JP2007519755A - 神経再生を促進する材料および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願の主題は一部、NICHD(助成金番号HD32571)による米国政府支援を受けている。従って、米国政府は本発明において一定の権利を有する。
本願は、2004年1月30日に出願された米国仮特許出願第60/540,522号の恩典を主張する。
神経損傷は慢性障害の主な原因である。神経損傷の不十分な対応は筋萎縮と関連し、切断された軸索が遠位神経と連続性を回復することができない場合、疼痛性神経腫につながることがある。神経には損傷後に再生する能力があるが、この能力は、再生しつつある神経線維(およびその軸索芽)が、切断された神経部分(およびその中にあるシュワン細胞基底層)と適切に接触していることに厳密に左右される。隙間または損傷部位を横断し、切断された遠位神経部分の基底層に入らない再生軸索は劣化して、ニューロン死、筋萎縮、および恒久的な機能欠陥の原因となる(Fawcett JW et al. [1990] Annu Rev Neurosci 13: 43-60(非特許文献1))。
本発明は、神経組織の修復および/または成長を促進する組成物および方法を提供する。好ましい態様において、本発明の方法は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)分解酵素を損傷神経に投与する工程を含む。
本発明は、神経組織の修復および/または成長を促進する組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、疾患、外傷性の出来事、または外科的処置によって遮断された神経の連続性を元通りにするのに使用することができる。本発明の組成物および方法は、損傷神経組織または移植した神経移植片を首尾よく貫通する軸索の数を増やすことによって神経組織の修復を促進して、機能回復を高める。
1つの態様において、HSPG分解酵素は、損傷神経、神経損傷部位、または神経損傷修復部位に適用される。好ましい態様において、HSPG分解酵素は、分断された神経または切り取られた神経の接合(すなわち、端と端をくっつける神経接合)を伴う、一次神経修復部位に適用される。神経損傷は、神経が部分的もしくは完全に分断されているか、小さな領域が傷つけられているか、もしくは外科的に取り除かれている神経離断(神経断裂)でもよく、神経上膜接合(神経縫合)が損傷神経を修復する一次的な方法である。例えば、本発明の組成物および方法は、損傷神経の神経鞘(例えば、基底層、神経周膜、または神経上膜)の少なくとも1つの連続性の破壊を伴う神経損傷の修復を促進するのに使用することができる。好ましくは、外科的修復によって神経要素の再編成が試みられる。
1つの態様において、HSPG分解酵素は神経移植片に適用される。1種類またはそれ以上のHSPG分解酵素が神経移植片に適用される時に、移植片全体を処理することができる。HSPG分解酵素は、まるごと神経移植片全体に適用することができる。この適用は前処理または移植前インキュベーションであり、適用された酵素を取り除く手順を伴っても、伴わなくてもよい。
患者(例えば、ヒトまたは動物)への投与に適した薬学的組成物に、1種類またはそれ以上のHSPG分解酵素を取り入れることができる。このような組成物は、一般的に、少なくとも1種類のHSPG分解酵素および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する用語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与と適合する任意のまたは全ての種類の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質に、このような媒体および薬剤を使用することは当技術分野において周知である。
本発明はまた、ヒトまたは動物に移植するための神経組織を培養する方法に関する。本発明の培養方法は、インビトロで神経組織を「予め変性させる(predegenerating)」ことを伴ってもよい。これによって、移植後に、移植片と宿主神経組織との間の境界面を横断する再生軸索の能力が改善される。さらなる詳細については、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、WO2003/015612を参照。このような文脈で、「予め変性させる」はHSPG分解酵素を(単独でまたは他の酵素と組み合わせて)移植片に適用することを含むことが理解されるはずである。
動物
