JP2007508247A

JP2007508247A - アンモニア酸化細菌の使用方法

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Publication number: JP2007508247A
Application number: JP2006528295A
Authority: JP
Inventors: ホイットロック，デービッド，アール．
Original assignee: ホイットロック，デービッド，アール．
Priority date: 2003-09-26
Filing date: 2004-09-27
Publication date: 2007-04-05
Also published as: EP1667646A4; EP1667646A2; AU2004275868A1; BRPI0414813A; WO2005030147A2; WO2005030147A3; CA2539974A1; US20070148136A1

Abstract

アンモニア酸化細菌の医薬の製造における使用並びに、高血圧症、肥大性器官退化、レイノー現象、線維性器官退化、アレルギー、自己免疫感作、末期腎不全、肥満、１型糖尿病、骨粗鬆症、インポテンス、脱毛、癌、加齢、自閉症、および自閉症の領域の症状の少なくとも１つを発生したか、または発生する危険のある対象を処置する方法であって、アンモニア酸化細菌を該対象の表面に極めて接近して置くことを含む、前記方法、一酸化窒素および一酸化窒素前駆体の、アンモニア酸化細菌を用いた使用。

Description

発明の分野
本発明は、対象の表面上での一酸化窒素および一酸化窒素前駆体の産生を増加させるアンモニア酸化細菌を含んだ組成物並びに、これを用いて、特に一酸化窒素を対象に投与することにより独立栄養性のアンモニア酸化細菌で、加齢の進行を遅延させ、高血圧症、肥大性器官退化、レイノー現象、線維性器官退化、アレルギー、自己免疫感作、末期腎不全、肥満、１型糖尿病、インポテンス、骨粗鬆症、加齢、自閉症、自閉症の領域の障害、脱毛および癌を処置および防止する方法に関する。

背景
工業化された国において生活することは、ヒトの健康に関して多くの利点を有する。先進の世界における死因は、加齢、心臓疾患、腎不全、アルツハイマー病、肝臓の損傷および癌の慢性の退化性疾患である傾向があり、一方、未開発の世界における死亡の主な原因は、急性の原因、例えば感染症、飢餓および戦争である傾向がある。しかし、未開発の世界において生活する多くの人々は、先進世界の年齢を整合させた対照よりも「良好である」と見られる健康プロフィルを有する。彼らは、比較的低い体重指数、比較的低い血圧、比較的低い１型糖尿病の発生率、比較的低い腎不全、比較的低い心臓疾患、比較的低いアレルギー、比較的低い自己免疫疾患、比較的低いアルツハイマー病を有する。差異は、同一の国内でも、都会と田園の居住者との間、富裕者と貧困者との間で、同等に明らかである。差異の多くは、暗色の皮膚を有する人々において特に明らかである。未開発国において出生し、育ち、先進国に移住した成人の移住者は、典型的には、先進国において出生し、育った小児よりも良好な健康プロフィルを有する。

先進の世界の慢性の退化性疾患の多くは、過剰な体脂肪と正に相関する。肥満により、事実上すべての慢性疾患についての予後が悪化する。しかし、すべての肥満の人が、これらの疾患を罹患しているわけではなく、これらの疾患を有する全員が肥満であるわけではない。いくつかの疾患、例えば癌は、「明らかな」原因を有するとは見られず、これらは、ほぼ無秩序に襲うと見られる。初期の年代において、人々は、このような疾患を、「悪霊」または「神を怒らせること」に帰していた。現在では、「慣用の知識」は、すべてのこれらの退化性疾患の「原因」が、人々が十分に運動せず、ＴＶを過度に視聴し、「過度の」脂肪、糖および塩分を有する過度に多くの「上品な」食物を摂食し、過度に多くの「化学物質」に曝露されることである、ということである。これは、やせているという現代の先入観にもかかわらず生じると考えられる。食事を１日わずか１００カロリー変化させると、１年に約１０ポンドの獲得（または損失）が生じる。田園の未開発の世界において、１日１００カロリー余分の食物へアクセスする人は事実上存在しないだろうと見られる。どちらかといえば、肥満は、未開発の世界において一層一般的であるべきである。その理由は、冷凍なしに、過剰の食物は、摂食され、脂肪として貯蔵されることにより最良に貯蔵されるからである。同様に、体重の減量を望むすべての成人が、彼らが彼らの摂取を１日に１００カロリー減少させることができない程度に意志が弱いとは思えない。

肥満により悪化する工業化された世界の退化性疾患は、死亡の有数の原因である。これらの疾患の多くは、拡張型心筋症を含む線維性器官肥大、またはうっ血性心不全、末期腎不全、全身性硬化症および肝硬変により特徴づけられる。これらの一見したところ異種の障害を防止し、治療することを試行するのに、何十億もが費やされたが、健康が彼らの肥満により悪化する肥満の個体の数は、増大している。これらの退化性障害を防止する方法は、主な健康の結果を有する。

糖尿病は、共に上昇した血中グルコースレベルにより特徴づけられる２種の障害を含む。１型糖尿病において、インシュリンを生成する膵島が破壊され、身体は、インシュリンを生成する能力を失う。インシュリンが投与されなければ、血糖は、病理学的レベルに上昇し得る。２型糖尿病において、身体は、「インシュリン耐性」となり、即ちグルコースは上昇し、膵島によるインシュリンの増大した分泌は、身体によるグルコース利用を適切に調節する作用を奏しない。通常、２型糖尿病が、１型糖尿病に先行するが、両方が同時に起こり得る。両方のタイプの糖尿病に関連する顕著な疾病率および死亡率にもかかわらず、原因の明確な理解はない。

免疫系感作は、原発性胆汁性肝硬変、１型糖尿病および全身性硬化症を含む、これらの同一の障害の多くを伴う。喘息およびアレルギーは、先進の世界においては一般的であり、未開発の世界においてはまれである。「衛生仮説」により、早期の小児期において「汚れ」、細菌または他の抗原に曝露されると、後期の生命において免疫系逸脱に対して「保護される」ことが示唆される。協調した研究にもかかわらず、現在のところは、このような剤は、見出されていない。

自閉症は、時々衰弱性の発達障害の領域である。「原因」は、不明瞭なままであるが、自閉症は、しばしば生命の最初の数年間において明らかになる。脳が急速に成長し、多くの新たな結合を形成し、再編成するのは、この時間の間である。自閉症が、これらの結合が適切に形成されない際に起こるという、ある考えがある。３〜４歳の自閉症の小児の中で、B. F. Sparks et al.は、脳の容積が、正常な小児および自閉症ではない発達遅延を有する小児におけるよりも、１０〜１３％大きかったことを示している。（Sparke et al, 自閉症の領域の障害を有する年少の小児における脳構造異常、Neurology 2002 Jul 23;59(2):184-92.）Dr. E. H. Aylward, et al.は、不適切な脳成長および特に過剰な脳容積が、自閉症と相関していることを例証した。（Aylward et al., 自閉症における脳容積および頭外周に対する年齢の効果 Neurology 2002;59:175-183.）

ＮＯは、多くの生理学的プロセスに関与する。ＮＯの効果の多くが非線形であり、多くの他の生理学的プロセスと結合しているため、ＮＯの効果の実験的な決定は、特に基底のＮＯレベルを変化させることが容易ではない際には、単純ではない。Ragnar Henningsson et al.は、ＮＯＳのＬ−ＮＡＭＥでの阻害により、ＮＯレベルが特定の部位において増大し得ることを示した。（Henningsson et al., ＮＯシンターゼの慢性的な遮断により、島ＮＯ産生が逆説的に増大し、島ホルモン放出が調節される、Am J Physiol Endocrinol Metab 279: E95-E107, 2000.）

Thayne L. Sweeten et al.は、自閉症の個体においては、増大したレベルのＮＯ産生があることを報告した。（Sweeten et al., 自閉症障害における高い一酸化窒素産生：インターフェロン−γについての可能な役割、Biological Psychiatry 第５５巻、第４版、２００４年２月、４３４〜４３７頁。）Sadik Sogut et al.はまた、自閉症個体における比較的高いレベルのＮＯを報告している。（Sogut et al., 一酸化窒素レベルにおける変化および抗酸化酵素活性は、自閉症に関与する病態生理学的機構において役割を奏し得る、Clinica Chimica Acta 331 (2003) 111-117.）上昇した血清硝酸塩および亜硝酸塩レベルはまた、G. Giovannoni et al.により、多発性硬化症を有する患者において観察される。（Giovannoni et al., 多発性硬化症を有する患者における上昇した血清硝酸塩および亜硝酸塩レベル、Journal of the Neurological Sciences 145 (1997) 77-81.）

１人の研究者、Lennart Gustafssonは、自閉症が、不適切なレベルの一酸化窒素シンターゼによる低いＮＯから生じ得ることを示唆した。神経回路網理論および最近の神経解剖学的知見により、不適切な一酸化窒素シンターゼが自閉症を生じることが示される。（In Pallade V, Howlett RJ, Jain L編、人工知能における講義ノート、第２７７４巻、第ＩＩ部、New York: Springer-Verlag, P 1109-14.）Gustafssonは、不適切なレベルの一酸化窒素シンターゼにより、発達の間に異常なミニカラム構造が産生されることを示唆し、彼が示唆したものはまた、低いレベルのセロトニンにより産生され得る。（「細胞ミニカラムの阻害構造における破壊」に関するコメント、自閉症についての結果、Neuroscientist 10 (3): 189-191, ２００４年１月８日。）彼は、自閉症が、脳中の一酸化窒素シンターゼの活性を増大させることにより処置され得ることを示唆しているが、これをいかにして行うかの示唆を提供していない。彼は、一酸化窒素説明により、自閉症の領域の障害において観察される、一見して異種の症状のいくつかについての論理的根拠が得られ、これには、てんかんとの同時罹患率、運動障害、睡眠の問題、侵襲および低下した痛覚が含まれることを記録している。

骨粗鬆症は、年長者の骨折における有数の悪化要因である。低い外傷の骨折の年齢標準化発生率は、既知の説明を伴わずに年長の集団において増大している。（P. Kannus et. al. 展望：なぜ低い外傷の骨折の年齢標準化発生率は、多くの年長者の集団において増大しているか？Journal of bond and mineral research vol. 17, No. 8, 2002.）

概要
本発明の１つの態様は、高血圧症、肥大性器官退化、レイノー現象、線維性器官退化、アレルギー、自己免疫感作、末期腎不全、肥満、１型糖尿病、インポテンス、癌、骨粗鬆症、加齢、自閉症、自閉症の領域の症状および脱毛の少なくとも１つを発生したか、または発生する危険のある対象を処置する方法に関する。この方法は、対象を同定することおよびアンモニア酸化細菌を該対象に極めて接近して配置することを含む。１つの観点において、アンモニア酸化細菌を、ニトロソモナス（Nitrosomonas）、ニトロソコッカス（Nitrosococcus）、ニトロソスピラ（Nitrosospira）、ニトロソシスティス（Nitrosocystis）、ニトロソロブス（Nitrosolobus）、ニトロソビブリオ（Nitrosovibrio）のいずれか、およびそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。

本発明の他の態様は、ＡＡＯＢを該動物の表面から除去することを含む、動物の成長を増大させることに関する。

他の態様において、アンモニア酸化細菌を、一酸化窒素を対象に提供するための医薬の製造において用い、ここで前記医薬は、実質的に明細書中に記載したように、前記対象に極めて接近して配置するのに適しており、ここで、該対象は：高血圧症、肥大性器官退化、レイノー現象、線維性器官退化、アレルギー、自己免疫感作、末期腎不全、肥満、１型糖尿病、骨粗鬆症、インポテンス、脱毛、癌、自閉症、自閉症の領域の症状および加齢による低下した健康の少なくとも１つを発生したか、または発生する危険のある。

詳説
本発明は、以下の記載において述べたかまたは図面中に例示した構成要素の構成および手配の詳細へのこの適用に限定されない。本発明は、他の態様が可能であり、種々の方法において実施するかまたは行うことが可能である。また、本明細書において用いる語法および専門用語は、記載の目的のためであり、限定されるものと考慮するべきではない。「含む(including)」、「包含する(comprising)」、または「有する(having)」、「内包する(containing)」、「伴う(involving)」および本明細書中でのこの変形を用いることは、以下に列挙する項目およびこれと等価なもの並びに追加の項目を包含することを意味する。

本発明は、対象の表面に極めて接近した場所での一酸化窒素および／または一酸化窒素前駆体の産生を増加させるアンモニア酸化細菌を含んだ組成物並びに、一酸化窒素を対象に投与することにより独立栄養性のアンモニア酸化細菌で、加齢の進行を遅延させ、高血圧症、肥大性器官退化、レイノー現象、線維性器官退化、アレルギー、自己免疫感作、末期腎不全、肥満、骨粗鬆症、１型糖尿病、インポテンス、自閉症、自閉症の領域の障害および癌を処置および防止する方法に関する。本明細書中で用いる「対象」は、ヒトまたはイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、例えばサルなどの霊長類、ラット、およびマウスを含むが、これらに限定されるものではない脊椎動物として定義される。「処置する」の用語は、本明細書中では、疾患もしくは障害の発症を予防もしくは阻害すること、および疾患もしくは障害の発症後の進行を阻害もしくは停止させること、または障害に一般的に関連するすべての症状を、当該症状が臨床的疾患についての許容限界に到達しない場合においても低減することを意味するために用いる。

本明細書中で用いる自閉症の領域の障害の語句は、一般的に認識されているように（ＤＳＭＩＶ、精神障害の診断的および統計的マニュアル、第４版、Washington, DC: American Psychiatric Association, 1994.）、即ち自閉症障害、または言語的および非言語的の両方のコニュニケーション、社会的相互関係および遊びにおける重篤な定量的な欠陥、並びに常同的な狭い範囲の関心、アスペルガー症候群、欠陥のある社交性および狭い範囲の関心、並びに崩壊的障害により特徴づけられる広汎性発達障害として定義され、ここで、他の点では正常に発達している小児は、重篤に退行し、重篤な後天性自閉症に至る。自閉症の領域の障害の例には、自閉症、アスペルガー症候群およびヘラー(Heller)症候群が含まれる。慣用の実際の下で、自閉症の領域の障害は、極めて重篤なレベルの機能障害に限定される。

自閉症は、社会的相互関係の重篤な障害により特徴づけられる重篤な障害である。個体は、自閉症についての診断的基準に適合するために、複数の、および重篤な欠陥を有しているはずである。自閉症の領域の障害を有する個体の特質の多くが、他の個体において、しかし比較的低い程度、即ち臨床的な自閉症または自閉症の領域の障害についての許容限界に到達しない程度で観察されることが、認識されるべきである。自閉症の領域の障害の数および／または程度の観点において診断的重篤性に到達し得るかまたは到達し得ない自閉症の領域の障害に特有の症状は、本明細書中では、自閉症の領域の症状として定義される。当該自閉症の領域の症状の重篤度をまた、本発明の方法により低減することができる。本発明の主な使用は、自閉症を有する個体および自閉症の領域の障害を有する個体の両方において、並びに自閉症または自閉症の領域の障害を発生する危険のある個体において、並びに自閉症の領域の障害の１つまたは２つ以上の症状を発生する危険のある個体において、これらの自閉症の症状の重篤度を低減することである。

本発明の態様において、一酸化窒素、一酸化窒素前駆体および／または一酸化窒素放出化合物を、対象の表面に極めて接近して置いて、加齢の進行を遅延させ、高血圧症、肥大性器官退化、レイノー現象、線維性器官退化、アレルギー、自己免疫感作、末期腎不全、肥満、骨粗鬆症、１型糖尿病、インポテンス、自閉症、自閉症の領域の障害および癌を処置および防止することができる。

本発明の１つの観点において、現代の世界のほとんどの慢性の退化性疾患、並びに肥満および多くの癌が、以前は未知の共生の独立栄養性アンモニア酸化細菌（ＡＡＯＢ）の顕著な量を洗浄して除去する現代の入浴の習慣に対する身体の自然の生理学的応答の自然の結果であり得ることが、理解される。従って、本発明の１つの観点は、これらの退化性疾患、自閉症、自閉症の領域の障害、１型糖尿病、骨粗鬆症および肥満を、対照上に、または対照に極めて接近してＡＡＯＢを適用することにより処置または防止することができることである。同様に、本発明の他の観点は、これらの退化性疾患を、入浴しないことにより処置または防止することができることである。

さらに特に、１つの態様において、独立栄養性アンモニア酸化細菌の組成物を皮膚に、入浴中または入浴後に適用して、尿素および蒸散の他の成分を亜硝酸塩に、および最終的には一酸化窒素（ＮＯ）に代謝させる結果、ＮＯの天然の供給源が得られる。本発明の１つの観点は、皮膚の表面またはこの付近における局所的な一酸化窒素の放出を生じ、ここでこれは、皮膚中に拡散し、局所的および全身的効果を有することができる。次に、この一酸化窒素は、一酸化窒素が身体により用いられる通常の代謝経路に関与することができる。

すべてのアンモニア酸化細菌を、本発明において用いることができる。好ましい態様において、アンモニア酸化細菌は、当該分野において容易に知られている以下の特徴を有することができる：アンモニアおよび尿素を亜硝酸塩および他のＮＯ前駆体に迅速に代謝する能力；病原性でないこと；アレルギー性でないこと；臭気化合物の生産者でないこと；悪臭化合物の生産者でないこと；ヒトの汗中で生存し、成長する能力；高い塩濃度の条件下で生存し、成長する能力；および低い水活性の条件下で生存し、成長する能力。アンモニア酸化細菌の例には、両方を本明細書中にすべての目的のための参照により導入するＰＣＴ公開番号WO 03/057380 A2およびＰＣＴ公開番号WO 02/13982 A1に開示されているように、ニトロソモナス、ニトロソコッカス、ニトロソスピラ、ニトロソシスティス、ニトロソロブス、ニトロソビブリオおよびこれらの組み合わせが含まれるが、これらには限定されない。

独立栄養性アンモニア酸化細菌（ＡＡＯＢ）は、すべての土壌およびすべての天然の水中に普遍的に存在し、ここでこれらは、硝化のプロセスにおける最初の段階（アンモニアの亜硝酸塩への酸化）を遂行する。ＮＯは、アンモニアをＯ_２で酸化する際のＡＡＯＢ代謝の通常の主要でない生成物である。いくつかの菌株は、亜硝酸塩またはＮＯ_２を末端電子シンクとして用いることができ、この場合において、ＮＯ産生は増大する。ＡＡＯＢは、必須の独立栄養素であり、すべてが従属栄養性である病原体の単離に適する培地上で成長することができない。ＡＡＯＢは、すべての代謝エネルギーを、中間体生成物としての一酸化窒素（ＮＯ）を用いたアンモニアの亜硝酸塩への酸化からのみ、これらの呼吸鎖において誘導し、事実上すべての炭素を、二酸化炭素を固定することにより誘導する。

これらは、いくつかの簡単な分子以外の炭素源を用いることができない。その理由は、これらが、このようにするための酵素系を有していないからである。独立栄養性アンモニア酸化細菌（ＡＡＯＢ）は、Alan B. HooperおよびA. Krummel et al.により記録されたように、必須の独立栄養性細菌である。（Alan B. Hooper, Nitrosomonas europaeaにおける必須の独立栄養素の生化学的基礎、Journal of Bacteriology, １９６９年２月、７７６〜７７９頁；Antje Krummel et al., アンモニア酸化細菌の成長および細胞収率に対する有機物質の効果、Arch Microbiol (1982) 133: 50-54.）この１種（Nitrosomonas europaea）の完全なゲノムは、Chain et alにより配列決定されており、タンパク質をコードする〜２４６０個の遺伝子を有する。（Chain et al., アンモニア酸化細菌および必須のケモリソオートトロフであるNitrosomonas europaeaの完全なゲノム配列。Journal Of Bacteriology, ２００３年５月、２７５９〜２７７３頁）

ゲノムの検査から、これらの細菌は、疾患を生じ得ないことが明らかである。これらまたは他の既知の病原性因子を分泌するための毒素または輸送体についての遺伝子は、存在しない。これらは、動物組織中に見出される複雑な有機化合物を分解するかまたは利用する酵素を有していない。これらは、病原体（このすべては、M Schaechterにより報告されたように従属栄養性である）を単離するために用いるようないかなる従属栄養性培地上でも成長しない。（Moselio Schaechter, Gerald Mendoff, David Schlessinger編、微生物疾患の機構、Williams & Wilkins, Baltimore, MD, USA, 1989.）これらは、グラム陰性細菌であり、抗体を発現させ、抗生物質に対して影響を受けやすく、ｐｐｍレベルの直鎖状アルキルベンゼンスルホネート洗浄剤により死滅する。これらは、従属栄養体についての２０分と比較して、１０時間の最適な倍加時間を伴って遅く成長する。

天然の細菌および、特性が遺伝子工学手法により変化した細菌を、用いることができる。細菌培養手法を用いて、前述の特性を有する菌株を単離することができる。純粋な菌株の混合物は、皮膚からの単純に培養される細菌に関連する問題を回避し、これには、病原体および所望しない特徴を有する他の細菌の潜在的な成長が含まれる。しかし、皮膚からの細菌を培養し、これらを、ヒト蒸散の組成物を模擬する成長培地上で成長させることはまた、一酸化窒素産生速度を上昇させるにあたり有効であり得る。このような細菌を培養し、単離するための有用な方法は、尿素およびアンモニアと鉱塩とを含むが、従属栄養性細菌が用いる有機化合物、例えば糖およびタンパク質を含まない培地上でこれらを成長させることである。

独立栄養性アンモニアおよびアンモニア酸化細菌を単離する際には、また、従属栄養性培地上での成長を試行して、独立栄養性菌株が従属栄養性細菌で汚染されていないことを立証するのが、望ましい場合がある。ニトロバクターは、上昇したｐＨにより、および遊離のアンモニアにより阻害される。土壌において、これにより、土壌においての亜硝酸塩の蓄積がもたらされ得、これは、硝酸塩と比較した際に極めて有毒である。皮膚は、亜硝酸塩をＮＯに還元する顕著なキサンチンオキシドレダクターゼを含み、これにより、亜硝酸塩の蓄積が実質的に防止される。皮膚上の亜硝酸塩濃度を低下させる阻害細菌、例えばニトロバクターは、一酸化窒素放出をさらに増強するのに有用な方法である。あるいはまた、ニトロバクターは、含まれ得、次にこれにより、硝酸塩の産生が増大する。次に、ヒト皮膚上でこの硝酸塩および他の有機化合物を用いて亜硝酸塩を形成する他の細菌を、用いることができる。

この点において有用な細菌は、ヒト蒸散の通常の構成成分をＮＯ前駆体に代謝する細菌である。これらには、例えば、尿素から亜硝酸塩、尿素から硝酸塩、硝酸塩から亜硝酸塩、尿素からアンモニア、亜硝酸塩から硝酸塩、およびアンモニアから亜硝酸塩が含まれる。いくつかの場合において、混合された培養が好ましい。細菌は、入浴中または入浴後に好都合に適用され得、種々の石鹸、局所的粉末、クリーム、エアロゾル、ゲルおよび軟膏中に導入することができる。本発明の１つの観点は、最も多く蒸散させる身体部、例えば手、足、生殖器領域、脇の下領域、首および頭皮への適用を意図する。皮膚のこれらの種々の領域間の主な差異は、水の活性である。手の皮膚は、手の周囲の空気の乾燥効果への増大した曝露のために、通常はソックスおよび靴で覆われている足の皮膚よりもはるかに乾燥している。種々の菌株の細菌が、身体の種々の領域上で最良に作用することができ、すべてのタイプの混合された培養により、最良に成長して増殖および順応し、特定の領域に存在する主要な培養物となる細菌が可能になる。また、衣服を着用して、局所的な微気候を、所望の細菌の成長を容易にするように変化させることができる。例えば、帽子を着用することにより、高密度の毛髪を模擬し、頭皮を一層温かい、および一層湿潤した環境に維持することを補助することができる。

通常の皮膚の環境が、比較的乾燥しているため、低い水張力環境に適合した細菌が、有利である。適度に好塩性のアンモニア酸化細菌の１つの例は、Hans-Peter Koops, et alにより記載されたNitrosococcus mobillisである(Arch. Microbiol. 107, 277-282(1976))。この細菌は、広範囲の成長を有する。例えば、成長のための最適なｐＨは、７．５である一方、ｐＨ６．５においては、これは尚、この最大の速度の３３％で成長する。H. P. Koops, et al. (arch. Micorbiol. (1990) 154:244-248)により記載された、他の比較的好塩性の種であるNitrosococcus halophillusは、天然の塩湖中の飽和した塩溶液から単離された。Nitrosococcus oceanus (ATCC 1907)は、好塩性であるが、他の２種の間の中間の最適塩濃度を有する。これらの３種についての最適なＮａＣｌ濃度は、それぞれ２００、７００および５００ｍＭのＮａＣｌである。

しかし、N. oceanusは、尿素を利用し、塩化アンモニウムとして１１００ｍＭ程度に高いアンモニア濃度を耐容する。最適な条件においての成長が最も迅速である一方、同様の結果が、一層多量の細菌を用いることにより達成され得る。従って、N. mobillisの成長のための最適なｐＨが７．５である一方、同一の亜硝酸塩産生を、３倍多量の細菌を用いることにより、ｐＨ６．５において達成することができる。本発明における細菌の量が、多量、即ち入浴後２４時間以内に生じるよりも大きい規模の程度の数であり得るため、皮膚のｐＨが、これらの細菌について最適ではないという事実は、これらの使用に対する阻害ではない。N. halophillusは、飽和した塩溶液から単離されたため、これは、比較的湿潤したヒトの皮膚の環境において容易に生存するべきである。

ある細菌は、一酸化窒素を直接産生する。１つの例は、Armin Remde, et al. (Arch. Microbiol. (1990) 154:187-191)による「亜硝酸塩の還元によるNitrosomonas europaeaにおける一酸化窒素の産生」中に記載されている。N. europaeaおよびニトロソビブリオは、一酸化窒素を直接産生することが例証された。ニトロソビブリオは、しばしば、生じた酸が腐食を生じる岩石上で成長することが見出される。Poth and Focht, 「ニトロソモナス単離物による亜硝酸塩からの二窒素産生」(Appl Environ Microbiol 52:957-959)により、亜硝酸塩の揮発性一酸化窒素へのこの還元を、生物体が、有毒な亜硝酸塩を、生物体が成長する環境、例えば岩石の表面から排除する方法として用いることが、示唆された。

これらの細菌の有益な観点を理解するために、血管新生を理解することが有用である。外部空気の数百ミクロン内のものを除いて、すべての体細胞は、すべての代謝的Ｏ_２を血液供給から受ける。Ｏ_２は、肺中の血液により吸収され、赤血球によりＯ_２化されたヘモグロビンとして末梢組織に運搬され、ここでこれは、二酸化炭素と交換され、これは、運搬して戻され、肺から吐き出される。Ｏ_２は、赤血球から血漿を介して、内皮を介して、および種々の組織を介して、これがこれを消費する細胞中のミトコンドリアに到達するまで拡散しなければならない。ヒトの身体は、約５リットルの血液を含み、従って循環器の容積は、身体の容積と比較して小さい。Ｏ_２は、能動的に輸送されない。これは、空気から赤血球への、赤血球から細胞への、および細胞からこれが消費されるチトクロームオキシダーゼへの濃度勾配を受動的に拡散して下降する。

消費の部位におけるＯ_２の濃度は、身体中で最も低く、Ｏ_２流量は、拡散耐性および濃度勾配により決定される。すべての末梢組織への十分なＯ_２供給を達成するには、毛細管の大きさおよび配置の絶妙の制御が必要である。毛細管間の間隔が増大したとすると、Ｏ_２の同一の流量を達成するには、比較的大きい濃度差異および従ってチトクロームオキシダーゼにおける比較的低いＯ_２濃度が必要であろう。毛細管間の一層多量の細胞について、Ｏ_２要求は、一層大きい。毛細管間の間隔が減少したとすると、器官の代謝機能を遂行する細胞に有用な空間が比較的小さいであろう。

本発明の１つの観点において、独立栄養性アンモニア酸化細菌（ＡＡＯＢ）からのＮＯは、外部の皮膚により容易に吸収され、外部の皮膚がヘモグロビンを含んでいないため、Ｓ−ニトロソチオール類に変換されることが、理解される。M. Stucker et al.は、外部の皮膚は、外部の空気からのこのＯ_２のすべてを受けることを、「大気酸素の皮膚の取り込みは、ヒト真皮および表皮の酸素供給に顕著に寄与する」(Journal of Physiology (2002), 538.3, pp. 985-994.)中で示した。これは、外部の皮膚が、本質的に赤血球を含まないことが明らかであるため、容易に明らかである。これらの層を通して血漿の循環がある。その理由は、これらは生きており、Ｏ_２ではない血液中の他の栄養素を必要とするからである。生成したＳ−ニトロソチオール類は、安定であり、身体全体に拡散することができ、真正のＮＯの容積供給源およびＮＯの供給源を構成して、タンパク質チオール類をトランスニトロソ化する(transnitrosate)。

本発明の他の観点において、毛細管粗鬆化は、不十分なレベルのＮＯの最初の指標の１つであり得ることが、理解される。ヒトの身体は、単一の細胞から成長し、損傷した脈管構造は、すべての組織において有効に治癒する。血管新生および血管リモデリングの調節は、熱心な研究の対象であり、多くの要因が、良好に理解されている。

F. T. Tarek et al.は、低密度の毛細管または毛細管粗鬆化は、本質的な高血圧症を有する人々において共通して見られることを示した。（本質的な高血圧症における構造的皮膚毛細管粗鬆化。Hypertension. 1999;33:998-1001.)Tarek et al.はまた、毛細管粗鬆化は、これを発症する前の高血圧症についての「危険のある」人々において見られることを示した。境界の本質的な高血圧症における皮膚毛細管の粗鬆化は、初期の構造的異常を示唆する。Hypertension. 1999; 34:655-658。現在のところ、毛細管粗鬆化の原因についての良好な説明はないが、E. Serne et al.、本質的な高血圧症における損傷した皮膚毛細管の補充は、機能的および構造的毛細管粗鬆化の両方により生じる(Hypertension. 2001;38:238-242.)により記録されたように、低下した密度の毛細管、および増大した局所的な血液要求に応答しての毛細管の低下した補充が、共に存在する。

毛細管粗鬆化がいかにして高血圧症を生じ得るかを理解するのは、容易である。組織の容積の代謝要求は、毛細管の密度が下降するに従って下降せず、従って毛細管の比較的低密度のネットワークを通しての血液流量は、現状を維持しなければならない。同一の流量について、しかし流れに有用な減少した断面について、圧力降下は、増大しなければならない。Greene et al.により、微小血管の粗鬆化は、増大した圧力降下をもたらさないことが、観察される。（高血圧症における微小血管の粗鬆化および組織血管耐性。Am. J. Physiol. 256 (Heart Circ. Physiol. 25): H126-Hl31, 1989.）Greene el al.はまた、毛細管から、毛細管から最も離間した細胞へのＯ_２拡散についての、増大した通路の長さについて、これらの最も離間した細胞におけるＯ_２濃度は、低下して同一のＯ_２流量を維持しなければならないことを示した。（高血圧症における組織酸素送達に対する微小血管の粗鬆化の効果。Am. J. Physiol. 262 (Heart Circ. Physiol. 31): H1486-H1493, 1992.）この最後の参考文献において、彼らは、一層大きい低酸素症に加えて、有酸素／低酸素領域の不均一性が、毛細管粗鬆化の条件の下ではるかに大きいことおよび、有酸素／低酸素状態間の変動が増大することを示している。

本発明の他の観点において、毛細管粗鬆化に影響するのは、Ｏ_２の濃度のみではなく、Ｏ_２の化学的電位も影響することが、理解される。Ｏ_２の化学的電位は、Ｏ_２分圧に正比例し、赤血球を含まない血漿および細胞外流体に溶解した濃度に比例する。赤血球中のＯ_２の化学的電位は、これと平衡にある血漿の化学的電位と等しい。Ｏ_２は、毛細管から、ヘモグロビンを含まない組織を通って拡散して、毛細管から離間した細胞に到達する。

多くの状態が、低くなる毛細管密度と関連する。高血圧症は、比較的早期に述べられ、研究者は、低密度の毛細管はまた、本質的な高血圧症を有する小児およびまた糖尿病を有する人々において見られることを報告した。糖尿病の顕著な合併症は、高血圧症、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害である。R, Candido et al.は、最後の２つの状態は、観察された症状の前の冒された領域への血流の減少により特徴づけられることを見出した。（１型糖尿病における微小血管合併症における血行力学。Diabetes Metab Res Rev 2002; 18: 286-304.）減少した毛細管密度は、糖尿病と関連しており、単純な体重損失は、A Philip et al.により「ヒトにおける筋繊維タイプ、繊維の大きさ、毛細度(capilarity)およびコハク酸脱水素酵素に対する体重損失の効果。The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism Vol. 84, No. 11 4185-4190, 1999」中に示されているように、毛細管密度を増大させる。

研究者は、原発性レイノー現象（ＰＲＰ）において、ネイルフォールド(nailfold)毛細管が、正常な対照よりも（わずかに）低密度であり、全身性硬化症（ＳＳｃ）に進行した患者におけるよりも豊富であることを示した。M. Bukhari, 原発性レイノー現象および全身性硬化症における増大したネイルフォールド毛細管寸法。British Journal Of Rheumatology Vol 24 No 35: 1127-1131, 1996.彼らは、毛細管密度が、３５ループ／ｍｍ^２（正常な対照）から３３（ＰＲＰ）に、および１７（ＳＳｃ）に減少したことを見出した。毛細管肢間の平均の距離は、対照、ＰＲＰおよびＳＳｃについて１８μ、１８μおよび３０μであった。

本発明の他の観点において、身体が通常「低酸素症」を感知するために用いる機構が、毛細管密度を調節する身体のシステムを冒し得ることが、理解される。本発明のこの観点において、「低酸素症」の顕著な成分は、Ｏ_２レベルの低下によってではなく、むしろＮＯレベルの上昇により感知される。基底ＮＯレベルの低下は、この「低酸素症」の感知に干渉し、従って「低酸素症」により調節される多くの身体機能を冒す。例えば、貧血は、一般的に、「ヘモグロビンが十分ではない」として定義され、十分ではないヘモグロビンの１つの結果は、「低酸素症」であり、これは、「Ｏ_２が十分ではない」として定義される。本発明の１つの観点において、これらの一般的な定義は、両方の状態の一酸化窒素により媒介された観点を説明しない。

休息時には、急性のイソボレミック(isovolemic)貧血は、良好に耐容される。ヘマトクリットの２／３の減少は、静脈還流量ＰｖＯ_２に対して最小の効果を有し、これは、Ｏ_２張力または全体を通しての送達のいずれかにおける減少がないことを示す。（Weiskopf et al., 急性であり、重篤なイソボレミック貧血に対するヒトの心血管および代謝応答、JAMA 1998, vol 279, No. 3, 217-221.）５０％の減少において（１４０から７０ｇＨｂ／Ｌへの）、平均のＰｖＯ_２（３２を超える対象）は、（飽和の）約７７％から約７４％まで下降した。血液のＯ_２容量の低下は、血管拡張および６３から８５ｂｐｍに増大する心拍数を伴う頻拍により補われる。補償が有効であることは、容易に明らかであるが、機構は明らかではない。

典型的な説明は、「低酸素症」のセンサーが、「低酸素症」を検出し、血管拡張および頻拍で補償したことである。しかし、検出されるべき「低酸素症」はなかった。０．７７から０．６２ｍＭ／Ｌへの血液乳酸塩（嫌気性呼吸についてのマーカー）のわずかな減少があり、これは、比較的嫌気性でない呼吸および比較的低い「低酸素症」を示した。静脈還流量ＰｖＯ_２の３％の減少は、高度が３００メートル上昇する（これは、人的経験から、頻拍を生じない）ことにより罹患する「低酸素症」の同一のレベルである。静脈還流量におけるＯ_２濃度を現状に維持して、Ｏ_２消費を現状に維持して、Ｏ_２濃度が低下する身体中の箇所はない。イソボレミック貧血の間の補償は、Ｏ_２感知により生じ得ない。

他の原因からの「低酸素症」は、心拍出量に対して同一の効果を有しない。Murray et al.は、イヌの正常な赤血球の一部をｍｅｔＨｂに完全に酸化された赤血球で交換した際に、「低酸素症」の補償は最小であることを示した。（血液粘度の循環効果：メトヘモグロビン血症および貧血の比較、Journal Of Applied Physiology Vol. 25, No. 5, 594-599、１９６８年１１月。）ヘマトクリットＨｃｔ（４３％）を現状に維持し、完全なｍｅｔＨｂ赤血球で交換した（０、２６、４７％）一方、心拍出量（ＣＯ）は、下降し（１７８、１７１、１５６ｍＬ／ｍ／ｋｇ）、一方動脈ＰａＯ_２（９３、８７、８４ｍｍＨｇ）およびＰｖＯ_２（５５、４６、３８）もまた下降した。対照的に、急性イソボレミック貧血（Ｈｃｔ４０、３０、２２）を血漿を用いて誘発した際に、補償ははるかに良好であり、ＣＯ（１５５、１７７、１８７）、ＰａＯ_２（８７、８８、９１）およびＰｖＯ_２（５１、４７、４２）であった。貧血を、デキストラン溶液を用いて誘発した際には（Ｈｃｔ４１、２５、１５）、心拍出量（１４３、１９５、２４３）、ＰａＯ_２（８９、９２、９３）、ＰｖＯ_２（５６、５６、５１）補償は、尚一層良好であった。

