成物が３ヶ月以上、６ヶ月以上保存できること、そして好ましくは、１年以上保存できることを意味すると理解される。長期間の保存は、また、薬学的組成物が２〜８℃で液体として、または例えば、−２０℃以下で凍結されてのいずれかで保存されることを意味するとも理解される。組成物を、２回以上凍結、および融解させることができることもまた意図される。用語「安定」は、長期保存に関しては、薬学的組成物の活性なポリペプチドが、保存開始時点の組成物の活性と比較して、２０％より多くはその活性を失わない、より好ましくは、１５％より多くは失わない、さらにより好ましくは、１０％より多くは失わない、そして最も好ましくは、５％より多くはその活性を失わないことを意味すると理解される。ＴＮＦＲ２ポリペプチドの活性は、多数のアッセイのいずれか１つによってアッセイすることができる。これらのアッセイには、ＥＬＩＳＡアッセイのようなリガンド結合アッセイが含まれる。ここでは、リガンドが固体支持体に結合させられ、ＴＮＦＲ２ポリペプチドの試験調製物と対照調製物が添加され、リガンドに対するＴＮＦＲ２の結合が、ＴＮＦＲ２ポリペプチドのＩｇ成分に向けられた標識された抗Ｉｇ抗体を使用して検出される。さらに、実施例６に記載されるアッセイのようなアッセイを使用して、ＴＮＦに結合するＴＮＦＲ２ポリペプチドの生物学的活性を検出することができ、また、これを、他のリガンドに結合するＴＮＦＲ２ポリペプチドの活性を試験するように変更することもできる。   Furthermore, the pharmaceutical compositions of the present invention provide improved long-term storage so that the active ingredient, eg, crystalline TNFR2 polypeptide, can be maintained during long-term storage either in liquid or frozen state. It is stable. As used herein, the phrase “long term” storage is understood to mean that the pharmaceutical composition can be stored for more than 3 months, more than 6 months, and preferably more than 1 year. . Long term storage is also understood to mean that the pharmaceutical composition is stored either as a liquid at 2-8 ° C. or frozen, for example, below −20 ° C. It is also contemplated that the composition can be frozen and thawed more than once. The term “stable”, for long-term storage, the active polypeptide of the pharmaceutical composition does not lose its activity by more than 20% compared to the activity of the composition at the start of storage, more preferably It is understood that no more than 15% is lost, even more preferably no more than 10% is lost, and most preferably no more than 5% does not lose its activity. The activity of a TNFR2 polypeptide can be assayed by any one of a number of assays. These assays include ligand binding assays such as ELISA assays. Here, a ligand is bound to a solid support, a test preparation and a control preparation of TNFR2 polypeptide are added, and the binding of TNFR2 to the ligand is labeled anti-Ig directed to the Ig component of the TNFR2 polypeptide. Detected using antibodies. In addition, an assay such as the assay described in Example 6 can be used to detect the biological activity of a TNFR2 polypeptide that binds to TNF, and this can be detected using TNFR2 that binds to other ligands. Modifications can also be made to test the activity of the polypeptide.

（投与および投与量）
本明細書中で使用される場合は、「結晶性ＴＮＦＲ２の投与」または「結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの投与」は、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを含む薬学的組成物、または結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを使用して調製された薬学的組成物の投与を意味する。 (Dose and dose)
As used herein, “administration of crystalline TNFR2” or “administration of crystalline TNFR2 polypeptide” uses a pharmaceutical composition comprising crystalline TNFR2 polypeptide, or crystalline TNFR2 polypeptide Administration of the prepared pharmaceutical composition.

任意の有効な投与経路を使用して、結晶性ＴＮＦＲ２を治療的に投与することができる。注射する場合は、結晶性ＴＮＦＲ２を、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、病変内、腹腔内、または皮下経路によって、ボーラス注射または持続的な注入によって投与することができる。他の適切な投与手段としては、移植物からの徐放、デポー製剤（移植されるもの、または注射されるもの）、坐剤、エアゾール吸入、点眼薬、経口調製物（丸剤、シロップ剤、トローチ剤、またはチューイングガムを含む）、および局所用調製物（例えば、ローション、ゲル剤、スプレー剤、軟膏）、あるいは、他の適切な技術が挙げられる。結晶性ＴＮＦＲ２が、１つ以上の他の生物学的に活性な化合物と組み合わせて投与される場合は、これらは、同じ経路によって投与される場合も、また、異なる経路によって投与される場合もあり、同時に投与される場合も、別々に投与される場合も、また連続して投与される場合もある。   Crystalline TNFR2 can be administered therapeutically using any effective route of administration. When injected, crystalline TNFR2 can be administered by bolus injection or continuous infusion, eg, by intra-articular, intravenous, intramuscular, intralesional, intraperitoneal, or subcutaneous routes. Other suitable administration means include sustained release from implants, depot preparations (transplanted or injected), suppositories, aerosol inhalation, eye drops, oral preparations (pills, syrups, Including lozenges or chewing gums) and topical preparations (eg, lotions, gels, sprays, ointments) or other suitable techniques. When crystalline TNFR2 is administered in combination with one or more other biologically active compounds, these may be administered by the same route or by different routes. They may be administered simultaneously, separately, or sequentially.

適切な投与量は、標準的な投与試験において決定することができ、これは選択される投与経路に応じて変化し得る。投与量および投与頻度は、処置される適応症の性質および重篤度、所望される応答、患者の年齢および状態などの要因に応じて変化する。以下の投与レジュメにおいては、投与される結晶性ＴＮＦＲ２の量は、結晶性ＴＮＦＲ２を含む薬学的組成物についての結晶性ＴＮＦＲ２の量、または結晶性ＴＮＦＲ２を使用して調製された薬学的組成物についてのＴＮＦＲ２ポリペプチドの量であると理解される。   Appropriate dosages can be determined in standard dosage studies, which may vary depending on the route of administration chosen. The dosage and frequency of administration will vary depending on factors such as the nature and severity of the indication being treated, the desired response, the age and condition of the patient. In the following dosing regimens, the amount of crystalline TNFR2 administered is the amount of crystalline TNFR2 for a pharmaceutical composition comprising crystalline TNFR2, or for a pharmaceutical composition prepared using crystalline TNFR2. It is understood that the amount of TNFR2 polypeptide.

本発明の１つの実施形態においては、結晶性ＴＮＦＲ２は、本明細書中に開示される医学的障害または状態を処置するために、１週間に１回投与される。別の実施形態においては、１週間に少なくとも２回投与され、別の実施形態においては、１週間に少なくとも３回投与される。成人患者とは、１８歳以上の人である。注射される場合は、成人についての結晶性ＴＮＦＲ２の有効量は、１〜２０ｍｇ／ｍ^２体表面積の用量範囲であり、好ましくは、約５〜１２ｍｇ／ｍ^２である。あるいは、均一な用量が投与される。このような量は、５〜１００ｍｇ／用量の範囲であり得る。皮下注射によって投与される均一な用量についての例示的な用量範囲は、５〜２５ｍｇ／用量、２５〜５０ｍｇ／用量、および５０〜１００ｍｇ／用量である。本発明の１つの実施形態においては、以下に記載される種々の適応症が、１用量あたり２５ｍｇのＴＮＦＲ２の結晶性ＴＮＦＲ２を含むかまたは、それから調製されたか、あるいは、１用量あたり５０ｍｇを含む注射できる調製物を投与することによって処置される。２５ｍｇまたは５０ｍｇの用量は、特に、慢性的な状態について、繰り返し投与することができる。注射以外の投与経路が使用される場合は、用量は、標準的な医療行為にしたがって適切に調節される。多くの例においては、患者の状態の改善は、少なくとも３週間の期間にわたる１週間に１回から３回の、約２５ｍｇの結晶性ＴＮＦＲ２の用量を注射することによって、あるいは、少なくとも３週間にわたる１週間に１回または２回の、５０ｍｇの結晶性ＴＮＦＲ２の用量を注射することによって得られるが、長期間にわたる処置が、所望される程度の改善を誘導するために必要である場合もある。治療不能な慢性的な状態については、患者の医師によって必要であると考えられる用量および頻度になるように調節されて、レジュメがいつまでも継続される場合もある。 In one embodiment of the invention, crystalline TNFR2 is administered once a week to treat the medical disorders or conditions disclosed herein. In another embodiment, it is administered at least twice a week, and in another embodiment, it is administered at least three times a week. An adult patient is a person over the age of 18. When injected, an effective amount of crystalline TNFR2 for an adult is a dose range of 1-20 mg / m ² body surface area, preferably about 5-12 mg / m ² . Alternatively, a uniform dose is administered. Such an amount can range from 5 to 100 mg / dose. Exemplary dose ranges for uniform doses administered by subcutaneous injection are 5-25 mg / dose, 25-50 mg / dose, and 50-100 mg / dose. In one embodiment of the invention, the various indications described below include injections containing or prepared from 25 mg of crystalline TNFR2 of TNFR2 per dose, or containing 50 mg per dose. It is treated by administering a possible preparation. The 25 mg or 50 mg dose can be administered repeatedly, especially for chronic conditions. If a route of administration other than injection is used, the dosage is adjusted appropriately according to standard medical practice. In many instances, improvement of the patient's condition is achieved by injecting a dose of about 25 mg crystalline TNFR2 from 1 to 3 times per week over a period of at least 3 weeks, or 1 Although obtained by injecting a dose of 50 mg crystalline TNFR2 once or twice a week, long-term treatment may be necessary to induce the desired degree of improvement. For chronic conditions that cannot be treated, the resume may continue indefinitely, adjusted to the dose and frequency deemed necessary by the patient's physician.

小児科の患者（４歳〜１７歳）については、適切なレジュメには、０．４ｍｇ／ｋｇ体重の皮下注射が含まれ、最大で２５ｍｇ／用量の結晶性ＴＮＦＲ２が、１週間に１回以上の皮下注射によって投与される。   For pediatric patients (ages 4-17), appropriate resume includes subcutaneous injections of 0.4 mg / kg body weight, with a maximum of 25 mg / dose crystalline TNFR2 at least once a week It is administered by subcutaneous injection.

ヒト患者に加えて、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ヒト以外の動物、例えば、ペット（イヌ、ネコ、鳥類、霊長類など）、家畜動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、鳥類など）、あるいは、本明細書中に記載されている状態の１つに匹敵する状態に罹患している任意の動物を苦しめている、本明細書中に記載されているような医学的状態の処置に有用である。このような例においては、適切な用量は、動物の体重に従って決定することができる。例えば、０．２〜１ｍｇ／ｋｇの用量が使用される場合がある。あるいは、用量は、動物の表面積にしたがって決定され、例示的な用量は、０．１〜２０ｍｇ／ｍ^２体表面積の範囲であり、またより好ましくは、５〜１２ｍｇ／ｍ^２体表面積である。イヌまたはネコのような小動物については、適切な用量は、０．４ｍｇ／ｋｇ体重である。別の実施形態においては、結晶性ＴＮＦＲ２（ここでは、ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、患者と同じ種に由来する遺伝子から発現されることが好ましい）が、注射または他の適切な経路によって、動物の状態が改善するまで、１週間に１回以上投与されるか、あるいは永久に投与される場合もある。 In addition to human patients, crystalline TNFR2 polypeptides may be used in non-human animals such as pets (dogs, cats, birds, primates, etc.), livestock animals (horses, cows, sheep, pigs, birds, etc.), or Useful for the treatment of a medical condition as described herein that afflicts any animal suffering from a condition comparable to one of the conditions described herein . In such instances, the appropriate dose can be determined according to the animal's body weight. For example, a dose of 0.2-1 mg / kg may be used. Alternatively, the dose is determined according to the animal's surface area, with exemplary doses ranging from 0.1-20 mg / m ² body surface area, and more preferably 5-12 mg / m ² body surface area. For small animals such as dogs or cats, a suitable dose is 0.4 mg / kg body weight. In another embodiment, crystalline TNFR2 (wherein the TNFR2 polypeptide is preferably expressed from a gene from the same species as the patient), but the animal's condition is altered by injection or other suitable route. It may be administered one or more times per week until improvement, or may be administered permanently.

結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドまたは結晶形態から再構成されたＴＮＦＲ２ポリペプチドが、結晶化していないＴＮＦＲ２ポリペプチド調製物よりも、１単位のＴＮＦＲ２ポリペプチドあたり高いレベルの生物学的活性を有する別の実施形態においては、上記の投与量を、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの生物学的活性の増大の程度に基づいて適切に減少させることができる。例えば、結晶化によって１単位のＴＮＦＲ２ポリペプチドあたり生物学的活性が２倍に増大する場合は、上記の投与量を、上記の投与量および投与量範囲の５０％に減少させることができる。他の実施形態においては、投与量を、上記の投与量の１０から９５％、または上記の投与量の２５から７５％、または上記の投与量の６０％、７０％、または８０％に減少させることができる。   Another embodiment wherein a crystalline TNFR2 polypeptide or a TNFR2 polypeptide reconstituted from a crystalline form has a higher level of biological activity per unit of TNFR2 polypeptide than a non-crystallized TNFR2 polypeptide preparation In the above, the dosage can be appropriately reduced based on the degree of increase in the biological activity of the crystalline TNFR2 polypeptide. For example, if crystallization doubles biological activity per unit of TNFR2 polypeptide, the dosage can be reduced to 50% of the dosage and dosage range described above. In other embodiments, the dosage is reduced to 10 to 95% of the dosage, or 25 to 75% of the dosage, or 60%, 70%, or 80% of the dosage. be able to.

本発明にはさらに、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを含むか、または、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを使用して調製された薬学的組成物と組み合わせて同じ患者に投与される、１つ以上の他の薬剤と同時に、結晶性ＴＮＦＲ２を投与することが含まれる。それぞれの薬剤は、その医薬品についての適切なレジュメにしたがって投与される。「同時投与」には、組み合わせの成分を用いた、同時または連続する処置が含まれ、さらに、薬剤が変更されるか、または１つの成分が長期間投与され、他の成分（単数または複数）が断続的に投与されるレジュメも含まれる。成分は、同じ組成物中で投与される場合も、また、別の組成物中で投与される場合も、そして、同じ投与経路で投与することも、また、異なる投与経路で投与することもできる。   The invention further includes one or more other agents that are administered to the same patient in combination with a pharmaceutical composition that includes or is prepared using a crystalline TNFR2 polypeptide At the same time, administration of crystalline TNFR2 is included. Each drug is administered according to the appropriate resume for that drug. “Simultaneous administration” includes simultaneous or sequential treatment with a combination of components, and in addition, the agent is altered or one component is administered over time and the other component (s) Including resumes administered intermittently. The components can be administered in the same composition, in different compositions, and can be administered by the same route of administration or by different routes of administration. .

（治療的使用）
本発明は、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを投与することにより、種々の医学的障害を処置するための方法に関する。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、他の生物学的に活性な分子と組み合わせて、本明細書中に記載される併用療法および／または同時治療によって例示されるがこれらに限定されない様式で投与することができる。本発明により、医学的障害に罹患しているヒト患者を含む哺乳動物患者を処置するための化合物、組成物、および方法が提供される。本開示の目的については、用語「疾病」、「疾患」、「医学的状態」、「異常な状態」などは、用語「医学的障害」と同義的に使用される。 (Therapeutic use)
The present invention relates to a method for treating various medical disorders by administering a crystalline TNFR2 polypeptide. The crystalline TNFR2 polypeptide may be administered in combination with other biologically active molecules in a manner exemplified by, but not limited to, the combination therapy and / or simultaneous treatment described herein. it can. The present invention provides compounds, compositions, and methods for treating mammalian patients, including human patients suffering from medical disorders. For the purposes of this disclosure, the terms “disease”, “disease”, “medical condition”, “abnormal condition” and the like are used interchangeably with the term “medical disorder”.

本発明にしたがって、医学的障害を有する患者には、治療有効量の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドが投与される。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、結晶性ＴＮＦＲ２：ＦｃのようなＴＮＦ−α−結合可溶性ＴＮＦ−α受容体の結晶形態であり得る。本明細書中で使用される場合は、語句治療薬の「治療的有効量を投与する」は、患者が、障害の重篤度を反映する少なくとも１つの指標においてベースラインを上回る改善の維持を誘導するために十分な量で十分な時間の間、その薬剤で処置されることを意味する。改善は、患者が１週間またはそれ以上の週によって間隔を明けられた少なくとも２回の時点において改善を示す場合に、「維持されている」とみなされる。改善の程度は、症候または兆候に基づいて決定され、決定にはまた、生活の質のアンケートのような、患者に対するアンケートも使用される場合がある。患者の疾病の程度を反映する種々の指標を、処置量または処置時間が十分であるかどうかを決定するために評価することができる。選択された指標（単数または複数）のベースラインの値は、結晶性エタナーセプトまたは他の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの最初の用量が投与される前の患者の試験によって確定される。好ましくは、ベースライン試験は、最初の用量の投与の約６０日以内に行われる。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドが急性の状態を処置するために、例えば、外傷性の膝の損傷を処置するために投与される場合は、最初の用量は、損傷が生じた後、可能な限り早く投与される。   In accordance with the present invention, a patient having a medical disorder is administered a therapeutically effective amount of crystalline TNFR2 polypeptide. The crystalline TNFR2 polypeptide can be a crystalline form of a TNF-α-binding soluble TNF-α receptor, such as crystalline TNFR2: Fc. As used herein, “administering a therapeutically effective amount” of the phrase therapeutic agent means that the patient maintains an improvement over baseline in at least one indicator that reflects the severity of the disorder. It means to be treated with the drug in a sufficient amount to induce for a sufficient time. An improvement is considered “maintained” if the patient shows improvement at least two time points separated by a week or more. The degree of improvement is determined based on symptoms or signs, and the determination may also use a questionnaire for the patient, such as a quality of life questionnaire. Various indicators that reflect the extent of the patient's illness can be evaluated to determine if the treatment dose or treatment time is sufficient. The baseline value of the selected indicator (s) is determined by patient testing before the first dose of crystalline etanercept or other crystalline TNFR2 polypeptide is administered. Preferably, the baseline study is performed within about 60 days of administration of the first dose. If the crystalline TNFR2 polypeptide is administered to treat an acute condition, eg, to treat traumatic knee injury, the first dose should be administered as soon as possible after the injury has occurred. Is done.

改善は、患者が選択された指標（単数または複数）についてベースラインを上回る改善を示すまで、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを投与することによって誘導される。慢性的な状態を処置することにおいては、この改善の程度は、少なくとも１ヶ月またはそれ以上、例えば、１ヶ月、２ヶ月、もしくは３ヶ月、またはそれ以上の期間にわたって、あるいは無期限に、この医薬品を繰り返し投与することによって得られる。１週間から６週間の期間、または１回の用量でもなお、多くの場合には、急性の状態を処置するためには十分である。損傷や急性状態については、１回の用量で十分である場合がある。処置後の患者の疾病の程度は、１つ以上の指標によっては改善しているように見えても、処置が、同じレベルで、または少ない用量もしくは頻度で無期限に継続される場合もある。一旦、処置が減少させられるかまたは中断されても、後に、状態が再度現れた場合には、もとのレベルで再開される場合もある。   Improvement is induced by administering crystalline TNFR2 polypeptide until the patient shows improvement over baseline for the selected indicator (s). In treating a chronic condition, the extent of this improvement is that the medicinal product over a period of at least 1 month or more, eg, 1 month, 2 months, 3 months or more, or indefinitely. Can be obtained by repeated administration. A period of 1 to 6 weeks, or even a single dose, is still often sufficient to treat acute conditions. A single dose may be sufficient for injury or acute conditions. Although the patient's degree of illness after treatment may appear to improve with one or more indicators, treatment may continue indefinitely at the same level or at a lower dose or frequency. Once treatment is reduced or interrupted, it may be resumed at the original level if the condition reappears later.