使用した実験動物は、thy-1-YFP-H系統のトランスジェニックマウスであった(Feng G, Mellor RH, Bernstein M, Keller-Peck C, Nguyen QT, Wallace M,Nerbonne JM, Lichtman JW, Sanes JR[2000]「Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP」Neuron 28: 41-51)。これらのマウスでは、黄色蛍光タンパク質(YFP)がthy-1プロモーターの制御下で発現される。このプロモーターは、thy-1遺伝子産物が運動ニューロンの軸索において正常に発現されるという理由で選択された(Vidal M, Morris R, Grosveld F, Spanopoulou E [1990]「Tissue-specific control elements of the Thy-1 gene」Embo J 9: 833-840)。使用した特定の系統(H)において、YFPは末梢神経の軸索の一部にしか発現しないが、発現すると、軸索ドメイン全体に満ち溢れる(Feng et al. , 2000, 前記)。これらの動物はヘテロ接合体として用いられ、野生型であるC57B/6Jの雌とヘテロ接合体thy-1-YFP-Hの雄を交配させることで得られた(Jackson Laboratories, Bar Harbor, MEから入手した)。組織ドナーとして使用した、これらの交配のF1世代の野生型動物は、thy-1-YFP-Hヘテロ接合体の同腹仔であった。全実験を2〜6ヶ月齢の動物に対して行った。動物は、Emory IACUCが認可したガイドラインを用いて、エモリー大学の動物施設において飼育した。神経科学会-神経科学研究における動物使用方針(Policy on the Use of Animals in Neuroscience Research of the Society for Neuroscience)に従って、全実験を行った。
プロテアーゼフリーコンドロイチナーゼABC(Proteus vulgaris由来,E.C.4.2.2.4)はSeikagaku(Tokyo,Japan)から入手した。ケラタナーゼ(E.C.3.2.1.103)、ヘパリナーゼI(E.C.4.2.2.7)、およびヘパリナーゼIII(ヘパリチナーゼ)(E.C.4.2.2.8)はSigma-Aldrich(St. Louis, MO)から入手した。
thy-1-YFP-Hマウスを用いた予備実験において、本発明者らは、少なくとも2週間、かなりの蛍光が切断神経の遠位断端に残っていたために、再生しつつあるYFP+軸索と順行性変性を受けている軸索を区別できないことを見出した。従って、thy-1-YFP-Hマウスにある離断神経は全て、野生型同腹仔からの移植片を用いて修復した。全実験において、まず最初に、ペントバルビタールナトリウム(90mg/kg,IP)を用いて野生型ドナーマウスに麻酔をかけた。麻酔が深く入ったら、両側にある坐骨神経の終枝を暴露した。予備研究において、坐骨神経の脛骨枝より、総腓骨(CF)神経の枝においてYFP標識ニューロンの数が多いことが分かったので、本発明者らの実験では総腓骨神経を使用した。次いで、坐骨神経からCF神経が分かれる点の遠位側にある、CF神経の3〜5mm長の部分を取り出した。これらの移植片は、再生軸索の観察を可能にする暗い背景となり、再生を増強するための潜在的な治療処置を適用するためのビヒクルともなる。ほとんどの実験において、野生型C57BL/6Jマウスからの左CF神経移植片を室温(23℃)の規定食塩液10μlに浸漬し、1時間の浸漬の間に食塩水が蒸発しないように、プラスチックチャンバーの中に入っている印をつけたカバーガラスの上に置いた。右神経の部分を同様に処理したが、10μlのコンドロイチナーゼABC(20U/ml)、ケラタナーゼ(20U/ml)、またはヘパリナーゼI(20U/ml)に1時間浸漬した。神経を取り出した後、野生型動物を安楽死させた。神経を浸漬している間に、thy-1-YFP-Hマウスに麻酔をかけ、CF神経を暴露した。動物の両側にあるCF神経を、CF神経が坐骨神経から分かれる点の約1mm遠位側で切断した。次いで、野生型ドナーマウスからの移植片を近位断端と遠位断端との間に挿入し、フィブリン接着剤で固定した。フィブリン(E.C.2325986)およびフィブロネクチン(E.C.2891492)の1:1混合物と等量のトロンビン(E.C.3.4.21.5)を一緒にした。これらの試薬は全てSigma-Aldrichから入手した。一緒に混合したら、接着剤を部位に適用し、少なくとも5分間放置した。神経が正しく並べられていなかった場合、またはこの領域が極度に湿っていた場合は、接着剤を再適用することが必要であったが、移植片の近位末端および遠位末端がしっかり留まり、thy-1-YFP-H神経の末端と正しく並ぶまで、手術部位は塞がなかった。一組11匹のさらなるマウスにおいて、未処理移植片を用いて切断神経を両側修復した(n=3)、または移植片をヘパリナーゼIII(20U/ml)溶液(n=4)もしくは4種類全ての酵素が等量含まれている混合物(それぞれ20U/ml,開始濃度)(n=4)で両側処理した後に切断神経の修復に使用した以外は前記のように、CF神経を切断および修復した。
神経の全厚に及ぶ厚さ10μmの光学切片の積み重なりを、前記のように共焦点顕微鏡観を用いて入手した。再生軸索の全長を捕らえるために、積み重なりを、いくつかの連続した顕微鏡視野から入手し、Adobe Photoshopを用いて縫い合わせた。これらの縫い合わされた画像の積み重なりを用いて、移植片における再生軸索1本1本の断面を完全な形で再構築した。Image Pro-Plusソフトウェアを用いて、これらの軸索断面長(外科的修復部位(近位断端)から遠位末端までの長さ)を測定した。軸索断面が2個以上の光学切片で見られても、軸索断面を完全な形で測定した。