ｍｅｔＨｂ試験を伴う彼らの実験の一部として、最終的な希釈を、デキストランを用いて行って、Ｈｃｔを２６％に低下させ、一方尚４７％ｍｅｔＨｂを維持した。補償は、ＣＯ（２６３ｍＬ／ｍ／ｋｇ）、ＰａＯ_２（８６ｍｍＨｇ）およびＰｖＯ_２（４１ｍｍＨｇ）を伴ってはるかに改善され、すべては、比較的低いＨｃｔ、比較的大きいＯ_２および比較的低い「低酸素症」にもかかわらず増大した。この「低酸素症」に対処するための補償機構は、Ｏ_２レベルが低下せず、実際にＯ_２レベルが増大したため、低下したＯ_２レベルのためではない場合がある。

Deem et alは、肺のガス交換効率が、イソボレミック貧血の間に改善され、吐き出されたＮＯが、Ｈｃｔが減少するに従って増大することを報告した（ウサギにおいて）。（イソボレミック血液希釈の間の肺のガス交換における改善の機構。J. Appl. Physiol. 83: 240-246, 1997.）

Ｈｃｔが、ヒドロキシエチルデンプン（３０、２３、１７、１１％）での希釈により減少した際に、心拍出量は増大し（０．５２、０．６０、０．７０、０．７６Ｌ／分）、吐き出されたＮＯレベルは上昇した（３０、３４、３８、４３ｎＬ／分）。

Calbet et al.は、最大のＯ_２消費（ＶＯ_２ｍａｘ）が、高い高度において低下し、この低下したＶＯ_２ｍａｘが、順応により回復しないことを示した。（なぜ高度順応の後のＶＯ_２ｍａｘは尚、動脈Ｏ_２含量の正常化にもかかわらず減少するか？Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 284: R304.R316, 2003。Koskolou et al.は、ＶＯ_２ｍａｘが、ヘマトクリットがＰａＯ_２またはＰｖＯ_２における差異がないにもかかわらず減少する際に、減少することを示した。（ヒトにおける急性貧血を有する動的運動への心血管応答。Am. J. Physiol. 273 (Heart Circ. Physiol. 42): H1787-H1793, 1997。）

この最後の参考文献において、Koskolou et al.のデータは、Ｈｂ変化（１５４．４から１２３．３ｇ／Ｌへ）、ＰａＯ_２変化（１１９．２から１１５．１ｍｍＨｇへ）およびＰｖＯ_２変化（２３．６から２３．０ｍｍＨｇへ）を伴っての最大仕事の１７％の減少を明確に示す。Koskolou et al.は、トレーニングされた筋肉が、血液により送達されるＯ_２を「抽出する」ことができないことまたは、心臓が、予備の心臓容量にもかかわらず一層多量の血液を送達することができないことについての説明をしていない。この挙動は、ＮＯのヘムタンパク質との相互作用および減少したＶＯ_２ｍａｘを生じるＮＯによるチトクロームオキシダーゼの競合的阻害により、説明することができる。

ＮＯＳ阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥで処置したウマは、Casey et al.により「ウマにおける大きい強度の運動の間の酸素取り込み動力学に対するＬ−ＮＡＭＥの効果」(J Appl Physiol 91: 891-896, 2001.)において報告されたように、ＶＯ_２の加速された増大および低下した「Ｏ_２負債」を示したが、またわずかに低いＶＣＯ_２ｍａｘを示した。加速されたＶＯ_２は、ミトコンドリア呼吸の低下したＮＯ阻害およびＬ−ＮＡＭＥ群において観察された減少した心拍出量（これは、血管狭窄のために１２％減少した）にわずかに減少したＶＣＯ_２ｍａｘ（６２．５、６１．０Ｌ／分）に帰した。Ｈｃｔの増大に伴って観察された増大したＶＯ_２ｍａｘは、「血液ドーピング」におけるのと同様に、減少したＮＯにより、適当である。これらの例は、すべてミトコンドリア呼吸のＮＯ阻害およびヘマトクリットにおける変化により変調した当該阻害と整合する。

Ｈｂは、ＨｂおよびＮＯの両方において一次である動力学を有する溶液からＮＯを除去することが、十分知られている。定常状態において、ＮＯ産生速度は、一定であり、産生速度は、崩壊速度に等しい（蓄積なし）。５０％のヘマトクリットの突然の降下の結果、産生速度が崩壊速度と等しいままであるため、ＮＯ濃度の増大がもたらされ、崩壊速度が、ＮＯおよびＨｂの両方において一次であるため、一定に維持されるのは、これらの産生である。ＮＯとＨｂとの間の反応は、新たなＮＯ濃度が事実上、血液と希釈物とが混合され、血管壁を通過すると直ちに到達する程度に、迅速である。

従って、急性イソボレミック貧血において観察される血管拡張は、血管壁における増大したＮＯ濃度のためであり得る。ＮＯは、ずれストレスおよび他の要因に応答して、血管の拡張を媒介する。ＮＯ代謝物のレベルの変化は、ＮＯの産生速度が不変であり、崩壊速度と等しいままであるため、観察されない。ｍｅｔＨｂ置換についての「低酸素症」でない補償の観察は、ｍｅｔＨｂがＮＯに、ちょうどＨｂが結合するのと同様に結合し、従ってＨｂ離脱についてと同様にｍｅｔＨｂ置換に伴うＮＯ濃度の増大がないため、理解され得る。

ＮＯ化学の多くの詳細は、十分知られている一方、普遍的に十分には理解されていない。リガンドＯ_２、ＣＯ、Ｈ_２ＳおよびＨＣＮ、並びにＮＯはすべて、ヘムに結合し、時々ヒト生理学において重要であり得る。従って、ヘム（および多く）を含むすべてのタンパク質の活性は、これらの種のすべての濃度により影響される。時々、１種または数種を無視することができるが、可能性のある活性化種を無視することができる状況を、十分に考慮しなければならない。その理由は、ＮＯ、ＣＯ、Ｈ_２ＳおよびＨＣＮについての結合定数が、最も豊富なリガンドであるＯ_２の結合定数よりも大きい規模の高次であるからである。種々のヘム含有タンパク質は、これらのリガンドのいずれをも独立して「感知」しない；これらは、すべてのリガンドの相対的濃度を「感知」するに過ぎない。

身体中のＮＯおよびＮＯＳ酵素の挙動は、複雑である。１つのアイソフォームｎＮＯＳについての遺伝子は、「現在プロモーター使用の観点において記載されている最も構造的に多様なヒト遺伝子」である。（Y. Wang et al.,ＲＮＡの多様性は、ニューロン性一酸化窒素シンターゼの翻訳に対する完全な効果を有する。pNAS、１９９９年１０月１２日、vol. 96 no. 21 12150-12155.）ＮＯは、測定するのが困難であり、極めて低いレベルにおいて活性であり、不安定であり、反応性であり、迅速に拡散し、従って濃度は、時間および空間において迅速に変化する。これは、これが多様なシグナル伝達および調節機能を複数の機構により発揮する多くの多様な部位において、活性である。これは、平滑筋のｃＧＭＰ媒介弛緩による血管緊張の調節の原因である。これは、Ｏ_２結合を競合的に阻害することによるチトクロームオキシダーゼによるＯ_２消費の調節の原因である。

これは、システイン残基のＳ−ニトロシル化による、カスパーゼを含むプロテアーゼの阻害の原因であり、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現を誘発する。ＮＯは、免疫反応の主要な成分であり、感染に応答してｉＮＯＳにより大量に産生される。また、ＮＯ勾配が重要である長さ規模は、個別の細胞に拡張されることを、認識するべきである。また、すべての「ＮＯ効果」が、「遊離のＮＯ」により媒介されるわけではないことを、認識するべきである。Ｓ−ニトロソチオール類は、かつて遊離のＮＯが存在していないタンパク質チオール基をトランスニトロソ化することができる。ＮＯ測定における従来の技術によっては、重要であることが知られている時間、距離および濃度規模についての測定が可能ではない。複雑さおよび実験的困難さのこのレベルについて、いかにしてＮＯがヘモグロビン（これはおそらく、最良に理解されているヒトタンパク質である）と相互作用するかの詳細が、当該分野において最も知識のある当業者により合意されていないことは、驚くべきことではない。

一酸化窒素は、多くの代謝的経路において作用を奏することが、知られている。ＮＯの基底レベルは、調性の阻害応答を奏すること、およびこの基底レベルの低下により、当該経路の脱抑制がもたらされることが、示唆されている。Zanzinger et al.は、ＮＯが、基底の交感神経系の緊張を阻害し、励起性反射を弱めることが示されていることを報告した。（一酸化窒素によるＲＶＬＭにおける基底の、および反射により媒介された交感神経系活性の阻害。Am. J. Physiol. 268 (Regulatory Integrative Comp. Physiol. 37): R958-R962, 1995.）

ＮＯの１つの機能は、チトクロームオキシダーゼに結合し、Ｏ_２の結合を競合的に阻害することにより、チトクロームオキシダーゼによるＯ_２消費を調節することである。Ｏ_２消費の阻害は、すべての細胞中の各々のミトコンドリアにおけるＯ_２の濃度を、良好に制御することができないため、有利である。Ｏ_２が消費されると、Ｏ_２レベルは低下し、一層多量のＮＯが結合し、阻害が増大し、残りのＯ_２の消費が遅くなる。この阻害がないと、Ｏ_２源に最も近いミトコンドリアは、一層多量に消費し、離間したミトコンドリアは、Ｏ_２をほとんどまたは全く獲得しない。いくつかの組織、例えば心筋について、Ｏ_２消費は、基底とピーク代謝活性との間で、１０倍よりも大きく変化し得る。このＯ_２流量を達成するために、毛細管の間隔が、Ｏ_２消費に伴って変化しない（また、他の場合においては空である毛細管のある増大した補充がある）ため、勾配を増大させなければならない。ＮＯ濃度が低下すると、ミトコンドリアによるＯ_２消費の速度が、ＮＯがもたらした阻害を解消することにより、上昇する。

ＮＯによるチトクロームオキシダーゼの阻害は、ＮＯとＯ_２との両方の相対的濃度に依存し得る。従って、減圧低酸素症の間のＶＯ_２ｍａｘの低下は、同一のＮＯに対する比較的少ないＯ_２のためであり得、一方イソボレミック貧血の間のＶＯ_２ｍａｘの低下は、同一のＯ_２に対する増大したＮＯのためであり得る。イソボレミック貧血の間の吐き出されたＮＯの増大は、鼻通路において産生されたＮＯの肺における比較的少ないトラップおよび破壊のためである。イソボレミック貧血の間の筋肉への減少したＯ_２送達は、比較的高いＮＯレベルのためである。ＮＯ濃度が高くなると、ミトコンドリアの動作基点は、一層高いＯ_２濃度の方向に変化する。ミトコンドリアにおけるＯ_２の濃度は、実際に、ＮＯによる一層大きい阻害のために、イソボレミック貧血の間増大する。Ｏ_２シンクにおける濃度が高くなると、濃度勾配は、比較的小さくなり、従ってＯ_２流量は比較的小さくなる。イソボレミック貧血の間の血液乳酸塩の減少により、ミトコンドリアは、実際に、比較的低酸素ではない場合があり、従って嫌気性解糖は、比較的小さいことが例証される。増大した嫌気性解糖をもたらす低下したＮＯレベルの逆の結果を、後に討議する。

ＶＯ_２ｍａｘの低下を、減圧低酸素症およびイソボレミック貧血において観察することができ、ＶＯ_２ｍａｘの増大は、Ｌ−ＮＡＭＥ阻害を伴って観察される。これは、ミトコンドリアにおけるＮＯ濃度が、ヘモグロビンによるＮＯの破壊により血液中のヘモグロビン濃度に、およびＮＯＳによるＮＯ産生に結合することを例証する。

ＮＯは、多くのタンパク質のヘムに結合する。身体の鉄のほとんどが、ヘモグロビン中にあるため、血液中のヘムの濃度は、すべての他の組織におけるよりもはるかに高く、従ってヘムによるＮＯの結合は、ここでは最も迅速であり、血液は、ＮＯの主なシンクであると考えられる。ＮＯの主な供給源は、ｅＮＯＳが構成的に発現される内皮である。ＮＯの供給源およびＮＯのシンクが、一緒に極めて近くにあり、供給源およびシンクから離間した領域におけるＮＯ濃度は、供給源−シンク相互作用の詳細に敏感に依存する。ＮＯの他の供給源が、同様に存在する。Stamler et al.は、血液および血漿が、主な１つがＳ−ＮＯ−アルブミンである多種のＳ−ニトロソチオール類を含むことを報告している。（一酸化窒素は、哺乳類血漿中を、主に血清アルブミンのＳ−ニトロソ付加物として循環する。Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 89, 764-7677, 1992.）

ＮＯは、光により、並びにキサンチンオキシダーゼを含む種々の酵素、銅イオンおよびＣｕ、ＺｎＳＯＤを含む銅含有酵素によりＳ−ニトロソチオール類から切断され得る。ＮＯの代謝機能の多くは、遊離のＮＯの遊離を必要としない。タンパク質の活性領域におけるシステインが、Ｓ−ニトロシル化されている際には、タンパク質の活性は、影響を受ける。１種のＳ−ニトロソチオールから他のものへのＮＯの移動は、トランスニトロソ化と呼ばれ、プロテインジスルフィドイソメラーゼを含む多種の酵素により触媒される。ＮＯの代謝効果の多くは、Ｓ−ニトロソチオール類により媒介される、例えばＳ−ニトロソチオール類は、低酸素症に対する換気性の応答を媒介することが、知られている。

ヘマトクリットにおける５０％の低下の例において、毛細管壁におけるＮＯ濃度は、前の破壊速度に整合するように増大し、倍加し得る。ＮＯはまた、身体全体に受動的に拡散し、血液中のヘモグロビンである主なシンクを伴って、他の箇所における濃度もまた、上昇する。ヘモグロビンであるシンクを伴って、最小のＮＯ濃度は、消費の部位、即ち血液中のヘモグロビンにおいて起こる。従って、末梢組織中にＮＯの供給源が存在する場合には、天然に、Ｏ_２勾配の逆であるＮＯ濃度の勾配が存在する。ＮＯＳは、多くの組織において発現されるが、このような供給源は報告されていない（おそらく大いに毛細管間のＮＯ勾配を測定するのが実験的に困難であるために）。

本発明の１つの観点において、ＮＯのこの容積供給源の１種の成分は、外部の皮膚上で独立栄養性アンモニア酸化細菌により産生されたＮＯから、赤血球を含まない皮膚において産生された低分子量のＳ−ニトロソチオール類であることが、理解される。これらの低分子量Ｓ−ニトロソチオール類は、長期間にわたり安定であり、血漿中で自由に拡散し、循環することができる。種々の酵素は、ＮＯを、酵素部位においてＮＯを遊離する種々のＳ−ニトロソチオール類から切断することができる。これは、正常な生理学において崩壊をもたらす皮膚上のＡＡＯＢからのＮＯのこの容積供給源の損失である。

Ｓ−ニトロソチオール類を用いて、毛細管の遠くでＮＯを発生する身体の利点は、Ｏ_２が、Ｓ−ニトロソチオール類からのＮＯの産生に必要ではないことである。一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）からのＮＯの産生には、Ｏ_２が必要である。Ｓ−ニトロソチオール類の十分な背景と共に、ＮＯは、無酸素領域においてさえも発生し得る。遊離のＮＯもまた、ＮＯが、他の分子、例えばシステイン残基のチオールまたはヘム中の鉄に結合した際にのみ効果を奏し、従ってＮＯの効果が、Ｓ−ニトロソチオール類およびトランスニトロソ化酵素が存在する場合に、遊離のＮＯの不存在下でさえもトランスニトロソ化反応により媒介され得るために、必要ではない。

本発明の他の態様において、顕性の無酸素の不存在下で、高められたＮＯが、低下したＯ_２よりも、ヘマトクリットおよび他の「低酸素症」媒介因子を調節するのに有効な「低酸素症」シグナルであり得ることが、理解される。「正常な」ヘマトクリット設定点が、顕性の低酸素症の不存在下で決定されるため、「正常な」Ｈｃｔ設定点を、ＮＯにより、およびＯ_２レベルによってではなく、または一層正確には、ＮＯ対Ｏ_２の比率（ＮＯ／Ｏ_２）により決定することができる。「低酸素症」シグナルは、ＮＯ／Ｏ_２と線形である必要はなく、「低酸素症」シグナルは、増大したＮＯに伴って増大することができ、減少したＯ_２に伴って増大することができる。各々は、「低酸素症」シグナルに対する効果を有することができるが、必ずしも等しい効果ではない。

同様に、通常連続的に、および顕性無酸素症の不存在下で起こる血管リモデリングをまた、また連続的に、および顕性無酸素症の不存在下で起こる「低酸素症」シグナルにより調節しなければならない。毛細管床への血液の流れが減少した際には、当該床により行われた組織の部分へのＯ_２送達は、減少する。この結果、低酸素症の不均一な出現がもたらされ、毛細管から最も離間した（Ｏ_２拡散耐性の意味において）細胞は、最初に低酸素症を経験する。このことは、インビトロで観察されており、ここで、灌流したラット心臓に、蛍光がＯ_２により消光されたＰｄポルフィン(porphine)を注入し、Ｐｄポルフィンの蛍光およびＮＡＤＨの蛍光（ミトコンドリア脱酸素の基準）は、Ince et al.により、正常酸素圧の、および低酸素症の灌流の間に観察された。（ラット心臓における低酸素症状態の不均一性は、毛細管レベルにおいて決定される。Am. J. Physiol. 264 (Heart Circ. PhysioI. 33): H294-H301, 1993.)

無酸素状態から正常酸素圧の状態への移行の間に、比較的少ないＯ_２を有する領域は、比較的多いＮＡＤＨを有する領域と整合し、当該領域の不均一性の長さ規模は、毛細管の領域と整合した。この文献は、「低酸素症」が局所的な効果であり、これが毛細管レベルにおいて不均一であること、不均一性が毛細管の間隔によるものであること、および停止した流れによる「低酸素症」は、高い流れでの無酸素的流体による「低酸素症」と同一の不均一性を有することを例証している。最も大きい不均一性は、無酸素からの回復の間に観察された。また、十分なＮＯの不存在下で、Ｏ_２についてのチトクロームオキシダーゼの活性は、比較的大きく、即ち所定のＯ_２濃度における活性は、比較的大きいことに、注意するべきである。従って、毛細管に極めて接近した場所にある細胞は、比較的多量のＯ_２を消費し、毛細管から離間した細胞のためには、尚一層少量が残る。

不十分なＮＯにより、低酸素症の不均一性の程度が悪化し、従って低酸素症と有酸素状態との間の移行の回数が増大する。超酸化物の産生は、低酸素症に続く再酸素化の間に最も大きい。ミトコンドリア呼吸鎖は、完全に還元され、Ｏ_２は、これが、チトクロームオキシダーゼに往復することができる前に電子を獲得する。低下したＮＯレベルと共に、ミトコンドリアの動作基点は、一層低いＯ_２濃度の方向に変化する。これは、組織中に貯蔵されたＯ_２のために、比較的小さい「容量」があることを意味する。一層多量の超酸化物が産生され、超酸化物が、拡散律速反応速度でＮＯを破壊するため、一層多量の超酸化物は、尚一層少量のＮＯを意味する。局所的低酸素症により生じた超酸化物によるＮＯのこの破壊により、不十分な灌流の条件が悪化し得る。

血液のＯ_２分圧は、通常極めて一定であり、極めて良好に調節される。毛細管の間隔を調節するために、身体は、Ｏ_２の拡散耐性を当該部位に対して判定し、Ｏ_２拡散耐性が過度に高い毛細管を発生し、耐性が過度に低い毛細管を切除しなければならない。組織のＯ_２要求が、これらの代謝活性に伴って変動し、「正常な」毛細管間隔は、「正常な」代謝要求（プラスある程度の予備）に十分でなければならない。Ｏ_２拡散耐性を決定し、従って調節することができる最も単純な方法は、供給を一定の要求において減少させることである。一定の供給における代替の、増大する要求には、放出されるべき代謝熱を散逸させる方法が必要であり、これは観察されていない。

当該要求が、供給を超えなければならないため、「低酸素症」状態は、誘発されるはずであり、この時点において正常な機能性は、危険にさらされるはずである（さもないとこれは低酸素症ではない）。Ｏ_２濃度または血液の流速が低下し、一方基底の代謝負荷が維持されると、低酸素症の状態が誘発され、従って細胞がＯ_２の拡散耐性を決定することが可能になる。代謝機能性は、必然的に危険にさらされるため、これを行うのに好ましい時間は、代謝要求が最小である際、生物体が移動していないかまたは肉食動物から逃れることが必要ではない際、例えば睡眠中である。また、最低の代謝速度における低酸素症を誘発することにより、最長の時定数がもたらされ、これにより、オーバーシュートおよび低酸素症損傷の機会が最小になる。

赤血球新生は、部分的に、エリスロポエチン（ＥＰＯ）により媒介され、これは、主に、減圧低酸素症、イソボレミック貧血、塩化コバルトおよびデフェロキサミンを含む「低酸素症」刺激に応答して、腎臓により発生する。「低酸素症」の効果の多くは、ＥＰＯ遺伝子を含む多数の遺伝子の転写を活性化する低酸素症誘発可能因子（ＨＩＦ−１α）により媒介される。ＮＯ曝露に応答してのＨＩＦ−１αの複雑な挙動は、Britta et alにより、真正のＮＯ、ＮＯドナーおよびまたｉＮＯＳを発現するトランスフェクトされた細胞をＮＯ供給源として用いることにより、例証されている。（一酸化窒素の影響下でのＨＩＦ−１ａの蓄積、Blood 2001; 97: 1009-1015.）

Sandau et al.は、比較的低いＮＯレベルにより、比較的高いレベルよりも迅速な応答が誘発され、多量のＨＩＦ−１αが産生されることを見出した。ＨＩＦ−１αを誘発しない試験した唯一のＮＯドナーは、またシアニドを放出するナトリウムニトロプルシドであった。彼らはまた、ＨＩＦ−１αの誘発が、ｃＧＭＰにより媒介されないことを決定した。Kimura et alは、血管新生が、部分的にＶＥＧＦにより媒介され、これは、ＮＯにより誘発されるＨＩＦ−１αにより誘発されることを示した。（ヒト血管内皮成長因子遺伝子の低酸素症応答要素は、一酸化窒素による転写調節を媒介する：一酸化窒素による低酸素症誘発可能因子−１活性の制御、Blood, 2000; 95: 189-197.）ＡＴＰの解糖的産生に必要な酵素の転写は、ＨＩＦ−１αに応答して生じる。次に、不十分なＮＯにより、同様に解糖的酵素の不十分なレベルがもたらされる。

Frank et al.は、正常な創傷治癒を伴う血管新生は、部分的に、増大した一酸化窒素により誘発される上昇したＶＥＧＦにより生じることを示した。（一酸化窒素は、培養されたケラチノサイト（ＨａＣａＴ）において、および皮膚の創傷が修復する間に、血管内皮成長因子発現の増大した誘発を引き起こす、FASEB J. 13, 2002-2014 (1999).）

従って、低酸素症が、十分なＮＯにより伴われない際には、一層長い期間についてのＯ_２の一層低いレベルが、ＨＩＦ−１αおよびＶＥＧＦの誘発を発現させるのに必要である。低いＮＯレベルについて、Ｏ_２のミトコンドリア消費は一層迅速であり、従ってＯ_２レベルは、高いＮＯについての場合よりも迅速および大幅に、かつ長期間にわたり降下することを、念頭に置くべきである。

本発明の他の態様において、毛細管粗鬆化により誘発された低酸素症による器官細胞の加速された代謝回転は、慢性の退化性疾患において観察された加速された加齢における要因であり得ることが、理解される。身体は、毛細管間の空間を、局所的なＯ_２要求が局所的な血液供給と整合するように制御する。これを行うために、これは、「低酸素症」の状態を誘発し、ＨＩＦ−１αおよびＶＥＧＦにより、必要な箇所において血管新生を開始する。毛細管が過度に近接していないことを確実にするために、また、内皮細胞アポトーシスにより毛細管切除をもたらし得る付近の「低酸素症」の不存在を示すシグナルが存在し得る。この切除は、付近の「低酸素症」細胞から拡散するＶＥＧＦ（または他の内皮細胞生存因子）の不存在により媒介され得る。

Lang et al.は、ＶＥＧＦ欠乏により、内皮細胞におけるアポトーシスが誘発されることを報告した。（ＶＥＧＦ欠乏により誘発されたアポトーシスは、計画された毛細管退行の構成要素である、Development 126, 1407-1415 (1999).）不十分なＯ_２を有するが、ＨＩｆ−１αを開始するＮＯ／Ｏ_２比率を有しない細胞からの低い基底ＮＯによる、不十分なＶＥＧＦにより、新たな毛細管が形成することが防止され、すでに形成した付近の毛細管が、これらからＶＥＧＦを剥奪することにより切除される。従って、低い基底のＮＯにより、毛細管から最も離間した細胞の集団において、慢性的な不十分なＯ_２の状態が誘発され得、毛細管間の平均の空間が増大し得る。いずれかの１つの時点において冒され得る細胞の数は、小さく、毛細管空間よりも小さい長さ規模を有する単離された領域において生じ得る。

さらに、細胞は、１つずつのみ冒され得る。このような単離された低酸素症細胞は、検出するのが困難である。このような細胞が、アポトーシスまたは壊死により死滅する際には、もたらされた炎症はまた、検出するのが困難である。時間の経過に伴って、冒された細胞は死滅し、除去され、毛細管構造の形状は崩壊し、新たな細胞は、低酸素症帯域中に移動し、一層多くの毛細管が切除され、長年にわたり、器官の細胞の多くは、冒され得る。生存する細胞が、***して死滅した細胞に代わる場合には、細胞死滅および細胞置換のサイクルは、多数回起こり得、長年にわたり、このようにして冒された細胞の数は、器官における合計を、おそらく何倍も超え得る。各々の細胞***に伴って、細胞中のテロメアは一層短くなり、テロメアが過度に短くなった際に、細胞は、もはや***することができない。

本発明の態様において、次に、毛細管粗鬆化は、毛細管から離間した細胞における過度に少ないＮＯの結果として理解され得ることが、理解される。十分なＮＯがないと、細胞は、血管新生を開始するためのシグナルを発生しない場合がある。十分なＮＯを伴わない慢性的な低いＯ_２にもかかわらず、血管新生を開始するための「低酸素症」シグナルはない。しかし、細胞には、種々の代謝機能を発揮するのに必要なＡＴＰおよび他の種を供給するために、酸化的リン酸化のためのＯ_２が必要である。Ｏ_２が不十分であると、細胞機能は低下する。十分なＮＯがないと、Ｏ_２勾配（ｄＯ_２／ｄｘ）は、低いＯ_２におけるチトクロームオキシダーゼの阻害の欠如のために、比較的急峻であることに注意するべきである。従って、血管新生を誘発するためのＮＯ／Ｏ_２許容限界を超える細胞は、一層大きい低酸素症により誘発された機能障害を受け得る。いくつかの細胞は、嫌気性解糖によりＡＴＰを生じることができる。しかし、嫌気性解糖により、発生したＡＴＰの単位あたり、好気性解糖により消費されるよりも１９倍多くのグルコースが消費される。少数の細胞さえも、嫌気性解糖によりＡＴＰを産生する場合には、局所的なグルコース濃度は、減少し得る。低酸素症によるグルコースレベルのこの局所的な減少の効果は、以降で明らかである。

嫌気性解糖への依存は、他の効果であるＮＡＤＨまたは還元等価物の発生を有する。これらの還元等価物は、Ｏ_２が不十分であるために、酸化され得ない。細胞がこれらを「廃棄する」ための１つの方法は、これらを、脂質の合成において用いることである。これは、非アルコール性脂肪性肝炎において観察される肝臓脂質の１つの供給源であり得る。肝臓によるアルコールの代謝により、脂肪性の肝臓をもたらす「過剰な」還元等価物が産生されるのと同時に、毛細管粗鬆化からの慢性のびまん性低酸素症による嫌気性解糖によっても、同様であり得る。

細胞が低酸素症である際、またはこれらが、酸素性状態と低酸素症状態との間で変化する際には、超酸化物の産生は、増大する。この超酸化物はさらに、ＮＯと超酸化物とが拡散律速反応速度で反応し、低いＮＯのすべての効果を悪化させるため、ＮＯレベルを低下させる。これは、ＮＯ急性発症およびレイノー現象の狭窄した毛細管についてもたらされるものであり得る。毛細管が粗鬆化した際には、組織は、特にすべての低酸素症発作に対して、組織の容積の灌流を減少させるすべての変化、例えば風邪に対して感受性である。

これが発生した際には、組織は、低酸素症となり、超酸化物が産生され、ＮＯが破壊され、毛細管は、低下した血管拡張のために一層狭窄し、これにより、さらなる低酸素症、さらなる超酸化物およびさらなる狭窄がもたらされる。低酸素症により、低いＮＯが悪化し、逆もまた同様である。これは、正のフィードバックの場合である。１つの解決方法は、第１の位置における毛細管粗鬆化を停止することである。ＮＯが、超酸化物で破壊された際には、ペルオキシ亜硝酸塩が生成する。ペルオキシ亜硝酸塩は、多くの酵素を冒す強力なオキシダントである。冒される酵素は、ｅＮＯＳである。Goligorsky et al.は、ｅＮＯＳにより、ＮＯがＬ−アルギニン、Ｏ_２、ＮＡＤＰＨおよびテトラヒドロビオプテリンから合成されることを報告した。（Goligorsky et al., カベオラとｅＮＯＳとの間の関係：近接にあるすべてのものおよびすべてのものの近接性、Am J Physiol Renal Physiol 283: F1-F10, 2002.）

電子は、ＮＡＤＰＨから、カルモジュリンを介して、ｅＮＯＳ二量体上に往復する。ｅＮＯＳ二量体が、ペルオキシ亜硝酸塩に曝露された際には、亜鉛チオラート錯体が不安定化され、ｅＮＯＳは、「分離」する。Zou et al.は、これにより、ＮＯの代わりに超酸化物が産生されることを示した。（Zou et al., 亜鉛−チオラート錯体の酸化およびペルオキシ亜硝酸塩による内皮性一酸化窒素シンターゼの分離、J. Clin. Invest. 109:817-826 (2002).）

本発明の他の観点において、ペルオキシ亜硝酸塩損傷は、過度に多量のＮＯの場合であり得ず、過度に少ない場合であり得ることが理解される。増大したＮＯにより増大した損傷を示す実験的結果の多くは、用いる実験的手法の人為的結果であり得る。このような実験において用いられるほとんどのＮＯドナーは、ＮＯを無差別に放出する。ＮＯと同程度に反応性である化合物を無差別に放出することにより問題が生じることは、驚くべきことではない。同様に、ＮＯＳ阻害剤の多くは、ＮＯ産生を阻害するのみならず、超酸化物産生をもＮＯＳにより阻害する。従って、虚血性損傷に対するＮＯＳ阻害剤の「保護」効果は、必ずしも、損傷が、ＮＯの結果であることを例証しない。

１個のみの細胞が、低酸素症となる場合においても、当該細胞の周囲で、得られた超酸化物は、ＮＯおよび細胞を破壊し、周辺の細胞は、ＮＯがさらに減少する。比較的少ないＮＯにより、ＨＩＦ−１αおよびＶＥＧＦのシグナルは、弱められ、毛細管粗鬆化は、進行し得る。

毛細管間隔を制御するために、専らＯ_２レベルに依存することは、Ｏ_２レベルが毛細管間隔を反映しない組織、例えば肺のガス交換領域においては、問題である。

癌
本発明の他の態様において、細胞が、ＤＮＡを複写する際の誤りについての比較的大きい危険のある際に、低酸素症の間のＮＯの存在により、細胞が、低酸素性ストレス下にある間に***することが防止され得ることが、理解される。１つの細胞の機能は、細胞サイクルの調節である。これは、細胞が、いかにして、およびいつＤＮＡを複製し、これを複製の染色体中に組み立て、***するかを制御する調節計画である。細胞サイクルの調節は、極度に複雑であり、完全には理解されていない。しかし、細胞サイクルの経過に沿って、サイクルが停止し得、このようになるための条件が改善されるまで***が停止し得る、多くの点がある。Ashcroft et al.により、「ストレスシグナルは、ｐ５３を安定化するための複数の経路を用いる」(Molecular And Cellular Biology, ２０００年５月、p. 3224-3233.)中に報告されているように、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質は、細胞サイクルの調節における重要なタンパク質であり、これは、細胞停止およびアポトーシスの両方を、ＤＮＡ損傷を含む多様な細胞ストレスシグナルから開始する作用を奏し、ｐ５３は、ヒト癌の半数より多くにおいて、突然変異している。

低酸素症は、ｐ５３の蓄積を開始し、低酸素症が、細胞サイクルを調節するにあたり重要である一方、低酸素症単独では、ｐ５３ｍＲＮＡエフェクタータンパク質の下流発現は誘発されず、従って細胞サイクルの停止は生じない。Goda et al.は、細胞停止の低酸素的誘発には、低酸素症誘発因子−１（ＨＩＦ−１α）が必要であることを報告した。（低酸素症誘発可能因子１αは、低酸素症の間の細胞サイクルの停止に必須である。Molecular And Cellular Biology, ２００３年１月、３５９〜３６９頁。）Britta et al.は、ＮＯは、ＨＩＦ−１αについての主な刺激の１種であることを報告した。（Britta et al., 一酸化窒素の影響の下でのＨＩＦ−１ａの蓄積、Blood, ２００１年２月１５日、第９７巻、第４号。）対照的に、ＮＯは、転写的に活性なｐ５３の蓄積を生じ、細胞サイクルの停止を生じ、アポトーシスを生じる。（Wang et al., 一酸化窒素によるｐ５３活性は、ｍｄｍ２の下方調節を伴う、The Journal Of Biological Chemistry Vol. 277, No. 18, ５月３日発行、１５６９７〜１５７０２頁、２００２年。）

細胞***の間の腫瘍における低酸素症により、遺伝子の不安定性が増大し、これには、増大した突然変異、欠失および塩基転換が含まれる。Graeber et al.は、腫瘍における低酸素症は、低酸素症媒介アポトーシスに対して耐性の腫瘍細胞を選択することを開示している。（Graeber et al., 固体腫瘍における減少したアポトーシス可能性を有する細胞の低酸素症により媒介された選択、Nature, １９９６年１月、4;379(6560):88-91.）誤りが、ｐ５３遺伝子中に導入された場合には（すべての癌の半数より多くにおいて発生したように）、当該細胞（およびすべての娘細胞）は、もはや癌が制御不能に成長するのを防止する主な腫瘍抑制遺伝子の１つを有しない。多くの腫瘍細胞は、低酸素症に対して極めて耐性であり、低酸素症により、化学療法薬と放射線との両方に対する耐性が付与され、多くの腫瘍は、低酸素症領域を有する。

Postovit et al.は、腫瘍侵襲性が、低酸素症により増大することおよび、増大が、ＮＯを放出する化合物により遮断されることを報告している。（Postovit et al., 一酸化窒素シグナル形成経路の腫瘍細胞侵襲性関与の酸素により媒介された調節、The Journal Of Biological Chemistry, Vol. 277, No. 38, ９月２０日発行、３５７３０〜３５７３７頁、２００２年。）Postovit et al.はまた、種々のＮＯＳ酵素は、Ｏ_２を用いてＮＯを発生し、従って正確に比較的多くのＮＯが必要である時点においては、低酸素症の条件下では比較的少ないＮＯを産生することを記録している。低酸素症により、ＶＥＧＦの産生が誘発され、従って血清欠乏によるアポトーシスが低下する。血清中には、多くの成長因子があり、この数種のみが、特徴づけされている。２型糖尿病におけるインシュリン（これはまた、内皮細胞のための成長因子である）の増大は、補償的であって、低い基底ＮＯレベルによる脈管構造のアポトーシスを低下させるか否かは、疑問である。

Marchesi et al.は、Ｌ−アルギニンを２型糖尿病患者に投与することにより、インシュリン感受性が増大し、前腕血流が増大することを開示している。（Marchesi et al., 長期間の経口Ｌ−アルギニン投与により、２型糖尿病患者における末梢および肝臓インシュリン感受性が改善される、Diabetes Care 24:875-880, 2001.）このことは、低下した基底ＮＯレベルが、２型糖尿病に特有であることを示す。さらに、Wideroff et al.により、癌並びに***、肝臓、腎臓、膵臓、大腸、脳および他の癌の合計の発生率は、すべて糖尿病と診断された患者において上昇していることが報告されている。（Wideroff et al., デンマークにおいて真性糖尿病で入院した患者の人口に基づく同齢集団における癌の発生率、J Natl Cancer Inst 1997;89:1360-5.）

本発明の他の観点において、早期の初経および増大した身長は、低い基底ＮＯによる増大した基礎代謝についてのマーカーであることが、理解される。乳癌において、危険を増大させる因子は、早期の初経、決して妊娠しないこと、決して母乳で育てないこと、先進地域に生活していること、都会の地域に生活していること、長身であることであることは、十分知られている。例えば、Yoo et al.は、ロサンゼルスに生活している華僑についての年齢補正発生率は、１００，０００あたり４８．７であり、一方上海に生活している中国人について、これは、２１．２であり；ロサンゼルスにおける日本民族について、これは、７２．２であり、大阪において、これは、２１．９であることを、報告した。（韓国における乳癌の疫学：発生、高危険群および防止、J Korean Med Sci 2002; 17: 1-6.）。乳癌の発生率に影響するとは見られない因子には、ＰＣＢまたはＤＤＴへの曝露が含まれ、このことは、「化学物質」への曝露は、主な要因ではないことを示唆する。保護効果を提供する妊娠および授乳を伴うのは、血管増殖および増大した毛細管密度であることが、あり得る。

