JP2007507480A - 止血を促進するためのフィブリノゲン標的微粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、薬剤を含む注入可能な薬学的生成物、ペプチドが結合する不溶性のキャリアを含む薬剤、その薬剤が結合したフィブリノゲンを介して不活性血小板よりも活性化血小板に結合するようにフィブリノゲンを結合し得るペプチドを提供し、そしてここでそのペプチドはフィブリノゲンではない。
従って、そのフィブリノゲン結合ペプチドは、GPIIbのアミノ酸294−314の配列を表す、AVTDVNGDRHDLLVGAPLYMの配列、またはそのフィブリノゲン結合断片を含み得る。そのような断片は、配列TDVNGDGRHDL(296−306)、配列GDGRHDLLVGAPL(300−312)および末端テトラペプチドGALPを含む。これらの配列は、フィブリノゲン、および特にフィブリノゲンのγ鎖の結合に関わると考えられる(Bennett、2001、前掲書中;D’Souzaら、1991、Nature、350、66−68;TaylorおよびGartner、1992、J.Biol.Chem.、267、11729−33)。断片296−306および300−312の類似した効果は、断片300−306もフィブリノゲン結合活性を提供し得ることを示唆する。
TDVNGDGRHDLの変異体は、
T(D,E)VNG(D,E)GRH(D,E)L
TD(V,L)NGDGRHDL
TDV(N,Q)GDGRHDL
TDVNGDG(R,K)HDL
を含む。
その微粒子を、あらゆる適当な物質で形成し得る。それは、架橋したタンパク質で形成し得る。これらの目的のために典型的なタンパク質はアルブミンであり、それは血清由来または組換え体であり得、そして配列がヒトまたは非ヒトであり得る。タンパク質微粒子を、タンパク質をスプレードライすることによって形成し得る。例えば、本発明によるキャリアとして使用するために適当な微粒子を、WO92/18164におけるような、周知のスプレードライ技術を用いて、ヒト血清アルブミンをスプレードライすることによって形成し得る。
(a)結合していないフィブリノゲンを除去する;
(b)薬剤学的に許容できるキャリアまたは希釈剤と共に生成物を処方する;
(c)生成物を希釈して薬剤学的に許容できる単位1回投与量を提供する;そして
(d)生成物を滅菌する。
(a)2000×gで15分間、20℃で遠心することによって、結合していないフィブリノゲンを除去し得、そして生成物を続いて、等張緩衝液(例えばpH7.0−7.4の0.15Mの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、またはpH7.0−7.4の0.15Mの塩化ナトリウムを含む0.02MのTris)に再懸濁することによって洗浄する。あるいは、生成物が膜に保持される場合は、接線方向の(tangential)限外ろ過を用いて、上記の緩衝液の1つで洗浄し得る。
(b)生理的pHで等張緩衝液に再懸濁することによって、生成物を処方し得る(例えば、上記で記載した緩衝液の1つを用いて)。例えばマンニトールまたはグルコースを含む緩衝液も使用し得る。1つの実施態様において、生成物を凍結乾燥して、凍結乾燥した製剤形式を産生し得、それを使用の直前に再構成し得る。適当な製剤形式は、0.5グラムから5グラムの間の生成物であり得る。
(1.0、3または6グリシン残基から成るスペーサーを有するペプチドGPRPを用いた、フィブリノゲン結合ミクロスフェアを産生する一般的な方法)
(i)洗浄したヒトアルブミンミクロスフェアの10mgアルブミン/mlの懸濁液を、pH7.4の等張緩衝液(例えばリン酸緩衝化生理食塩水)中で調製した。使用したアルブミンミクロスフェアは、静脈内で使用するのに適当な直径であり、そして従って6μmより小さかった。適当なアルブミンミクロスフェアは当該分野において公知である。例えば、WO03/015756は、pH7.4、2−3μmの直径を有するアルブミン微粒子を開示する。
(ii)30μlの10mM 5,5’−ジチオ−ビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)を、10mgのミクロスフェアに加え、そして室温で2時間混合した。ミクロスフェアを次いで、上清から分離し、そして3000×gで少なくとも5分間の遠心を用いて、緩衝液(我々はリン酸緩衝化生理食塩水を用いた)中で少なくとも2回洗浄した。
(iii)ペレットを1mlのリン酸緩衝化生理食塩水のような適当な緩衝液に再懸濁した。Merck Biosciencesから供給されたペプチド(GPRPC、GPRPGGGC、またはGPRPGGGGGGCのいずれか)をリン酸緩衝化生理食塩水に溶解し、そして0.23mMの最終濃度でミクロスフェアに加えた。これを室温で24時間混合した。調製物を0.23mMのL−システイン(システインコントロール)で処理することによって、適当なネガティブコントロールを与えた。3000×gで5分間遠心し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁することによって洗浄した。洗浄工程を2回繰り返し、続いて1mlの容積に最終的に再懸濁した。