コンドロイチナーゼABCはCSPGのタンパク質コアからGAG側鎖を分解するので、GAG側鎖が消化されたら小さな連結領域がコアタンパク質に残る。これらの連結領域は、コンドロイチン硫酸の4-硫酸化部分を認識する抗体(抗体2B6)またはコンドロイチン硫酸の6-硫酸化部分を認識する抗体(抗体3B3)のネオエピトープを形成する(Caterson B, Christner JE, Baker JR,Couchman JR [1985]「Production and characterization of monoclonal antibodies directed against connective tissue proteoglycans」Fed Proc 44: 386-393)。従って、これらの抗体を用いた陽性免疫反応は、CSPGが完全に分解されたことを示すアッセイとなる。本発明者らは、ケラタナーゼまたはヘパリナーゼの一方で神経を処理することによってCSPGが分解されたかどうかを調べるために、このアッセイを用いた。抗体3G10は、HSPGの連結領域にあるネオエピトープを認識する。このネオエピトープは、ヘパリナーゼIII消化後に現れるが、コンドロイチナーゼABC消化後では現れず、ヘパリナーゼI消化後でも現れない(David G, Bai XM, Van der Schueren B, Cassiman JJ, Van den Berghe H [1992]「Developmental changes in heparan sulfate expression: in situ detection with mAbs」J Cell Biol 119: 961-975)。様々なヘパリナーゼを用いた本発明者らの処理によって、切断末梢神経の修復に用いられた移植片においてHSPGの糖鎖除去(de-glycanation)が生じたかどうか調べるために、本発明者らは、マウスCF神経部分の組織切片と、ヘパリナーゼI、ヘパリナーゼIII、コンドロイチナーゼABC、または食塩水を反応させた。3G10免疫反応の正の対照として、本発明者らはマウス腎臓の連続切片を同様に処理した。
thy-1-YFPマウスのH系統では、黄色蛍光タンパク質の存在によって末梢神経の軸索の一部が標識されるが(Feng G, Mellor RH, Bernstein M, Keller-Peck C, Nguyen QT, Wallace M, Nerbonne JM, Lichtman JW, Sanes JR[2000]「Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP」Neuron 28: 41-51)、標識された全ての軸索の割合(知覚軸索でも運動軸索でも)は分かっていない。CF神経に寄与する主要な体節神経(L4およびL5)の後根および前根にあるYFP+軸索の数を、3匹のマウスからの脊髄神経(5組の神経)のホールマウントを通る光学切片において数えた(図1A)。知覚軸索および運動軸索の数の平均(±SEM)を表Iに示した。
野生型同腹仔からの未処理移植片または食塩水処理移植片を用いてCF神経の外科的切断を修復した1週間後のthy-1-YFP-Hマウスにおいて(図2A)、軸索が再生した証拠はほとんど認められない(図2B:食塩水)。神経修復の1週間後、標識軸索の蛍光断面の大部分は、切断神経の近位断端と移植片との境界面である外科的修復部位の近くに見られた。わずかな軸索が移植片に貫通し、成長して移植片の中に入っていたが、観察された大部分の軸索断面は成長していなかった。このような未処理移植片への成長の乏しさは、軸索断面の測定長の分布に反映されている(図3A)。これらの神経における蛍光軸索断面の90%超が500μmより短かった。
野生型マウスからのコンドロイチナーゼABC処理移植片を用いて切断CF神経を修復した1週間後のthy-1-YFP-Hマウスでは、結果はかなり異なっている(図2B,コンドロイチナーゼ ABC)。食塩水処理移植片または未処理移植片における軸索断面の大部分の末端は、膜状物(lamellopodia)含有成長円錐または収縮バルブ(retraction bulb)に似た大きく平らな終末であったのに対して(図2C)、コンドロイチナーゼ処理移植片の中に入り、成長した軸索断面の終末は紡錘状をしていた(図2D〜F)。強い蛍光を発する多くの軸索が移植片の中に成長していることが見出され、かなり長く成長しているものもあった。この観察は、蛍光を発する再生軸索の断面長の分布に反映されている。1匹のマウスの右神経および左神経からの軸索断面長の測定値のヒストグラムである図3Aに示したように、食塩水処理移植片およびコンドロイチナーゼABC処理移植片では両方とも、多くの軸索断面長は非常に短い。