１つの実施形態においては、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドで処置される医学的状態は、異常なＴＮＦ−α濃度または過剰なＴＮＦ−α濃度を特徴とする。全身的または局所的なＴＮＦ−αの過剰は、多数の医学的障害の進行に関係しているとの提案がなされている。例えば、慢性心不全の患者は、高い血清ＴＮＦ−α濃度を有しており、これは、疾患の進行を加速させることが示されている（例えば、Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３２３：２３６−２４１，１９９０を参照のこと）。種々の他の疾患が、高いＴＮＦ−α濃度に関係している（例えば、Ｆｅｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ３０：４１２６−４１２７，１９９８を参照のこと）。ＴＮＦ−αの抑制が異常なＴＮＦ−αの発現または過剰なＴＮＦ−αの発現を特徴とする障害に罹患している患者に有効であることが示唆されている。しかし、このような疾患の有効な処置の考案は進歩してはいるが、改良された医薬品および処置方法が必要とされている。   In one embodiment, the medical condition treated with crystalline TNFR2 polypeptide is characterized by abnormal TNF-α concentration or excessive TNF-α concentration. It has been proposed that systemic or local excess of TNF-α is associated with the progression of a number of medical disorders. For example, patients with chronic heart failure have high serum TNF-α concentrations, which have been shown to accelerate disease progression (eg, Levine et al., N Eng J Med 323: 236). -241, 1990). A variety of other diseases are associated with high TNF-α concentrations (see, eg, Feldman et al., Transplant Processing 30: 4126-4127, 1998). It has been suggested that suppression of TNF-α is effective for patients suffering from disorders characterized by abnormal TNF-α expression or excessive TNF-α expression. However, while the development of effective treatments for such diseases has progressed, improved pharmaceuticals and treatment methods are needed.

異常なＴＮＦＲ−αの発現を特徴とする多数の医学的障害を処置するための方法が、本明細書中で提供される。この方法は、ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような可溶性ＴＮＦ−α受容体の結晶形態のような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、患者の状態の持続的な改善を誘導するために十分な期間の間投与することによる。この方法には、内因性の生物学的に活性なＴＮＦ−αの有効量を、例えば、ＴＮＦ−αのその細胞表面受容体（ＴＮＦＲ）に対する結合を妨げることによって減少させることができる結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを含むか、またはこれを使用して調製された処方物を患者に投与することが含まれる。   Provided herein are methods for treating a number of medical disorders characterized by abnormal TNFR-α expression. This method involves administering a crystalline TNFR2 polypeptide, such as a crystalline form of a soluble TNF-α receptor, such as TNFR2: Fc, for a period sufficient to induce sustained improvement in the patient's condition. by. In this method, an effective amount of endogenous biologically active TNF-α can be reduced by, for example, crystalline TNFR2 which can be reduced by preventing binding of TNF-α to its cell surface receptor (TNFR). It includes administering to a patient a formulation that includes or is prepared using the polypeptide.

（心臓血管疾患）
心臓血管障害は、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、その薬学的組成物、および／または併用療法を用いて処置することができる。結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドで処置することができる心臓血管障害の例として、以下が挙げられる：大動脈瘤、動脈炎、血管閉塞（大脳動脈の閉塞を含む）；冠状動脈のバイパス手術の合併症；虚血／再潅流障害；心臓病（アテローム性心臓病を含む）、心筋炎、（慢性自己免疫性心筋炎、およびウイルス性心筋炎を含む）；心不全（慢性心不全（ＣＨＦ）、心不全の悪液質を含む）；心筋梗塞；心臓の外科手術後の再狭窄；無症候性心筋虚血；左心室補助循環装置の移植後の合併症；レイノー現象；静脈血栓症；脈菅炎（カワサキ脈肝炎を含む）；巨細胞性動脈炎、ウェグナー肉芽腫症；およびシェーンライン・ヘノッホ型紫斑病。 (Cardiovascular disease)
Cardiovascular disorders can be treated using the disclosed crystalline TNFR2 polypeptide, pharmaceutical compositions thereof, and / or combination therapies. Examples of cardiovascular disorders that can be treated with a crystalline TNFR2 polypeptide such as crystalline TNFR2: Fc include: aortic aneurysm, arteritis, vascular occlusion (including cerebral artery occlusion); coronary artery Complications of bypass surgery; ischemia / reperfusion injury; heart disease (including atherosclerotic heart disease), myocarditis (including chronic autoimmune myocarditis, and viral myocarditis); heart failure (chronic heart failure ( CHF), including cachexia of heart failure); myocardial infarction; restenosis after cardiac surgery; asymptomatic myocardial ischemia; complications after transplantation of left ventricular assist device; Raynaud's phenomenon; venous thrombosis; Vasculitis (including Kawasaki hepatitis); giant cell arteritis, Wegner's granulomatosis; and Schönlein-Hennoch's purpura.

さらに、本明細書中で開示されるＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは他の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、心臓血管の疾患（虚血が原因であるか、虚血以外が原因である心筋症、心筋梗塞の後の脈菅形成療法を含む）の処置、または末梢動脈疾患のための骨髄幹細胞療法または血管形成幹細胞療法と組み合わせて使用することができる。この目的のために有用である幹細胞としては、間充織幹細胞および内皮前駆細胞（例えば、脾臓、胎児の肝臓、骨髄、または循環している血液中に見られるもの）が挙げられる（米国特許第５，４８６，３６９号；Ｄｅｉｓｈｅｒ Ｔ，Ｄｒｕｇｓ ３（６）：６４９−５３（２０００）；Ｈｕｓｓ Ｒ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １８：１−９（２０００）；Ｈｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １８：２５２−６０（２０００））。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、幹細胞移植と同時に、さらには、増殖能力を有するかまたは分化能力を有する幹細胞増殖因子での処置と同時に与えられる場合もある。   In addition, TNFR2: Fc or other crystalline TNFR2 polypeptides disclosed herein are useful for cardiovascular disease (after ischemia or other than ischemia, cardiomyopathy, after myocardial infarction In combination with bone marrow stem cell therapy or angiogenic stem cell therapy for peripheral arterial disease. Stem cells that are useful for this purpose include mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells, such as those found in the spleen, fetal liver, bone marrow, or circulating blood (US Pat. Desher T, Drugs 3 (6): 649-53 (2000); Huss R, Stem Cells 18: 1-9 (2000); Huss et al., Stem Cells 18: 252-60 (No. 5,486,369); 2000)). Crystalline TNFR2 polypeptides may be given concomitant with stem cell transplantation, or even with treatment with a stem cell growth factor that has proliferative or differentiation potential.

ＴＮＦ−αおよびＩＬ−８は、化学走査性因子としてアテローム性腹部大動脈瘤に関係している（Ｓｚｅｋａｎｅｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌ ６２：１３４−１３９（１９９４））。腹部大動脈瘤は、ヒト患者においては、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを投与することによって処置することができる。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ＩＬ−８の阻害因子と組み合わせて投与することができ、このような処置には、この状態に関係している病理学的新血管形成を減少させる効果がある。   TNF-α and IL-8 have been implicated in atheromatous abdominal aortic aneurysms as chemical scanning factors (Szekanecz et al., Pathobiol 62: 134-139 (1994)). Abdominal aortic aneurysms can be treated in human patients by administering a crystalline TNFR2 polypeptide such as crystalline TNFR2: Fc. Crystalline TNFR2 polypeptides can be administered in combination with inhibitors of IL-8, and such treatment has the effect of reducing pathological neovascularization associated with this condition.

メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）が心筋の再構築および心筋線維症の鍵となる要素であることが、研究によって示されている。したがって、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、ＭＭＰの直接の阻害と組み合わせて炎症性反応とＴＮＦ−αとを阻害するために投与することにより、左心室のポンプ機能の不全のような障害を軽減、予防、またはくい止めることができる。これは、ＭＭＰ阻害因子と共に、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを同時投与することによって行われる。あるいは、左心室のポンプ機能の不全の処置には、ＭＭＰ阻害因子を同時に使用することなく、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを投与することが含まれる場合もある。   Studies have shown that metalloproteinases (MMPs) are key components of myocardial remodeling and myocardial fibrosis. Thus, administration of crystalline TNFR2 polypeptide in combination with direct inhibition of MMP to inhibit inflammatory responses and TNF-α reduces and prevents disorders such as left ventricular pump failure. Or you can stop. This is done by co-administering a crystalline TNFR2 polypeptide such as crystalline TNFR2: Fc with an MMP inhibitor. Alternatively, treatment of left ventricular pump dysfunction may include administering a crystalline TNFR2 polypeptide without the simultaneous use of an MMP inhibitor.

開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドのいずれか、または本明細書中で開示される併用療法はまた、家族性混合型高脂血症（ＦＣＨ）を処置するために使用することもできる。ＦＣＨは、早すぎる冠状動脈性心臓病を特徴とする遺伝性の異常脂質血症である。ＦＣＨ患者は、そのＴＮＦＲ ＩＩ遺伝子が遺伝的に欠損しており、その体内でのＴＮＦＲ ＩＩレベルが低く、内因性のＴＮＦ−αの悪影響に過剰に反応するようである（ｖａｎ Ｇｒｅｅｎｂｒｏｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １５３：１−８）。ＦＣＨに関係している冠状動脈の疾患、インシュリン耐性、および肥満は、ＦＣＨ患者に、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは結晶性エタナーセプトのような、本明細書中で開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドのいずれか１つを投与することによって、緩和または予防することができる。さらに、ＦＣＨについての結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドでの処置は、食事に含まれる脂肪分およびコレステロールを減らすことと同時に、ならびに／または、以下を含む、この状態を処置するために使用される１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与される場合もある：胆汁酸捕捉樹脂（コレスチルアミンおよびコレスチポール）、ニコチン酸、ナイアシン、コレステロールを低下させる薬剤（例えば、ゲムフィブロジルもしくはプロブコール、またはコレステロールを低下させる「スタチン」の１つ、またはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害因子（例えば、ロバスタチンもしくはパラバスタチン）。本発明の別の態様においては、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の高い血清濃度を有しており、したがって、そのコレステロール値が低い場合でも心臓発作の危険がある患者を処置するために使用される（Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３４４：１９５９−１９６５）。   Any of the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, or the combination therapies disclosed herein, can also be used to treat familial mixed hyperlipidemia (FCH). FCH is an inherited dyslipidemia characterized by premature coronary heart disease. Patients with FCH are genetically deficient in their TNFR II gene, have low levels of TNFR II in their bodies, and appear to overreact to the adverse effects of endogenous TNF-α (van Greenbroek et al.,). 2000, Atherosclerosis 153: 1-8). Coronary artery disease, insulin resistance, and obesity related to FCH may cause any of the crystalline TNFR2 polypeptides disclosed herein, such as crystalline TNFR2: Fc or crystalline etanercept, to FCH patients. Administration of either one can alleviate or prevent. Further, treatment with crystalline TNFR2 polypeptide for FCH may be performed simultaneously with reducing dietary fat and cholesterol and / or one or more used to treat this condition, including: May also be administered in combination with other drugs: bile acid scavenging resins (cholestylamine and colestipol), nicotinic acid, niacin, cholesterol lowering drugs (eg, gemfibrozil or probucol, or cholesterol lowering “statins” Or an HMG-CoA reductase inhibitor (eg, lovastatin or paravastatin). In another aspect of the invention, the crystalline TNFR2 polypeptide has a high serum concentration of C-reactive protein (CRP). And therefore Value of cholesterol are used for treating patients at risk of heart attack or low (Ridker et al, 2001, New Eng J Med 344:. 1959-1965).

（感染および損傷）
開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、本明細書中に記載されている組成物および／または併用療法は、細菌、ウイルス、原虫による感染、ならびにそれらによって生じる合併症を処置するための医薬品において有用である。１つのそのような疾患は、マイコプラズマ肺炎である。さらに、ＡＩＤＳおよび関連する状態、例えば、ＡＩＤＳによる認知症、ＡＩＤＳによる消耗、抗レトロウイルス療法が原因で生じるリピディストロフィー（ｌｉｐｉｄｉｓｔｒｏｐｈｙ）；およびカポジ肉腫を処置するために、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを使用することが、本明細書中で提供される。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、原虫に関係する疾患（マラリア（脳マラリアを含む）および住血吸虫症を含む）を処置するために使用することが、本明細書中で提供される。さらに、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、癩性結節性紅斑；細菌性またはウイルス性髄膜炎；結核症（肺結核を含む）；および細菌またはウイルスによる感染に対する二次的な肺炎を処置するために使用することも、提供される。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、回帰熱ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）によって引き起こされるような、シラミによって媒介される回帰熱を処置するための医薬品を調製するために使用することもまた、本明細書中で提供される。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、また、ヘルペスウイルスによって引き起こされる状態、例えば、ヘルペスによる間質性角膜炎、角膜病変、およびウイルスによって誘導される角膜の障害を処置するための医薬品を調製するために使用することもできる。さらに、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ヒトのパピローマウイルスによる感染を処置することにおいて、ならびに、感染性単核球症を処置することにおいて使用することができる。また、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、インフルエンザを処置するための、ならびに、重症疾患多発性神経障害および筋障害（ＣＩＰＮＭ）、長引く伝染性疾患と組み合わせて時折生じる炎症症候群を処置するための医薬品を調製するために使用される。本発明の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、また、プリオンによって媒介されると考えられている、感染性海綿状脳症を処置するためにも使用される。 (Infection and damage)
The disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions and / or combination therapies described herein are useful in pharmaceuticals to treat bacterial, viral, protozoal infections, and complications resulting therefrom. is there. One such disease is mycoplasma pneumonia. In addition, crystalline TNFR2 polypeptides are used to treat AIDS and related conditions such as AIDS dementia, AIDS exhaustion, lipidosis resulting from antiretroviral therapy; and Kaposi's sarcoma It is provided herein that It is provided herein that the crystalline TNFR2 polypeptide is used to treat diseases associated with protozoa, including malaria (including brain malaria) and schistosomiasis. In addition, crystalline TNFR2 polypeptides are used to treat erythema nodosum erythema; bacterial or viral meningitis; tuberculosis (including pulmonary tuberculosis); and secondary pneumonia against infection by bacteria or viruses It is also provided to do. Also provided herein is the use of a crystalline TNFR2 polypeptide to prepare a medicament for treating lice-mediated reversal fever, such as that caused by recurrent fever Borrelia. Is done. Crystalline TNFR2 polypeptides are also used to prepare medicinal products for treating conditions caused by herpes viruses, eg, interstitial keratitis due to herpes, corneal lesions, and corneal disorders induced by viruses. You can also Furthermore, crystalline TNFR2 polypeptides can be used in treating infection by human papillomavirus, as well as in treating infectious mononucleosis. Crystalline TNFR2 polypeptides also prepare pharmaceuticals to treat influenza and to treat occasional inflammatory syndromes in combination with severe illness polyneuropathy and myopathy (CIPNM), prolonged infectious diseases Used to do. The crystalline TNFR2 polypeptides of the present invention are also used to treat infectious spongiform encephalopathy, which is believed to be mediated by prions.

開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、その薬学的組成物、および／または併用療法のいずれかで処置することができる別の障害は、熱帯性対麻痺／ＨＴＬＶ−１関連ミエロパシー（ＴＳＰ／ＨＡＭ）である。この疾患は、ヒトレトロウイルスＨＴＬＶ−１への感染によって引き起こされる。最近の研究は、ＴＮＦ−αがＨＴＬＶに感染した細胞によって示されるグルタミンの取り込みの減少において役割を果たしていることを示唆している（Ｓｚｙｍｏｃｈａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４：６４３３−６４４１）。ＴＳＰ／ＨＡＭは、肢が弱くなることと、肢の筋肉の硬直を引き起こす脊髄のゆっくりと進行する状態であり、多くの場合は、足の感覚が失われることが伴う。この状態に対する既知の処置には、コルチコステロイドおよび血漿交換法が含まれる。ＴＳＰ／ＨＡＭは、本明細書中に開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドのいずれかで処置することができる。本明細書中に開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドのいずれかは、コルチコステロイドまたは血漿交換法と、あるいは両方と同時に投与することができる。ＴＳＰ／ＨＡＭを処置するための例示的な結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃである。処置が十分であることは、肢の硬直の改善について患者をモニターすること、または患者の悪化の停止によって、あるいは、患者の医師によって適切であると考えられる任意の他の手段によって決定される。   Another disorder that can be treated with any of the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, pharmaceutical compositions thereof, and / or combination therapy is tropical paraplegia / HTLV-1-related myelopathy (TSP / HAM) is there. This disease is caused by infection with the human retrovirus HTLV-1. Recent studies suggest that TNF-α plays a role in reducing glutamine uptake exhibited by cells infected with HTLV (Szymocha et al., 2000, J Virol 74: 6433-6441). TSP / HAM is a slowly progressing state of the spinal cord that causes weakness of the limbs and stiffness of the limb muscles, often accompanied by a loss of sensation in the foot. Known treatments for this condition include corticosteroids and plasma exchange methods. TSP / HAM can be treated with any of the crystalline TNFR2 polypeptides disclosed herein. Any of the crystalline TNFR2 polypeptides disclosed herein can be administered concurrently with corticosteroids or plasma exchange methods, or both. An exemplary crystalline TNFR2 polypeptide for treating TSP / HAM is crystalline TNFR2: Fc. Sufficient treatment is determined by monitoring the patient for improved limb stiffness, or by stopping the patient's worsening, or by any other means deemed appropriate by the patient's physician.

開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法によって処置することができる他の状態としては、頭部または脊髄の損傷によって生じる、頭部の外傷が原因である硬膜下血腫を含む状態が挙げられる。   Other conditions that can be treated by the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies include subdural hematoma caused by head trauma caused by head or spinal cord injury The state containing is mentioned.

（神経疾患、疼痛、および熱）
頚椎性頭痛は、頸部の機能異常が原因で生じる頭痛の一般的な形態であり、これは、高いレベルのＴＮＦ−αと関係している。ＴＮＦ−αは、患者の不快感に関係している炎症性の状態を媒介すると考えられている（Ｍａｒｔｅｌｌｅｔｔｉ，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １８（２ Ｓｕｐｐｌ １９）：Ｓ３３−８（Ｍａｒ−Ａｐｒ，２０００）。頚椎性頭痛は、本明細書中に開示されているような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを投与することによって処置することができ、これにより、炎症反応とそれに伴う頭痛の痛みが軽減する。 (Neuropathy, pain, and fever)
Cervical spine headache is a common form of headache caused by cervical dysfunction, which is associated with high levels of TNF-α. TNF-α is believed to mediate inflammatory conditions that are associated with patient discomfort (Marteletti, Clin Exp Rheumatol 18 (2 Suppl 19): S33-8 (Mar-Apr, 2000). Sexual headache can be treated by administering a crystalline TNFR2 polypeptide as disclosed herein, which reduces the inflammatory response and associated headache pain.

さらに、本発明の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法は、慢性的な痛みの状態、例えば、慢性的な骨盤痛（慢性的な前立腺炎／骨盤痛症候群を含む）を処置するために使用される。さらなる例として、本発明の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法は、ヘルペスの後の痛みを処置するために使用される。   Furthermore, the crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies of the present invention treat chronic pain conditions such as chronic pelvic pain (including chronic prostatitis / pelvic pain syndrome). Used to do. As a further example, the crystalline TNFR2 polypeptide, composition, and / or combination therapy of the present invention is used to treat pain after herpes.

本発明の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法は、原発性アミロイドーシスを処置するために有用である。さらに、種々の状態を特徴とする二次性アミロイドーシスもまた、本明細書中に記載されている、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、ならびに組成物および／または併用療法を用いて処置することができる。このような状態としては、アルツハイマー病、二次的な反応性アミロイドーシス、ダウン症、および透析によるアミロイドーシスが挙げられる。遺伝性間欠熱症候群（家族性地中海熱、超免疫グロブリンＤおよび間欠熱症候群、ならびにＴＮＦ受容体による間欠熱症候群（ＴＲＡＰＳ）を含む）もまた、本発明の化合物、組成物、および／または併用療法を用いて処置することができる。   The crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies of the present invention are useful for treating primary amyloidosis. In addition, secondary amyloidosis characterized by various conditions also uses crystalline TNFR2 polypeptides, such as crystalline TNFR2: Fc, and compositions and / or combination therapies described herein. Can be treated. Such conditions include Alzheimer's disease, secondary reactive amyloidosis, Down's syndrome, and amyloidosis by dialysis. Hereditary intermittent fever syndrome (including familial Mediterranean fever, hyperimmunoglobulin D and intermittent fever syndrome, and intermittent fever syndrome with TNF receptor (TRAPS)) are also compounds, compositions, and / or combination therapies of the present invention. Can be used to treat.

