JP2007503844A - 血管新生が関与する障害を診断しかつ治療するための方法及び組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は血管新生関連障害に関連するポリヌクレオチドに関する。本発明は、癌といったような血管新生関連障害に関連する新規遺伝子であるネコエンドスタチン遺伝子にも関する。本発明は、エンドスタチン核酸、組換え型ＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子又はその縮重変異体、エンドスタチン遺伝子産物及びかかる遺伝子産物に対する抗体、哺乳動物エンドスタチン遺伝子分子を含むクローニングベクター並びにかかる分子を発現するべく遺伝子工学処理された宿主をも包含する。本発明はさらに、エンドスタチン遺伝子及び遺伝子産物の発現を調節する化合物の同定のための方法並びに、例えば癌といったような血管新生関連障害の治療における治療薬としてのかかる化合物の使用にも関する。本発明は、例えば癌といった血管新生関連障害の診断的評価、遺伝子検査及び予後診断のための方法、並びにこれらの障害の治療のための方法及び組成物にも関する。

Description

本発明は、血管新生の調節に関連することが本書で示されているポリヌクレオチド配列に関する。より特定的には、本発明は、血管新生阻害物質エンドスタチン、さらに特定的にはネコ血管新生阻害物質をコードする新規ポリヌクレオチド配列に関する。該発明は、エンドスタチン核酸、その組換え型ＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子及び縮重変異体、かかるエンドスタチン核酸を含有するベクター並びにかかる分子を発現する及び／又は含有するように遺伝子工学処理された宿主を包含している。該発明はさらに、エンドスタチン遺伝子産物及びかかる遺伝子産物に対する抗体にも関する。該発明はさらに、かかるエンドスタチン核酸の発現、合成及び活性を調節する化合物の同定のための方法、並びに癌を含む（ただし、これに制限されるわけではない）血管新生関連障害の治療における治療薬として本書で同定されているもののような化合物の使用方法にも関する。本発明は同様に、癌を含む（ただし、これに制限されるわけではない）血管新生関連障害の診断的評価、遺伝子検査及び予後診断のための方法にも関する。
既存の血管からの新しい血管の成長又は発生として定義づけされる血管新生は、主として胚発育の間に起こる複雑なプロセスである。成人の正常な生理学的条件下では、血管新生は、毛髪の成長及び創傷の治ゆといったような非常に限定的な状況でのみ起こる（Auerbach, W. 及び Auerbach, R.,１９９４，Pharmacol Ther ６３（３）：２６５−３１１；Ribatti et al.,１９９１，Haematologica ７６（４）：３１１−２０；Risau, １９９７，Nature３８６（６６２６）：６７ １−４）。癌、心臓血管疾患、関節リウマチ、乾癬及び糖尿病性網膜症を含む（ただし、これに制限されるわけではない）広範囲にわたる障害の原因が無秩序な血管新生であることが徐々に認識されてきた（Folkman, １９９５，Nat Med１（１）：２７−３１；Isner,１９９９，Circulation ９９（１３）：１６５３−５；Koch, １９９８，Arthritis Rheum４１（６）：９５１−６２；Walsh,１９９９，Rheumatology (Oxford)３８（２）：１０３−１２；Ware and Simons, １９９７，Nat Med ３（２）：１５８−６４）。最も興味深いのは、固形腫瘍がその成長及び転移に血管新生を必要とするという観察事実である（Folkman, １９８６，Cancer Res,４６（２）４６７−７３，Folkman １９９０，J Natl. Cancer Inst.,８２（１）４−６，Folkman, １９９２，Semin Cancer Biol３（２）：６５−７１；Zetter, １９９８，Annu Rev Med ４９：４０７−２４）。腫瘍は通常、利用可能な毛細血管床からの距離が原因で数立方ミリメートルのサイズまでしか増殖できない単一の異常細胞として始まり、長期間にわたりさらなる成長及び播種無く「休眠状態」にとどまることができる。一部の腫瘍細胞は次に血管新生表現型へと切換わり、内皮細胞を活性化し、これは新しい毛細血管へと増殖し成熟する。これらの新たに形成された血管は、原発性腫瘍の連続した成長を可能にするのみならず、転移性腫瘍細胞の播種及び再コロニー形成をも可能にする。血管新生スイッチを制御する精確なメカニズムは充分に理解されていないが、腫瘍塊の新血管形成は多数の血管新生刺激物質及び阻害物質のネットバランスの結果としてもたらされると考えられている（Folkman, １９９５，Nat Med１（１）：２７−３１）。
最も強力な血管新生阻害物質の１つは、O’ Reilly及びFolkmanによって同定されたエンドスタチンである（O’ Reilly et al.,１９９７，Cell８８（２）：２７７−８５；O’ Reilly et al.,１９９４，Cell７９（２）：３１５−２８）。その発見は、或る種の原発性腫瘍が遠位の転移の成長を阻害できるという現象に基づいていた。O’ Reilly及びFolkmanは、原発性腫瘍が、阻害物質を上回る血管新生刺激物質を生成することによって血管新生を開始させるという仮説を立てた。しかしながら、血管新生阻害物質は、循環内の半減期がより長いために、刺激物質よりも大量に続発性腫瘍の部位に到達する。最終的な結果は、原発性腫瘍の成長及び続発性腫瘍の阻害である。エンドスタチンは、原発性腫瘍により産生されるこのような血管新生阻害物質の増大しつつあるリストに入るものである。それは、さらに大きいタンパク質のタンパク質分解性フラグメントである。エンドスタチンはコラーゲンＸＶＩＩＩの２０ｋＤａのフラグメントである（マウスコラーゲンＸＶＩＩＩ中のアミノ酸 Ｈｌ １３２−Ｋ１３１５）。エンドスタチンはインビトロでの内皮細胞増殖を特異的に阻害し、インビボで血管新生を遮断することが示されてきた。より重要なことに、腫瘍をもつマウスに対するエンドスタチンの投与は、著しい腫瘍退行を導き、多数の治療サイクルの後でさえいかなる毒性も薬物耐性も観察されなかった（Boehm et al., １９９７，Nature ３９０（６６５８）：４０４−４０７）。エンドスタチンは、遺伝的に安定した内皮細胞を標的とし、さまざまな固形腫瘍を阻害するという事実により、極めて魅力的な抗癌療法の候補になっている（Fidler及びEllis, １９９４，Cell７９（２）：１８５−８；Gastl et al., １９９７，Oncology ５４（３）：１７７−８４；van Hinsbergh et al., １９９９，Ann Oncol １０ Suppl ４：６０−３）。さらに、血管新生阻害物質は、放射線及び化学療法薬と組合わせた場合により効果的であることが示されてきた（Klement, ２０００，J, Clin Invest, １０５（８）Ｒ１５−２４．Browder, ２０００，Cancer Res.６−（７）１８７８−８６，Arap et al., １９９８；Science ２７９（５３４９）；３７７−８０；Mauceri et al., １９９８，Nature ３９４（６６９０）：２８７−９１）。
癌は、人類にとって破壊的であるばかりでなく、同様にネコにおける自然死の最も一般的な原因でもある。１０万匹あたり１２７７匹のネコが腫瘍を有している。（William A. Prester and Frank W. McKay−Malignant tumor types in companion animals：the Occurrence of tumors in domestic animals. NCI monograph＃５４ １９８０、ＮIH Publication No.８０−２０４６）。放射線療法及び化学療法といった治療の成功は、非常に限られたものでしかない。かくして、例えばネコの癌といったような血管新生疾患のためのさらに有効な治療が必要である。
発明の要約
本発明は、例えば癌といった血管新生関連障害に関連する新規のヌクレオチド配列を包含する。該発明はより特定的には、エンドスタチンをコードするヌクレオチド配列に関する。さらに、エンドスタチン核酸、その組換え型ＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子又は縮重変異体が本書中で提供されている。該発明は同様に、エンドスタチン核酸分子を含む発現ベクターを含めたベクター、及びかかるエンドスタチン遺伝子産物を発現及び／又は含有するべく遺伝子工学処理された宿主をも提供する。
本発明はさらに、新規エンドスタチン遺伝子産物及びかかる遺伝子産物に対する抗体或いはその変異体又はフラグメントにも関する。
本発明はさらに、エンドスタチンが媒介するプロセスの調節のため、及び障害の少なくとも１つの症状の改善又は予防を内含する、癌といったような血管新生が関与する障害の治療のための方法にも関し、ここで、かかる方法はエンドスタチン遺伝子の発現及び／又はエンドスタチン遺伝子産物の合成若しくは活性を調節する化合物を投与することを含む。１つの実施態様においては、該発明は、哺乳動物の対象例えばネコにおけるこのような障害の症状を治療又は改善するための、新規エンドスタチン遺伝子産物又はそのフラグメント、類似体若しくは模倣体、又はエンドスタチン遺伝子産物に対する抗体若しくは抗体フラグメントの使用にも関する。
かかる障害には、例えば、固形腫瘍、白血病などの血液性腫瘍及び腫瘍転移を含む血管新生依存性癌；例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫などの良性腫瘍；関節リウマチ；乾癬；例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシスなどの眼の血管新生疾患；オスラー・ウェーバー症候群；心筋血管新生；プラーク新血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節症；血管線維腫；創傷肉芽発生；冠動脈側枝；脳側枝；動静脈奇形；虚血性四肢血管新生；糖尿病性新血管形成；黄斑変性症；骨折；血管形成；造血；***；月経及び胎盤形成が含まれるがこれらに制限されているわけではない。
本発明はさらに、エンドスタチンが媒介するプロセスの調節のため、及び障害の少なくとも１つの症状の改善又は予防を含む、内皮細胞の異常な刺激が関与する障害の治療のための方法にも関し、ここで該方法は、エンドスタチン遺伝子の発現及び／又はエンドスタチン遺伝子産物の合成若しくは活性を調節する化合物を投与することを含む。１つの実施形態においては、該発明は、哺乳動物の対象例えばネコにおけるこのような障害の症状を治療又は改善するための、新規エンドスタチン遺伝子産物又はフラグメント、その類似体又は模倣体、若しくはエンドスタチン遺伝子産物に対する抗体若しくは抗体フラグメントの使用にも関する。
本発明の内皮細胞増殖阻害タンパク質は、内皮細胞の過剰な又は異常な刺激の疾患の治療において有用である。これらの疾患は、腸管ゆ着症、アテローム性動脈硬化症、強皮症及び肥厚性瘢痕すなわちケロイドを含むが、これに制限されるわけではない。これらは同様に、ネコひっかき病（Rochele minalia quintosa）及び潰瘍（Helicobacter pylori）といったような病理的結果として血管新生を有する疾患の治療においても有用である。
本発明はさらに、エンドスタチン及びそのそれぞれのレセプタの間の相互作用をレセプタアンタゴニストとして作用する類似体によって遮断するための方法に関する。これらのアンタゴニストは、内皮化及び血管化を促進し得る。このような効果は、子宮内膜の不適切な血管化及び付随する不妊症、創傷修復、傷口及び切り口の治ゆ、糖尿病における血管の病気の治療、特に網膜及び末梢血管の病気、筋肉及び皮膚を含む移植された組織内の血管化の促進、特に心臓又は心臓組織の移植後及びバイパス手術後の心筋の血管化の促進、細胞毒素送達の増強のための固形及び比較的無血管の腫瘍の血管化の促進並びに脳皮質及び脊髄を含む（ただし、これに制限されるわけではない）神経系への血流の増強を含む（ただし、これに制限されるわけではない）状況において望ましいものであり得る。
本書で使用する「エンドスタチン関連障害」という語は、エンドスタチン遺伝子又は遺伝子産物が関与する障害或いは、正常な罹患していない、損傷を受けていない個体の体内で見られるレベル、臨床的に正常な個体の体内に見られるレベル、及び／又はそのレベルが基準線、平均エンドスタチンレベルを表わしている集団の中に見られるレベルと比べて異常なレベルのエンドスタチン遺伝子発現、遺伝子産物合成及び／又は遺伝子産物活性がそれぞれ関与する障害を意味する。
本書で使用される「エンドスタチン媒介プロセス」という語は、エンドスタチン遺伝子の発現、遺伝子産物合成及び／又は遺伝子産物活性のレベルに対し直接的に又は間接的に依存及び／又は応答するプロセスを内含する。
もう１つの実施態様においては、かかる方法は、エンドスタチン媒介プロセス又は障害が治療される、例えば１つの症状が改善されるような形で、細胞内のエンドスタチン遺伝子産物の発現レベル又は活性を調節することを含むことができる。もう１つの実施形態では、かかる方法は、エンドスタチン媒介プロセス又は障害が治療される例えば１つの症状が改善されるような形で細胞内のエンドスタチン遺伝子産物のレベル、発現又は活性を増加させるためにエンドスタチン遺伝子産物をコードする核酸分子を供給することを含むことができる。エンドスタチン遺伝子産物をコードする核酸分子は、活性又は発現レベルの増加した突然変異体エンドスタチン遺伝子産物をコードすることができる。
本発明はさらに又、エンドスタチン媒介プロセスの調節のための方法、或いは、エンドスタチン遺伝子 突然変異及び／又はエンドスタチン発現又は活性のレベルが異常である結果としてもたらされる障害及び単数又は複数のエンドスタチン遺伝子又は遺伝子産物が関与する障害を含む（ただし、これに制限されるわけではない）、癌といったようなエンドスタチン関連障害の治療に関し、ここで治療は、例えばネコといった哺乳動物の対象におけるこのような障害の少なくとも１つの症状の改善又は予防を内含している。１つの実施形態においては、かかる方法は、損傷を受けていないエンドスタチン遺伝子産物が発現され障害が治療される、例えば症状が改善されるような形で、損傷を受けていないエンドスタチン遺伝子産物をコードする核酸分子を、治療を要する哺乳動物に供給することを含むことができる。もう１つの実施態様においては、かかる方法は、細胞が損傷を受けていないエンドスタチン遺伝子産物を発現し、障害が治療される、例えば症状が改善されるような形で損傷を受けていないエンドスタチン遺伝子産物をコードする核酸分子を含む細胞を、治療を要する哺乳動物（例えばネコ）に供給することを含むことができる。さらに他の実施態様においては、かかる方法は、例えばエンドスタチン遺伝子又は遺伝子産物の活性を調節することのできる、小分子、ペプチド又は抗体などの調節性化合物を、治療を要する哺乳動物（例えばネコ）に供給することを含む。
さらに、本発明は、癌といったような血管新生関連障害の診断的評価、遺伝子検査及び／又は予後診断のためにエンドスタチン遺伝子配列及び／又はエンドスタチン遺伝子産物配列を利用する方法に向けられている。例えば該発明は、例えば癌といった血管新生関連障害を診断するための方法であって、哺乳動物の対象（例えばネコ）の試料中のエンドスタチン遺伝子発現を測定すること又はかかる障害を示す疑いのある哺乳動物（例えばネコ）のゲノム内でかかる障害の存在又は発生と相関関係をもつエンドスタチン突然変異を検出することを含み得る方法、に関する。
本発明は同様に、ヒト染色体のマッピングのためのマーカーとしてエンドスタチン遺伝子配列及び／又は遺伝子産物を利用することにも向けられている。
本発明は、さらに又、エンドスタチン遺伝子の発現及び／又はエンドスタチン遺伝子産物の合成若しくは活性を調節することのできる化合物を同定するための方法に関し、ここで、該方法は、かかるエンドスタチン遺伝子を発現する細胞と化合物を接触させること、遺伝子発現、遺伝子産物発現又は遺伝子産物活性のレベルを測定することそして、化合物の存在下で得られたレベルがその不在下で得られたものと異なる場合に、エンドスタチン遺伝子の発現及び／又はエンドスタチン遺伝子産物の合成若しくは活性を調節する能力をもつ化合物が同定されるように、かかるレベルを、かかる化合物の不在下で細胞により生成されたエンドスタチン遺伝子発現、遺伝子産物又は遺伝子産物活性レベルに比較すること、を含んで成る。
略号
本書で使用されている以下の用語は、指示されている略号を有するものとする。
ＢＡＣ： 細菌人工染色体
ｂｐ： 塩基対（単複）
ｄｂＥＳＴ： 発現済み配列タグデータベース（国立バイオテクノロジー情報センター）。
ＥＳＴ： 発現済み配列タグ
ＲＴ−ＰＣＲ： 逆転写酵素ＰＣＲ
ＳＳＣＰ： １本鎖立体配座多型
ＳＮＰ： 単一ヌクレオチド多型
ＹＡＣ： 酵母人工染色体
発明の詳細な説明
血管新生が関与する障害に関連する核酸配列に関する組成物及び方法が本書で記述されている。血管新生関連障害に関連する新規の遺伝子が同定された。このような遺伝子はエンドスタチンをコードする。特に、以下で記述されているのは、エンドスタチン核酸分子ならびにこれらの分子を含むベクター、かかる分子を含有及び／又は発現するように工学処理された宿主細胞、エンドスタチン遺伝子産物及びかかる遺伝子産物を特異的に認識する抗体である。同様に記述されているのは、これらの核酸、ポリペプチド及び抗体ならびにその検出方法のさまざまな使用である。例えば、血管新生関連プロセスの調節及び癌といったような血管新生関連障害の治療のためのこれらの分子の使用方法が記述されている。エンドスタチン遺伝子又は遺伝子産物と相互作用するか或いはエンドスタチン遺伝子又は遺伝子産物活性を調節する化合物をスクリーニングするためのアッセイについても以下で記述されている。本発明の組成物及び本発明の方法によって同定された組成物を用いた血管新生関連障害の治療方法がさらに記述されている。最後に、本発明の組成物と共に使用するための医薬組成物が記述されている。
本書で使用されている「動物又は対象」又は「対象」という語は、あらゆる哺乳動物対象例えばヒト、マウス及びネコを意味する。本発明により提供された組成物及び方法はネコに適用するのに特に有用である。
このセクションでは、エンドスタチン核酸分子が記述されている。特記しないかぎり、「エンドスタチン核酸」という語は集合的に、本書に記述されている配列を意味する。
本発明のエンドスタチン核酸分子には以下のものが含まれる：
（ａ）エンドスタチンのＤＮＡ配列（図３（配列番号３））を含有する核酸分子、又はそのフラグメント；
（ｂ）エンドスタチン核酸配列（例えば、図１に記されている核酸 配列（配列番号１））を含む核酸分子又はそのフラグメント；
（ｃ）エンドスタチン遺伝子産物（例えばエンドスタチンポリペプチド）をコードする核酸分子；
（ｄ）エンドスタチン遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸分子；
（ｅ）上述の（ｂ）内のエンドスタチンヌクレオチド配列の上流側未翻訳領域、イントロン領域及び／又は下流側未翻訳領域のエンドスタチン遺伝子配列を含む核酸分子又はそのフラグメント；
（ｆ）単数又は複数のドメインの全て又は一部分が欠失されるか又は改変されているエンドスタチン遺伝子産物の突然変異体をコードする核酸分子或いはそのフラグメント；
（ｇ）非相同ポリペプチドに融合された、エンドスタチン遺伝子産物を含む融合タンパク質をコードする核酸分子、又はそのフラグメント；
（ｈ）癌といったような血管新生関連障害に対するリスクをもつ又はかかる障害を示す個体を同定し診断するために本発明の方法の一部として利用可能であるか又はヒト染色体をマッピングするために使用可能である、上述のｂ）中に記述されているエンドスタチン遺伝子（例えばプライマ）の内部又は、エンドスタチン遺伝子に隣接する染色体ヌクレオチド配列の内部の核酸分子；そして
（ｉ）癌といったような血管新生関連障害と相関関係をもつ、上述のｂ）中で記述されたエンドスタチン遺伝子の内部又はエンドスタチン遺伝子に隣接する染色体ヌクレオチド配列の内部の核酸分子；
本発明のエンドスタチンヌクレオチド配列はさらに、単数又は複数のエクソン又はそのフラグメントが欠失している上述の（ａ）−（ｉ）のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列を内含する。
本発明のエンドスタチンヌクレオチド配列は同様に、エンドスタチンがニワトリ、イヌ、ヒト又はマウスエンドスタチンでないことを条件として、上述の（ａ）−（ｉ）のエンドスタチンヌクレオチド配列に対し少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％以上のヌクレオチド配列同一性を有し、長さが２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上の塩基対であるヌクレオチド配列をも内含している。
本発明のエンドスタチンヌクレオチド配列はさらに、上述の（ａ）−（ｉ）のエンドスタチンヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドに対し少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％以上のアミノ酸配列同一性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに内含している。
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の同一性百分率を決定するために、配列は最適な比較を目的として整列させられる（例えば、第２のアミノ酸又は核酸配列との最適なアラインメントのためには第１のアミノ酸又は核酸配列の配列内にギャップを導入することができる）。このとき対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列内の１つの位置が第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有されている場合には、該分子はその位置において同一となる。２つの配列の間の同一性百分率は、配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち同一性％＝同一の重なる位置の数／重なる位置の合計数×１００％）。１つの実施形態においては、２つの配列は同じ長さのものである。
２つの配列の間の同一性百分率の決定は、数学的アルゴリズムを用いても達成可能である。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの非制限的な好ましい例は、Karlin及びAltschul, １９９３，Proc. Natl. Acad, Sci. ＵＳＡ９０；５８７３−５８７７の場合のように修正されたKarlin 及び Altschul, １９９０，Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８７；２２６４−２２６８のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Altschul, et al., １９９０，J. Mol. Biol. ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム内に組込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るため、ＮＢＬＡＳＴプログラム、評点＝１００、文字長＝１２で実施可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るべくＸＢＬＡＳＴプログラム、評点＝５０、文字長＝３で実施可能である。比較を目的としてギャップ有りのアラインメントを得るためには、Altschul et al, １９９７，Nucleic Acids Res. ２５：３３８９−３４０２の中で記述されている通りに、ギャップ有りＢＬＡＳＴを利用することができる。或いは、分子間の距離的関係を検出する反復探索を実施するためにＰＳＩ−Blastを使用することができる（Altschul et al., １９９７，上掲書）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ有りＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。（http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。２つの配列の比較のために利用された数学アルゴリズムの非制限的なもう１つの好ましい例は、Karlin及びAltschul, １９９３，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０：５８７３−５８７７の場合のように修正されたKarlin及びAltschul, １９９０，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Altschul, et al., １９９０，J. Mol. Biol. ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム内に組込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るため、ＮＢＬＡＳＴプログラム、評点＝１００、文字長＝１２で実施可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るべくＸＢＬＡＳＴプログラム、評点＝５０、文字長＝３で実施可能である。比較を目的としてギャップ有りのアラインメントを得るためには、Altschul et al, １９９７，Nucleic Acids Res. ２５：３３８９−３４０２の中で記述されている通りに、ギャップ有りＢＬＡＳＴを利用することができる。或いは、分子間の距離的関係を検出する反復探索を実施するためにＰＳＩ−Blastを実施することができる（Altschul et al., １９９７，上掲書）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ有りＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。（http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。配列の比較のために利用された数学アルゴリズムの非制限的なもう１つの好ましい例は、Myers及びMiller, １９８８，CABIOS ４：１１−１７のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）の中に組込まれている。アミノ酸配列を比較するためのＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２というギャップ長ペナルティ、及び４というギャップペナルティを使用することができる。
２つの配列間の同一性百分率は、ギャップを伴って又はギャップを許容することなく、以上で記述されたものと類似の技術を用いて決定することができる。同一性百分率を計算するにあたっては、典型的には正確なマッチのみが計数される。