早期の初経を伴うエストロゲン「ホルモン」への増大した曝露は、必然的であることが、示唆された。しかし、多くの***腫瘍が、エストロゲン依存性である一方、いかにしてエストロゲンが、癌の開始をもたらす遺伝子異常を誘発するかは、明らかではない。妊娠により、多くの成長因子が誘発され、妊娠の多くの成長因子は、いくらか「保護的」であるが、早期の初経の少数の成長因子は、「必然的」であることは、見込みがないと見られる。都会／田園および先進国／未開発国の効果は、ＡＡＯＢおよび基底ＮＯレベルに対するこれらの効果のためであり得る。多くの保護的因子の多くは、比較的大きい毛細管密度と整合しており、既知の危険因子の多くは、低下した毛細管密度と整合している。先進世界における乳癌の発生率が、所々未開発の世界の発生率の２倍よりも大きいことは、最も先進の世界の癌は、開発に伴う環境的な変化により生じることを示す。

移住の研究により、移住者の乳癌発生率は、最初に、起源の位置の乳癌発生率と整合し、時間経過に伴って、移住した地域の乳癌発生率に整合するように変化することが示された。しかし、Grover et al.は、この変化についての時定数は、１０年の程度であることを示した（解説乳癌および前立腺癌の発症、Carcinogenesis vol. 23 no. 7 pp. 1095-1102, 2002.）。抗生物質に曝露されると、乳癌の危険が増大することが、示されている。（Velicer et al., 乳癌の危険に関する抗生物質の使用。JAMA. 2004; 291: 827-835.）抗生物質への曝露により、乳癌の危険が、皮膚上または場合によってはさらに乳管中に生息するＡＡＯＢを除去することにより、改変され得る。

ＡＴＰ減少の悪影響
事実上すべての代謝プロセスがＡＴＰを用いるため、不十分なＡＴＰにより、事実上すべての細胞機能が危険にさらされる。ＡＴＰの減少により、アポトーシスがもたらされ得、重篤な場合には、壊死がもたらされ得る。このようなアポトーシスおよび壊死は、毛細管から最も離間した細胞において予測され、１個ずつの細胞で発生すると見込まれる。びまん性アポトーシスまたは壊死は、観察するのが困難であるが、これらの同一の退化性疾患の多くにおいて観察される慢性びまん性炎症を説明し得る。

代謝負荷を増大させるすべての発作は、ＡＴＰ減少の条件下で、ニトロ減少症(nitropenia)により悪化すると予測される。

すべての細胞において、損傷され、かつミスフォールドされたタンパク質は、ユビキチンと結合することにより廃棄され、プロテアソームに輸送され、ここでこれらは、ＡＴＰ媒介タンパク質分解により分解される。不十分なＡＴＰの条件下で、損傷し、かつユビキチン化されたタンパク質は、多くの障害において観察されるように、病理学的レベルに蓄積すると予測される。例えば、アルツハイマー病において、アミロイド堆積物が、脳中に蓄積する。同様に、パーキンソン病において、損傷した超ユビキチン化された(hyperubiquitinated)タンパク質から構成されるレビ小体は、脳中に蓄積する。同様に、関節リウマチにおいて、腹部の脂肪中のアミロイド堆積物は、異常ではない。同様に、透析を受けている患者において、アミロイドの蓄積は、異常ではない。うっ血性心不全において、損傷され、超ユビキチン化されたタンパク質は、心臓中に蓄積する。タンパク質の病理学的蓄積は、ニトロ減少症による不十分なＡＴＰの症状であり得る。

本発明の他の観点において、増大したナトリウム取り込みにより、腎臓に対する代謝負荷が増大し、虚血性発作に対する感受性が増大し、これにより低ＮＯにより誘発された毛細管粗鬆化の進行が加速され得ることが、理解される。低酸素症ストレス下にある間の増大した細胞***により、増大した突然変異がもたらされ、癌性変換の可能性が増大する。慢性的な低いＮＯの条件下で、毛細管が粗鬆化した後に、毛細管から最も離間した細胞は、常に低酸素性ストレスの慢性的状態にあり、従ってこれらを正常から逸脱させ、アポトーシスまたは壊死または遺伝子的不安定性をもたらす発作に特に感受性である。代謝負荷を増大するすべての発作により、局所的低酸素症が増大し、これらが死滅するかまたは変異する速度が上昇する。

腎臓において、主な代謝負荷は、ナトリウム再吸収のためである。増大したナトリウムにより、腎臓に対する代謝負荷が増大し、虚血性発作に対する感受性が増大し、低ＮＯにより誘発された毛細管粗鬆化の進行が加速される。これは、なぜ高い塩分の食事が高血圧症および腎臓損傷を悪化させるかを説明し得る。Lieber et al.は、肝臓において、アルコール代謝により、９０％までの他の代謝基質が置換され得ることを報告した。（Lieber et al., 代謝効果および他の薬剤との相互作用を含むアルコールの薬理学および代謝、Clinics in Dermatology 1999;17:365-379.）肝臓中の細胞にアルコールでストレスを加えると、低酸素症ストレスに対するこれらの応答が悪化することが予測される。肥大性の心臓は、低酸素症に対して特に脆弱である。従って、退化性疾患についての認識された危険因子の多くは、正常な毛細管密度を有する患者において良好に耐容され得るが、屈折した毛細管を有するすべての組織の代謝的欠陥を悪化させ得る因子である。

同様に、また、ミトコンドリア減少により、虚血性または低酸素症発作に対する脆弱性が増大する。

本発明の他の観点において、低酸素症性／虚血性死滅をもたらす毛細管粗鬆化およびミトコンドリア減少を防止することにより、細胞の壊死的死滅を防止することは、自己免疫障害を防止し得ることが、理解される。細胞を、慢性低酸素症に曝露した際に、反射性酸素種（ＲＯＳ）の産生は増大し、細胞の代謝機構および最終的には細胞のＤＮＡに対する増大した損傷がある。減少した代謝容量により、ＲＯＳによる、および外来性発癌物質への曝露による損傷の修復についての能力が低下する。時間経過に伴って、損傷は蓄積し、最終的には３つの事象の１つをもたらす。細胞は、癌防止遺伝子の欠失を受け、細胞は、癌性となり、細胞は、壊死により死滅するか、または細胞は、アポトーシスにより死滅する。細胞が壊死またはアポトーシスのいずれかにより死滅した際に、細胞残骸は、当該部位から除去されなければならない。

死滅した細胞は、免疫細胞、通常樹状細胞により貪食される。樹状細胞が体を貪食した際には、これは、種々のタンパク質分解酵素により、抗原性断片に消化され、次にこれらの抗原は、主な組織適合性複合体（ＭＨＣ１、ＭＨＣ２）に付着し、抗原−ＭＨＣ複合体は、細胞の表面に移動し、ここでこれは、Ｔ細胞と相互作用し、Ｔ細胞を種々の方法で活性化することができる。すべての細胞損傷により、免疫系を種々の方法で刺激するアジュバントが放出される。一般的に、壊死を受ける細胞は、アポトーシスを受ける細胞よりも大きい免疫応答を刺激する。従って、樹状細胞を死滅した、および死滅している細胞に慢性的に曝露すると、自己免疫性障害がもたらされると見込まれる。慢性的な炎症は、癌発生率を増大することが、十分知られている。

他の観点において、加齢に伴って生じる器官の一般化された収縮は、毛細管粗鬆化／ミトコンドリア減少による細胞の次第のアポトーシス的損失からもたらされ得ることが、理解される。細胞が、壊死により死滅した際には、これらは、炎症を誘発し、細胞残骸は、廃棄のために貪食されなければならない。壊死的組織が、樹状細胞により貪食された際には、樹状細胞は、成熟し、壊死的組織および主な組織適合性複合体から由来する抗原を発現し、免疫刺激性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発をもたらす。顕著な量の壊死的組織（細胞１個ずつ）は、免疫系を自己免疫疾患のために極めて良好に刺激し得る。炎症の重要な成分は、超酸化物の増大した産生であることを認識するべきである。この超酸化物は、ＮＯを破壊し、ニトロ減少症を局所的に悪化させる。

毛細管粗鬆化／ミトコンドリア減少を受けるすべての器官は、自己免疫感作のための候補である。ＰＲＰからＳＳｃおよび自己免疫感作への進行は、単に一層大きい毛細管粗鬆化および自己免疫感作についての増大した機会の反映である。同様に、他の自己免疫障害は、毛細管粗鬆化により誘発された慢性炎症のためである。

Bukhari et al.は、原発性レイノー現象（ＰＲＰ）において、ネイルフォールド毛細管は、正常な対照よりも（わずかに）低密度であり、全身性硬化症（ＳＳｃ）に進行した患者におけるよりも豊富であることを例証した。（Bukhari et al., 原発性レイノー現象および全身性硬化症における増大したネイルフォールド毛細管寸法、British Journal Of Rheumatology Vol 24 NO 35: 1127-1131, 1996.）

彼らは、毛細管密度が、３５ループ／ｍｍ^２（正常な対照）から３３（ＰＲＰ）に、および１７（ＳＳｃ）に減少したことを見出した。毛細管肢間の平均の距離は、対照、ＰＲＰおよびＳＳｃについて１８μ、１８μおよび３０μであった。各々の毛細管の間の数個の細胞のみが、いずれか１つの時点において低酸素症により損傷したとしても、当該損傷は蓄積し、最終的には、当該細胞は、壊死し、貪食されるであろう。自己免疫感作についての極めて多くの機会と共に、これは、自己免疫感作が生じる前の単に時間の問題であると見られる。ストレスを加えられた細胞が、アポトーシスにより除去された場合には、これらがかつて当該箇所にあったという剖検に対する徴候がない場合がある。加齢に伴って生じる器官の一般化された収縮は、毛細管粗鬆化による細胞の次第のアポトーシス的損失からもたらされ得る。

本発明の他の観点において、低い基底ＮＯにより、線維性肥大がもたらされることが理解される。死滅した細胞が除去された後に、新たな細胞は、容易にこれに代わることができない。その理由は、これを支持するＯ_２が不十分であるからである。すべてのこのような新たな細胞は、同一の運命を経験する。空間が空のままであり得、この場合において、器官は収縮し、毛細管は、一緒に一層近接し、新たな細胞は、ここでは、ここで失われた細胞により正式に産生されたＶＥＧＦが剥奪され、従って毛細管は切除され、低酸素帯域が再編成される。これにより、冒された組織の一般的な収縮がもたらされ得る。線維症を支持する組織において、比較的不活性なコラーゲン線維が、空間を満たし得る。問題の特定の器官に対する身体の代謝要求が、低下しないため、器官は、一層大きく、しかしここでは顕著な線維含量を伴って成長することを試行し得る。

これにより、例えば心臓、肝臓および腎臓の線維性肥大がもたらされ得る。いくつかの器官、例えば脳は、神経および血管の３次元結合性が重要であるため、一層大きく、または一層小さく成長することができず、非対称的に収縮する脳上に連続的かつ同時に位置づけられ得ない。空間は、何かで満たされなければならず、β−アミロイドは、（あまり不活性ではない）空間充填体であり得る。腎臓は、腎臓カプセルのために一層大きく成長することができず、従って生存する細胞の数は、一層少なくなり、これらは、線維性組織で置換される。死滅した細胞が除去された場合には、組織は収縮し、ＮＯ／Ｏ_２の比率は、再び下降し、毛細管は、再び一層低密度になる。

これにより、末期腎不全、うっ血性心不全／心臓肥大、原発性胆汁性肝硬変、アルツハイマー病、アテローム硬化症、炎症性腸疾患、肥大性瘢痕形成、およびレイノー現象で開始し、全身性硬化症で終了する多発性結合組織疾患およびまた毛細管粗鬆化が観察される原発性シェーグレン症候群の危険な循環が構成され得る。Ferrini et al,は、ＮＯＳのＬ−ＮＡＭＥでの慢性的な阻害による基底ＮＯレベルの低下により、心臓および腎臓の一般化された線維症がもたらされることを示した。（Ferrini et al., 誘発可能な一酸化窒素シンターゼの抗線維化作用。Nitirc Oxide: Biology and Chemistry Vol. 6, No. 3, pp. 283-294 (2002).）低い基底ＮＯにより、線維性肥大がもたらされることがあり得る。

食欲調節における要因としての毛細管密度およびミトコンドリア減少
本発明の他の態様において、毛細管粗鬆化／ミトコンドリア減少は、対象の食欲を制御する能力を冒すことが、理解される。毛細管粗鬆化は、加齢したヒトおよび動物の脳において観察される。毛細管粗鬆化は、インシュリン様成長因子−１を含む循環する成長因子の減少と関連する。成体脳における神経発生は、血管新生と協調する。脳が、多くの恒常性機能を調節するため、脳の制御要素に対する毛細管間の増大した拡散長さは、当該種の不適切な血液濃度として「解釈され」得る。脳中のグルコースの流量は、正常な代謝要求に極めて近接しており、ここで、最大のグルコース流量は、グルコース消費よりもわずか５０〜７５％大きいのみであり、血液脳関門を横断するグルコース輸送体は、飽和可能であり、立体特異的であり、エネルギーまたはイオン勾配と独立している。

食欲の調節の大部分は、脳により媒介され、毛細管粗鬆化は、「栄養素」（または「栄養素」と比例するマーカー化合物）の適切な血液濃度が、不十分であると解釈されることを生じ得る。これは、肥満の異常発生の１つの原因であり得る。食欲を制御することができない個体は、単に、当該個体の毛細管と食欲を誘発する脳細胞との間の過度に長い経路を有し得る。当該個体の脳は、毛細管からいくらか過度に離間した当該個体の脳細胞が、「飢えている」ため、当該個体に、当該個体が、「飢えている」と告知し得る。これは、単に比較的長い拡散経路からもたらされるのではなく、介在性細胞による「栄養素」の消費によりもたらされ得る。細胞が、低酸素症であるか、または不十分なミトコンドリアを有し、かつＡＴＰを酸化的解糖から誘導することができない際には、これらは、代わりに、嫌気性解糖によりＡＴＰを発生する。

嫌気性解糖による代謝を支持するのに必要であるグルコースの量は、酸化的解糖によるよりも、１９倍大きい。従って、単一の低酸素症／ミトコンドリア減少細胞は、１９個の低酸素症でない細胞と同程度に多量のグルコースを消費し得る。数個の部分的に低酸素症の細胞さえも、「グルコース感知細胞」とグルコース供給源である毛細管との間にあったとすると、「グルコース感知細胞」は、必然的に誤って低い読み取りを受けるであろう。ニューロンが、ＡＴＰを、酸化的リン酸化によってのみ発生する一方、他の脳細胞、例えばアストロサイトはまた、ＡＴＰを、嫌気性解糖により発生することができる。ニューロンに近接した数個の低酸素症アストロサイトは、当該ニューロンからグルコースを剥奪すると見込まれる。多くの人々を悩ます糖および炭水化物に対する欲求は、付近の低酸素症アストロサイトのためにグルコースが剥奪された特定のニューロンから由来し得る。

高められた血糖は、一層多量のグルコースを当該細胞に取り入れる試行であり得るが、グルコース輸送体が、飽和可能であり、経路が、過度に多くの低酸素症アストロサイトにより遮断されているため、血糖が十分高いことは、可能ではない場合がある。肥満の慢性退化性疾患との関連は、肥満が、これらを「生じる」からではなく、肥満を生じる事項（毛細管粗鬆化およびミトコンドリア減少）がまた、退化性疾患を生じるからであり得る。Kingwellは、運動により、正常に健康な、および高コレステロール血症の個体における基底ＮＯレベルが上昇することを示した。（Kingwell, 運動中の一酸化窒素により媒介された代謝調節：健康および心血管疾患におけるトレーニングの効果。FASEB J. 14, 1685-1696 (2000).）。

肥満に対する運動の正の効果は、一酸化窒素により媒介された血管新生により媒介され得ることが、あり得る。飢餓またはケトン体を産生する食事（低い炭水化物）のいずれかによるケトン症の誘発により、肝臓が、ケトン体アセト酢酸およびβ−ヒドロキシ酪酸を脂質から発生する。これらのケトン体は、循環し、グルコースの代わりに酸化的リン酸化においてニューロンにより用いられる。ケトン体を産生する食事により、電気ショック、高圧Ｏ_２および化学的に誘発されたてんかん発作によるてんかん発作の誘発のための許容限界が上昇する。ケトン体を産生する食事は、半世紀を超えて、てんかんを処置するために用いられていた。ケトン体を産生する食事のてんかん発作防止効果は、一層大きいニューロンエネルギー予備によるものであることが、示唆された。ケトン体を産生する食事の食欲抑制効果は、同様に、一層大きいニューロンエネルギー予備から由来し得る。

本発明者は、ＡＡＯＢを、１年間にわたり適用し、食欲の顕著な低下に注目し、顕著な不快を伴わずに単に比較的少量を摂食することにより、１年にわたり〜３０ポンドを損失させた。本発明者が、正式に食事を抜く間に機能することができなかった一方、当該発明者は、現在では、精神的に、または物理的に機能する能力の損失を伴わずに、複数の食事を抜くことができる。

非インシュリン依存性糖尿病の原因としての毛細管粗鬆化／ミトコンドリア減少
本発明の他の観点において、毛細管粗鬆化／ミトコンドリア減少は、非インシュリン依存性糖尿病の原因であり得ることが、理解される。非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）はまた、代謝症候群または２型糖尿病として知られており、インシュリン耐性により特徴づけられる。身体のインシュリンに対する感受性は低下し、インシュリンレベルは上昇する。「原因」は、熱心な研究にもかかわらず未知のままである。これは、世界中のすべての先進地域において、多くの文化および多くの民族群の全域で観察される。ＮＩＤＤＭを有する人々は、高い血中グルコース、高い血中トリグリセリドを有し、典型的に肥満、高血圧症であり、典型的に顕著な内臓脂肪を有する。

他の症状は、ＮＩＤＤＭを伴い、これを、本発明者は、原因としての毛細管粗鬆化に対する核心であると考える。ＮＩＤＤＭを有する、および有しない、肥満の（ＢＭＩ２９）およびやせた（ＢＭＩ２４）４０人の男性（各々１０人）の研究において、Konrad et al.は、休息時の血中乳酸塩レベルは、ＮＩＤＤＭを有しないやせた男性、ＮＩＤＤＭを有しない肥満の男性、ＮＩＤＤＭを有するやせた男性、ＮＩＤＤＭを有する肥満の男性について、それぞれ１．７８、２．２６、２．４２および２．７６（ｍＭ／Ｌ）であったことを報告している。（Konrad et al., Ａ−リポ酸処置により、血清乳酸塩およびピルビン酸塩濃度が低下し、２型糖尿病を有するやせた、および肥満の患者におけるグルコース有効性が改善される、Diabetes Care 22:280-287, 1999.）乳酸塩は、嫌気性解糖の基準である。Ｏ_２が、酸化的リン酸化によりＡＴＰを発生するのに不十分である際には、細胞は、ＡＴＰを、嫌気性解糖により産生することができる。

嫌気性解糖の生成物の１種は、乳酸塩であり、これは、細胞から搬出されなければならず、さもないとｐＨは降下し、機能に危機が生じる。血中乳酸塩は、共通して、運動研究において測定され、ここで、増大は、最大の酸化的仕事がなされ得る仕事負荷を示す。休息時の乳酸塩の一層高いレベルにより、休息時の増大した嫌気性解糖が示され、これは、毛細管粗鬆化と整合する。やせた糖尿病の男性が、肥満の糖尿病でない男性よりも高い乳酸塩を有していたことに注目することは、興味深い。

ＮＩＤＤＭ個体の筋肉細胞は、ＮＩＤＤＭではない個体よりも、解糖的対酸化的酵素の高い比率を有する。従って、ＮＩＤＤＭの個体は、酸化的リン酸化からよりも大きい比率の当該個体の筋肉エネルギーを、嫌気性解糖から誘導している。

筋肉活動前および筋肉活動中のＭＲＩでの筋肉ｐＨおよびリン酸塩種の測定により、良好に制御された１型糖尿病を有する男性は、筋肉生理学が変化していることが例証された。Crowther et al.による研究において、糖尿病の男性は、低下した酸化的能力を有し、彼らのＡＴＰの一層大きい比率を嫌気性解糖から誘導し、この差異は、休息時にも明らかである。（Crowther et al., 良好に制御されたインシュリン依存性（１型）糖尿病を有する男性の骨格筋における変化したエネルギー性特性、Am J Physiol Endrocrinol Metab 284: E655-E662, 2003.）この研究は、これが、乳酸塩産生をインビボで、ｐＨ変化により測定しているため、興味深い。彼らの研究において、彼らは、数人の個体が、異なるｐＨおよび従って乳酸塩産生を有する筋肉細胞の２種の異なる集団を有し、１０人の糖尿病患者のうちの４人および１０人の糖尿病患者でないうちの２人であることを記録した。彼らの研究において、彼らは、単に値を平均したが、異なる乳酸塩産生を有する細胞の別個の集団は、異なる酸化的リン酸化能力および従って異なるＯ_２供給の指標である。

ＮＩＤＤＭを有する女性は、やせた、および肥満の対照の両方と比較した際に、減少したＶＯ_２ｍａｘを有する。この減少したＶＯ_２ｍａｘは、いかなる心血管合併症も存在しない際にも、明らかである。ＮＩＤＤＭを有する女性は、休息時および運動中の両方において、比較的低いピーク仕事産生および比較的高い血中乳酸塩レベルを有していた。

１型糖尿病と２型糖尿病との両方を有する人々における増大した嫌気性解糖のこれらの観察は、末梢組織への、および／または不十分なミトコンドリアへの慢性的に減少したＯ_２送達と整合する。この減少した嫌気性解糖が、代謝要求が最小である際の休息時に観察されることは、この減少したＯ_２送達／不十分なミトコンドリアが慢性的であることを示す。

インシュリン依存性糖尿病（１型糖尿病）の原因としての毛細管粗鬆化／ミトコンドリア減少
１型糖尿病は、血中グルコースレベルの増大に応答してインシュリンを放出する膵島の自己免疫性破壊により特徴づけられる。毛細管粗鬆化、ミトコンドリア減少および解糖酵素の低下した発現により媒介されたニトロ減少症によるＡＴＰ減少により、膵臓中のミトコンドリアが、一層高い電位となり、これにより、超酸化物が発生し、これにより、タンパク質の分離が誘発され、次にこれにより、ＡＴＰレベルが低下し、次にこれにより、島アポトーシスまたは壊死がもたらされる。次に、自己免疫性感作が生じ得る。免疫系が感作されて膵島を攻撃した後に、超酸化物が、これらの周辺において産生され、これにより、局所的なＮＯレベルが尚一層低下し、毛細管粗鬆化、ミトコンドリア減少および不十分な解糖酵素が悪化する。

肝炎のＡＡＯＢでの処置
原発性胆汁性肝硬変は、レイノー現象、そう痒症、乾燥症候群、骨粗鬆症、門脈圧亢進症、神経障害および膵臓不全と関連する。肝臓異常は、リウマチ疾患と関連する。上昇した肝臓酵素は、肝炎の症状であり、上昇した肝臓酵素は、「無症候性」原発性胆汁性肝硬変の初期の症状として観察される。

上昇した肝臓酵素は、胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎および肝臓マトイド(matoid)関節炎（ＲＡ）の結節性再生性過形成、多発性筋炎および皮膚筋炎（ＰＭおよびＤＭ）、全身性硬化症（ＳＳｃ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）および結節性多発性動脈炎（ＰＡＮ）を含む膠原病を有する患者において、共通して見られる。

原発性胆汁性肝硬変の進行は、４つの段階により特徴づけられ、最初は、以前には知られていない原因による肝内小胆管の炎症性破壊であり、続いて小導管の増殖および／またはピースミール壊死であり、続いて線維症および／または架橋的壊死であり、続いて肝硬変である。Benvegnu et al.は、肝臓の肝硬変と肝臓癌との間の相関関係を報告している。（Benvegnu et al., 肝硬変の病因学と肝細胞癌腫発生のパターンとの間の関連についての証拠。Gut 2001;48:110-115.）種々の自己免疫性結合組織病は、原発性胆汁性肝硬変と関連しており、これには、シェーグレン症候群、強皮症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象、食道蠕動低下、手指硬化もしくは末梢血管拡張）、炎症性関節炎または甲状腺疾患が含まれる。

原発性胆汁性肝硬変のための選択された処置は、経口的なウルソデオキシコール酸である。これは、肝臓の循環における他の一層有毒な疎水性胆汁塩類に代わる親水性胆汁塩である。機構が、完全には理解されていない一方、治療効果の要素は、減少した胆汁合成による肝臓に対する低下した代謝負荷から由来し得る。

抗ミトコンドリア抗体が、通常は原発性胆汁性肝硬変において存在する一方、ＰＢＣを有する５〜１０％の患者は、このような抗体をさらに有しておらず、これらの患者のほとんどは、平滑筋または核因子に対する自己免疫性抗体を有する。しかし、免疫抑制療法は、ＰＢＣの進行を遅くするにあたり、経口的なウルソデオキシコール酸と同等には有効ではない。これは、自己免疫性抗体が、ＰＢＣの原因ではなく、代わりにある他の原因の結果であることを示す。

本発明の１つの態様において、ＡＡＯＢを個体の頭皮および身体に適用すると、肝臓酵素の低下がもたらされた。図１は、共にＡＡＯＢを頭皮および身体に適用する前および適用している間の、単一の個体についての肝臓酵素、アラニントランスアミナーゼレベル（ＳＧＰＴまたはＡＬＴ）のプロットを示す。ＡＡＯＢの適用に続いて、ＳＧＰＴレベルは、２０年近くにおいて最低の点に降下した。Schoen et al.は、一酸化窒素が、肝臓再生の開始を引き起こすことが知られていることを報告した。（Schoen et al., ずれストレスにより誘発された一酸化窒素放出は、肝臓再生カスケードを引き起こす、Nitric Oxide: Biology and Chemistry Vol. 5, No. 5, pp. 453-464 (2001).）従って、ＡＡＯＢの適用は、上昇した肝臓酵素および上昇した肝臓酵素が示す慢性肝炎を低下させるのに有効であることが示されている。ＡＡＯＢの適用の後の肝臓酵素の低下の時間的規模を示すためのデータが、わずかであるに過ぎない一方、これは、即効性ではないと見られる。次第の減少は、上昇した基底ＮＯレベルに続く毛細管リモデリングによる、長期にわたる毛細管粗鬆化の次第の回復と整合する。

肝炎が低下すると、ＰＢＣおよび他の肝臓疾患の進行が遅くなり、肝臓癌と関連する肝硬変への進行が低下する。

本発明の他の観点において、毛細管密度を調節するために用いられる「低酸素症」は睡眠中に起こり得ることが、理解される。１つの特定の理論により束縛されないが、睡眠中に正常に起こる血圧および血流速度の低下は、身体の正常な「ハウスキーピング」機能の１つであり、毛細管と、当該毛細管が支持する細胞との間のＯ_２拡散耐性をリセットする作用を奏する。Zoccoli et al.によると、夜間における血圧の正常な低下は、増大したＮＯに帰し、ここで、ＮＯＳのＬ−ＮＮＡでの阻害により、脳血流量における覚醒−睡眠差異が消失する。（Zoccoli et al., 一酸化窒素阻害により、脳循環における睡眠−覚醒差異が消失する、Am J Physiol Heart Circ Physiol 280: H2598-H2606, 2001.）Kapfis et al.は、ラットにおけるＮＯＳの阻害により、正常な睡眠が阻害されることを示している。（Kapfis et al., 一酸化窒素合成の阻害により、ラットの睡眠が阻害される。Brain Research 664 (1994) 189-196.）

Weitzberg et al.は、ハミング(humming)により、鼻ＮＯが、ＮＯが産生される洞とのガス交換を増大させることにより大幅に増大することを報告した。（Weitzberg et al., ハミングにより、鼻一酸化窒素が大幅に増大する、Am J Respir Crit Care Med Vol 166. pp 144-145, 2002.）毛細管粗鬆化と関連する多くの障害はまた、夜間における障害を受けた呼吸、いびきまたは睡眠時無呼吸のいずれかと関連する。肥満、加齢、心血管疾患、高血圧症、関節リウマチはすべて、睡眠中の障害を受けた呼吸と関連する。従って、高レベルのＮＯは、睡眠中に有利であり得、夜間において発汗することおよびいびきは、共に基底ＮＯを増大させるための生理学的機構であり得ることが、理解される。睡眠中の高レベルのＮＯにより、ＮＯ／Ｏ_２比率が増大し、従って「低酸素症」シグナルが増大する。

毛細管空間が、睡眠中に決定されるという仮説は、運動選手が低い高度においてトレーニングするが、生活し、睡眠するために高い高度に移動する、「高い高度での生活−低い高度でのトレーニング」の運動トレーニング生理学により支持される。低い高度におけるトレーニングにより、トレーニングされる筋肉に対する代謝負荷が一層大きくなり、ここで、低酸素症は、最大代謝負荷の付近により誘発される。夜間においてＯ_２供給を減少させることにより低酸素症を誘発することは、嫌気性呼吸についての彼らの高い能力および高いレベルのＯ_２を貯蔵するミオグロビンのために、筋肉については有効ではない場合がある。しかし、筋肉を、不十分なＮＯでの夜間の低酸素症に触れさせることを回避することは、なぜ筋肉の癌がまれであるかについての説明であり得る。意識的な制御下にはない器官における低酸素症は、運動によっては自発的には誘発され得ない。

例えば、エリスロポエチンは、「低酸素症」の条件の下で、腎臓により産生され、赤血球およびＨｃｔの産生を調節する。Ge et al.は、エリスロポエチンが、２８００メートルにおいて、６時間後に５０％近くの増大を伴って、減圧低酸素症でほとんど即座に上方調節されることを示した。（Ge et al., 短時間減圧低酸素症に応答してのエリスロポエチン放出の決定。J Appl Physiol 92: 2361-2367, 2002.）ＥＰＯは、罹患したか、または欠けている腎臓からのＥＰＯの損失を補償し、ヘマトクリットを上昇させるために、共通して腎臓透析患者に施与される。しかし、「正常な」範囲に近いヘマトクリットを上昇させると、死亡率が、比較的低いレベルよりも増大する。

Besarab et al.による１２３３人の患者の無秩序化された研究において、Ｈｃｔを４２％に上昇させた結果、Ｈｃｔを３０％に上昇させた患者よりも、２９ヶ月にわたり２２％大きい死亡率がもたらされ（１８３人対１５０人の死亡）、死因は、２つの群において同様であり、透析患者に特有なことに、高いＨｃｔ群において単に比較的高い死亡があった。（Besarab et al., 血液透析およびエポエチンを施与されている心臓病を有する患者における低いヘマトクリット値と比較しての、正常の効果、N Engl J Med 1998;339:584-90.）上昇したＨｃｔにより基底ＮＯレベルが低下し、上昇した死亡率は、低下した基底ＮＯによるものであったことがあり得る。死因は、両方の群が実際に低いＮＯレベルを有し、腎臓損傷を第一にもたらしたのが、低いＮＯであるため、同様であった。低いＨｃｔが「劣悪である」一方、低いＮＯもまた劣悪である。基底ＮＯレベルを上昇させるための良好な方法を伴わずに（現在まで）、血液の増大したＯ_２容量を低下したＮＯ濃度と均衡させることは、困難な処置の選択肢である。

アルツハイマー病
Torre et alは、アルツハイマー病（ＡＤ）は、低灌流に続発する神経学的劣化を伴い、部分的に不十分な一酸化窒素からもたらされる微小血管の障害であることを報告した。（概説：アルツハイマー病が微小血管の障害であるという証拠：構成的一酸化窒素の役割、Brain Research Reviews 34 (2000) 119-136.）

ＡＤは、すべての個体において起こるわけではなく、これは、単一の、またはさらに少数の低灌流のエピソードにおいて起こらず、むしろこれは、長期間にわたり、時々長年にわたり起こる。アルツハイマー病の経過は、不変であり、単調である一方、定常的ではなく、低灌流または失神の既知のエピソードとは関連していない。初期の段階において、神経障害の程度および低下の速度の顕著な可変性があり得る。これは、アルツハイマー病の診断を、初期の段階において困難にし得る１つの要因である。

低灌流によるＡＤにおいて観察された酸化的損傷のレベルを生じるのに十分な虚血のレベルにより、顕著な同時発生する精神的効果が生じる。酸化的損傷を生じない低酸素症および虚血のレベルは、顕著である。混乱または失神をもたらす低灌流のレベルは、典型的には、アルツハイマー病患者によっては報告されておらず、従って酸化的損傷は、報告可能ではない時間の間に起こっているはずであり、これは、睡眠中に起こっている場合がある。

睡眠中、身体全体の代謝は低下する。血圧は下がり、血流は減少する。身体全体で血流の速度が低下し、血管壁におけるずれ（shear）が減少するので、ｅＮＯＳが下方制御されｅＮＯＳによるＮＯ産生は低下する。脳のエネルギー需要は低下する。しかし、脳はまだかなり活性化しており、まだ相当量の血流を必要とする。

低体温は、虚血事象中の脳の損傷を低減させることが知られている。このような事象の最中およびその後でさえも、低体温は、再灌流による障害を低減させることによって脳の損傷を低減させる。睡眠は通常、０．５〜０．７℃の体温低下をもたらす。睡眠中の中程度の低体温は、脳のエネルギー必要性を独立して低下させ、損傷に対する虚血の許容限界を低下させる。基礎代謝は熱が１℃上昇する毎に約１４％上昇するため、睡眠中の０．５〜０．７℃の「通常の」低下は、７〜１０％の代謝率の低下である。

ＮＯは、低酸素症による基礎体温の低下において必要であることが知られている。Almeida et al.は、ＮＯ合成がＮ−ニトロ−Ｌアルギニン（Ｌ−ＮＮＡ）で阻害された際に、低酸素症の後の基礎体温の低下は大幅に減少することを報告した。（Almeida et al., 熱の低酸素症阻害における一酸化窒素の役割、J. Appl Physiol. 87(6): 2186-2190, 1999.）

非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）と関連するアルツハイマー病に対する「保護効果」の報告は、部分的には、体温を低下させるこれらの効果からもたらされ得る。

アルツハイマー病の疫学は、先進国においては良好に研究されているが、未開発国においてははるかに研究が不十分である。多くの患者、多くの医師および多くの文化全域の信頼でき、かつ一貫性のある鑑別診断は、困難であり、場合によっては誤りを伴う。とは言うものの、現在の理論により、低酸素症の原因となる事象は、睡眠中に起こり、次に発生率は、睡眠温度の上昇に伴って上昇しているはずである。表１および２は、SuhおよびShahによる概説記事中に報告されているアルツハイマー病の発生率を示す。（Guk-Hee Suh, Ajit Shah, 概説記事：認知症における疫学的遷移の概説−アルツハイマー病および血管性認知症に関連する指数の国間の比較、Acta Pyschiatr Scand 2001: 104: 4-11.）

気温は、Yahoo天気情報www.yahoo.comからの集計された月平均気温からとった。研究都市についてのデータが得られない場合は、近くの都市を用いた（括弧内）。

データは、２つのセット、「先進国」および「未開発国」群に分類した。北京は両方に分類されており、１９８７年のデータは「未開発国」群、１９９９年のデータは「先進国」群となっている。この２群は、読み取られた１人あたりの入浴に対する水消費量に基づいて分けられた。関連する人口はＡＤの危険のある人口、即ち年長者である。当該人口は、新しい入浴習慣の適用において他に遅れをとりやすい。

表１は、未開発国の都市における、月平均気温の最高および最低値並びにアルツハイマー病と認知症全体の発生率を示す。表２は、先進国の都市における、月平均気温の最高および最低値並びにアルツハイマー病と認知症全体の発生率を示す。

重要であると考えられている入浴習慣は、頭および頭皮を、頭皮中への吸収のための一酸化窒素を産生する独立栄養性アンモニア酸化細菌の天然の集団を洗浄して除去する洗浄剤で洗浄することである。本発明の１つの観点において、頭を洗浄しないことは、ＡＤの観点から保護的であり、集団は、おそらく、種々のパターンの頭洗浄を伴う混合された挙動を示す。豊富なシャンプー製品および清浄な高温水を有する開発国の都市において、頭を洗浄することは、一般的であり、１週間あたり１回よりも少なく頭を洗浄する集団は、おそらく少数である。頭を洗浄することは、開発国の都市において一般的であり、１週間あたり１回よりも少なく頭を洗浄する集団は、おそらく少数である。未開発国の都市において、本質的に独立栄養性細菌を含まないのに十分頻繁に頭を洗浄する数は、おそらく尚顕著である。集団の当該部分は、未開発国の都市におけるＡＤの症例の大部分を表し得る。

データを、図２にプロットし、これは、ＡＤの発生率対最も暑い月における最低気温（即ち、睡眠中の夜間の気温）を示す。２つのデータのセットは２つの群に対応し、最低気温の上昇はＡＤの増大した発生率に相関しているが、傾きと切片は異なると見られる。未開発国群の切片は約７０°Ｆである。「先進国」群に対するすべての切片はこのグラフの範囲からはずれており、温度を上げて「快適帯」にするために暖房が使用されるため、非現実的である。未開発の地域におけるＡＤの進行が、種々の睡眠温度のために季節性を示し得る一方、開発された地域において、切片は、外側の温度とは無関係にほとんどの人々が睡眠している最低気温よりも低い。

本発明の１つの観点において、ＡＤの現在の高い発生率における要因は、しばしば、さらには毎日シャンプーで洗浄することを可能にした１９７０年代初期に起こったシャンプー技術の改善であることが、理解される。当該時期の前には、毎日シャンプーで洗浄したとしたら、頭は「わら状に曲がり」、非審美的であったであろう。毎日の洗髪を可能にしたのは、「コンディショニング」シャンプーの開発であった。シャンプーに関して刊行された米国特許の数のグラフを、図３に示す。１９７０年代初期には、大きい急増がある。同様に、１型糖尿病と診断された人の数における急増が、約１０〜１５年後にある。本発明の１つの観点において、肥満、糖尿病およびＡＤの現在の異常発生は、コンディショニングシャンプーの開発およびこれらの頻繁な使用の採用から由来する。