(iv)凍結乾燥フィブリノゲンのバイアル(例えばScottish National Blood Transfusion Serviceによって供給される材料)を再構築し、そして3mgのフィブリノゲンを、工程(iii)から得られた1mlのアルブミンミクロスフェアに加え、そして室温で1時間混合した。混合物を次いで3000×gで5分間遠心し、そして上清を除去した。ミクロスフェアを、以前に記載したようにリン酸緩衝化生理食塩水で3回洗浄した。最終的なペレットを、1mlのリン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁した。
ペプチド結合ミクロスフェアに対するフィブリノゲンの結合を示す方法を下記に記載し、ここでミクロスフェアに結合したフィブリノゲンを検出するために、抗ヒトフィブリノゲンFITC標識抗体を使用する。
(i)上記の方法1の工程(iv)から得た人工血小板の5μlの懸濁液を、1μlのヒトフィブリノゲンに対するFITC標識ウサギ抗体(DakoCytomation;F0111)を含む50μlのHEPES緩衝化生理食塩水に加えた。混合物を20℃で20分間インキュベートした。ブランクのミクロスフェア(DTNB処理またはペプチドなし)またはシステインコントロール試料を、これらのアッセイのネガティブコントロールとして使用した。
(ii)20分後、0.5mlの生理食塩水を加えることによって反応を止めた。さらに10分後、試料を生理食塩水で1/10に希釈し、そしてフローサイトメーター(例えばCoulter XL−MCL Flow Cytometer)において分析した。
(iii)データを、フィブリノゲンに関して陽性のミクロスフェアのパーセンテージおよび粒子の蛍光強度の中央値として記録した。後者は、ミクロスフェアに結合したフィブリノゲンの量の測定値であり、そして任意単位(対数目盛)である。
以下の生成物を産生した−
生成物1:工程(iv)で3mg/mlではなく0.1mg/mlのフィブリノゲンを用いた以外は、上記で議論したような実施例1の方法1の工程(i)から(iv)までを用いて、結合したフィブリノゲンを有するペプチドGPRPGGGGGGC(すなわちGlyn=6)を用いて、人工血小板を産生した。
(i)1グラムのミクロスフェアを洗浄し、そして50mlの0.01M リン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0に懸濁した。
(ii)凍結乾燥フィブリノゲンのバイアル(例えばScottish National Blood Transfusion Serviceによって供給される材料)を再構築した。
(iii)フィブリノゲンを、0.01Mのリン酸ナトリウムの緩衝液、pH6.0を用いて10mg/mlに希釈した。
(iv)15mlの希釈フィブリノゲン溶液を、ミクロスフェアのグラムあたり加え、そして室温(例えば20℃)で4時間混合した。
(v)混合物を次いで2000×gで、20℃で15分間遠心し、ミクロスフェアをペレット化した。上清を除去し、そしてペレットを0.01Mのリン酸ナトリウムpH6.0で洗浄した。
(vi)次いで混合物を、上清のE280での吸光度によって決定されるタンパク質が少なくなるまで少なくとも2回、0.01Mのリン酸ナトリウム緩衝液中で遠心および再懸濁した。
(vii)ミクロスフェアを次いで最終的に洗浄およびリン酸緩衝化生理食塩水pH7.4に10mg/mlで再懸濁した。
(viii)フィブリノゲンでコートしたミクロスフェアを次いで500μlのアリコートに満たし、そしてマイナス70℃で保存した。
本発明の薬剤上のペプチドに結合したフィブリノゲンが、依然としてトロンビンによって切断されてフィブリンを形成し得るかどうか決定するために、本発明の薬剤を、ヒトトロンビンで処理し得る。フィブリン−フィブリン架橋による、本発明の薬剤の架橋を、修飾凝集アッセイ、例えばLeviら、1999、Nature Medicine、51、107−111に基づくプロトコールにおいて試験し得る。我々が使用した方法を下記に報告する。
光透過血小板凝集計を用いてアッセイを行った(我々はPAP4血小板凝集計(BioData Corporation)を用いた)。トロンビンを、血漿(血小板無し)および生成物の混合物に加えた。トロンビンは血漿中およびミクロスフェア上でフィブリノゲンを切断し、隣接するミクロスフェア間でフィブリン架橋を形成するのを可能にする。ミクロスフェアの凝集は、光透過性の増加を引き起こし、それを血漿単独に相対的な「凝集」パーセンテージとして記録し得る。