本発明のエンドスタチンヌクレオチド配列はさらに、（ａ）例えば約４５℃で６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのフィルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションとそれに続く０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中、約５０〜６５℃での単数又は複数回の洗浄といった中庸のストリンジェント条件下、又は（ｂ）例えば約４５℃での６×ＳＳＣ中のフィルター結合された核酸に対するハイブリダイゼーションとそれに続く約６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．２％のＳＤＳ中での単数又は複数回の洗浄といった高いストリンジェント条件下、又は当業者にとって明らかであるその他のハイブリダイゼーション条件下（例えば、Ausubel F.M. et al., eds., １９８９、Current Protocols in Molecular Biology、Vol １，Green Publishing Associates, Inc., 及びJohn Wiley & sons, Inc., New York, ６．３．１−６．３．６及び２．１０．３ページ）での本発明のエンドスタチン核酸分子に対しハイブリッド形成するあらゆるヌクレオチド配列を内含している。好ましくは、以上の（ａ）及び（ｂ）で記述した条件下でハイブリッド形成するエンドスタチン核酸分子は、エンドスタチン遺伝子産物をコードする核酸分子の相補体を含むものである。好ましい実施形態においては、以上の条件（ａ）及び（ｂ）の下でハイブリッド形成する核酸分子は、遺伝子産物例えばエンドスタチン遺伝子産物と機能的に等価である遺伝子産物をコードする。
機能的に等価であるエンドスタチン遺伝子産物には、同じ又は異なる種の中に存在する天然のエンドスタチン遺伝子産物が含まれる。機能的に等価のエンドスタチン遺伝子産物は、エンドスタチン遺伝子産物の生物活性のうちの少なくとも１つを保持し及び／又はかかる遺伝子産物に対する抗体によって認識されこれに結合する遺伝子産物をも内含する。
本発明の核酸分子の中には、上述のエンドスタチン核酸分子に対しきわめて高いストリンジェント条件下で又はストリンジェント条件下でハイブリッド形成するデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）がある。一般に、長さが１４〜７０ヌクレオチドの間のプローブについては、融解温度（Ｔｍ）は、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ〔一価のカチオン（モル）〕）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）（５００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブの長さである）という等式を用いて計算される。ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含有する溶液中で実施される場合には、融解温度は、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ〔一価のカチオン（モル）〕）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（０．６１％ホルムアミド）−（５００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブの長さである）という等式を用いて計算される。一般に、ハイブリダイゼーションは、（ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては）Ｔｍより約２０〜２５度低い温度又は（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては）Ｔｍより１０〜１５度低い温度で実施される。
高いストリンジェント条件の例というのは、例えば、３７℃（約１４塩基のオリゴについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴについて）及び６０℃（約２３塩基のオリゴについて）で６×ＳＳＣ／０．０５％のピロリン酸ナトリウム中での洗浄を意味し得る。
本発明の核酸分子はさらに、上述の核酸の相補体を含む。かかる分子は例えばエンドスタチン遺伝子の制御において有用なアンチセンス分子として、及び／又はエンドスタチン遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマとして作用し得る。
本発明の核酸配列は、エンドスタチン遺伝子の制御においても有用であり得るリボザイム及び／又は３重らせん配列の一部として使用可能である。さらには、かかる分子は、例えば癌といった血管新生関連障害に関与する特定のエンドスタチン対立遺伝子の存在などを検出できる、又は対立遺伝子がまたがっているヒト染色体領域をマッピングすることが関与する診断方法の一構成要素として使用することもできる。
エンドスタチン核酸分子のフラグメントは、長さが少なくとも１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００以上の隣接するヌクレオチドであり得るエンドスタチン核酸配列を意味する。或いは、フラグメントは、エンドスタチン遺伝子産物の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０以上の隣接アミノ酸残基をコードする配列を含むことができる。１つの実施形態においては、エンドスタチン核酸分子は、例えばエンドスタチン遺伝子産物といった、対応するエンドスタチン遺伝子産物の少なくとも１つの生物活性を示す遺伝子産物をコードする。エンドスタチン核酸分子のフラグメントは、同様に、エンドスタチンエキソン又はイントロンを意味することもあり得、そしてさらには、エンドスタチン遺伝子産物のドメインをコードするエンドスタチンコーディング領域の一部分を意味する可能性もある。
エンドスタチンヌクレオチド配列の同定及び単離に関しては、かかる配列は、例えば標準的配列決定及び細菌人工染色体（ＢＡＣ）技術を利用することによって、容易に得ることができる。
当業者であればわかるように、エンドスタチン遺伝子のＤＮＡ配列多型性が、個々の生体の集団（例えばヒト又はネコ集団）内部に存在することになる。かかる多型性は、例えば、天然の対立遺伝子変異に起因して、１つの集団内部の個々の生体の間で存在し得る。かかる多型性は、アミノ酸配列の変化を導く多型性を含む。本書で使用されるように、「対立遺伝子変異体」という語句は、一定の遺伝子座で発生するヌクレオチド配列又は、そのヌクレオチド配列によりコードされる遺伝子産物を意味する。かかる天然の対立遺伝子変異は、一定の遺伝子のヌクレオチド配列内で１〜５％、５〜２０％又は２０〜５０％の相違を結果としてもたらす可能性がある。対立遺伝子というのは、一定の遺伝子座において交互に発生する一群の遺伝子のうちの１つである。代替的対立遺伝子は、多数の異なる個々の生体内の問題の遺伝子の配列を決定することにより同定可能である。これは、さまざまな個々の生体における同じ遺伝子座を同定するためにハイブリダイゼーションプローブを使用することによって容易に実施可能である。本書で使用されている「遺伝子」及び「組換え型遺伝子」という語は、本発明のポリペプチドをコードする読取り枠を含む核酸分子を意味する。この語はさらに、上流側及び／又はエキソン／イントロン配列及び構造を含む核酸分子をも内含し得る。
ヒトエンドスタチン遺伝子の付加的な対立遺伝子変異体及びその他の種（例えばモルモット、乳牛、マウス、ネコ）からの相同体及びオーソログのクローニングに関しては、本書に開示されている単離済みエンドスタチン遺伝子配列を標識し、問題の生体（例えばモルモット、乳牛、マウス、ネコ）に由来する適切な細胞又は組織（例えば肝臓）から得られたｍＲＮＡで構築されたｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために使用することができる。使用されるハイブリダイゼーション条件は一般に、ｃＤＮＡライブラリが該標識された配列が由来した生体のタイプと異なる生体に由来する場合に、より低いストリンジェンシーのものであるべきであり、例えば標的及び基準生体の相対的な関連性などに基づいて日常的に決定可能である。
或いは、ここでも適切なストリンジェント条件を用いて、問題の生体に由来するゲノムライブラリをスクリーニングするために、標識されたフラグメントを用いることができる。適切なストリンジェント条件は、上述の通り当業者にとって周知であり、ライブラリ及び標識済み配列が由来する特定の生体に応じて予測可能な形で変動することになる。かかる条件に関する指針については、例えば、共にその全体が本書に参考として内含されている、Sambrook, et al., １９８９，Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Press, N.Y.：及び Ausubel, et al.,１９８９−１９９９，Current Protocols in Molecular Biology、Green Pubilishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.,を参照のこと。
さらに、例えば、本書に開示されているエンドスタチン遺伝子産物の内部のアミノ酸配列に基づいて設計された２つの縮重オリゴヌクレオチドのプライマプールを用いてＰＣＲを実施することによって、ヒト又はネコの核酸から、エンドスタチン遺伝子対立遺伝子 変異体を単離することができる。反応のための鋳型は、例えば（例えば肝細胞といったような）野生型又は突然変異体エンドスタチン遺伝子対立遺伝子を発現するものとして知られている又はその疑いのあるヒト又は非ヒト細胞系列又は組織から調製されたｍＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡであり得る。１つの実施形態においては、対立遺伝子変異体は、血管新生を媒介とした障害を有する個々の生体から単離される。
ＰＣＲ産物は、増幅された配列がエンドスタチン遺伝子核酸配列の配列を表わすことを確かめるべくサブクローニングされ、配列決定され得る。このときＰＣＲフラグメントを使用してさまざまな方法により全長ｃＤＮＡクローンを単離することが可能である。例えば増幅されたフラグメントを標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするのに使用することができる。或いは、ゲノムライブラリのスクリーニングを介してゲノムクローンを単離するのに標識済みフラグメントを使用することが可能である。
ＰＣＲ技術は同様に、全長ｃＤＮＡ配列ならびに代替的にスプライシングされたｍＲＮＡ種に対応するｃＤＮＡ配列を単離するために利用することもできる。例えば、適切な細胞又は組織供給源（すなわち、例えば生検又は死体解剖を通して得られた肝組織試料などといったエンドスタチン遺伝子を発現するものとして知られた又はその疑いのあるもの）から、標準的手順に従ってＲＮＡを単離することができる。第１ストランドの合成のプライミングのために、増幅されたフラグメントの５’最末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマを用いてＲＮＡについて逆転写反応を実施することが可能である。得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを次に、標準末端トランスフェラーゼ反応を用いてグアニンで「テーリング」することができ、ハイブリッドをＲＮアーゼＨで消化することができ、そして次に第２ストランド合成をポリ−Ｃプライマでプライミングすることができる。かくして、増幅されたフラグメントの上流側のｃＤＮＡ配列を容易に単離することができる。使用可能なクローニング戦略を再考するためには、上掲のSambrook et al., １９８９又はAusubel et al., を参照のこと。
例えばエンドスタチン遺伝子の突然変異体、変異体といったような対立遺伝子のｃＤＮＡを、例えば、当業者にとって周知の技術であるＰＣＲを用いることによって単離することができる。この場合、推定上突然変異体エンドスタチン対立遺伝子を担持する個々の生体内で発現されるものとして知られているか又はその疑いのある組織から単離されたｍＲＮＡに対しオリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させること及び逆転写酵素で新しいストランドを拡張することによって、第１のｃＤＮＡストランドを合成し得る。ｃＤＮＡの第２のストランドは次に、正常な遺伝子の５’末端に対し特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを用いて合成される。これらの２つのプライマを用いて、産物は次にＰＣＲを介して増幅され、適切なベクター内にクローニングされ、当業者にとって周知の方法を通してＤＮＡ配列分析に付される。突然変異体エンドスタチン対立遺伝子のＤＮＡ配列を正常なエンドスタチン対立遺伝子のものに比較することによって、突然変異体エンドスタチン遺伝子産物の機能の喪失又は改変の原因である突然変異（単複）を解明することが可能である。
或いは、突然変異体エンドスタチン対立遺伝子を担持する疑いがあるか又はそういうものとして知られている個々の生体から得られたＤＮＡを用いてゲノムライブラリを構築することができ、そうでなければ、突然変異体エンドスタチン対立遺伝子を発現するものとして知られているか又はその疑いのある組織由来のＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリを構築することができる。次に、損傷を受けていないエンドスタチン遺伝子又はその任意の適切なフラグメントを、標識し、かかるライブラリ内の対応する突然変異体エンドスタチン対立遺伝子を同定するためのプローブとして使用することができる。そして、突然変異体エンドスタチン遺伝子配列を含有するクローンを精製し、当業者にとって周知の方法に従って、配列分析に付すことができる。
さらに、例えば、突然変異体エンドスタチン対立遺伝子を担持する疑いがあるか又はそういうものとして知られている個々の生体内でかかる突然変異体対立遺伝子を発現するものとして知られているか又はその疑いのある組織から単離されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを利用して発現ライブラリーを構築することができる。この要領で、推定上突然変異体である組織により作られた遺伝子産物を発現し、以下で記述するように、正常なエンドスタチン遺伝子産物に対する抗体を用いる標準的抗体スクリーニング技術を用いてスクリーニングすることができる（スクリーニング技術については、例えば、Harlow及びLane, eds., １９８８、“Antibodies：A Laboratory Manual”、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.を参照のこと）。
エンドスタチン突然変異が、（例えばミスセンス又はフレームシフト突然変異の結果としての）改変された機能をもつ発現された遺伝子産物を結果としてもたらす場合、抗エンドスタチン遺伝子産物抗体のポリクローナルセットは、突然変異体エンドスタチン遺伝子産物と交差反応する確率が高い。かかる標識された抗体とのその反応を介して検出されたライブラリクローンを精製し、当業者にとって周知の方法に従って配列分析に付すことができる。
エンドスタチン突然変異又は多型性は、ＰＣＲ増幅技術を用いてさらに検出可能である。プロモータ調節領域を含むエンドスタチン配列全体の重複する領域を増幅するように、プライマを日常的に設計できる。１つの実施形態においては、プライマは、エキソン−イントロン境界を網羅するように設計されており、かくしてコーディング領域を突然変異について走査することができるようになっている。
本発明は、先行する段落のヌクレオチド配列の相補体である核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も内含する。
或る実施形態においては、本発明の核酸分子は、非相同（例えばベクター、発現ベクター又は融合タンパク質）配列を含有又はコードする核酸配列を含む核酸分子の一部分として存在している。
エンドスタチン遺伝子産物は、上述のエンドスタチン遺伝子配列を含む核酸分子によりコードされるような遺伝子産物を含む。さらに、エンドスタチン遺伝子産物は、機能的に等価の遺伝子産物を表わすタンパク質を内含し得る。このような等価のエンドスタチン遺伝子産物は、内部欠失を含む欠失、融合タンパク質を生成する付加を含む付加、又は、それが機能的に等価のエンドスタチン遺伝子産物を産生するという点で「サイレント」である変化をもたらす、上述のエンドスタチン遺伝子配列によりコードされたアミノ酸配列内及び／又はそれに隣接するアミノ酸残基の置換を含み得る。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似性に基づいて行なうことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれ；正荷電（塩基）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれ；負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。
或いは、機能の改変が望まれる場合、改変されたエンドスタチン遺伝子産物を産生するために欠失又は非保存的改変を工学処理することができる。かかる改変は例えばエンドスタチン遺伝子産物の生物学的機能のうちの単数又は複数のものを改変できる。さらに、かかる改変は、選ばれた宿主細胞内での発現、スケールアップなどにより適したエンドスタチン遺伝子産物を生成するように選択可能である。例えば、システイン残基を欠失させるか又はもう１つのアミノ酸残基と置換させてジスルフィド架橋を除去することができる。
エンドスタチンタンパク質の単数又は複数のドメインに対応するペプチド及び／又はタンパク質ならびに、エンドスタチン又はその一部分、例えばトランケーションされたエンドスタチンタンパク質又はペプチド又はエンドスタチンタンパク質ドメイン、が無関係のタンパク質に融合されている融合タンパク質も同じく本発明の範囲内に入る。かかるタンパク質及びペプチドは以上で開示されているエンドスタチンヌクレオチド配列に基づいて及び／又はここで開示されているエンドスタチンアミノ酸配列に基づいて設計可能である。融合タンパク質は、インビボでエンドスタチンタンパク質若しくはペプチドを安定化させ半減期を延長させるＩｇＦｃ融合；又は融合タンパク質が細胞膜に定着され得るようにするあらゆるアミノ酸配列に対する融合；又はマーカー機能を提供する酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質又はフラグエピトープタンパク質若しくはペプチドに対するエンドスタチンタンパク質ドメインの融合を内含する。
該発明のエンドスタチンタンパク質は、ｃＤＮＡ配列の少なくとも１つのエキソンによりコードされるドメイン又はそのフラグメントが欠失している、エンドスタチンタンパク質配列も内含している。
上述のエンドスタチンタンパク質配列は、分泌のためのエンドスタチン遺伝子産物をターゲティングするシグナル配列を含むドメインを内含することができる。本書で使用されているように、シグナル配列は、分泌及び膜結合タンパク質のＮ末端で発生しアラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン、トリプトファン又はバリンといったような少なくとも約７０％の疎水性アミノ酸残基を含む、長さが少なくとも約１５又は２０個のアミノ酸残基のペプチドを内含する。好ましい実施形態においては、シグナル配列は少なくとも約１０〜４０個、好ましくは約１９〜３４個のアミノ酸残基を含み、少なくとも約６０〜８０％、より好ましくは６５〜７５％、より好ましくは少なくとも約７０％の疎水性残基を有する。シグナル配列は、脂質二重層へかかる配列を含有するタンパク質を導くのに役立つ。
本発明のポリペプチドのシグナル配列を、問題の分泌されたタンパク質又はその他のタンパク質の分泌及び単離を容易にするのに使用することができる。シグナル配列は典型的には、一般に単数又は複数の切断事象における分泌の間に成熟タンパク質から切断される疎水性アミノ酸のコアにより特徴づけられる。かかるシグナルペプチドは、分泌経路を通過するにつれて成熟タンパク質からのシグナル配列の切断を可能にするプロセッシング部位を含む。かくして、該発明は、シグナル配列をもつ記述されたエンドスタチンポリペプチド（すなわち「未成熟」ポリペプチド）ならびに、エンドスタチンシグナル配列自体、及びシグナル配列の不在下でのエンドスタチンポリペプチド（すなわち「成熟」エンドスタチン切断産物）に関する。本発明のエンドスタチンポリペプチドは、上述のような特徴をもつあらゆるシグナル配列及び成熟エンドスタチンポリペプチド配列を含むポリペプチドをさらに含むことができるということを理解すべきである。
本発明のエンドスタチンポリペプチドはさらに、グリコシル化、アセチル化、ミリスチル化及びホスホリル化を含む（ただし、これに制限されるわけではない）翻訳後の修飾を含むことができる。未変性のエンドスタチンタンパク質がかかる修飾を可能にする認識モチーフを有していない場合、修飾されたエンドスタチン遺伝子産物を産生するべく、酵素認識シグナルといったようなモチーフをコードするヌクレオチド配列をエンドスタチン遺伝子内に導入することは当業者にとって日常的なことであると思われる。
エンドスタチン遺伝子産物、そのペプチドフラグメント及び融合タンパク質は、当該技術分野において周知の技術を用いて組換え型ＤＮＡ技術によって産生可能である。かくして、エンドスタチン遺伝子配列を含む核酸を発現することにより本発明のエンドスタチン遺伝子 ポリペプチド、ペプチド、融合ペプチド及び融合ポリペプチドを調製するための方法が本書で記述されている。当業者にとって周知である方法を使用して、エンドスタチン遺伝子産物コーディング配列及び適切な転写及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換え型ＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。例えば、Sambrook et al.，１９８９、上掲書及びAusubel, et al., １９８９、上掲書を参照のこと。或いは、例えば合成装置を用いて、エンドスタチン遺伝子産物配列をコードする能力をもつＲＮＡを化学的に合成することもできる。例えば、「オリゴヌクレオチド合成」１９８４，Gait, ed., ＩＲＬ Press, Oxford内に記述された技術を参照のこと。
本発明のエンドスタチン遺伝子コーディング配列を発現するために、さまざまな宿主発現ベクター系を利用することができる。かかる宿主発現系は、問題のコーディング配列を産生しその後精製することのできるビヒクルを表わすが、適切なヌクレオチドコーディング配列で形質転換又はトランスフェクトされた場合にインサイチュで本発明のエンドスタチン遺伝子産物を示すことができる細胞を表わすこともできる。これらには、エンドスタチン遺伝子産物コーディング配列を含有する組換え型バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えばE.coli、B.subtilis）といった微生物；エンドスタチン遺伝子産物コーディング配列を含有する組換え型酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばSaccharomyces、Pichia）；エンドスタチン遺伝子産物コーディング配列を含有する組換え型ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換え型ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、又はエンドスタチン遺伝子産物コーディング配列を含有する組換え型プラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；又は哺乳動物細胞のゲノム（例えばメタロチオネインプロモータ）から又は哺乳動物ウイルス（例えばアデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス ７．５Ｋプロモータ）から誘導されたプロモータを含有する組換え型発現構築物を宿す哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が含まれるが、それに制限されるわけではない。
細菌系内では、発現されつつあるエンドスタチン遺伝子産物のために意図された用途に応じて数多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、エンドスタチンタンパク質の医薬組成物の生成のため又はエンドスタチンタンパク質に対する抗体を産生させるためにこのようなタンパク質を大量に産生すべきである場合、例えば、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが望ましいかもしれない。かかるベクターには、融合タンパク質が産生されるような形でベクター内の同一枠内でｌａｃＺコーディング領域とエンドスタチン遺伝子産物コーディング配列を個別にライゲートすることのできるE.coli発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., １９８３，ＥＭＢＯＪ．２，１７９１）；ｐＩＮベクター（Inouye及びInouye, １９８５，Nucleic Acids Res, １３，３１０１−３１０９；Van Heeke及びSchuster, １９８９，J. Biol. Chem. ２６４，５５０３−５５０９）などが含まれるがこれらに制限されるわけではない。ｐＧＥＸベクターを用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来性ポリペプチドを発現することもできる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに対する吸着とそれに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解細胞から容易に精製可能である。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出できるような形でトロンビン又はＸａ因子プロテアーゼ切断部位を内含するように設計されている。