高血圧症に関連する他の健康上の悪影響はまた、低い基底ＮＯの結果であり得る。高血圧症において、低下した血管反応性がある。血管拡張に対する低下した応答はまた、低い基底ＮＯと一致する。ＮＯは、供給源からセンサー部位に拡散し、ここでこれは、シグナル伝達効果を有する拡散可能な分子である。低いＮＯレベルについて、すべてのＮＯ供給源は、一層多くのＮＯを産生して、ある強度の等しいＮＯシグナルをある距離だけ離間して発生しなければならない。ＮＯは、３次元において拡散し、当該拡散範囲内の合計の容積は、適切なシグナルをセンサーの位置において付与するレベルに増大しなければならない。これにより、供給源において、および供給源とセンサーとの間で一層高いＮＯレベルがもたらされ得る。次に、供給源付近の上昇したＮＯの局所的な悪影響は、過度に低いＮＯ背景から生じ得る。この筋書きが、実際に発生するというある証拠がある。

ラット膵島において、Henningsson et alは、ＮＯＳをＬ−ＮＡＭＥで阻害すると、ｉＮＯＳの誘発により全体的なＮＯ産生が増大することを報告した。（ＮＯシンターゼの慢性的な遮断は、膵島ＮＯ産生を逆説的に増大し、膵島ホルモン放出を変調させる。Am J Physiol Endocrinol Metab 279: E95-E107, 2000.）ＮＯＳ活性を増大させることによるＮＯの増大は、ある限界まで徐々に上昇するに過ぎない。ＮＯＳを活性化するが、十分なテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）またはＬ−アルギニンを供給しない際には、これは、「分離し」、超酸化物（Ｏ_２−）をＮＯの代わりに発生する。次に、このＯ_２−は、ＮＯを破壊し得る。ＮＯを、ＢＨ４またはＬ−アルギニンの供給を超える速度で産生する試行により、代わりにＮＯレベルが低下し得る。これにより、正のフィードバックがもたらされ得、ここで、低いＮＯレベルは、ＮＯＳの刺激により悪化し、分離したＮＯＳは、顕著なＯ_２−を発生し、これは、アテローム硬化症、末期腎不全、アルツハイマー病および糖尿病において観察されるように、局所的な反応性のＯ_２種（ＲＯＳ）損傷を生じる。

骨粗鬆症
骨粗鬆症は、多くの年長者を冒す障害である。年長者における骨折の年齢調整した発生率は、増大している。S. Khosla et. al.により、３０年間にわたる小児期の遠位の前腕骨折の発生率、JAMA. 2003; 290;: 1479-1485中に報告されているように、小児期の遠位の前腕骨折の発生率は、最近の３０年間で増大している。一酸化窒素は、骨密度を冒すことが、十分知られている。骨密度に対するエストロゲンの正の効果のいくつかは、ＮＯ代謝に対するエストロゲンの効果により媒介され、ここで、S. J. Wimalawansaは、ニトログリセリンが、骨損失を防止するにあたり、エストロゲンと同程度に有効であることを、「ニトログリセリン療法は、卵巣摘出により誘発された骨損失の防止における標準的なエストロゲン置換療法（プレマリン）と同程度に有効である：ヒトの試験的な臨床的研究(Journal of Bone and mineral research Vol. 15, NO. 11, 2000.)」において報告している。小児期の間の、および年長者における骨折の増大は、皮膚上のＡＡＯＢの損失からのＮＯの損失の結果であることが、あり得る。皮膚上のＡＡＯＢを置換すると、骨粗鬆症が低下する。

加齢
加齢の進行を遅くするための剤は、古代以来探求されているが、ほとんど効果はない。寿命を延長する唯一例証された処置は、カロリー制限であり、ここで、Holloszyは、食物摂取を随意の対照の７０％に制限すると、坐位のラットにおける寿命が８５８日から１，０５１日に、約２５％延長されることを報告した。（Holloszy, 食物を制限した運動している雄のラットの死亡率および長寿：再評価。J. Appl. Physiol. 82(2): 399-403, 1997.）カロリー制限と延長された寿命との間の関係は、良好に確立されているが、原因となる機構は、確立されていない。Lopez-Torres et al.は、ラットにおける肝臓ミトコンドリア酵素の試験により、カロリー制限と関連した低下した複合体Ｉ活性によるＨ_２Ｏ_２産生の減少が示されることを報告した。（Lopez-Torres et al., ラット肝臓ミトコンドリアにおける酸素基発生および酸化的ＤＮＡ損傷に対する加齢および長期間のカロリー制限の影響、Free Radical Biology & Medicine Vol. 32 No 9 pp882-8899, 2002.）

Ｈ_２Ｏ_２は、呼吸中にミトコンドリアにより産生された主なＲＯＳであるＯ_２−の不均化により産生される。Ｏ_２−の主な供給源は、Kushareva et al.他により、ＮＡＤ／ＮＡＤＨレドックス対を複合体ＩＩＩからの電子の逆流により触媒する複合体Ｉであると示唆され、即ちコハク酸還元の部位である。Beckmanにより提案された、加齢の遊離基理論は、細胞ＤＮＡ、抗酸化系およびＤＮＡ修復系に対する遊離基損傷は、年齢に伴って蓄積し、臨界的に重要な系が修復を超えて損傷された際に、死が続くことを想定している。（Beckman , 加齢する成熟体の遊離基理論。Physiol. Rev. 78: 547- 581, 1998.）ミトコンドリアが、超酸化物の主な産生体であること、並びに超酸化物の産生速度およびミトコンドリア効率は、ミトコンドリア電位に強く依存していることが、認識されるべきである。ミトコンドリア電位が低下すると、ＡＴＰの産生が一層効率的になり、超酸化物の産生が一層低くなる。カロリー制限は、加齢に対するこの保護効果を、細胞に一層多くのミトコンドリアを産生することを強制して、一層高い代謝効率を達成することにより奏することができ、この副作用は、低下した超酸化物である。

老化をもたらす遊離基損傷に加えて、また各々の細胞***に伴って短縮されるテロメアの長さに基づく計画された老化がある。ＮＯは、Vasa et al.により、テロメアを活性化し、内皮細胞の老化を遅延させることが例証された。（Vasa et al., 一酸化窒素は、テロメアを活性化させ、内皮細胞の老化を遅延させる。Circ Res. 2000;87:540-542.）低い基底ＮＯは、基礎代謝速度を、チトクロームオキシダーゼの脱抑制により増大する。また、増大した基礎代謝により、細胞代謝回転および成長速度が上昇する。毛細管粗鬆化は、慢性低酸素症を誘発することにより、遊離基損傷を増大させ得、また細胞代謝回転を増大させ得、従って加齢を両方の機構により促進する。

本発明の他の観点において、ＡＡＯＢは、思春期開始の年齢に影響することが、理解される。ヒト老化における興味深い観察は、初経の年齢が、地域が一層開発されるに従って低くなることである。多くの要因が、これを説明するために用いられているが、データに「最良」に適合する相関関係は、Thomas et al.により提案されている文盲率との逆の関係である。（Thomas et al., 初経および閉経における年齢の国際的可変性：パターンおよび主な決定因子。Human Biology, ２００１年４月、v. 73, no. 2, pp. 271-290.）しかし、Freedman et al.は、米国において、１９７４年における初経の中央値の年齢は、それぞれ黒人および白人の少女について１２．９歳および１２．７歳であることを報告した。（Freedman et al., 人種、時間の期間、および人体寸法に対する初経における年齢の関係：The Bogalusa Heart Study, Pediatrics 2002;110(4).）１９９４年において、これらは、１２．１歳および１２．５歳であった。初経の年齢のこの低下は、食事の習慣、特に食事における増大した脂肪に関することが、示唆された。

しかし、１９６５年から１９９５年にかけて、１１〜１８歳の食事中の脂肪の百分率は、実際には、３８．７％から３２．７％に低下した。ノルウェーにおいて、初経の年齢は、１８５０年における１６．９歳から１９５０年においては１３．３歳に低下した。この変化は、時間経過と共に極めて直線的である。米国において、１９１０年から１９５０年にかけて、この低下は、１４歳から１３歳であり、また極めて直線的であり、おそらく食物の入手可能性が比較的低かった世界大恐慌の間に、上昇は観察されていない。思春期の年齢は、実際に、入浴によるＡＡＯＢの損失によるものであり得、食物の上昇した入手可能性のためではない。早期の初経の識字能力の比率との関連は、「きれい好きは敬神に近い」という西洋の概念の採用のためであり得る。疾患は、汚れとは関連しておらず、疾患は、汚れと関連し得るかまたは関連し得ない病原体と関連している。現代の公衆衛生による下痢性疾患の解消は、増大した入浴のためではなく、糞便を含む病原体の衛生的な廃棄および病原体含有廃棄物による水供給の汚染の防止のためであり得る。

平均寿命は、一般的に、経済の発達に伴って増大する。この増大は、多くの要因のためである。乳児死亡率は、飢餓、下痢性疾患および他の感染症の減少により低下する。成人の平均余命は、ヘルスケアに対する一層良好なアクセスにより増大する。しかし、いくつかの先進国は、年長の人口の平均余命が実際に減少しているのを観測し始めている。オランダにおいては、Nusselder et al.により報告されているように、８５歳における平均余命は、男性においては１９８０年代以来、および両方の性別において１９８５／８９年以来減少している。（Nusselder et al., オランダにおける加齢した年齢における平均余命の改善の欠如、International Journal of Epidemiology 2000;29:140-148.）精神障害（おそらくアルツハイマー病）、癌および糖尿病並びに慢性閉塞肺疾患による増大があり、すべての状態は、基底ＮＯレベルの低下により悪化すると予測される。

アレルギーおよび自己免疫障害
本発明の他の観点において、独立栄養性アンモニア酸化細菌は、アレルギーおよび自己免疫障害についての保護的観点をもたらし得ることが、理解される。小児の間でのアレルギーの発生率は、先進世界全体にわたり増大しており、喘息は、現在では小児の最も一般的な慢性疾患である。種々の人口群間のアレルギーおよび喘息の異なる発生率の明確な説明は、提案されていない。データは、極めて複雑であり、一見したところ矛盾する。自己免疫障害もまた一般的である。最良に知られているのは、おそらく１型糖尿病であり、これは、免疫系による膵臓中のインシュリン産生細胞の破壊からもたらされる。再発性妊娠損失はまた、自己免疫障害と関連しており、ここで、正の自己免疫抗体の数は、再発性妊娠損失の数と正に相関している。全身的硬化症、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎および種々のリウマチ性障害は、自己免疫障害の他の例である。

一般的に、アレルギーの発生率は、集団の裕福さが開発により上昇し、かつ集団内で、発生率が最も裕福な群において一層高いため、裕福さに伴って上昇する。しかし、Platts-Mills et al.は、米国において、都会のアフリカ系アメリカ人における喘息の発生率は、郊外の小児の発生率の３倍であることを報告している。（Platts-Mills et al., 喘息およびアレルゲンへの屋内曝露、New England Journal of Medicine、第３３６巻：１３８２〜１３８４頁、１９９７年５月８日、第１９号。）

Rasmussen et al.は、アフリカで出生したスウェーデンの新兵は、スウェーデンで出生したアフリカ家系よりも低いアレルギー症状を示すことを報告した。（Rasmussen et al., スウェーデン新兵における移住およびアトピー性障害、Pediatr Allergy Immunol 1999: 10: 209±215.）この論文は、スウェーデンで出生した人々およびスウェーデン国外で出生した人々の両方についての、「熱帯の家系」の人々（アフリカ、ラテンアメリカまたはアジアにおいて母系出生した人々）についての「社会経済的地位」に基づくアレルギー発生率（＞１２年の母親の教育により測定して）の顕著な差異を示す。興味深いことに、「温暖な」地域（東ヨーロッパ、西ヨーロッパおよびスウェーデン）で母系出生した人々について、「社会経済的地位」に基づく差異ははるかに小さい。中間の地域（中東、南ヨーロッパ）からの母親を有する人々は、「社会経済的地位」に伴って高いアレルギーを示すが、スウェーデンで出生した人々についてのみである。

スウェーデンで出生した「高い」「社会経済的地位」を有するアフリカ家系の人々における喘息の発生率は、スウェーデン人よりも２．９倍大きく、ほぼ米国において都会のアフリカ系アメリカ人と郊外の（おそらく白人）小児にとの間に見られるのと同一の比率である。低い「社会経済的地位」により、発生率は、低い「社会経済的」スウェーデン人のわずか１．１倍まで低下する。スウェーデン国外で出生したことは、高い「社会経済的地位」について保護的価値をほとんど有しておらず、発生率は、尚２．５倍高い。しかし、低い「社会経済的地位」であることおよびスウェーデン国外で出生したことにより、顕著な保護が付与され、発生率は、スウェーデン人のわずか０．５６倍である。従って、出生の場所に依存して、アフリカ家系の人々についての喘息の発生率において、５倍の差異がある。増大した母親の教育に伴って、アレルギーの発生率が上昇することは、母親の識字能力を有する初経の年齢の低下と平行していることは、興味深い。

田園のババリアドイツにおいて、家庭の暖房のために用いられている燃料のタイプと喘息および他のアレルギーの発生との間に、相関関係があることが、見出された。石炭または木材での暖房（セントラルヒーティングと比較して）は、保護的であることが見出された。もしかすると、比較的涼しい寝室の温度により、チリダニに対する感作が比較的小さいことが説明され得るが、またネコ、イヌおよび花粉に対する感作が比較的小さいことが、示唆された。ネコまたはイヌがいる家庭の百分率は、石炭／木材群において比較的大きかった。「社会経済的地位」は、石炭／木材群においては比較的低かった。

これらのような観察により、人々は、小児期の間のアレルゲンまたは疾患への増大した曝露は、後のアレルギーの発生に関する保護的効果の原因であると考えられるという「衛生仮説」を提案した。しかし、衛生仮説に向けられた会議における多くの専門家による合意された声明は、データは相反するままであり、いずれの微生物または他の剤が、保護的効果の原因であり得るかについての指示はないことを述べた。

ＡＡＯＢの適用は、実際に、長期間継続するアレルギー、即ち本発明者の季節的な枯草熱を覆すと見出された。ＡＡＯＢの存在／不存在は、文献における「矛盾する」データを説明し、これが全く矛盾しないことを例証し得る。事実上すべての研究は、開発された世界において出生し、生活する際の、熱帯の家系の人々についてのアレルギーの急激に上昇した発生率についての理由であるように、本明細書中に記載した原因的機構により説明され得る。これはまた、なぜ低い経済的地位が、入浴の習慣が経済的地位の関数である地域に生活する際に特に保護的であるかを説明し得る。石炭／木材で暖房する田園のドイツ人は、入浴するために多量の流れる高温の水を有しないと見込まれる。これは、彼らが保護的である彼らの家庭をいかにして暖房するかではなく、代わりに入浴するための高温水の不足であった。

「衛生仮説」の動因が極めて分かりにくかった理由は、これが、いかなる疾患をも生じないことである。実際に、この動因は、これが独立栄養性のアンモニア酸化細菌（ＡＡＯＢ）であるため、疾患を生じることができない（おそらく免疫無防備状態の個体においても生じることができない）。これらは、病原体を単離するために用いられるようないかなる従属栄養性培地（このすべては、Schechter et al.により報告されたように従属栄養性である）上でも成長しない。（Schechter et al., 微生物疾患の機構、Williams & Wilkins, Baltimore, MD, USA, 1989.）これらがヒト身体上で見出されていない唯一の理由は、誰も、適切な培養培地および手法を用いてこれらを探求していないことである。これらは、硝化のプロセスにおけるアンモニアの硝酸塩への酸化における最初の段階の原因となるすべての土壌中に普遍的に存在する。独立栄養性細菌として、これらは、これらが必要とする基質、即ちアンモニアまたは尿素、Ｏ_２、鉱塩を欠いているいかなる箇所でも、成長することができない。

これらの基質は、洗浄していない皮膚上で、汗残留物から豊富に入手可能であり、「野生の」、および石鹸を用いて頻繁に入浴しない場合において、ヒトは、当該ヒトの外部の皮膚にこれらの細菌が定着することを防止することができない。実際に、これらの細菌は、有益であり、本発明の観点において、これらが共生であること、並びにヒト生理学の多くの観点が、これらの細菌の成長および当該ヒトがこのように豊富に産生するＮＯの利用を容易にするために展開されたことが、理解される。

場合によってはこれらの単離を防止している他の要因は、開発された地域における入浴習慣である。体臭の発生を防止するのに十分な頻度で入浴することは、一般的になった。体臭は、一般的に、入浴しない数日後に起こり、臭気化合物は、剥離した皮膚および汗残留物を臭気のある化合物に代謝する、外部皮膚上の従属栄養性細菌により発生する。３日のうちに、独立栄養性細菌は、入浴後の集団と比較しての約１００倍の増大について、約７倍に倍加し得る。対照的に、従属栄養性細菌は、１０ｅ＋６０倍の増大について、約２００倍で倍加し得る。明らかに、従属栄養性細菌の成長は、栄養素により制限される。独立栄養性細菌および従属栄養性細菌の入浴による除去の同様の動力学を推測して、従属栄養性細菌を入浴により制御することにより、独立栄養性細菌が低く、場合によっては検出不能なレベルに低下する。

本発明の１つの態様において、皮膚上のＡＡＯＢの十分な集団により、従属栄養性細菌による体臭が実質的に抑制されることが、理解される。本発明者は、ＡＡＯＢを本発明者の皮膚に適用し、現在入浴を、２回の夏を含む１５ヶ月間控えている。発汗に関連する体臭は、ほとんどない。実際に、発汗により、体臭が、ＡＡＯＢに栄養分を与え、従属栄養性細菌を抑制するＮＯおよび亜硝酸塩の産生を増強することにより、減少し得る。低い周囲温度により発汗が減少する冬の間に、体臭は増大した。しかし、衣服を増加させて（セーターを着用して）、本発明者は、基礎的発汗を増大させ、体臭を再びゼロ近くに減少させることができた。そう痒、発疹、皮膚感染症または運動選手の足の感染症の発生はなく、足の臭いは実質的になかった。

Pough et alにより報告されているように、ＡＡＯＢは、一酸化窒素を、これらの正常な代謝における中間体として産生する。（Pough et al., 独立栄養性硝化細菌についてのエネルギーモデルおよび代謝流量分析、Biotechnol Bioeng 72: 416-433, 2001.）Zart et al.により試験された１種の菌株は、約１００ｐｐｍの空気中のＮＯの濃度（この研究において試験された最も高いレベル）において、最適な成長を有していた。（Zart et al., Nitrosomonas eutrophaによるアンモニア酸化についてのガス状ＮＯの重要性。Antonie van Leeuwenhoek 77: 49-55, 2000.）これらは、一層高いレベルを耐容することができる。Schmidt et al.により報告された他の菌株を用いて、０〜６００ｐｐｍ（ＡｒおよびＣＯ_２中で嫌気性）のＮＨ_３消費における減少はなかったが、これは、１０００ｐｐｍのＮＯにおいて１／３減少した。（Schmidt et al., ２種の異なる無機栄養生物による酸化窒素類（ＮＯｘ）の存在下での嫌気性アンモニア酸化、Applied and Environmental Microbiology, ２００２年１１月、５３５１〜５３５７頁。）

ほとんどは好気性であるが、いくつかの菌株は、亜硝酸塩または硝酸塩を、Ｏ_２に加えて用いて、ＮＯ産生を増大させることができる。空気中の１０００ｐｐｍのＮＯは、水性溶液中の約２μＭ／Ｌに相当する。本発明者が用いた菌株は、２．２μＭ／Ｌの測定されたＮＯ濃度を産生した。ＡＡＯＢ代謝のほとんどの研究は、アンモニアおよび硝酸塩を廃水から除去するために廃水処理プロセスにおいてこれらを用いることにより、動機づけされた。廃水処理設備の操作は、数百ｐｐｍのＮＯにおいて所望でなく、従って当該条件下でのこれらの細菌の生理学が、十分に研究されていなかったことは、予想外ではない。

ＡＡＯＢがアレルギーおよび自己免疫障害に対するこれらの保護効果を奏し得る１つの機構は、主にＮＦ−κＢの調節阻害および免疫細胞の活性化の防止および炎症反応の誘発により、一酸化窒素を産生することによる。ＮＦ−κＢは、遺伝子発現を上方調節する転写因子であり、これらの遺伝子の多くは、炎症および免疫応答に関連し、これには、サイトカイン、ケモカインおよび種々の付着因子の放出を生じる遺伝子が含まれる。これらの種々の免疫因子は、免疫細胞の、これらの放出の部位への移動を生じ、炎症応答をもたらす。構成的なＮＯ産生は、ＮＦ−κＢを、ＩκＢα崩壊を防止することによりＩκＢα（ＮＦ−κＢの阻害剤）を安定化することにより強壮に(tonicly)阻害することが、示されている。

アレルギー、喘息、および自己免疫障害は、免疫系の特定の抗原に対する不適切な過剰な応答により特徴づけられる。これは、最初に、胎内での、または生後間もなくのＴ細胞の初期の「刺激」、続いてＴＨ２表現型への刺激、続いてＴＨ１／ＴＨ２のＴＨ２（アレルゲン性）タイプへの傾斜および極性化から誘導されると考えられる。

ＮＯドナーの投与は、Xu et al.により、ラットにおける実験的なアレルギー性脳脊髄炎の発生を防止することが示された。（Xu et al., ＳＩＮ−１、一酸化窒素ドナーにより、初発の局面におけるルイスラットにおける実験的なアレルギー性脳脊髄炎が改善される：時間ウインドウの重要性。The Journal of Immunology, 2001, 166: 5810-5816.）この研究において、ＮＯドナーを投与することにより、マクロファージの中枢神経系中への浸潤が低下し、血液単核細胞の増殖が低下し、血液単核細胞のアポトーシスが増大することが、例証された。これらの結果はすべて、誘発された自己免疫応答の程度および重篤さを低下させることが予測される。

アレルゲン曝露は、感作の必要な観点であるが、アレルギーの発生率が、アレルゲン曝露に直接相関するという証拠はほとんどない。同様の量のアレルゲンへの曝露により、常には同様のレベルのアレルギーは生じない。同様のレベルの喘息は、同一の、および異なるアレルゲンに対する全く異なる曝露を有する集団において生じる。統一の前のアレルゲンおよびその後のアトピー性感作の東および西ドイツのレベルの比較において、最も高い曝露レベルは、東ドイツにおいてであり、アトピー性感作の最も高いレベルは、西ドイツにおいてであった。アレルゲン低下により、感作された個体におけるアレルギー性応答が防止されるという良好な証拠があるが、感作に対するアレルゲン曝露の原因的に関連する規模の良好な証拠はない。数種のアレルゲンについて、正の用量−応答効果（チリダニ）があると見られるが、他のものについて、逆の用量−応答効果（ネコアレルギー）がある。

本発明の他の観点において、アレルギーおよび自己免疫感作の阻害を、皮膚において活性なＮＯ種を産生するＡＡＯＢの局所的な適用により達成することができることが、理解される。いかにして免疫系が作動するかの正確な詳細は、完全には理解されていない。一般的に、細菌、死滅したかまたは死滅している細胞、外来の生物体または他の残骸は、先ず、抗原提示細胞により貪食される。これらの抗原提示細胞の主な群は、樹状細胞（ＤＣ）である。これらの貪食された成分は、一層小さい断片に消化され、これらの断片は、抗原提示細胞の表面に、主な組織適合性複合体ＩおよびＩＩ（ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ）のタンパク質と共に提示される。未成熟のＤＣは、外来体を、プロテアソームの、またはエンドソームの経路のいずれかにより消化する。プロテアソームの経路において、（主に）ＤＣ細胞質からのタンパク質は消化され、得られた抗原は、ＭＨＣＩに結合する。エンドソームの経路において、外来体は消化され、得られた抗原は、ＭＨＣＩＩに結合する。

次に、ＭＨＣに結合した抗原は、細胞表面に輸送され、ここでこれらは、抗原提示細胞と接触するＴヘルパー細胞と相互作用することができる。一般的に、「自己タイプ」の抗原は、プロテアソームの経路により加工され、「外来のタイプ」の抗原は、エンドソームの経路により加工されるが、ここである程度の交差刺激があり、抗原および主な組織適合性複合体に同時に結合することにより、活性化される。次に、これらの活性化されたＴヘルパー細胞は、他の免疫細胞の活性化をもたらす。Gaboury et al.は、一酸化窒素が、肥満細胞により誘発された炎症を阻害することを報告した。（Gaboury et al., 一酸化窒素は、肥満細胞により誘発された炎症の多くの特徴を阻害する、Circulation. 1996;93:318-326.）Forsythe et al.は、一酸化窒素が、システイン残基のＳ−ニトロシル化により肥満細胞付着を阻害することを示した。（Forsythe et al., カルパインの阻害は、ヒト肥満細胞付着の一酸化窒素により誘発された下方調節の構成要素である、The Journal of Immunology, 2003, 170: 287-293.）Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）は、肥満細胞付着を強力に下方調節した。ＧＳＮＯは、皮膚においてＡＡＯＢから産生されると予測される種である。

自閉症
低い基底ＮＯにより、自閉症が、脳中の新たな結合が「良好に形成しない」という、および結合のこの先天性異常が、不十分な基底一酸化窒素の結果であるという機構により、もたらされ得る。不十分な基底一酸化窒素は、神経結合の形成および／または改良の間に十分な一酸化窒素が欠如したことからもたらされ得る。神経結合の形成および／または改良は、主に睡眠中に起こり得る。

自閉症個体において示された追加の症状はまた、原因として低いＮＯを指摘し得、これには、増大したピッチ識別、腸障害、免疫系機能障害、低下した脳血流、脳の増大したグルコース消費、増大した血漿乳酸塩、愛着障害およびハミングが含まれる。これらの症状の各々は、低い基底ＮＯレベルに帰し得る。

自閉症を防止するための１つの方法は、基底ＮＯレベルを、「野生」において（先史時代の状態の下で）頭皮および外部皮膚上に生息し、尿素から誘導された汗から一酸化窒素を発生する、以前は認識されていない共生の独立栄養性アンモニア酸化細菌（ＡＡＯＢ）を回復することにより上昇させることである。本発明者は、以前に、現代の入浴習慣では、これらの細菌は、これらが増殖することができるよりも迅速に洗浄除去され、これらが発生した一酸化窒素の損失により、高血圧症、心臓疾患、肥満、糖尿病およびアルツハイマー病を含む現代の世界の多くの慢性疾患が生じ得ることを報告した。（D. Whitlock, 共生の独立栄養性アンモニア酸化細菌による、尿素から誘導された汗からのヒトの皮膚上でのＮＯの産生、Poster P208, 第３回一酸化窒素の生物学、化学および治療的適用についての国際会議／第４回日本一酸化窒素学会の科学的年会、２００４年５月２４〜２８日において提示。）

ＡＡＯＢを外部皮膚に適用することにより基底ＮＯレベルを上昇させると、自閉症の領域の障害において見出されるいくつかの症状が改善され得る。科学および技術において成功している多くの他の人々と共通して、本発明者は、本発明者が、アスペルガー症候群の穏和な形態を有すると考慮する。これらの細菌を適用することによる、本発明者の基底ＮＯレベルの上昇により、本発明者が独創的に考える能力が主観的に改善され、一方本発明者が注意をそらさせる刺激を無視する能力が低下した。

独立栄養性アンモニア酸化細菌は、すべての土壌中に普遍的に存在し、ここでこれらは、硝化のプロセスであるアンモニアの亜硝酸塩への酸化における最初の段階を遂行する。必須の独立栄養素として、これらは、病原体の単離のために用いられるいかなる標準的な培地上でも成長することができず、なぜこれらがヒト共生動物として一層早期に同定されず、病原性であり得ないかを説明し得る。すべての既知の病原体は、従属栄養性である。多くの動物は、当該動物自体を汚れで本能的に覆い、年少の小児はまた、本能的に汚れの中で遊ぶ。従って、一年中発汗が起こる熱帯の地域において「野生で」生活しているヒトが、これらの細菌を含むバイオフィルムを外部皮膚上に発生させないことは、ほぼ不可能であり得る。

ＮＯのこのような供給源を、進化の期間にわたり連続的に入手可能にして、ヒトは、当該ＮＯをヒト生理学において用いるように進化する。非温度調節性発汗についての１つの生理学的理由は、皮膚上のＮＯ産生を増大させることであることがあり得る。すべての哺乳類は、汗腺を有し、発汗により温度調節しない哺乳類（ラット、マウス、イヌ）は、汗腺が、足に集中して、おそらく従属栄養性細菌および菌類による感染の防止を容易にしている。現代の入浴習慣によるこのＮＯ供給源の除去により、機能障害が生じ得る。

ＣＮＳ、ＡＮＳにおける軸索方向、シナプス形成：
脳は、絶妙に複雑であり、何インチにもわたる連結を有する。ニューロンは、運動性であり、移動すること、および軸索は、長く延在し、結合し、誤って向けられた際に退縮することは、十分知られている。不適切な結合は、排除され、適切な結合が、安定化される。脳中の多くの結合は、「無秩序」ではなく、完全には理解されていない方法で「計画されている」。種々の向神経性要因は、軸索の成長錐状体に化学的合図を提供して、拒絶し、「目指す」ことに関係する。いずれの化合物も、数インチの長さにわたり純粋に引力性の拡散を可能にする特性を有しない。拡散および軸索拡張のための時定数を、達成可能であり、かつ検出可能である濃度に整合させることはできない。

従って、軸索の方向の多くは、反発性であり得、ここで軸索は、不適切な脳領域から拒絶される。成長錐状体が、「十分近接した」際に、これは、引力性の拡散体を用いることを目指すことができる。これらの結合が数インチにわたることにより、複数の向神経性要因が、長い、中程度の、および短い範囲の向性に関係していることが示唆される。ニューロンの数は、可能な向神経性要因および向神経性要因レセプターの数を超える。従って、これらの要因の多くを、１つより多いニューロンにより用いることができる。可能性のある向神経性要因の「有効な範囲」は、この産生速度、背景濃度、崩壊濃度および拡散係数に依存する。

「理想的な」引力性化合物は、高い拡散性、短い寿命、低い背景および低い検出限界を有する小さい分子である。ＮＯは、このような特性を有する。反発性化合物は、完全に不動および静的であり得、いくつかは、細胞膜に固定されると見込まれる。「引力性の」化合物の範囲は、標的の成長錐状体に到達するのに十分でなければならないが、成長錐状体が拡散により正確に勾配の見当を合わせることができる距離を超えることはできない。反発性化合物は、ゼロ範囲を有することができ、接触しての作用のみが必要である。成長錐状体は、この成長経路に沿って多くの箇所において拒絶されなければならないが、これがこの末端結合を形成する１つのみの部位に引きつけられ得る。

成長する軸索の拡張と、これが誤って向けられた際に退縮することができる長さ規模との間の均衡により、発達している脳中の長さ規模が決定され得る。おそらく、脳の１つの「特徴的な長さ規模」は、最後の反発性相互作用と成長する軸索の最終的な「正確な」結合との間の距離である。おそらく、この長さ規模は、引力性拡散体の範囲と同一の程度である。軸索は、特定の細胞に結合して適切に機能する必要はない。おそらく、「ほぼ十分」である結合により、その後のヘビアン(Hebbian)改良が、結合の機能性をこれが十分であるまで「改善する」ことを可能にし得る。

H-J Song et al.は、ｃＧＭＰを含む環状ヌクレオチド類により、ニューロン成長錐状体の反発から引きつけへの変化が生じることを示した。ニューロン成長錐状体の変換は、環状ヌクレオチド類により反発から引きつけに応答する。Science Vol 281 １９９８年９月４日。ｃＧＭＰは、ＮＯにより刺激された際にグアニリルシクラーゼにより産生される。従って、ＮＯは、シグナルを、シグナル進行成長錐状体に提供して目指すことができる。最初の少数の軸索結合は、「無秩序」に作成され得るが、適切な軸索のいくつかが適切な領域に移動した後には、これらは、ＮＯの放出を、移動している軸索における作用電位を有する局面で刺激することができる。ＮＯによる「弱い」結合は、「強い」結合に、シナプス形成により変換され得る。Jeseph A. Gally et al.は、ＮＯが、局所的な容積におけるニューロンの活性を、これらがシナプスにより結合しているか否かとは無関係に結合する「第２のメッセンジャー」であることを示唆した。（Jeseph A. Gally et al., ＮＯ仮説：神経系の発達および機能における寿命が短い迅速に拡散可能なシグナルの可能な効果、Proc Natl Acad Sci. USA Vol. 87, 3547-3551, １９９０年５月。）

神経成長および結合形成が観察され得るいくつかの神経構造の１つは、ニワトリ胚においてである。ニワトリ脳の網膜と視覚的皮質との間の結合の位置づけは、発達の間の顕著な改良を経由する。一酸化窒素は、結合性の組織分布的な正確さのこの改良に必須であることが示された。この改良の間、ＮＯＳは、脳の標的領域中で発現され、網膜においては発現されない。Hope H. Wu et al.は、ＮＯＳの全身的阻害により、結合の改良が妨害されることを示した。（Hope H. Wu et al., ニワトリの網膜視蓋の突出における組織分布的な正確さの発達における一酸化窒素の役割、J Neurosci. 2001, 21 (12):4318-4325.）

Yan Heは、一酸化窒素が、薄い引きずる残遺物を残す間に軸索退縮を発生することを例証した。（Yan He , 一酸化窒素により誘発された軸索退縮の間の微小管再構成、J Neurosci. 2002, 22(14):5982-5991.）この退縮は、微小管および微小繊維の大規模な脱重合を伴わずに発生した。脳に由来する神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の存在下で、ＮＯは、ニューロン成長錐状体を安定化する。Alan F. Ernst et al.は、ＢＤＮＦを塗布した小球と接触させた成長錐状体を、ＮＯにより誘発された退縮に対して安定化した。（Alan F. Ernst et al., 一酸化窒素および脳に由来する神経栄養因子の組み合わされたシグナル形成による成長する網膜軸索の安定化、J Neurosci 2000, 20(4):1458-1469.）

他の因子、神経成長因子（ＮＧＦ）およびニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）は、ＮＯにより誘発された成長錐状体が崩壊するのを防止しなかった。Hope H. Wu et al.は、ＮＯＳの阻害により、同側性に突出する神経節細胞の数が、対照と比較して１０００％増大するが、このうちのわずか１０％が生存することを示した。（Hope H. Wu et al., 発達における遷移的な網膜視蓋の突出の解消における一酸化窒素の関与、Science; １９９４年９月９日；265, 5178.）P. Cammpello-Costa et al.は、ＮＯＳの遮断により、結合性における増大した誤りが誘発され、ラット網膜視蓋突出における病変により誘発された柔軟性が増大することを示した。（P. Cammpello-Costa et al., 一酸化窒素合成の急性の遮断により、組織崩壊が誘発され、ラット網膜視蓋突出における病変により誘発された柔軟性が増幅される、J. Neurobiol 44:371-381, 2000.）

Marriann Sondell et al.は、軸索成長は、ＶＥＧＦにより刺激されることを示した。（Marriann Sondell et al.,血管内皮成長因子は神経栄養活性を有し、軸索成長を刺激し、末梢神経系における細胞生存およびシュワン細胞増殖を増強する、The Journal of Neuroscience, １９９９年７月１５日、19(14):5731-5740. ）ＶＥＧＦ転写は、ＨＩＦ−１αにより開始され、これは、Greg L. Semenzaにより、ＨＩＦ−１α：低酸素症に対する生理学的および病態生理学的応答のメディエイタ、Invited Review (J. Appl Physiol 88: 1474-1480, 2000)中に；並びにSandau et al.により、一酸化窒素の影響下でのＨＩＦ−１αの蓄積(Blood. 2001;97:1009-1015.)中に例示されているように、低いＯ_２および高いＮＯの組み合わされたシグナルにより開始する。血流は、神経活性と強力に相関していることが知られている。

血管拡張は、血管平滑筋の弛緩をもたらすグアニリルシクラーゼのＮＯ活性化およびｃＧＭＰ産生により媒介され得る。神経的に発生したＮＯは、ＶＥＧＦの転写を開始するシグナルを提供し、血管新生を刺激し、血液供給を神経活性と組み合わせ得る。酸素化されたヘモグロビンであるＮＯについての「シンク」について、「過度の」血管新生を防止するための天然のフィードバック機構があり得る。脳血管新生を制御する因子は、血液脳関門が、例えばＮＯを透過する分子に限定され得る。Kon et al.は、ＮＯＳの阻害により、血管新生における血管の出芽が遅延することを示した。Ｎ（Ｇ）−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルによる一酸化窒素シンターゼ阻害により、血管新生における血管の出芽が遅延する。（Kon et al., 微小血管研究 65 (2003) 2-8.）Toshiro Matsunaga et al.は、心臓側副血管の虚血により誘発された成長には、ｅＮＯＳおよびＮＯが必要であることを示した。虚血により誘発された冠血管の側副成長は、血管内皮成長因子および一酸化窒素に依存する。(Circulation 2000;102:3098-3103.)