開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法はさらに、急性の多発性神経障害；拒食症；顔面麻痺；慢性疲労症候群；伝染性認知症（クロイツフェルトヤコブ病を含む）；脱髄性ニューロパシー；ギラン・バレー症候群；椎間板の疾患；湾岸戦争病；重症筋無力症；無症候性脳虚血；睡眠障害（発作性睡眠および睡眠時無呼吸を含む）；慢性神経変性；および発作（脳の虚血疾患を含む）を処置するために有用である。   The disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies further include acute polyneuropathy; anorexia; facial paralysis; chronic fatigue syndrome; contagious dementia (including Creutzfeldt-Jakob disease); Demyelinating neuropathy; Guillain-Barre syndrome; intervertebral disc disease; Gulf War disease; myasthenia gravis; asymptomatic cerebral ischemia; sleep disorders (including paroxysmal sleep and sleep apnea); chronic neurodegeneration; Useful for treating stroke (including cerebral ischemic disease).

（腫瘍性疾患および血液疾患）
種々の腫瘍性疾患および血液疾患を処置するために結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法を使用するための方法が、本明細書中で提供される。例えば、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、急性骨髄性白血病、エプスタインバーウイルス陽性鼻咽頭ガン、胆嚢ガン、神経膠腫、結腸癌、胃ガン、前立腺ガン、腎細胞ガン、子宮頸ガンおよび卵巣ガン、肺ガン（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）（ガンに関係する吐き気、ガンに関係する悪液質、倦怠感、衰弱、悪液質および高カルシウム血症の腫瘍随伴症候群を含む）を含む種々の形態のガンを処置するために使用される。本発明の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法を用いて処置することができるさらなる疾患は、充実性腫瘍（肉腫、骨肉腫、およびガン腫、例えば、腺ガン（例えば、乳ガン）、および扁平上皮ガンを含む）である。さらに、本発明の化合物、組成物、および／または併用療法は、白血病（慢性または急性骨髄性白血病、慢性または急性リンパ芽球性白血病、および毛様細胞白血病を含む）を処置するために有用である。侵襲性の転移の可能性がある他の悪性腫瘍を、本発明の化合物、組成物、および／または併用療法を用いて処置することができ、これには、多発性骨髄腫が含まれる。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドが腫瘍を処置するために使用される場合は、この処置は、処置される特定の腫瘍上で高いレベルで発現される膜タンパク質を標的とする抗体と組み合わせて投与される。例えば、乳ガン、卵巣ガン、および前立腺ガンのような腫瘍、または他のＨｅｒ２陽性腫瘍には、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは他の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対する抗体、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（一般的には、「トラツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂｕ）」；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．として知られている）と組み合わせて投与することができる。ガン（例えば、卵巣ガンまたは前立腺ガン）は、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドと、インターフェロン−γとの同時投与によって処置することができる（Ｗｉｎｄｂｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８２：１１３８−１１４４）。 (Neoplastic and blood diseases)
Provided herein are methods for using crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies to treat various neoplastic and hematological diseases. For example, crystalline TNFR2 polypeptide is found in acute myeloid leukemia, Epstein-Barr virus positive nasopharyngeal cancer, gallbladder cancer, glioma, colon cancer, stomach cancer, prostate cancer, renal cell cancer, cervical cancer and ovarian cancer, lung Treat various forms of cancer, including cancer (SCLC and NSCLC) (including cancer-related nausea, cancer-related cachexia, malaise, weakness, cachexia and hypercalcemic associated tumors) Used to do. Additional diseases that can be treated using the crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies of the present invention include solid tumors (sarcomas, osteosarcomas, and carcinomas such as adenocarcinoma (eg, breast cancer). ), And squamous cell carcinoma). Furthermore, the compounds, compositions, and / or combination therapies of the present invention are useful for treating leukemia (including chronic or acute myeloid leukemia, chronic or acute lymphoblastic leukemia, and hairy cell leukemia). is there. Other malignancies with potential for invasive metastases can be treated using the compounds, compositions, and / or combination therapies of the present invention, including multiple myeloma. When a crystalline TNFR2 polypeptide is used to treat a tumor, the treatment is administered in combination with an antibody that targets membrane proteins that are expressed at high levels on the particular tumor being treated. For example, for tumors such as breast cancer, ovarian cancer, and prostate cancer, or other Her2-positive tumors, crystalline TNFR2: Fc or other crystalline TNFR2 polypeptide may be added to an antibody against Her2 / neu, eg HERCEPTIN (Trade mark) (generally “trastuzumabu”; known as Genentech, Inc.). Cancer (eg, ovarian cancer or prostate cancer) can be treated by co-administration of a crystalline TNFR2 polypeptide, such as crystalline TNFR2: Fc, and interferon-γ (Windbichler et al., 2000, British J Cancer 82: 1138-1144).

種々のリンパ増殖性疾患もまた、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法を用いて処置することができる。これらには、自己免疫性リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、慢性リンパ芽球性白血病、毛様細胞白血病、慢性リンパ性白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、エプスタインバーウイルス陽性Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、ホジキン病、びまん性侵攻性リンパ腫、急性リンパ性白血病、Ｔγリンパ増殖性疾患、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（すなわち、菌状息肉腫）、およびセザリー症候群が挙げられるが、これらに限定されない。   Various lymphoproliferative diseases can also be treated using the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies. These include autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS), chronic lymphoblastic leukemia, ciliary cell leukemia, chronic lymphocytic leukemia, peripheral T cell lymphoma, small lymphocytic lymphoma, mantle cell lymphoma, follicular Lymphoma, Burkitt lymphoma, Epstein-Barr virus positive T cell lymphoma, histiocytic lymphoma, Hodgkin's disease, diffuse aggressive lymphoma, acute lymphocytic leukemia, Tγ lymphoproliferative disease, cutaneous B cell lymphoma, cutaneous T cell lymphoma (ie , Mycosis fungoides), and Sezary syndrome.

さらに、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法を、慢性疾患による貧血、再生不良性貧血（ファンコニ再生不良性貧血を含む）；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；骨髄異形成症候群（不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、過剰な芽球を伴う不応性貧血、形質転換の際の過剰な芽球を伴う不応性貧血を含む）；骨髄線維症／骨髄様化生；および鎌状赤血球血管障害（ｓｉｃｌｅ ｃｅｌｌ ｖａｓｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｃｒｉｓｉｓ）を含む、貧血症および血液疾患を処置するために使用することができる。さらに、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、慢性特発性好中球減少症の処置に有用である。   Further, the disclosed crystalline TNFR2 polypeptide, composition, and / or combination therapy may be used to treat chronic disease anemia, aplastic anemia (including Fanconi aplastic anemia); idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) Myelodysplastic syndrome (including refractory anemia, refractory anemia with cyclic iron blasts, refractory anemia with excessive blasts, refractory anemia with excessive blasts upon transformation); bone marrow fibers Can be used to treat anemia and hematological disorders, including sickness / myeloplasia; and sickle cell vasoclusive crisis. In addition, crystalline TNFR2 polypeptides such as crystalline TNFR2: Fc are useful for the treatment of chronic idiopathic neutropenia.

結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドと１つ以上の抗血管形成因子の組み合わせを、充実性腫瘍を処置するために使用することができ、それによって、腫瘍組織に栄養を与える脈菅形成を減少させることができる。このような併用療法に適している抗血管形成因子としては、ＩＬ−８阻害因子、アンギオスタチン、エンドスタチン、クリングル５、脈菅内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の阻害因子、アンジオポエチン−２またはアンジオポエチン−１の他のアンタゴニスト、血小板活性化因子のアンタゴニスト、塩基性線維芽細胞成長因子のアンタゴニストが挙げられる。脈菅内皮成長因子に対する抗体、例えば、組み換えのヒト化抗ＶＥＧＦ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、「ベバシツマブ(ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ)」；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．として一般的に知られている）が、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドとの併用療法に有用である。   A combination of crystalline TNFR2 polypeptide and one or more anti-angiogenic factors can be used to treat solid tumors, thereby reducing vasculogenesis that nourishes tumor tissue . Anti-angiogenic factors suitable for such combination therapy include IL-8 inhibitor, angiostatin, endostatin, kringle 5, vascular endothelial growth factor (VEGF) inhibitor, angiopoietin-2 or angiopoietin-1. Other antagonists, platelet activating factor antagonists, basic fibroblast growth factor antagonists. Antibodies against vascular endothelial growth factor, such as recombinant humanized anti-VEGF (AVASTIN®, “bevacizumab”; commonly known as Genentech, Inc.), are crystalline TNFR2: Fc Are useful in combination therapy with crystalline TNFR2 polypeptides such as

本発明の１つの実施形態においては、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドが、プロテアソーム阻害因子と組み合わせてガン患者に投与される。これには、血液のガンまたは充実性腫瘍に罹患している患者に対する投与が含まれる。プロテアソームは、細胞周期およびアポトーシスに関係している種々のタンパク質、例えば、サイクリンおよびＮＦ−κＢの安定性を制御する（例えば、Ｓｃｈｅｎｋｅｉｎ，２００２，Ｃｌｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ３：４９−５５およびＡｄａｍｓ，２００２，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｎｃｏｌ １４：６２８−６３４を参照のこと）。プロテアソーム阻害因子はアポトーシスを誘導することができ、したがって、他の抗ガン剤に対してガン細胞を感作することができる。本発明の組み合わせについての例示的なプロテアソーム阻害因子としては、例えば、カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシナル（ＭＧ１３２）、クラストラクタシスチンβ−ラクトン（Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）、カルボベンゾキシ−Ｌ−イソロイシル−（γ）−ｔ−ブチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシナル（ＰＳＩ）、Ｎ−アセチル−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ノルロイシナル（ＡＬＬＮ）、ＭＬＮ５１９（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、［（１Ｒ）−３−メチル−１−［［（２Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−２−［ピラジニルカルボニル］アミノ］プロピル］−アミノ］ブチル］ボロン酸（ＰＳ−３４１、「ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）」、商品名ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標)（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）として一般に知られている）、およびカルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ノルバリナル（ＭＧ１１５；Ａｆｆｉｎｉｔｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が挙げられる。例えば、多発性骨髄腫、卵巣ガン、前立腺ガン、乳ガン、悪性血液疾患（例えば、リンパ腫または白血病）、あるいは他の腫瘍は、ＰＳ−３４１のようなプロテアソーム阻害因子、および結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃもしくは結晶性エタナーセプトのような、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドで同時に処置することができる。   In one embodiment of the invention, a crystalline TNFR2 polypeptide such as crystalline TNFR2: Fc is administered to a cancer patient in combination with a proteasome inhibitor. This includes administration to patients suffering from blood cancer or solid tumors. The proteasome controls the stability of various proteins involved in the cell cycle and apoptosis, such as cyclin and NF-κB (eg, Schenkein, 2002, Clin Lymphoma 3: 49-55 and Adams, 2002, Curr Opin Oncol 14: 628-634). Proteasome inhibitors can induce apoptosis and thus sensitize cancer cells to other anticancer agents. Exemplary proteasome inhibitors for the combinations of the present invention include, for example, carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal (MG132), class tractactistin β-lactone (AG Scientific, Inc. .), Carbobenzoxy-L-isoleucyl- (γ) -t-butyl-L-glutamyl-L-alanyl-L-leucinal (PSI), N-acetyl-leu-leu-norleucinal (ALLN), MLN519 (Millennium) Pharmaceuticals), [(1R) -3-methyl-1-[[(2S) -1-oxo-3-phenyl-2- [pyrazinylcarbonyl] amino] propyl] -amino] butyl] boronic acid (PS- 341, “bortezomib”, Name Velcade (R) is commonly known as (Millennium Pharmaceuticals)), and carbobenzoxy -L- leucyl -L- leucyl -L- Norubarinaru (MG115; Affiniti Research Products) can be mentioned. For example, multiple myeloma, ovarian cancer, prostate cancer, breast cancer, hematologic malignancies (eg, lymphoma or leukemia), or other tumors, such as proteasome inhibitors such as PS-341, and crystalline TNFR2: Fc or crystals It can be treated simultaneously with a crystalline TNFR2 polypeptide, such as sex etanercept.

特定の療法による望ましくない副作用は、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドで処置することができる。このような副作用は、いくつかの例においては、高いＴＮＦ−αレベルによって媒介され、このような患者は、ＴＮＦ−αのレベルを低下させる薬剤での処置による恩恵を受けることができる。例えば、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、化学療法に伴う吐き気、または他の薬剤によって誘導される吐き気の治療を助けるために投与することができる。さらに、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、脳腫瘍の放射性治療に伴う放射線によって誘導される脳の損傷を処置するために使用される。さらに、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、特定の種のガン細胞の表面上に存在する抗原に対して指向させられたモノクローナル抗体の投与に伴う毒性を処置するために使用される。例えば、本明細書中で開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ＣＡＭＰＡＴＨ１−Ｈ（登録商標）（「アレンツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）」、Ｂｅｒｌｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓとして一般的に知られている；ＥＰ０３２８４０４Ａ１もまたを参照のことのこと）の注入に伴う毒性を処置するために使用することができる。ＣＡＭＰＡＴＨ１−Ｈ（登録商標）は、慢性リンパ球性白血病を処置するために使用される。ＣＡＭＰＡＴＨ１−Ｈは、単球、Ｂ細胞、およびＴ細胞上に見られる細胞表面抗原であるＣＤ５２に特異的なヒト化抗体である。本発明の別の実施形態においては、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは結晶性エタナーセプトのような開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、長期間にわたるインターフェロン療法に関係する自己免疫障害を緩和するために投与することができる。   Undesirable side effects from certain therapies can be treated with crystalline TNFR2 polypeptides such as crystalline TNFR2: Fc. Such side effects are, in some instances, mediated by high TNF-α levels, and such patients can benefit from treatment with agents that reduce TNF-α levels. For example, a crystalline TNFR2 polypeptide such as crystalline TNFR2: Fc can be administered to help treat nausea associated with chemotherapy or nausea induced by other drugs. In addition, crystalline TNFR2 polypeptides are used to treat brain damage induced by radiation associated with radiotherapy of brain tumors. In addition, crystalline TNFR2 polypeptides are used to treat the toxicity associated with the administration of monoclonal antibodies directed against antigens present on the surface of certain types of cancer cells. For example, the crystalline TNFR2 polypeptide disclosed herein is commonly known as CAMPATH1-H® (“Alemtumumab”, Berlex Laboratories; see also EP0328404A1 Can be used to treat the toxicity associated with infusions. CAMPATH1-H® is used to treat chronic lymphocytic leukemia. CAMPATH1-H is a humanized antibody specific for CD52, a cell surface antigen found on monocytes, B cells, and T cells. In another embodiment of the invention, a disclosed crystalline TNFR2 polypeptide, such as crystalline TNFR2: Fc or crystalline etanercept, is administered to alleviate autoimmune disorders associated with long-term interferon therapy. be able to.

結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、長期間にわたるインターフェロンの投与に伴う望ましくない副作用を減少させるために、ガン患者に投与することができる。望ましくない副作用としては、疲労、発熱、好中球減少、発疹、頭痛、消化器疾患、肝臓の酵素のバランスが崩れることなどを挙げることができる。例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、卵巣ガンに有効であることが示されており、しがたって、卵巣ガンの患者は、ＩＦＮγと、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは結晶性エタナーセプトのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを同時に投与することによって処置することができる。同様に、ＩＦＮαは、多くの場合、黒色腫、慢性骨髄性白血病、基底細胞ガン、毛様細胞白血病、膀胱ガン、乳児および幼児の血管腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、菌状息肉腫、非ホジキンリンパ腫、および腎細胞ガンを処置するために使用され、インターフェロンによって誘導される副作用を減少させるために、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドと同時に投与することができる。   Crystalline TNFR2 polypeptides can be administered to cancer patients to reduce undesirable side effects associated with long-term administration of interferon. Undesirable side effects include fatigue, fever, neutropenia, rash, headache, gastrointestinal disease, and loss of liver enzyme balance. For example, interferon gamma (IFNγ) has been shown to be effective in ovarian cancer, and thus patients with ovarian cancer have IFNγ and crystalline TNFR2 such as crystalline TNFR2: Fc or crystalline etanercept. Treatment can be by administering the polypeptides simultaneously. Similarly, IFNα is often melanoma, chronic myelogenous leukemia, basal cell cancer, ciliary cell leukemia, bladder cancer, infant and infantile hemangioma, multiple myeloma, Kaposi's sarcoma, mycosis fungoides, Used to treat non-Hodgkin's lymphoma and renal cell carcinoma and can be co-administered with a crystalline TNFR2 polypeptide such as crystalline TNFR2: Fc to reduce the side effects induced by interferon.

さらに、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、低分子に結合することができ、塩基性分子に優先的に結合するタンパク質である、α−１酸糖タンパク質（ＡＧＰ）に結合される薬剤に対する薬剤耐性を生じることを防ぐか、またはそのような薬剤耐性を緩和するためにも使用することができる。ＡＧＰは、種々の病的状態（慢性的な炎症、心筋梗塞、およびガンを含む）において増大する急性期タンパク質である。ＳＴＩ５７１（Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標）、「イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）」（Ｎｏｖａｒｉｔｉｓ）として一般的に知られている）は、Ｂｃｒ−Ａｂ１およびＣ−ｋｉｔキナーゼ活性について有効な阻害因子であり、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の処置に有用である。ＣＭＬのマウスモデルの研究により、ＡＧＰがイマチニブに結合してこれを不活化させ、したがって、この薬剤に対する耐性を生じることが示されている（Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎ Ｉｎｓｔ ９２：１６４１−１６５０）。患者のＡＧＰのレベルは、ペントキシフィリンを投与することによって下げることができる（Ｖｏｉｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７５：Ｒ１４１２−Ｒ１４１９）。本発明により、イマチニブに対する耐性を防ぐかまたはそのような耐性を減少させる方法が提供される。この方法は、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは結晶性エタナーセプトのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、イマチニブでの処置を受けるＣＭＬ患者に同時に投与することによる。ＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）は、消化器腫瘍および他の充実性腫瘍を処置するために使用される薬剤であり、これもまた、ＡＧＰに結合する傾向も有する（Ｓｅｎｄｅｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９２（５）：３７６−３８７）；Ｎｏｒｉａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃ Ｂｕｌｌ ２３（７）：８９３−８９５；Ｆｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９（５）；１０５４−１０６０；Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ａｎｎｕ Ｍｅｅｔ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １８：Ａ６１１）。結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、ＵＣＮ−０１で同時に処置される消化器ガンの患者に投与することによって、ＡＧＰに対するＵＣＮ−０１の結合を妨げるかまたは減少させ、それによって、ＵＮＣ−０１での処置の有効性を増大させるための方法が、本明細書中に提供される。あるいは、イマチニブまたはＵＣＮ−０１を投与された患者を、ＩＬ−１阻害因子または結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、ＩＬ−１阻害因子、例えば、ＷＯ０１／８７３２８（これは、引用によりその全体が本明細書中に組み入れられる）に記載されているＩＬ−１阻害因子の１つとともに同時投与することによって処置することができる。これらの方法については、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、１週間に１回以上、例えば、１週間に１回、２回、または３回投与することができる。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの投与についての他の適切な態様は、皮下注射である。患者が成人である場合には、注射される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドについての適切な用量としては、５〜１２ｍｇ／ｍ^２体表面積、または２５ｍｇ、または５０ｍｇ／用量が挙げられる。患者が小児科の患者である場合は、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、皮下注射によって、１週間に１回以上、０．４ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、最大で２５ｍｇ／用量までを投与することができる。 In addition, crystalline TNFR2 polypeptides can bind to small molecules and produce drug resistance to drugs bound to alpha-1 acid glycoprotein (AGP), a protein that binds preferentially to basic molecules. It can also be used to prevent or alleviate such drug resistance. AGP is an acute phase protein that increases in a variety of pathological conditions, including chronic inflammation, myocardial infarction, and cancer. STI571 (Glivec®, commonly known as “imatinib” (Novaritis)) is an effective inhibitor of Bcr-Ab1 and C-kit kinase activity, and chronic myeloid leukemia ( It is useful for the treatment of CML). Studies of mouse models of CML have shown that AGP binds to and inactivates imatinib, thus creating resistance to this drug (Gambacorti-Passerini et al. 2000, J Natl Can Inst 92: 1641-1650). The patient's AGP level can be lowered by administering pentoxifylline (Voisin et al., 1998, Am J Physiol 275: R1412-R1419). The present invention provides methods for preventing or reducing such resistance to imatinib. This method is by simultaneously administering a crystalline TNFR2 polypeptide, such as crystalline TNFR2: Fc or crystalline etanercept, to a CML patient undergoing treatment with imatinib. UCN-01 (7-hydroxystaurosporine) is an agent used to treat gastrointestinal and other solid tumors, which also has a tendency to bind to AGP (Senderowicz et al. , 2000, J Natl Cancer Inst 92 (5): 376-387); Noraki et al. Biol Pharma Bull 23 (7): 893-895; Fuse et al. 1999, Cancer Res 59 (5); 1054-1060; Tamura et al. 1999, Proc. Annu Meet Am Soc Clin Oncol 18: A611). By administering a crystalline TNFR2 polypeptide, such as crystalline TNFR2: Fc, to a patient with gastrointestinal cancer that is co-treated with UCN-01, thereby preventing or reducing the binding of UCN-01 to AGP, thereby Provided herein are methods for increasing the effectiveness of treatment with UNC-01. Alternatively, patients who have received imatinib or UCN-01 are treated with an IL-1 inhibitor or a crystalline TNFR2 polypeptide and an IL-1 inhibitor such as WO01 / 87328 (which is hereby incorporated by reference in its entirety. Can be treated by co-administration with one of the IL-1 inhibitors described in). For these methods, the crystalline TNFR2 polypeptide can be administered one or more times per week, for example once, twice, or three times per week. Another suitable embodiment for the administration of crystalline TNFR2 polypeptide is subcutaneous injection. If the patient is an adult, suitable doses for injected crystalline TNFR2 polypeptide include 5-12 mg / m ² body surface area, or 25 mg, or 50 mg / dose. If the patient is a pediatric patient, the crystalline TNFR2 polypeptide can be administered by subcutaneous injection at a dose of 0.4 mg / kg body weight at least once a week, up to a maximum of 25 mg / dose. .