昆虫系においては、外来性遺伝子を発現するためのベクターとしてAutographa californica, 核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。該ウイルスは、Spodoptera frugiperda 細胞内で成長する。エンドスタチン遺伝子コーディング配列を、個々にウイルスの可欠領域（例えばポリヘドリン遺伝子）内にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモータ（例えばポリヘドリンプロモータ）の制御下に置くことが可能である。エンドスタチン遺伝子コーディング配列をうまく挿入した結果として、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、閉塞されていない組換え型ウイルス（すなわちポリヘドリン遺伝子によりコードされたタンパク質様外皮が欠如したウイルス）が産生されることになる。これらの組換え型ウイルスは次に、挿入された遺伝子が内部で発現されるSpodoptera frugiperda 細胞を感染させるのに使用される（例えば、Smith, et al., １９８３，J. Virol. ４６，５８４；Smith, 米国特許第４，２１５，０５１号明細書を参照のこと）。
哺乳動物の宿主細胞においては、数多くのウイルスベースの発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが使用される場合には、問題のエンドスタチン遺伝子コーディング配列を、例えば後期プロモータ及び３部から成るリーダー配列といったアデノウイルス転写／翻訳制御複合体にライゲートすることができる。このキメラ遺伝子を次にインビトロ又はインビボ組換えによりアデノウイルスゲノム内に挿入することができる。ウイルスゲノムの可欠領域（例えば領域Ｅ１又はＥ３）内への挿入は、感染した宿主内で生存可能でかつエンドスタチン遺伝子産物を発現する能力をもつ組換え型ウイルスを結果としてもたらすことになる（例えば Logan及びShenk, １９８４，Proc. Natl. Acad. Sci. USA８１，３６５５−３６５９を参照のこと）。挿入されたエンドスタチン遺伝子産物コーディング配列の効率のよい翻訳のためには特異的開始シグナルも必要であり得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列が含まれる。開始コドン及び隣接する配列を含む全エンドスタチン遺伝子が適切な発現ベクター内に挿入される場合には、付加的な翻訳制御シグナルは全く必要でないかもしれない。エンドスタチン遺伝子コーディング配列の一部分のみが挿入される場合には、恐らくはＡＴＧ開始コドンを含む類似の外因性翻訳制御シグナルが提供されなくてはならない。さらに開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするため所望のコーディング配列の読取り枠と一致していなくてはならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方のさまざまな起源に由来するものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサ要素、転写ターミネータなどの内含により高めることができる（Bittner et al., １９８７，Methods in Enzymol. １５３，５１６−５４４を参照のこと）。
さらに、挿入された配列の発現を調節するか又は遺伝子産物を望まれた特異的な形で修飾しプロセッシングする宿主細胞菌株を選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾（例えばグリコシル化）及びプロセッシング（例えば切断）は該タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後のプロセッシング及び修飾のための特徴的及び特異的メカニズムを有する。発現された外来性タンパク質の適正な修飾及びプロセッシングを確保するために適切な細胞系列又は宿主系を選択することができる。この目的で、一次転写物の適正なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化、及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を使用することができる。かかる哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、及びＷＩ３８が含まれるがこれらに制限されるわけではない。
組換え型タンパク質の長期にわたる高収量産生のためには、安定した発現が好ましい。例えば、エンドスタチン遺伝子産物を安定した形で発現する細胞系列を工学処理することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなくむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えばプロモータ、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）により制御されたＤＮＡ及び選択マーカーで形質転換され得る。外来性ＤＮＡの導入の後、工学処理された細胞を富化した培地内で１〜２日成長させることができ、次に選択培地に切換える。組換え型プラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体中にプラスミドを安定した形で組込み成長してそれ自体クローニングを受け細胞系列内に拡張され得る増殖巣を形成させることができるようにする。この方法は、エンドスタチン遺伝子産物を発現する細胞系列を工学処理するために有利に使用可能である。かかる工学処理された細胞系列は、エンドスタチン遺伝子産物の内因性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニング及び評価において特に有用であり得る。
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler, et al.,１９７７，Cell １１，２２３）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska及びSzybalski, １９６２，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ４８，２０２６）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, et al., １９８０，Cell２２，８１７）遺伝子を含む（ただし、これに制限されるわけではない）数多くの選択系をそれぞれｔｋ−hgprt−又はaprt-細胞内で使用することができる。同様に、以下の遺伝子のための選択の基礎として、代謝拮抗物質に対する耐性を使用することができる：メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（Wigler, et al., １９８０，Proc. Natl. Acad. Sci. USA７７，３５６７；O’Hare, et al.,１９８１，Proc. Natl. Acad. Sci, USA ７８，１５２７）；マイコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（Mulligan 及び Berg, １９８１，Proc. Natl. Acad. Sci. USA７８，２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するneo（Colberre-Garapin, et al.,１９８１，J. Mol. Biol. １５０，１）及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロ（Santerre, et al.,１９８４，Gene３０，１４７）。
或いは、発現されつつある融合タンパク質に特異的な抗体を利用することによってあらゆる融合タンパク質を容易に精製することができる。例えば、Janknecht et al.が記述した系は、ヒト細胞系列内で発現された未変性の融合タンパク質の容易な精製を可能にする（janknecht, et al.,１９９１，Proc. Natl. Acad. Sci. USA８８，８９７２−８９７６）。この系においては、遺伝子の読取り枠が６つのヒスチジン残基から成るアミノ末端タグに翻訳により融合されるような形でワクシニア組換えプラスミド内に問題の遺伝子がサブクローニングされる。組換え型ワクシニアウイルスに感染した細胞からの抽出物がＮｉ2+ニトリロ酢酸アガロースカラム上に添加され、ヒスチジンでタグ付けされたタンパク質がイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出される。
或いは、挿入された調節要素が内因性エンドスタチン遺伝子と作動可能な形で連結されるように、安定した細胞系列又はクローニングされた微生物のゲノム内に異種ＤＮＡ調節要素を挿入することにより、細胞、細胞系列又は微生物内の内因性エンドスタチン遺伝子の発現特性を修飾することができる。例えば、通常「転写的にサイレントである」内因性エンドスタチン遺伝子、すなわち細胞、細胞系列又は微生物の中で通常発現されていないか又は非常に低いレベルでのみ発現されているエンドスタチン遺伝子を、その細胞、細胞系列又は微生物内で通常は発現されている遺伝子産物の発現を促進する能力をもつ調節要素を挿入することにより活性化することができる。或いは、転写的にサイレントである内因性エンドスタチン遺伝子を、あらゆる細胞型に働く無差別の制御要素の挿入により活性化させることができる。
当業者にとっては周知であり、例えば１９９１年５月１６日に公示されたＰＣＴ国際公開第９１／０６６６７号パンフレット；Chappel の米国特許第５，２７２，０７１号明細書中に記述されている標的された相同組換えといった技術を用いて、内因性エンドスタチン遺伝子と作動可能な形で連結されるように、安定した細胞系列又はクローニングされた微生物の中に異種調節要素を挿入することができる。
エンドスタチン遺伝子産物は、トランスジェニック動物の体内でも発現可能である。エンドスタチントランスジェニック動物を生成するために、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、並びに非ヒト霊長類例えばヒヒ、サル及びチンパンジーを含む（ただし、これに制限されるわけではない）あらゆる種の動物を使用することができる。本書で使用する「トランスジェニック」という語は、異なる種からのエンドスタチン遺伝子配列を発現する動物（例えばヒト又はイヌエンドスタチン配列を発現するマウス）、ならびに内因性（すなわち同じ種）エンドスタチン配列を過剰発現するように遺伝子工学処理された動物、又はもはや内因性エンドスタチン遺伝子配列を発現しないように遺伝子工学処理された動物（すなわち「ノックアウト」動物）、及びそれらの子孫を意味する。
当該技術分野において既知のあらゆる技術が、トランスジェニック動物の創始系列を産生する目的で動物の体内にエンドスタチン遺伝子トランス遺伝子を導入するために使用可能である。かかる技術には、前核マイクロインジェクション（Hoppe及びWagner, １９８９，米国特許第４，８７３，１９１号明細書）；生殖細胞系列内へのレトロウイルスを媒介とする遺伝子導入（van der Putten, et al.,１９８５，Proc. Natl. Acad. Sci., USA８２，６１４８−６１５２）；胚幹細胞内の遺伝子ターゲティング（Thompson, et al., １９８９，Cell５６，３１３−３２１）；胚のエレクトロポーレーション（Lo, １９８３，Mol. Cell. Biol.３，１８０３−１８１４）及び***を媒介とする遺伝子導入（Lavitrano et al., １９８９，Cell５７，７１７−７２３）が含まれるがこれらに制限されるわけではない。（かかる技術の再考のためには、Gordon １９８９，Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. １１５，１７１−２２９を参照のこと）。
エンドスタチントランス遺伝子を含むトランスジェニック動物クローンを作成するためには、例えば静止状態に至るように誘発された培養胚、胎児又は成熟細胞に由来する核の除核卵母細胞内への核移植といった当該技術分野において既知のあらゆる技術を使用することができる（Campbell, et al., １９９６，Nature３８０，６４−６６；Wilmut, et al., Nature ３８５，８１０−８１３）。
本発明は、その全ての細胞内にエンドスタチントランス遺伝子を担持するトランスジェニック動物ならびに、その全てではなく一部分の中にトランス遺伝子を担持する動物（すなわちモザイク動物）を提供する。トランス遺伝子は、単一のトランス遺伝子としてか又はコンカテマー、例えば頭部−頭部タンデム又は頭部−尾部タンデム）の形で組込まれ得る。トランス遺伝子は同じく、例えばLasko et al.（１９９２，Proc. Natl. Acad. Sci. USA８９，６２３２−６２３６）の教示に従って特定の細胞型の中に選択的に導入されその中で活性化されてもよい。このような細胞型特異的活性化のために必要とされる制御配列は、問題の特定の細胞型に依存し、当業者には明らかとなることであろう。エンドスタチン遺伝子トランス遺伝子を内因性エンドスタチン遺伝子の染色体部位内に組込むことが望まれる場合、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡単に言うと、かかる技術が利用されなくてはならない場合、内因性エンドスタチン遺伝子に相同ないくつかのヌクレオチド配列を含有するベクターが、内因性エンドスタチン遺伝子のヌクレオチド配列の中に染色体配列との相同組換えを介して組込まれ、その機能を分析する目的で設計される。トランス遺伝子は、例えばGu.et al.（１９９４，Science ２６５，１０３−１０６）の教示に従うことにより、特定の細胞型内に選択的に導入され、かくしてその細胞型のみの中で内因性エンドスタチン遺伝子を不活性化することもできる。かかる細胞型特異的不活性化に必要とされる制御配列は、問題の特定の細胞型に依存し、当業者には明白となるだろう。
トランスジェニック動物がひとたび生成された時点で、組換え型エンドスタチン遺伝子の表現型発現は、標準的技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、トランス遺伝子の組込みが行なわれたか否かをアッセイするべく動物の組織を分析するためにサザンブロット分析又はＰＣＲ技術により達成され得る。トランスジェニック動物の組織内のトランス遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルも又、動物から得た組織試料のノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析及びＲＴ−ＰＣＲ（リバーストランスクリプターゼＰＣＲ）を含む（ただし、これに制限されるわけではない）技術を用いて評価可能である。エンドスタチン遺伝子発現組織の試料は、エンドスタチントランス遺伝子産物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的に評価することもできる。
エンドスタチン遺伝子産物又はそのペプチドフラグメントをさまざまな用途のために調製することが可能である。例えばかかる遺伝子産物又はそのフラグメントは、診断アッセイの中で抗体の生成のために、或いは癌といったような血管新生関連障害の制御に関与するその他の細胞内又は細胞外遺伝子産物のマッピング及び同定のために使用することができる。かかるエンドスタチン遺伝子産物には、エンドスタチン遺伝子産物、特に単数又は複数の疎水性ドメインが欠失させられるような形で修飾されているエンドスタチン遺伝子産物の単数又は複数のドメインに対応するペプチド又はポリペプチドといったような可溶性誘導体が含まれるがこれらに制限されるわけではない。或いは、エンドスタチンタンパク質に対する抗体又は（Ｆａｇ フラグメントを含む）エンドスタチン遺伝子産物を模倣する抗イディオタイプ抗体、アンタゴニスト又はアゴニストを、癌といった血管新生関連障害を治療する目的で使用することができる。さらにもう１つのアプローチでは、かかるエンドスタチン遺伝子産物をインビボで発現するべく宿主細胞を遺伝子工学処理するため、かかるエンドスタチン遺伝子産物をコードするヌクレオチド構築物を使用することができる。これらの遺伝子工学処理された細胞は、体内で「バイオリアクター」として機能し、エンドスタチン遺伝子産物、エンドスタチンペプチド又は可溶性エンドスタチンポリペプチドの持続的な供給を送達することができる。
本書に記述されているのは、単数又は複数のエンドスタチン遺伝子産物エピトープ又は該遺伝子産物の保存された変異体又はペプチドフラグメントのエピトープを特異的に認識する能力をもつ抗体産生のための方法である。
かかる抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、イヌ、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリにより作成されたフラグメント、抗イディオタイプ（anti−Ｉｄ）抗体及び以上のもののいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれ得るが、これらに制限されるわけではない。かかる抗体は、例えば、生物試料内のエンドスタチン遺伝子産物の検出において使用され得、従ってエンドスタチン遺伝子産物の異常レベルについて及び／又はかかる遺伝子産物の異常な形態の存在について対象をテストできる診断又は予後診断技術の一部として利用可能である。かかる抗体は同様にエンドスタチン遺伝子産物レベル及び／又は活性に対する試験化合物の効果の評価のため、以下で記述するような化合物スクリーニングスキームと併せて利用することもできる。さらに、かかる抗体は、例えば、対象の体内へのその導入に先立ち正常な及び／又は工学処理されたエンドスタチン発現細胞を評価するため、以下に記述されている遺伝子療法技術と併用することができる。
異常なエンドスタチン遺伝子産物活性の阻害のための方法として、抗エンドスタチン遺伝子産物抗体を付加的に使用することができる。かくして、かかる抗体は例えば癌といった血管新生関連障害のための治療方法の一部として利用され得る。
エンドスタチン遺伝子産物に対する抗体の産生のためには、エンドスタチン遺伝子産物又はその一部分を注射することによりさまざまな宿主動物を免疫化することができる。かかる宿主動物としては、ほんの少しだけ挙げるだけでもウサギ、マウス及びラットが含まれうるがこれらに制限されるわけではない。宿主の種に応じて免疫応答を増大させるために、フロインド（完全及び不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムといったようなミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールといった界面活性物質及びＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌）及びCorynebacterium parvumといった潜在的に有用なヒトアジュバントを含む（ただし、これに制限されるわけではない）さまざまなアジュバントを使用することができる。
ポリクローナル抗体は、エンドスタチン遺伝子産物又はその抗原性機能的誘導体といったような抗原で免疫化された動物の血清から得られた抗体分子の不均質集団である。ポリクローナル抗体の産生のためには、以上に記述されているような宿主動物を、同じく上述の通りのアジュバントで補足されたエンドスタチン遺伝子産物の注射によって免疫化することが可能である。
特定の抗原に対する抗体の均質集団であるモノクローナル抗体は、培養中の連続した細胞系列による抗体分子の産生を提供するあらゆる技術により得ることができる。これらには、Kohler 及びMilsteinのハイブリドーマ技術（１９７５，Nature ２５６，４９５−４９７；及び米国特許第４，３７６，１１０号明細書）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al., １９８３，Immunology Today４，７２；Cole et al., １９８３，Proc. Natl. Acad. Sci.USA８０，２０２６−２０３０）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al.,１９８５，Monoclonal Antibodies And Cancer Theray Alan R, Liss, Inc., pp.７７−９６）が含まれるがこれらに制限されるわけではない。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含むあらゆる免疫グロブリンクラス及びあらゆるサブクラスのものであり得る。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養され得る。インビボでの高力価のｍＡｂｓの産生のためこれらは現在好ましい産生方法となっている。
さらに、標準の組換え型ＤＮＡ技術を用いて作ることのできるヒト及び非ヒトの両方の部分を含むキメラ及びヒト化モノクローナル抗体といった組換え型抗体が、本発明の範囲内に入る。キメラ抗体は、マウスｍＡｂ及びヒト免疫グロブリン定常領域に由来する可変領域を有するものといった、異なる動物種から異なる部分が誘導されている１つの分子である（例えば全体が本書に参考として内含されている Cabilly et al. 米国特許第４，８１６，５６７号明細書及びBoss et al. 米国特許第４，８１６，３９７号明細書を参照のこと）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の単数又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である。（例えば全体が本書に参考として内含されている Queenの米国特許第５，５８５，０８９号明細書を参照のこと）。かかるキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、例えばＰＣＴ国際公開第８７／０２６７１号パンフレット；欧州特許出願第１８４，１８７号明細書；欧州特許出願第１７１，４９６号明細書；欧州特許出願第１７３，４９４号明細書；ＰＣＴ国際公開第８６／０１５３３号明細書；米国特許第４，８１６，５６７号明細書；欧州特許出願第１２５，０２３号明細書；Better et al.（１９８８）Science２４０：１０４１−１０４３；Llu et al.（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８４：３４３９−３４４３；Liu et al.（１９８７）J. Immunol. １３９：３５２１−３５２６；Sun et al.（１９８７）Proc. Natl. Acad.Sci. USA ８４：２１４−２１８；Nishimura et al.（１９８７）Canc.Res.４７：９９９−１００５；Wood et al.（１９８５）Nature ３１４：４４６−４４９；及びShaw et al.（１９８８）J. Natl. Cancer lnst. ８０：１５５３−１５５９）；Morrison（１９８５）Science２２９：１２０２−１２０７；Oi et al.（１９８６）Bio/Techniques４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号明細書，Jones et al.（１９８６）Nature ３２１：５５２−５２５；Verhoeyan et al.（１９８８）Science２３９；１５３４；及びBeidler et al（１９８８）J. Immunol, １４１；４０５３−４０６０の中で記述されている方法を用いて、当該技術分野において既知の組換え型ＤＮＡ技術により産生可能である。
ヒトの患者の治療的処置のためには、完全にヒトの抗体が特に望ましい。かかる抗体は、例えば内因性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現する能力をもたないもののヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生可能である。トランスジェニックマウスは、例えば本発明のポリペプチドの全て又は一部分といった選択された抗原で通常のやり方で免疫化される。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが宿すヒト免疫グロブリントランス遺伝子はＢ細胞分化の間に再構成し、その後クラススイッチ及び体細胞突然変異を受ける。かくしてこのような技術を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概論については、Lonberg 及びHuszar（１９９５，Int. Rev. Immunol.１３；６５−９３）を参照のこと。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術及びかかる抗体を産生するためのプロトコルの詳細な論述については、例えば米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，５６９，８２５号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書；米国特許第５，５４５，８０６号明細書を参照のこと。さらに、Abgenix, Inc.（Fremont, CA）といったような会社を雇って、上述のものに類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供させることも可能である。
選択されたエピトープを認識する完全にヒトの抗体を「誘導選択」と呼ばれる技術を用いて生成することができる。このアプローチでは、例えばマウス抗体といった選択された非ヒトモノクローナル抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択が誘導される（Jespers et al,（１９９４）Bio/technology １２：８９９−９０３）。
或いは、１本鎖抗体の産生のために記述されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号明細書；Bird, １９８８，Science２４２，４２３−４２６；Huston, et al.,１９８８, Proc.Natl. Acad. Sci. USA ８５，５８７９−５８８３；及びWard, et al.,１９８９，Nature ３３４，５４４−５４６）を、エンドスタチン遺伝子産物に対する１本鎖抗体を産生するように適合させることができる。アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖及び軽鎖フラグメントを連結させ、その結果として１本鎖ポリペプチドを得ることにより、１本鎖抗体が形成される。