Dong Ya Zhuは、局所的な脳虚血に続く神経発生には、一酸化窒素が必要であり、ｉＮＯＳ遺伝子を欠いている成体のマウスにおいては欠乏していることを示した。（Dong Ya Zhu et al., 局所的な脳虚血の後の誘発可能な一酸化窒素シンターゼの発現は、成体げっ歯動物歯状回における神経発生を刺激する、J. Neurosci. ２００３年１月１日、23(1):223-229.）おそらく、他の時点における神経発生にはまた、ＮＯが必要であり得る。J. D. Robertson et al.は、一酸化窒素シンターゼの阻害により、タコにおける触覚の、および視覚の学習が遮断されることを報告した。（J. David Robertson, et al.一酸化窒素は、Octopus vulgarisにおける触覚の学習に必要である、Proc. R. Soc. Lond. B (1994) 256, 269-273；およびJ. David Robertson et al., 一酸化窒素は、Octopus vulgarisにおける視覚の学習に必要である、会報；Biological Sciences, Vol. 263, No. 1377（１９９６年１２月２２日）、１７３９〜１７４３。）

脳中の多くの神経結合は、「良好に形成されている」。おそらく、これを達成するためには、結合を「試験し」、「正確な」結合を安定化し、「不正確な」結合を排除することができる機構があり得る。おそらく、特定の神経構造の発生は、関連する細胞の増殖、軸索の関連する脳容積への突出、不適切な容積からの反発、適切な細胞への結合、増殖のフィードバック阻害、続いて過剰な、または誤って結合された細胞の除去を伴い得る。おそらく、これらの結合が生じ得る長さ規模は、移動する軸索が目指すために用いる拡散性吸引体の範囲に依存する。当該拡散性吸引体がＮＯである場合には、ＮＯ拡散の範囲を低下させるすべてのものにより、「良好に結合され」得る脳要素の容積の大きさが減少し得る。低い基底ＮＯレベルの条件下で発達する脳を、ＮＯの低下した有効な範囲のために、一層小さい容積の要素中に配置することができる。

ＮＯは、容積シグナル伝達分子として関係していた。極めて小さい疎水性分子としてのＮＯの独特の特徴は、これが、他の神経伝達物質と比較して大きい距離を拡散し、脂質膜を貫通し、血液−脳関門を貫通することができることである。ＮＯが拡散し、ある末端濃度を達成することができる距離は、ＮＯの背景濃度に依存する。ＮＯの拡散シグナルを、背景ＮＯ濃度に加えることができ、合計が作用レベルを超えた際には、ＮＯシグナルの作用が起こり得る。シグナルが、ＮＯの特定の量を産生する際には、当該シグナルの範囲は、ＮＯ背景に依存し得る。一層低い背景について、容積を作用レベルに増大させるのに必要なＮＯの量は、増大し得る。あるいはまた、ＮＯシグナルが冒し得る容積は、ＮＯ背景が比較的低い際には減少し得、または言い換えると、ＮＯシグナルの有効な範囲は、低下し得る。

ＮＯの作用の範囲に対する背景濃度依存性は、自閉症において見られるいくつかの効果を説明し得る。いくつかの自閉症個体は、優れた聴覚性ピッチ識別、低下した聴覚性の「広範囲の干渉」、および／または「誤った記憶」の増大した識別を示す。いわゆる「学者」タイプの能力は、珍しいものではない。軸索を保護するための「ホーミングレンジ」の距離の変化により、「簡単な」課題の改善された神経的プロセシングが、当該「簡単な」精神的機能を提供する領域における局所的な短距離の神経的結合密度を増大させることにより生じ得るが、これは、一層長い距離にわたる結合により一層大きい容積にわたる複数のプロセスの一体化を必要とする一層「複雑な」課題を犠牲にして、起こり得る。

Dr. E. H. Aylward et al.は、自閉症個体は、当該個体の肢系において、減少したニューロンの大きさ、増大したニューロンの密度および減少した樹状突起の複雑さを有することを報告した。（E. H. Aylward, PhD et al., 精神的に遅延していない自閉症の青年期の人および成体における扁桃体および海馬のＭＲＩ容積、Neurology 1999;53:2145.）

同様に、M. F. Casanova et alは、ミニカラム中の細胞は、大きさが減少しているが、数が増大していることを報告した。（Manuel F. Casanova, et al.,自閉症におけるミニカラム病理学、Neurology 2002;58:428-432.）また、D. G. Amaral et alにより、扁桃体において、細胞は、大きさが減少しているが、数密度が増大していることが報告されている。（D. G. Amaral, M. D. et al., 扁桃体および自閉症：非ヒト霊長類研究からの結果、Genes, Brain and Behavior (2003) 2: 295-302、概説。）自閉症および失読症の脳のｆＭＲＩ比較において、類似性が、白質容積過剰において記録されている。M. R. Herbert et al.は、広範囲の容積過剰が、自閉症の個体において観察され、頭頂葉における容積過剰が、失読症の個体において観察されることを示した。（Martha R. Herbert et al., 自閉症および発育言語障害における白質容積増大の局所化、Ann. Neurol 2004; 55:530-540.）

いくつかの自閉症個体がまた失読症である一方、自閉症個体は、まれにハイパレクシアである。Peter E. Turkeltaub et al.により報告された１つの場合において、自閉症の少年は、彼が発語することができる前に読むことを学習し、彼の最初の発語された言葉は、彼が読んだ言葉であった。（Peter E. Turkeltaub, et. al., ハイパレクシア読みの神経的基礎：ｆＭＲＩケーススタディー、Neuron, vol 41, 11-25, ２００４年１月８日。）積木問題などのテストにおいて一層高い技能を示す自閉症の個体により、人々、例えばH. Tager-Flusbert et al.は、脳の異なる要素間の不適切な結合性があり、この不適切な結合性は、プロセス形態に対する損なわれた能力に言い換えられるという、弱い中心的干渉性仮説を提案した。（Helen Tager-Flusberg, et al, 自閉症、精神的遅れおよび発育能力障害に関する研究における現在の方向、研究概説、7: 21-29 (2001).）

ＮＯは、ＮＭＤＡレセプターと協調して作用し得る。過剰なＮＯ産性により、ＮＭＤＡレセプターが阻害され、これは、A. Contestabileにより、ニューロン励起可能性のフィードバック制御に関与していることが報告されている。（Antonio Contestabile, 脳発達におけるＮＭＤＡレセプター活性および一酸化窒素産生の役割、Brain Research Reviews 32(2000) 476-509.）M. Virgili et alは、ラットにおけるＮＭＤＡレセプターの新生児の遮断の結果、ｎＮＯＳの長期間の下方調節がもたらされることを報告している。（M. Virgili et al., ニューロンの一酸化窒素シンターゼは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩レセプターの慢性的な新生児の遮断の下に置かれたラットの小脳において、永久的に減少する、Neurosci Lett. 258 (1988) 1-4.）R. J. Nelson et alは、ｎＮＯＳノックアウトマウスおよびｎＮＯＳ阻害剤で処置したマウスが、他のマウスに対して過剰な攻撃を示すことを例証した。（R. J. Nelson et al. ニューロンの一酸化窒素シンターゼが欠乏している雄のマウスにおける挙動の異常、Nature 378 (1995) 383-386.）従って、ＮＯは、ニューロン増殖、ニューロン移動、シナプス形成において重要であり得る。おそらく、ＮＯ代謝における破壊は、ニューロン発達において複数の効果を有し得る。

一酸化窒素は、Klyachko et alにより、ニューロンの励起可能性を、イオンチャネルのｃＧＭＰ改変による後の過分極を増大させることにより増大させることが例証された。（Klyachko et al., 過剰極性化の後のスパイクの増強による神経末端におけるｃＧＭＰにより媒介された促進、Neuron, Vol. 31, 1015-1025, ２００１年９月２７日。）C. Sandie et al.は、ＮＯＳの阻害により驚愕が低下することを示した。（Carmen Sandi et al., 一酸化窒素シンターゼ阻害剤で処置したラットにおける低下した自発的な運動活性および驚愕応答、European journal of pharmacology 277 (1995) 89-97.）注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）は、自発的に高血圧のラット（ＳＨＲ）およびナポリ高励起可能性（ＮＨＥ）ラットを用いて形に表された。これらのモデルの両方は、Raffaele Aspide et alにより、急性ＮＯＳ阻害の期間の間の増大した注意欠陥を示すことが示された。（Raffaele Aspide et al., 注意欠陥多動性障害の推定上の動物モデルにおける非選択的注意および一酸化窒素、Behavioral Brain Research 95 (1998) 123-133.）

ＮＯＳの阻害はまた、M. R. Dzoljicにより、睡眠を阻害することが示された。（M. R. Dzoljic et al., 睡眠および一酸化窒素：７−ニトロインダゾールの効果、脳一酸化窒素シンターゼの阻害、Brain Research 718 (1996) 145-150.）G. Zoccoliは、迅速な目の動きおよび脳循環における睡眠−覚醒差異を含む、睡眠中に見られる多くの生理学的効果は、ＮＯＳが阻害された際に変化することを報告した。（G. Zoccoli, et al., 一酸化窒素阻害により、脳循環における睡眠−覚醒差異が消失する、Am. J. Physiol. Heart Circ Physiol 280: H2598-2606, 2001.）ＮＯドナーは、L. Kapas et al.により、ノンレム睡眠を促進することが示されたが、これらの増大は、ＮＯドナーの持続よりもはるかに長く持続し、これは、場合によっては、逆戻り効果を示唆する。（Levente Kapas et al., 一酸化窒素ドナーＳＩＮ−１およびＳＮＡＰにより、ラットにおけるノンレム睡眠が促進される、Brain Research Bullitin, vol 41, No 5, pp. 293-298, 1996.）

M. Rosaria et al., 中枢のＮＯにより、陰茎の***およびあくびが共に容易になる。（Maria Rosaria MelisおよびAntonio Argiolas, 陰茎の***およびあくびの制御における中枢の一酸化窒素の役割、Prog Neuro-Psychopharmacol & Biol. Phychiat. 1997, vol 21, pp 899-922.）P. Tani et alは、不眠が、アスペルガー症候群を有する成人における頻繁な所見であることを報告した。（Pekka Tani et al., 不眠は、アスペルガー症候群を有する成人における頻繁な所見である、BMC Psychiatry 2003, 3:12.）Y. Hoshinoはまた、自閉症の小児における睡眠障害を観察した。（Hoshino Y et al., 自閉症の小児の睡眠障害に関する検査。Folia Psychiatr Neurol Jpn. 1984;38(1):45-51（要約）。）K.A. Schreck et al.は、睡眠障害の重篤度が、自閉症症状の重篤度と相関することを観察した。（Schreck KA, et al., 自閉症の強化された症状の可能な前兆としての睡眠の問題、Res Dev Disabil. ２００４年１月〜２月；25(1):57-66（要約）。）

高いＮＯレベルは、睡眠に必須であり、これらの高いＮＯレベルはまた、睡眠中に起こり得る神経改良に必要であることがあり得る。夜間の時間は、大きい用量のＮＯを脳に投与するのに理想的な時間であり得る。基礎代謝は、この最低のレベルにあり、従って、ＮＯにより誘発された低血圧およびチトクロームオキシダーゼのＮＯにより誘発された阻害を補償するための最大の代謝的な予備があり得る。個別の対象は、不動であり、従って脳は、物理的活動を制御するように機能する必要はない。個別の対象は、意識がなく、従って脳は、視覚的データを一体化するように機能する必要はない。この夜間のＮＯの急増の間、当該多くの長期間の増強が起こることがあり得る。ＮＯの大幅な急増は、誤って向けられた軸索が収縮するのを生じる作用を奏し得、新たに形成したシナプスを強化し得る。睡眠中に起こる脳活性は、新たに形成したシナプスを作動させて、種々の結合をインピーダンス整合させ、最適化する作用を奏し得る。脳の外側からの広範囲の機構、例えば頭皮上の夜間の発汗を用いると、脳が、基底の一酸化窒素レベルの局所的な調節から解放され得る。

さらに、睡眠中の高レベルのＮＯは、脳の「正常な」「ハウスキーピング」機能の一部であり得、一般的に結合を改良し、短期間の記憶を永久的にし、脳機能を「最適にする」作用を奏し得ることが、あり得る。レム睡眠を伴う神経活動は、いずれを保存し、いずれを切除するかを「決定する」のに必要な神経の結合の「試験」の一部であることが、あり得る。睡眠中の高レベルのＮＯは、睡眠を、これらの「ハウスキーピング」機能に有効にするのに必要であり得る。睡眠中に観察された血圧の低下の原因となり得るのは、部分的に睡眠している脳の神経活動により生じたこれらの高レベルのＮＯである。特に頭皮上の、夜間のアドレナリン作動性の発汗により、尿素の頭皮への放出がもたらされ、ここで、独立栄養性アンモニア酸化細菌（ＡＡＯＢ）は、ＮＯを発生する。

S. Ogawaは、脳中の血流は、神経活動と密接に関連しており、この密接な関連は、ヘモグロビン酸素化（Ｏ_２レベルの上昇）における刺激（サブセカンド(sub second)）の変化が、神経活動と相関し得る、ｆＭＲＩ研究のための基礎であることを、報告した。（Seiji Ogawa, et al., ミリ秒まで低下した神経時間規模での機能的なＭＲＩにより、ある神経系相互作用を探索するための方法。PNAS ２０００年９月２６日、vol 97 no 19, 10661-10665.）末梢循環において、血流は、グアニリルシクラーゼのＮＯにより媒介された活性化および血管平滑筋のｃＧＭＰにより媒介された弛緩により、調節され得る。おそらく、同様の機構が、脳脈管構造に、同様に適用可能であり得る。神経活動から発生したＮＯは、血管の平滑筋を弛緩させるためのＮＯを提供し得る。しかし、ヘモグロビン酸素化における変化の刺激により、Ｏ_２消費の変化（ＮＯによるチトクロームオキシダーゼの阻害による）が、増大した供給（血管拡張により媒介された流れの増大）よりも示唆され得る。ミトコンドリアが、ＮＯにより調節され、ミトコンドリアの動作基点が、Ｏ_２とＮＯとの両方の瞬間的な濃度により固定されるため、ＮＯのすべての増大により、ミトコンドリア活性が低下し得る。ＮＯの両方の効果は、同時に起こると見込まれ得る。

また、ＮＯレベル、即ちＮＯ／Ｏ_２の比率を測定すると、Ｏ_２Ｈｂに対する「Ｏ_２拡散性近接性」の一層良好な基準および従って脳中の毛細管空間の調節がもたらされ得ることが、あり得る。おそらく、酸素化されたヘモグロビン（Ｏ_２Ｈｂ）（Ｏ_２の供給源）に対する特定の部位の「Ｏ_２拡散性近接性」を測定しなければならず、血管新生が、これが過度に低い際に開始し、毛細管は、これが過度に高い際に切除される。しかし、単にＯ_２レベルを測定することは、病理学的に不適切な灌流の検出が、病理学的なＯ_２レベルを必要とするため、不適切であることが、あり得る。また、適切な毛細管密度を有する領域は、両方の場合においてＯ_２レベルが適切であるため、過剰な毛細管密度を有する領域から消失しない場合がある。ＮＯレベルを測定すると、一層良好な基準が得られる。ＮＯは、Ｏ_２と極めて類似した拡散性を有する。

Ｏ_２Ｈｂは、Ｏ_２の供給源であり、またＮＯについてのシンクであり、ここでＯ_２Ｈｂは、ＮＯを拡散律速反応速度で破壊する。従って、低いＮＯは、適切な「Ｏ_２拡散性近接性」を示す「シグナル」であり得る。低い基底ＮＯにより、多くの障害において観察される毛細管粗鬆化がもたらされ得、これには、高血圧症および糖尿病が含まれる。脳中の低い基底ＮＯにより、毛細管粗鬆化および低灌流並びに、ｆＭＲＩにおいて観察され、多くの神経疾患を伴う特徴的な白質超強度がもたらされ得る。神経活動による高い局所的なレベルのＮＯは、付近の成長する軸索による当該領域の一層大きい神経支配およびまた、血管新生による一層大きい血管新生化の両方の前兆となり得る。

Takashi Ohnishi et al.は、自閉症の個体が、低下した血流を示すことを報告した。（Takashi Ohnishi et al., 小児期の自閉症における異常な局地的な脳血流、Brain (2000), 123, 1838-1844.）J.M. Rumsey et al.は、自閉症の個体が、増大したグルコース消費を有することを報告した。（Rumsey et al., 自閉症における脳代謝、ポジトロン放出断層撮影で測定した休息時の脳グルコース利用速度。Arch Gen Psychiatry, １９８５年５月；42(5):448-55（要約）。）D.C. Chuganiは、自閉症の個体は、増大した血漿乳酸塩レベルを有することを報告した。（Chugani DC, et al., 自閉症の小児における変化したエネルギー代謝の証拠、Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. １９９９年５月；23(4):635-41.）これらの効果の発生は、脳中の毛細管粗鬆化の結果であり得、これは、血流およびＯ_２供給を、脳の代謝負荷のいくらかが、酸化的リン酸化の代わりに解糖により得られ得るように低下させ得る。解糖は、同一のＡＴＰを産生し、乳酸塩を産生するために、酸化的リン酸化よりも１９倍多量のグルコースを消費する。ニューロンがＡＴＰを解糖により産生しない一方、脳中の他の細胞、即ちアストロサイトは産生する。毛細管粗鬆化により、血流が減少し、かつグルコース消費が増大し、かつ乳酸塩産生が増大し得る。

発達のある臨界的に重要な期間の間にＮＯが欠乏すると、高い忠実度およびある長さ規模にわたる有効な神経結合の形成が干渉されることがあり得る。基底ＮＯをＮＯＳ阻害により低下させた際の、ニワトリ視覚皮質において観察される結合性の損傷はまた、基底ＮＯをあらゆる手段により低下させた際にヒトにおいて起こり得る。おそらく、他のニューロンは、視覚皮質において用いられる同一のＮＯにより媒介される機構を用いる。高レベルの局所的な結合性により、単純な神経的課題の優れたプロセシングが、当該単純な課題を全体に統合することができないことを犠牲にして得られ得る。

浸出および臨界的に重要な結合性
脳の多くは、本質的に、個別のミニカラムの２次元的関連である。ヒト脳と動物脳との主な差異は、個別のミニカラムの構造ではなく、ヒトにおいては大幅に増大した数および結合性である。おそらく、ヒトを動物から区別する「緊急の(emergent)」ヒト特徴、例えば言語を生じるのは、当該個体ミニカラムの結合性である。ミニカラムの関連が、結合されたネットワークとして見られる場合には、当該ネットワークの結合性を、長さ規模により表すことができる。G. Grimmettは、浸出許容限界の付近において、ネットワークの全体的な結合性は、局所的な結合性の小さい変化に極めて感受性になることを報告した。（Geoffrey Grimmett, 浸出、Springer-Verlag, 1989.）

機能する神経ネットワークにおけるすべての要素を、すべての他の要素に結合することはできない。すべての要素のいずれも、結合を断絶することはできない。結合性の程度が変化すると、ネットワークの特性が最も迅速に変化する結合性の程度は、浸出許容限界にあり、ここで、「臨界的に重要な」挙動が観察される。即ち、ネットワークの種々の特性は、浸出許容限界において分化する。例えば、浸出許容限界のわずかに下において、最も大きい結合したクラスターの長さ規模は、有限であり；許容限界のわずかに上において、これは、無限である。おそらく、脳を形成する神経ネットワークは、浸出許容限界の上であり得る。他の箇所には、結合していない脳の領域がある。脳は、「単純な」ネットワークではない。複数の神経伝達物質があり、おそらく各々は、異なるネットワークを表す。

ＮＯは、種々の（いくらか）独立したネットワーク間の結合剤として作用することがあり得る。ＮＯとの「弱い」結合により、軸索移動および血管新生並びに正確な「適地」におけるシナプスの形成による「強力な」結合の形成が容易になり得る。脳のある部分は、浸出許容限界に近接していると見込まれ得る。浸出許容限界よりもはるかに高い結合性の程度に対しては、強力な利点はない。浸出許容限界よりもはるかに高い結合性は、ネットワークの安定性を増大するが、当該ネットワークの変化に対する感受性を犠牲にしてであると見込まれる。自閉症個体は、単にわずかに過度に低い局所的な結合性の程度を有し得、これは、低い基底ＮＯレベルによりもたらされ得る。浸出許容限界よりも下で、ネットワークの機能性は、急速に低下すると予測され得る。

神経ネットワークの低下した安定性により、てんかん発作に対する増大した脆弱性が生じ、自閉症個体は、てんかん発作の一層大きい発生率を有することが、注目される。興味深いことに、I. T. Demchenko et al.は、高圧のＯ_２により脳ＮＯレベルが低下し、またてんかん発作が誘発されることを報告した。（Ivan T. Demchenko, et. al., 高圧のＯ_２により脳血流が一酸化窒素を不活性化することにより低下する。Nitric oxide: Biology and Chemistry vol 4, No. 6, 597-608 (2000).）N. Bittermanにより報告されているように、ＮＯＳ阻害剤により、Ｌ−アルギニンと同様にてんかん発作に対する潜伏が増大するが、ＮＯドナーであるＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）により、これは顕著に短縮される。（Noemi Bitterman et al., Ｌ−アルギニン−ＮＯ経路およびＣＮＳＯ_２毒性、J Appl Physiol 84 (5): 1633-1638, 1998.）ＮＯＳは、ＮＯを発生するが、これはまた、ＮＯを破壊する超酸化物をも発生し得る。ＮＯＳ阻害剤は、ＮＯおよび超酸化物産生を共に遮断し得る。ＮＯおよび超酸化物が一緒に産生される際には、ペルオキシ亜硝酸塩が産生される。ペルオキシ亜硝酸塩は、ＮＯＳ複合体中のＺｎ−チオレート基を酸化し、ＮＯＳを「分離」して超酸化物産生をもたらし得る。従って、てんかん発作許容限界に対するＮＯＳ阻害剤の効果は、超酸化物産生のこの遮断のためであり、ＮＯ産生の遮断のためではない場合がある。

脳を、多くのいくらか独立したプロセス、例えば視覚的プロセシング、聴覚的プロセシング、個別の初期の機能発生、言語、運動、ＡＮＳなどとして見ることができる。おそらく、これらの種々の「機能」の各々は、個別の脳構造を必要とし得る。おそらく、当該個別の脳構造は、ある程度の局所的な結合性を有する局所的なネットワークであり得る。ネットワークについての浸出許容限界は、臨界的に重要な核心であり得る。浸出許容限界の付近において、ネットワークの特性は、指数関数的に変化し、即ち、これには、浸出許容限界に近くなるに従って、ネットワークにおける巨視的な変化をもたらすために、指数関数的に尚小さい変化が必要である。おそらく、異なる脳の構造には、所要の機能を達成するために種々の程度の結合性が必要であり得る。おそらく、感覚プロセシングのような比較的「単純な」機能について、「健全な」操作は、変化するための極度な感受性よりも重要である。

このような構造は、臨界的に重要な浸出レベルよりも十分に高い結合性を有すると見込まれる。例えば独創性などの機能のための、一層大きい計算の効果には、浸出許容限界に一層近い結合性が必要であり得る。自閉症患者またはアスペルガー症候群患者の「接触」は、知能および独創性に寄与し得ることが示唆された。（Uta Frith, Elisabeth Hill編、自閉症：知力および脳、Oxford University Press: 2003, reviewed Nature 428, ２００４年４月１日、４７０〜４７１頁。）引用は、Hans Aspergerに帰しており、「科学または技術における成功のためには、わずかな自閉症は必須であると見られる。」（Allan Snyder, 自閉症天才？本概説：Nature 428, ２００４年４月１日、４７０〜４７１頁。）場合によっては、いくつかの精神的領域における自閉症個体の増大した能力は、浸出許容限界への一層近接した接近および変化するための一層大きい感受性をもたらす当該脳構造における低下した結合性から由来し得る。低下した結合性の長さは、ある点に対して有用であるに過ぎない。浸出許容限界に到達した後に、ネットワークの機能性は、急速に低下し得る。

低下した結合性が、自閉症の脳における問題である場合には、結合性を増大させることが、機能を改善するために予測され得る。結合性が、近い浸出許容限界領域にある場合には、変化は、指数関数的であり、高度に非線形であり得、改善は、劇的であり得る。

形態を「見る」ための損なわれた能力は、他の領域中に同様に拡張され得る。「灰色のシェード」を知覚し、物事を「黒または白」のいずれかとして知覚することができないことは、多くの種々の刺激（または初期の要素）を全体に一体化する低下した能力から由来し得る。特定の対象に対する妄想性愛着は、応答する脳構造の高度に局所的な極めて小さい領域への同様の崩壊から由来し得る。脳の容積の顕著な成分は、種々の脳領域を接合する軸索からなる。能率的な結合性は、経路の長さを最小にし、軸索容積を最小にし得る。非能率的な結合性は、機能性を増大させずに増大した脳容積をもたらし得る。自閉症の小児において観察される増大した脳の大きさは、非能率的な結合性の基準であり得る。

N. Schweighofer et al.は、ＮＯの拡散は、脳の学習を容易にし得ることを報告した。（Nicolas Schweighofer et al., 一酸化窒素の拡散は、脳の学習を容易にし得る：シミュレーション研究。PNAS ２０００年９月１２日、vol 97, no. 19, 10661-10665.）これは、妥当なＮＯ濃度および拡散特性により、誤りの修正が改善され得ることを示したシミュレーション研究であった。M. F. Casanova et al.は、自閉症においては一層小さいミニカラムの増大した密度があることを報告した。（Manuel F. Casanova et al., 自閉症におけるミニカラム病理学。Neurology 2002; 58:428-432.）低いＮＯ背景により、ＮＯシグナルが作用し得る範囲が減少し、場合によっては一層小さいミニカラムの増大した密度についての論理的根拠が得られ得る。神経発生を開始するシグナルがあり得るように、また、神経増殖を停止するシグナルがあり得る。ＮＯにより、両方のシグナルが得られ得る。

供給源に近接した高レベルのＮＯにより、増殖が開始することができ、拡散によりＮＯ濃度が低下する距離における低いレベルのＮＯにより、これが終了することができる。Tenneti et al.は、神経カスパーゼのＳ−ニトロシル化は、ニューロンアポトーシスを阻害することを示したことを報告した。（Lalitha Tenneti et al., カスパーゼのＳ−ニトロシル化によるニューロンアポトーシスの抑制。Neuroscience Letters 236 (1997) 139-142.）E. Ciani et al.は、ＮＯが、神経芽細胞腫細胞を、血清剥奪によるアポトーシスから保護することを報告した。（Elisabetta Ciani et al., 一酸化窒素は、神経芽細胞腫細胞を、ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質（ＣＲＥＢ）活性化による血清剥奪により誘発されたアポトーシスから保護する、J Bio Chem, 277 (51) 49896-49902, 2002.）C. Nucci et al.は、ＮＯは、シグナル伝達からニューロンアポトーシスを生じ、かつ防止するまでの、側方の膝状体核における種々の役割に関与し得ることを報告した。（C. Nucci et al., 側方の膝状体核における一酸化窒素の多角的な役割：視覚的シグナル伝達からニューロンアポトーシスまで、Toxicology letters 139 (2003) 163-173.）

脳は、ニューロン結合が初期の小児期の間に作成される唯一の箇所ではない。乳児が自制不能である理由の１つは、当該乳児が、***機能の神経的制御を有していないことである。自発的な筋肉が、適切に神経支配して機能しなければならないように、また、種々の平滑筋および内臓器官は、自律神経系（ＡＮＳ）に結合して適切に機能しなければならない。乳児が成人の食物を消化することができないことの一部は、ＡＮＳによる種々の消化器官の制御の欠如に由来し得る。自閉症について見られる消化障害のいくつかは、ＡＮＳの内臓への適切な結合性の欠如に由来し得る。D. Blottnerは、一酸化窒素を、一酸化窒素含有経路が重要であるＡＮＳにおけるメッセンジャーとして関係させた。（Dieter Blottner, 一酸化窒素および自律神経系における標的器官制御：解剖学的分布、時空的シグナル伝達および神経効果器維持、J Neurosci Res. 58:139-151 (1999).）H. Matsuama et al.は、血管作動性腸管タンパク質（ＶＩＰ）放出が、ＮＯにより調節されることを報告した。（H. Matsuyama Et Al., Hamster jejunumにおけるペプチド作動性および一酸化窒素含有阻害神経伝達：一酸化窒素による血管作動性腸管ペプチド放出の調節、Neuroscience Vol. 110, No. 4, pp. 779-788, 2002.）

D. Blottnerはまた、一酸化窒素は、自律神経系の維持および柔軟性における栄養機構に関与することを報告した。（Dieter Blottner, 一酸化窒素および自律神経系における標的器官制御：解剖学的分布、時空的シグナル伝達および神経効果器維持、Journal of Neuroscience Research 58:139-151 (1999).）E. Niebergall-Roth et al.は、膵臓による消化酵素の放出が、部分的にＡＮＳにより制御されることを報告した。（E. Niebergall-Roth et al., 膵臓外分泌の中枢および末梢神経制御、Journal of physiology and pharmacology 2001, 52, 4, 523-538.）H. E. Raybouldはまた、消化酵素の放出はまた、腸におけるセンサーからの合成的なフィードバックにより調節されることを報告した。（Helen E. Raybould. あなたの腸は味わうか？消化管における感覚伝達、News Physiol. Sci. vol 13, １９９８年１２月、２７５〜２８０頁。）

おそらく、ＡＮＳによる腸の不適切な神経支配により、機能が損なわれ得る。T. Wester et al.は、ＮＡＤＰＨジアホラーゼ（ＮＯＳに相当する）について陽性に染色される腸中のニューロンの密度が、初期の小児期において顕著に低下すること、および「一酸化窒素が、ヒト消化管における非アドレナリン作動性の、非コリン作動性の神経において最も重要な伝達物質である」ことを示した。（T. Wester et al., 正常なヒト腸の筋層間神経叢における顕著な出生後変化、Gut 1999;44:666-674.）

愛着における一酸化窒素の関与：
ＮＯは、出生から２時間以内に雌羊において起こる結合およびにおい認識の発達に関与する。K.M. Kendrick et al.は、ｎＮＯＳの阻害により、嗅覚記憶の形成が遮断されること、およびこの遮断を、ＮＯを嗅球中に注入することにより覆すことができることを示した。（Kendrick KM et al., 一酸化窒素により媒介された嗅覚記憶の形成、Nature, １９９７年８月、14;388(6643):670-4.）J. N. Ferguson et al.は、オキシトシンが、マウスにおける正常な社会的愛着の形成に必須であることを報告した。（Jennifer N. Ferguson et al., 中央の扁桃体におけるオキシトシンは、マウスにおける社会的認識に必須である、Journal Neuroscience, ２００１年１０月１５日、21 (20):8278-8285.）G. L. Williams et al.は、若い雌牛における硬膜外麻酔に続いてのオキシトシン放出の低下は、母親の結合タイプの挙動の低下に先行することを報告した。（G. L. Williams et al., 若い雌牛における母親挙動の生理学的調節：生殖器刺激、脳内オキシトシン放出および卵巣ステロイドの役割、Biology of Reproduction 65, 295-300 (2001).）

G. Gimpl et al.は、オキシトシンレセプターの活性化により、一酸化窒素シンターゼの活性化が生じることを報告した。（Gerald Gimpl et al., オキシトシンレセプター系：構造、機能および調節、生理学的概説、vol. 81, No. 2, 629-683, ２００１年４月。）S. K. Mani et al.は、一酸化窒素シンターゼの阻害により、プロゲステロンで刺激したエストロゲンで刺激した卵巣切除したラットにおいて脊柱前弯症が阻害されることを報告した。（Shailaja K. Mani, et al., 一酸化窒素により、雌ラットにおける性的挙動が媒介される、Proc Natl Acad Sci, Vol. 91, 6468-6472, １９９４年７月。）

W. D. Ratnasooriya et alは、雄ラットにおけるＮＯＳの阻害により、***前活動が低下し、***が低下し、繁殖性が低下することを報告した。（W. D. Ratnasooriya et al., 一酸化窒素（ＮＯ）シンターゼ阻害剤であるＮ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステルの投与による雄ラットの***および繁殖性の低下、International journal of andrology, 23: 187-191 (2000).）R.R. Ventura et al.は、一酸化窒素が、ナトリウムおよび水の均衡の調節におけるオキシトシンおよびバソプレッシンの活性を変調させることを報告した。（R. R. Ventura, et al., ナトリウム摂取および高張性血液容積膨張に応答しての、バソプレッシン、オキシトシンおよび心房性ナトリウム利尿ペプチド分泌の一酸化窒素含有変調、Brazilian journal of medical and biological research (2002) 35: 1101-1109.）従って、一酸化窒素は、愛着において重要であることが知られている経路に関与し得る。

愛着の間に起こる神経学的変化、即ち交際に続いての母親の結合または対の結合のいずれかは、健全であり、長期間継続し得、これは、「良好に形成した」結合であることを示す。C.O. Okere et al.は、これらの結合は、数時間の間隔で起こり得ることを報告した。（Okere and Kaba, マウスにおける嗅覚認識記憶の形成の間の付属の嗅球におけるニューロン一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡの増大した発現、Eur J Neurosci. ２０００年１２月；12(12):4552-6.）従って、軸索が、移動してこれらの新たな結合を形成しなければならない距離は、限られている場合がある。「愛着」神経結合が、低いＮＯの期間の間に形成する場合には、場合によっては、これらの結合は、極めて局所的な領域において形成するのみであり、これにより強力な「愛着」が形成し得、しかし場合によっては、他の領域からの入力により変調し得ない。場合によっては、これはまた、機能障害愛着、濫用者への愛着、無生物物体への愛着および場合によっては強迫性挙動をもたらし得る。

「愛着」は、ある意味において、「計画されている」。ヒト（および他の動物）は、彼らの子孫および彼らの仲間に愛着することが「計画されている」。この特徴的な応答は、迅速に起こり得（雌羊において数時間）、これは、神経発生のための時間よりも短く、これは、挙動が、すでに存在するニューロンから発生するが、彼らは、当該時間の間に種々の方法で結合されることを示す。

免疫系相互作用
小児における自閉症症状の発症は、ついでながら言うと、小児期のワクチン接種と関連していた。一方、疫学的研究により、ＭＭＲ使用または不使用と同時に起こる大きい集団における発生率において、変化は示されなかった。ワクチン接種および免疫系の活性化の結果は、サイトカインの放出およびｉＮＯＳの誘発である。上昇した血漿硝酸塩は、免疫系の刺激と関連しており、ｉＮＯＳ誘発の結果である。ｉＮＯＳ転写は、ＮＦκＢにより媒介される。M. Colasanti et al.は、ＮＦκＢが、ＮＯにより阻害され、従ってｉＮＯＳ転写は、ＮＯにより阻害されることを報告した。（Marco Colasanti et al., 外来性一酸化窒素による一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡ発現抑制の誘発、J Bio Chem 270, 45, 26731-26733, 1995.）従って、低い基底ＮＯレベルにより、免疫活性化の間に、増大したｉＮＯＳ発現および増大したＮＯレベル（一層高い基底ＮＯレベルについて到達したレベルを超える）がもたらされ得る。ｉＮＯＳは、「フィードフォワード」タイプの調節で調節されるため、過度に多量のｉＮＯＳが発生した場合には、ＮＯレベルは、感染性ショックにおけるように、病理学的レベルに上昇し得る。

ｉＮＯＳ誘発は、ニューロンシグナル伝達に対する効果を有し得る。ＮＯの増大した背景により、効果を生じるのに必要なＮＯに関する量が減少し得、これらの効果が起こり得る範囲が増大し得る。ｎＮＯＳおよびｅＮＯＳにより媒介されたＮＯの効果は、ＮＯ産生の一層低い許容限界において起こる。ｎＮＯＳおよびｅＮＯＳ転写のフィードバック阻害は、一層低いｎＮＯＳおよびｅＮＯＳ発現において起こると見込まれ得る。U. Forstermann et al.は、インビトロで、細菌性リポ多糖類（これは、ｉＮＯＳの発現を生じる）での処置に続いて、ｎＮＯＳ発現は、下方調節されることを報告した。（Ulrich Foerstermann et al., 一酸化窒素シンターゼの「構成的」アイソフォーム（ＮＯＳＩおよびＮＯＳＩＩＩ）の発現制御、FASEB J. 12, 773-790 (1998).）

基底ＮＯのｉＮＯＳにより誘発された増大の後に、基底ＮＯは、ｉＮＯＳの前のレベル（またはこれより低く）に低下し得る。ｎＮＯＳは、細胞体中、小胞体中で合成され、次に軸索を通って、活性の部位に輸送される。この輸送は、必然的にある時間を要する。低いＮＯレベルの間の免疫刺激に続く高いＮＯレベルによる低下したｎＮＯＳ転写により、ＮＯレベルは、尚さらに低下し得る。S. H. Fatemiは、マウスの出生前のウイルス感染は、種々のマウス脳領域において、ｎＮＯＳ発現の長期間の上昇および低下を生じると例証されたことを、例証した。（Fatemi SH et al., 出生前のウイルス感染は、発達するマウス脳におけるｎＮＯＳ発現の変化を生じる、Neuroreport. ２０００年５月、 15;11(7):1493-6（要約）。）

ＮＯが細胞間の伝達物質として機能するために、ＮＯは、１つの細胞において産生され、他の細胞において検出されることが、必要である。細胞によるＮＯの産生は、細胞内で調節され、また細胞の表面上のレセプターにより調節される。ＮＯと同程度に迅速に拡散する分子は、極めて少ない。非ＮＯ伝達物質での細胞によるＮＯ産生のフィードバック調節は、必然的に、顕著なタイムラグを伴い得、この時間の間に、ＮＯ産生は、調節されず、超生理学的レベルに到達し得る。

しかし、免疫化は、初期の小児期の間のｉＮＯＳ誘発をもたらす免疫系活性化の唯一の供給源ではない。初期の小児期は、多くの感染症、風邪、鼻水、下痢により特徴づけられる。ＮＯ代謝の動揺が、すべての特定の免疫化の結果として起こり得る一方、これは、すべての他の免疫刺激の結果として同等に起こり得る。従って、ＭＭＲワクチン接種は、影響を受けやすい個体についての最も近い「原因」であり得るが、ＭＭＲがないと、おそらく小児期の多くの疾患の１種である、ある他の免疫刺激は、常にＮＯ代謝の変化を開始し得る。従って、大きい集団において観察された自閉症の発生率の変化がないことは、影響を受けやすい個体における自閉症応答を引き起こすにあたり同等に有効である、初期の小児期の無数の他の免疫系刺激事象からもたらされ得る。