(i)生成物、参照バッチ、またはコントロールのカウントを、100×103/mlに調整した。フローサイトメーター(例えばBeckman Coulter MCL−XL)またはCoulterZ2のような粒子計数器を用いてミクロスフェアを計数し得る。
(ii)血液を1500×gで30分間遠心し、そして上清を回収することによって、血小板を含まない血漿を調製した。
(iii)350μlの血小板を含まない血漿を、血小板凝集計のキュベットに入れ、そして50μlのブランクミクロスフェアを加えた。10、20または40μlのトロンビンを、PAP4血小板凝集計中の各アリコートに3.2u/mlで加え、0.08、0.04、または0.02u/mlトロンビンの最終濃度を達成した。光透過性の変化を、10分間にわたって測定した。最適下限の光透過性(すなわち、血漿との最低限の凝固)のみを与えるトロンビン濃度を選択した。典型的には、これは20μlであることが見出された。
(iv)50μlの各試験調製物または生成物、参照バッチまたはコントロールミクロスフェアを、350μlの血小板を含まない血漿に加えた。最適下限のトロンビン(上記で記載したように決定した)の存在および非存在下で、20分間にわたる光透過性の増加を測定した。結果を表4に報告する。
本発明の薬剤と血小板および止血システムの相互作用の異なる局面、すなわち血小板凝集、血小板活性化、血小板依存性の血栓形成および流動条件下での接着、トロンビン産生およびフィブリン溶解を評価するために、多くのよく規定されたインビトロアッセイを使用し得る。
(3.1 血小板枯渇全血の調製)
(i)2つのチューブの血液を、21ゲージの翼状針による清潔な静脈穿刺によって、クエン酸3ナトリウム抗凝固剤中へ採取した。インビトロにおける血小板の活性化を最小限にするために、血液を採取から10分以内に処理した。
(ii)血液の1つのチューブを、20℃で、150×gで20分間遠心し、血小板が豊富な血漿(PRP)を調製した。
(iii)血液の2番目のチューブを、20℃で、1500×gで30分間遠心し、血小板が乏しい血漿(PPP)を調製した。
(iv)PRPを血球画分から除去し、そしてPPPで置換した。この手段によって、血小板カウントは、約75%減少し、約50×106血小板/mlのカウントを達成した。
(v)いくつかの血液チューブを使用することによって、より多くの容量の血小板枯渇血液を調製し得る。
(i)2つのチューブの血液を、21ゲージの翼状針による清潔な静脈穿刺によって、クエン酸3ナトリウム抗凝固剤中へ採取した。インビトロにおける血小板の活性化を最小限にするために、血液を採取から10分以内に処理した。
(ii)血液の1つのチューブを、20℃で、150×gで20分間遠心し、血小板が豊富な血漿(PRP)を調製した。
(iii)血液の2番目のチューブを、20℃で、1500×gで30分間遠心し、血小板が乏しい血漿(PPP)を調製した。
(iv)PRPを血球画分から除去し、そしてPPPと混合して、10から50×106血小板/mlの間の血小板カウントを達成した。
(v)いくつかの血液チューブを使用することによって、より多くの容量の血小板枯渇血漿を調製し得る。
この方法を用いて、本発明の薬剤が、アゴニストの存在下でのみ血小板凝集を増強することを示し得る。Beckman Coulter MCL−XLフローサイトメーター、およびACTDiff細胞計数器、およびPAP4 Bio/Data Corporation血小板凝集計が、全血、血小板が豊富な血漿(PRP)、血小板枯渇全血または血小板枯渇血漿において、血小板の凝集を測定するために利用可能である。自発的な凝集(アゴニストの非存在下)またはADP(アデノシン二リン酸)、TRAP(トロンビン受容体活性化ペプチド)およびCPR(コラーゲン関連ペプチド)のようなアゴニスト存在下での凝集のいずれかを決定し得、そして例えば攪拌システムにおいて、試験ミクロスフェア有りまたは無しで得られた結果を比較し得る。
残留単独血小板の数を計数し、そしてそれによって人工血小板に結合した血小板のパーセンテージを計算するためにフローサイトメトリーを使用し得る。試料を前方および側方散乱光によって分析し、そして電子ゲートを単独血小板の集団付近にセットする。これを行うために、EDTAを含む血小板が豊富な血漿の試料を使用して、血小板−血小板凝集の発生を防止する。血小板を、全ての血小板上のGPIb受容体に結合するCD42bモノクローナル抗体のような、蛍光が結合した抗体で標識する。この方法において、特に試料がCD42b抗体に結合しない人工血小板を含む場合には、血小板ゲートにおけるCD42b陽性発生の数は、血小板の数の正確な測定を与える。