（肺疾患）
多数の肺疾患もまた、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法で処置することができる。１つのこのような状態は、成人の急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）である。これは、高いＴＮＦ−αに関係しており、毒性化合物との接触、膵炎、外傷、または他の原因を含む種々の原因によって引き起こされ得る。開示される本発明の化合物、組成物、および／または併用療法は、また、気管支−肺形成不全（ＢＰＤ）；リンパ管平滑筋腫症；高圧肺；早産児の慢性繊維性肺疾患；および特発性気管支拡張症の処置に有用である。特発性気管支拡張症は、好中球によって気管支マトリックスのプロテオグリカン成分の分解が媒介される疾患である。気管支拡張症患者の気管支分泌物中のプロ炎症性媒介因子、具体的には、ＴＮＦ−αは、これらの好中球の分解作用を増強すると疑われる（Ｓｈｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １６２：１９２５−３１（２０００））。本発明により、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを投与することを含む、特発性気管支拡張症の処置が提供される。さらに、本発明の化合物、組成物、および／または併用療法は、石綿症、炭坑労働者塵肺、珪肺症、または、微粒子に長期間さらされることに関係する同様の状態を含む職業性肺疾患を処置するために使用される。本発明の他の態様においては、開示される化合物、組成物、および／または併用療法は、慢性気管支炎または肺気腫を伴う慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む肺疾患；嚢胞性線維症、特発性肺線維症、および放射線によって誘導される肺線維症のような繊維性の肺疾患；肺サルコイドーシスを含むサルコイドーシス；およびアレルギー性リウマチ、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、および喘息を含むアレルギーを処置するために使用される。 (Lung disease)
A number of pulmonary diseases can also be treated with the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies. One such condition is adult acute respiratory distress syndrome (ARDS). This is associated with elevated TNF-α and can be caused by a variety of causes including contact with toxic compounds, pancreatitis, trauma, or other causes. The disclosed compounds, compositions and / or combination therapies of the present invention also include broncho-pulmonary dysplasia (BPD); lymphangioleiomyomatosis; high-pressure lung; chronic fibrotic lung disease in preterm infants; and idiopathic Useful for the treatment of bronchiectasis. Idiopathic bronchiectasis is a disease in which neutrophils mediate the degradation of the proteoglycan component of the bronchial matrix. Pro-inflammatory mediators in bronchial secretions of patients with bronchiectasis, specifically TNF-α, are suspected to enhance the degrading action of these neutrophils (Shum et al., Am J Respir Crit Care Med 162: 1925-31 (2000)). The invention provides for the treatment of idiopathic bronchiectasis comprising administering a crystalline TNFR2 polypeptide such as crystalline TNFR2: Fc. Further, the compounds, compositions, and / or combination therapies of the present invention may prevent occupational lung disease, including asbestosis, coal miner pneumoconiosis, silicosis, or similar conditions related to prolonged exposure to particulates. Used to treat. In other aspects of the invention, the disclosed compounds, compositions, and / or combination therapies are pulmonary diseases including chronic bronchitis or chronic obstructive pulmonary disease (COPD) with emphysema; cystic fibrosis, idiopathic Treats pulmonary fibrosis and fibrotic lung diseases such as radiation-induced pulmonary fibrosis; sarcoidosis including pulmonary sarcoidosis; and allergies including allergic rheumatism, contact dermatitis, atopic dermatitis, and asthma Used to do.

嚢胞性線維症は、多量の粘液の蓄積を主な特徴とする遺伝性の状態であり、この患者は、慢性的な肺の感染、および膵臓の閉塞になりやすく、その結果、栄養の吸収不良や栄養失調を生じる。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、嚢胞性線維症を処置するために投与される場合もある。所望される場合は、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドでの処置は、吸入される組み換えのデオキシリボヌクレアーゼＩ（例えば、ＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）または吸入されるトブラマイシン（ＴＯＢＩ（登録商標）；Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．）のような粘膜を薄くする薬剤であるコルチコステロイドと同時に投与することができる。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドはまた、修正遺伝子治療、嚢胞性線維症細胞が塩化物を分泌するように刺激する薬剤、または他のまだ発表されていない処置と同時に投与することができる。処置が十分であることは、例えば、唾液または肺の洗浄液中の病原性生物（例えば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））の数の減少を観察することによって、体重の増加について患者をモニターすることによって、肺の能力の増大を検出することによって、または任意の他の便利な手段によって評価することができる。   Cystic fibrosis is an inherited condition primarily characterized by the accumulation of large amounts of mucus, and this patient is prone to chronic lung infection and pancreatic obstruction, resulting in poor malabsorption Cause malnutrition. Crystalline TNFR2 polypeptide may be administered to treat cystic fibrosis. If desired, treatment with crystalline TNFR2 polypeptide can be achieved by inhaled recombinant deoxyribonuclease I (eg, PULMOZYME®; Genentech, Inc.) or inhaled tobramycin (TOBI®); And can be administered simultaneously with corticosteroids, which are agents that thin the mucosa, such as Pathogenesis, Inc.). Crystalline TNFR2 polypeptides can also be administered concurrently with modified gene therapy, agents that stimulate cystic fibrosis cells to secrete chloride, or other unpublished treatments. Sufficient treatment is, for example, the number of pathogenic organisms (eg Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, and Pseudomonas aeruginosa) in saliva or lung lavage fluid It can be assessed by observing the decrease, by monitoring the patient for weight gain, by detecting an increase in lung capacity, or by any other convenient means.

結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、またはサイトカインＩＦＮγ−１ｂ（例えば、ＡＣＴＩＭＭＵＮＥ（登録商標）；ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）と組み合わせた結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを、嚢胞性線維症または繊維性の肺疾患、例えば、特発性肺線維症、放射線によって誘導される肺線維症、およびブレオマイシンによって誘導される肺線維症を処置するために使用することができる。さらに、この組み合わせは、全身性硬化症（「強皮症」とも呼ばれる）（これには、多くの場合、肝臓の線維症が含まれる）を含む臓器の線維症を特徴とする他の疾患を処置するために有用である。嚢胞性線維症を処置するためには、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドおよびＩＦＮγ−１ｂを、ＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（登録商標）またはＴＯＢＩ（登録商標）または嚢胞性線維症についての他の処置と組み合わせることができる。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、単独で、またはＩＦＮγ−１ｂと組み合わせて、繊維性肺疾患を処置するために現在使用されている他の処置とともに投与することができる。このようなさらなる処置としては、グルココルチコイド、アザチオプリン、シクロホスファミド、ペニシラミン、コルヒシン（ｃｏｌｃｈｉｓｉｎｅ）、酸素補給などが挙げられる。ＩＰＦのような繊維性肺疾患の患者は、多くの場合、乾性咳嗽、呼吸困難を伴い、肺の機能試験において拘束性の換気パターンを示す。胸部Ｘ線検査により、患者の肺には繊維の蓄積が明らかにされる。開示される方法にしたがって繊維性肺疾患を処置する場合は、処置が十分であることは、患者の咳（咳をしている場合）の減少を観察することによって、または肺の全能力、肺活量、残っている肺容量の改善を検出するための標準的な肺機能試験を使用することによって、あるいは、運動条件下での脱飽和を測定する動脈血気体決定を行うことによって検出することができ、患者の肺機能がこれらの測定の１つ以上にしたがって改善されたことが示される。さらに、患者の改善は、胸部Ｘ線検査の、患者の肺の線維症の進行が停止しているかまたは線維症が減少していることを示す結果によって決定することができる。さらに、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、コラーゲンの生成をダウンレギュレートし、それによって線維形成を阻害するホルモンであるレラキシンと組み合わせて投与される場合、またはＴＧＦ−βの線維形成活性をブロックする薬剤と組み合わせて投与される場合には、臓器の線維症を処置するために有用である。結晶性ＴＮＦＲ２および組み換えヒトレラキシンを使用する併用療法は、例えば、全身性硬化症または繊維性肺疾患（嚢胞性線維症、特発性肺線維症、放射線によって誘導される肺線維症、およびブレオマイシンによって誘導される肺線維症を含む）を処置するために有用である。   A crystalline TNFR2 polypeptide, or a crystalline TNFR2 polypeptide in combination with a cytokine IFNγ-1b (eg, ACTIMMUNE®; InterMune Pharmaceuticals) can be used to treat cystic fibrosis or fibrotic lung disease, eg, idiopathic lung fiber , Pulmonary fibrosis induced by radiation, and pulmonary fibrosis induced by bleomycin. In addition, this combination can be used to treat other diseases characterized by organ fibrosis, including systemic sclerosis (also called “scleroderma”), which often includes liver fibrosis. Useful for treating. To treat cystic fibrosis, crystalline TNFR2 polypeptide and IFNγ-1b can be combined with PULMOZYME® or TOBI® or other treatments for cystic fibrosis. Crystalline TNFR2 polypeptide can be administered alone or in combination with IFNγ-1b in conjunction with other treatments currently used to treat fibrotic lung disease. Such further treatments include glucocorticoids, azathioprine, cyclophosphamide, penicillamine, colchicine, supplemental oxygen, and the like. Patients with fibrotic lung diseases such as IPF are often accompanied by dry cough, dyspnea, and exhibit a restrictive ventilation pattern in lung function tests. Chest x-ray examination reveals fiber accumulation in the patient's lungs. When treating fibrotic lung disease according to the disclosed method, the treatment is sufficient by observing a reduction in the patient's cough (if coughing) or by the full capacity of the lung, vital capacity Can be detected by using standard lung function tests to detect improvements in remaining lung volume, or by making arterial blood gas determinations that measure desaturation under exercise conditions, It is shown that the patient's lung function was improved according to one or more of these measurements. Further, patient improvement can be determined by results of a chest x-ray showing that the progression of fibrosis in the patient's lungs has stopped or has decreased. In addition, the crystalline TNFR2 polypeptide can be administered in combination with relaxin, a hormone that down-regulates collagen production and thereby inhibits fibrogenesis, or with an agent that blocks the fibrogenic activity of TGF-β. When administered in combination, it is useful for treating organ fibrosis. Combination therapies using crystalline TNFR2 and recombinant human relaxin are e.g. induced by systemic sclerosis or fibrotic lung disease (cystic fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, radiation-induced pulmonary fibrosis, and bleomycin) Useful in treating pulmonary fibrosis).

（リウマチおよび皮膚疾患）
他の実施形態により、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法を、種々のリウマチ障害を処置するために使用する方法が提供される。慢性関節リウマチを処置することにおいてＴＮＦ−α阻害因子を使用することは、Ｍｏｒｅｌａｎｄ，Ｌ．Ｗ．，１９９１，Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２６ Ｓｕｐｐｌ ５７：７−１５にまとめられており、脊椎関節症および強直性脊椎炎を処置することにおけるＴＮＦ−α阻害因子の使用は、Ｓｃｈｎａｒｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２０（Ｓｕｐｐｌ．２８）：Ｓ１２６−Ｓ１２９、およびＧｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４６（１８）：１３４９−１３５６に、それぞれ開示されている。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法で処置することができる状態として、成人および幼児の慢性関節リウマチ；全身性エリテマトーデス；通風；変形性関節症；リウマチ性多発性筋肉痛；血清反応陰性頚椎関節炎（強直性脊椎炎を含む）；およびライター病（反応性関節炎）が挙げられる。本発明の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法はまた、乾癬性関節炎および慢性ライム病関節炎を処置するためにも使用される。乾癬性関節炎の処置にＴＮＦ−α阻害因子を使用することは、Ｒｕｄｅｒｍａｎ，Ｅ．Ｍ．，２００２，Ａｍ Ｊ Ｍａｎａｇ Ｃａｒｅ ８：Ｓ１７１−１８０およびＳａｌｖａｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２０（Ｓｕｐｐｌ．２８）Ｓ７１−Ｓ７５に記載されている。スティル病、および慢性関節リウマチに関係しているブドウ膜炎もまた、これらの化合物、組成物、および／または併用療法で処置することができる。さらに、本発明の化合物、組成物、および／または併用療法は、皮膚筋炎および多発性筋炎を含む随意筋の炎症を生じる障害の処置に使用される。さらに、本明細書中で開示される化合物、組成物、および／または併用療法は、散発性の封入体筋炎を処置するために有用である。なぜなら、ＴＮＦ−αは、これらの筋疾患の進行において重要な役割を果たし得るからである。さらに、本明細書中で開示される化合物、組成物、および／または併用療法は、多中心性細網組織球症を処置するために使用される。多中心性細網組織球症は、顔および手の関節破壊および丘疹状小結節が、多核化した巨細胞によるプロ炎症性サイトカインの過剰な生成に関係している疾患である。本発明の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法は、過剰なＴＮＦ−αの分泌に一部原因があると考えられている現象である、肥大性瘢痕を阻害するために使用することができる。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、単独で投与することができ、また、肥大性瘢痕を阻害するための他の薬剤、例えば、ＴＧＦ−αの阻害因子と同時に投与することもできる。 (Rheumatic and skin diseases)
Other embodiments provide methods of using the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies to treat various rheumatic disorders. The use of TNF-α inhibitors in treating rheumatoid arthritis is described in Moreland, L .; W. 1991, J Rheumatol 26 Suppl 57: 7-15, and the use of TNF-α inhibitors in treating spondyloarthropathy and ankylosing spondylitis is described in Schnarr et al. , 2002, Clin Exp Rheumatol 20 (Suppl. 28): S126-S129, and Gorman et al. , 2002, N Engl J Med 346 (18): 1349-1356, respectively. Rheumatoid arthritis in adults and infants; systemic lupus erythematosus; ventilation; osteoarthritis; rheumatic polymyalgia; serum that can be treated with crystalline TNFR2 polypeptide, composition, and / or combination therapy Reaction-negative cervical spondyloarthritis (including ankylosing spondylitis); and Reiter's disease (reactive arthritis). The crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies of the present invention are also used to treat psoriatic arthritis and chronic Lyme disease arthritis. The use of TNF-α inhibitors for the treatment of psoriatic arthritis is described in Ruderman, E .; M.M. , 2002, Am J Manag Care 8: S171-180 and Salvarani et al. 2002, Clin Exp Rheumatol 20 (Suppl. 28) S71-S75. Still's disease and uveitis associated with rheumatoid arthritis can also be treated with these compounds, compositions, and / or combination therapies. In addition, the compounds, compositions, and / or combination therapies of the invention are used to treat disorders that cause voluntary muscle inflammation, including dermatomyositis and polymyositis. Further, the compounds, compositions and / or combination therapies disclosed herein are useful for treating sporadic inclusion body myositis. This is because TNF-α can play an important role in the progression of these muscle diseases. Furthermore, the compounds, compositions, and / or combination therapies disclosed herein are used to treat multicentric reticulohistiocytosis. Multicentric reticulohistiocytosis is a disease in which joint destruction and papule nodules in the face and hands are associated with excessive production of pro-inflammatory cytokines by multinucleated giant cells. The crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies of the present invention are used to inhibit hypertrophic scarring, a phenomenon believed to be due in part to excessive TNF-α secretion. can do. The crystalline TNFR2 polypeptide can be administered alone or concurrently with other agents for inhibiting hypertrophic scars, such as inhibitors of TGF-α.

皮膚または粘膜に関係している障害もまた、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法を使用して処置することができる。このような障害としては、棘融解性疾患（ダリエ病、毛胞性角化症、および尋常性天疱瘡を含む）が挙げられる。また、本発明の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法としては、にきび；酒さ；円形脱毛症；アフタ性口内炎；水疱性類天疱瘡；火傷；疱疹状皮膚炎；湿疹；紅斑（多形性紅斑を含む）、および大水胞性多形性紅斑（スティーブンス・ジョンソン症候群）；炎症性皮膚疾患；扁平苔癬；線形ＩｇＡ水疱性疾患（ｌｉｎｅａｒ ＩｇＡ Ｂｕｌｌｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ）（子供の慢性水胞症）；肌の弾力が失われること；粘膜表面の潰瘍；好中球性皮膚炎（Ｓｗｅｅｔ’ｓ症候群）；毛孔性紅色粃糠疹；乾癬；壊疽性膿皮症；および中毒性表皮剥離症が挙げられる。   Disorders involving the skin or mucosa can also be treated using the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies. Such disorders include spinolytic diseases (including Darier's disease, follicular keratosis, and pemphigus vulgaris). In addition, the crystalline TNFR2 polypeptide, composition, and / or combination therapy of the present invention include acne; rosacea; alopecia areata; aphthous stomatitis; bullous pemphigoid; burns; Erythema (including polymorphic erythema), and large vesicular polymorphic erythema (Stevens-Johnson syndrome); inflammatory skin disease; lichen planus; linear IgA Bullous disease (chronic in children) (Hydropsia); loss of skin elasticity; mucosal surface ulcers; neutrophilic dermatitis (Sweet's syndrome); pore erythema eruption; psoriasis; gangrenous pyoderma; Symptoms.

別の実施形態においては、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、脂肪類皮膚硬化症（ｌｉｐｏｄｅｒｍａｔｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）および慢性静脈性潰瘍（多くの場合は、脚に存在する）を処置するため、およびそれらの再発を防ぐために使用される。複数の研究によって、ＴＮＦ−αが、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）の活性化によって、ならびに、ＴＧＦαおよび他のサイトカインの生成を誘導することによって、脂肪類皮膚硬化症および慢性静脈性潰瘍の病因に関係していることが示されている。オキシペンチフィリン（ｏｘｐｅｎｔｉｆｙｌｌｉｎｅ）およびペントキシフィリンは、この設定において有効であることが示されている。結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは結晶性エタナーセプトを含む開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、慢性静脈性潰瘍を処置するために、単独で、あるいは、オキシペンチフィリン、ペントキシフィリン、ＧＭ−ＣＳＦ、レプチン、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ、および／またはＩＧＦの１つ以上と組み合わせて使用することができる。これらの処置により、治癒が加速され、再発を防ぐ。投与は、全身的である場合も局所的である場合もある。局所投与については、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドが、軟膏、ローション、ゲル、またはクリーム剤で局所塗布されるか、病変の周辺に、潰瘍に直接あるいは、潰瘍から約１０センチメートルまでの位置に注射される。   In another embodiment, the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides are for treating lipodermatosclerosis and chronic venous ulcers (often in the leg) and for their recurrence Used to prevent. Studies have shown that TNF-α has been implicated in the pathogenesis of fatty sclerosis and chronic venous ulcers by activation of matrix metalloproteinase 2 (MMP2) and by inducing the production of TGFα and other cytokines. It is shown to be related. Oxypentylphyllin and pentoxyphyllin have been shown to be effective in this setting. Disclosed crystalline TNFR2 polypeptides comprising crystalline TNFR2: Fc or crystalline etanercept alone or to treat chronic venous ulcers, or oxypentifylline, pentoxifylline, GM-CSF, leptin, It can be used in combination with one or more of PDGF, bFGF, EGF, TGF, and / or IGF. These treatments accelerate healing and prevent recurrence. Administration can be systemic or local. For topical administration, crystalline TNFR2 polypeptide is topically applied in an ointment, lotion, gel, or cream, or injected around the lesion, directly into the ulcer, or at a location about 10 centimeters from the ulcer. The

（その他の障害）
内分泌系の種々の障害を処置するために、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法を使用するための方法もまた、提供される。例えば、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、若年発症糖尿病（自己免疫性糖尿病およびインシュリン依存性糖尿病の型を含む）を処置するために、さらには、成人発症型糖尿病（非インシュリン依存性糖尿病および肥満によって誘導される糖尿病を含む）を処置するためにも使用される。さらに、本発明の化合物、組成物、および／または併用療法は、糖尿病に付随する二次的な状態、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病患者における腎移植拒絶、肥満によって媒介されるインシュリン耐性、および腎不全（これら自体が、タンパク質尿症および高血圧と関係している場合もある）を処置するためにも使用される。他の内分泌疾患もまた、これらの化合物、組成物、および／または併用療法を用いて処置することができる。例として、多嚢胞卵巣疾患、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー、甲状腺機能低下症、および甲状腺炎（橋本病（すなわち、自己免疫性甲状腺炎）を含む）が挙げられる。 (Other obstacles)
Also provided are methods for using crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies to treat various disorders of the endocrine system. For example, crystalline TNFR2 polypeptides are used to treat juvenile-onset diabetes (including forms of autoimmune diabetes and insulin-dependent diabetes), and further induced by adult-onset diabetes (non-insulin-dependent diabetes and obesity) Also used to treat diabetes). In addition, the compounds, compositions, and / or combination therapies of the present invention provide secondary conditions associated with diabetes such as diabetic retinopathy, renal transplant rejection in diabetic patients, insulin resistance mediated by obesity, and It is also used to treat renal failure, which may themselves be associated with proteinuria and hypertension. Other endocrine disorders can also be treated using these compounds, compositions, and / or combination therapies. Examples include polycystic ovarian disease, X-linked adrenoleukodystrophy, hypothyroidism, and thyroiditis (including Hashimoto's disease (ie, autoimmune thyroiditis)).