HSPGのGAGは、ヘキスロン酸(D-グルクロン酸(GlcA)またはそのエピマー、L-イズロン酸(IdoA))とD-グルコサミン(GlcN)からなる二糖のポリマーからなる。ヘパリンに含まれるGlcNは大部分がN-硫酸化されているのに対して、ヘパランに含まれるGlcNは一様でなく、N-アセチル化およびN-硫酸化が両方ともなされている(Lindahl U, Kusche-Gullberg M, Kjellen L (1998)「Regulated diversity of heparan sulfate」J Biol Chem 273: 24979-24982)。2種類の細菌ヘパリンリアーゼを用いて、HSPGのGAGを分解した。両方とも糖対間のα-1,4結合を分解する。ヘパリナーゼIは、高度に硫酸化された糖(例えば、ヘパリン)に含まれるグリコシド結合の分解に最も有効である。ヘパリナーゼIはHSPGのあまり硫酸化されていないヘパラン硫酸含有GAG側鎖を除去することもできるが、ヘパリナーゼIIIの方が有効である(Desai UR, Wang H, Linhardt RJ [1993]「Substrate specificity of the heparin lyases from Flavobacterium heparinum」Arch Biochem Biophys 306: 461-468)。
4つの神経移植片を、等濃度の4種類全ての酵素(ヘパリナーゼI、ヘパリナーゼIII、コンドロイチナーゼABC、およびケラチナーゼ)からなる混合物で処理した後に、これらの神経移植片を用いて切断CF神経を修復した。これらの動物における軸索断面長の分析結果を図4Cに示した。異なる酵素からなる混合物で処理すると軸索断面長の分布が変化した。この変化は、食塩水処理移植片において見られるものより有意に大きく(p<0.01)、また、これらの酵素のいずれか一種類だけで処理された移植片において見られるものより大きかった。
移植片をコンドロイチナーゼABC、ヘパリナーゼI、またはヘパリナーゼIIIに浸漬した場合、移植片の中に500μmより長く伸長した軸索断面の割合は、移植片を食塩水もしくはケラタナーゼの中でインキュベートするか、または全くインキュベートしなかった場合より有意に多かった(図5A)。近位修復部位から500μm超えて伸長したのは、平均して、食塩水処理移植片において測定された軸索断面では5.64%(±2.37,SEM)しかなかったのに対して、コンドロイチナーゼABC処理移植片における軸索断面では31.28%(±6.06)であった(Fisher LSD,p<0.017)。これらの差異はまた、3つの未処理移植片において測定された500μmを超える軸索断面長のパーセント(9.55%±3.69)より有意に大きかった (LSD,p<0.05)。ケラタナーゼ処理移植片において500μmより長かったのは、平均して、全ての軸索断面の15.64%(±2.37,SEM)しかなかった(LSD,p<0.51)。500μmを超える軸索断面長の有意に大きな割合が、ヘパリナーゼI処理移植片(38.93%±16.51,SEM)(LSD,p<0.007)およびヘパリナーゼIII処理移植片(63.96%±8.74 SEM)(LSD,p<0.0001)において測定された。
切断末梢神経の近位断端にある軸索は、再生の最初期の局面の1つとして芽を形成する。プロテオグリカン糖鎖除去が軸索再生に影響を及ぼし得るやり方の1つは、このような再生芽の形成の刺激によるものである。この可能性をアッセイするために、各動物における神経切断の近位側にあるCF神経のYFP+軸索断面の数を数え、この数と、移植片において測定された軸索断面の数を比較した。後者は、軸索断面が非常に短くても、外科的修復部位の遠位側で測定することができた全ての軸索断面を含んでいる。遠位数と近位数の比は出芽指数である。異なる処理群の出芽指数の平均(±SEM)を図6に示した。大部分の群の間で有意な違いは見られなかったが、ヘパリナーゼIで処理された神経移植片において見られた軸索の枝の数は他の群のほぼ2倍であった(LSD,p<0.01)。
コンドロイチナーゼABC活性によってCSPGからGAG側鎖が除去されていると、この酵素の糖鎖除去活性によって生じたCSPGコア糖タンパク質上のGAG結合部位にあるネオエピトープに、抗体3B3および2B6が結合する(Caterson B, Christner JE, Baker JR, Couchman JR [1985] 「Production and characterization of monoclonal antibodies directed against connective tissue proteoglycans」Fed Proc 44: 386-393)。これらの抗体の両方に対する陽性免疫反応が、インサイチューでコンドロイチナーゼABC処理された末梢神経切片の神経内膜管の位置に見出された(図7:A,B)。この免疫反応は神経切片全体において見出された。食塩水、ケラタナーゼ(図7:C,D)、ヘパリナーゼI(図7:E,F)、またはヘパリナーゼIII(図7:G,H)に浸漬された神経の切片では、免疫反応(すなわち、コンドロイチナーゼ活性)は観察されなかった。従って、前記のヘパリナーゼI処理およびヘパリナーゼIII処理の成長促進効果は、これらの酵素が移植片にあるCSPGの糖鎖除去を誘導したことによるものではなかった。
Claims (33)
- 損傷神経に少なくとも1種類のヘパラン硫酸プロテオグリカン分解酵素を適用する工程を含む、損傷神経の再生を促進する方法。
- ヘパリナーゼI、ヘパリナーゼIII、ヘパラナーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼからなる群より選択されるヘパラン硫酸プロテオグリカン分解酵素を投与する工程を含む、請求項1記載の方法。