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の技術により生成可能である。例えば、かかるフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により産生可能なＦ（ａｂ’）２フラグメント及びＦ（ａｂ’）２ フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成可能なＦａｂフラグメントが含まれるがこれらに制限されるわけではない。或いは、所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定を可能にするためにＦａｂ発現ライブラリを構築することができる（Huse, et al.,１９８９，Science, ２４６，１２７５−１２８１）。
本書に記述されているのは、エンドスタチン遺伝子配列、そのペプチドフラグメント及び融合タンパク質を含めたエンドスタチン遺伝子産物並びにエンドスタチン遺伝子産物及びそのペプチドフラグメントに対する抗体のさまざまな利用分野である。かかる利用分野には、例えば、癌などの血管新生関連障害の予後及び診断評価、並びに、以下のセクションで記述されているようなかかる障害に対する素因をもつ対象の同定が含まれる。付加的には、かかる利用分野は、以下で記述されているようなエンドスタチン遺伝子産物の合成若しくは活性及び／又はエンドスタチン遺伝子の発現を調節する化合物の同定のため、並びに以下に記述するような例えば癌といった血管新生関連障害の治療のための方法が含まれている。
さらに、そのペプチドフラグメント及び融合タンパク質を含めたエンドスタチン遺伝子配列及び遺伝子産物並びにエンドスタチン遺伝子産物及びそのペプチドフラグメントに対する抗体は、血管新生関連障害及びプロセスにおいてエンドスタチンがもち得る役目とは無関係の目的のために利用される。例えば、ペプチドフラグメントを含むエンドスタチン遺伝子産物ならびにエンドスタチン特異的抗体を、もう１つの問題のタンパク質の回収、検出又は位置特定を容易にするべく融合タンパク質の構築のために使用することができる。さらに、エンドスタチン遺伝子及び遺伝子産物を遺伝子マッピング、すなわち遺伝子地図の精密化のために使用することができる。例えば、エンドスタチンに特異的な抗体を、ヒト染色体又はその一部分を含有する体細胞ハイブリッド内のヒトエンドスタチンの発現を検出するためのプローブとして使用することができる。かかるエンドスタチン特異的抗体は、エンドスタチン染色体領域を含む細胞を同定するために使用可能である。この方法は、例えば、染色体のこの領域に対して問題の遺伝子又は形質を位置特定するために使用可能である。
染色体地図を作成し精密化するために、エンドスタチン遺伝子配列及び遺伝子産物を使用することが可能である。癌を含む（ただし、これに制限されるわけではない）さまざまな血管新生関連障害に関連する染色体間隔をさらに精密化するための新しい遺伝子マーカーを開発するのにエンドスタチン配列を使用することができる。当業者には明らかとなるように、疾病と関連する遺伝子間隙内の核酸配列を、マイクロサテライトといったような新しいマーカーについて走査することができる。単純配列反復（ＳＳＲ）としても知られているマイクロサテライトは、１〜５個のヌクレオチドのジ−、トリ−又はテトラヌクレオチド反復から成る超可変的タンデム配列反復である。かかるマイクロサテライトは、ヒトゲノム全体を通して遍在的に分布し、反復長内できわめて可変的であり、きわめて多型である傾向にあることから、連結研究のためのすぐれた遺伝子マーカーを作る。比較的一般的なマイクロサテライト（例えば（ＣＡ）nジヌクレオチド反復）はおよそ３００〜５００ｋｂ毎に発生する。マイクロサテライト反復に加えて、該領域は、ミニサテライト（９〜６４個のヌクレオチド反復）といったような精密マッピングに有用な多型部位のその他のタイプ、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）及びはるかに発生頻度の低い単一ヌクレオチド多型について走査され得る。新しい配列内でひとたび多型部位が同定された時点で、多型部位にフランキングするＰＣＲプライマが合成され、マイクロサテライト又はその他の多型部位を増幅するために用いられる。このとき、ポリアクリルアミド配列決定ゲル上でＰＣＲ産物を分解することにより反復の長さを決定することができる。次に、反復の頻度及び可変性を見極めるために単純配列長多型（ＳＳＬＰ）についてヒト集団由来のゲノムＤＮＡを分析することができる。高品質ＳＳＬＰがひとたび発見された時点で、癌といったような血管新生関連障害が新しいマーカーに連結されているか否かを見極めるために、罹患した集団について連結分析を実施することができる。サザンブロットハイブリダイゼーション及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）といったその他の技術を、ゲノム集団内の多型を分析するためにＰＣＲベースの方法に加えて又はこれと併せて使用することができる（Current Protocols in Human Genetics, Dracopoli et al. (eds.) John Wiley & Sons, 1998を参照）。
もう１つの実施態様においては、融合タンパク質の構築のために、エンドスタチン遺伝子、タンパク質或いはそのフラグメント又はドメインを使用することができる。最後に、エンドスタチン核酸及び遺伝子産物は、食品添加物又は化粧品用の核酸、タンパク質及びアミノ酸の補足的供給源といったような一般的な用途にも用いられる。
本書で同定されているｃＤＮＡ配列（及び対応する完全遺伝子配列）の部分又はフラグメントを、ポリヌクレオチド試薬として数多くのやり方で使用することができる。例えば、これらの配列は、（ｉ）エンドスタチン遺伝子特異的突然変異又は多型についてスクリーニングするため、（ｉｉ）染色体上でそのそれぞれの遺伝子をマッピングし、かくして遺伝的疾患に関連する遺伝子領域を位置特定するため；（ｉｉｉ）わずかな生物試料から個々の生体を同定するため（組織型の決定）；及び（ｉｖ）生物試料の法医学的同定を補助するために使用することができる。これらの利用分野については、以下のサブセクションの中で記述されている。
エンドスタチン遺伝子特異的突然変異又は多型（エンドスタチン遺伝子をフランキングする多型、例えば特定のエンドスタチン対立遺伝子と同時分離するものを含む）の存在についてスクリーニングするため及びエンドスタチン核酸配列のレベルを検出及び／又はアッセイするためにさまざまな方法を利用することができる。
エンドスタチン遺伝子の内部の又はこれらにフランキングする突然変異又は多型を数多くの技術を利用することによって検出することができる。問題のエンドスタチン遺伝子を発現するあらゆる細胞又はあらゆる有核細胞に由来する核酸を、かかるアッセイ技術のための出発点として使用でき、当業者にとっては周知のものである標準的な核酸調製手順に従って単離可能である。
点突然変異、挿入、欠失、反転、転座及び染色体再構成を含むエンドスタチン遺伝子構造が関与する異常を検出するために、生物学的試料のハイブリダイゼーション又は増幅アッセイの中でエンドスタチン核酸配列を使用することができる。かかるアッセイには、サザン分析、１本鎖立体配座多型分析（ＳＳＣＰ）及びＰＣＲ分析が含まれ得るが、これらに制限されるわけではない。
エンドスタチン遺伝子特異的突然変異又は多型の検出のための診断方法は例えば、エンドスタチン遺伝子の内部の又はそれにフランキングするその相補的配列に対するこれらの試薬の特異的アニーリングに有利な条件下で、上述のもののような組換え型ＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子又はその縮重変異体を含めた単数又は複数の標識された核酸試薬と、患者の試料又はその他の適切な細胞供給源に由来するものといったような１つの試料から得られた核酸を接触させ、インキュベートさせることを含むことができる。本発明の診断方法はさらに、エンドスタチン遺伝子の単一のヌクレオチド突然変異又は多型の検出のために核酸を接触させインキュベートさせることをも包含している。好ましくは、エンドスタチン遺伝子の内部のこれらの核酸試薬配列又はエンドスタチン遺伝子にフランキングする染色体核酸配列の長さは１５〜３０ヌクレオチドである。
インキュベーションの後、全てのアニーリングされていない核酸は、核酸：エンドスタチン分子ハイブリッドから除去される。かかる分子が存在する場合にはハイブリッド形成した核酸の存在が次に検出される。かかる検出スキームを用いて、例えば膜といった固体支持体に対して或いはマイクロタイタープレート又はポリスチレンビーズ上といったようなプラスチック表面上に、問題の細胞型又は組織からの核酸を固定化することができる。この場合、インキュベーションの後、上述のタイプのアニールされていない標識済みの核酸試薬が容易に除去される。残りのアニールされた標識済みエンドスタチン核酸試薬の検出が、当業者にとって周知の標準的技術を用いて達成される。核酸試薬をアニールさせたエンドスタチン遺伝子配列を正常なエンドスタチン遺伝子配列から予想されるアニーリングパターンと比較して、エンドスタチン遺伝子突然変異が存在するか否を見極めることができる。
好ましい実施態様においては、基材又は「遺伝子チップ」に固定化されたエンドスタチン核酸配列のマイクロアッセイを用いることにより、エンドスタチン突然変異又は多型を検出することができる（例えばCronin et al., １９９６，Human Mutation７：２４４−２５５を参照のこと）。
患者の試料又はその他の適切な細胞供給源中のエンドスタチン遺伝子特異的核酸分子（又はエンドスタチンフランキング配列）検出のための代替的な診断方法には、例えばＰＣＲ（Mullis, １９８７，米国特許第４，６８３，２０２号明細書中に記されている実験的実施態様）によるその増幅とそれに続いて例えば以上で列挙したような当業者にとって周知の技術を用いて増幅済み分子を分析することが関与し得る。疾病をひき起こすエンドスタチン対立遺伝子と連鎖不均衡状態にあるエンドスタチン遺伝子突然変異又は多型が存在するか否かを見極めるために、増幅されつつある核酸がエンドスタチン遺伝子の正常なコピーのみを含んでいた場合に予想されるものと、結果として得られた増幅済み配列を比較することができる。
さらに、エンドスタチン遺伝子突然変異を担持する個々の生体を同定するために、周知の遺伝子型特定技術を実施することができる。かかる技術には例えば、使用される特定の制限酵素のための認識部位の１つにおける配列変動が関与する制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）の使用が含まれる。
さらに、制限酵素部位の間の可変的数の短かくタンデム反復されたＤＮＡ配列の存在を利用した、エンドスタチン遺伝子特異的突然変異体の同定のために利用可能な改良型のＤＮＡ多型分析方法が記述された。例えば、Weber（米国特許第５，０７５，２１７号明細書）は（ｄＣ−ｄＡ）n−（ｄＧ−ｄＴ）n短タンデム反復のブロック内の長さ多型に基づいたＤＮＡマーカーについて記述している。（ｄＣ−ｄＡ）n−（ｄＧ−ｄＴ）nブロックの平均的間隔は、３０，０００〜６０，０００ｂｐであると推定される。密に間隔どりされたマーカーが高頻度の同時形質遺伝を示し、例えばエンドスタチン遺伝子内部の突然変異といった遺伝的突然変異の同定及びエンドスタチン突然変異に関連する疾患及び障害の診断において極めて有用である。
同様にCaskey et al.（米国特許第５，３６４，７５９号明細書）は、短かいトリ及びテトラヌクレオチド反復配列を検出するためのＤＮＡプロファイリングアッセイについて記述している。該プロセスには、エンドスタチン遺伝子といったような問題のＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを増幅し、かつ反復配列を標識して個々の生体のＤＮＡの遺伝子型地図を形成することが含まれる。
共に１つの集団中でかなり高い頻度で存在している２つの対立遺伝子を有する双対立遺伝子ＳＮＰ又は双対立遺伝子マーカーを含むその他の当該技術分野において周知の方法を、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の同定のために使用することが可能である。ＳＮＰを検出するための従来の技術としては、例えば、従来のドットブロット分析、ＳＳＣＰ分析（例えば Orita et al.,１９８９，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：２７６６−２７７０）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ヘテロ２重鎖分析、ミスマッチ切断検出、及び当該技術分野において周知のその他の日常的技術（例えばSheffield et al., １９８９，Proc. Natl. Acad. Sci. ８６：５８５５−５８９２；Grompe, １９９３，Nature Genetics５；１１１−１１７）が含まれる。ＳＮＰを検出しマッピングする代替的な好ましい方法は、標的ＤＮＡのＳＮＰ部位が単一ヌクレオチドプライマ伸長反応（single nucleotide primer extension reaction）によって検出されるマイクロ配列決定技術を含む（例えばGoelet et al.,ＰＣＴ国際公開第９２／１５７１２号パンフレット；Mundy 米国特許第４，６５６，１２７号明細書；Vary 及びDiamond,米国特許第４，８５１，３３１号明細書；Cohen et al., ＰＣＴ国際公開第９１／０２０８７号パンフレット；Chee et al., ＰＣＴ国際公開第９５／１１９９５号パンフレット；Landegren et al., １９８８，Science ２４１：１０７７−１０８０；Nicerson et al.,１９９０，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.８７：８９２３−８９２７；Pastinen et al.,１９９７，Genome Res.７：６０６−６１４；Pastinen et al., １９９６，Clin, Chem. ４２：１３９１−１３９７；Jalanko et al.,１９９２， Clin. Chem. ３８：３９−４３；Shumaker et al., １９９６，Hum. Mutation ７：３４６−３５４；Caskey et al., ＰＣＴ 国際公開第９５／００６６９号パンフレットを参照のこと）。
エンドスタチン発現レベルも、遺伝子発現のレベルについて最初にアッセイすることによって決定可能である。例えば、肝臓といったようなエンドスタチン遺伝子を発現するものとして知られているか又はその疑いのある細胞型又は組織由来のＲＮＡを、以上で記述されているようなハイブリダイゼーション又はＰＣＲ技術を利用して単離及び試験することができる。単離された細胞は、細胞培養又は対象に由来することができる。培養から取出した細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子治療技術の一部として、或いはエンドスタチン遺伝子の発現に対する化合物の効果をテストするため、使用すべき細胞の評価において必要な段階であり得る。
かかる検出スキームの１実施態様においては、ｃＤＮＡ分子は問題のＲＮＡ分子から（例えばｃＤＮＡ内へのＲＮＡ分子の逆転写によって）合成される。このとき、ｃＤＮＡ内部の１配列が、ＰＣＲ増幅反応などの核酸増幅反応のための鋳型として使用される。この方法の逆転写及び核酸増幅段階における合成開始試薬（例えばプライマ）として使用される核酸試薬は、上述のエンドスタチン遺伝子核酸試薬の中から選択される。かかる核酸試薬の好ましい長さは、少なくとも９〜３０ヌクレオチドである。増幅済み産物の検出のためには、核酸増幅は、放射活性物質で又はそれ以外のもので標識されたヌクレオチドを用いて実施できる。或いは、標準的臭化エチジウム染色によって又はその他の何らかの適切な核酸染色方法を利用することによって、産物を視覚化できるような形で充分な増幅済み産物を作ることが可能である。
さらに、インサイチュで、すなわちいかなる核酸精製も必要でないように生検又は切除から得られた対象の組織の組織切片（固定及び／又は凍結されたもの）に対し直接的に、かかるエンドスタチン遺伝子発現アッセイを実施することが可能である。上述のもののような核酸試薬を、このようなインサイチュ手順のためのプローブ及び／又はプライマとして使用し得る（例えばNuovo, G.J.,１９９２，“PCR in Situ Hybridization：Protocols And Applications”、Raven Press, NY）。
或いは、適切な細胞を充分量得ることができる場合、エンドスタチン遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルを決定するために標準的ノーザン分析を実施することもできる。
１つの遺伝子の配列（又は配列の一部分）がひとたび単離された時点で、染色体上の遺伝子の場所をマッピングするためにこの配列を使用することができる。従って、本書に記述されている核酸分子又はそのフラグメントを使用して染色体上の対応する遺伝子の場所をマッピングすることができる。染色体に対する配列のマッピングは、疾病に関連する遺伝子とこれらの配列を相関させる上での１つの重要な段階である。
簡単に言うと、本発明の遺伝子の配列から（好ましくは長さが１５〜２５ｂｐの）ＰＣＲプライマを調製することにより染色体に対し遺伝子をマッピングすることができる。ゲノムＤＮＡ内の２つ以上のエクソンにまたがらないプライマを迅速に選択しかくして増幅プロセスを単純化するために、本発明の遺伝子の配列のコンピュータ解析を使用することが可能である。そして、これらのプライマは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用可能である。該遺伝子配列に対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅済みフラグメントを生成することになる。この技術を再考するためには、D’ Eustachio et al.（１９８３，Science, ２２０；９１９−９２４）を参照のこと。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に対して特定の配列を割当てるための高速手順である。単一のサーマルサイクラを用いて一日に３個以上の配列を割当てることができる。オリゴヌクレオチドプライマを設計するために本発明の核酸配列を用いて、特定の染色体からのフラグメントパネルでサブ位置特定（sublocalization）を達成することができる。その染色体に遺伝子をマッピングするのに同様に使用可能であるその他のマッピング戦略には、インサイチュハイブリダイゼーション（Fan et al., １９９０，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８７：６２２３−２７）、標識されたフローソーティングされた染色体でのプレスクリーニング（Popp S, et al., １９９３，Hum Genet, ９２（６）：５２７−３２）及び染色体特異的ｃＤＮＡライブラリに対するハイブリダイゼーションによる予備選択が含まれる。１つの段階で正確な染色体の場所を提供するように、さらに***中期の染色体の広がりに対するＤＮＡ配列の蛍光インサイチェハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用することができる（この技術の再考のためには、Verma et al., Human Chromosomes : A Manual of Basic Techniques、Pergamon Press, New York, １９８８を参照のこと）。
単一染色体又はその上の単一の部位をマーキングするために染色体マッピングのための試薬を個別に使用でき、そうでなければ、多数の部位及び／又は多数の染色体をマーキングするために試薬パネルを使用することができる。実際に、遺伝子の非コーディング領域に対応する試薬がマッピングを目的として好まれている。コーディング配列は、遺伝子ファミリ内に保存される確率がさらに高く、かくして、染色体マッピング中の交差ハイブリダイゼーションの確率が高くなる。
１つの配列がひとたび正確な染色体の場所に対してマッピングされた時点で、遺伝子地図データと染色体上の配列の物理的位置を相関させることができる（このようなデータは例えばJohns Hopkins大学Welch医学図書館を通してオンラインで入手可能であるV. McKusick, Mendelian Inheritance in Manの中に見られる）。そして、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患の間の関係は、例えばEgeland et al.（１９８７．Nature ３２５：７８３−７８７）の中で記述されている連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時形質遺伝）を通して同定可能である。
その上、本発明の遺伝子に関連する病気に罹患した及びしていない個々の生体間のＤＮＡ配列の差を見極めることができる。罹患した個々の生体の一部分又は全てで突然変異が観察され、罹患していない個々の生体では観察されない場合には、その突然変異が特定の疾患の病原因子である確率が高い。罹患した又はしていない個々の生体の比較は一般に、染色体の広がりから目に見えるか、又はそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出可能な欠失又は転座といったような染色体内の構造的改変をまず探すことを含む。究極的には、突然変異の存在を確認し多型と突然変異を区別するために、複数の個々の生体からの遺伝子の完全な配列決定を実施することができる。
本発明の核酸配列は、わずかな生物試料から個々の生体を同定するために使用可能である。例えば、米国軍は、その人員の同定のために制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術では、個々の生体のゲノムＤＮＡが単数又は複数の制限酵素で消化され、サザンブロット上でプローブされて同定のための独特のバンドを生成する。この方法は、紛失、交換又は盗難の可能性があって確実な同定をむずかしくする「ドッグタグ」が現在持っている制限を受けない。本発明の配列は、（米国特許第５，２７２，０５７号明細書に記述されている）ＲＦＬＰのための付加的なＤＮＡマーカーとして有用である。
さらに、個々の生体のゲノムの選択された部分の実際の塩基毎のＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供するために、本発明の配列を使用することができる。かくして、本書に記述されている核酸配列を、配列の５’及び３’末端から２つのＰＣＲプライマを調製するために使用できる。そして、これらのプライマは、個々の生体のＤＮＡを増幅し、その後それを配列決定するために使用可能である。
このやり方で調製された個々の生体由来の対応するＤＮＡのパネルは、個々の生体が対立遺伝子の差異に起因してこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有することになるため、一意的な個々の同定を提供することができる。本発明の配列は、個々の生体及び組織からこのような同定配列を得るために使用することができる。本発明の核酸配列は、ヒトゲノムの部分を一意的に表わす。対立遺伝子変異は、これらの配列のコーディング領域中で或る程度発生し、非コーディング領域内ではさらに大きい度合で発生する。個々のヒトの間の対立遺伝子変異は５００塩基毎に約１回の頻度で発生すると推定される。本書に記述されている配列の各々は、或る程度は、個々の生体由来のＤＮＡを同定目的で比較できる１つの標準として使用することができる。非コーディング配列内にはより多くの多型が発生することから、個体を弁別するためには、比較的少ない配列しか必要でない。
本書で記述されている核酸配列に由来する試薬パネルを用いて１つの個体のための一意的同定データベースを作成する場合、これらの同じ試薬を後で使用してその個体からの組織を同定することが可能である。一意的同定データベースを使用して、きわめて小さい組織試料から生きた又は死んだ個々の生体の確実な同定を行なうことができる。
ＤＮＡベースの同定技術は、法医生物学の中でも使用することができる。法医生物学は、例えば一つの犯罪の犯人を確実に同定するための手段として犯罪現場で発見された生物学的証拠の遺伝子型特定を利用する科学的分野である。このような同定を行なうためには、犯罪現場に発見された例えば血液、唾液又は***といった体液或いは例えば毛髪又は皮膚といった組織などのきわめて小さい生物試料からとられたＤＮＡ配列を増幅するために、ＰＣＲ増幅を使用することができる。このとき増幅された配列を１つの標準に比較し、かくして生物試料の起源の同定を可能にすることができる。
本発明の配列は、ヒトゲノム内の特異的遺伝子座にターゲティングされた例えばＰＣＲプライマといったポリヌクレオチド試薬を提供するために使用することができ、該ポリヌクレオチド試薬は、例えばもう１つの「同定マーカー」（すなわち特定の個々の生体に独特のものであるもう１つのＤＮＡ配列）を提供することにより、ＤＮＡベースの法医学的同定の信頼性を高めることができる。上述の通り、制限酵素で生成されたフラグメントによって形成されるパターンに対する正確な代替物として、同定のために実際の塩基配列情報を使用することができる。非コーディング領域内でさらに多数の多型が発生し、この技術を用いた個々の生体の弁別がより容易になることから、この用途にとっては、非コーディング領域にターゲティングされた配列が特に適当である。ポリヌクレオチド試薬の例には、本発明の核酸配列又はその一部分、例えば少なくとも２０又は３０個の塩基の長さをもつ非コーディング領域に由来するフラグメントが含まれる。
本書に記述されている核酸配列はさらに、例えば、肝組織といった特定の組織を同定するためインサイチュハイブリダイゼーション技術などにおいて使用することのできる標識された又は標識可能なプローブなどのポリヌクレオチド試薬を提供するために使用可能である。これは、起源がわからない組織が法医学病理学者に提示された場合にきわめて有用であり得る。種毎及び／又は器官タイプ毎に組織を同定するために、かかるプローブのパネルを使用することができる。
以上で論述されている損傷を受けていない又は突然変異体のエンドスタチン遺伝子産物或いはその保存された変異体又はペプチドフラグメントに対する抗体を、本書で記述されているように例えば癌といった血管新生関連障害についての診断及び予測として使用することもできる。かかる方法は、エンドスタチン遺伝子産物の合成又は発現のレベルの異常或いはエンドスタチン遺伝子産物の構造、一時的発現及び／又は物理的位置の異常を検出するために使用することができる。以下で記述する抗体及びイムノアッセイ法は、例えばエンドスタチン遺伝子産物を精製する上で、及び癌といった血管新生関連障害のための治療の効能を査定する上で、重要なインビトロ利用分野を有する。以下で記述するもののような抗体又はそのフラグメントを使用して、エンドスタチン遺伝子発現及びエンドスタチンペプチド産生に対するその効果を判定するべくインビトロで潜在的な治療用化合物をスクリーニングすることが可能である。例えば癌などの血管新生関連障害に対し有益な効果をもつ化合物を同定し、治療上有効な用量を決定することができる。