結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法は、さらに、肝炎（急性アルコール性肝炎、急性薬剤性肝障害、またはウイルス性肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎を含む）、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、特発性門脈圧亢進症、ならびに、原因不明の肝臓の炎症のような肝臓の状態を処置するために使用される。上記の肝臓疾患は、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドで、同じ状態を処置するために使用される他の医薬品と同時に処置することができる。一例として、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、インターフェロンα（ＩＦＮα）で同時に処置される患者においてＣ型肝炎（慢性Ｃ型肝炎を含む）を処置するために使用することができる。肝臓でのＩＮＦαの高レベルの発現は、ＩＦＮαの作用を妨害し、それによってＩＦＮαでの処置に対する患者の応答を妨害する（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１、ＦＡＳＥＢ Ｊ １５：１５９５−１５９７）。Ｃ型肝炎を処置するために結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドと同時に投与することができる処置としては、ペグ化ＩＦＮα、リバビリン、またはリバビリンとインターフェロン−αもしくはペグ化インターフェロン−αの組み合わせが挙げられる。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドとの同時使用に適しているインターフェロン−α部分としては、ＩＦＮα−２ａ（例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ペグ化ＩＦＮα−２ａ（例えば、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ＵＳ２００２０１２７２０３Ａ１に記載されているようなペグ化ＩＦＮα−２ａまたはＩＦＮα−２ｂ、あるいは、ＷＯ９９６４０１６に記載されているペグ化ＩＦＮα結合体が挙げられる。別の実施形態においては、Ｃ型肝炎を、インターフェロン−αと、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃ以外の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド（例えば、レナーセプト（ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）もしくはオナーセプト（ｏｎｅｒｃｅｐｔ）の結晶形態）の同時投与によって処置することができる。   Disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies, such as crystalline TNFR2: Fc, may further comprise hepatitis (acute alcoholic hepatitis, acute drug-induced liver injury, or viral hepatitis, hepatitis A To treat liver conditions such as hepatitis B, and C), sclerosing cholangitis, autoimmune hepatitis, idiopathic portal hypertension, and liver inflammation of unknown cause used. The above liver diseases can be treated with a crystalline TNFR2 polypeptide, such as crystalline TNFR2: Fc, at the same time as other medications used to treat the same condition. As an example, a crystalline TNFR2 polypeptide can be used to treat hepatitis C (including chronic hepatitis C) in a patient who is concurrently treated with interferon alpha (IFNα). High level expression of INFα in the liver interferes with the action of IFNα, thereby preventing the patient's response to treatment with IFNα (Hong et al., 2001, FASEB J 15: 1595-1597). Treatments that can be co-administered with a crystalline TNFR2 polypeptide to treat hepatitis C include pegylated IFNα, ribavirin, or a combination of ribavirin and interferon-α or pegylated interferon-α. Interferon-α moieties suitable for co-use with crystalline TNFR2 polypeptides include IFNα-2a (eg, ROFERON®; Hoffmann-LaRoche), pegylated IFNα-2a (eg, PEGASYS®) Hoffmann-LaRoche), pegylated IFNα-2a or IFNα-2b as described in US20020127203A1, or pegylated IFNα conjugates described in WO99664016. In another embodiment, hepatitis C is treated by co-administration of interferon-α and a crystalline TNFR2 polypeptide other than crystalline TNFR2: Fc (eg, crystalline form of lenercept or onercept). can do.

消化器系の状態（セリアック病を含む）もまた、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法を用いて処置することができる。クローン病の処置においてＴＮＦ−α阻害因子を使用することは、Ｒｉｃａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｄｒｕｇｓ ｏｆ Ｔｏｄａｙ ３８（１１）；７２５−７４４に開示されている。さらに、本発明の化合物、組成物、および／または併用療法は、クローン病、消化器疾患もしくは他の全身性疾患に関係する吐き気；潰瘍性大腸炎；特発性胃不全麻痺；胆石症（胆石）；膵炎（慢性膵炎および急性膵炎に伴う肺の損傷を含む）；ならびに、潰瘍（胃潰瘍および十二指腸潰瘍を含む）を処置するために使用される。   Gastrointestinal conditions (including celiac disease) can also be treated with crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies. The use of TNF-α inhibitors in the treatment of Crohn's disease is described by Ricart et al. , 2002, Drugs of Today 38 (11); 725-744. Further, the compounds, compositions, and / or combination therapies of the present invention may include nausea associated with Crohn's disease, gastrointestinal disease or other systemic diseases; ulcerative colitis; idiopathic gastric failure paralysis; cholelithiasis (gallstones) Used to treat pancreatitis (including lung damage associated with chronic and acute pancreatitis); and ulcers (including gastric and duodenal ulcers);

本発明の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法を、糸球体腎炎（自己免疫性糸球体腎炎、毒物への暴露が原因である糸球体腎炎、または溶血連鎖球菌もしくは他の感染源への感染についての二次的な糸球体腎炎を含む）のような泌尿生殖器系の障害を処置するために、使用する方法もまた含まれる。***性症候群およびその臨床的な合併症（例えば、腎不全、貧血、および肥大型心筋症）（環境有害物質、薬物に対する暴露、または他の原因に関係している***性症候群を含む）もまた、本発明の化合物、組成物、および／または併用療法で処置することができる。本発明の化合物、組成物、および／または併用療法で処置することができるさらなる状態は、血液透析の合併症；前立腺の状態（良性前立腺肥大症、非細菌性前立腺炎、および慢性前立腺炎を含む）；ならびに、血液透析の合併症である。   The crystalline TNFR2 polypeptide, composition, and / or combination therapy of the present invention may be used in combination with glomerulonephritis (autoimmune glomerulonephritis, glomerulonephritis caused by exposure to toxins, or Streptococcus pyogenes or other infections). Also included are methods used to treat genitourinary disorders such as secondary glomerulonephritis for source infection). Uremic syndrome and its clinical complications (eg, renal failure, anemia, and hypertrophic cardiomyopathy) (including uremic syndrome associated with environmental hazards, exposure to drugs, or other causes) Can also be treated with the compounds, compositions, and / or combination therapies of the present invention. Additional conditions that can be treated with the compounds, compositions, and / or combination therapies of the invention include hemodialysis complications; prostate conditions (including benign prostatic hyperplasia, non-bacterial prostatitis, and chronic prostatitis ); And complications of hemodialysis.

さらに、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法は、異常なＴＮＦ−αの発現に関係している難聴のような難聴を含む種々の障害を処置するために使用される。これらの１つは、内耳性難聴または蝸牛神経に関係している難聴である。蝸牛神経に関係している難聴は、自己免疫プロセスによるもの、すなわち、自己免疫性難聴と考えられている。この状態は、現在は、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは他の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドと同時に投与することができる、ステロイド、メトトレキセート、および／またはシクロホスファミドで処置することができる。多くの場合は難聴を伴う中耳疾患であるコレステリン腫もまた、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法で処置することができる。   Furthermore, the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies are used to treat a variety of disorders, including hearing loss, such as hearing loss associated with abnormal TNF-α expression. The One of these is inner ear hearing loss or hearing loss associated with the cochlear nerve. Hearing loss associated with the cochlear nerve is thought to be due to an autoimmune process, ie autoimmune hearing loss. This condition can now be treated with steroids, methotrexate, and / or cyclophosphamide, which can be administered concurrently with crystalline TNFR2: Fc or other crystalline TNFR2 polypeptides. Cholesteroma, a middle ear disease often accompanied by hearing loss, can also be treated with the disclosed crystalline TNFR2 polypeptide, composition, and / or combination therapy.

さらに、本発明により、骨および関節の関節炎以外の医学的状態の処置のための、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法が提供される。これには、例えば、骨粗鬆症（閉経後の骨粗鬆症を含む）、歯の緩みもしくは歯を失うことになる歯周炎、および関節置換術の後の補綴物のゆるみ（一般的には、磨耗くずに対する炎症反応に関係している）が含まれるが、これらに限定されない骨量の減少につながる破骨細胞の障害が含まれる。この後者の状態は、「整形外科用インプラントの溶解」と呼ばれる。結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを投与することによって処置することができる他の状態として、一時的な下顎関節機能不全（ＴＭＪ）、ガンの高カルシウム血症が原因で生じる骨量の減少（例えば、骨への転移が含まれる）（例えば、黒色腫、あるいは肺ガン、乳ガン、肺ガン、扁平上皮ガン、および頭頸部ガン、腎臓ガン、または前立腺ガンにおいて生じるもの）が挙げられる。   Furthermore, the present invention provides crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies for the treatment of medical conditions other than bone and joint arthritis. This includes, for example, osteoporosis (including postmenopausal osteoporosis), periodontitis that will loose or lose teeth, and loosening of the prosthesis after joint replacement (generally against wear debris) Including, but not limited to, osteoclast disorders that lead to bone loss. This latter condition is called “dissolution of the orthopedic implant”. Other conditions that can be treated by administering a crystalline TNFR2 polypeptide, such as crystalline TNFR2: Fc, include bones caused by temporary mandibular joint dysfunction (TMJ), cancer hypercalcemia Reduction in volume (eg, including metastasis to bone) (eg, occurring in melanoma or lung, breast, lung, squamous, and head and neck, kidney, or prostate cancer) It is done.

移植に関係する障害もまた、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法で処置することができる。例えば、移植片対宿主病、および固形臓器の移植（心臓、肝臓、肺、皮膚、腎臓、または他の臓器の移植を含む）によって生じる他の合併症である。このような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、例えば、肺移植後の閉塞性細気管支炎、および器質化肺炎につながる閉塞性細気管支炎のような閉塞性細気管支炎の発症を防ぐかまたは阻害するために投与することができる。末梢血幹細胞移植の形態で自己の造血幹細胞移植を受けた患者は、「移植症候群」すなわち「ＥＳ」を発症する場合があり、これは、造血幹細胞の移植の時点とほぼ同じ時点で生じる、有害な一般的には治療をしないでも長期的には状態が落ち着いたり収まる性質のある応答であり、肺の損傷を生じる場合がある。ＥＳは、ＩＬ−８またはＴＮＦ−αのいずれかの阻害因子（例えば、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃ、または他の結晶性ＴＮＦＲポリペプチド）で、あるいは、これらのサイトカインの両方に対する阻害因子の組み合わせを用いて処置することができる。開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、また、骨髄移植片の拒絶、あるいは、他のタイプの移植片（例えば、角膜移植、または肝臓もしくは他の固形臓器の移植）を受け入れることに対してレシピエントの体がうまくいかないことのような、移植の失敗を処置あるいは予防するために有用である。移植の拒絶には、多くの場合、高濃度のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０が伴う。移植の拒絶は、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドとＩＬ−１０阻害因子の組み合わせで処置することができる。   Transplant related disorders can also be treated with the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies. For example, graft-versus-host disease, and other complications caused by solid organ transplantation (including heart, liver, lung, skin, kidney, or other organ transplants). Such crystalline TNFR2 polypeptides prevent or inhibit the development of obstructive bronchiolitis such as obstructive bronchiolitis after lung transplantation and obstructive bronchiolitis leading to organizing pneumonia Can be administered. Patients who have undergone autologous hematopoietic stem cell transplantation in the form of peripheral blood stem cell transplantation may develop “transplant syndrome” or “ES”, an adverse event that occurs at approximately the same time as the time of hematopoietic stem cell transplantation. In general, it is a response with a calming or calming nature in the long term without treatment, and may cause lung damage. ES uses inhibitors of either IL-8 or TNF-α (eg, crystalline TNFR2: Fc, or other crystalline TNFR polypeptides), or a combination of inhibitors against both of these cytokines. Can be treated. The disclosed crystalline TNFR2 polypeptides are also suitable for recipients of bone marrow transplant rejection or other types of transplants (eg, corneal transplants, or liver or other solid organ transplants). It is useful for treating or preventing transplant failure, such as failure of the body. Transplant rejection is often accompanied by high concentrations of TNF-α and IL-10. Transplant rejection can be treated with a combination of crystalline TNFR2 polypeptide and an IL-10 inhibitor.

眼疾患もまた、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法を用いて処置することができ、これには、裂孔原性網膜剥離、および炎症性眼疾患、および喫煙に関係している炎症性眼疾患、さらには、喫煙に関係しているかまたは加齢に関係している黄斑変性症が含まれる。   Ocular diseases can also be treated using the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies, including for rhegmatogenous retinal detachment, and inflammatory eye diseases, and smoking. Involved inflammatory eye diseases, as well as macular degeneration associated with smoking or associated with aging.

本明細書中に記載される、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、開示される組成物、および／または併用療法は、女性の生殖器官に影響を与える障害の処置に有用である。例として、多発性の移植による不具合／不妊症；胎児消失症候群、またはＩＶ胚消失（自然流産）；子癇前症妊娠（ｐｒｅｅｃｌａｍｐｔｉｃ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ）または子癇；ならびに、子宮内膜症が挙げられるが、これらに限定されない。   The crystalline TNFR2 polypeptides, disclosed compositions, and / or combination therapies, such as crystalline TNFR2: Fc, described herein are useful for the treatment of disorders affecting the female reproductive tract. is there. Examples include failure / infertility due to multiple transplants; fetal loss syndrome or IV embryo loss (natural abortion); preeclamptic pregnancies or eclampsia; and endometriosis It is not limited.

さらに、開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法は、肥満の処置に有用であり、これには、レプチン生成の減少を生じるための処置、、または抗鬱剤の投与を用いることに伴う体重増加の処置が含まれる。また、本発明の化合物、組成物、および／または併用療法は、神経原性疼痛、坐骨神経痛、老化の状態、重度の薬物反応（例えば、ＩＬ−２の毒性またはブレオマイシンによって誘導される肺症および線維症）を処置するために、あるいは、心臓の外科手術もしくは他の外科手術において、または肢もしくは関節の外傷性の損傷（例えば、外傷性の膝の損傷）を処置することにおいて、自己赤血球の輸血前、その間、もしくはその後の炎症反応を抑制するために、使用される。開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法を用いて処置することができる種々の他の医学的障害として、多発性硬化症；ベーチェット症候群；シェーグレン症候群；自己免疫性溶血性貧血；ベータ・サラセミア；筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病）；パーキンソン病；および原因不明の腱滑膜炎、ならびに遺伝的欠損に関係している種々の自己免疫障害または疾患が挙げられる。さらに、本発明の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド、組成物、および／または併用療法は、ゴーシェ病、ハンチントン病、線形ＩｇＡ疾患、および筋ジストロフィーのような遺伝性の状態を処置するために使用される。   Furthermore, the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies are useful for the treatment of obesity, including treatment to produce reduced leptin production, or administration of antidepressants. Treatment of weight gain associated with use is included. In addition, the compounds, compositions, and / or combination therapies of the present invention may include neurogenic pain, sciatica, aging conditions, severe drug reactions (eg, IL-2 toxicity or bleomycin-induced pneumonia and Fibrosis) or in cardiac surgery or other surgery, or in treating traumatic injury of the limb or joint (eg traumatic knee injury) Used to suppress inflammatory reactions before, during or after transfusion. Various other medical disorders that can be treated using the disclosed crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies include: multiple sclerosis; Behcet's syndrome; Sjogren's syndrome; autoimmune hemolysis Anemia; beta thalassemia; amyotrophic lateral sclerosis (Lou Gehrig's disease); Parkinson's disease; and unexplained tendon synovitis and various autoimmune disorders or diseases associated with genetic defects It is done. In addition, the crystalline TNFR2 polypeptides, compositions, and / or combination therapies of the invention are used to treat genetic conditions such as Gaucher disease, Huntington's disease, linear IgA disease, and muscular dystrophy.

本発明のさらに別の実施形態においては、本明細書中で開示される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、自閉症の領域の障害、および他の広汎性発達障害を処置するために使用される。プロ炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１を含む）は、自閉症の患者のサブセットにおいて過剰発現されていることが示されており、このことは、これらの患者が過剰な生まれつきの免疫反応を有しており、そして／またはＴ細胞応答のための調節性サイトカインを異常に生成していることを示している。したがって、自閉症の領域の障害を、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを投与することによって処置するための方法が、本明細書中で提供される。   In yet another embodiment of the invention, the crystalline TNFR2 polypeptide disclosed herein is used to treat disorders in the area of autism, and other pervasive developmental disorders. Pro-inflammatory cytokines (including TNF-α and IL-1) have been shown to be overexpressed in a subset of autistic patients, indicating that these patients have excessive innate immunity. It has been shown to have a response and / or abnormally produce regulatory cytokines for T cell responses. Accordingly, provided herein are methods for treating disorders in the area of autism by administering a crystalline TNFR2 polypeptide such as crystalline TNFR2: Fc.