(i)血小板ゲートをセットするために、EDTA中に採取された全血を使用した。5μlのEDTA抗凝固血液を、50μlのHepes緩衝化生理食塩水に加え、そしてフローサイトメーター(例えばBeckman Coulter MCL−XL)において前方および側方散乱光によって分析した。>98%の単独血小板が血小板ゲートに含まれるように、ゲートを血小板集団周辺にセットした。
(ii)10−60×106/mlの血小板カウントを有する400μlの血小板枯渇血漿を、20μlのコントロールミクロスフェア(実施例1、方法1(i)において開示されたブランクカプセル)と10mgアルブミン/mlで混合し、そしてADPを1から4×10−5Mの間の最終濃度で加えた。試料を血小板凝集計のキュベット中で10分間まで、37℃で900rpmで攪拌し、そして光透過性の変化として凝集を測定した(下記の4.2項で記載するように)。続く生成物と血小板枯渇血漿の相互作用の分析のために、>0%および<20%の凝集を与えたADP濃度を使用した。我々は、2×10−5MのADP濃度が適当であることを見出した。
(iii)生成物を試験するために、10−60×106/mlの血小板カウントを有する400μlの血小板枯渇血漿を、20μlの試験ミクロスフェアと10mgアルブミン/mlで、そしてADPと上記で記載したように決定した濃度で混合した。試料を900rpmで10分まで混合した。適当な時間で、5μlのアリコートを以下のようなフローサイトメトリー分析のために除去した。
(iv)分析のために、5μlの試験試料を、適当な濃度の全ての血小板上に存在する抗原に対する蛍光結合抗体を含む、50μlのHepes緩衝化生理食塩水に加えた。我々は、1μlのRPE結合CD42bモノクローナル抗体を使用した(我々はBD Pharmingenによって提供された抗体555473を使用した)。試料を室温(典型的には20℃)で20分間インキュベートし、次いで0.5mlのホルミル生理食塩水(0.9%のNaCl中0.2%のホルマリン)で希釈した。
(v)次いで希釈した試料を、フローサイトメーター(例えばBeckman Coulter MCL−XL)において、固定した容量の試料(例えば20μl)がサイトメーターを通過することを可能にする、コントロール試料における血小板集団周辺にセットしたゲートを用いて(4.1.iを参照のこと)、前方および側方散乱光によって分析した。血小板ゲート中に囲い込まれた粒子を蛍光に関して分析し、ゲート中の単独血小板の数を同定した。蛍光のネガティブコントロールを、同じ蛍光色素に結合した抗血小板抗体(例えばBD PharmingenからのRPE−マウスIgG1κ)のアイソタイプコントロールを用いて設定した。
(vi)血小板ゲートからの単独血小板(すなわち、CD42b陽性粒子)の損失パーセントとしてデータを記録した。結果を下記の表6に示す。
このシステムにおいて、生成物を9000rpmでの攪拌システムにおいて血小板枯渇血漿と混合し、そして光透過性の変化によって凝集を測定した。
(i)400μlの血小板枯渇血漿を、20μlのブランクミクロスフェアと10mgアルブミン/mlで混合した。
(ii)ADPを1から4×10−5Mの間の濃度で加えた。
(iii)凝集を20分間にわたって測定し、そして100%の凝集の値を設定するために自己由来の血漿を用いて、最大値のパーセンテージとして記録した。
血小板および本発明の薬剤間の相互作用の化学量論を調査するために、および本発明の薬剤が、外来性の刺激の非存在下で表面抗原(例えばPセレクチン)の変化によって示されるような、血小板活性化を引き起こすかどうかをアッセイするために、Coulter Epics XL MCLフローサイトメーターを使用し得る。Pセレクチンは、血小板脱顆粒の、そして従って血小板活性化のマーカーである。
様々なせん断速度を用いた流動条件下で、本発明の薬剤と血小板の相互作用を研究するために、Parallel Plate Perfusion Chamberを使用し得る。
(1.血小板減少ウサギモデルにおける、用量依存性の止血活性)
オスNew Zealand白色ウサギ2.5−3.0kg(約4ヶ月齢)を、信頼できる供給業者から得る。6匹のウサギのグループを、研究日のそれぞれ12日および9日前に、ブスルファンの2回投与を用いて血小板減少症にする。ブスルファンの投与量は、必要な血小板減少症の重症度によって変化する、例えば20mg/kgの2回投与は、一般的に血小板カウントを10−20×109/lに減少させ、一方25mg/kgの2回投与は、血小板カウントを10×109/lより少なく減少させる。血小板カウントの減少に加えて、ブスルファンの投与は白血球の枯渇に関連するが、ヘマトクリットをわずかに減少させるのみであり、そして明白な毒性を有さない。この手順に麻酔は必要でない。
候補FLP調製物の潜在的血栓形成性を、実質的にWesslerら、1959、Journal of Applied Physiology、14、943−946によって記載されたように、しかし血小板代替物に適当なコントロールを含めて、Wesslerモデルにおいて評価する。コントロールは、インビトロにおける方法から得たデータを考慮して規定する。