例えば、癌といったような血管新生関連障害のための細胞ベースの遺伝子治療の効能を査定するために、インビトロのイムノアッセイを使用することもできる。例えば、エンドスタチンペプチドを産生するように遺伝子工学処理された細胞内で達成されたエンドスタチン遺伝子発現のレベルを決定するべく、エンドスタチンペプチドに対する抗体をインビトロで使用することができる。細胞内エンドスタチン遺伝子産物の場合には、このような査定は、好ましくは細胞可溶化物又は抽出物を用いて行なわれる。かかる分析は、インビボで治療的効能を達成するのに必要な形質転換を受けた細胞の数の決定、ならびに遺伝子交換プロトコルの最適化を可能にする。
分析すべき組織又は細胞型は一般に、エンドスタチン遺伝子を発現するものとして知られているか又はその疑いのあるものを含むことになる。本書で使用されているタンパク質単離方法は例えば、Harlow 及び Lane（１９８８、“Antibodies : A Laboratory Manual”、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）に記述されているような方法であり得る。単離された細胞は、細胞培養又は対象に由来することができる。培養から取られた細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子治療技術の一部として、或いはエンドスタチン遺伝子の発現に対する化合物の効果をテストするために、使用すべき細胞の査定における必要な段階であり得る。
エンドスタチン遺伝子産物或いはその保存された変異体又はペプチドフラグメントの検出のための好ましい診断方法は、例えば、抗エンドスタチン遺伝子産物特異的抗体とのその相互作用によってエンドスタチン遺伝子産物或いは保存された変異体又はペプチドフラグメントが検出されるイムノアッセイを含むことができる。
例えば、以上で記述したような本発明において有用な抗体又はそのフラグメントは、エンドスタチン遺伝子産物或いはその保存された変異体又はペプチドフラグメントの存在を定量的又は定性的に検出するために使用可能である。これは、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリ又は蛍光による検出とあわされた蛍光標識された抗体（本セクションの以下参照）を利用した免疫蛍光技術によって達成可能である。かかる技術は、特に、細胞表面上で発現されるエンドスタチン遺伝子産物にとって好ましい。
本発明において有用な抗体（又はそのフラグメント）は、さらに、エンドスタチン遺伝子産物或いはその保存された変異体又はペプチドフラグメントのインサイチュ検出のため免疫蛍光顕微鏡又は免疫電子顕微鏡観察などにおいて組織学的に利用しうる。インサイチュ検出は、対象から組織学的標本を取出しこれに本発明の標識された抗体を適用することによって達成され得る。抗体（又はフラグメント）は好ましくは、標識された抗体（又はフラグメント）で生物試料表面を覆うことによって適用される。かかる手順の使用を通してエンドスタチン遺伝子産物或いはその保存された変異体又はペプチドフラグメントの存在のみならず検査対象の組織内のその分布をも決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、多種多様な組織学的方法（例えば染色手順）のいずれかを改変してかかるインサイチュ検出を達成することができるということを容易に認識することだろう。
エンドスタチン遺伝子産物或いはその保存された変異体又はペプチドフラグメントのためのイムノアッセイは、典型的に、エンドスタチン遺伝子産物或いはその保存された変異体又はペプチドフラグメントを同定する能力をもつ検出可能な形で標識された抗体の存在下で、細胞培養内でインキュベートされた体液、組織抽出物、収獲されたばかりの細胞、又は細胞可溶化物といったような試料をインキュベートすること、及び当該技術分野において周知の数多くの技術のいずれかにより結合した抗体を検出することを含むことになる。
生物試料は、ニトロセルロースといったような固相支持体又は担体上或いは、細胞、細胞粒子又は可溶性タンパク質を固定化する能力をもつその他の固体支持体と接触させ、その上に固定化することができる。支持体はその後適切な緩衝液で洗浄され、その後検出可能な形で標識されたエンドスタチン遺伝子特異的抗体で処理することができる。その後、固相支持体を二度目に緩衝液で洗浄し、未結合抗体を除去することができる。固体支持体上の結合標識の量は、このとき従来の手段により検出可能である。
「固相支持体又は担体」というのは、抗原又は抗体を結合する能力をもつあらゆる支持体を意図している。周知の支持体又は担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び改質セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩及びマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的のためには、幾分か可溶性であるか又は不溶性であるかのいずれかであり得る。支持体材料は、カップリングされた分子が抗原又は抗体に結合する能力をもつかぎり、事実上考えられるあらゆる構造的形態を有し得る。かくして、支持体の形態は、ビーズの場合のように球形であるか、又は試験管の内側表面又はロッドの外部表面の場合のように円筒形であり得る。或いは、表面はシート、テストストリップなどのように平坦であってよい。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが含まれる。当業者であれば、抗体又は抗原を結合させるための数多くのその他の適切な担体を知ることになると思われ、そうでなければ、日常的実験の使用によりそれを確認できるものと思われる。
抗エンドスタチン遺伝子産物抗体の一定のロットの結合活性を周知の方法に従って判定することができる。当業者であれば、日常的実験を利用することによって各々の判定のための作業上の最適なアッセイ条件を決定することができるだろう。
エンドスタチン遺伝子ペプチド特異的抗体を検出可能な形で標識できる方法の１つは、これを酵素に連結すること及びエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）における使用によるものである。（Voller, A.,“Tne Enzyme Linked Immunosolbent assay（ＥＬＩＳＡ）”１９７８，Diagnostic Horizons ２，１−７，Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD）；Voller, A. et al.,１９７８，J. Clin. Pathol. ３１，５０７−５２０；Butler, J.E., １９８１，Meth. Enzymol. ７３，４８２−５２３；Maggio, E.(ed.)，１９８０，Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, ＦＬ；Ishikawa, E. et al.,(eds), １９８１，Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo）。抗体に結合される酵素は、例えば分光光度測定手段、蛍光測定手段、又は目視手段によって検出可能な化学的部分を産生するような形で、適切な基質好ましくは色素生産性基質と反応することになる。抗体を検出可能な形で標識するために使用可能な酵素としてはマレートデヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、ベータグリセロホスフェート、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれるがこれらに制限されるわけではない。検出は、酵素のための色素生産性基質を利用する比色法によって達成することができる。検出は、類似の形で調製された標準と比べて、基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することによっても達成することができる。
検出は、さまざまなその他のイムノアッセイのいずれかを用いて達成することもできる。例えば、抗体又は抗体フラグメントを放射活性物質で標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を通してエンドスタチン遺伝子ペプチドを検出することが可能である（例えば、Weintranb Ｂ.,Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques、The Endocrine Society, March, １９８６を参照のこと）。放射性同位元素は、ガンマカウンタ又はシンチレーションカウンタの使用といったような手段によってか又はオートラジオグラフィによって検出可能である。
蛍光化合物で抗体を標識することも可能である。適切な波長の光に対して蛍光標識された抗体が曝露されている場合、蛍光によってこのときその存在を検出することができる。最も一般的に使用されている蛍光標識用化合物としては、フルオレセイン イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、及びフルオレサミンがある。
抗体は、152Ｅｕといったような蛍光発光金属又はランタニド系元素のその他のものを用いて検出可能な形で標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）といった金属キレート化基を用いて抗体に付着させることができる。
化学発光化合物にカップリングさせることによって、抗体を検出可能な形で標識することもできる。そして、化学発光タグ付けされた抗体の存在は、化学反応の間に生じるルミネセンスの存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識用化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。
同様にして、本発明の抗体を標識するために、生物発光化合物を使用することができる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる生体系内で見られる化学発光の一タイプである。生物発光タンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することによって決定される。標識を目的とした重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びエクオリンである。
以下のアッセイは、エンドスタチン遺伝子産物に結合する化合物、例えばエンドスタチン遺伝子産物と反応する細胞内タンパク質又はその一部分といったタンパク質、細胞内タンパク質とのエンドスタチン遺伝子産物の相互作用を妨害する化合物及びエンドスタチン遺伝子の活性を調節する（すなわち、エンドスタチン遺伝子発現のレベルを調節する及び／又はエンドスタチン遺伝子産物活性のレベルを調節する）化合物を同定するように設計されている。エンドスタチン遺伝子制御配列（例えばプロモータ配列；Platt, １９９４，J. Biol. Chem.２６９，２８５５８−２８５６２参照）に結合しかつエンドスタチン遺伝子発現のレベルを調節し得る化合物を同定するアッセイをさらに利用することができる。化合物には、血液−脳障壁を横断し、適切な細胞内に進入しかつエンドスタチン遺伝子又はエンドスタチン制御経路に関与するいくつかのその他の遺伝子の発現に影響を及ぼすことのできるもの又は細胞内タンパク質といったような小さな有機分子が含まれ得るが、これらに制限されるわけではない。
かかる細胞内タンパク質の同定のための方法が以下で記述されている。かかる細胞内タンパク質は、心的状態の制御及び／又は調節に関与し得る。さらに、これらの化合物に含まれるのは、エンドスタチン遺伝子発現及び／又はエンドスタチン遺伝子産物活性のレベルに影響を及ぼし、以下で記述するように例えば癌といったエンドスタチン障害の治療的処置の中で使用可能な化合物である。
化合物としては、例えば、Ｉｇ−テイルド融合ペプチド及びランダムペプチドライブラリの成員を含む（ただし、これに制限されるわけではない）可溶性ペプチドといったようなペプチド；（例えば、Lam, et al.,１９９１，Nature ３５４，８２−８４；Houghten, et al.,１９９１，Nature ３５４，８４−８６）を参照のこと）、並びにＤ及び／又はＬ−形態のアミノ酸、ホスホペプチド（ランダム又は一部縮重の定方向ホスホペプチドライブラリの成員を含むが、これに制限されるわけではない；例えばSongyang, et al.,１９９３，Cell ７２，７６７−７７８を参照のこと）、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ又は１本鎖抗体並びにＦab，Ｆ（ab’）２及びＦab発現ライブラリフラグメント及びそのエピトープ結合フラグメントを含むが、これに制限されるわけではない）並びに有機又は無機小分子から成るコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリが含まれ得るがこれらに制限されるわけではない。
かかる化合物は、血管新生関連障害の症状を改善するか又は悪化させるものとして知られている薬物又は薬物クラス又はファミリーの成員をも内含し得る。かかる化合物には、メタロプロティナーゼ阻害物質、ＦＧＦ及びＶＥＧＦレセプタ阻害物質、ＣＯＸ−２阻害物質、ＩＮＦ、ＩＬ−１２、タキソール、ビンブラスチン、サリドマイドなどが含まれるがこれらに制限されるわけではない。好ましくは、かかる化合物は、それらが以前に投与されたやり方とは異なるやり方で（例えば異なる投薬量、投与様式、及び／又は単数又は複数の付加的な化合物との同時投与）利用される。
本書で記述されているようなアッセイを介して同定された化合物は、例えば、エンドスタチン遺伝子産物の生物学的機能を作り上げる上で及び癌などの血管新生関連障害を改善させるために有用であり得る。例えば、かかる技術を介して同定された化合物は、エンドスタチン媒介プロセスを調節しかつ／又は血管新生関連障害の症状を改善する能力についてテストされるべきリード化合物を提供することができる。例えば上述のもののような技術によって同定された化合物の有効性をテストするためのアッセイについて、以下で論述する。
インビトロシステムは、例えばエンドスタチンポリペプチドといったような本発明のエンドスタチン遺伝子産物を結合する化合物を同定するように設計可能である。同定された化合物は、例えば損傷を受けていない及び／又は突然変異体エンドスタチン遺伝子産物の活性を調節する上で有用であり得るか、エンドスタチン遺伝子産物の生物学的機能を解明する上で有用であり得るか、正常なエンドスタチン遺伝子産物相互作用を破壊する化合物を同定するためのスクリーニングの中で利用され得るか、又は自らがかかる相互作用を破壊し得、かつ、エンドスタチン媒介プロセスを調節しかつ／又は血管新生関連障害の症状を改善させる能力についてさらにテストされるべきリード化合物を提供することができる。
エンドスタチン遺伝子産物に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理には、エンドスタチン遺伝子産物とテスト化合物が相互作用して結合し、かくして反応混合物中で除去及び／又は検出され得る複合体を形成することができるようにするのに充分な条件下でかつ充分な時間で該２つの成分の反応混合物を調製することを含む。これらのアッセイは、さまざまな方法で実施できる。例えば、かかるアッセイを行なう１つの方法には、固相上にエンドスタチン遺伝子産物又はテスト物質を定着させること及び反応の終わりで固相上に定着したエンドスタチン遺伝子産物／テスト化合物の複合体を検出することを含むであろう。かかる方法の１つの実施態様においては、エンドスタチン遺伝子産物を固体表面上に定着させることができ、定着されていないテスト化合物は直接的又は間接的に標識され得る。
実際には、マイクロタイタープレートは、固相として便利に利用可能である。定着された成分は、非共有結合又は共有結合により固定化され得る。非共有結合は、単に固体表面をタンパク質の溶液でコーティングし、乾燥させることによって達成可能である。或いは、固定化されるべきタンパク質に特異的である固定化された抗体好ましくはモノクローナル抗体を用いて、タンパク質を固体表面に定着させることができる。表面を予め調製し保管することが可能である。
アッセイを実施するためには、定着した成分を含有するコーティングされた表面に、固定化されていない成分が添加される。反応が完了した時点で、形成されたあらゆる複合体が固体表面上に固定化された状態にとどまるような条件下で、未反応成分が（例えば洗浄によって）除去される。固体表面上に定着された複合体の検出は、数多くの方法で達成可能である。先に固定化されていない成分は、予備標識され、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを表わす。先に固定化されていない成分が予備標識されていない場合、例えば、先に固定化されていない成分に特異的な標識済み抗体を用いて（抗体自体は、標識済みＩｇ抗体で間接的に標識されるか又は直接標識され得る）、表面上に定着された複合体を検出するために間接的標識を使用することができる。
或いは、例えば溶液中で形成されたあらゆる複合体を定着するためのエンドスタチン遺伝子産物又はテスト化合物に特異的な固定化された抗体及び定着した複合体を検出するための考えられる複合体のその他の成分に特異的な標識済み抗体を使用して、反応を液相内で実施し、反応産物を未反応成分から分離し、複合体を検出することができる。
エンドスタチンタンパク質−タンパク質相互反応を同定するためには、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適したあらゆる方法を利用することができる。
利用可能な従来の方法の中には、勾配又はクロマトグラフィカラムを通した同時免疫沈降、架橋及び同時精製がある。これらのような手順を利用することにより、エンドスタチン遺伝子産物と相互作用する細胞内タンパク質を含めたタンパク質の同定が可能となる。ひとたび単離された時点で、かかるタンパク質を同定し、標準的な技術と併用してこれを用いて、それが相互作用するタンパク質を同定することができる。例えば、Edman分解技術といったような当業者にとって周知の技術を用いて、エンドスタチン遺伝子産物と相互作用するタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分を確定することができる（例えばCreighton，１９８３“Proteins : Structures and Molecular Principles,”W. H. Freeman&Co., N.Y.,ｐ３４〜４９）。得られたアミノ酸配列を、かかるタンパク質をコードする遺伝子配列についてスクリーニングするのに使用できるオリゴヌクレオチド混合物の生成のための指針として使用することができる。スクリーニングは、例えば、標準的なハイブリダイゼーション又はＰＣＲ技術によって達成できる。オリゴヌクレオチド混合物の生成及びスクリーニングのための技術は周知である（例えばAusubel、上掲書及び１９９０“PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications,”Innis et al., eds Academic Press Inc., New Yorkを参照のこと）。
さらに、エンドスタチンタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子の同時同定を結果としてもたらす方法を利用することが可能である。これらの方法には、例えば、周知のλｇｔ１１ライブラリの抗体プローブ技術と類似のやり方でエンドスタチンタンパク質を用いて、標識されたエンドスタチンタンパク質で発現ライブラリをプローブすることが含まれる。
インビボでタンパク質の相互作用を検出する１つの方法である２−ハイブリッド系が、制限的な意味でなく単なる例示を目的として詳述されている。この系の１バージョンが記述されており（Chien et al., １９９１，Prot, Natl, Acad, Sci, USA, ８８：９５７８−９５８２），Clontech（Polo Alto, CA）から市販されている。
簡単に言うと、かかる系を利用して、エンドスタチン遺伝子産物に融合された転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインから成るものと、ｃＤＮＡライブラリの一部としてこのプラスミド内に組込まれたｃＤＮＡによりコードされた未知のタンパク質に融合された転写活性化タンパク質の活性化ドメインから成るものという２つのハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドが構築される。ＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミド及びｃＤＮＡライブラリは、転写活性化体の結合部位を含む制御領域をもつレポータ遺伝子（例えばＨＢＳ又はlacZ）を含む酵母Saccharomyces cerevisiaeの一菌株へと形質転換される。いずれのハイブリッドタンパク質も単独ではレポータ遺伝子の転写を活性化することができない。すなわち、ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは、活性化機能を提供しないために活性化できず、活性化ドメインハイブリッドは、活性化体の結合部位に局在化できないことから活性化できない。２つのハイブリッドタンパク質の相互作用は、機能的活性化体タンパク質を再構成し、レポータ遺伝子の発現を結果としてもたらし、この遺伝子はレポータ遺伝子産物についてのアッセイによって検出される。
２ハイブリッド系又はそれに関連する方法は、「ベイト」遺伝子産物と相互作用するタンパク質について活性化ドメインライブラリをスクリーニングするために使用することができる。限定としてではなく一例として、エンドスタチン遺伝子産物をベイト遺伝子産物として使用することができる。全ゲノム又はｃＤＮＡ配列は、活性化ドメインをコードするＤＮＡに融合される。このライブラリ及びＤＮＡ結合ドメインに融合したベイトエンドスタチン遺伝子産物のハイブリッドをコードするプラスミドが酵母レポータ菌株に同時形質転換され、結果としての形質転換体は、レポータ遺伝子を発現するものについてスクリーニングされる。例えば、限定的な意味でなく、エンドスタチン遺伝子の読取り枠といったようなベイトエンドスタチン遺伝子配列を、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡに対し翻訳により融合されるようにベクター内にクローニングさせることができる。これらのコロニーは精製され、レポータ遺伝子発現を担当するライブラリプラスミドは単離される。そして、ＤＮＡ配列決定を用いて、ライブラリプラスミドによりコードされたタンパク質を同定する。
当該技術分野において日常的に実践されている方法を用いてベイトエンドスタチン遺伝子産物と相互作用するタンパク質を作ることのできる細胞系列のｃＤＮＡライブラリ。本書で記述されている特定の系に従うと、例えば、ＧＡＬ４の転写活性化ドメインに翻訳により融合されるように１つのベクター内にｃＤＮＡフラグメントを挿入することができる。このライブラリを、ＧＡＬ４活性化配列を含むプロモータにより駆動されるlacZ遺伝子を含む酵母菌株の中にベイトエンドスタチン遺伝子−ＧＡＬ４融合プラスミドと共に同時形質転換させることができる。ベイトエンドスタチン遺伝子産物と相互作用するＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合されたｃＤＮＡコード化されたタンパク質が、活性ＧＡＬ４タンパク質を再構成し、かくしてＨＩＳ３遺伝子の発現を駆動する。ＨＩＳ３を発現するコロニーは、ヒスチジンが欠如した半固体寒天ベースの培地の入ったペトリ皿上でのその成長によって検出可能である。そして、これらの菌株からｃＤＮＡを精製でき、当該技術分野において日常的に実践されている技術を用いてベイトエンドスタチン遺伝子相互作用タンパク質を産生し単離するためにこれを使用することができる。
本発明のエンドスタチン遺伝子産物はインビボで、タンパク質といったような細胞内又は細胞外高分子を含む単数又は複数の高分子と相互作用し得る。かかる高分子には、上述したような方法を介して同定されたタンパク質及び核酸分子又は細胞レセプタといったようなその他のタンパク質が含まれるがこれらに制限されるわけではない。例えば、エンドスタチン遺伝子産物は、ペプチドホルモン又は神経ペプチドのようなレセプタと相互作用し得る。この論述を目的として、高分子は本書では「結合パートナ」と呼ばれる。このようにしてエンドスタチン結合を破壊する化合物は、エンドスタチン遺伝子産物、特に突然変異体エンドスタチン遺伝子産物の活性を制御する上で有用であり得る。例えば、かかる化合物はエンドスタチン遺伝子産物とそのレセプタの相互作用を妨害する可能性がある。かかる化合物としては、例えば以上で記述されているように、エンドスタチン遺伝子産物にアクセスできる能力をもつと思われるペプチドなどといった分子が含まれ得るがこれらに制限されるわけではない。
エンドスタチン遺伝子産物とその結合パートナ（単複）の間の相互作用を妨害する化合物を同定するのに用いられるアッセイ系の基本原理には、エンドスタチン遺伝子産物及び結合パートナを含む反応混合物を、これら２つが相互作用し結合して１つの複合体を形成できるのに充分な条件下でかつ充分な時間で調製することが含まれる。阻害活性について１つの化合物をテストするために、該テスト化合物の存在下及び不在下で反応混合物が調製される。テスト化合物は最初から反応混合物中に内含されていてよく、そうでなければエンドスタチン遺伝子産物及びその結合パートナの添加の後の一時点で添加することもできる。対照反応混合物をテスト化合物無しで又はプラシーボと共にインキュベートする。エンドスタチン遺伝子タンパク質と結合パートナの間のあらゆる複合体の形成は、その後検出される。対照反応中には複合体が形成するがテスト化合物を含有する反応混合物中では形成しない場合、それは、該化合物がエンドスタチン遺伝子タンパク質と相互作用性結合パートナの相互作用を妨害していることを表わす。さらに、テスト化合物及び正常なエンドスタチン遺伝子タンパク質を含有する反応混合物内での複合体の形成を、テスト化合物と突然変異体エンドスタチン遺伝子タンパク質を含有する反応混合物内での複合体形成と比較することもできる。この比較は、突然変異体エンドスタチン遺伝子タンパク質の相互作用を破壊するものの正常なエンドスタチン遺伝子タンパク質の相互作用を破壊しない化合物を同定することが望ましいような場合に重要であり得る。
エンドスタチン遺伝子産物及び結合パートナの相互作用を妨害する化合物についてのアッセイは、不均一又は均一形式で実施することができる。不均一アッセイは、エンドスタチン遺伝子産物又は結合パートナを固相上に定着させ反応の終りで固相上に定着された複合体を検出することを含む。均一アッセイでは、反応全体は液相内で実施される。いずれのアプローチにおいても、反応物の添加順序は、テストされる化合物について異なる情報を得るべく変動させることができる。例えば、エンドスタチン遺伝子産物と結合パートナの間で例えば競合により相互作用を妨害するテスト化合物は、テスト物質の存在下で反応を行なうことによって、すなわちエンドスタチン遺伝子タンパク質及び相互反応性細胞内結合パートナより前又はそれらと同時に反応混合物にテスト物質を添加することによって同定可能である。或いは、予め形成された複合体を破壊するテスト化合物、例えば複合体からの成分のうちの１つを置換するより高い結合定数を有する化合物は、複合体の形成後反応混合物にテスト化合物を添加することによって試験可能である。以下ではさまざまな形式について記述する。