- 酵素がヘパリナーゼIまたはヘパリナーゼIIIである、請求項2記載の方法。
- 神経に少なくとも1種類の他のGAG分解酵素を投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 神経に少なくとも1種類のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、およびコンドロイチナーゼACからなる群より選択される、請求項5記載の方法。
- 神経に少なくとも1種類のケラタン硫酸プロテオグリカン分解酵素を投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- ケラチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がケラタナーゼまたはエンド-b-ガラクトシダーゼである、請求項7記載の方法。
- 損傷神経に組織接着剤を同時適用する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 損傷神経に生物学的に活性な薬剤を適用する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 生物学的に活性な薬剤が成長因子である、請求項10記載の方法。
- 損傷神経に細胞を適用する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 細胞が幹細胞またはシュワン細胞である、請求項12記載の方法。
- 損傷神経が損傷末梢神経である、請求項1記載の方法。
- 損傷神経が損傷中枢神経である、請求項1記載の方法。
- 損傷神経がヒトである、請求項1記載の方法。
- 少なくとも1種類のヘパラン硫酸プロテオグリカン分解酵素および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- ヘパリン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、ヘパリナーゼI、ヘパリナーゼIII、ヘパラナーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼからなる群より選択される、請求項17記載の薬学的組成物。
- 酵素がヘパリナーゼIまたはヘパリナーゼIIIである、請求項18記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1種類の他のGAG分解酵素をさらに含む、請求項1記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1種類のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素をさらに含む、請求項1記載の薬学的組成物。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、およびコンドロイチナーゼACからなる群より選択される、請求項21記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1種類のケラタン硫酸プロテオグリカン分解酵素をさらに含む、請求項1記載の薬学的組成物。
- ケラチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がケラタナーゼまたはエンド-b-ガラクトシダーゼである、請求項23記載の薬学的組成物。
- 神経移植片に少なくとも1種類のヘパリン硫酸プロテオグリカン分解酵素を適用する工程を含む、移植用神経移植片を調製する方法。
- ヘパリナーゼI、ヘパリナーゼIII、ヘパラナーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼからなる群より選択されるヘパラン硫酸プロテオグリカン分解酵素を投与する工程を含む、請求項25記載の方法。
- 酵素がヘパリナーゼIまたはヘパリナーゼIIIである、請求項26記載の方法。
- 神経に少なくとも1種類の他のGAG分解酵素を投与する工程をさらに含む、請求項25記載の方法。
- 神経に少なくとも1種類のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を投与する工程をさらに含む、請求項25記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、およびコンドロイチナーゼACからなる群より選択される、請求項29記載の方法。
- 神経に少なくとも1種類のケラタン硫酸プロテオグリカン分解酵素を投与する工程をさらに含む、請求項25記載の方法。
- ケラチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がケラタナーゼまたはエンド-b-ガラクトシダーゼである、請求項31記載の方法。
- 神経組織に少なくとも1種類のヘパリン硫酸プロテオグリカン分解酵素を適用する工程を含む方法によって調製された神経組織を含む、移植用神経移植片。
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