Claims (31)
- 薬剤を含む注入可能な薬学的生成物であって、該薬剤はペプチドが結合される不溶性キャリアを含み、該ペプチドはフィブリノゲンに結合し得、その結果、該薬剤が該結合されたフィブリノゲンを介して、不活性な血小板よりも優先して活性血小板に結合され、ここで、該ペプチドはフィブリノゲンではない、生成物。
- 前記生成物が静脈内に導入される場合、前記ペプチドがフィブリノゲンに結合し、その結果、該結合されたフィブリノゲンが、血小板がすでに活性化された創傷の部位において血餅の形成に優先的に関与するようになる、請求項1に記載の生成物。
- 前記ペプチドが、血小板膜糖タンパク質GPIIbまたはGPIIIaから得られるフィブリノゲン結合配列(例えば、配列TDVNGDGRHDL)またはそのような配列の改変体を含む、請求項1または2に記載の生成物。
- 前記ペプチドが、TDVNGDGRHDLを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の生成物。
- 前記ペプチドが、アミノ末端にGly−(Pro/His)−Arg−Xaaの配列を含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の生成物。
- Xaaが、Pro、Ser、GlyまたはValである、請求項5に記載の生成物。
- 前記ペプチドが、4〜200のアミノ酸を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の生成物。
- 前記キャリアが、肺毛細血管床を通じる前記薬剤の送達を保証するのに適切なサイズを有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の生成物。
- 前記キャリアが微粒子である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の生成物。
- 前記微粒子が、アルブミン微粒子のようなタンパク質微粒子である、請求項11に記載の生成物。
- 前記生成物が、キャリアの集団を含み、該集団のうちの2%未満が最大寸法で6μmを超える、請求項8〜10のいずれか1項に記載の生成物。
- 前記キャリアの大多数が、最大寸法で2μm〜4μmである、請求項8〜11のいずれか1項に記載の生成物。
- 前記ペプチドが、共有結合によって前記キャリアに結合される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の生成物。
- 前記ペプチドがシステイン含み、そして該ペプチドが、該システインの−SH基が前記キャリアのチオール反応基に連結することにより該キャリアに結合される、請求項13に記載の生成物。
- 前記生成物が、前記ペプチドに結合されたフィブリノゲン、またはその改変体もしくはフラグメントをさらに含み、該フィブリノゲンまたはその改変体もしくはフラグメントは、誘導性の血小板凝集活性を有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の生成物。
- 前記フィブリノゲン(または改変体もしくはフラグメント)が、非共有結合により前記ペプチドに結合される、請求項15に記載の生成物。
- 前記フィブリノゲン(または改変体もしくはフラグメント)が、共有結合により前記ペプチドに結合される、請求項15または16に記載の生成物。
- 誘導性の血小板凝集活性を有する注入可能な薬学的生成物であって、フィブリノゲンまたはその改変体もしくはフラグメントが一定の構成で結合される不溶性キャリアを含み、その結果、該フィブリノゲンが、不活性な血小板よりも優先して活性血小板に結合する、生成物。
- 請求項18に記載の生成物であって、静脈内に導入される場合、血小板がすでに活性化された創傷の部位における血餅の形成に顕著に関与するようになるのみである、生成物。
- 請求項15〜19のいずれか1項に記載の生成物を調製するための方法であって、
請求項1〜14のいずれか1項に記載の生成物を提供する工程、および
フィブリノゲンまたはその改変体もしくはフラグメントと混合する工程
を包含し、そして必要に応じて、以下の工程:
(a)非結合のフィブリノゲンを除去する工程;
(b)該生成物を薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と配合する工程;
(c)該生成物を希釈して、薬学的に受容可能な単位用量を提供する工程;および
(d)該生成物を滅菌するか、または工程(a)〜(c)を通して生成物の無菌性を保証する工程、
のうちの1以上をさらに包含する、方法。 - 個体において止血を促進する方法であって、請求項1〜19のいずれか1項に記載の生成物の薬学的有効量を該個体に投与する工程を包含する、方法。