不均一アッセイ系においては、未定着種を直接的又は間接的のいずれかで標識する一方で、固体表面上にエンドスタチン遺伝子産物又は相互作用性結合パートナを定着させる。実際には、マイクロタイタープレートを利用するのが便利である。定着された種は、非共有結合又は共有結合により固定化され得る。非共有結合は、単純に、エンドスタチン遺伝子産物又は結合パートナの溶液を固体表面にコーティングし乾燥させるだけで達成可能である。或いは、定着されるべき種に特異的な固定化された抗体を用いて固体表面に種を定着させることも可能である。該表面を予め調製し、保管しておくこともできる。
アッセイを行なうためには、固定化された種のパートナをテスト化合物を伴って又は伴わずにコーティング済み表面に曝露する。反応が完了した後、未反応成分を（例えば洗浄によって）除去し、形成されたあらゆる複合体は、固体表面上に固定化された状態にとどまることになる。固体表面上に定着させられた複合体の検出は数多くの方法で達成可能である。固定化されていない種が予め標識されている場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを表わす。固定化されていない種が予め標識されていない場合、例えば当初固定化されていない種に特異的な標識された抗体を用いて（該抗体はそれ自体、標識された抗−Ｉｇ抗体で関接的に又は直接的に標識されていてよい）、表面上に定着された複合体を検出するために、間接的標識を用いることができる。反応成分の添加順序に応じて、複合体形成を阻害するテスト化合物又は予め形成された複合体を破壊するテスト化合物を検出することが可能である。
或いは、例えば、溶解状態で形成されたあらゆる複合体を定着させるため結合成分のうちの１つに特異的な固定化された抗体を、及び定着された複合体を検出するための他のパートナに特異的な標識された抗体を用いて、テスト化合物、未反応成分から分離させた反応産物及び検出された複合体の存在下又は不在下で、液相で反応を実施することが可能である。ここでも又、液相に対する反応物の添加順序に応じて、複合体を阻害するテスト化合物又は予め形成された複合体を破壊するテスト化合物を同定することができる。
本発明のもう１つの実施態様においては、均一アッセイを使用することができる。このアプローチでは、エンドスタチン遺伝子タンパク質及び相互作用性結合パートナの予め形成された複合体が調製され、ここでエンドスタチン遺伝子産物又はその結合パートナのいずれかが標識されているものの、該標識により生成されるシグナルは、複合体形成のためクエンチングされる（例えば、イムノアッセイのためにこのアプローチを利用するRubensteinによる米国特許第４，１０９，４９６号明細書を参照のこと）。予め形成された複合体由来の種のうちの１つと競合しこれを置換するテスト物質を添加すると、結果としてバックグラウンドより上のシグナルが生成されることになる。このようにして、エンドスタチン遺伝子タンパク質／結合パートナ相互作用を破壊するテスト物質を同定することができる。
特定の実施態様においては、上述の組換え型ＤＮＡ技術を用いた固定化のためにエンドスタチン遺伝子産物を調製することができる。例えば、結果として得られた融合タンパク質中でその結合活性が維持されるようなやり方で、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１といったような融合ベクターを用いてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に対してエンドスタチンコーディング領域を融合することができる。相互作用性結合パートナを精製し、当該技術分野において日常的に実践される上記の方法を用いてモノクローナル抗体を産生させるために使用することができる。この抗体を、例えば当該技術分野において日常的に実践されている方法によって、放射性同位体125Ｉで標識することができる。不均一アッセイにおいては、例えばＧＳＴエンドスタチン融合タンパク質は、グルタチオン−アガロースビーズに定着され得る。そして、相互作用性結合パートナは、相互作用及び結合がおこることを可能とするやり方でテスト化合物の存在下又は不在下で添加可能である。反応期間の終りで、未結合材料を洗い去ることができ、該系に標識済みモノクローナル抗体を添加し、複合化した成分に結合させることができる。エンドスタチン遺伝子タンパク質と相互作用性結合パートナの間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズに付随した状態にとどまっている放射活性の量を測定することにより検出可能である。テスト化合物がうまく相互作用を阻害した場合、結果として、測定された放射活性値は減少することになる。
或いは、ＧＳＴ−エンドスタチン遺伝子融合タンパク質と相互作用性結合パートナを、固体グルタチオン・アガロースビーズの不存在下で液体状態で混合させることができる。種を相互作用させている間か又はその後にテスト化合物を添加することができる。この混合物を次にグルタチオン・アガロースビーズに添加することができ、未結合材料は洗い流す。ここでも又、エンドスタチン遺伝子産物／結合パートナ相互作用の阻害の程度は、標識済み抗体を添加しビーズに付随した放射活性を測定することによって検出可能である。
本発明のもう１つの実施態様においては、全長タンパク質のうちの一方又は両方の代りにエンドスタチンタンパク質及び／又は相互作用性又は結合パートナ（結合パートナがタンパク質である場合）の結合ドメインに対応するペプチドフラグメントを用いて、これらの同じ技術を利用することができる。結合部位を同定しかつ単離するためには、当該技術分野において日常的に実践されている任意の数の方法を使用することができる。これらの方法としては、タンパク質の１つをコードする遺伝子の突然変異誘発及び同時免疫沈降アッセイにおける結合の破壊についてのスクリーニングが含まれるがこれらに制限されるわけではない。次に複合体内の第２の種をコードする遺伝子中の突然変異の補償を選択することができる。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列分析は、相互作用性結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異を明らかにすることになる。或いは、１つのタンパク質を、本節で上述した方法を用いて固体表面に定着させ、トリプシンといったようなタンパク質分解酵素ですでに処理されたその標識済み結合パートナと相互作用させてそれに結合させることができる。洗浄後、結合ドメインを含む短かくかつ標識されたペプチドが固体材料と会合した状態でとどまることができ、これを単離しアミノ酸配列決定によって同定することができる。同様に、該セグメントについてコードする遺伝子をひとたび工学処理してタンパク質のペプチドフラグメントを発現するようにできたならば、次にそれを結合活性について試験し、精製又は合成することができる。
例えば、制限的な意味ではないが、ＧＳＴ−エンドスタチン融合タンパク質を作りそれをグラチオン・アガロースビーズに結合させることにより、本節で上述した通り固体材料にエンドスタチン遺伝子産物を定着させることができる。得られた相互作用性結合パートナを35Ｓといった放射性同位体で標識し、トリプシンといったようなタンパク質分解酵素で切断することができる。次に切断産物を定着したＧＳＴ−エンドスタチン融合タンパク質に添加し結合させることができる。未結合のペプチドを洗い去った後、結合パートナ結合ドメインを表わす標識された結合済み材料を溶出させ、精製し、周知の方法によりアミノ酸配列について分析することができる。このように同定されたペプチドを、組換え型ＤＮＡ技術を用いて適切な促進タンパク質に融合させるか又は合成的に産生することが可能である。
上述のもののようなアッセイ技術を介して同定された結合化合物を含む（ただし、これに制限されるわけではない）化合物は、例えば、固形腫瘍、白血病などの血液性腫瘍及び腫瘍転移を含む血管新生依存性癌；血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫などの良性腫瘍；関節リウマチ；乾癬；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシスなどの眼の血管新生疾患；オスラー・ウェーバー症候群；心筋血管新生；プラーク新血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節症；血管線維腫；創傷肉芽発生；冠動脈側枝；脳側枝；動静脈奇形；虚血性四肢血管新生；糖尿病性新血管形成；黄斑変性症；骨折；血管形成；造血；***；月経；胎盤形成；腸管癒着症；アテローム性動脈硬化；強皮症；肥厚性瘢痕すなわちケロイド；猫引っかき病（Rocheli minalia quntosa）；及び潰瘍（Helicobacter pylori）といった血管新生関連障害の症状を改善させる能力について試験することができる。本書に記述されているアッセイが、エンドスタチン遺伝子発現に影響を及ぼすこと又はエンドスタチン遺伝子産物の活性レベルに影響を及ぼすことのいずれかによってエンドスタチン遺伝子活性に影響を及ぼす化合物を同定できる、という点に留意すべきである。例えば、エンドスタチン遺伝子及び／又はエンドスタチン遺伝子産物が関与する経路内のもう１つのステップに関与しかつこの同じ経路に影響を及ぼすことによってガンといったような血管新生関連障害の発生に対するエンドスタチンの効果を調節しうる化合物を同定することができる。かかる化合物は、障害の処置のための治療的方法の一部として使用可能である。
以下で記述するのは、例えば癌といった血管新生関連障害の症状を改善するような能力を示す化合物の同定のための細胞ベースの及び動物モデルベースのアッセイである。
まず最初に、癌などの血管新生関連障害の症状を改善させるように作用し得る化合物を同定するために、細胞ベースの系を使用できる。かかる細胞系には、例えばエンドスタチン遺伝子を発現する細胞系列といったような例えば組換え型又は非組換え型細胞が含まれる可能性がある。
かかる細胞系を利用するにあたっては、曝露された細胞内のかかる症候のかかる改善を惹起するのに充分な時間、充分な濃度で、癌などの血管新生関連障害の症状を改善する能力を示す疑いのある化合物に対して、エンドスタチンを発現する細胞を曝露させることができる。曝露の後、エンドスタチンｍＲＮＡ転写物（例えばノーザン分析による）又は細胞が発現するエンドスタチン遺伝子産物について細胞可溶化物をアッセイすることによりエンドスタチン遺伝子の発現における改変を測定するべく、細胞をアッセイすることができ；エンドスタチン遺伝子の発現を調節する化合物は、治療薬として優れた候補である。或いは、例えば癌といった血管新生関連障害に関連する単数又は複数の細胞表現型が、より正常な又は損傷を受けていない、影響を受けていない表現型或いはより低い発生率又は重症度の障害症状を生成する確率がより高い表現型に似るように改変されたか否かを見極めるために、細胞を検査する。
さらに、癌などの血管新生関連障害のための動物ベースの系又はモデルを用いて、該障害の症状を改善する能力をもつ化合物を同定することが可能である。かかる動物ベースの系又はモデルには、例えばトランスジェニックマウス、例えば外因性又は内因性エンドスタチン遺伝子配列を発現するように、或いは、内因性エンドスタチン遺伝子配列をもはや発現しないように遺伝子工学処理されたマウス（すなわち「ノックアウト」マウス）が内含され得る。かかる動物モデルは、かかる障害を治療する上で効果的であり得る薬物、医薬品、療法及び処置の同定のためのテスト基質として使用できる。例えば、曝露された動物の体内で癌などの血管新生関連障害の症状のかかる改善を惹起するのに充分な時間、充分な濃度で、症状を改善する能力を示す疑いのある化合物に対し、動物モデルを曝露することができる。曝露に対する動物の応答はかかる症状の逆転を査定することによってモニター可能である。
処置に関しては、癌などの血管新生関連障害の症状のあらゆる局面を逆転させるあらゆる処置を、かかる障害におけるヒトの治療的処置の候補として考慮すべきである。テスト作用物質の投薬量は、以下で論述するように、用量−応答曲線を引き出すことによって決定可能である。
癌などの血管新生関連障害の診断及び予後評価のため及びかかる障害への素因を有する対象の同定のために、さまざまな方法を使用することができる。
かかる方法は例えば、上述のエンドスタチン遺伝子ヌクレオチド配列といったような試薬、及び上述の、そのペプチドフラグメントを含めたエンドスタチン遺伝子産物に対する抗体を利用し得る。特定的には、かかる試薬は、例えば以下の目的で使用可能である：
（１） エンドスタチン遺伝子突然変異の存在の検出、又は癌といった血管新生関連障害の状態に関係するエンドスタチン遺伝子ｍＲＮＡの過剰又は過少発現のいずれかの検出；
（２） 非罹患状態に関係するエンドスタチン遺伝子産物の過剰又は過少存在度のいずれかの検出；及び
（３） 非罹患状態に関係するエンドスタチン遺伝子産物活性の異常レベルの検出。
エンドスタチン遺伝子ヌクレオチド配列は例えば、上述のエンドスタチン突然変異検出用技術などを用いて血管新生関連障害を診断するために使用可能である。
本書で記述されている方法は例えば、癌などの血管新生関連障害の異常を示す対象を診断するべく臨床的環境などにおいて便利に使用可能である、本書で記述されている少なくとも１つの特異的エンドスタチン遺伝子核酸又は抗エンドスタチン遺伝子抗体試薬を含む、予めパッケージになった診断用キットを利用することによって、実施可能である。
エンドスタチン突然変異の検出のためには、ゲノム核酸用の出発供給源として、あらゆる核化細胞を使用することができる。エンドスタチン遺伝子発現又はエンドスタチン遺伝子産物の検出のためには、エンドスタチン遺伝子が中で発現され得るあらゆる細胞型又は組織を利用することができる。
核酸ベースの検出技術が以上で記述されている。ペプチド検出技術も上述されている。
本書で記述されている方法はさらに、本発明のポリペプチドの異常な発現又は活性に関連する疾患又は障害を有するか又は発生のリスクのある対象を同定するための診断又は予後診断用アッセイとしてもさらに利用可能である。例えば、先行する診断アッセイ又は後続するアッセイのような、本書で記述されているアッセイを、本発明のポリペプチドの異常な発現又は活性に関連する障害を有するか又はその発生のリスクのある対象を同定するために利用することができる。或いは、かかる疾患又は障害を有するか又はその発生のリスクのある対象を同定するべく、予後診断アッセイを利用することができる。かくして、本発明は、対象から試験試料を得、本発明のポリペプチド又は核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出する方法において該ポリペプチド又は核酸の存在が、該ポリペプチドの異常な発現又は活性に関連する疾患又は障害又はその発生のリスクを対象が有しているかについての診断である方法を提供している。本書で使用されている「試験試料」というのは、問題の対象から得られた生物試料を意味する。例えば、試験試料は、体液（例えば血清）、細胞試料又は組織であり得る。
その上、本書で記述されている予後診断アッセイは、本発明のポリペプチドの異常な発現又は活性に関連する疾病又は障害を治療するための作用物質（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド類似物質、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子又はその他の薬物候補）を対象に投与できるか否かを決定するために使用することができる。例えば、かかる方法を用いて、対象を特定の作用物質又は複数の作用物質クラス（例えばポリペプチドの活性を低下させるタイプの作用物質）で有効に治療できるか否かを見極めることができる。かくして、本発明は、該発明のポリペプチドの異常な発現又は活性に関連する障害について１つの作用物質で対象を有効に治療できるか否かを見極めるための方法において、試験試料を得、該ポリペプチド又はそれをコードする核酸を検出する（例えば該ポリペプチド又は核酸の存在が、該ポリペプチドの異常な発現又は活性に結びつけられて障害を治療するべく該作用物質の投与を受けることのできる対象についての診断である）方法を提供する。
本発明の方法は同様に、該発明の遺伝子内の遺伝子病変又は突然変異を検出し、かくして該病変遺伝子を有する対象が本発明のポリペプチドの異常な発現又は活性により特徴づけされる障害のリスクを有するか否かを決定するために使用することもできる。好ましい実施態様においては、該方法には、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす改変又は該発明のポリペプチドをコードする遺伝子の誤発現のうちの少なくとも１つを特徴とする遺伝子病変又は突然変異の存在又は不在を、該対象からの細胞試料中で検出することが含まれる。例えば、かかる遺伝子病変又は突然変異は、１）遺伝子からの単数又は複数のヌクレオチドの欠失；２）遺伝子に対する単数又は複数のヌクレオチドの付加；３）遺伝子の単数又は複数のヌクレオチドの置換；４）遺伝子の染色体再構成；５）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの改変；６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンに対するような、遺伝子の異常な修飾；７）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在；８）遺伝子によりコードされるタンパク質の非野生型レベル；９）遺伝子の対立遺伝子の喪失；及び１０）遺伝子によりコードされるタンパク質の不適切な翻訳後修飾のうちの少なくとも１つの存在を確認することによって検出可能である。本書で記述されているように、１つの遺伝子内の病変を検出するために使用できる当該技術分野において既知の検出技術は多数存在する。
一部の実施形態においては、病変の検出には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び４，６８３，２０２号明細書参照）例えばアンカーＰＣＲ又はＲＡＣＥ ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応における、或いはライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばLandegran et al.（１９８８）Science ２４１：１０７７−１０８０；及びナカザワet al.（１９９４）.Proc. Natl. Acad. Sci. USA９１：３６０〜３６４参照）におけるプローブ／プライマの使用が関与しており、ここで後者のものは１つの遺伝子内の点突然変異を検出するために特に有用である（例えばAbravaya et al.（１９９５）Nucleic Acids Res.２３：６７５〜６８２参照）。この方法には、対象から細胞試料を収集するステップ、試料の細胞から核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡ又は両方）を単離するステップ、遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーション及び増幅が発生するような条件下で、選択された遺伝子に対し特定的にハイブリッド形成する単数又は複数のプライマと核酸試料を接触させるステップ、及び増幅産物の存在又は不在を検出し対照試料と長さを比較するステップが含まれ得る。本書に記述されている突然変異を検出するために使用される技術のいずれかと併わせて予備増幅ステップとしてＰＣＲ及び／又はＬＣＲを使用することが望ましいかも知れないと予想される。
代替的な増幅方法としては、自己持続的配列複製（self sustained sequence replication)（Guatelli et al.（１９９０）Proc. Natl. Acad. Sci. USA８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Kwoh, et al.（１９８９）Proc. Natl. Acad. Sci. USA８６：１１７３−１１７７）Ｑベータレプリカーゼ（Lizardi et al.（１９８８）Bio/Technology６：１１９７）又はその他の核酸増幅方法とそれに続く、当業者にとっては周知の技術を用いた増幅済み分子の検出が含まれる。これらの検出スキームは、かかる分子が非常に少ない数で存在する場合に、核酸分子の検出にとって特に有用である。
代替的な１つの実施形態においては、試料細胞からの選択された遺伝子内の突然変異は、制限酵素切断パターンの改変により同定できる。例えば、試料及び対照ＤＮＡが単離され、増幅され（任意）、単数又は複数の制限エンドヌクレアーゼで消化され、ゲル電気泳動によりフラグメント長サイズが決定され比較される。試料と対照ＤＮＡの間のフラグメント長サイズの差異が、試料ＤＮＡ中の突然変異を表わす。その上、リボザイム切断部位の発生又は喪失による特異的突然変異の存在についての評定のために、配列特異的リボザイム（例えば米国特許第５，４９８，５３１号を参照）を利用することが可能である。
その他の実施態様においては、試料及び対照核酸例えばＤＮＡ又はＲＮＡを何百又は何千ものオリゴヌクレオチドプローブを収納する高密度アレイに対しハイブリッド形成させることによって、遺伝子突然変異を同定することができる（Cronin et al., １９９６，Human Mutation７：２４４−２５５；Kozal et al., １９９６，Nature Medicine２：７５３−７５９）。例えば、Cronin et al.,上掲書中で記述されているような光生成ＤＮＡプローブを収納する２次元アレイの中で、遺伝子突然変異を同定することができる。簡単に言うと、順次重複するプローブの線状アレイを作ることにより配列間の塩基変化を同定するべく試料及び対照中のＤＮＡの長いひと続き全体を通して走査するのに、第１のハイブリダイゼーションプローブアレイを使用することができる。このステップにより、点突然変異の同定が可能となる。このステップの後には、検出された全ての変異体又は突然変異に相補的なより小さく専門化されたプローブアレイを用いることにより特異的突然変異の特徴づけを可能にする第２のハイブリダイゼーションが続く。各々の突然変異アレイは、野生型遺伝子に相補的なものと突然変異体遺伝子に相補的なもう１つのものという、平行なプローブセットで構成されている。
さらにもう１つの実施態様では、当該技術分野において既知のさまざまな配列決定反応のいずれかを用いて、選択された遺伝子を直接配列決定し、試料核酸の配列と対応する野生型（対照）配列と比較することによって、突然変異を検出することが可能である（配列決定反応の例としては、Maxim及びGilbert, １９７７，Proc. Natl. Acad. Sci. USA７４：５６０又はSanger, １９７７，Proc. Natl. Acad. Sci. USA７４：５４６３により開発された技術に基づくものが含まれる）。同様に、質量分光分析による配列決定を含め、診断アッセイ（１９９５，Bio/Techiques１９：４４８）を実施する場合にさまざまな自動化された配列決定手順のいずれでも利用できるということも考慮されている（例えばＰＣＴ国際公開第９４／１６１０１; Cohen et al., １９９６，Adv. Chromatogr. ３６：１２７−１６２：及びGriffin et al., １９９３，Appl. Biochem. Biotechnol. ３８：１４７−１５９を参照のこと）。
選択された遺伝子における突然変異を検出するためのその他の方法としては、ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２重鎖中のミスマッチ塩基を検出するために切断剤からの保護が用いられる方法がある（Myers et al., １９８５，Science２３０：１２４２）。一般に、ミスマッチ切断技術は、組織標本から得た潜在的に突然変異体であるＲＮＡ又はＤＮＡと共に野生型配列を含有する（標識された）ＲＮＡ又はＤＮＡをハイブリッド形成することにより形成されたヘテロ２重鎖を提供することを必要とする。２本鎖２重鎖は、対照と試料ストランドの間の塩基対のミスマッチに起因して存在することになるもののような２重鎖の１本鎖領域を切断する作用物質で処理される。ＲＮＡ／ＤＮＡ２重鎖は、ミスマッチ領域を消化させるためＲＮアーゼで処理でき、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、ミスマッチ領域を消化するべくＳ１ヌクレアーゼで処理できる。その他の実施態様においては、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウム及びピペリジンで、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ２重鎖のいずれでも処理することができる。ミスマッチ領域の消化の後、次に結果としての材料を、突然変異部位を決定するべく変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズ毎に分離させる（例えばCotton et al., １９８８，Proc. Natl. Acad. Sci. USA８５：４３９７；Saleeba et al., １９９２，Methods Enzymol. ２１７：２８６−２９５を参照のこと）。好ましい実施態様では、検出のため、対照ＤＮＡ又はＲＮＡを標識することができる。
さらにもう１つの実施態様では、ミスマッチ切断反応は、細胞試料から得たｃＤＮＡ内の点突然変異を検出しマッピングするため、規定の系内で２本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する単数又は複数のタンパク質（いわゆるＤＮＡミスマッチ修復酵素）を利用する。例えば、E.coliのmutY酵素は、Ｇ／ＡミスマッチにおいてＡを切断し、HeLa細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチでＴを切断する、（Hsu et al., １９９４，Carcinogenesis１５：１６５７−１６６２）。１つの例示的実施態様によれば、例えば野生型配列といった選択された配列に基づくプローブは、テスト細胞（単複）からのｃＤＮＡ又はその他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。２重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理され、切断産物があれば、それは電気泳動プロトコルなどから検出可能である（例えば米国特許第５，４５９，０３９号明細書参照）。