ワクチン接種と自閉症との間に原因となる連鎖がある場合には、ＮＯにより媒介された経路は、当該原因となる連鎖における考えられる結合であり得る。しかし、これが、免疫刺激の間に達した高レベルおよび／または自閉症症状を発症する低レベルの後ワクチン接種であるかは、不明である。低レベルの後ｉＮＯＳ刺激は、自閉症症状を発症すると見込まれる。発達は、すべて一度に起こるものではなく、これは、継続的なプロセスである。当該プロセスに対するすべての障害は、同様に継続的であると見込まれ得る。ＡＡＯＢにより発生したＮＯがないと、基底ＮＯレベルは、不安定になり得る。低いＮＯにより、免疫刺激の間に増大したｉＮＯＳ発現並びにｅＮＯＳおよびｎＮＯＳの低下がもたらされ、これにより、尚一層低い基底ＮＯレベルがもたらされる。従って、免疫刺激の各々の例により、基底ＮＯレベルが徐々に低下し得る。「野生」において、寄生虫での慢性的な感染またはＡＡＯＢでの皮膚の定着により、基底ＮＯレベルに対する安定化効果が奏され得る。先進地域における個体の、寄生虫を有しないままであることへの願望により、他の障害に対する感受性が増大し得る。同様に、ＡＡＯＢのバイオフィルムにより、基底ＮＯレベルが上昇し、ＮＯレベルに対する安定化効果が奏され得る。

Dr. N. A. Halsey et al.は、免疫系逸脱が、自閉症の小児において観察され、これは、Ｔｈ１細胞の減少およびＴｈ２細胞の増加により特徴づけられたことを報告した。（Neal A. Halsey et al., Measles-Mumps-Rubellaワクチンおよび自閉症の領域の障害：Oak Brook, Illinoisにおいて招集された小児免疫化会議における新たな挑戦からの報告、２０００年６月１２〜１３日、Pediatrics 2001;107(5).URL:http://www.pediatrics.org/cgi/content/full/107/5/e84.）R. C van der Veen et alは、Ｔｈ１細胞は、抗原と共にインキュベートした際に、Ｔ細胞増殖を阻害するＮＯを発生することを記録した。（Roel C. van der Veen, et al., マクロファージによるＴｈ１細胞に対する、しかしＴｈ２細胞に対してではない抗原提示により、一酸化窒素産生およびＴ細胞増殖の阻害がもたらされる：インターフェロン−γは、必須であるが不十分である、Cellular Immunology 206, 125-135 (2000) doi:10.1006/cimm.2000.1741, http://www.idealibrary.comにおいてオンラインで入手可能。）C. S. Benn et alは、免疫系逸脱は、初期の小児期における重大な感染症の回数が増大するに伴って増大すると見られたことを報告した。（Christine Stabell Benn et al., 生後最初の１８ヶ月の間の同胞効果、感染性疾患およびアトピー性皮膚炎の危険の同齢集団研究、BMJ, doi:10.1136/bmj.38069.512245.FE（２００４年４月３０日刊行）。）従って、小児における「ＮＯの次第の変化」により、次第に悪化する免疫逸脱がもたらされ得る。

細胞性ＡＴＰおよびエネルギー減少は、ニトロ減少症の結果であり得る
ＡＴＰは、細胞の主なエネルギー輸送種である。ＡＴＰが、ＡＤＰ＋Ｐｉに切断された際に、エネルギーが放出され、多くの生理学的プロセスが、当該エネルギーをエネルギー消費プロセスの遂行と結合する。細胞の代謝プロセスの事実上すべてが、ＡＴＰを必要としており、ＡＴＰレベルが過度に低く低下した場合には、細胞は、必ず劣化し、最終的には死滅する。従って、ＡＴＰ産生および調節は、臨界的に重要であり、ＡＴＰ産生および調節のための複数の余分の機構がある。しかし、これらの多くは、ＮＯにより媒介されたプロセスにより調節され、ＮＯが不十分であるかまたはニトロ減少症である際には、１つの結果は、低下した基底ＡＴＰレベルである。本明細書中で用いる用語「ニトロ減少症」は、低い基底一酸化窒素を記載するために用いる。

事実上すべての代謝プロセスがＡＴＰを用いるため、不十分なＡＴＰにより、事実上すべての細胞機能が危険にさらされる。ＡＴＰの減少により、アポトーシスがもたらされ得、重篤な場合には、壊死がもたらされ得る。このようなアポトーシスおよび壊死は、毛細管から最も離間した細胞において予測され、１個ずつの細胞で発生すると見込まれる。びまん性アポトーシスまたは壊死は、観察するのが困難であるが、これらの同一の退化性疾患の多くにおいて観察される慢性びまん性炎症を説明し得る。

ＡＴＰ要求は、一定ではないこと、ＡＴＰ要求は、すべての細胞機能により細胞上の代謝負荷に伴って変動することが、認識されるべきである。明らかに、不十分なＡＴＰの問題は、要求が供給を超えた場合にのみもたらされる。ＡＴＰレベルは、フィードバック制御の下にある。ＡＴＰ要求と供給とにおける不整合は、フィードバック系内での小さい破壊に伴って（即ちニトロ減少症）、またはフィードバック系の外側の総計の破壊に伴って（即ち虚血または低酸素症またはミトコンドリア阻害）起こり得る。

ＡＴＰ産生は、「健全」である。ＡＴＰ産生系は、ある量の崩壊を耐容し、尚ＡＴＰレベルを生理学的範囲に維持することができる。しかし、あるレベルの崩壊において、ＡＴＰ産生は、危険にさらされ、不十分なＡＴＰに伴って、細胞の種々の「ハウスキーピング」機能は、危険にさらされ、これにより、ＡＴＰ産生を含むすべての細胞プロセスが崩壊する。いずれのプロセスが「最初に」崩壊するかは、知られておらず、個体細胞代謝、局所的なＯ_２およびグルコース供給、局所的な代謝要求、局所的なミトコンドリア密度の特異体質の詳細並びにＤＮＡ発現の詳細に依存すると見込まれる。種々のミトコンドリア性タンパク質は、種々の器官において発現され、これは、種々の代謝要求のために、種々のＡＴＰ調節経路を有しなければならない。

ＡＴＰ産生および消費の産生および調節は、単純ではない。多くの経路が、非線形であり、結合されており、完全には理解されていないため、これらのモデリングおよび分析は、困難である。本発明者の目的は、すべての経路を徹底的に説明することではなく、単にＮＯにより媒介された多くの経路を指摘することであり、これは、ニトロ減少症の状態により下方調節され、次にこれにより、一層低いＡＴＰ産生速度が生じる。ＡＴＰ減少および一酸化窒素を伴う種々の代謝プロセスが、非線形であり、「結合している」ため、これらは、時間的または空間的のいずれかにおいて、線形の方式では起こらず、これらを記載しているこの論文もまた、線形の方式では準備されない。むしろ、これは、ニトロ減少症の種々の結果および当該結果のいくつかがいかにしてＡＴＰ減少を悪化させ、ＡＴＰ減少がいかにしてこれらの状態の多くを悪化させるかを討議する小さい寸描において、準備される。

ＡＴＰ産生は、多くの連続的であり、平行する経路を含み、この各々には、駆動力が必要であり、従って増加的な「不可逆性」を増加的な動力学と交換する。ＡＴＰ産生経路が、長期間にわたり進化したため、種々の経路が、「最適」となった。これにより本発明者が意味することは、一般的に、経路における種々の「非能率性」が、経路全体にわたり分布しており、従って全体的な非能率性を最小にしていることである。これが意味することは、ＡＴＰ産生を限定する「制御」経路は１つもなく、むしろ代謝経路における各々の段階の「能力」が、すべての他の段階の「能力」に整合していることである。いずれか１つの段階における過剰な能力は有効に「廃棄され」、何らかの資源も、過剰な能力が過剰に存在しない他の段階において一層良好に消費されるように向けられる。

ＡＴＰ減少および最終的に器官損傷により特徴づけられる、多くの一見して異種の障害は、実際に、ニトロ減少症により「生じ」、基底一酸化窒素の広範囲の欠乏により生じることが、あり得る。これが、心臓において生じた際には、結果は、拡張型心筋症である。これが、脳において生じた際には、結果は、白質超強度、アルツハイマー病、血管性うつ症、血管性認知症、パーキンソン病およびレビ小体認知症である。これが、腎臓において生じた際には、結果は、末期腎不全であり、これが、肝臓において生じた際には、結果は、原発性胆汁性肝硬変である。これが、筋肉において生じた際には、結果は、線維筋痛症、湾岸戦争症候群または慢性疲労症候群である。これが、腸において生じた際には、結果は、虚血性腸疾患である。これが、膵臓において生じた際には、結果は、最初に２型糖尿病、続いて膵臓の慢性炎症、続いて膵臓の自己免疫攻撃（または膵臓癌）、続いて１型糖尿病である。これが、結合組織において生じた際には、結果は、全身性硬化症である。

ＡＴＰ減少が、最終的にはすべての代謝プロセスを冒す一方、本発明者は、本発明者が仮説する主な退化性障害において破壊し、ニトロ減少症により生じることが知られているプロセスに焦点を当てる。正のフィードバックがあることに注目するべきである。細胞のＡＴＰ産生が、危険にさらされ、損傷が起こり始めた後に、当該損傷は蓄積し、ＡＴＰ産生がさらに危険にさらされる。細胞「機構」が損傷されるに伴って、損傷の速度は、加速される。

酸化的リン酸化からのＡＴＰ
哺乳類細胞は、好気性である。有機化合物（主にグルコースおよび脂肪酸）は、血流により輸送され、細胞に能動的に運搬され、小さい片に破壊され、クエン酸回路中に供給され、ミトコンドリアにおいてＣＯ_２および水に酸化され、還元等価物およびＡＴＰを産生する。これを達成するために、ミトコンドリアに、有機化合物およびＯ_２を供給しなければならない。Ｏ_２は、肺において吸収され、赤血球中のヘモグロビンに変換され、血流により運搬され、ここでこれは、末端毛細管からミトコンドリアに拡散する。Ｏ_２の輸送は、濃度（実際には化学的電位）勾配を低下する純粋に受動的な拡散である。「能動的な」Ｏ_２輸送はない。ミトコンドリアにおけるＯ_２の化学的電位（しばしば分圧として測定される）は、これがＯ_２が消費されるミトコンドリアにおいてであるため、身体中の最低の点にあり得る。

多くの器官は、可変の代謝速度を有する。例えば、心臓の代謝速度は、１けた(an order of magnitude)近く変化し得る。脈管構造の形態は、この変化の間に感知可能な程度に変化しない（血管のある増大した補充があっても）。血液中の一定のＯ_２分圧および一定の物体輸送面積および一定の拡散長さに伴って、１０倍多量のＯ_２をミトコンドリアに送達することができる唯一の方法は、濃度勾配が増大する場合である。濃度勾配を増大させるための唯一の方法は、ミトコンドリアにおけるＯ_２レベルが、低下することである。その理由は、毛細管中のレベルが、ほぼ一定であり、大気のＯ_２含量により固定されるからである。ミトコンドリアＯ_２レベルが１けた下降し、ミトコンドリアＯ_２消費が１けた増大した場合には、固有のＯ_２消費（１ＴｏｒｒのＯ_２あたりチトクロームオキシダーゼあたり消費されたＯ_２）は、２けた増大するはずである。

基底の状態の下で、Ｏ_２消費は、チトクロームオキシダーゼにおいて起こり、一酸化窒素（ＮＯ）により阻害される。ＮＯ阻害を解消するために、ＮＯを除去しなければならない。これを達成するための１つの方法は、超酸化物を発生し、これをＮＯと、拡散限定された速度で反応させることである。従って、代謝を加速させるための１つの方法は、超酸化物を発生し、これがＮＯを破壊し、チトクロームオキシダーゼを脱抑制し、ミトコンドリアがここではＯ_２を一層高い速度で消費し、ミトコンドリアに局所的なＯ_２レベルが降下し、血管からミトコンドリアへのＯ_２の濃度勾配が増大し、一層多量のＯ_２が、ここでは一層活性なミトコンドリアに拡散することができることである。従って、超酸化物の発生は、局所的な代謝速度をチトクロームオキシダーゼを脱抑制することにより上昇させる「特徴」であると見られる。しかし、これは、チトクロームオキシダーゼがＮＯにより阻害される場合にのみ作動する。チトクロームオキシダーゼが、ＮＯにより阻害されない場合には（即ちニトロ減少症の条件の下で）、超酸化物を加えることによっては、代謝は増大せず、これは単に、酸化的損傷を生じる。

反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生は、低酸素症および再灌流において観察され、虚血および低酸素症により行われる損傷の主な原因である。少量のＲＯＳは、これがＯ_２入手可能性をＯ_２拡散を増大することにより増大させたとすると、良好であろうが、これは、十分なＮＯが存在する際にのみ起こり得る。

「Ｏ_２拡散耐性」（またはＯ_２拡散耐性に比例するあるパラメーター）を測定して、正常な毛細管間隔および従ってＯ_２の正常な拡散耐性がいかにして設定されるかを決定することができる。低酸素症により誘発可能な因子（ＨＩＦ−１α）は、「低酸素症」により刺激され、ＶＥＧＦを含む血管新生因子を刺激する多数の遺伝子の転写を生じる。Sandau et al.は、ＨＩＦ−１αが、高いＮＯと低いＯ_２との組み合わされたシグナルにより刺激されることを報告した。（一酸化窒素の影響下でのＨＩＦ−１αの蓄積。Blood. 2001; 97: 1009-1015.）

血管供給が不十分である際に身体が血管新生を開始しなければならない一方（これは、Ｏ_２レベルにより測定することができる）、血管供給が「過度に多量」である際には、これはまた、毛細管を切除しなければならない。毛細管の切除は、単に「十分な」Ｏ_２供給により媒介され得ない。心臓のような器官において、正常なＯ_２消費は、ピーク消費よりもはるかに低い。「正常な」毛細管間隔が、「正常な」条件の下で決定されるため、「低酸素症」感知は、単に「低いＯ_２レベル」により達成されず、部分的に基底ＮＯレベルにより、特に高いＮＯレベルにより、またはさらに特に、ＮＯ対Ｏ_２の比率により決定され得ることが、あり得る。

酸素化されたヘモグロビン（Ｏ_２Ｈｂ）は、ＮＯを、拡散限定速度近くで破壊する。Ｏ_２Ｈｂは、血流中に位置し、Ｏ_２をミトコンドリアに送達する。すべてのミトコンドリアは、必然的に、Ｏ_２を酸化的リン酸化のために受け取るように、Ｏ_２Ｈｂに拡散的に近くなければならない。Ｏ_２ＨｂがまたＮＯのシンクであり、最小のＮＯレベルはまた、Ｏ_２Ｈｂの部位になければならない。従って、血管外の空間において、血管壁は、ＮＯ最小であり、ＮＯ濃度は、細胞がＯ_２Ｈｂから「どれだけ離間しているか」の基準であり、正確には、Ｏ_２拡散耐性を決定するのに必要である基準である。従って、ＮＯ／Ｏ_２の比率は、特定の部位が一層多量の（または一層少量の）Ｏ_２交換能力をいつ必要とするかの優れた基準である。「十分でないＯ_２」に対する多くの生理学的応答が、ＨＩＦ−１αにより媒介される。ＨＩＦ−１αは、部分的にＮＯにより調節され、ここで一層高いＮＯレベルは、ＨＩＦ−１αが刺激されるＯ_２レベルを増大させる。

ニトロ減少症は、Ｏ_２レベルの関数としてのＨＩＦ−１αの空間的な分布に対する効果を有し得る。比較的低いＮＯレベルと共に、比較的低いＯ_２レベルが、ＨＩＦ−１αを刺激するために必要である。従って、毛細管がリモデリングされる際に（これらが連続的にリモデリングされる）、これらは次第に、Ｏ_２レベルが、ＮＯ／Ｏ_２比が毛細管の最も離間した点においてＨＩＦ−１αを引き起こすのに十分低く低下するまで、一層遠く離間する。「正常な」毛細管間隔は、「正常な」生理学的条件の間に決定される。わずかに比較的低いＯ_２レベルは、基底の条件の下で耐容可能であり得るが、一層高い代謝負荷の下では不適切である。

比較的低いＮＯレベルと共に、比較的低いＯ_２レベルが、ＨＩＦ−１αを刺激するために必要である。従って、毛細管がリモデリングされる際に（これらが連続的にリモデリングされる）、これらは次第に、Ｏ_２レベルが、ＮＯ／Ｏ_２比が毛細管の最も離間した点においてＨＩＦ−１αを引き起こすのに十分低く低下するまで、一層遠く離間する。「正常な」毛細管間隔は、「正常な」生理学的条件の間に決定される。わずかに比較的低いＯ_２レベルは、基底の条件の下で耐容可能であり得るが、一層高い代謝負荷の下では不適切である。

毛細管間のＮＯ勾配についての報告はなく、Ｏ_２勾配についての報告は少数である。しかし、人々が規則的に運動しない際には、彼らは、「健康ではなくなる」。好気性代謝活性についての彼らの能力は、低下する。これは、血管リモデリングにより、毛細管が、Ｏ_２拡散能力を低下するように切除されることを示す。好気性能力における変化についての時間規模は、この血管リモデリングが起こる時間規模を示す。低いＮＯレベルにより、物理的調節を行うのに必要な好気性運動のレベルが改変される。ＮＯレベルが高いと、適度の運動により、顕著な好気性能力が得られ得る。ＮＯレベルが比較的低いと、比較的大きい代謝低酸素症を生じる比較的高いレベルの運動が、必要である。増大した代謝活性が、運動により筋肉において周期的に誘発され得る一方、いくつかの器官の代謝要求は、筋肉が運動する方法を変動させない。

従って、毛細管粗鬆化により、当該毛細管床により提供された組織の最大代謝能力が低下する。基底条件下で、低下した最大能力は、ニトロ減少症の条件の下で、明らかではない場合がある。その理由は、主に、ＮＯが低いと、ミトコンドリアにおけるＯ_２レベルもまた一層低く、基底の要求を満たすためのＯ_２拡散を、増大したＯ_２勾配のために粗鬆化した毛細管により適合させることができるからである。しかし、増大した代謝負荷の条件下で、代謝能力は、代謝要求を満たすのには不十分であり得、ＡＴＰ減少の状態が起こる。

各々の器官は、異なる代謝機能および代謝負荷を増大させる異なる環境を有する。例えば、腎臓において、主な代謝負荷は、ナトリウムの再吸収である。次に、増大した食事性のナトリウムにより、腎臓に対する代謝負荷が増大し、代謝能力を超えた場合には、ＡＴＰ減少および機能障害を生じる。拡張型心筋症において、心臓は、低酸素症および過負荷に対して一層感受性になる。実際に、動物において、拡張型心筋症は、単に歩調合わせまたは圧力過負荷のいずれかによる慢性心臓過負荷により誘発され得る。これは、ＮＯにより媒介された毛細管粗鬆化の仮説と整合する。心臓が過剰に負荷された際には、心筋に送達されるＯ_２は不十分である。超酸化物が発生して、ＮＯを破壊し、チトクロームオキシダーゼを脱抑制し、Ｏ_２濃度を低下させ、従って一層多量のＯ_２が、過負荷された筋肉に拡散し得る。急性に、これにより、代謝能力が増大する（しかしチトクロームオキシダーゼがＮＯにより阻害される際にのみ）。しかし、慢性的に低いＮＯにより、拡張型心筋症に特有の血管リモデリングおよび毛細管粗鬆化が生じる。超酸化物により、タンパク質が損傷され、低いＡＴＰレベルにより、プロテアソームによるユビキチン化されたタンパク質廃棄の速度が低下し、超ユビキチン化されたタンパク質が蓄積する。

同様に、末期腎不全の残遺物腎臓モデルにおいて、腎臓の一部を除去し（手術的に、または毒素で）、これは、残りに対する代謝負荷を増大する。超酸化物が発生して、ＮＯが減少し、腎臓ミトコンドリアに対するＯ_２拡散が増大する。慢性的な過負荷の結果、進行性の腎臓毛細管粗鬆化および進行性の腎不全が生じる。急性腎不全において、人に透析を施すことにより、腎臓に「休息」が付与され得、これが回復することが可能になる。横紋筋融解症（ミオグロビンを血流中に放出する筋肉損傷）により誘発された急性腎不全において、腎臓損傷は、虚血性損傷により特徴づけられる。ミオグロビンは、ちょうどヘモグロビンと同様にＮＯを除去し、腎臓における血管狭窄を生じ、虚血をもたらす。ミオグロビンはまた、局所的なニトロ減少症および事象のカスケードを誘発し、さらなるＡＴＰ減少をもたらす。

代謝負荷の低下により、腎臓に回復する時間が付与され得るが、ＮＯの基底レベルが低い場合には、腎臓脈管構造は、粗鬆化したままであり、腎臓は、代謝過負荷に対して極めて影響を受けやすいままである。

増大した毛細管間隔により、Ｏ_２についての拡散耐性が増大し、これは、部分的に、ＮＯによるチトクロームオキシダーゼの低下した阻害により補償され、ミトコンドリアにおける低下したＯ_２濃度がもたらされる。グルコースの輸送能力もまた低下する。Ｏ_２は、赤血球により運搬され、これは、脈管構造に限定されたままである。対称的に、グルコースは、血漿に溶解し、血漿は、血管外空間に浸透し、多くのタイプのグルコース輸送体により細胞中に能動的に運搬される。不都合なことに、血管外グルコースの測定は、困難であり、文献において報告された測定はほとんどない。しかし、これは、血糖よりも低くなければならない。その理由は、グルコースが、血管外流体が血管外空間に浸透するに従って消費されるからである。

グルコースが消費されるため、ちょうどＯ_２濃度における勾配があるのと同様に、グルコース濃度における勾配があるはずである。Ｏ_２の輸送は、拡散により、グルコースの輸送は、拡散、伝達および能動輸送による。おそらく、一層多くの細胞が、所定の毛細管により供給されたグルコースを消費しているため、毛細管粗鬆化により、一層低いグルコース濃度がもたらされる。Ｏ_２濃度とは対称的に、グルコース濃度は、上昇して一層大きい濃度勾配を提供し得る。同様に、グルコース輸送体の濃度もまた、上昇し得る。場合によっては、２型糖尿病において観察された上昇した血糖が、毛細管から過度に離間した組織へのグルコースの送達を増大させるように代償的であることが可能である。同様に、増大したインシュリン放出は、グルコース輸送体の濃度を上昇させるように代償的であり得る。

ＡＴＰの主な供給源は、酸化的リン酸化である。細胞は、ＡＴＰを、解糖により誘導することができるが、解糖は、酸化的リン酸化よりもＡＴＰの単位あたり１９倍多量のグルコースを消費する。毛細管粗鬆化が、Ｏ_２供給が危険にさらされる点に進行し、細胞が、ＡＴＰを解糖から誘導しなければならない場合には、グルコース消費は、大幅に増大する。グルコース消費が供給を超えた場合には、ＡＴＰ減少は、常に起こる。

食欲は、部分的に、グルコース濃度の測定により調節される。おそらく、この測定は、グルコースが最も一定である大きい血管においては正確に起こらず、末梢組織、血管外空間においては起こる。グルコースを感知し、従って食欲を調節する細胞が、粗鬆化した毛細管の間にある場合には、これらは、血中の大量のグルコース含量が十分であるにもかかわらず、低いグルコースレベルを記録し得る。粗鬆化した毛細管の存在下で、「正常な」血糖は、過度に低く記録され得、身体は、高血糖で応答し得る。毛細管粗鬆化が、酸化的リン酸化を損なうのに十分である場合には、解糖は、上昇した血糖および上昇したインシュリンレベルにもかかわらずＡＴＰ供給を維持するには不十分であり得る。粗鬆化した毛細管床中の細胞が、低いグルコースレベルおよび／または低いＡＴＰレベルを経験していたとしたら、これらは、「私は飢えている」というシグナルを脳に送り、食欲を増大させるであろう。粗鬆化した毛細管を有する人々は、体脂肪の十分な予備にもかかわらず摂食を継続し得る。その理由は、グルコース恒常性を感知する細胞が、十分有しないからである。炭水化物欲求、上昇した血糖、インシュリン耐性および肥満の調節不全の食欲は、肥満において観察される粗鬆化した毛細管の結果であり得る。

ミトコンドリア生合成は、グアニリルシクラーゼからのｃＧＭＰにより、一定のＡＴＰにおけるＮＯの増大または一定のＮＯにおけるＡＴＰの降下のいずれかにより開始する。従って、低下した基底ＮＯレベルにより、ミトコンドリアの濃度が低下し、基底のＡＴＰ濃度が低下する。酸化的リン酸化の能率は、速度（ｍＬＯ_２／ｍｇタンパク質）が上昇するに従って低下する。ＡＴＰ産生の速度は、高いミトコンドリア電位を必要とするＡＴＰ／ＡＤＰの高い比率における高いＡＴＰ産生速度に伴うミトコンドリア電位に依存する。

代謝症候群の症状の多くは、ニトロ減少症により生じたミトコンドリア減少によるＡＴＰ減少により悪化し得る。ミトコンドリア減少に伴って、解糖によるＡＴＰの増大した発生がある。しかし、解糖により、１／１９倍の量のＡＴＰが産生されるため、一層多量の血中グルコースが必要である。細胞におけるグルコース移入は、グルコース輸送体により制限され、これは、インシュリンにより誘発される。ほとんどの細胞は、血液と直接接触しておらず、これらが血漿により灌流され、グルコースおよびインシュリン濃度が介在性の細胞による消費のために血中よりも低い血管外空間中にある。酸化的リン酸化によりＡＴＰを産生するためのグルコース送達に適切な毛細管間隔は、同一のＡＴＰを解糖により産生するには極度に不適切である。毛細管から「過度に離間した」細胞は、大量の血液中の高血糖の状態の下でさえも、局所的な不適切なグルコースを有し得る。このようなＡＴＰが減少した細胞は、「私は飢えている」というシグナルを送り得る。このような飢餓シグナルにより、炭水化物の消費が、貯蔵脂肪の十分な、またはさらには過剰の全体的な生物体の予備にもかかわらず余儀なくされ得る。

ミトコンドリア生合成／調節
ＡＴＰ産生の臨界的に重要な「エンジン」は、ミトコンドリアである。すべての多細胞生物は、ミトコンドリアを有し、いくつかの単細胞生物も有する。組織のミトコンドリア含量は、可変であり、心筋については２０〜３０容積％に接近し、これと比較して比較的好気性でない筋肉では数％である。ミトコンドリアは、多くのＲＯＳ発生の部位であり、ミトコンドリアのいくつかの構成成分は、不可逆的損傷を受けやすく、ミトコンドリア構成成分が作動不能となった際には、これらを交換しなければならない。異なる細胞は、異なるミトコンドリア密度を有するため、おそらく、種々の細胞における種々の密度を調節する機構（１または２以上）がある。おそらく、これには、過度に少ない際にミトコンドリアの数を増大させるための、および過度に多い際にミトコンドリアを切除するための機構（１または２以上）が含まれる。

ミトコンドリア生合成は、Nisoli et al.により、ｃＧＭＰを介しての溶解性グアニリルシクラーゼ（ｓＧＣ）を介してＮＯにより開始されることが示された。（Nisolie, et al., 哺乳類におけるミトコンドリア生合成：内在性一酸化窒素の役割、Science, ２００３年２月７日、Vol 299, 896-899.）ｓＧＣは、Ruiz-Stewart et al.により、ＮＯレベルとＡＴＰレベルとの両方に対して感受性であることが示されており、ここで、ｃＧＭＰ産生のＮＯ誘発についての許容限界は、ＡＴＰレベルに比例し、即ち、一層低いＡＴＰレベルにおいて、ｓＧＣは、ＮＯに対して一層感受性であり、逆もまた同様である。（Ruiz Stewart et al., グアニリルシクラーゼは、一酸化窒素シグナル伝達を細胞代謝に結合させるＡＴＰセンサーである、PNAS ２００４年１月６日、Vol 101, No. 1, 37-42.）一定のＮＯレベルにおいて、ＡＴＰの降下により、ｓＧＣが引き起こされ、ｃＧＭＰが産生される。しかし、低い基底ＮＯレベルにおいて（ニトロ減少症）、ｃＧＭＰ産生を引き起こすＡＴＰレベルは、高いＮＯレベルにおけるよりも低い。従って、ミトコンドリア生合成は、ニトロ減少症の条件下では比較的低い。ミトコンドリアが一層少ないと、各々のミトコンドリアは、一層高いＯ_２／基質代謝回転速度において作動する。

ピーク代謝能力が、「休息時における」「正常な」代謝能力を超えることが、必要である。おそらく、この差異は、基礎代謝を供給するのに必要であるよりも多いミトコンドリアである、「過剰な」ミトコンドリアの産生から生じる。おそらく、ＡＴＰが、ミトコンドリア生合成のためのシグナルである場合には、基底の条件の下でミトコンドリア阻害があって、基底のＡＴＰ濃度における過剰なミトコンドリア産生を可能にしなければならない。次に、当該阻害は、ピーク代謝能力の間に解除されて、増大したＡＴＰ産生を可能にする。ＮＯは、阻害剤の役割を果たす。ＮＯは、チトクロームオキシダーゼを阻害する。ＮＯの低下により、代謝が加速される。

Nogueria et al.は、一般的に、酸化的リン酸化の能率が、速度（ｍＬＯ_２／ｍｇタンパク質）が上昇するに従って低下することを報告した。（Nogueria et al., 細胞エネルギー要求に対するミトコンドリア呼吸鎖調整、J. Biol Chem 276, 49, 46104-46110, 2001.）また、Kadenbachは、ＡＴＰの産生の速度は、高いミトコンドリア電位を必要とするＡＴＰ／ＡＤＰの高い比率における高いＡＴＰ産生速度に伴うミトコンドリア電位に依存することを報告した。（Kadenbach, 酸化的リン酸化の本質的な、および非本質的な分離、Biochimica et Biophysica Acta 1604 (2003) 77-94.）

ミトコンドリアは、ＲＯＳの主な生産者である。ミトコンドリアによるＲＯＳの産生は、ミトコンドリア電位に強力に依存し、電位が高くなると、ＲＯＳ発生は指数関数的に増大する。

ミトコンドリアの密度が比較的低い際には、各々のミトコンドリアは、「一層熱心に」作動し、比較的高い電位において作動し、比較的多量のＲＯＳを産生し、ＡＴＰを比較的低い能率で産生する。ＲＯＳ発生が比較的高いと、ミトコンドリアタンパク質損傷は、比較的大きいと予測される。Echtay et alにより報告されたように、.高いミトコンドリア電位および高いＲＯＳ発生により、分離するタンパク質の誘発がもたらされる。（Echtay et al., 超酸化物により、マトリックス側からのミトコンドリア分離タンパク質２が活性化する、J Biol Chem 277, 49, 47129-47135, 2002）。Sluse et alにより報告されたように、これは、ミトコンドリア電位を低下させ、ＲＯＳ発生を低下させる作用を奏する。（動物および植物分野の外側の分離タンパク質：機能および進化観点。FEBS Letters 510 (2002) 117-120.）Taniguchi et alにより報告されたように、分離タンパク質２は、原発性胆汁性肝硬変において豊富に発現され、ウルソデオキシコール酸（これは、胆汁合成を追放することにより肝臓代謝負荷を低下させる）での成功した処置の後に低下する。（Taniguchi et al., 原発性胆汁性肝硬変における胆汁上皮細胞中の分離タンパク質２の発現、Liver 2002: 22: 451-458.）

チトクロームオキシダーゼによるＯ_２の消費は、ＮＯにより阻害される。基底条件下で、チトクロームオキシダーゼは、ほとんど阻害され、Ｏ_２の消費は、高いＯ_２分圧において起こる。ミトコンドリアにおけるＯ_２の消費により、Ｏ_２濃度勾配が生じ、これにより、ミトコンドリアへの純粋に受動的なＯ_２拡散が駆動される。一層高いレベルの酸化的リン酸化において、Ｏ_２消費は、〜１０倍増大し得るが、Ｏ_２の拡散のための経路の長さは、大幅には変化せず、血管壁におけるＯ_２濃度もまた大幅には変化しない。一定の拡散形態において心筋のＯ_２消費を〜１０倍増大させるために、Ｏ_２勾配は、〜１０倍増大しなければならず、末端Ｏ_２濃度は、〜１／１０降下しなければならない。チトクロームオキシダーゼのＯ_２への親和性におけるこの変化は、部分的に、ＮＯ濃度を変化させることにより達成される。ＮＯ濃度を低下させることにより、低下した能率および増大したＲＯＳ発生においても、ミトコンドリアのＯ_２への親和性は増大し、ミトコンドリアあたりのＡＴＰ産生は、増大する。一層高いＯ_２消費を伴う超酸化物により、ＮＯレベルは低下し、低いＯ_２濃度において高いＯ_２消費が可能になり、これにより、ミトコンドリアへの高いＯ_２拡散が可能になる。従って、高いＡＴＰ産生速度における超酸化物の産生は、ＮＯを消費することによる高いＯ_２消費を容易にする「特徴」である。

ＡＴＰに対する細胞要求は、低下したミトコンドリア密度にもかかわらず低下しないことが、あり得る。同一のＡＴＰが、低下したミトコンドリア密度において産生されると、Ｏ_２消費の増大または加速された基礎代謝速度がもたらされる。加速された基底代謝速度は、以下のものを含む多くの状態において観察される：鎌状赤血球性貧血、うっ血性心不全、糖尿病、肝硬変、クローン病、筋萎縮性側索硬化症、肥満、末期腎不全、アルツハイマー病および慢性閉塞性肺疾患。

ある増大したＯ_２消費が、生産的に用いられ得る一方、これらの状態の多くにおいて、分離タンパク質はまた、上方調節され、これは、増大した代謝速度の少なくとも一部が、無効性によることを示す。分離タンパク質が上方調節されることが知られている状態は、以下のものである：肥満および糖尿病。

ＲＯＳを増大させる状態により、ＵＣＰ２の誘発が生じ、これは、ＡＴＰレベルをさらに低下させる効果を有することが、あり得る。超酸化物は、ＮＯを破壊し、ＮＯレベルを尚さらに低下させる。従って、ミトコンドリア生合成を低下させるのに十分なニトロ減少症により、ＡＴＰ減少がもたらされ、これにより、一層大きいミトコンドリアＲＯＳ発生がもたらされ、これにより、さらなるＮＯ低下および尚一層低いミトコンドリア生合成がもたらされる。ニトロ減少症により、ＡＴＰ減少、ＲＯＳ発生、ＵＣＰ誘発、ミトコンドリア切除および最終的には器官不全により特徴づけられる末期退化性疾患がもたらされる。

従って、ニトロ減少症により、同一のＡＴＰを、しかし比較的低い能率で、比較的低い「予備の」代謝能力で、ミトコンドリアにおける比較的低いＯ_２濃度において、および比較的大きい超酸化物産生で産生することができるミトコンドリアが一層少なくなる。

Ｏ_２を一層低いＯ_２濃度に消費する一層少ないミトコンドリアについて、Ｏ_２拡散を駆動するＯ_２勾配は、一層大きく、従ってＯ_２拡散経路長さは、増大し、毛細管粗鬆化をもたらし得、これは、拡張型心筋症、高血圧症、２型糖尿病、腎臓高血圧症において観察される。

低酸素症誘発可能因子ＨＩＦ−１α
「低酸素症」の効果の多くは、ＥＰＯ遺伝子を含む多数の遺伝子の転写を活性化する低酸素症誘発可能因子（ＨＩＦ−１α）により媒介される。ＮＯ曝露に応答してのＨＩＦ−１αの複雑な挙動は、Sandau et alにより報告されているように、真正のＮＯ、ＮＯドナーおよびまたＮＯ供給源としてｉＮＯＳを発現するトランスフェクトされた細胞を用いて例証されている。（Sandau et al., 一酸化窒素の影響の下でのＨＩＦ−１ａの蓄積。Blood. 2001;97:1009-1015.）Sandau et alは、比較的低いＮＯレベルにより、比較的高いレベルよりも迅速な応答が誘発され、多量のＨＩＦ−１αが産生されたことを見出した。ＨＩＦ−１αを誘発しなかった、試験した唯一のＮＯドナーは、またシアニドを放出するナトリウムニトロプルシドであった。ＨＩＦ−１αは、高いＮＯおよび低いＯ_２を共に感知するため、低いＮＯについて、一層低いＯ_２レベルが、ＨＩＦ−１αを刺激するために必要である。多くの経路が、ＨＩＦ−１α誘発を必要としており、これには、嫌気性条件下でグルコースからＡＴＰを産生し、乳酸塩を産生することができる嫌気性解糖、グルコースを細胞中に運搬するグルコース輸送体、血管新生経路の一部であるＶＥＧＦ、および赤血球の産生を引き起こし、ヘマトクリットを増大させるエリスロポエチンが含まれる。

Goda et al.は、ＨＩＦ−１αはまた、ｐ５３により細胞サイクルの停止のために必要であることを報告した。（Goda et al.,低酸素症誘発可能因子１αは、低酸素症の間に細胞サイクル停止のために必須である、Molecular and cellular biology, ２００３年１月、３５９〜３６９頁。）細胞サイクルの停止は、低酸素症ストレスの条件下で重要であり、従って細胞分割は、不十分なＡＴＰの条件下では起こらない。

従って、低下した基底ＮＯレベルにより、ＨＩＦ−１αにより媒介された遺伝子の低下した発現、および低下したレベルのグルコース輸送体（グルコース「耐性」を生じる）、低下したレベルのＥｐｏ（貧血を起こす）がもたらされる。