（さらなる併用療法）
本明細書中に記載される疾患を処置するために使用される種々の他の医薬品もまた、結晶性ＴＮＦＲ２を含む組成物、または結晶性ＴＮＦＲ２を使用して調製される組成物と同時に投与することができる。このような医薬品として、抗ウイルス剤；抗生物質；鎮痛剤；非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）；抗リウマチ予防維持薬（ＤＭＡＲＤ）；コルチコステロイド；局所ステロイド；全身性ステロイド（例えば、プレドニソン）；サイトカイン；炎症性サイトカインのアンタゴニスト；Ｔ細胞表面タンパク質に対する抗体；経口レチノイド；サリチル酸；およびヒドロキシウレアが挙げられる。このような併用に適している鎮痛剤として、アセトアミノフェン、コデイン、ナプシル酸プロポキシフェン、オキシコドン塩酸塩、ヒドロコドン酸性酒石酸塩、およびトラマドールが挙げられる。本発明の併用療法に適しているＮＳＡＩＤとしては、サリチル酸（アスピリン）およびサリチル酸誘導体；イブプロフェン；インドメタシン；セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））；レフォコキシブ（ＶＩＯＸＸ（登録商標））；バルデコキシブ（ＢＥＸＴＲＡ（登録商標））；ケトロラック；ナムブメトロン；ピロキシカム；ナプロキセン；オキサプロジン；スリンダク；ケトプロフェン；ジクロフェナク；および他のＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２阻害因子、プロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、フマル酸誘導体、カルボン酸誘導体、酪酸誘導体、オキシカム、ピラゾール、およびピラゾロンが挙げられ、これらには、新しく開発される抗炎症剤も含まれる。このような併用に適しているＤＭＡＲＤとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、硫酸ヒドロキシクロロキン、メトトレキセート、レフルノミド、ミノサイクリン、ペニリルアミン、スルファサラジン、および経口用金、金チオリンゴ酸ナトリウム、およびアウロチオグルコースのような金化合物が挙げられる。結晶性ＴＮＦＲ２と併用することができるサイトカイン阻害因子の例としては、例えば、ＴＧＦβのアンタゴニスト、ＩＬ−６のアンタゴニスト、またはＩＬ−８のアンタゴニストが挙げられる。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドはまた、抗レトロウイルス療法を受けるＨＩＶ感染患者においてＴ細胞の増殖を増強するために、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、および／またはプロテインキナーゼＡ１型の阻害因子と組み合わせて投与することができる。さらに、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、ホジキン病を処置するために、ＩＬ−１３の阻害因子と組み合わせることもできる。神経成長因子もまた、特定の状態を処置するために、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドと組み合わせることができる。このような状態としては、神経変性疾患、脊髄損傷、および多発性硬化症が挙げられる。この組み合わせで処置することができる他の状態は、緑内障および糖尿病である。さらに、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、抗マラリア薬またはコルヒチンと組み合わせて投与することができる。 (Further combination therapy)
Various other medicaments used to treat the diseases described herein are also co-administered with a composition comprising crystalline TNFR2, or a composition prepared using crystalline TNFR2. be able to. Such drugs include antiviral agents; antibiotics; analgesics; non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs); antirheumatic preventive maintenance drugs (DMARDs); corticosteroids; topical steroids; systemic steroids (eg, prednisone) Cytokines; antagonists of inflammatory cytokines; antibodies to T cell surface proteins; oral retinoids; salicylic acid; and hydroxyurea. Analgesics that are suitable for such combinations include acetaminophen, codeine, propoxyphene napsylate, oxycodone hydrochloride, hydrocodone acid tartrate, and tramadol. NSAIDs suitable for the combination therapy of the present invention include salicylic acid (aspirin) and salicylic acid derivatives; ibuprofen; indomethacin; celecoxib (CELEBREX®); refocoxib (VIOXX®); valdecoxib (BEXTRA®) ); Ketorolac; nambumetholone; piroxicam; naproxen; oxaprozin; sulindac; ketoprofen; diclofenac; and other COX-1 and COX-2 inhibitors, propionic acid derivatives, acetic acid derivatives, fumaric acid derivatives, carboxylic acid derivatives, butyric acid derivatives, oxicam , Pyrazole, and pyrazolone, including newly developed anti-inflammatory agents. Suitable DMARDs for such combinations include azathioprine, cyclophosphamide, cyclosporine, hydroxychloroquine sulfate, methotrexate, leflunomide, minocycline, penylylamine, sulfasalazine, and oral gold, gold sodium thiomalate, and aurothioglucose. Such gold compounds are mentioned. Examples of cytokine inhibitors that can be used in combination with crystalline TNFR2 include, for example, an antagonist of TGFβ, an antagonist of IL-6, or an antagonist of IL-8. Crystalline TNFR2 polypeptide is also combined with inhibitors of cytokines GM-CSF, IL-2, and / or protein kinase A1 to enhance T cell proliferation in HIV-infected patients receiving antiretroviral therapy Can be administered. Furthermore, crystalline TNFR2 polypeptides can be combined with inhibitors of IL-13 to treat Hodgkin's disease. Nerve growth factor can also be combined with crystalline TNFR2 polypeptide to treat specific conditions. Such conditions include neurodegenerative diseases, spinal cord injury, and multiple sclerosis. Other conditions that can be treated with this combination are glaucoma and diabetes. Further, the crystalline TNFR2 polypeptide can be administered in combination with an antimalarial drug or colchicine.

結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドと組み合わせて本明細書中に記載される疾患の処置に適している他の化合物としては、サリドマイドもしくはサリドマイド類似体、ペントキシフィリン、またはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害因子のような低分子、あるいは他の低分子が挙げられる。この目的に適しているＭＭＰ阻害因子としては、例えば、米国特許第５，８８３，１３１号、同第５，８６３，９４９号、および同第５，８６１，５１０号に記載されているもの、さらには、米国特許第５，８７２，１４６号に記載されているメルカプトアルキルペプチジル化合物が挙げられる。ＴＮＦ−αの生成を減少させることができる他の低分子としては、例えば、米国特許第５，５０８，３００号、同第５，５９６，０１３号、および同第５，５６３，１４３号に記載されている分子が挙げられ、これらのいずれかを、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドと組み合わせて投与することができる。本明細書中に記載される疾患を処置するために結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドと組み合わせて有用であるさらなる低分子としては、米国特許第５，７４７，５１４号、米国特許第５，６９１，３８２号に記載されているＭＭＰ阻害因子、さらには、米国特許第５，８２１，２６２号に記載されているヒドロキサム酸誘導体が挙げられる。本明細書中に記載される疾患は、また、ホスホジエステラーゼＩＶおよびＴＮＦ−αの生成を阻害する低分子、例えば、置換されたオキシム誘導体（ＷＯ９６／００２１５）、キノリンスルフォンアミド（米国特許第５，８３４，４８５号）、アリールフラン誘導体（ＷＯ９９／１８０９５）、および複素二環式誘導体（ＷＯ９６／０１８２５；ＧＢ２，２９１，４２２Ａ）を含む併用療法で処置することができる。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮγを抑制するチアゾール誘導体（ＷＯ９９／１５５２４）、さらには、ＴＮＦ−αおよび他のプロ炎症性サイトカインを抑制するキサンチン誘導体（例えば、米国特許第５，１１８，５００号、米国特許第５，０９６，９０６号、および米国特許第５，１９６，４３０号を参照のこと）もまた、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドとの組み合わせにおいて有用である。本明細書中に記載される状態を、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドと同時に用いて処置するために有用なさらなる低分子として、米国特許第５，５４７，９７９号に開示されているものが挙げられる。   Other compounds suitable for the treatment of the diseases described herein in combination with crystalline TNFR2 polypeptide include thalidomide or thalidomide analogs, pentoxifylline, or matrix metalloproteinase (MMP) inhibitors. Small molecules, or other small molecules. Suitable MMP inhibitors for this purpose include, for example, those described in US Pat. Nos. 5,883,131, 5,863,949, and 5,861,510, Include mercaptoalkylpeptidyl compounds described in US Pat. No. 5,872,146. Other small molecules that can reduce the production of TNF-α are described, for example, in US Pat. Nos. 5,508,300, 5,596,013, and 5,563,143. Any of these can be administered in combination with a crystalline TNFR2 polypeptide. Additional small molecules that are useful in combination with crystalline TNFR2 polypeptides to treat the diseases described herein include US Pat. No. 5,747,514, US Pat. No. 5,691,382. And the hydroxamic acid derivatives described in US Pat. No. 5,821,262. The diseases described herein also include small molecules that inhibit the production of phosphodiesterase IV and TNF-α, such as substituted oxime derivatives (WO 96/00215), quinoline sulfonamides (US Pat. No. 5,834). 485), arylfuran derivatives (WO 99/18095), and heterobicyclic derivatives (WO 96/01825; GB 2,291,422A). Thiazole derivatives that suppress TNF-α and IFNγ (WO 99/15524), as well as xanthine derivatives that suppress TNF-α and other pro-inflammatory cytokines (eg, US Pat. No. 5,118,500, US Pat. 5,096,906, and US Pat. No. 5,196,430) are also useful in combination with crystalline TNFR2 polypeptides. Additional small molecules useful for treating conditions described herein in conjunction with crystalline TNFR2 polypeptides include those disclosed in US Pat. No. 5,547,979.

さらに、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、第２のＴＮＦ−αアンタゴニストと組み合わせることができる。第２のＴＮＦ−αアンタゴニストとして、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−α受容体に対する抗体、ＴＮＦ−αに由来するペプチド（これは、ＴＮＦ−αの競合的阻害因子として作用する）（例えば、米国特許第５，７９５，８５９号、または米国特許第６，１０７，２７３号に記載されているもの）、Ｉｇ融合タンパク質以外の可溶性ＴＮＦＲ、または内因性のＴＮＦ−αのレベルを低下させる他の分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、またはＴＮＦ−αの生成を阻害するリボザイム、またはＴＮＦ−α転換酵素の阻害因子（例えば、米国特許第５，５９４，１０６号を参照のこと）、または上記に記載されている低分子もしくはＴＮＦ−α阻害因子のいずれか（ペントキシフィリンまたはサリドマイドもしくはその誘導体を含む）が挙げられる。サリドマイドまたはサリドマイド誘導体は、例えば、血液疾患および腫瘍性疾患を処置するために、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドと同時に投与することができる。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチド単独で処置することができるこのような障害の例として、移植片対宿主病、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、鎌状赤血球血管障害、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞白血病、悪液質および高カルシウム血症の腫瘍随伴症候群、多発性骨髄腫、およびＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経障害、臓器肥大症、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症、および皮膚の変化）、骨髄線維症／骨髄様化生、カポジ肉腫、ガンに伴う悪液質、アミロイドーシス、慢性疾患の貧血、扁平上皮ガン、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性溶血性貧血、およびベータ・サラセミアが挙げられる。本発明の１つの実施形態においては、サリドマイドと併用される結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは結晶性エタナーセプトである。   Furthermore, the crystalline TNFR2 polypeptide can be combined with a second TNF-α antagonist. As a second TNF-α antagonist, an antibody to TNF-α or a TNF-α receptor, a peptide derived from TNF-α, which acts as a competitive inhibitor of TNF-α (see, eg, US Pat. 5,795,859, or those described in US Pat. No. 6,107,273), soluble TNFR other than Ig fusion proteins, or other molecules that reduce the level of endogenous TNF-α (eg, , Antisense oligonucleotides), or ribozymes that inhibit the production of TNF-α, or inhibitors of TNF-α convertase (see, eg, US Pat. No. 5,594,106), or as described above Any small molecule or TNF-α inhibitor (including pentoxifylline or thalidomide or its derivatives). It is. Thalidomide or thalidomide derivatives can be administered concurrently with the crystalline TNFR2 polypeptide, for example, to treat hematological and neoplastic diseases. Examples of such disorders that can be treated with crystalline TNFR2 polypeptide alone include graft versus host disease, myelodysplastic syndrome, aplastic anemia, sickle cell vascular disorder, acute myeloid leukemia (AML), Chronic lymphocytic leukemia (CLL), hairy cell leukemia, cachexia and hypercalcemia associated tumor syndrome, multiple myeloma, and POEMS syndrome (polyneuropathy, organ hypertrophy, endocrine disorder, monoclonal) Immunoglobulinemia and skin changes), myelofibrosis / myeloid metaplasia, Kaposi's sarcoma, cachexia associated with cancer, amyloidosis, chronic disease anemia, squamous cell carcinoma, idiopathic thrombocytopenic purpura ( ITP), thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), autoimmune hemolytic anemia, and beta thalassemia. In one embodiment of the invention, the crystalline TNFR2 polypeptide used in combination with thalidomide is crystalline TNFR2: Fc or crystalline etanercept.

さらに、本発明により、その必要があるヒト患者を処置するための方法が提供される。この方法には、ＵＳ２００１／００２１３８Ａ１（これは、引用によりその全体が本明細書中に組み入れられる）に記載されているように、治療有効量の結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドおよびＩＬ−４阻害因子を患者に投与することが含まれる。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドとＩＬ−４阻害因子の組み合わせによって効果的に処置するができる状態としては、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺胞タンパク症、ブレオマイシンによって誘導される肺症（ｐｎｅｕｍｏｐａｔｈｙ）および線維症、放射線によって誘導される肺線維症、嚢胞性線維症、肺でのコラーゲンの蓄積、ＡＲＤＳ；種々の皮膚疾患（疱疹状皮膚炎（ダーリング病）、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、蕁麻疹（慢性特発性蕁麻疹を含む）を含むが、これらに限定されない）、ならびに、自己免疫性水疱形成性疾患（尋常性天疱瘡、および水疱性類天疱瘡を含む）；重症筋無力症、サルコイドーシス（肺サルコイドーシスを含む）、強皮症、反応性関節炎；高ＩｇＥ症候群、多発性硬化症、および特発性好酸球増加症候群；医薬品に対するアレルギー性の反応が挙げられる。さらに、アレルギーの免疫療法に対するアジュバントとして使用される。特定の実施形態においては、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドとＩＬ−４阻害因子の組み合わせが、１週間に１回以上、皮下注射によって、またはエアゾールの肺投与によって、例えば、ネブライザーによって投与される。   Furthermore, the present invention provides a method for treating a human patient in need thereof. This method involves the treatment of a therapeutically effective amount of crystalline TNFR2 polypeptide and IL-4 inhibitor as described in US2001 / 002138A1, which is incorporated herein by reference in its entirety. Administration. Conditions that can be effectively treated by the combination of crystalline TNFR2 polypeptide and IL-4 inhibitor include asthma, chronic obstructive pulmonary disease, alveolar proteinosis, bleomycin-induced pneumopathy and fibrosis , Pulmonary fibrosis induced by radiation, cystic fibrosis, accumulation of collagen in the lung, ARDS; various skin diseases (herpes dermatitis (Darling's disease), atopic dermatitis, contact dermatitis, urticaria Including but not limited to chronic idiopathic urticaria), and autoimmune blistering diseases (including pemphigus vulgaris and bullous pemphigoid); myasthenia gravis, sarcoidosis (Including pulmonary sarcoidosis), scleroderma, reactive arthritis; high IgE syndrome, multiple sclerosis, and idiopathic eosinophilia syndrome; They include allergic reactions to chemicals. In addition, it is used as an adjuvant for allergy immunotherapy. In certain embodiments, the combination of crystalline TNFR2 polypeptide and IL-4 inhibitor is administered one or more times per week by subcutaneous injection or by pulmonary administration of an aerosol, for example, by a nebulizer.

本明細書中に記載される疾患についての他の処置としては、ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫ−リガンドに対するアンタゴニスト抗体、オステオプロテゲリン、または、ＲＡＮＫの可溶性形態（ＲＡＮＫ：Ｆｃを含む）、およびＲＡＮＫを誘発することのないＲＡＮＫ−リガンドの可溶性形態のような、ＲＡＮＫとＲＡＮＫ−リガンドとの結合をブロックする化合物と同時に、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドを投与することが含まれる。本発明の１つの実施形態においては、ヒトＲＡＮＫＬに特異的に結合する抗体が、結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドと同時に投与される。これらの組み合わせに適しているＲＡＮＫの可溶性形態は、例えば、米国特許第６，０１７，７２９号に記載されている。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドの、ＲＡＮＫ：Ｆｃまたはオステオプロテゲリンとの同時投与は、骨粗鬆症、多発性骨髄腫、または骨の変性を生じる他の悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない種々の設定、あるいは骨への転移を防ぐことを助ける抗腫瘍療法において骨破壊を防ぐために、または補綴物の磨耗くずまたは歯周炎に伴う骨破壊を防ぐために有用である。結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドとＲＡＮＫ阻害因子の組み合わせで処置することができる腫瘍として、乳ガン、肺ガン、黒色腫、骨肉腫、扁平上皮ガン、頭頸部ガン、腎臓ガン、前立腺ガン、および高カルシウム血症を伴うガンが挙げられる。   Other treatments for the diseases described herein include antagonist antibodies to RANK or RANK-ligand, osteoprotegerin, or soluble forms of RANK (including RANK: Fc), and RANK Administration of a crystalline TNFR2 polypeptide simultaneously with a compound that blocks the binding of RANK to RANK-ligand, such as a soluble form of RANK-ligand without the same. In one embodiment of the invention, an antibody that specifically binds human RANKL is administered concurrently with a crystalline TNFR2 polypeptide, such as crystalline TNFR2: Fc. Soluble forms of RANK suitable for these combinations are described, for example, in US Pat. No. 6,017,729. Co-administration of crystalline TNFR2 polypeptide with RANK: Fc or osteoprotegerin can be used in a variety of settings, including but not limited to osteoporosis, multiple myeloma, or other malignancies that produce bone degeneration, or bone It is useful to prevent bone destruction in anti-tumor therapy that helps prevent metastasis to or to prevent bone destruction associated with prosthetic wear debris or periodontitis. Tumors that can be treated with a combination of crystalline TNFR2 polypeptide and a RANK inhibitor include breast cancer, lung cancer, melanoma, osteosarcoma, squamous cell carcinoma, head and neck cancer, kidney cancer, prostate cancer, and hypercalcemia Cancer with

（さらなる用途）
リンパ球の非ウイルスベクターでのトランスフェクションにより、ＴＮＦ−αおよびＣＤ９５によって媒介される経路を通じて標的細胞のアポトーシスを誘導することができる（例えば、Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ５：１６５−７３（１９９９）を参照のこと）。結晶性ＴＮＦＲ２：Ｆｃのような結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、このアポトーシスを阻害するために、単独で使用することができ、また、ＣＤ９５に対する抗体のようなＣＤ９５阻害因子と組み合わせて使用することもできる。この処置は、非ウイルスベクターを使用した場合、特に、リポソーム媒介性もしくは受容体媒介性遺伝子導入方法を使用した場合には、リンパ球への遺伝子の導入を増強させる。このような処置によって、標的細胞内への外来遺伝子の取り込みを改善することができる。 (Further use)
Transfection of lymphocytes with non-viral vectors can induce apoptosis of target cells through a pathway mediated by TNF-α and CD95 (eg, Ebert et al., Cytokines, Cell & Mol Ther 5: 165). -73 (1999)). Crystalline TNFR2 polypeptides such as crystalline TNFR2: Fc can be used alone or in combination with CD95 inhibitors such as antibodies to CD95 to inhibit this apoptosis. . This treatment enhances gene transfer into lymphocytes when using non-viral vectors, particularly when using liposome-mediated or receptor-mediated gene transfer methods. Such treatment can improve the uptake of foreign genes into target cells.

さらに、本発明の組成物は、また、結晶性ＴＮＦＲ２ポリペプチドが処置しようとする状態の処置または緩和のための１つ以上の医薬品の製造のために使用することもできる。   Furthermore, the compositions of the invention can also be used for the manufacture of one or more medicaments for the treatment or alleviation of conditions to which the crystalline TNFR2 polypeptide is to be treated.

以下の実施例は、本発明をさらに完全に説明するために提供され、その範囲を限定するとは解釈されない。   The following examples are provided to more fully illustrate the present invention and are not to be construed as limiting its scope.

（実施例１）
（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタナーセプト）の結晶化のための方法）
エタナーセプトポリペプチドは、上記のように、ヒトの免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）の一部に融合させられたヒト腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ ｐ７５）の細胞外ドメインの一部からなる。エタナーセプトポリペプチドは、哺乳動物宿主細胞中でエタナーセプトをコードするＤＮＡ構築物を発現させることによって調製し、その後、実質的に均質となるように精製した。その後の結晶化実験のために、エタナーセプトポリペプチドを、リン酸緩衝液中に懸濁させた。 Example 1
(Method for crystallization of ENBREL® (Ethanercept))
The etanercept polypeptide consists of part of the extracellular domain of human tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR p75) fused to a part of human immunoglobulin G1 (IgG1) as described above. The etanercept polypeptide was prepared by expressing a DNA construct encoding etanercept in mammalian host cells and then purified to be substantially homogeneous. For subsequent crystallization experiments, etanercept polypeptide was suspended in phosphate buffer.