その他の実施態様では、電気泳動易動度の改変を用いて遺伝子内の突然変異を同定することになる。例えばＳＳＣＰを用いて、突然変異体と野生型核酸の間の電気泳動易動度の差を検出することができる。（Orita et al., １９８９，Proc. Natl. Acad. Sci. USA８６：２７６６；同様にCotton, １９９３，Mutat. Res.２８５：１２５−１４４；Hayashi, １９９２，Genet. Anal. Tech. Appl.９：７３−７９）。試料及び対照核酸の１本鎖ＤＮＡフラグメントが変性され、復元できるようになる。１本鎖核酸の二次構造は配列に応じて変動し、結果としてもたらされる電気泳動易動度の改変は、単一の塩基変化でさえ検出可能である。ＤＮＡフラグメントを標識するか又は標識されたプローブで検出することができる。アッセイの感度はＲＮＡ（ＤＮＡではなく）を用いることにより増強され得、ここで２次構造は配列変化に対しより敏感である。好ましい実施態様においては、当該方法は電気泳動易動度の変化に基づいて２本鎖ヘテロ２重鎖分子を分離するためにヘテロ２重鎖分析を利用する（Keen et al., １９９１，Trends Genet. ７：５）。
さらにもう１つの実施態様においては、変性剤濃度勾配を含むポリアクリルアミドゲル内の突然変異体又は野生型フラグメントの動きは、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いてアッセイされる（Myers et al., １９８５，Nature ３１３：４９５）。分析方法としてＤＧＧＥが使用される場合、例えばＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点のＧＣ豊富なＤＮＡのＧＣクランプを付加することにより、ＤＮＡを完全に変性しないように修飾させることになる。さらにもう１つの実施態様においては、対照及び試料ＤＮＡの易動度の差異を同定するため、変性剤濃度勾配のかわりに温度勾配が使用される（Rosenbaum及びReissner, １９８７，Biophys. Chem. ２６５：１２７５３）。
点突然変異を検出するためのその他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅又は選択的プライマ伸長法が含まれるが、これらに制限されるわけではない。例えば、既知の突然変異が中央に置かれたオリゴヌクレオチドプライマを調製し、次に、完全にマッチすることが見い出された場合にのみハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的ＤＮＡに対しこれをハイブリッド形成させることができる（Saiki et al., １９８６，Nature ３２４：１６３；Saiki et al., １９８９，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：６２３０）。かかる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、それがハイブリッド形成膜に付着され、標識された標的ＤＮＡとハイブリッド形成される場合には、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡにハイブリッド形成されるか又は、多くの異なる突然変異に対しハイブリッド形成される。
或いは、本発明と併わせて、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を使用することができる。特異的増幅のためのプライマとして使用されるオリゴヌクレオチドは、（増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように）分子の中心に（Gibbs et al., １９８９，Nucleic Acids Res. １７：２４３７−２４４８）、又は適切な条件下でミスマッチがポリメラーゼ拡張を防止又は低減させ得る１つのプライマの３’最末端に（Prossner, １９９３，Tibtech １１：２３８）、問題の突然変異を担持し得る。さらに、切断ベースの検出を作り出すべく突然変異の領域内に新規の制限部位を導入することが望ましいかもしれない（Gasparini et al., １９９２，Mol. Cell Probes６：１）。一部の実施形態においては、増幅用のTaqリガーゼを用いて、増幅を実施することも同様に可能であると予想される（Barany, １９９１，Proc. Natl. Acad. Sci. USA８８：１８９）。このような場合には、ライゲーションは、５’配列の３’末端に完全なマッチングが存在する場合にのみ起こり、かくして増幅の有無を探すことで特定の部位における既知の突然変異の存在が検出できるようになる。
本書で記述している方法は、例えば、本書で記述された少なくとも１つのプローブ核酸又は抗体試薬を含む予めパッケージになった診断キットを利用することによって実施でき、このキットは、例えば、該発明のポリペプチドをコードする遺伝子が関与する疾患又は病気の家族歴又は症状を示す対象を診断するべく臨床的環境内で便利に使用可能である。さらに、本発明のポリペプチドが内部で発現されるあらゆる細胞型又は組織好ましくは末梢血白血球を、本書で記述された予後診断アッセイにおいて利用することができる。
本発明はさらに、本書で記述されているエンドスタチン遺伝子及び遺伝子産物の使用及び／又は検出を容易にするキットを提供している。本書で記述されているキットは、例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子が関与する疾患又は病気の家族歴又は症状を示す対象を診断するべく臨床的環境内で便利に使用可能である。さらに、本発明のポリペプチドが内部で発現されるあらゆる細胞型又は組織を本書で記述された予後診断アッセイにおいて利用することができる。
１つの実施態様においては、エンドスタチン遺伝子又は遺伝子産物を誤発現する細胞又は組織を同定するための診断用テストキットが提供される。この実施態様においては、オリゴヌクレオチド、例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に対しハイブリッド形成する検出可能な形で標識されたオリゴヌクレオチドの入った単数又は複数の容器を伴う診断キットが提供される。もう１つの実施態様においては、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を増幅するために有用な一対のプライマの入った単数又は複数の容器を伴うキットが提供される。その他のさまざまな実施態様において、該キットは、例えば緩衝剤、防腐剤又はタンパク質安定化剤などを含むこともできる。該キットは、検出可能な作用物質を検出するのに必要な構成要素を含むこともできる（例えば酵素又は基質）。該キットは、アッセイ可能でかつ試験試料に比較可能な対照試料又は一連の対照試料を含むこともできる。キットの各構成要素は通常個々の容器内に封入されており、さまざまな容器の全ては、テスト対象が該ポリペプチドの異常な発現に関連する障害を患っているか又はそれを発生させるリスクをもつか否かを観察するため、使用説明書と共に単一のパッケージ内に入っている。かかるキットは、例えば、対象からの細胞試料内のタンパク質をコードする核酸分子のレベルを測定し、例えばｍＲＮＡレベルを検出するか又はタンパク質をコードする遺伝子が突然変異又は欠失を受けたか否かを決定するために使用できる。
もう１つの実施態様では、本発明は、生物試料（試験試料）中の本発明のポリペプチド又は核酸の存在を検出するためのキットを提供する。かかるキットは、対象が、本発明の配列の使用に関して以上のセクションなどで論述してきたような本発明のポリペプチドの異常発現に関連する障害を患っているか又はそれを発生させるリスクが増大しているかを見極めるために、使用可能である。この実施態様においては、（１）本発明のポリペプチドに結合する（例えば固体支持体に付着した）第１の抗体；そして、任意には（２）ポリペプチド又は第１の抗体のいずれかに結合しかつ検出可能な作用物質に結合されている第２の異なる抗体の入った単数又は複数の容器を伴うキットが提供される。かかるキットは、対象が、癌といった血管新生関連障害を患っているか又はそのリスクが増大しているか否かを見極めるために使用可能である。
以下で記述されているのは、エンドスタチン媒介プロセスを修正でき及び／又は癌などの血管新生関連障害を治療できる方法及び組成物である。
例えば、かかる方法は、該プロセスが調節されるか又は該障害の症状が改善されるような形でエンドスタチン遺伝子産物の合成若しくは活性及び／又はエンドスタチン遺伝子の発現を調節する化合物を投与する段階を含むことができる。
或いは、癌などの血管新生関連障害がそれぞれエンドスタチン活性を低下させるか又は根絶させるエンドスタチン遺伝子突然変異の結果としてもたらされるようなケースにおいては、かかる方法は損傷を受けていないエンドスタチン遺伝子産物が発現され障害の症状が改善されるように、損傷を受けていないエンドスタチン遺伝子産物をコードする核酸分子を哺乳動物に供給することを含むことができる。
エンドスタチン遺伝子突然変異の結果もたらされる癌などの哺乳動物の血管新生関連障害の治療方法のもう１つの実施態様においては、かかる方法は、細胞が損傷を受けていないエンドスタチン遺伝子産物を発現し障害の症状が改善されるように、損傷を受けていないエンドスタチン遺伝子産物をコードする核酸分子を含む細胞を哺乳動物に供給することを含むことができる。
正常なエンドスタチン遺伝子産物の機能の喪失が癌などの血管新生関連障害表現型の発生という結果をもたらす場合においては、エンドスタチン遺伝子産物活性の増大が、エンドスタチン遺伝子発現及び／又はエンドスタチン遺伝子産物活性レベルの不足を示す個々の生体の中で無症状状態に向かっての進行を容易にすると思われる。エンドスタチンの発現又は合成を促進するための方法としては、例えば、以下で記述するような方法が含まれ得る。
或いは、エンドスタチン遺伝子産物活性及び／又はエンドスタチン遺伝子発現のレベルを減少させる化合物を投与することにより、癌などの血管新生関連障害表現型の症状を改善することができる。エンドスタチンの合成又は発現を阻害するかそのレベルを低減させるための方法には、例えば、以下で記述するもののような方法が含まれる可能性がある。
治療方法の１つの実施態様においては、投与される化合物は、血管新生関連障害の症状を改善するか又は悪化させると報告された化合物、特に薬物を含まない。かかる治療方法がこのような化合物を実際に含んでいる場合、好ましくは、かかる化合物は、かかる化合物が以前に投与されたやり方とは異なるやり方（例えば異なる投薬量、投与様式、及び／又は単数又は複数の付加的な化合物との同時投与）で利用される。
もう１つの実施態様においては、癌などの本書で記述されている障害の症状は、例えば上述のエンドスタチンタンパク質、融合タンパク質及びペプチド配列を用いてエンドスタチンのレベル及び／又は活性を増減させるエンドスタチンタンパク質療法によって、或いはエンドスタチン遺伝子又は遺伝子産物と相互作用してその活性を阻害又は増強するタンパク質又はタンパク質フラグメント（例えばペプチド）の投与によって改善され得る。
かかるタンパク質療法は、例えば、機能的エンドスタチンタンパク質又は機能的エンドスタチンドメインを表わすエンドスタチンタンパク質のフラグメント（例えばペプチド）の投与を内含し得る。
１つの実施態様においては、機能的エンドスタチン結合ドメインを表わすエンドスタチンフラグメント又はペプチドは、ペプチドがエンドスタチン結合タンパク質、例えばエンドスタチンレセプタに結合するように、個々の生体に投与される。かかるフラグメント又はペプチドは、結合タンパク質に対するエンドスタチンの結合と競合しかくしてそれを阻害し、かくして本書で記述されている障害の症状を改善させることにより、個々の生体内でエンドスタチン活性を阻害するのに役立ち得る。或いは、かかるフラグメント又はペプチドは、インビボでエンドスタチンの機能を模倣することによって個々の生体内のエンドスタチン活性を増強させ、それによって本書で記述されている障害の症状を改善する。
本発明の方法において使用可能なタンパク質及びペプチドは、合成（例えば組換え型又は化学的に合成された）タンパク質及びペプチドならびに天然のタンパク質及びペプチドを内含している。タンパク質及びペプチドは、天然のもの及び天然以外のものの両方のアミノ酸残基（例えばＤ−アミノ酸残基）及び／又は単数又は複数の非ペプチド結合（例えばイミノ、エステル、ヒドラジド、セミカルバジド及びアゾ結合）を有し得る。タンパク質又はペプチドは、例えば該ペプチドの安定性、バイオアベイラビリティー及び／又は阻害活性が増強されるように、アミノ及び／又はカルボキシ末端に存在するさらなる化学基（すなわち官能基）をも含有してよい。官能基の例としては、疎水基（例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル及びｔ−ブチルオキシカルボニル基）、アセチル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基及びペプチド基を含む高分子担体基（例えば脂質−脂肪酸コンジュゲート、ポリエチレングリコール又は炭水化物）がある。
もう１つの実施態様においては、癌といった或る種の血管新生関連障害の症状は、エンドスタチン遺伝子発現のレベルを減少させるべく周知のアンチセンス、遺伝子「ノックアウト」、リボザイム及び／又は３重らせん方法と併せてエンドスタチン遺伝子配列を使用することによって、エンドスタチン遺伝子産物活性及び／又はエンドスタチン遺伝子発現レベルを減少させることで改善できる。癌などの血管新生関連障害の症状を改善させる能力を含むエンドスタチン遺伝子の活性、発現又は合成を調節する能力を示すことのできる化合物の中には、アンチセンス、リボザイム及び３重らせん分子がある。かかる分子は、損傷を受けていないか又は適当な場合には突然変異体である標的遺伝子のいずれかの活性を低減させるか又は阻害するように設計され得る。かかる分子の産生及び使用のための技術は、当業者にとっては周知のものである。
アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子は、ターゲティングされたｍＲＮＡに対しハイブリッド形成しタンパク質の翻訳を妨害することによってｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用する。アンチセンスアプローチは、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドの設計を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を妨害することになる。完全な相補性は、好ましいものの必要ではない。
本書で言及されている、ＲＮＡの一部分に対して「相補的な」配列というのは、ＲＮＡとハイブリッド形成して安定した２重鎖を形成することができるように充分な相補性をもつ配列を意味し、２重鎖アンチセンス核酸の場合、２重鎖ＤＮＡの単一ストランドがかくしてテストされてもよいし、又は、３重鎖構成をアッセイすることもできる。ハイブリッド形成する能力は、相補性の程度及びアンチセンス核酸の長さの両方に依存することになる。一般に、ハイブリッド形成する核酸が長くなればなるほど、それが含有することができ、かつなおも安定した２重鎖（又は場合によって３重鎖）を形成し得るＲＮＡとの塩基ミスマッチは多くなる。当業者であれば、ハイブリッド形成された複合体の融点を決定するための標準的な手順を使用することにより許容可能なミスマッチの程度を確定することができる。
１つの実施態様においては、エンドスタチン遺伝子の非コーディング領域に相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスアプローチにおいて使用して、内因性エンドスタチンｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。アンチセンス核酸は、少なくとも長さが６ヌクレオチドであるべきであり、好ましくは６〜約５０個のヌクレオチドという長さ範囲内のオリゴヌクレオチドである。特定の側面において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド又は少なくとも５０ヌクレオチドである。
標的配列の選択の如何に関わらず、遺伝子発現を阻害するべくアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量するためのインビトロ研究をまず最初に実施することが好ましい。これらの研究では、アンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的生物学的効果を区別する対照が利用されることが好ましい。これらの研究が標的ＲＮＡ又はタンパク質のレベルを内部対照のＲＮＡ又はタンパク質のレベルと比較することも、同様に好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を対照のオリゴヌクレオチドを用いて得たものと比較することも考慮される。対照のオリゴヌクレオチドは、テストオリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さのものであること及びオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が標的配列に対する特異的ハイブリダイゼーションを妨害するのに必要な程度以下しかアンチセンス配列と異なっていないことが好ましい。
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ或いはそのキメラ混合物又は誘導体或いは１本鎖又は２本鎖のその修飾バージョンであり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば分子、ハイブリダイゼーションなどの安定性を改善させるべく、塩基部分、糖部分又はリン酸塩骨格において修飾可能である。オリゴヌクレオチドは、（例えばインビボで宿主細胞レセプタをターゲティングするための）ペプチド、又は細胞膜（例えばLetsinger, et al., １９８９，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ８６，６５５３−６５５６；Lemaitre, et al., １９８７，Proc. Natl. Acad. Sci. ８４，６４８−６５２；１９８８年１２月１５日に公示されたＰＣＴ国際公開第８８／０９８１０号パンフレットを参照）又は血液−脳障壁（例えば１９８８年４月２５日付けで公示されたＰＣＴ国際公開第８９／１０１３４号パンフレット参照）を横断する輸送を容易にする作用物質、ハイブリダイゼーションを誘因とする切断剤（例えば、Krol et al., １９８８，BioTechniques ６，９５８−９７６を参照）又はインターカレート剤（例えばZon, １９８８，Pharm. Res.５，５３９−５４９を参照）といったその他の追加の群を内含し得る。この目的で、オリゴヌクレオチドは、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションを誘因とする架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションを誘因とする切断剤などのその他の分子に結合され得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ハイポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンを含む（ただし、これに制限されるわけではない）グループの中から選択される少なくとも１つの修飾された塩基部分を含み得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む（ただし、これに制限されるわけではない）群の中から選択された少なくとも１つの修飾された糖部分を含む。
さらにもう１つの実施態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホラミドチオアート、ホスホラミダート、ホスホルジアミダート、メチルホスホナート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はそれらの類似体から成る群の中から選択された少なくとも１つの修飾されたリン酸塩骨格を含む。
さらにもう１つの実施態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ単位と異なりストランドが互いに平行に走っている特異的２本鎖ハイブリッドを相補的ＲＮＡと形成する（Gautier, et al., １９８７，Nucl. Acids Res.１５，６６２５−６６４１）。オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Inoue, et al., １９８７，Nucl. Acids Res.１５，６１３１−６１４８）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue, et al., １９８７，FEBS Lett. ２１５，３２７−３３０）である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置（例えばBiosearch, Applied Biosystemsなどから市販されているもの）を使用して、当該技術分野において既知の標準的方法によって合成され得る。例としては、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、Stein, et al.,（１９８８，Nucl. Acids Res.１６，３２０９）の方法により合成可能であり、メチルホスホナートオリゴヌクレオチドは、制御型多孔質ガラスポリマー（controlled pore glass polymer）支持体を用いることによって調製可能である（Sarin, et al.,１９８８，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.８５，７４４８−７４５１）等々。
標的遺伝子コーディング領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用することができると思われるものの、転写された未翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
インビボで標的遺伝子を発現する細胞に対しアンチセンス分子を送達すべきである。アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを細胞に送達するために数多くの方法が開発されてきた。例えば、アンチセンス分子を、組織部位内に直接注入することが可能であり、そうでなければ、所望の細胞をターゲティングするように設計された修飾済みアンチセンス分子（例えば標的細胞表面上で発現されたレセプタ又は抗原に特異的に結合するペプチド又は抗体に連結されたアンチセンス）を全身的に投与することができる。
ただし、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑圧するのに充分なアンチセンスの細胞内濃度を達成するのは往々にして困難である。従って、好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌＩＩＩ又はｐｏｌＩＩプロモータの制御下に置かれる組換え型ＤＮＡ構築物を利用している。対象の体内で標的細胞をトランスフェクトするのにこのような構築物を使用した結果、内因性標的遺伝子転写物と相補的塩基対を形成しかくして標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を防止する充分な量の標的１本鎖ＲＮＡの転写がもたらされることになる。例えば、細胞により取り込まれアンチセンスＲＮＡの転写を導くような形で、ベクターを導入することができる。かかるベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写され得るかぎり、エピソームであり続けるか又は染色体組込みされ得る。かかるベクターは、当該技術分野において標準的な組換え型ＤＮＡ技術方法によって構築可能である。ベクターは、プラスミド、ウイルス又は哺乳動物細胞内での複製及び発現に用いられる当該技術分野において既知のその他のものであり得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞内で作用するものとして当該技術分野において既知である任意のプロモータによるものであり得る。かかるプロモータは誘導性又は構成性であり得る。かかるプロモータには、ＳＶ４０早期プロモータ領域（Benoist 及びChambon,１９８１，Nature ２９０，３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復内に含まれるプロモータ（Yamamoto, et al., １９８０，Cell ２２，７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Wagner, et al., １９８１，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ７８，１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Brinster, et al., １９８２，Nature ２９６，３９−４２）などが含まれるがこれらに制限されるわけではない。組織部位内に直接導入され得る組換え型ＤＮＡ構築物を調製するためには、あらゆるタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣ又はウイルスベクターを使用することができる。或いは、所望の組織を選択的に感染させるウイルスベクターを使用することができ、この場合、投与はもう１つの経路で達成可能である（例えば全身的）。
標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳ひいては標的遺伝子産物の発現を妨害するため、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物を触媒作用的に切断させるように設計されたリボザイム分子も同様に使用可能である。（例えば１９９０年１０月４日付けＰＣＴ国際公開第９０／１１３６４号パンフレット；Sarver, et al., １９９０，Science ２４７，１２２２−１２２５を参照）。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒する能力をもつＲＮＡ酵素分子である（再考のためには、Rossi, １９９４，Current Biology４，４６９−４７１を参照のこと）。リボザイム作用のメカニズムには、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションとそれに続くエンドヌクレアーゼ的切断事象が含まれる。リボザイム分子の組成は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な単数又は複数の配列を内含していなければならず、ｍＲＮＡ切断の原因である周知の触媒配列を内含しなければならない。この配列については、全体が本書に参考として内含されている米国特許第５，０９３，２４６号明細書を参照のこと。