皮膚上でのＡＡＯＢからのＮＯ吸収の概算
この分析についての動機づけは、ＡＡＯＢにより産生され、皮膚を通して吸収されたＮＯの生物学的利用能を概算することである。ガスについての交換表面としての肺と皮膚との間の主な差異は、ヘモグロビンの近接性と関連がある。肺において、有効なＯ_２負荷が必要であり、肺から進出する動脈血液は、典型的には、Ｏ_２で＞９０％飽和されている。酸素化されたＨｂは、ＮＯを極めて迅速に破壊する。脱酸素化されたＨｂはまた、ＮＯに迅速に結合し、これを利用不能にする。Sampath et al.により報告されたように、Ｈｂとの反応とは対照的に、アルブミンとの反応により、ＮＯの血管拡張活性が、種々のＮＯ含有種の形成により保存され、これには、アルブミン分子の疎水性領域において物理的に吸収されたＮＯとしてのＳ−ＮＯ−アルブミンが含まれる。（Sampath et al., 一酸化窒素のアルブミンおよびヘムタンパク質との麻酔様相互作用、タンパク質機能の制御のための機構、The Journal Of Biological Chemistry Vol. 276, No. 17, ４月２７日発行、pp. 13635.13643, 2001.）また、Nedospasov et al.により報告されたニトロソ化種の形成がある。（Nedospasove et al., タンパク質ニトロシル化の自己触媒的機構、PNAS, ２０００年１２月５日、vol. 97, no. 25, 13543-13548.）

ニトロソ化種は、Rafikova et alにより、また疎水性領域において吸収されたＮ_２Ｏ_３であると報告されている。（Rafikova et al., 血清アルブミンによるＳ−ニトロソチオール類生成の触媒：血管制御における機構および関与、PNAS ２００２年４月３０日、vol. 99, no. 9, 5913-5918.）この最後の参考文献には、アルブミンが、即座に真正のＮＯおよびＯ_２と反応して、数分間にわたり安定であり、真正のＮＯをゆっくりと放出する複合体を生成すること、およびこれらのＮＯ−Ｏ_２−アルブミン複合体が、Ｌ−ＮＡＭＥで血管狭窄したラットにおいてインビボで血管拡張を生じることが、例証されている。これらの複合体はまた、低分子量チオール類を含む種々の物質のニトロソ化を生じる。インビトロで、スルフヒドリル基の遮断により、Ｓ−ＮＯ−アルブミンの生成が防止されたが、このＮＯ−Ｏ_２−アルブミンニトロソ化複合体の生成は、防止されなかった。Ｓ−ＮＯ−アルブミンはまた、グルタチオンを、特にＣｕ含有タンパク質、例えばセルロプラスミンの存在下でトランスニトロソ化する。Ｓ−ＮＯ−チオール類はまた、ＮＯを放出し、ＮＯ、ＧＳＮＯ、他の低分子量Ｓ−ＮＯ−チオール類またはＳ−ＮＯ−アルブミンのいずれの種が、重要な活性種であるかは、正確には明確ではないが、おそらくこれらのすべてが、重要な活性種である。

本発明の１つの観点において、ＮＯ種を皮膚からこれが作用することができるグアニリルシクラーゼ（ＧＣ）に移動させるための輸送機構が、Ｓ−ＮＯ−チオール類、Ｓ−ＮＯ−アルブミン、ＧＳＮＯまたは他の低分子量種のいずれかを介してであることが、理解される。皮膚を、アルブミンのニトロシル化のための交換表面として用いる利点は、いくつかある。最初に、これにより、ＮＯが、ほとんどＨｂに遭遇せずに血管外血漿中に吸収されることが可能になる。Ｈｂのない血漿中でのＮＯ種の寿命は、極めて長い。第２に、外部皮膚は、肺よりもはるかにＮＯｘに対して耐容性である。外部表面は、実際に死滅しており、連続的に再生している。インビトロで生成したＮＯ−アルブミン複合体が、ＮＯを全身的にインビボで輸送する種である場合には、経皮的ＮＯの治療的有効性は、吸入によるよりも、何倍も高い。第３に、予測された活性種が、Ｓ−ＮＯ−チオールであるため、ＮＯのＯ_２での非酵素的酸化により、ＮＯが破壊されず、これはこれを、良好なニトロソ化剤であるＮ_２Ｏ_３に変換する。

独立栄養性アンモニア酸化細菌は、共生であり得、ヒトは、これらが産生するＮＯを用いるように進化している場合があり、従って、基底ＮＯレベルを上昇させるためのこれらの使用から有害な副作用は何もあってはならない。本発明の１つの観点において、現代の世界の疾患の多くは、現代の入浴習慣によるこれらの細菌の損失によるＮＯ欠乏からもたらされることが、理解される。特に最近の先祖が、冬の間にＡＡＯＢからのＮＯの損失に対処するための補償的ＮＯ経路を進化させなかった最近のアフリカの家系の人々における正の副作用は、ＡＡＯＢの使用からもたらされ得る。これは、なぜアフリカ系アメリカ人の社会が、肥満、糖尿病、高血圧症、喘息、アテローム硬化症、心臓疾患、末期腎不全、思春期早発症などにより一層深刻な打撃を受けるかについての１つの理由であり得る。ＳＮＯ−チオール類からのＮＯの光化学的解離は、十分知られており、高緯度における皮膚および毛髪染色の損失は、外部皮膚におけるＳＮＯ−チオール類の増大した光化学的解離についての必要性から由来しており、ビタミンＤ代謝から由来していない場合がある。頭皮上での発汗は、ＳＮＯ−チオール類の光解離が最小である夜間に増大する。毛髪は、年齢に伴って白くなって、おそらく光化学的ＮＯ放出のための一層大きい光透過を可能にする。チロシナーゼ、即ちメラニンを生成する酵素は、３型の銅含有オキシダーゼであり、この多くは、ＳＮＯ−チオール類の生成を触媒する。

外部の皮膚は、この代謝的Ｏ_２の必要性のすべてを、外部空気から由来している。従って、赤血球が、これらの領域を通って循環する必要はなく、通例これらは循環しない。通例、皮膚の色は、顔料および赤血球による。染色されていない皮膚は、比較的透明であり、色は、表面層における赤血球の循環を正確に反映する。皮膚の生存している外側層が、Ｏ_２を大気から由来している一方、これらは、すべての他の栄養素を、血液から由来している。血漿は、赤血球を有しない血液であり、従ってＯ_２以外のすべてのものを供給することができる。皮膚の外側層が、実質的に赤血球を含まないが、尚活性に代謝しているため、血漿は、Ｏ_２を大気から由来する皮膚の当該外側層を通って循環している場合がある。ＮＯのＳ−ＮＯ−アルブミンへの変換が起こるのは、この赤血球非含有皮膚においてである。

血液中のＮＯの寿命は、極めて短い。ＮＯは、Ｏ_２Ｈｂにより迅速に酸化され、Ｈｂに迅速に結合し、アルブミンにより複合され、Ｏ_２で非酵素的反応によりＮ_２Ｏ_３およびＮＯ_２に酸化され、またＳ−ＮＯ−チオール類を生成する。Bellamy et al.は、ＮＯの作用の重要な部位は、グアニリルシクラーゼ（ＧＣ）であり、ここで、明らかなＥＣ５０は、迅速な活性化（〜１００ｍｓ）について約４５ｎＭ／Ｌおよび遅い活性化（〜１〜１０秒）について２０ｎＭ／Ｌであることを報告した。（Bellamy et al., インタクトな小脳細胞における一酸化窒素レセプター、溶解性グアニリルシクラーゼの秒以下の動力学、The Journal Of Biological Chemistry Vol. 276, No. 6, ２月９日発行、pp. 4287-4292, 2001.）薬理学的量で目的の組織に到達するＮＯ供給源の投与された用量の部分を概算するにあたり、顕著な困難がある。

例えば、吸入されたＮＯが、＞９０％のＯ_２中で８０ｐｐｍで投与された（１６μＭ／分＝１４μＭ／ｋｇ／時）際には、平均動脈圧力における変化はない。対照的に、Cockrill et al.は、０．９μＭ／分（０．７５μＭ／ｋｇ／時）におけるナトリウムニトロプルシド（ＳＮＰ）により、平均動脈圧力の２５％の低下が生じることを報告した。（Cokrill et al., 一酸化窒素、ニトロプルシドおよびニフェジピンの、慢性肺高血圧症を有する患者における血行動態および右心室の収縮性に対する効果の比較^＊、CHEST 2001; 119:128-136.）これにより、ＮＯを吸入により投与した際に、耐性決定血管におけるＮＯの濃度は、２０ｎＭ／Ｌに増大せず、ＧＣを活性化することが示され得る。従って、ＳＮＰは、多数回、吸入されたＮＯよりも、「ＮＯ活性種」の末梢ＧＣへの送達において、「有効」である。

ＳＮＰはまた、静脈内ＮＯと比較され、ここで、静脈内ＮＯ、ＳＮＰおよびＳ−ＮＯ−グルタチオン（ＧＳＮＯ）は、Rassaf et al.により、それぞれ６μＭ、３４ｎＭ、および５ｎＭの局所的上腕動脈血管拡張においてボーラス注入として投与された、相対的に「最大に有効な用量」を有することが示された。（Rassaf et al., ヒト血漿における生理活性一酸化窒素のインビボ輸送についての証拠、J. Clin. Invest. 109:1241-1248 (2002).）これは、静脈内ＮＯ、ＳＮＰおよびＧＳＮＯの相対的有効性を１：１７６：１２００とする。上記の処置により誘発された血管拡張の一時的な経過において、顕著な差異があった。ＮＯおよびＧＳＮＯ処置は共に、ＳＮＰよりも持続的な効果を有していた。従って、ＧＳＮＯは、「ＮＯ活性種」を末梢ＧＣに獲得させるにあたり、ＳＮＰよりも約７倍「有効」である。次に、おそらく、約０．１μＭ／ｋｇ／時の用量のＧＳＮＯは、０．７５μＭ／ｋｇ／時のＳＮＰに等しい血管拡張効果を有する。基底硝酸塩分泌は、約１μＭ／ｋｇ／時である。本発明者らが、０．７５μＭ／ｋｇ／時のＳＮＰの血管拡張効果が、すでに産生された常在性のＮＯと「同一の程度」にあると推測した場合には、０．１μＭ／ｋｇ／時のＧＳＮＯは、基底のレベルを５０％超える「有効なＮＯ」の増大を表す。

Ｃｕ^２＋またはセルロプラスミン（ＣＰ）（成人血清中に０．３８ｇ／Ｌで存在し、０．３２％のＣｕであり、９４％の血清銅を含む、主なＣｕ含有血清タンパク質）のいずれかとしての銅は、ＮＯおよびチオール含有基（ＲＳＨ）からのＳ−ＮＯ−チオール類の生成を触媒する。μＭ／Ｌ濃度より小さいＣＰは、遊離のＣｕ^２＋よりも大きい活性を有し、生理学的塩化物濃度の存在下で、活性は、約二倍化した。多くの他のＣｕ含有酵素もまた、Ｓ−ＮＯ−Ｒの生成を触媒する：

Katsuhisa Inoue et al.は、銅イオンおよび多くの銅含有酵素は、Ｓ−ＮＯ−Ｒ化合物の生成を触媒し、例えば、これらは、種々の銅含有タンパク質のニトロソチオール産生活性を測定することを、例証している。（Katsuhisa et al., インビボでの細胞保護機構についてのセルロプラスミン関与により触媒されるニトロソチオール生成、The Journal Of Biological Chemistry Vol. 274, No. 38, ９月１７日発行、pp. 27069-27075, 1999.）ＲＳ−ＮＯは、還元したグルタチオン（ＧＳＨ）（２０μＭ）またはＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）（２０μＭ）およびＰ−ＮＯＮＯエート（１０μＭ）の、ＣｕＳＯ_４または種々の銅含有タンパク質の存在下での、または不存在下での反応において生成した。ＣｕＳＯ_４または銅含有タンパク質（タンパク質サブユニット）は、２．０μＭの濃度で用いられた。ＲＳ−ＮＯ（ＧＳ−ＮＯおよびＮＡＣ−ＮＯ）の量は、ＣｕＳＯ_４または各々の銅含有タンパク質の濃度が、２μＭを超えた際に、水平状態に達したか、または低下した。データは、４つの実験の平均６Ｓ．Ｅ．である。

ＮＯおよびＧＳＨからのＧＳＮＯの生成は、ＣＰの生理学的濃度の存在下で、約１００倍大きいと示されている。彼らはまた、ＣＰが、ＮＯのナノモル程度の濃度においてさえも、顕著なＧＳＮＯを産生したことを報告している。

彼らはまた、細胞培養物において、インターフェロン−γおよびリポ多糖類により誘発されたｉＮＯＳを有し、クレブス−リンガー−リン酸塩中のＣＰ（２μＭ／Ｌ）を補足したマウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４）は、酸化されたＮＯ種（硝酸塩、硝酸塩およびＲＳＮＯ）の約１／３が産生され、最終的に回収されたＮＡＣ−ＮＯとなったことを、示している。この発見は、顕著である。これは、ヘモグロビンの不存在下で、真正のＮＯのＲＳＮＯへの変換は、極めて効率的であり得、３３％程度に高いことを例証する。

血漿のＣｕ含量は、可変であり、感染症の条件の下で増大する。Berger et al.は、やけど浸出物のＣｕおよびＺｎ含量は、皮膚の１／３がやけどした患者について顕著であり、正常な身体のＣｕ含量の２０〜４０％およびＺｎ含量の５〜１０％が、７日のうちに失われることを報告した。（Berger et al., やけどにおける皮膚銅および亜鉛損失、Burns, １９９２年１０月、18(5):373-80.）やけど浸出物におけるＣｕは、ここでは、ＮＯのＳ−ＮＯ−チオール類への変換を触媒するべきであることが、あり得る。余談として、患者の皮膚に、ＡＡＯＢが定着したとすると、ＡＡＯＢが必要である尿素およびＦｅ、ＣｕおよびＺｎを含む創傷浸出物は、ＮＯおよび亜硝酸塩に変換され、ｉＮＯＳによるＮＯの局所的な産生を、代謝的に攻撃された創傷における資源（例えばＯ_２およびＬ−アルギニン）を消費せずに、大いに補足するであろう。

創傷の表面上のＡＡＯＢによるＮＯおよび亜硝酸塩の高い産生は、特に嫌気性細菌、例えばテタヌス、ガス壊疽、およびボツリヌス中毒を生じるクロストリジアによる感染症を阻害することが、予測される。皮膚のキサンチンオキシダーゼ含量は、ＮＯレベルを、ＡＡＯＢによりＮＯ中に産生されるすべての亜硝酸塩を減少させることにより、増大させる。ボツリヌス食中毒を生じるクロストリジアを阻害することは、一酸化窒素を（亜硝酸塩として）用いて、肉を保存処理し(cure)、保存する(preserve)ための主な理由である。微生物疾患に関するテキストブックにおいて、クロストリジアに関する章の著者であるRubinは、以下のように記載している：「いくつかの開発されている国において、新生の小児の臍帯断端は、泥または糞で包装されて、胎児を沈静化している。」（E. Rubin, 微生物疾患の機構におけるクロストリジア１１章、M. Schaechter, G. Medoff, D. Schlessinge編、Williams & Wilkins, 1989, Baltimore MD.）Rubinは、このような手順は、テタヌス感染症を、創傷を好気性にすることにより防止することを示唆しているが、実際の抗テタヌス剤は、糞中に見出されるアンモニアおよび尿素に対して作用する際にＡＡＯＢ細菌により泥中に産生された一酸化窒素であり得る。

皮膚は、９．２ｐｐｍのＦｅを含み、一方全血は、５００ｐｐｍのＦｅを含み、血漿は、１ｐｐｍのＦｅを含む。皮膚中のヘムの主な濃度は、毛細管中のヘモグロビンであり、これは、なぜ皮膚の色が灌流を反映しているかである。皮膚のヘム含量が、多くとも血液の２％であるため、皮膚中で、ＮＯは、血液中の少なくとも５０倍の寿命を有することが、予測される。実際に、これは一層大きい。その理由は、鉄のいくらかがヘムとしてではなく、ＮＯに対して反応性ではない鉄錯体として存在するからである。皮膚は、成人の体重の１８％を表し、身体のアルブミンの２３％（７０ｋｇの男性について約６５ｇ）を含む。ＮＯは、Ｏ_２Ｈｂと反応して、不活性な亜硝酸塩および硝酸塩を生成する。ＮＯは、チオール類と反応して、Ｓ−ＮＯ−チオール類を生成し、Ｏ_２と非酵素的な反応を有して、ＮＯ_２を生成する。

ＮＯ_２もまた、チオール類を容易にニトロソ化することができる。従って、Ｏ_２との非酵素的反応によっては、ＮＯがＳ−ＮＯ−チオール類を生成することが解消および防止されない。皮膚におけるＳ−ＮＯ−アルブミンの産生を決定するにあたっての反応は、ＮＯのＯ_２Ｈｂによる破壊である。このようにして破壊されないＮＯはすべて、代わりにＳ−ＮＯ−アルブミンを生成するはずである。実際に、Godber et al.は、亜硝酸塩または硝酸塩に変換されるＮＯは、ＮＯに、キサンチンオキシドレダクターゼにより還元され得ることを報告した。（Gobert et al., キサンチンオキシドレダクターゼにより触媒される、亜硝酸塩の一酸化窒素への還元、The Journal Of Biological Chemistry. Vol. 275, No. 11, ３月１７日発行、pp. 7757-7763, 2000.）同様に、亜硝酸塩および硝酸塩は、汗管により分泌され、次に亜硝酸塩または硝酸塩をＯ_２の代わりに嫌気性条件下で用いることができるＡＡＯＢにより「再循環」され得る。

皮膚の角質層のＯ_２透過性は、生きている部分において約３．７Ｅ−７ｍｌ／ｍ／分／ｍｍＨｇおよび１．３Ｅ−６である。角質層は、厚さが約１０〜２０ミクロンである。生存可能な表皮および乳頭層は、約２５０ミクロンにわたり、両方には、外部雰囲気からであり、脈管構造からではないＯ_２が供給される。両方の組織の透過性は、水含量が増大するに従って増大する。角質層の水和状態は、特定されておらず、従って一層高い透過性は、発汗する頭皮上で予測され得る。

Ｏ_２およびＮＯの物理的特性は、極めて類似しており、これには、水性相と脂質相との間の分別が含まれ、従ってＮＯに対する皮膚の透過性は、Ｏ_２に類似するが、ＮＯは、水および他の流体への一層高い溶解性を有する一層軽い分子である。本発明者らが、透過性が水への溶解性が変化するに従って変化すると推測した場合には、ＮＯは、Ｏ_２よりも１．５大きい透過性を有する。内部ＮＯ濃度が２０ｎＭ／Ｌを超えた場合には、ＧＣは、活性化され、局所的な血管は拡張し、血流は増大し、２０ｎＭ／Ｌを超えるＮＯは、移動するかまたはＯ_２Ｈｂにより酸化される。２０ｎＭ／Ｌは、１０ｐｐｍのガス相濃度に相当する。次に、皮膚によるＮＯ流量は、濃度差異、皮膚の透過性および種々の層の厚さに比例する。

主な知られていないことは、ＮＯが拡散して血漿に到達し、ここでこれがＲＳＮＯ種に変換されなければならない皮膚の厚さである。毛髪を有しないマウスの角質層のグルタチオン（ＧＳＨ）含量は、約１００ｐＭ／μｇタンパク質または約０．３％である。第２の知られていないことは、ＮＯのＲＳＮＯへの変換の能率である。

外部の「バイオフィルム」の拡散耐性は、治療的に調整するのが容易である。すべてのゲル形成材料、例えばＫＹゼリーまたは種々の毛髪ジェルは、毛髪を介しての周囲の空気へのＮＯ損失に対する拡散障壁を表す。皮膚中のＮＯレベルは、２０ｎＭ／Ｌを大きく超えることはできない。その理由は、当該レベルにより、ＧＣが活性化され、局所的な血管拡張および過剰なＮＯの酸化的破壊が生じるからである。角質層におけるＮＯ濃度は、これが拡散するか、またはこれを産生する細菌が阻害されるまで増大する。いずれが最初に起こるかは、主に容易に調整される外部耐性に依存する。

頭皮を、注入された汗からＮＯを発生するバイオリアクターとしてモデリングすることができる。しかし、頭皮バイオフィルムからの唯一の損失機構は、頭皮を介しての拡散および周囲空気への拡散である。バイオフィルムを、乾燥した好気性条件と湿潤した嫌気性条件との間を循環するリアクターとして考えることができる。ＮＨ_３を、亜硝酸塩に酸化し、これは、乾燥個体として蓄積する。尿素は、アンモニアに加水分解され、ｐＨを７〜８に上昇させる。ＡＡＯＢは、このｐＨ範囲において極めて活性であり、ｐＨを約６に降下させ、ここで、ＮＨ_３は、アンモニウムに変換され、利用不能である。代謝は、毛髪が乾燥するに従っての低い水活性により阻害される。活発な発汗の期間の下で、孔は、新鮮な汗であふれる。

Simon et al.は、約４のｐＨにおいて、ここで亜硝酸塩の分解は、顕著であり、ＡＡＯＢは、尚尿素を亜硝酸塩に代謝することができることを、開示した。（Simon et al., 尿素加水分解による低いｐＨでの独立栄養性アンモニア酸化、Applied And Environmental Microbiology, ２００１年７月、p. 2952-2957.）この新鮮な汗は、蓄積した亜硝酸塩を溶解し、これを汗の表面張力のｐＨ依存性（低いｐＨにおいて一層高い）により、低いｐＨの領域の方向に移動させる。低いｐＨ領域は、ＡＡＯＢが、最も活性であり、陽イオン（ＮＨ_４ ^＋）を陰イオン（ＮＯ_２ ⁻）に変換し、ｐＨを低下させる領域である。孔が、汗で満たされる際に、バイオフィルムの底は、嫌気性となり、ＡＡＯＢは、亜硝酸塩をＯ_２の代わりに用いる。Schmidt et al.は、嫌気性条件下で（ガス状ＮＯ_２および亜硝酸塩を用いて）、ＮＨ_３、ＮＯ_２の消費およびＮＯの産生は、１：２：１の比率で進行することを報告した。（Schmidt et al., ２種の異なる無機栄養生物による酸化窒素類（ＮＯｘ）の存在下での嫌気性アンモニア酸化、Applied And Environmental Microbiology, ２００２年１１月、p. 5351-5357.）

窒素のための唯一の出口経路が、ＮＯとしてであるため、本質的に分泌されたすべてのＮＨ_３および尿素が、ＮＯに変換される。これらの条件の下で、基底の発汗からの平均のＮＯ産生は、０．１５リットルの汗／日に基づいて、２０ｍＭ／リットルのＮＨ_３において約１２５μＭ／時＝３ｍＭ／日、１００％変換において＝３ｍＭ／日＝１２５μＭ／時である。他人、例えばWeiner et al.は、１ｍＭのＮＯ／時を吸入空気中に投与した。（Weiner et al., 鎌状赤血球疾患を有する小児科患者における急性血管閉塞性急性発症についての吸入された一酸化窒素の予備的評価、JAMA 2003; 289:1136-1142.）皮膚はまた、亜硝酸塩をＮＯに迅速かつ定量的に還元するキサンチンオキシドレダクターゼを含む。

バイオフィルムの孔が、汗で満たされた場合には、一酸化窒素に対するバイオフィルムの厚さの拡散耐性は、皮膚の拡散耐性に接近し得る。皮膚の厚さは、毛細管からの生きている細胞への栄養素の拡散耐性により制限されており、従ってバイオフィルムと同様に任意に厚くすることはできない。

皮膚は、３次元であり、これらの細菌（このいくつかは運動性である）は、汗管中に移動し得、ここでこれらは、尿素およびアンモニアの一層良好な供給を有し、ここでこれらのＮＯは、一層良好に吸収される。哺乳類の所定の特徴は、乳腺であり、これは、改変された汗管である。すべての哺乳類は、汗腺を有するが、多くの種は、汗腺を冷却のために用いず、これには、げっ歯動物、イヌおよびネコが含まれる。汗腺は、足に集中している。

天然に分泌された汗中の尿素からＮＯを産生するための細菌に依存することにより、ＮＯ投与を調節するための天然の生理学的機構が可能になる。頭皮上のアドレナリン作動性媒介汗は、正確に当該目的のために生じ得る。

例
本発明者は、現在２７ヶ月間（頭皮上に３３ヶ月間）本発明者の洗浄していない皮膚上に生息するＡＡＯＢを有していた。この時間の間に、本発明者の長期間の本質的な高血圧症は、顕著に低下し、ある時間の間、本発明者は、この抑制のために投薬を必要とせず、本発明者は、低下した食欲のために、および前の体重損失の試行に伴った不快を伴わずに、３０ポンド損失し、肝臓酵素は、正常な範囲に低下した。本発明者は、事実上毎晩複数回の夜間の***を経験している。主観的に、本発明者は、一層高い精神的鋭敏さおよび熱に対する一層高い耐容性を経験している。本発明者他は、一層活発な夢状態を記録した。

本発明を用いる方法
本発明の観点において、多くの現代の退化性疾患が、ＮＯ種の欠如により生じ得ること、および外部皮膚上のＡＡＯＢが、拡散により当該種を供給し得ること、および皮膚へのＡＡＯＢの適用により、長期間継続する医学的状態が解決することが、理解される。本発明の他の態様において、ＡＡＯＢを、対象に適用して、特に陰イオン性洗浄剤でＡＡＯＢを外部皮膚から除去する現代の入浴習慣を弱める。

ＡＡＯＢの多くの種々の菌株がある。しかし、これらはすべて、極めて類似している。これらはすべて、独立栄養性であり、従ってこれらのいずれも、感染症を起こすことはできない。好ましい菌株は、尿素およびアンモニアを用い、従って汗中の尿素の加水分解は、細菌による吸収および利用の前に必要ではない。また、低いｐＨにおいて成長するために、細菌は、ＮＨ_４ ^＋イオンまたは尿素のいずれかを吸収しなければならない。選択された菌株はまた、外部皮膚上で生存することができ、当該箇所での条件に耐容でなければならない。本発明者がこのような菌株を単離するために用いた方法は、混合培養を庭土壌から回収し、これを有機物質非含有培地中で数ヶ月間成長させ、次にこれを本発明者の身体に適用し、数ヶ月後、本発明者の身体から培養物を再び単離することであった。これにより、身体上で生息することができる菌株が選択される。

次に、再び単離した培養物を、有機物質非含有培地中で成長させ、次に活性培養物を、局所的に適用する。有機物質非含有培地を用いることの１つの利点は、独立栄養性細菌により産生されたものを除いて、従属栄養性細菌が代謝するための基質がないことである。このようにして成長した(as-grown)培養物を用いることの他の利点は、顕著な亜硝酸塩が、培養培地中に蓄積し、この亜硝酸塩がまた、従属栄養性細菌について阻害的であり、従って貯蔵の間に保存剤として作用することである。活性培養物を適用した際に、皮膚中のキサンチンオキシダーゼは、亜硝酸塩を一酸化窒素に還元し、ＮＯの「流れ」を生成する。この即座のＮＯが有用である一方、ＮＯの長期間の連続的な投与は、一層重要である。

理想的な方法は、十分な細菌を適用し、次に発汗を誘発するために十分な衣類を着用することである。しかし、多くの人々は、彼らの現在の入浴習慣を維持する一方でＡＡＯＢの利点を誘導することを望んでおり、この場合においては、細菌の培養物を、これらがＮＯを産生するのに十分な基質と共に適用することができる。ヒト汗の無機組成に近似する栄養素溶液が、最適である。ヒト汗に近似する培地に適合した細菌を用いて、これらが適用された際に適合するための時間が最小になる。汗は、皮膚表面上に分泌された後に蒸発するため、一層高いイオン強度を有する培養培地を用いることが、望ましい。本発明者は、ヒト汗の約２倍の濃度を用いたが、他の条件は、同様に作用させることができる。

本発明者が用いた菌株は、尿素を直接用いず、亜硝酸レダクターゼを有しない。長期間の入浴しない条件の下で、尿素を用いない菌株が、好ましい場合がある。多くの従属栄養性細菌は、尿素のアンモニアへの加水分解を生じる。ＡＡＯＢの実質的なバイオフィルムの存在下で、このような細菌によるすべての尿素加水分解は、ＮＯおよび亜硝酸塩の即座の放出により達成され、この両方は、ほとんどの従属栄養性細菌を阻害する。本発明の方法により処置することができる退化性疾患のいくつかは、アンモニアの分泌により特徴づけられる。末期腎不全、肝硬変は、アンモニアの分泌により特徴づけられる。アンモニアを用いる菌株の他の利点は、尿素が、溶液中であまり安定ではなく、長期間にわたり分解されて、アンモニアを放出し、ｐＨを上昇させ得ることである。貯蔵の考慮について、アンモニアを用いることは、好ましい場合がある。

入浴が、比較的頻繁に（数日おき）行われる際には、ＡＡＯＢバイオフィルムは、これが入浴により除去される前に大きい厚さに達する時間を有しない。当該環境の下で、バイオフィルムの活性は、どれだけ多くの細菌が適用されるかに依存する。長期間入浴しない条件下で、バイオフィルムは、顕著な厚さを構築することができ、ＡＡＯＢの活性を制限することが望ましい場合がある。

ＡＡＯＢは、単純な代謝必要性、ＮＨ_３または尿素、Ｏ_２、ＣＯ_２および鉱物を有する。これらは、鉄、銅および亜鉛を含む微量鉱物への極めて高い必要性を有する。いくつかの菌株はまた、コバルト、モリブデンおよびマンガンを用いる。これらはまた、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、塩化物、リン酸塩および硫酸塩を必要とする。これらの化合物のすべては、汗中で、これらの細菌のための培養培地において典型的に用いられているものとは異ならない比率で入手可能である。

動物成長に対するＡＡＯＢの効果
本発明の他の観点において、ウシおよび一層大きい大きさ、早期の思春期の増強された成長、並びに工業化された地域におけるヒトの肥満は、共に正常な共生のＡＡＯＢの阻害によることが、理解される。従って、本発明の１つの観点は、動物成長は、ＡＡＯＢの除去により増大し得ることを理解することである。本明細書中で用いる用語「増大」は、体重、身長、幅、成長速度、および／または食物能率（１ポンドの食物あたりの体重獲得）の増大として定義するために用いる。興味深い類似点は、食物のために飼育される動物についてなされ得る。何千トンもの抗生物質が、動物飼料中に、成長速度を上昇させるため、および食物能率を上昇させるために導入される。現在のところ、抗生物質が成長を刺激する機構の良好な説明はない。McEwenによると、「成長促進の機構は、尚正確には知られていない」（Scott A. McEwenおよびPaula J. Fedorka-Cray. (McEwenおよびFedorka-Cray, 動物における抗菌使用および耐性、Clinical Infectious Diseases 2002; 34（補完３）：S93-106.）

これらは、「無症状性の感染症」を処置するか、または他の方法では「栄養素」を消費する細菌の抑制により、または「免疫系」による栄養素消費を減少させることによることが示唆された。これらの機構は、信じがたいと見られる。「無症状性の感染症」は、処置により解決され、抗生物質の連続的な供給は、必要ではない。群れ中のすべての動物が、同一の「無症状性の感染症」を有しており、従って各々は、体重を同一の量だけ獲得することを補助されたとすると、驚くべきであろう。同様に、群れ中のすべての動物の免疫系は、当該動物が、最適な速度で体重を獲得しない程度に過剰に刺激されているであろうか？栄養素を消費する細菌について、通常は、動物は、当該動物が欲する程度に多量の飼料を自由に消費する。細菌消費が、数パーセント一層高いとすると、動物は、一層多量に摂取することにより補償し得るであろうが、当該動物は、一層多量に摂取しない。また、抗生物質処置によっては、当該動物の消化系は細菌非含有とはされない。対照的に、細菌の集団は、尚極めて高い。また、多くの細菌は、これらの抗生物質に対する耐性を発生し、高いレベルで持続する。

飼料中の抗生物質の成長増強特性は、これらの動物の外部皮膚上に生息する独立栄養性アンモニア酸化細菌（ＡＡＯＢ）の阻害により媒介され得る。野生において、発汗するすべての動物（すべての哺乳類を含む）は、当該動物の汗中の尿素を代謝し、ＮＯおよび亜硝酸塩を産生する当該動物の外部皮膚上のアンモニア酸化細菌の集団を有すると予測される。ウシは、例外ではない。大きい用量の抗生物質を施与すると、動物の汗中の抗生物質および外部皮膚上のすべてのＡＡＯＢの阻害が得られると予測される。これらの細菌の阻害により、基底ＮＯレベルが低下し、基礎代謝が増大し、成長速度が増大し、成体の大きさが増大し、成熟するための時間が短縮され、体重および体脂肪が増大する。これらは、正確に、工業化の間にヒト集団において観察された変化である。人々は一層大きくなり、一層早く成熟し、肥満になる。

この理解と共に、飼料中の抗生物質は、外部皮膚上のＡＡＯＢを阻害することを必要としない場合がある。抗生物質についての動物成長増強の多くの観点は、ＡＡＯＢが標的の生物体であることが認識された際に理解可能になる。ＡＡＯＢは、極めて小さいゲノムを有する。Nitrosomonas europaeaは、わずか２，４６０種のタンパク質コード遺伝子を有する。これは、生体異物化合物を代謝するための遺伝子を有していない。これはまた、生体異物化合物を分泌するための膜輸送体を有していない。独立栄養性細菌として、これは、極めて遅い代謝を有し、倍加時間は、従属栄養性細菌よりも３０倍長い。これは、３０倍遅く進化することが予測されるが、これがまたこのような限定されたゲノムを有するため、これは、突然変異し、次に新たな機能を発揮し、例えば抗生物質耐性を提供し得る遺伝子を有しない。従って、独立栄養性細菌は、従属栄養性細菌よりもはるかに遅く抗生物質耐性が進化する（仮にそうであるとしても）と予測される。

Halling-Sorensenは、ＡＡＯＢは、グラム陰性細菌であり、多くの抗生物質に対して極めて感受性であることを報告している。（Halling- Sorensen, 抗菌剤による汚水汚泥中の細菌の好気性成長および硝化の阻害、Arch. Environ. Contam. Toxicol. 40, 451-460 (2001)）動物飼料において用いられる抗生物質の多くは、吸収されず、糞便中に分泌され、肥料中に蓄積する。肥料は、豊富なアンモニアおよび尿素を含み、阻害化合物の不存在下で、豊富なＡＡＯＢを含む。動物肥料中の抗生物質と共に、ＡＡＯＢは成長することができず、従ってウシの外部皮膚に接種することができない。ウシを、抗生物質を肥料と混合し、これをウシの生息地域に適用するための動因として用いることは、理想的な方法未満であると見られる。本発明において、ＡＡＯＢを動物の生息空間において阻害するための化合物は、直接適用され得る。

ＡＡＯＢは、アンモニアモノオキシゲナーゼ酵素を阻害する化合物に対して極めて感受性である。アリルチオ尿素は、アンモニアモノオキシゲナーゼを阻害するにあたり極めて有効である化合物であり、この化合物は、生物学的Ｏ_２要求またはＢＯＤを決定する際に廃水試験において一般的に用いられる。アリルチオ尿素は、他の方法でアンモニアをＯ_２で酸化し、測定されたＯ_２消費を上昇させるＡＡＯＢを阻害するために加えられる。硝化阻害剤はまた、肥料利用において用いられる。多くの植物は、窒素を、アンモニアおよび硝酸塩の両方として吸収することができる。しかし、アミノ酸中に導入されるべき窒素について、これは、アンモニア形態でなければならない。従って、硝酸塩は、アンモニアに還元されなければならない。この還元により、他の方法で植物バイオマスを産生するために用いられ得るエネルギーが消費される。従って、いくつかの例において、窒素肥料が、アンモニアまたは尿素の形態で加えられた際に、土壌中の硝化細菌を阻害するのが、望ましい。多くの化合物は、肥料の実際において共通して用いられており、これらの化合物のいずれかを用いることはまた、家畜の外部表面に局所的に適用された際に、汗中の尿素の硝化を遮断するにあたり有効である。

しかし、このような化合物を動物に適用する安全性は、知られていない。一層良好な方法は、陰イオン系洗浄剤を用いることである。Brandt et al.は、ＡＡＯＢは、陰イオン系洗浄剤に対して極めて感受性であり、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、例えば４−（２−ドデシル）ベンゼンスルホン酸に対して特に感受性であり、これは、それぞれN. europaea、N. mobilis、N, multiformis、Nitrosospira種菌株ＡＶについて５、３、１および１ｍｇ／Ｌ（ｐｐｍ）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を有することを示したことを報告した。（Brandt et al., 代謝活性、成長速度および４種のニトロソモナスおよびニトロソスピラ菌株の微小コロニー形成に対する直鎖アルキルベンゼンスルホネートの毒性効果、Applied And Environmental Microbiology, ２００１年６月、Vol. 67, No. 6, p. 2489-2498.）彼らは、試験したＡＡＯＢが、一層低い用量に曝露された際に、耐性または耐容性を発生しないことを見出した。ＬＡＳについての臨界的に重要なミセル濃度（ＣＭＣ）は、４１０ｐｐｍであり、これは、ＩＣ５０よりもはるかに高く、これは、洗浄力により媒介された効果よりもむしろ化学的効果を示す。

１つの特定の理論に束縛されないが、陰イオン系洗浄剤がＡＡＯＢに対して極めて有毒である可能な理由は、陰イオンとして、これらが、硫酸塩、リン酸塩および重炭酸塩を運搬するために必要な陰イオン輸送体により細胞中に運搬されることである。内側の後に、ＡＡＯＢは、これを無害の化合物に代謝するかまたはこれを排出することによりこれを除去するための代謝機構を有していない。従属栄養性細菌は、高レベルのＬＡＳに容易に適合し、これらの多くは、ＬＡＳを、炭素源として用いることができる。ＬＡＳは、食器用洗剤および洗濯洗剤を含む多くの洗浄製品において用いられるが、これはいくらか「不快」であり、皮膚に「粘着性の」感触を残すため、通常はシャンプーにおいては用いられない、一般的な陰イオン系洗浄剤である。しかし、ＬＡＳは、１９８７年に１，８００，０００トンが世界中で生産された、大量生産の材料である。莫大な量が、環境中にすでに排出されており、従ってこれを用いて家畜の皮膚上のＡＡＯＢを阻害することは、いかなる環境的影響をも有しないと予測される。いずれの場合においても、ＬＡＳを家畜成長増強のために用いると、抗生物質が追放され、これは、すでに用いられており、病原性細菌における抗生物質耐性の誘発によりすでにはるかに劣悪な問題を生じている。