- 血小板減少を有する個体を処置する方法であって、請求項1〜19のいずれか1項に記載の生成物の薬学的有効量を投与する工程を包含する、方法。
- 医学で使用するための、請求項1〜19のいずれか1項に記載の生成物。
- 止血を促進するための医薬の製造における、請求項1〜19のいずれか1項に記載の生成物の使用。
- 血小板減少を有する患者の処置のための医薬の製造における、請求項1〜19のいずれか1項に記載の生成物の使用。
- 前記患者が、400×109/lよりも低い血小板数、好ましくは、150×109/lより低い血小板数を有する、請求項21〜25のいずれか1項に記載の方法または使用。
- 前記血小板数が、10×109/lよりも低い、請求項26に記載の方法または使用。
- 前記患者が、骨髄からの血小板産生不全を有する、請求項21〜27のいずれか1項に記載の方法または使用。
- 前記骨髄からの血小板産生不全が、血液の癌、または細胞毒性を有する化学療法もしくは放射線療法によって引き起こされる、請求項28に記載の方法または使用。
- 前記患者が、血小板の数または機能において遺伝的な障害または薬物性の障害を有する、請求項21、23または24のいずれか1項に記載の方法または使用。
- 前記患者の血小板が機械的に損傷を与えられた、請求項21、23または24のいずれか1項に記載の方法または使用。
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KR20100057641A (ko) * | 2007-09-11 | 2010-05-31 | 몬도바이오테크 래보래토리즈 아게 | 인터메딘 47 및 53 펩티드의 치료적 용도 |
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001523648A (ja) * | 1997-11-14 | 2001-11-27 | クワッドラント・ヘルスケア・(ユーケイ)・リミテッド | 2種の活性剤を含むコンジュゲート |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5357042A (en) * | 1984-04-23 | 1994-10-18 | The General Hospital Corporation | Synthetic peptides capable of eliciting fibrin-specific monoclonal antibodies lacking fibrinogen-cross-reactivity |
US6391343B1 (en) * | 1991-01-15 | 2002-05-21 | Hemosphere, Inc. | Fibrinogen-coated particles for therapeutic use |
DE4310632A1 (de) * | 1993-04-01 | 1994-10-06 | Merck Patent Gmbh | Lineare Adhäsionsinhibitoren |
EP0796090B1 (en) * | 1994-12-16 | 2003-03-12 | Elan Drug Delivery Limited | Cross-linked microparticles and their use as therapeutic vehicles |
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JP2001523648A (ja) * | 1997-11-14 | 2001-11-27 | クワッドラント・ヘルスケア・(ユーケイ)・リミテッド | 2種の活性剤を含むコンジュゲート |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20140121864A (ko) * | 2012-02-01 | 2014-10-16 | 해모스타틱스 리미티드 | 지혈용 상처 드레싱 |
JP2015506764A (ja) * | 2012-02-01 | 2015-03-05 | ハエモスタティクス リミティド | 止血創傷被覆材 |
KR102168157B1 (ko) * | 2012-02-01 | 2020-10-21 | 해모스타틱스 리미티드 | 지혈용 상처 드레싱 |
JP2019511997A (ja) * | 2015-12-17 | 2019-05-09 | レジェンティス バイオマテリアルズ リミテッド | タンパク質−ポリマー・コンジュゲートを含む有機溶媒不含組成物および該組成物の使用 |
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