エタナーセプトの結晶化は、結晶化スクリーン（ＰＥＧ／ＬｉＣｌ Ｇｒｉｄ Ｓｃｒｅｅｎ；Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）を使用して行った。これは、「懸滴」蒸気拡散として知られている巨大分子の結晶化のための方法を使用する。ポリペプチド試料および結晶化試薬（「結晶化緩衝液」または「母液」）の混合物からなる液滴を、シアラナイズしたカバーガラスの下側に載せ、その後、カバーガラス上の液滴をグリースでシールし、通常は２４ウェルＶＤＸトレイの上に乗せて、試薬の液体容器と蒸気平衡を生じるようにする。平衡に達するように、水蒸気を、液滴と、トレイのウェルの中の１ミリリットルの容器溶液との間で交換する。液滴の水分がなくなると、ポリペプチド試料は相対的な濃度が上昇して、最終的には、過飽和を生じる場合がある。結晶化を行うために必要なのはポリペプチド試料の濃度の上昇である。通常は、液滴には、容器よりも低い濃度の試薬が含まれており、通常は、液滴には、容器中の試薬の濃度の半分が含まれている。なぜなら、等しい容量の試料と試薬を、液滴を形成させるために混合するからである。これらの実験では、液滴中の最初のポリペプチド濃度を、通常、２５．４８ｍｇ／ｍＬ、または５０．９６ｍｇ／ｍＬとしたが、結晶化はまた、およそ６ｍｇ／ｍＬのエタナーセプトポリペプチド濃度でも観察でき、また、１００ｍｇ／ｍＬのような高濃度、もしくはおよそ３ｍｇ／ｍＬのようなさらに低いポリペプチド濃度でも得られた。しかし、低濃度では、より長時間のインキュベーションが、最初の液滴の大きさに応じて、結晶の成長のために必要である場合がある。   Crystallization of etanercept was performed using a crystallization screen (PEG / LiCl Grid Screen; Hampton Research, Aliso Viejo, CA). This uses a method for crystallization of macromolecules known as “hanging drop” vapor diffusion. Droplets consisting of a mixture of polypeptide sample and crystallization reagent ("crystallization buffer" or "mother liquor") are placed on the underside of a sheared cover glass, and then the droplets on the cover glass are sealed with grease. Typically placed on a 24-well VDX tray to provide vapor equilibrium with the reagent liquid container. To reach equilibrium, water vapor is exchanged between the droplet and 1 milliliter of container solution in the well of the tray. When the droplets are depleted, the polypeptide sample increases in relative concentration and may eventually become supersaturated. What is required to perform crystallization is an increase in the concentration of the polypeptide sample. Typically, the droplet contains a lower concentration of reagent than the container, and typically the droplet contains half the concentration of the reagent in the container. This is because equal volumes of sample and reagent are mixed to form droplets. In these experiments, the initial polypeptide concentration in the droplet was usually 25.48 mg / mL, or 50.96 mg / mL, but crystallization also resulted in an etanercept polypeptide concentration of approximately 6 mg / mL. However, it was also possible to obtain high concentrations such as 100 mg / mL or even lower polypeptide concentrations such as approximately 3 mg / mL. However, at lower concentrations, longer incubations may be necessary for crystal growth, depending on the initial droplet size.

結晶化スクリーンを、２４ウェルＶＤＸポリプロピレン組織培養トレイ中にセットした。ＶＤＸトレイの中のそれぞれの位置には、１ｍＬの試薬容器を含め、それぞれのウェルの試薬容器は、種々の結晶化緩衝液条件の並びとなるように、他のウェルとは組成が異なるようにした。それぞれのポリペプチド濃度の１マイクロリットルのポリペプチド溶液を、１マイクロリットルの容器溶液に添加して、液滴を形成させた。トレイを、５±３℃、または室温（２０±３℃）のいずれかでインキュベートした。室温でインキュベートしたいくつかのウェルの中ではおよそ４８時間で結晶が現れ、その後数日間、成長させるためにインキュベートし続けた。   The crystallization screen was set in a 24-well VDX polypropylene tissue culture tray. Each position in the VDX tray contains a 1 mL reagent container, and each well reagent container has a different composition from the other wells so that it is aligned with various crystallization buffer conditions. did. One microliter of polypeptide solution at each polypeptide concentration was added to a 1 microliter container solution to form droplets. The trays were incubated at either 5 ± 3 ° C. or room temperature (20 ± 3 ° C.). In some wells incubated at room temperature, crystals appeared in approximately 48 hours and then continued to grow for several days.

最初のスクリーンにおいては、２５．４８ｍｇ／ｍＬのエタナーセプト濃度、または５０．９６ｍｇ／ｍＬの濃度のいずれかを使用した以下の条件下で、結晶が得られた：
１．１．０Ｍの塩化リチウム、０．１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）；３０％のポリエチレングリコール６０００
２．１．０Ｍの塩化リチウム、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；３０％のポリエチレングリコール６０００
３．１．０Ｍの塩化リチウム、０．１ＭのＢｉｃｉｎｅ（ｐＨ９．０）；３０％のポリエチレングリコール６０００
４．０．２Ｍの硫酸リチウム、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）；３０％のポリエチレングリコール４０００
５．０．２Ｍの硫酸リチウム、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）；２５％のポリエチレングリコール３３５０
６．０．５Ｍの硫酸リチウム、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）。
上記の最初の３つの条件下で形成されたエタナーセプトの結晶は、およそ１ｍｍの長さの桿状はまた桿のクラスターであり、多くの場合は、不定形の沈殿物が付随していた。硫酸リチウム条件で形成されたエタナーセプトの結晶は、およそ０．１〜０．２ｍｍの長さの桿状であり、塩化リチウム条件で見られた不定形の沈殿物を伴わずに形成された。エタナーセプトの結晶のいくつかを、Ｘ線回折によって試験したが、塩様の回折パターンは示さなかった。結果は、ポリペプチド物質を含む結晶と一致した。エタナーセプトの結晶のいくつかを溶解させ、それらのポリペプチド内容物を、７サイクルの自動エドマン分解によって部分的に配列決定した；３〜４ｐｍｏｌの部分的なアミノ酸配列をこれらの結晶から得、エタナーセプトの配列のＮ末端部分と一致することを確認した（ＬＰＡＱＶＡＦ；配列番号４のアミノ酸１から７を参照のこと）。図１は、１ミリリットルあたり５０．９６ｍｇのエタナーセプトを、０．１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、３０％のＰＥＧ ６００００、０．７Ｍの塩化リチウムの結晶化容器緩衝液とともに含むポリペプチド溶液から形成されたエタナーセプト結晶の写真である。室温で７日間の後、結晶を手で回収し、上記の容器緩衝液十分に洗浄し、写真を撮影した。このグループからの結晶を、上記のＮ末端アミノ酸配列の分析に供した。別の結晶化条件 − １Ｍの硫酸リチウム、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．０１Ｍの塩化ニッケル − によって結晶が生じた。しかし、これらの結晶のポリペプチド内容物は確認できず、したがって、この特定の条件の組み合わせのもとでは、塩の結晶は形成されていないと考えられる。 In the first screen, crystals were obtained under the following conditions using either an etanercept concentration of 25.48 mg / mL or a concentration of 50.96 mg / mL:
1.1.0 M lithium chloride, 0.1 M HEPES (pH 7.0); 30% polyethylene glycol 6000
2.1.0 M lithium chloride, 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0); 30% polyethylene glycol 6000
3.1.0 M lithium chloride, 0.1 M Bicine (pH 9.0); 30% polyethylene glycol 6000
4. 0.2 M lithium sulfate, 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5); 30% polyethylene glycol 4000
5. 0.2 M lithium sulfate, 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5); 25% polyethylene glycol 3350
6. 0.5 M lithium sulfate, 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5).
The etanercept crystals formed under the first three conditions described above were approximately 1 mm long rods, which were also clusters of rods, often accompanied by amorphous precipitates. Crystals of etanercept formed under lithium sulfate conditions were in the form of bowls with a length of approximately 0.1 to 0.2 mm, and were formed without the amorphous precipitates found under lithium chloride conditions. Some of the etanercept crystals were examined by X-ray diffraction and did not show a salt-like diffraction pattern. Results were consistent with crystals containing polypeptide material. Some of the crystals of etanercept were dissolved and their polypeptide contents were partially sequenced by 7 cycles of automated Edman degradation; 3-4 pmol of partial amino acid sequence was obtained from these crystals and etanercept of Confirmed to match the N-terminal portion of the sequence (LPAQVAF; see amino acids 1 to 7 of SEQ ID NO: 4). FIG. 1 is formed from a polypeptide solution containing 50.96 mg of etanercept per milliliter together with a crystallization vessel buffer of 0.1 M HEPES (pH 7.0), 30% PEG 60000, 0.7 M lithium chloride. It is the photograph of the prepared etanercept crystal. After 7 days at room temperature, the crystals were collected by hand, washed thoroughly with the container buffer described above and photographed. Crystals from this group were subjected to analysis of the N-terminal amino acid sequence described above. Crystallization was caused by another crystallization condition-1 M lithium sulfate, 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5), 0.01 M nickel chloride. However, the polypeptide content of these crystals cannot be confirmed, and therefore it is believed that no salt crystals are formed under this particular combination of conditions.

これらの結果に基づいて、上記の最初の３つの条件の３個のパラメーター（ＬｉＣｌ濃度、ｐＨ、および％（重量／容量）で示されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００の濃度）のそれぞれを、さらなる実験において変化させた。これによって、さらなる実験用トレイの中の全ての液滴の中で結晶の形成が生じた。０．７Ｍから１．２Ｍの間の塩化リチウム濃度、２２％から３２％の間のＰＥＧ ６０００濃度、およびｐＨ６．８から７．３の間の０．１ＭのＨＥＰＥＳのｐＨ値の全てが、室温でおよそ４８時間の、２５．４８ｍｇ／ｍＬおよび５０．９６ｍｇ／ｍＬのエタナーセプト濃度で、良好な結晶化を生じた。さらなる実験では、良好な結晶化条件の範囲を、０．２Ｍから１．２ＭのＬｉＣｌ、および１６％から３２％のＰＥＧ ６０００までを含むように拡大したが、エタナーセプトの結晶化は、０．２ＭのＬｉＣｌを含む条件の全ての組み合わせで起こらず、そして／または、エタナーセプトの結晶は０．２ＭのＬｉＣｌを使用した場合には、形成するまでにより長い時間がかかり得る。したがって、以下の条件の全ての組み合わせ − ０．３Ｍから１．２Ｍの間の塩化リチウム濃度、１６％から３２％の間のＰＥＧ ６０００濃度、およびｐＨ６．８から７．３の間の０．１ＭのＨＥＰＥＳのｐＨ値 − を、エタナーセプトの結晶化に適している条件と考えられる。さらに、０．２Ｍから０．５Ｍの間の硫酸リチウム、およそｐＨ８．５の０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含み、状況に応じて、３０％までのＰＥＧ（ＰＥＧ ３３５０〜ＰＥＧ ４０００までの大きさの範囲）を含む条件を、エタナーセプトの結晶化に適している条件であると考えられる。   Based on these results, each of the three parameters of the first three conditions above (LiCl concentration, pH, and concentration of polyethylene glycol (PEG) 6000 in% (weight / volume)) was further tested. Was changed. This resulted in the formation of crystals in all the droplets in the additional laboratory tray. Lithium chloride concentration between 0.7M and 1.2M, PEG 6000 concentration between 22% and 32%, and pH value of 0.1M HEPES between pH 6.8 and 7.3 are all at room temperature. Good crystallization occurred at etanercept concentrations of 25.48 mg / mL and 50.96 mg / mL for approximately 48 hours. In further experiments, the range of good crystallization conditions was expanded to include 0.2M to 1.2M LiCl and 16% to 32% PEG 6000, but etanercept crystallization was 0.2M. Does not occur in all combinations of conditions including LiCl and / or etanercept crystals may take longer to form when 0.2 M LiCl is used. Thus, all combinations of the following conditions-lithium chloride concentration between 0.3M and 1.2M, PEG 6000 concentration between 16% and 32%, and 0.1M between pH 6.8 and 7.3. The pH value of HEPES of − is considered to be a condition suitable for etanercept crystallization. In addition, it contains between 0.2M and 0.5M lithium sulfate, 0.1M Tris-HCl at approximately pH 8.5, depending on the situation, up to 30% PEG (sizes from PEG 3350 to PEG 4000) It is considered that the conditions including the above range are suitable for the crystallization of etanercept.

（実施例２）
（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタナーセプト）の結晶化のための別の方法）
上記の実施例１に記載した結晶化のための「懸滴」方法を、エタナーセプトのさらなる結晶を調製するために使用した。エタナーセプトを、製品の説明書に従って市販されているＥＮＢＲＥＬ（登録商標）凍結乾燥粉末から再構成した：ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）の凍結乾燥粉末のバイアルには、２５ｍｇのエタナーセプト、４０ｍｇのマンニトール、１０ｍｇのスクロース、および１．２ｍｇのトロメタミンが含まれている。これを、１ｍＬの滅菌された静菌性注射用水[Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ Ｗａｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ＵＳＰ（０．９％のベンジルアルコールを含む）]で再構成する。再構成したエタナーセプトの溶液を、１０，０００分子量カットオフ透析カセットを使用して水中に透析しその後、１０，０００分子量カットオフ遠心分離フィルターを使用して１００ｍｇ／ｍＬに濃縮した。それぞれの結晶化ウェルには、以下に列挙するように、容器中に１．０ｍＬの特定の結晶化試薬を含めた。液滴を、１マイクロリットルのその結晶化試薬に対して１００ｍｇ／ｍＬのエタナーセプト溶液１マイクロリットルを添加することによって生成した。結晶を、室温（およそ２２℃）で成長させた。約１００マイクロメートルの長さの針状のエタナーセプトの結晶が、以下に列挙する全ての結晶化試薬中で、いくつかの場合には、２日程度の短い期間で、そして他の場合には、２週間から４週間の期間で、形成された。 (Example 2)
(Another method for crystallization of ENBREL® (Ethanercept))
The “hanging drop” method for crystallization described in Example 1 above was used to prepare additional crystals of etanercept. Etanercept was reconstituted from commercially available ENBREL® lyophilized powder according to product instructions: ENBREL® lyophilized powder vials contained 25 mg etanercept, 40 mg mannitol, 10 mg sucrose. , And 1.2 mg tromethamine. This is reconstituted with 1 mL of sterile bacteriostatic water for injection [Sterile Bacteriostatic Water for Injection, USP (containing 0.9% benzyl alcohol)]. The reconstituted etanercept solution was dialyzed into water using a 10,000 molecular weight cut-off dialysis cassette and then concentrated to 100 mg / mL using a 10,000 molecular weight cut-off centrifuge filter. Each crystallization well contained 1.0 mL of a specific crystallization reagent in a container as listed below. Droplets were generated by adding 1 microliter of a 100 mg / mL etanercept solution to 1 microliter of the crystallization reagent. Crystals were grown at room temperature (approximately 22 ° C.). Approximately 100 micrometer long needle-shaped etanercept crystals are present in all the crystallization reagents listed below, in some cases as short as 2 days, and in other cases, Formed over a period of 2 to 4 weeks.

別の結晶化実験においては、約１００マイクロメートルの長さのエタナーセプトの針状結晶が、以下の結晶化条件下で２週間から４週間の期間で形成された。

In another crystallization experiment, etanercept needles of about 100 micrometers in length were formed over a period of 2 to 4 weeks under the following crystallization conditions.

（実施例３）
（結晶化条件のさらなる拡大）
上記の実施例１でエタナーセプトの結晶化について記載した「懸滴」方法のような蒸気拡散結晶化方法は、ＴＮＦＲ２ポリペプチドのようなポリペプチドの結晶化を行うために変更することができる。例えば、試薬に対して他の容量のポリペプチド試料を混合して、液滴と容器との間の試薬濃度の差を変化させることができ、また、液滴中の最初のポリペプチド濃度を変化させることもできる。９部のポリペプチド試料に対して１部の試薬を混合することによって、容器の試薬濃度の０．１倍である、最初の試薬濃度を有する液滴を生じることができる。本発明の特定の実施形態においては、液滴中の結晶化試薬の最初の濃度は、容器中の結晶化試薬の濃度の、およそ０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．７、０．８、０．８５、０．９、または０．９５倍である。液滴中の最初のポリペプチド濃度は、およそ６ｍｇ／ｍＬのような低濃度であっても、１００ｍｇ／ｍＬのような高濃度であっても、また、１２０ｍｇ／ｍＬのような可能な限り高い濃度であってもよい。３ｍｇ／ｍＬのような低いポリペプチド濃度でも結晶は形成されるが、結晶を検出することができるまでにはより長いインキュベーション時間が必要である場合がある。

(Example 3)
(Further expansion of crystallization conditions)
Vapor diffusion crystallization methods such as the “hanging drop” method described for etanercept crystallization in Example 1 above can be modified to crystallize a polypeptide such as a TNFR2 polypeptide. For example, you can mix other volumes of polypeptide sample with the reagent to change the difference in reagent concentration between the drop and the container, and change the initial polypeptide concentration in the drop It can also be made. Mixing 1 part reagent with 9 parts polypeptide sample can produce droplets with an initial reagent concentration that is 0.1 times the reagent concentration of the container. In certain embodiments of the invention, the initial concentration of the crystallization reagent in the droplet is approximately 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.7, 0.8, 0.85, 0.9, or 0.95 times. The initial polypeptide concentration in the droplet is as low as approximately 6 mg / mL, as high as 100 mg / mL, and as high as possible, such as 120 mg / mL. It may be a concentration. Crystals are formed at polypeptide concentrations as low as 3 mg / mL, but longer incubation times may be required before crystals can be detected.

結晶化条件のさらなる拡大により、エタナーセプトまたは他のＴＮＦＲ２ポリペプチドの結晶を得るために適切であるさらなる条件が、以下に記載するように得られる。例えば、塩条件、ｐＨ緩衝液条件、状況に応じたＰＥＧ条件、および状況に応じた補因子条件を組み合わせることができる。それぞれの条件は、以下に記載する条件の対応するグループから選択される。   With further expansion of crystallization conditions, additional conditions that are suitable for obtaining crystals of etanercept or other TNFR2 polypeptides are obtained as described below. For example, salt conditions, pH buffer conditions, PEG conditions depending on the situation, and cofactor conditions depending on the situation can be combined. Each condition is selected from the corresponding group of conditions described below.

（実施例４）
ポリペプチド結晶を形成させた後、これらを、それらのポリペプチド内容物を確認し、それらの物理的な構造をさらに試験するために、種々の分析に供することができる。例えば、必要である場合は、個々の結晶を、結晶化溶液から取り出すことができ、そして水性溶媒もしくは有機溶媒、または添加物で洗浄し、その後（例えば、風乾によって、結晶の上に不活性気体の流れを通過させることによって、凍結乾燥によって、または減圧によって）乾燥させることができる。結晶を単離し、結晶成長用液滴から離し、その後、Ｘ線回折装置に取り付けることができる。

Example 4
After forming the polypeptide crystals, they can be subjected to various analyzes in order to confirm their polypeptide contents and further test their physical structure. For example, if necessary, individual crystals can be removed from the crystallization solution and washed with an aqueous or organic solvent, or additive, and then inert gas over the crystals (eg, by air drying). Can be dried by lyophilization, by lyophilization, or by vacuum. The crystal can be isolated and separated from the crystal growth droplet and then attached to an X-ray diffractometer.

別の例として、ポリペプチド結晶を結晶化溶液から取り出し、洗浄するかまたはリンスして、結晶化溶液の大部分を結晶から除去し、別の溶液で置き換えることもできる。この方法では、結晶化手順に使用した特定の塩を、結晶格子中で、別の塩と置き換えることができる。本発明の１つの実施形態においては、結晶化ＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば、結晶性エタナーセプトは、結晶化緩衝液から分離され、ナトリウム、カリウム、またはマグネシウムの塩（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、または硫酸マグネシウム）を含む溶液に入れられる。Ｘ線回折のためには、置換溶液に、結晶化ポリペプチドの原子座標を決定することにおいて有用である重原子を含めることができる。さらなる実施形態においては、ＴＮＦＲ２ポリペプチドは、それらのリガンドとともに共結晶化させることができ、例えば、エタナーセプトは、ＴＮＦＲ−リガンド相互作用の詳細な構造の決定のために、ＴＮＦ−αと共に結晶化させることができる。   As another example, polypeptide crystals can be removed from the crystallization solution, washed or rinsed to remove most of the crystallization solution from the crystals and replaced with another solution. In this way, the particular salt used in the crystallization procedure can be replaced with another salt in the crystal lattice. In one embodiment of the invention, the crystallized TNFR2 polypeptide, eg, crystalline etanercept, is separated from the crystallization buffer, and the sodium, potassium, or magnesium salt (eg, sodium acetate, sodium chloride, citric acid). Sodium, sodium phosphate, sodium sulfate, potassium chloride, potassium citrate, or magnesium sulfate). For X-ray diffraction, the replacement solution can include heavy atoms that are useful in determining the atomic coordinates of the crystallized polypeptide. In further embodiments, TNFR2 polypeptides can be co-crystallized with their ligands, eg, etanercept is crystallized with TNF-α for determination of the detailed structure of TNFR-ligand interactions. be able to.