ＬＡＳの安全性および刺激性に関する広範囲のデータがあるが、ほとんどの研究は、ＣＭＣよりもはるかに低い濃度を調査しておらず、その理由は、ここでの効果が極めて小さいからであると見込まれる。実際に、洗浄剤溶液を、動物に対して噴霧し、次に洗浄して除去せず、または動物に、材料の浴を通って泳ぐことを強制することができる。界面活性剤の洗浄力は、ＣＭＣより高い濃度でほぼ一定であり、ＣＭＣより低い濃度でほぼ直線状である。皮膚上での洗浄剤の悪影響のほとんどは、タンパク質変性および皮膚の脱脂による。洗浄力が、ＡＡＯＢの阻害のためには必要ではないため、タンパク質を変性させ、皮膚を脱脂するレベルは、必要ではない。皮膚に対する長期間の阻害投与量を確実にするための１つの方法は、低い溶解性の「石鹸」をインサイチュで形成することである。

ＬＡＳを水に溶解した溶液を、動物に対して噴霧し、次に２価の塩、例えば塩化カルシウムの溶液を、同様に噴霧する。混合が、皮膚上で起こり、ここでＬＡＳは、比較的不溶のカルシウムＬＡＳ石鹸として沈殿する。沈殿した石鹸は、動物の毛髪に付着し、従って動物が発汗したか、または上に降雨があった際に溶解するＬＡＳの貯留を提供する。沈殿したＬＡＳの量を、処置間のＬＡＳの阻害レベルを達成するために調整することができる。ＬＡＳ（炭素数〜１２、平均ＭＷ＝３４３）についての溶解度積Ｋｓｐは、８．４ｅ−１２である。ヒト汗のカルシウム含量は、３ｍＭ／Ｌである。ウシ汗について同様の値を推測して、次にＣａ（ＬＡＳ）２の溶解度限界において、ＬＡＳ濃度は、１８ｐｐｍである。これは、ウシの上にすべての残留Ｃａ（ＬＡＳ）２石鹸が存在した限りは、ＡＡＯＢが、実質的に阻害されるのに十分高い。初期濃度は、洗浄剤が最初に噴霧される際には、はるかに高い。他の分子量のＬＡＳ化合物は、異なるＫｓｐを有する。例えば、３３９のＭＷを有するＬＡＳ（炭素数〜１１．４）は、１．８ｅ−１１のＫｓｐを有する。これは、２６ｐｐｍの濃度を表す。

他の阻害剤を用いることができるが、ＬＡＳと同等に安価であり、良性であり、容易に入手できる材料は、ほとんどない。

一酸化窒素代謝：
一酸化窒素は、腸において、食事性および唾液性硝酸塩の従属栄養性細菌による還元により産生される。この還元は、２段階において起こり、最初は硝酸レダクターゼにより亜硝酸塩に、次に亜硝酸レダクターゼにより一酸化窒素に還元される。Ben L. J. Godber, et al.により報告されたように、牛乳は、豊富なキサンチンオキシドレダクターゼを含み、これはまた、硝酸塩および亜硝酸塩のＮＯへの還元を触媒することができる。（Godber et al., キサンチンオキシドレダクターゼにより触媒された亜硝酸塩の一酸化窒素への還元、The Journal Of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 11, ３月１７日発行、pp. 7757-7763, 2000.）この経路からの過剰なＮＯは、血液ヘモグロビンのメトヘモグロビンへの酸化から生じる「青色児」症候群を生じ得る。メトヘモグロビンは、有毒ではないが、これは、Ｏ_２を運搬せず、過剰な量においては低酸素症を生じ得る。

T. Ljung et alは、一酸化窒素は、腸中で、活性炎症性腸疾患を有する小児により産生され、ここで直腸のＮＯは、健康な小児の約１００倍に増大したことを示した。（Tryggve Ljung et al., 活性炎症性腸疾患を有する小児における増大した直腸一酸化窒素、J Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 34:302-306, 2002.）糞便のＮＯは、健康な小児よりも増大せず、これは、細菌的に発生したＮＯ以外の供給源を示している（しかし、これらのアッセイ方法が、好気性であると見られたため、細菌性亜硝酸レダクターゼから予測される嫌気性ＮＯ産生を検出していない場合がある）。炎症性腸疾患の間に観察された増大したＮＯは、低い基底ＮＯレベルへの適応反応であり得る。

E. Weitzberg et al.は、ハミングにより、鼻経路におけるＮＯ産生が増大することを報告した。（Eddie Weitzberg et al., ハミングにより、鼻の一酸化窒素が大幅に増大する、Am J Resp Crit Care Medicine Vol 166. 144-145 (2002).）ＮＯ産生は、Ｏ_２の活性酵素への拡散により制限される。ハミングにより、ガス交換が増大し、従ってＮＯ産生および鼻空気において測定されるＮＯが増大する。空気中のＮＯは、吸入されるが、このほとんどは、肺中で硝酸塩に酸化される。しかし、発生の部位におけるＮＯの濃度は、比較的高く、いくらかは、鼻経路を供給する血液中に拡散し得、これは、脳中の種々の洞中に排出される。いくつかの自閉症個体の観察された特徴的挙動であるハミングにより、ＮＯレベルが増大し得る。

R. Henningsson et alは、マウスにおけるＬ−ＮＡＭＥでのＮＯＳの慢性的阻害により、合計の膵島ＮＯ産生が予測不能に増大することを示した。（Ragnar Henningsson et al., ＮＯシンターゼの慢性的な遮断は、膵島ＮＯ産生を逆説的に増大し、膵島ホルモン放出を変調させる、Am J Physiol Endocrinol Metab 279: E95-E107, 2000.）しかし、ＮＯ合成の調節は、極めて複雑である。すべての正常な代謝産物の中で、ＮＯは、呼吸を阻害するものである。十分高いＮＯレベルにより、呼吸が遮断され、細胞損傷が生じ得る。ＮＯは、外来の細胞が死滅する機構の一部であり、従って免疫細胞は、細胞毒性レベルのＮＯを発生する能力を有し得る。ＮＯの細胞毒性レベルは、ここでの細胞が死滅するため、ＮＯの供給源において調節され得ない。従って、調節は、ＮＯ発生の部位から、時間的に、または空間的に分離され得る。誘発可能なＮＯＳは、時間における高いＮＯ産生の調節を分離し得る。空間的な分離には、種々の（現在知られていない）メッセンジャー分子が必要であり得る。

ＮＯは、多くの種々のレセプターの活性化に応答して産生される。例えば、K. Chanblissは、エストロゲンレセプターにより、ＮＯの放出が生じることを示した。（Ken L. Chambliss et al., 内皮性一酸化窒素シンターゼのエストロゲン変調。Endocrine reviews 23(5):665-686.）P. Forteは、女性は、一層高いレベルのＮＯ代謝物並びに、高血圧症および心臓血管疾患を含む、低い一酸化窒素と関連する疾患の低下した発生率を有すると観察されることを、例証している。（Pablo Forte et al., 健康な女性と男性との間の一酸化窒素生合成における差異についての証拠。Hypertension, 1998;32:730-734.）男性と女性との間の自閉症の異なる発生率は、増大したエストロゲン媒介ＮＯ放出による、女性における増大した基底ＮＯレベルから由来し得る。

一酸化窒素およびストレス
ＮＯは、チトクロームオキシダーゼを、Ｏ_２との競合的阻害により調性的に(tonally)阻害する。この阻害は、Ｏ_２の個別のミトコンドリアへの送達が、純粋に受動的な拡散によるという点で、重要な生理学的効果を有する。Ｏ_２消費の調節がないとすると、Ｏ_２供給源に最も近接したミトコンドリアは、最も多量のＯ_２を消費し、離間したミトコンドリアは、比較的少量を獲得するかまたは獲得しない場合がある。ＮＯとの競合的阻害により、代謝負荷が、多くのミトコンドリアにわたり分布することが可能になり得る。これは、Ｏ_２消費が高度に可変である組織、例えば筋肉において、重要であり得る。心筋のＯ_２消費は、１けた近く変化し得る。Ｏ_２送達が、受動的な拡散によるものであり、供給源およびシンクの形態が、変化せず（ある増大した血管補充があるが、１けたではない）、Ｏ_２供給源（脈管構造中のＯ_２の分圧）が、大幅に変化しないため、Ｏ_２流量が、１けた変化した際に、Ｏ_２勾配は、Ｏ_２拡散のための増大した駆動力を生じるように変化し得る。高いＯ_２消費の条件の下でのミトコンドリアにおけるＯ_２濃度は、一層多量のＯ_２がここで拡散するために、一層低い場合がある。

一定の供給源および形態においてＯ_２流量を１けた増大させるために、Ｏ_２シンク濃度は、１けた低下し得る。Ｏ_２消費が、１けた増大し、一方濃度が、１けた低下した場合には、酵素活性は、２けた増大し得る。代謝能力を増大させるために、ＮＯレベルは、低下し得る。これは、低酸素症の間の超酸化物産生の「特徴」である。超酸化物は、ＮＯを破壊し、従ってミトコンドリアＯ_２消費を脱抑制し、ミトコンドリアがＯ_２を、極めて低いＯ_２濃度においても消費することを可能にする。極めて低いＯ_２濃度により、Ｏ_２が、これが消費される箇所に拡散することが可能になり得る。超酸化物は、これがタンパク質を損傷するため所望でない。しかし、十分でないＡＴＰは、次に細胞が応答する能力を有せず、壊死するため、一層劣悪である。

一酸化窒素調節およびフィードバック：
ＮＯは、種々の部位において発生し、次にＮＯの作用が種々の機構により奏される種々の他の部位に拡散する。ＮＯが、迅速に拡散するガスであり、「短い」拡散経路の長さを有する一方、各々の部位は、これが受ける全体的なＮＯシグナルを一体化し得る。基底の一酸化窒素レベルの低下により、ＮＯの背景レベルが低下し得る。ＮＯの低下した背景レベルにより、第２のメッセンジャーとして産生されたＮＯの有効な範囲の減少がもたらされ得る。一層低い背景レベルについて、遷移的なＮＯ供給源は、下流の標的を活性化し得、一層希釈され得、従ってこれが活性化濃度に達する一層短い範囲を有し得る。神経結合の先天性異常において重要であり得るのは、作用のこの一層短い範囲である。移動する軸索は、これらが「目指す」ことを必要とするＮＯシグナルを受けるのに「十分近接」とならない場合がある。「十分近接」となる軸索は、良好な高密度の局所的結合を形成し、場合によっては増大した聴覚的識別についての説明であり得る。

ＮＯ供給源が、フィードバックループの一部である際には、当該供給源は、一層高いレベルのＮＯを産生するように調節され得、これは、一層低い背景レベルを補償し得る。ＮＯセンサーに拡散した後に調節されたレベルに到達するための、ＮＯ供給源における濃度は、比較的高い場合があり、一層高い背景レベルよりもはるかに高い場合がある。次に、ＮＯセンサーよりも供給源に近い細胞は、「正常」よりも高いＮＯレベルに曝露され得る。ＮＯセンサーよりも供給源から離間している細胞は、比較的低いＮＯレベルに曝露され得る。

事実上すべての重要な代謝系が、あるタイプのフィードバック制御の下にある。一酸化窒素は、多くのフィードバック制御ループに関与し得、これには、ずれストレス依存性ＮＯ放出、続いて血管拡張による末梢血管耐性の調節が含まれる。ＮＯのフィードバック制御についての困難性は、ＮＯが容易に拡散し、これが短い半減期を有することである。ＮＯの供給源により、これを消費するシンクよりも高いＮＯ濃度が生じ得る。一酸化窒素は、高いレベルにおいて有毒であり、一酸化窒素のすべての供給源は、フィードバックにより時間的、または空間的のいずれかで調節されなければならない。基底ＮＯ濃度が、フィードバックにより調節される場合には、いくつかの供給源の阻害により、他の供給源が上方調節され得る。自閉症の小児が、一層高いレベルのＮＯ代謝物を有するという観察はまた、しかるべき位置における十分でないＮＯにより説明され得、従って一層多量のＮＯが、補償するために産生される。

例えば、感染性ショックの低血圧は、大いにｉＮＯＳによる一酸化窒素の過剰な産生から由来する。ｉＮＯＳは、ＮＯＳの誘発可能な形態であり、ｅＮＯＳにおけるような「フィードバック」の種類の制御よりむしろ「フィードフォワード」タイプの制御の例である。細胞による極めて高いレベルの一酸化窒素の産生は、「フィードフォワード」タイプの制御により最良に達成される。細胞が、高レベルの一酸化窒素を産生するのを開始した後に、このようにして産生された一酸化窒素は、当該細胞中のミトコンドリアのチトクロームオキシダーゼを阻害し得、正常な細胞代謝に干渉する。

G. Stefano et al.は、ヒト顆粒球による基底一酸化窒素の産生が、数分の周期で、および１０００ｐＭの範囲で時間周期的であることを示した。（George B. Stefano, et al., ヒト顆粒球および無脊椎動物神経節および免疫細胞による環状一酸化窒素放出：電流滴定的一酸化窒素決定のナノテクノロジー的(nano-technological)増強、Med Sci Monit, 2002;8(6): BR199-204.）これらの測定は、１０Ｅ３個の細胞のペレットの１０μｍ上方で行った。この周期的なシグナルは、必然的に多くの細胞からの平均であった。周期的なシグナルが観察されたことは、細胞が、時間変化速度においてＮＯを産生したことおよび、このＮＯ産生が一致していたことを示す。極めて多くの細胞にわたり相干渉性を維持することは、細胞間の連絡およびＮＯ放出のフィードバック制御を示す。ある他のメッセンジャー分子が、細胞間の連絡を媒介することが可能であるが、このような分子のすべては、相干渉性を維持するために、ＮＯよりも短い寿命および迅速な拡散を有する必要がある。しかし、タイムラグがあっても、一酸化窒素濃度の直接の感知および一酸化窒素産生のフィードバック調節があってもよい。

基底ＮＯレベルは、ＮＯ産生の部位においては測定し、調節することはできない。その理由は、ＮＯ産生の部位は、必然的に基底レベルよりも高いからである。ＮＯを、離間して測定し、シグナルは、基底ＮＯを産生する細胞に非ＮＯ伝達物質により伝達されなければならない。

「運動」の仮説は、一酸化窒素が物理的活性に応答して産生されるため、ヒトが、狩猟採集民のライフスタイルに必要な適度な物理的活性により産生された一酸化窒素に依存するように進化している場合があることを議論している。「正常な」物理的活性レベルにより、十分な一酸化窒素が産生されている場合があり、従って、他の一酸化窒素供給源を展開するための進化的な圧力はなかった場合がある。しかし、先史時代の乳児および小児は、狩猟採集民ではなかった。彼らの食物は、現代の世話人よりも十分に物理的に活性であった場合がある彼らの世話人により狩猟され、採集された。はう前の、または歩く前の小児の物理的活性レベルは、先史時代においてはあまり高くはなかった場合がある。しかし、ヒトが先史時代の間に依存した一酸化窒素の認識されていない供給源は、共生の独立栄養性アンモニア酸化細菌のものであり、現代のライフスタイルの頻繁な入浴により、一酸化窒素のこの供給源が除去される。

ＮＯの供給源としての独立栄養性アンモニア酸化細菌：
汗中の尿素から生理学的ＮＯを発生するための、皮膚上および特に頭皮上に存在する共生の独立栄養性アンモニア酸化細菌は、冷却機構として以外の汗分泌についての論理的根拠を提供する。アドレナリン作動性発汗は、アドレナリン作動性系の刺激の間に起こる。アドレナリン作動性発汗は、ストレスの期間の間に起こり、また一般的に夜間に起こる。夜間における頭皮上の発汗は、極めて高い用量のＮＯを脳に投与する作用を奏し得、これにより、ＮＯシグナル伝達経路を「リセット」し、脳が、高いＮＯレベルを必要とするすべての「ハウスキーピング」機能を遂行することを可能にする。

これらの細菌は、これらが何ら疾患を生じないため、ヒト身体と関連するとは同定されていない。実際に、これらは、疾患を生じることができない（おそらく、免疫無防備状態の個体においても生じることができない）と見込まれる。ゲノムの検査から、これらの細菌は、疾患を生じることができないことが、明らかである。毒素または溶解性の酵素についての遺伝子はない。これらは、例えば動物組織中に見出される複雑な有機化合物を用いる代謝機構を有しない。

独立栄養性細菌として、これらは、これらが必要とする基質、即ちアンモニアまたは尿素、Ｏ_２、鉱塩を欠いているいかなる箇所でも、成長することができない。これらの基質は、洗浄していない皮膚上で、汗残留物から豊富に得られ得、「野生の」、および石鹸を用いて頻繁に入浴しない場合において、ヒトは、当該ヒトの外部の皮膚にこれらの細菌が定着することを防止することができない。これらの細菌は、有益および共生であり得、かつヒト生理学の多くの観点は、これらの細菌の成長および当該ヒトがこのように豊富に産生するＮＯの利用を容易にするために展開されている場合がある。

場合によってはこれらの単離を防止している他の要因は、開発された地域における入浴習慣であり得る。体臭の発生を防止するのに十分な頻度で入浴することは、一般的になった。体臭は、一般的に、入浴しない数日後に起こり、臭気化合物は、剥離した皮膚および汗残留物を臭気のある化合物に代謝する、外部皮膚上の従属栄養性細菌により発生する。３日のうちに、独立栄養性細菌は、入浴後の集団と比較しての約１００倍の増大について、約７倍に倍加し得る。対照的に、従属栄養性細菌は、１０ｅ＋６０倍の増大について、約２００倍で倍加し得る。従属栄養性細菌の成長は、栄養素により制限される。独立栄養性細菌および従属栄養性細菌の入浴による除去の同様の動力学を推測して、従属栄養性細菌を入浴により制御することにより、独立栄養性細菌が低く、場合によっては検出不能なレベルに低下する。

本発明者は、皮膚上のＡＡＯＢの十分な集団により、従属栄養性細菌による体臭が実質的に抑制されることを、見出した。本発明者は、ＡＡＯＢを本発明者の皮膚に適用し、入浴を、３回の夏を含めて現在＞２年間控えている。発汗に関連する体臭は、ほとんどない。実際に、発汗により、体臭が、ＡＡＯＢに栄養分を与え、ＮＯおよび亜硝酸塩のこれらの産生を増強することにより、低下する。低い周囲温度により発汗が減少する冬の間に、体臭は増大した。しかし、衣服を増加させて（セーターを着用して）、本発明者は、基礎的発汗を増大させ、体臭を再びゼロ近くに低下することができた。そう痒、発疹、皮膚感染症、運動選手の足の感染症はなく、足の臭いは実質的になかった。

L Poughon et al.は、ＡＡＯＢは、一酸化窒素を、これらの正常な代謝における中間体として産生することを報告した。（Laurent Poughon, et al., 独立栄養性硝化細菌についてのエネルギーモデルおよび代謝流量分析。Biotechnol Bioeng 72: 416-433, 2001.）D. Zart et al.は、１種の菌株は、約１００ｐｐｍの空気中のＮＯの濃度（この研究において試験された最も高いレベル）において、最適な成長を有することを例証した。（Dirk Zart, et al., Nitrosomonas eutrophaによるアンモニア酸化についてのガス状ＮＯの重要性。Antonie van Leeuwenhoek 77: 49-55, 2000.）ＡＡＯＢは、一層高いレベルを耐容することができる。I. Schmidtは、他の菌株を用いて、０〜６００ｐｐｍ（ＡｒおよびＣＯ_２中で嫌気性）のＮＨ_３消費における減少はないが、これは、１０００ｐｐｍのＮＯにおいて１／３減少することを示した。（Ingo Schmidt et al., ２種の異なる無機栄養生物による酸化窒素類（ＮＯｘ）の存在下での嫌気性アンモニア酸化、Applied and Environmental Microbiology, ２００２年１１月、５３５１〜５３５７頁。）

ほとんどのＡＡＯＢは好気性であるが、いくつかの菌株は、亜硝酸塩または硝酸塩を、Ｏ_２に加えて用い、これによりＮＯ産生を増大させることができる。空気中の１０００ｐｐｍのＮＯは、水性溶液中の約２μＭ／Ｌに相当する。本発明者が用いた菌株は、２．２μＭ／Ｌの測定されたＮＯ濃度を産生した。ＡＡＯＢ代謝のほとんどの研究は、廃水からのアンモニアおよび硝酸塩除去のための廃水処理プロセスにおけるこれらの利用により、動機づけされた。数百ｐｐｍのＮＯにおける廃水処理設備の操作は所望でなく、従って当該条件下でのこれらの細菌の生理学が、十分に研究されていなかったことは、予想外ではない。

本発明者は、アスペルガー症候群に関連し得る多くの特徴は、これらの細菌を適用して以来変化したことに気付いた。「並行作業をする」ことは、一層困難になった。刺激は、一層注意をそらすものであり、即ち、注意をそらす刺激が存在する間に作業することは、以前と同程度には容易ではない。しかし、新たな情報を学習するのは、一層容易であり、当該情報は、前の情報と一層良好に一体化される。

主観的に、本発明者の睡眠パターンは、本発明者が、現在夜間に目が覚める頻度が少なくなっているという点で、主観的に変化した。本発明者のにおいおよび感触の感覚は、主観的に一層鋭敏になっており、関節痛についての許容限界のストレスは、一見したところ低下した。これらの変化は、主観的である一方、増大したＮＯレベルと一致する。本発明者他は、夢は、これらの細菌を頭皮に適用した後に一層活発であることに気付き、これは、正常な神経学的プロセスに対する増大したＮＯの影響を例証する。

実験的：試験的研究（１のｎ）：
ＡＡＯＢの富化培養物を、庭の土壌から、ヒト汗を模擬する有機化合物非含有培地中でＮＨ_４Ｃｌを用いて調製した。高いｍＭの亜硝酸塩レベルへの多数回の経過および成長の後に（従属栄養性細菌を弱めるために）、ＡＡＯＢ培養物を、対象（現在４９歳の男性）の頭皮に適用した。連続的な成長が、現在３３ヶ月間持続しており、活性なＡＡＯＢバイオフィルムが蓄積し、専ら天然の分泌から栄養分を与えられている。５ヶ月後、培養物を、対象の身体全体に適用した。「野生」における条件を模擬するために、入浴を停止した。驚異的なことに、体臭は、２７ヶ月間よりも長期間入浴しない後にさえも、豊富な熱的および運動により誘発された発汗の後にさえも、発生しなかった。発汗が比較的低い周囲温度のために消失した最初の冬の間に、体臭のわずかな増大があった。しかし、セーターを着用すると、基底発汗が増大し、即座に体臭が低下した。

これらのＡＡＯＢにより産生されたＮＯ、亜硝酸塩、ＮＯ_２（時々臭気により検出され得る）、および場合によってはＮＯ付加物は、臭気により生じる従属栄養性細菌を抑制していなければならないことが、あり得る。

バイオフィルムにより産生されたＮＯの測定に、着手した。頭皮を、外部の編んだポリエステルバンド（堅い帽子縁タイプのウインドソックス(wind sock)）で一定の位置に保持した、ＰＴＦＥフィルム製の密接に適合する帽子で覆い、周囲空気を、ガス流計（Omega ＦＭＡ１８１６）により、頭皮上を通過させ、次にＮＯ分析装置（Sievers ＮＯＡ２８０ｉ）を用いて試料を採取した。流れおよびＮＯを、〜１／秒記録した。ＮＯ流量対スイープガス中のＮＯを、図４にプロットした。一層高い流量において、ＮＯ濃度は、下降したが、流れは、上昇した。ＮＯ流れは、ＡＡＯＢバイオフィルムにより発生し、測定することができるキャップの下で空気中に、および測定することができない頭皮中の両方に拡散した。しかし、ＮＯ供給源は、外部のガス流が外部の拡散耐性を迅速に変化させることにより変化することができる程度に迅速に変化することはできず、内部の流れを推論することができる。「ＮＯ供給源」は、「切片」であり、これは、ゼロの外部濃度におけるＮＯ流量である。「ゼロ流れ」の点を測定し、これは、外部の拡散が遮断された際に到達した濃度である（回復する流れに伴って測定されたピークのＮＯ）。

蓄積したＡＡＯＢバイオフィルムを有する頭皮から進出するＮＯ流量は、顕著であり、ある期間の運動の後に１ｎＭ／分に接近している。運動後に、流量は、急速に変化し、従ってこれを直線に適合させることを試行する際に、ある程度の散乱がある。これらの測定から推論される頭皮中へのＮＯ流量は、顕著であり、〜０．３ｎＭ／分である。同一の装置を用いて、これらの細菌を有しない同様の対象（男性、４８歳）（対照）は、測定されたＮＯ流れがはるかに小さかった（０．０３）。ＮＯの増大は、運動後の期間において観察されるが、定着した個体において観察された基底ＮＯレベルは、定着していない個体の運動後の刺激されたＮＯレベルよりも顕著に高い。

他の一連の実験において、５ｍＬのＨ_２Ｏ中の１０μＭのＮＨ_４Ｃｌを、頭皮に適用した。図５は、スイープガスのＮＯ濃度の連続的なトレースである。５ｍＬのＨ_２Ｏ中の１０μＭのＮＨ_４Ｃｌを、管をＰＴＦＥキャップの下でくねらせることにより、適用した。得られたＮＯ流量を、図６に例示する。ＮＯ流れは、即座に増大し（〜１分以内に０．３ｎＭ／分から０．８ｎＭ／分に）、これは、ＮＯが、ＮＨ_３から由来しており、亜硝酸塩または硝酸塩または哺乳類一酸化窒素シンターゼから由来するものではないことを例証する。増大の即座性は、ＮＯ放出が、汗によるＮＨ_３放出と密接に関係していることを例証する。本実験において用いられるＡＡＯＢの特定の菌株は、尿素をＮＨ_３のみを直接用いず、これは、亜硝酸レダクターゼを有しない。

ＰＴＦＥキャップを適用し、連続的なＮＯ測定を、他の点では正常な睡眠の間に行った。プレチスモグラフを用いて、圧力（容積）および温度（血流）による腫れをモニタリングした。ＮＯおよびプレチスモグラフ圧力および温度の測定を、図７および８に示すように、〜１０秒おきに記録した。４回の連続した夜における試験において、腫れの増大の直前またはこれと同時に、夜間の***の１１の例およびＮＯ流量の増大の６つの増大例があった。トレースは、ＮＯ放出と腫れとの間の最も強制的な関連の２つの例を示す最初の夜からのものおよび、腫れの４つの例を示す最後の夜からのものである。ＮＯのこの増大が、必然的であるか、または単に腫れに先行し、これを伴う発汗と関連しているかは、知られていない。増大した夜間の***は、主観的に、ＡＡＯＢを最初に適用した後に感知され、これは、現在では＞２年間にわたり衰えずに継続した。ＮＯは、***生理学において重要であることが知られている。インポテンスのための一般的な民間療法は、唾液を陰茎に適用することである。唾液は、舌の上の従属栄養性細菌による唾液硝酸塩の還元からの亜硝酸塩を含む。皮膚は、亜硝酸塩をＮＯに還元するキサンチンオキシドレダクターゼを含む。ＮＯドナーの局所的な適用は、***不全のための処置として用いられる。

アンモニアの供給に密接に関係しているＡＡＯＢによるＮＯの産生および皮膚上の従属栄養性細菌の阻害が、例証される。進化期間にわたり、ＮＯ種のこのような供給源が、正常なヒト生理学中に導入されないとすると、驚くべきことである。ＮＯ放出は、ＮＯにより媒介されると知られている生理学的効果と一致すると観察された。アドレナリン作動性発汗についての生理学的説明が、アンモニアをＡＡＯＢの常在するバイオフィルムに、亜硝酸塩およびＮＯの即座の放出のために供給することであることが、あり得る。多くの障害において観察される豊富な発汗は、ニトロ減少症に対する正常な生理学的応答であり得る。

ＮＯ放出体として、ＡＡＯＢは、ＮＦκＢの阻害による炎症の抑制による免疫系による攻撃に対していくらか耐性であり得る。進化時間規模にわたり皮膚上に存在する共生の非病原性の生物として、免疫系は、これらの存在を可能にするように進化している場合がある。あるＡＡＯＢは、運動性であり、汗孔中への移動および定着は、細菌とヒトとの両方に対して有利であり得る。これは、ＮＯ吸収についての拡散距離を短縮し、従属栄養性細菌および菌類による潜在的な定着を低下させる。Ruiz et alにより報告されたように、ＡＡＯＢは、好気性である一方、これらは、低いＯ_２レベルを耐容することができ、〜１２ＴｏｒｒのＯ_２において能動的に呼吸することができる。（高いアンモニア濃度を有する廃水の処理のための高い亜硝酸塩蓄積を伴う硝化。Water Res. 2003 Mar;37(6):1371-7）〜１２Ｔｏｒｒは、皮膚において測定された最小のＯ_２レベルよりも低い。孔の定着により、ＡＡＯＢが光、洗浄および何気ない入浴から保護され得るが、陰イオン系洗浄剤および抗菌剤を用いて頻繁に入浴するますます一般的な習慣は、これらが耐容することができる範囲を超え得る。

硬水および軟水：
硬水（ＣａおよびＭｇイオンを有する水）を有する地域に生活することは、発作、心血管疾患および糖尿病を含む多くの疾患の一層低い発生率と相関している。飲料水中のマグネシウムおよび真性糖尿病およびさらに癌での死亡の危険。飲料水中のカルシウムおよびマグネシウム並びに乳癌での死亡の危険。（J Toxicol Environ Health A. ２０００年６月；60(4):231-41.）硬水からの健康の効果は、一般的に、ＣａおよびＭｇの増大した摂取の正の効果またはＣｄもしくは他の重金属の減少した漏出による低下した毒性の効果のいずれかに帰していた。しかし、他の食事性の供給源からのＣａおよびＭｇは、同一の効果を有しない。（Nerbrand C, Agreus L, Lenner RA, Nyberg P, Svardsudd K., 心血管死亡率の差異を有する硬水および軟水の地域に生活する個体における心血管危険因子に対する飲料水および食事におけるカルシウムおよびマグネシウムの影響、BMC Public Health. ２００３年６月１８日）。

飲用は、家庭水の唯一の使用ではない。一般的に、家庭水は、飲用および入浴の両方に用いられる。硬水は、２価のイオンが不溶性の石鹸沈殿物を生成し、石鹸を界面活性剤として利用不能にするため、入浴に用いるのが困難である。石鹸およびさらに洗浄剤を用いて入浴することは、硬水においては比較的有効でない。硬水は、多くの陰イオン系界面活性剤を沈殿させるため、硬水により、多くの種に対する界面活性剤の毒性が低下する。（Coral Verge, Alfonso Moreno, Jose Bravo, Jose L. Berna, 直鎖状アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）の生物学的利用能および毒性に対する水の硬度の影響、Chemosphere 44 (2001) 1749-1757）。ヒトの皮膚上で、硬水は、ＡＡＯＢバイオフィルムの除去を妨げ、石鹸および洗浄剤のＡＡＯＢに対する毒性を低下させ、入浴についての動機づけ、特に毛髪を洗浄することについての動機づけを低下させ得る。

水の硬度と虚血性心臓疾患死亡率との間の負の相関関係は、オランダにおいて、１９５８〜１９６２年、１９６５〜１９７０年および１９７１〜１９７７年から、低下する有意性の相関係数と共に観察された。（Zielhuis RL, Haring BJ. オランダにおける水の硬度および死亡率、Sci Total Environ. １９８１年４月；18:35-45）。興味深いことに、これは、合成洗浄剤の使用が増大した期間およびシャンプー技術が急速に進化した際とほぼ同一の期間である。ＡＡＯＢの共生の皮膚に適合した菌株は、鹸化された脂肪酸を耐容することができると見込まれ、洗浄していない皮膚上で豊富であると見込まれる。石鹸により、表面汚れと一緒のこれらの除去が容易になり得るが、特別の毒性効果を奏するとは見込まれない。アルキルベンゼンスルホネート類は、対照的に、ｐｐｍレベルでＡＡＯＢに対して有毒である。

ＮＯ産生の主な部位は、毛髪、頭皮毛髪および陰毛を有する箇所であり、ここで、ＮＯおよび亜硝酸塩は、感染に対する防御として作用し得る。毛髪は、ＡＡＯＢについての保護的適性を提供し、皮膚を通しての熱の損失を減少させる作用を奏し得、これは、薄く、十分に血管新生化されてＮＯ吸収を容易にしなければならない。本発明者は、ＡＡＯＢが、活性な生理学的制御の下にあるか否かが疑わしい。いくつかの健康的な変化は、この試験的な研究の間観察されている。しかし、１のｎについて、および対照を伴わないと、これらの健康的な変化を、専ら局所的なＡＡＯＢからの増大したＮＯに決定的に帰するのは困難であり、観察された変化の多くは、主観的である。

試験的研究において観察された主観的な健康的変化は、以下のものを含む：食欲減退および体重損失、運動するための増大した動機、アレルギー低下（枯草熱）、血清アラニントランスアミナーゼレベルの低下、血圧の低下、皮膚創傷の一層迅速な治癒、脱毛の速度の低下／損失した毛髪の再生、増大した精神的鋭敏さおよび改善された気分。

ＡＡＯＢを頭皮および身体に適用する前および適用している間の両方の、単一の個体についての肝臓酵素、アラニントランスアミナーゼレベル（ＳＧＰＴまたはＡＬＴ）のプロットを示す図である。多くの都市についてのアルツハイマー病の発生率対最も暑い月における最低気温を示す図である。シャンプーに関して刊行された米国特許の刊行の年に対する数および１型糖尿病を有すると診断された人の年に対する数を示す図である。

スイープガス中のＮＯ流量対ＮＯｐｐｂを示す図である。スイープガス中のＮＯ対時間を示す図である。スイープガス中のＮＯ流量対ＮＯｐｐｂを示す図である。

頭皮からのＮＯ、プレチスモグラフ温度および容積対時間を示す図である。頭皮からのＮＯ、プレチスモグラフ温度および容積対時間を示す図である。

Claims

高血圧症、肥大性器官退化、レイノー現象、線維性器官退化、アレルギー、自己免疫感作、末期腎不全、肥満、１型糖尿病、骨粗鬆症、インポテンス、脱毛、癌、加齢、自閉症、自閉症の領域の症状、加齢による遅延の少なくとも１つを発生したか、または発生する危険のある対象を処置する方法であって：
高血圧症、肥大性器官退化、レイノー現象、線維性器官退化、アレルギー、自己免疫感作、末期腎不全、肥満、１型糖尿病、骨粗鬆症、インポテンス、脱毛、癌、自閉症、自閉症の領域の症状の少なくとも１つを発生したか、または発生する危険のある対象を同定すること；および
アンモニア酸化細菌を該対象に極めて接近して配置すること
を含む、前記方法。
細菌を配置する行為が、ニトロソモナス、ニトロソコッカス、ニトロソスピラ、ニトロソシスティス、ニトロソロブス、ニトロソビブリオのいずれか、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された細菌を配置することを含む、請求項１に記載の方法。
アンモニア酸化細菌を配置する行為が：
アンモニア酸化細菌を対象の表面に、該細菌が、該表面上のアンモニア、アンモニウム塩、または尿素のいずれかを、一酸化窒素、一酸化窒素前駆体、またはそれらの組み合わせのいずれかに代謝することを生じるのに有効な量で適用すること
を含む、請求項２に記載の方法。
細菌を適用する行為が、該細菌を好適な担体に適用することを含む、請求項３に記載の方法。
細菌を表面に適用する行為が、細菌を皮膚、毛髪、またはそれらの組み合わせに適用することを含む、請求項３に記載の方法。
細菌を適用する行為が、実質的に純粋な細菌を適用することを含む、請求項３に記載の方法。
細菌を適用する行為が：
細菌を物品に適用すること；および
該物品を対象の表面に接触させること、
を含む、請求項３に記載の方法。
細菌を適用する行為が、酸と混合された細菌を適用することを含む、請求項３に記載の方法。
動物の成長を増大させる方法であって：
ＡＡＯＢを該動物の表面から除去すること
を含む、前記方法。
アンモニア酸化細菌の、一酸化窒素を対象に提供するための医薬の製造における使用であって、前記医薬が、実質的に明細書中に記載したように、前記対象に極めて接近して配置するのに適しており、ここで、該対象が：高血圧症、肥大性器官退化、レイノー現象、線維性器官退化、アレルギー、自己免疫感作、末期腎不全、肥満、１型糖尿病、骨粗鬆症、インポテンス、脱毛、癌、自閉症、自閉症の領域の症状および加齢による低下した健康の少なくとも１つを発生したか、または発生する危険のある、前記使用。
前記細菌が、ニトロソモナス、ニトロソコッカス、ニトロソスピラ、ニトロソシスティス、ニトロソロブス、ニトロソビブリオのいずれか、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されている、請求項１０に記載の使用。
前記医薬が、前記細菌が該表面上のアンモニア、アンモニウム塩、または尿素のいずれかを、一酸化窒素、一酸化窒素前駆体、またはそれらの組み合わせのいずれかに代謝することを生じるのに有効な量で、対象の表面に適用するのに適する、請求項１１に記載の使用。
医薬が、皮膚、毛髪、またはそれらの組み合わせに適用するのに適する、請求項１２に記載の使用。
医薬が、物品に適用するのに適し、物品が、前記対象の表面と接触するのに適する、請求項１２に記載の使用。