さらなる例においては、ポリペプチドの結晶を、結晶化溶液から取り出し、さらなる試験のための適切な緩衝液、例えば、ゲル電気泳動によって結晶化させられたポリペプチドの分析のためのＳＤＳを含む緩衝液の中に溶解させることができる。ゲル電気泳動によりタンパク質を分析するための方法は当該分野で周知であり、これには、銀またはクマシーブルー色素でのゲルの染色、および既知の分子量のポリペプチドマーカーの移動と結晶化させられたポリペプチドの電気泳動による移動を比較することが含まれる。別の方法においては、ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的に結合する標識抗体の使用によって、ゲル中で視覚化させられる。結晶化させられたポリペプチドはまた、エドマン分解によるアミノ酸配列決定のための、質量スペクトル分析のための、他の分光学的分散、屈折、回折、もしくは吸光の研究のための、あるいは、ポリペプチドに対する標識分子の結合によりポリペプチドを標識するための、適切な緩衝液中に溶解させることもできる。   In a further example, polypeptide crystals are removed from the crystallization solution and a suitable buffer for further testing, for example a buffer comprising SDS for analysis of the polypeptide crystallized by gel electrophoresis. Can be dissolved. Methods for analyzing proteins by gel electrophoresis are well known in the art, including gel staining with silver or Coomassie blue dye, and migration and crystallization of polypeptide markers of known molecular weight. Comparing electrophoretic migration of polypeptides is included. In another method, the polypeptide is visualized in a gel by use of a labeled antibody that specifically binds to the polypeptide. Crystallized polypeptides can also be used for Edman degradation amino acid sequencing, for mass spectral analysis, for other spectroscopic dispersion, refraction, diffraction, or absorbance studies, or for polypeptides It can also be dissolved in a suitable buffer for labeling the polypeptide by binding of a label molecule to the.

（実施例５）
（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）の結晶のタンパク質内容物のアッセイ）
上記の実施例１に記載したような、結晶化の「懸滴」方法を、エタナーセプトの別の結晶を調製するために使用した。それぞれのウェルには、容器中に１００マイクロリットルの結晶化試薬を含めた。この実験では、結晶化試薬は、０．２Ｍの酢酸アンモニウム、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）、および４５％の２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）とした。エタナーセプトを、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．３）、１００ｍＭのＮａＣｌを含む溶液中に入れ、その後、２９〜３０ｍｇ／ｍＬに、例えば、２９．６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。液滴を、液滴中の最終的なエタナーセプトの濃度がおよそ１４．５〜１５ｍｇ／ｍＬとなるように、１マイクロリットルの結晶化試薬に対してこの２９ｍｇ／ｍＬのエタナーセプトの溶液を１マイクロリットル添加することによって生成した。液滴中の最終的なエタナーセプト濃度は、これらの特定の結晶化条件下で結晶化を達成することにおいて重要な要因であり、およそ１５ｍｇ／ｍＬの最終的なエタナーセプト濃度が、繰り返した実験において結晶化に有効であることがわかったが、１０ｍｇ／ｍＬ未満、または２５ｍｇ／ｍＬより高い最終濃度は有効ではなかった。液滴を、室温（２０±３℃）でおよそ１週間から３週間の間、容器中の試薬と蒸気交換させた。結晶は、通常は１つの液滴についての２個から４個の核として、複数の分岐を持った構造または樹状構造として形成されて現われ、主構造に多数の突起や分岐が伴う。それぞれの分岐全体の全寸法は、核の中心からおよそ５０マイクロメートルの長さ、およそ３０マイクロメートルの幅、そしておよそ１０マイクロメートルの厚みもしくは深さである。枝の１つは、ナイロンの輪で結晶からはずすことができ、３回の連続する洗浄において上記の結晶化試薬で洗浄し、４×ＳＤＳ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に溶解させ、その後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのウェルに入れ、電気泳動を行った。電気泳動の後、ゲルを銀で染色すると、結晶化させられたタンパク質を泳動させたレーンの中に、結晶を生じさせるために使用したエタナーセプト調製物に由来するタンパク質と同じ程度移動した明確に見ることができる銀染色されたバンドが生じる。このＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動アッセイを、これらの実験で生じた結晶に由来する他の枝を使用して繰り返した。エタナーセプトと同じ電気泳動による移動度を有する溶解させた結晶物質のバンドの染色は、クマシーブルー染色を使用しても行うことができる。したがって、エタナーセプト溶液から形成された結晶には、明らかにエタナーセプトである物質が含まれる。なぜなら、これは、エタナーセプトタンパク質の既知の試料と同じ様式で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で移動し、ゲル中にタンパク質のバンドを生じるからである。 (Example 5)
(Enbrel® Crystalline Protein Content Assay)
The “hanging drop” method of crystallization, as described in Example 1 above, was used to prepare another crystal of etanercept. Each well contained 100 microliters of crystallization reagent in a container. In this experiment, the crystallization reagents were 0.2M ammonium acetate, 0.1M Tris (pH 8.5), and 45% 2-methyl-2,4-pentanediol (MPD). Etanercept was placed in a solution containing 25 mM sodium phosphate (pH 6.3), 100 mM NaCl, and then concentrated to 29-30 mg / mL, for example, 29.6 mg / mL. Add 1 microliter of this 29 mg / mL etanercept solution to 1 microliter crystallization reagent so that the final etanercept concentration in the droplet is approximately 14.5-15 mg / mL. Produced by adding. The final etanercept concentration in the droplets is an important factor in achieving crystallization under these specific crystallization conditions, and a final etanercept concentration of approximately 15 mg / mL was observed in repeated experiments. A final concentration of less than 10 mg / mL or higher than 25 mg / mL was not effective. The droplets were vapor exchanged with the reagents in the container at room temperature (20 ± 3 ° C.) for approximately 1 to 3 weeks. Crystals usually appear as 2 to 4 nuclei per droplet, formed as a structure with multiple branches or a dendritic structure, with a number of protrusions and branches in the main structure. The total dimensions of each entire branch are approximately 50 micrometers long, approximately 30 micrometers wide, and approximately 10 micrometers thick or deep from the center of the nucleus. One of the branches can be detached from the crystal with a nylon loop, washed with the crystallization reagent described above in three successive washes, dissolved in 4 × SDS Laemmli buffer, and then SDS-polyacrylamide. It was placed in a gel well and subjected to electrophoresis. After electrophoresis, when the gel is stained with silver, the crystallized protein migrates into the lane where the crystallized protein migrates, as clearly as it migrates to the same extent as the protein from the etanercept preparation used to generate the crystals. Silver-stained bands that can be produced. This SDS-polyacrylamide gel electrophoresis assay was repeated using other branches derived from the crystals generated in these experiments. Staining of the band of dissolved crystalline material having the same electrophoretic mobility as etanercept can also be performed using Coomassie blue staining. Thus, the crystals formed from the etanercept solution include substances that are clearly etanercept. This is because it migrates in an SDS-polyacrylamide gel in the same manner as a known sample of etanercept protein, resulting in a protein band in the gel.

（実施例６）
（結晶化したポリペプチドの生物学的活性の試験）
上記の実施例に記載したように、ポリペプチドの結晶を、結晶化溶液から回収し、状況に応じて、別の溶液に入れ、洗浄し、そして／または乾燥させて結晶化緩衝液を除去し、その後、さらなるアッセイのために適切な溶液中に溶解させることができる。ＴＮＦＲ２ポリペプチドの生物学的活性は、多数のアッセイのうちのいずれか、例えば、予め結晶化させたＴＮＦＲ２（すなわち、再構成させたＴＮＦＲ２ポリペプチド）についてそのリガンドに結合する能力を決定するための結合アッセイを使用して、試験することができる。以下の実施例では、ＴＮＦ−αに結合するそのようなＴＮＦＲ２ポリペプチド、例えば、エタナーセプトの生物学的活性を測定するためのアッセイを説明する（例えば、Ｍｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１：１５４８−１５６１を参照のこと）。当業者は、このようなアッセイに、他のＴＮＦＲ２ポリペプチドの生物学的活性を測定することにおいて使用するために変更を加えることができることを認識しているであろう。 (Example 6)
(Test of biological activity of crystallized polypeptide)
As described in the above examples, polypeptide crystals are recovered from the crystallization solution and, depending on the situation, placed in another solution, washed and / or dried to remove the crystallization buffer. Can then be dissolved in a suitable solution for further assay. The biological activity of a TNFR2 polypeptide can be determined by any of a number of assays, for example, the ability to bind its ligand to a previously crystallized TNFR2 (ie, a reconstituted TNFR2 polypeptide). Binding assays can be used to test. The following examples describe assays for measuring the biological activity of such TNFR2 polypeptides that bind to TNF-α, eg, etanercept (eg, Mohler et al., 1993, J Immunol 151: 1548-1561). One skilled in the art will recognize that such assays can be modified for use in measuring the biological activity of other TNFR2 polypeptides.

（結合競合アッセイ）
０．５ｎＭの標識したヒトＴＮＦ−α、例えば、［^１２５Ｉ］ＴＮＦ−αを、結合媒体（ＲＰＭＩ １６４０、２．５％のＢＳＡ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．４％のＮａＮ_３）中で４℃で２時間、段階希釈した競合結合因子（例えば、結晶形態から再構成したエタナーセプト、または結晶形態から再構成した別のＴＮＦ−α−結合ＴＮＦＲ２ポリペプチド、あるいは、対照としての未標識のヒトＴＮＦ−αまたは結晶化させていないエタナーセプト）、および２×１０^６個のＵ９３７細胞とともにインキュベートした。その後、２連のアリコートを取り出し、遊離のリガンドと結合したリガンドを分けるためにフタル酸エステルの油混合物を通じて遠心分離し、放射活性（細胞に結合した［^１２５Ｉ］ＴＮＦ−α）を、ガンマカウンターを使用して測定した。非特異的結合値を、２００倍モル過剰の未標識のＴＮＦ−αを含めることによって決定し、全結合データから引き算して特異的結合値を得た（例えば、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７１：１０７３−１０８９を参照のこと）。 (Binding competition assay)
0.5 nM labeled human TNF-α, for example, [ ¹²⁵ I] TNF-α, was added to the binding medium (RPMI 1640, 2.5% BSA, 50 mM HEPES, pH 7.4), 0.4% NaN. ₃ ) A competitive binding factor (eg, etanercept reconstituted from the crystalline form, or another TNF-α-binding TNFR2 polypeptide reconstituted from the crystalline form, for 2 hours at 4 ° C. in 2) or as a control Unlabeled human TNF-α or uncrystallized etanercept), and 2 × 10 ⁶ U937 cells. Thereafter, duplicate aliquots were removed and centrifuged through a phthalate oil mixture to separate the free and bound ligands, and the radioactivity ([ ¹²⁵ I] TNF-α bound to the cells) was measured using a gamma counter. Was measured using. Nonspecific binding values were determined by including a 200-fold molar excess of unlabeled TNF-α and subtracted from total binding data to obtain specific binding values (see, eg, Park et al., 1990, J Exp Med 171: 1107-1089).

（ＬＰＳによって誘導される死亡率からの救出）
致死量のＬＰＳ（リポ多糖）の注射により、マウスにおいて血清ＴＮＦ−αレベルを上昇させて、ＴＮＦ−αの作用を中和する十分な量の試薬を投与していない場合の死亡率を生じさせた（例えば、Ｍｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１：１５４８−１５６１を参照のこと）。ＬＰＳ、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の細菌ＬＰＳを、１０ｍｇ／ｍＬの滅菌した生理食塩水に再懸濁させ、少量のアリコートとして−２０℃で保存した。ＬＰＳを適切な濃度に希釈し、注射の前に１分間超音波処理した。ＢＡＬＢ／ｃの雌マウス（１８から２０ｇ）のようなマウスに、ＬＤ６０からＬＤ１００用量のＬＰＳ（３００〜４００マイクログラム）を、０．２ｍＬの生理食塩水溶液で静脈注射した。ＬＰＳは、単独で、または結晶形態から再構成させたエタナーセプトと、もしくは結晶形態から再構成させた別のＴＮＦ−α結合ＴＮＦＲ２ポリペプチド、あるいは、結晶化させていないエタナーセプトもしくはヒトＩｇＧのような対照タンパク質と組み合わせてのいずれかで注射した。生存性を、少なくとも５日間モニターした。活性のある再構成したＴＮＦ−α−結合ＴＮＦＲ２ポリペプチドの存在は、十分な量の再構成されたＴＮＦ−α−結合ＴＮＦＲ２ポリペプチドが投与された場合の、ＬＰＳを注射したマウスの生存性の増大によって示される。 (Rescue from LPS-induced mortality)
Injection of lethal doses of LPS (lipopolysaccharide) raises serum TNF-α levels in mice, resulting in mortality in the absence of a sufficient amount of reagent to neutralize the effects of TNF-α. (See, eg, Mohler et al., 1993, J Immunol 151: 1548-1561). LPS, for example bacterial LPS from E. coli, was resuspended in 10 mg / mL sterile saline and stored as a small aliquot at −20 ° C. LPS was diluted to the appropriate concentration and sonicated for 1 minute prior to injection. Mice, such as BALB / c female mice (18-20 g), were intravenously injected with 0.2 mL of saline solution at an LD60 to LD100 dose of LPS (300-400 micrograms). LPS alone or etanercept reconstituted from a crystalline form, or another TNF-α-binding TNFR2 polypeptide reconstituted from a crystalline form, or a control, such as uncrystallized etanercept or human IgG Injection was either in combination with protein. Viability was monitored for at least 5 days. The presence of active reconstituted TNF-α-conjugated TNFR2 polypeptide is indicative of the viability of mice injected with LPS when a sufficient amount of reconstituted TNF-α-conjugated TNFR2 polypeptide is administered. Indicated by an increase.

本発明は、本発明の実施のための特定の態様を含むように見られるかまたはそのように提案される特定の実施形態に関して記載されている。本発明の開示を参照して、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、多数の変更および変化を説明される特定の実施形態の中で行うことができることは、当業者に明らかであろう。   The invention has been described with reference to particular embodiments that are either seen or suggested to include particular aspects for the practice of the invention. With reference to the present disclosure, it will be apparent to those skilled in the art that numerous changes and modifications can be made in the specific embodiments described without departing from the intended scope of the invention. Let's go.

（配列表に示された配列）   (Sequence shown in Sequence Listing)

図１は、以下の実施例１にさらに記載されるように、１ミリリットルあたり５０．９６ｍｇのエタナーセプトを含むポリペプチド溶液から形成させられたエタナーセプト結晶の写真である。結晶保存緩衝液は、０．１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、３０％のＰＥＧ ６０００、０．７Ｍの塩化リチウムとした；室温で７日間の後、結晶を、手で回収し、上記の保存緩衝液中で十分に洗浄し、写真を撮影した。このグループによる結晶を、Ｎ末端のアミノ酸配列分析に供した。FIG. 1 is a photograph of an etanercept crystal formed from a polypeptide solution containing 50.96 mg of etanercept per milliliter, as further described in Example 1 below. The crystal storage buffer was 0.1 M HEPES (pH 7.0), 30% PEG 6000, 0.7 M lithium chloride; after 7 days at room temperature, the crystals were collected by hand and stored as described above. Wash thoroughly in buffer and take a picture. Crystals from this group were subjected to N-terminal amino acid sequence analysis.

Claims (27)

エタナーセプトの結晶。 Crystal of etanercept. 前記結晶が桿状形態である、請求項１に記載のエタナーセプトの結晶。 The etanercept crystal according to claim 1, wherein the crystal is in a bowl-like form. 前記結晶が、０．５ミリメートルから１．５ミリメートルの間の最大長を有する、請求項１に記載のエタナーセプトの結晶。 The etanercept crystal of claim 1, wherein the crystal has a maximum length between 0.5 millimeters and 1.5 millimeters. 前記結晶が、０．０５ミリメートルから０．３ミリメートルの間の最大長を有する、請求項１に記載のエタナーセプトの結晶。 The etanercept crystal of claim 1, wherein the crystal has a maximum length between 0.05 millimeters and 0.3 millimeters. 前記結晶が、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、塩化リチウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および硫酸ナトリウムからなる群より選択される塩を含む、請求項１に記載のエタナーセプトの結晶。 The crystals are ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium sulfate, diammonium hydrogen phosphate, lithium chloride, lithium sulfate, magnesium sulfate, potassium chloride, potassium citrate, potassium phosphate, sodium acetate, sodium chloride, sodium citrate, phosphorus The crystal of etanercept according to claim 1, comprising a salt selected from the group consisting of sodium acid and sodium sulfate. 前記結晶が、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、および塩化ナトリウムからなる群より選択される塩を含む、請求項１に記載のエタナーセプトの結晶。 The etanercept crystal according to claim 1, wherein the crystal comprises a salt selected from the group consisting of ammonium acetate, ammonium phosphate, diammonium hydrogen phosphate, and sodium chloride. エタナーセプトの結晶を生成する方法であって、該方法は、エタナーセプトポリペプチドの溶液を、塩を含む結晶化緩衝液と組み合わせる工程を包含する、方法。 A method of producing etanercept crystals comprising combining a solution of etanercept polypeptide with a crystallization buffer comprising a salt. 前記組み合わせが、結晶化緩衝液の容器との蒸気平衡中に位置する、請求項７に記載の方法。 8. The method of claim 7, wherein the combination is located during vapor equilibration with a crystallization buffer vessel. 前記結晶化緩衝液が４．０から１０．５の間のｐＨを有する、請求項７に記載の方法。 The method of claim 7, wherein the crystallization buffer has a pH between 4.0 and 10.5. 前記塩が、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、塩化リチウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および硫酸ナトリウムからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。 The salt is ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium sulfate, diammonium hydrogen phosphate, lithium chloride, lithium sulfate, magnesium sulfate, potassium chloride, potassium citrate, potassium phosphate, sodium acetate, sodium chloride, sodium citrate, phosphorus 8. The method of claim 7, wherein the method is selected from the group consisting of sodium acid and sodium sulfate. 前記結晶化緩衝液中の塩の濃度が、０．０４Ｍから１．２Ｍの間である、請求項７に記載の方法。 8. The method of claim 7, wherein the concentration of salt in the crystallization buffer is between 0.04M and 1.2M. 前記結晶化緩衝液が、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、請求項７に記載の方法。 8. The method of claim 7, wherein the crystallization buffer further comprises 2-methyl-2,4-pentanediol (MPD) or polyethylene glycol (PEG). 結晶が形成した後、前記結晶化緩衝液の少なくとも一部を除去する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。 8. The method of claim 7, further comprising removing at least a portion of the crystallization buffer after crystals are formed. 前記結晶化緩衝液の一部が遠心分離によって除去される、請求項１３に記載の方法。 14. The method of claim 13, wherein a portion of the crystallization buffer is removed by centrifugation. 前記結晶が、有機添加物を含む溶液中に入れられる、請求項１３に記載の方法。 The method of claim 13, wherein the crystals are placed in a solution containing an organic additive. 賦形剤の添加をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。 14. The method of claim 13, further comprising the addition of an excipient. 前記賦形剤が、スクロース、トレハロース、またはソルビトールからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。 17. The method of claim 16, wherein the excipient is selected from the group consisting of sucrose, trehalose, or sorbitol. 前記有機添加物が、エタノールまたはイソプロパノールである、請求項１５に記載の方法。 The method of claim 15, wherein the organic additive is ethanol or isopropanol. 形成した結晶を乾燥させる工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。 The method according to claim 7, further comprising the step of drying the formed crystals. 前記結晶が、空気に対する暴露によって、または減圧に対する暴露によって、または窒素ガスに対する暴露によって、乾燥させられる、請求項１９に記載の方法。 20. The method of claim 19, wherein the crystals are dried by exposure to air or by exposure to reduced pressure or by exposure to nitrogen gas. 請求項７〜２０のいずれか１項に記載の方法によって生成されたエタナーセプトの結晶。 21. A crystal of etanercept produced by the method of any one of claims 7-20. 結晶形態のエタナーセプトを含む組成物。 A composition comprising etanercept in crystalline form. 結晶性エタナーセプトを再構成することによって生成される組成物。 A composition produced by reconstituting crystalline etanercept. 医薬品の調製における、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のエタナーセプトの結晶または請求項２２〜２３のいずれか１項に記載の組成物の使用。 24. Use of an etanercept crystal according to any one of claims 1 to 21 or a composition according to any one of claims 22 to 23 in the preparation of a medicament. 前記医薬品が、過剰なＴＮＦ−αレベルにより特徴付けられる状態を処置するためのものである、請求項２４に記載の使用。 25. Use according to claim 24, wherein the medicament is for treating a condition characterized by excessive TNF- [alpha] levels. 前記医薬品が、被験体の血清または組織中のＴＮＦ−αレベルを低下させる、請求項２５に記載の使用。 26. Use according to claim 25, wherein the medicament reduces TNF- [alpha] levels in the serum or tissue of a subject. 前記状態が、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬、または強直性脊椎炎である、請求項２５に記載の使用。 26. Use according to claim 25, wherein the condition is rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, psoriasis, or ankylosing spondylitis.

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