標的遺伝子ｍＲＮＡｓを破壊するためには部位特異的認識配列においてｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用することができるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成するフランキング領域により指示された場所でｍＲＮＡを切断する。唯一の必要条件は、標的ｍＲＮＡが２つの塩基の配列すなわち５’−ＵＧ−３’を有しているということである。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び産生は当該技術分野において周知であり、全体が本書に参考として内含されているHasel off及びGerlach, １９８８，Nature, ３３４，５８５−５９１及びMyers, １９９５，Molecular Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, New York,（特に図４，ｐ８３３を参照）により詳細に記述されている。
好ましくは、リボザイムは、標的遺伝子ｍＲＮＡの５’末端近くに切断認識部位があるように、すなわち効率を高め非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小限におさえるように設計される。
本発明のリボザイムは、天然にTetrahymena thermophila（ＩＶＳ、又はＬ−１９ＩＶＳＲＮＡとして知られている）内で発生し、Thomas Cech及びその共同研究者によって広範に記述されてきたもの（Zaug, et al., １９８４，Science, ２２４，５７４−５７８；Zaug及びCech, １９８６，Science, ２３１，４７０−４７５；Zaug, et al., １９８６，Nature, ３２４，４２９−４３３；University Patents Inc.,が公示した国際公開第８８／０４３００号パンフレット；Been及びCech, １９８６，Cell, ４７，２０７−２１６）といったようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下「Cech型リボザイム」と呼ぶ）をも内含している。Cech型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列に対してハイブリッド形成する８塩基対活性部位を有し、その後標的ＲＮＡの切断がおこる。本発明は、標的遺伝子内に存在する８塩基対活性部位をターゲティングするこれらのCech型リボザイムを包含する。
アンチセンスアプローチの場合と同様に、リボザイムは、（例えば安定性の改善、ターゲティングなどのために）修飾されたオリゴヌクレオチドで構成され得、インビボで標的遺伝子を発現する細胞に送達されるべきである。好ましい送達方法には、トランスフェクトされた細胞が内因性標的遺伝子メッセージを破壊し翻訳を阻害するのに充分な量のリボザイムを産生するような形で、強い構成性ｐｏｌＩＩＩ又はｐｏｌＩＩプロモータの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することが関与している。リボザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性であることから、効率のために必要とされる細胞内濃度は比較的低いものである。
ターゲティングされた相同組換えを用いて標的遺伝子又はそのプロモータを不活性化又は「ノックアウト」することにより、内因性標的遺伝子発現を減少させることもできる（例えば、各々全体が本書に参考として内含されているSmithies, et al., １９８５，Nature ３１７，２３０−２３４；Thomas及びCapecchi, １９８７，Cell ５１，５０３−５１２；Thompson, et al., １９８９，Cell５，３１３−３２１を参照）。例えば、内因性標的遺伝子に相同なＤＮＡ（標的遺伝子のコーディング領域又は制御領域のいずれか）によりフランキングされた突然変異体非機能的標的遺伝子（又は完全に無関係のＤＮＡ配列）を、選択マーカー及び／又は負の選択マーカーと共にか或いはこれを伴わずに使用して、インビボで標的遺伝子を発現する細胞をトランスフェクトすることができる。ターゲティングされた相同組換えを介したＤＮＡ構築物の挿入は、結果として標的遺伝子の不活性化をもたらす。かかるアプローチは、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）に対する修飾を用いて不活性標的遺伝子を有する動物の子孫を生成することのできる農業分野において特に適している（例えばThomas及びCapecchi,１９８７及びThompson, １９８９，上掲書を参照のこと）しかしながら、このアプローチは、組換え型ＤＮＡ構築物が直接投与されるか又は適切なウイルスベクターを用いてインビボで所要の部位にターゲティングされることを条件として、ヒトにおいて使用するべく適合させることができる。
或いは、体内の標的細胞内の標的遺伝子の転写を妨害する３重らせん構造を形成するために標的遺伝子（すなわち標的遺伝子プロモータ及び／又はエンハンサー）の制御領域に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲティングすることにより、内因性標的遺伝子発現を低減させることができる（一般的には、Helene, １９９１，Anticancer Drug Des., ６（６），５６９−５８４；Helene, et al., １９９２，Ann. N. Y. Acad. Sci., ６６０，２７−３６；及びMaher, １９９２，Bioassays １４（１２），８０７−８１５を参照のこと）。
転写の阻害のために三重鎖らせん構成の中で使用すべき核酸分子は、一本鎖でかつデオキシヌクレオチドで構成されているべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般にプリン又はピリミジンのかなり大きなストレッチが２重鎖の１本のストランド上に存在することを必要とする、Hoogsteen塩基対合法則を介して３重らせん形成を促進するように設計されなくてはならない。ヌクレオチド配列はピリミジンベースのものであり得、その結果、結果としての３重らせんの３つの会合したストランドを横断してＴＡＴ及びＣＧＣトリプレットがもたらされる。ピリミジン豊富な分子は、そのストランドに対し平行な配向で、２重鎖の単一ストランドのプリン豊富な領域に相補的な塩基を提供する。さらに、プリンに富む、例えばＧ残基のストレッチを含む核酸分子を選択することができる。これらの分子は、ＧＣ対に富むＤＮＡ２重鎖と３重らせんを形成することになり、この中で大部分のプリン残基はターゲティングされた２重鎖の単一ストランド上にあり、結果として、３重鎖内の３つのストランドを横断してＧＧＣトリプレットをもたらす。
或いは、３重らせん形成のためにターゲティングされ得る潜在的配列を、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作り上げることによって増加させることができる。スイッチバック分子は、交替する５’−３’、３’−５’の要領で合成され得、かくして、これらは２重鎖の最初の１つのストランドと塩基対合し、次にもう１つのストランドと塩基対合し、２重鎖の１本のストランドの上にプリン又はピリミジンのいずれかのかなり大きなストレッチが存在する必要性を無くしている。
本書で記述されているアンチセンス、リボザイム、及び／又は３重らせん分子が突然変異体遺伝子発現を阻害するために利用されるケースにおいては、該技術が正常な標的遺伝子の対立遺伝子により産生されたｍＲＮＡの転写（３重らせん）及び／又は翻訳（アンチセンス、リボザイム）を非常に効率良く低減させるか又は阻害するため、存在する正常な標的遺伝子産物の濃度が正常な表現型にとって必要なものよりも低いものであり得るかもしれないと考えられる。従って、このような場合には、標的遺伝子活性の実質的に正常なレベルを確実に維持させるため、いかなるアンチセンス、リボザイム又は３重らせん治療が利用されていようともそれらに対し感受性のある配列を含んでいない、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子のポリペプチドをコードし発現する核酸分子を、以下に記すもののような遺伝子治療を介して細胞内に導入することができる。或いは、標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードするケースでは、標的遺伝子活性の所要レベルを維持するために、正常な標的遺伝子タンパク質を同時投与することが好ましいかもしれない。
本発明のアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ、リボザイム及び３重らせん分子は、上述の通りのＤＮＡ又はＲＮＡ分子の合成のための当該技術分野において既知のあらゆる方法によって調製することができる。これらには、例えば固相ホスホラミダイト化学合成といったような当該技術分野において周知のオリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための技術が含まれる。或いは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ及びインビボ転写によって生成可能である。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモータといったような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを取込む様々なベクター内に取込まれ得る。或いは、使用されるプロモータに応じて構成的又は誘発的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を細胞系列中に安定した形で導入することが可能である。
正常なエンドスタチン遺伝子発現レベル及び／又はエンドスタチン遺伝子産物活性の増加に関しては、例えば上述のエンドスタチン遺伝子核酸配列を癌などの血管新生関連障害の治療のために利用することができる。かかる治療は例えば遺伝子交換療法の形で投与され得る。特定的には、正常なエンドスタチン遺伝子機能を示すエンドスタチン遺伝子産物の産生を導く正常なエンドスタチン遺伝子又はその一部分の単数又は複数のコピーを、リポソームといったような、細胞内にＤＮＡを導入するその他の粒子に加えて、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス及びレトロウイルスベクターを含む（ただし、これに制限されるわけではない）ベクターを用いて、対象内の適切な細胞の中に挿入することができる。
エンドスタチン遺伝子は脳内で発現され得ることから、かかる遺伝子交換療法技術は、対象内でこれらの細胞型にエンドスタチン遺伝子配列を送達する能力を有するべきである。かくして、１つの実施態様においては、エンドスタチン遺伝子配列が血液−脳障壁を容易に横断できるようにし脳内の細胞に配列を送達するために、当業者にとっては周知の技術（例えば、１９８８年４月２５日付けのＰＣＴ国際公開第８９／１０１３４号パンフレットを参照のこと）を使用することができる。血液−脳障壁を横断する能力をもつ送達に関しては、例えば以上で記述したもののようなウイルスベクターが好まれる。
もう１つの実施態様においては、送達技術には、エンドスタチン遺伝子配列が中で発現されるはずの細胞の部位に対するかかるエンドスタチン遺伝子配列の直接投与が含まれる。
エンドスタチン遺伝子発現の全体的レベル及び／又はエンドスタチン遺伝子産物活性を増大させるために利用可能な付加的な方法としては、適切なエンドスタチン発現細胞好ましくは自系細胞を、癌などの血管新生関連障害の症状を改善させるために充分な位置及び数で対象内に導入することが含まれる。かかる細胞は組換え型又は非組換え型のいずれであってもよい。
対象内でのエンドスタチン遺伝子発現の全体的レベルを増加させるために投与され得る細胞としては、エンドスタチン遺伝子を発現する正常細胞、好ましくは肝細胞がある。
或いは、細胞、好ましくは自系細胞をエンドスタチン遺伝子配列を発現するように工学処理することができ、そして次に癌などの血管新生関連障害の症状の改善に適した位置で対象の体内にこれを導入することができる。かわりに、損傷を受けていないエンドスタチン遺伝子を発現する細胞及びＭＨＣがマッチする個々の生体からの細胞を利用することができ、これには例えば肝細胞が含まれる。エンドスタチン遺伝子配列の発現は、必要な細胞型内でのかかる発現を可能にするべく適切な遺伝子制御配列によって制御される。かかる遺伝子制御配列は、当業者にとっては周知のものである。かかる細胞ベースの遺伝子治療技術は、当業者にとって周知のものである。例えばAnderson,米国特許第５，３９９，３４９号を参照のこと。
投与すべき細胞が非自系細胞である場合、これらは、導入された細胞に対する宿主免疫応答の発生を防止する周知の技術を用いて投与可能である。例えば、細胞は、直接的細胞外環境と構成要素の交換を可能にしながら、導入された細胞を宿主免疫系に認識させないカプセル封入された形態で導入され得る。
さらに、エンドスタチン遺伝子産物活性を調節する能力をもつ上記のもののような技術を介して同定されたものといった化合物は、当業者にとって周知の標準的技術を用いて投与可能である。投与されるべき化合物に脳細胞との相互作用が含まれるケースでは、投与技術には、血液−脳障壁の横断を可能にする周知のものが含まれるべきである。
本書で記述されているスクリーニングアッセイによって同定されるような本発明のポリペプチドの活性又は発現に対し刺激又は阻害効果を有する作用物質又はモジュレータを、該ポリペプチドの異常活性に付随する障害を（予防的に又は治療的に）処置する目的で個々の生体に投与することができる。かかる処置と併用して、個々の生体の薬理ゲノミクス（すなわち個体の遺伝子型と外来性化合物又は薬物に対するその個体の応答の間の関係の研究）を考慮することができる。各治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の血中濃度と用量の間の関係を変化させることによって、重大な毒性又は治療の失敗を導き得る。かくして、個々の生体の薬理ゲノミクスは、個々の生体の遺伝子型を考慮した上でそれに基づいて予防的又は治療的処置のために有効な作用物質（例えば薬物）を選択することを可能にする。かかる薬理ゲノミクスは、さらに、適切な投薬量及び治療計画を決定するためにも用いることができる。従って、本発明のポリペプチドの活性、該発明の核酸の発現又は個々の生体内の該発明の遺伝子の突然変異含有率を決定し、これにより個々の生体の治療的又は予防的処置のための適切な作用物質（単複）を選択することが可能である。
薬理ゲノミクスは、罹患した個々の動物の体内での変化した薬物動態及び異常な作用に起因する薬物に対する応答の臨床的に有意な遺伝的変動を取扱う。例えばLinder（１９９７）Clin, Chem.４３（２）；２５４−２６６を参照のこと。一般に、２つのタイプの薬理遺伝的条件を区別することができる。薬物の身体に対する作用の様式を改変させる単一の因子として伝達される遺伝的条件は、「改変済み薬物作用」と呼ばれる。これらの薬理遺伝的条件は、稀な欠陥としてか又は多型のいずれかとして発生しうる。例えばグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠乏症（Ｇ６ＰＤ）は、酸化剤薬物（抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取及びソラマメの消費後の溶血反応が主たる臨床的合併症である一般的な遺伝性酵素病である。
例示的な実施態様としては、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度及び持続時間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えばＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）及びシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見により、何故一部の対象で期待された薬物効果が得られないか又は標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後過度の薬物応答及び重大な毒性を示すかについての説明が得られた。これらの多型は、集団内の２つの表現型、つまり高代謝群（ＥＭ）及び低代謝群（ＰＭ）として発現される。ＰＭの有病率は、異なる集団間で異なっている。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６についてコードする遺伝子は、きわめて多型であり、ＰＭ内で複数の突然変異が同定されており、これら全てが機能的ＣＹＰ２Ｄ６の不在を導く。ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は標準用量を受けた時点できわめて頻繁に、過度の薬物応答及び副作用を経験する。代謝産物が活性治療剤部分である場合、ＰＭは、そのＣＹＰ２Ｄ６から形成された代謝産物モルヒネにより媒介されたコデインの鎮痛効果について実証された通り、いかなる治療的応答も示さないことになる。もう１つの極端な場合は、標準用量に応答しないいわゆる超高代謝群である。最近になって、超高代謝の分子的基礎がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因するものとして同定されてきた。
従って、本発明のポリペプチドの活性、該ポリペプチドをコードする核酸の発現又は個々の生体内でのポリペプチドをコードする遺伝子の突然変異含有量を決定し、かくして個々の生体の治療的又は予防的処置のための適切な作用物質（単複）を選択することができる。さらに、個々の生体の薬物応答性表現型の同定に対し薬物代謝酵素をコードする多型性対立遺伝子の遺伝子型特定を適用するために、薬理遺伝的研究を用いることができる。この知識は、用量決定又は薬物選択に適用された場合、不利な反応又は治療の失敗を回避し、かくして本書で記述されているスクリーニングアッセイ例の１つによって同定された調節剤といったような、該ポリペプチドの活性又は発現の調節剤で対象を処置する場合の治療的又は予防的効率を増強することができる。
本発明のポリペプチドの発現又は活性に対する作用物質（例えば薬物、化合物）の影響（例えば異常な細胞増殖走化性及び／又は分化を調節する能力）をモニターすることを、基本的薬物スクリーニングのみならず臨床試験においても適用することが可能である。例えば、本書に記述されているようなスクリーニングアッセイにより決定されるような１つの作用物質の有効性を、減少した遺伝子発現、タンパク質レベル又はタンパク質活性を示す対象の臨床試験においてモニターすることができる。或いは、スクリーニングアッセイにより決定される、遺伝子発現、タンパク質レベル又はタンパク質活性を減少させる１つの作用物質の有効性は、増大した遺伝子発現、タンパク質レベル又はタンパク質活性を示す対象の臨床試験においてモニターすることが可能である。このような臨床試験においては、本発明のポリペプチドの発現又は活性そして好ましくは、例えば細胞増殖障害に関与してきたその他のポリペプチドの発現又は活性を、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして使用することができる。
例えば、制限的な意味でなく、（本書に記述されているスクリーニングアッセイにおいて同定されるような）本発明のポリペプチドの活性又は発現を調節する作用物質（例えば化合物、薬物又は小分子）での処置によって細胞内で調節される、本発明のものを含めた遺伝子を同定することができる。かくして、例えば臨床試験において細胞増殖障害に対する作用物質の効果を研究するためには、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、本発明の遺伝子及び該障害に関与するその他の遺伝子の発現レベルについてこれを分析することができる。遺伝子発現レベル（すなわち遺伝子発現パターン）は、本書に記述されているように、ノーザンブロット分析又はＲＴ−ＰＣＲによってか、或いは本書に記述されている方法のうちの１つによって、産生されたタンパク質の量を測定することによってか、或いは本発明の遺伝子又はその他の遺伝子の活性レベルを測定することによって定量化可能である。このようにして、遺伝子発現パターンは、作用物質に対する細胞の生理学的応答を表わすマーカーとして役立つことができる。従って、この応答状態は、作用物質による個々の生体の処置の前、及びその間のさまざまな時点で決定できる。
好ましい実施態様において、本発明は、１つの作用物質（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド類似薬、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子又は本書で記述されているスクリーニングアッセイにより同定されるその他の薬物候補）での対象の治療の有効性をモニターする方法において、（ｉ）該作用物質の投与に先立ち対象から投与前試料を得ること；（ｉｉ）投与前試料中で本発明のポリペプチド又は核酸のレベルを検出すること；（ｉｉｉ）対象から単数又は複数の投与後試料を得ること；（ｉｖ）投与後試料中の本発明のポリペプチド又は核酸のレベルを検出すること；（ｖ）投与前試料中の本発明のポリペプチド又は核酸のレベルを投与後の試料（単複）中の本発明のポリペプチド又は核酸のレベルと比較すること；及び（ｖｉ）該対象に対する該作用物質の投与をしかるべく改変することを含む方法を提供している。例えば、検出されたものよりも高いレベルまでポリペプチドの発現又は活性を増大させる、つまり作用物質の有効性を増大させるためには、作用物質の投与を増加させることが望ましい可能性がある。或いは、検出されたものよりも低いレベルまでポリペプチドの発現又は活性を減少させる、つまり作用物質の有効性を減少させるためには、作用物質の投与を減少させることが望ましい可能性がある。
本発明の化合物は、哺乳動物の体内の作用物質作用部位と有効成分の接触を作り出すあらゆる手段によって、さまざまな血管新生関連障害を阻害するように処方され投与され得る。これらは、個別の治療用活性成分としてか又は治療用活性成分の組合せの形で、医薬品との併用のために利用可能なあらゆる従来の手段によって投与可能である。これらは、単独で投与可能であるが、一般的には、選ばれた投与経路及び標準的な薬学的実践方法に基づいて選択される医薬担体と共に投与される。
投与される投薬量は、血管新生関連障害の症状の改善を結果としてもたらすのに充分な治療上有効な量の化合物であり、当然のことながら、特定の有効成分の薬力学的特性及びその投与様式及び投与経路、受容者の年令、性別、健康状態及び体重；症状の性質及び程度；競合する治療の種類、治療頻度及び望まれる効果といった既知の要因に応じて変動することになる。
かかる化合物の毒性及び治療的効能は、例えばＬＤ50（集団の５０％に対する致死用量）及びＥＤ50（集団の５０％において治療上有効である用量）を決定するため、細胞培養又は実験動物において標準的薬学手順により決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、これはＬＤ50／ＥＤ50の比率として表現できる。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することもできるが、感染していない細胞に対する潜在的損傷を最小限におさえかくして副作用を低減させるために、罹患した組織の部位にかかる化合物をターゲティングする送達系を設計するように注意すべきである。
ヒト及びネコにおいて使用するための１つの投薬量範囲を処方する上で、細胞培養アッセイ及び動物研究から得たデータを使用することができる。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全く無いＥＤ50を含む循環濃度範囲内に入る。該投薬量は、利用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲の中で変動し得る。本発明の方法において使用されるあらゆる化合物について、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定可能である。用量は、細胞培養中で決定される通りのＩＣ50（すなわち症状の最大阻害の半分を達成するテスト化合物の濃度）を内含する循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて処方され得る。ヒト及びネコにおける有用な用量を正確に決定するために、このような情報を使用することができる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィによって測定可能である。
抗体のためには特定の投薬量を利用することもできる。典型的には、好ましい投薬量は体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇ（一般的には１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）であり、抗体が脳内で作用することになっている場合には、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの投薬量が通常適切である。抗体が一部分ヒトのもの又は完全にヒトのものである場合には、それは一般にその他の抗体よりも長い半減期をヒトの体内で有することになる。従って、部分的又は完全にヒトの抗体のさらに低い投薬量が、往々にして可能である。抗体をさらに安定化させるために付加的な修飾を用いることが可能である。例えば、抗体を安定化し、取り込み及び組織浸透（例えば脳内へ）を増強させるために、脂質化を用いることができる。抗体の脂質化のための方法は、Cruikshank et al. （（１９９７）J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology １４：１９３）によって記述されている。
タンパク質又はポリペプチドの治療上有効な量（すなわち有効投薬量）は、体重１ｋｇあたり約０．００１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、さらに一層好ましくは約１〜１０ｍｇ、２〜９ｍｇ、３〜８ｍｇ、４〜７ｍｇ又は５〜６ｍｇの範囲内にある。
さらに、治療上有効な量のタンパク質、ポリペプチド又は抗体による対象（例えばネコ）の処置は、単回処置を含み得、そうでなければ好ましくは一連の処置を含み得る。好ましい例においては、約１〜１０週、好ましくは２〜８週、より好ましくは約３〜７週、そしてさらに一層好ましくは約４、５又は６週間、一週あたり１回の割合で体重１ｋｇあたり約０．１〜２０ｍｇの範囲内の抗体、タンパク質又はポリペプチドで対象を処置する。
本発明はさらに、発現又は活性を調節する作用物質を包含する。作用物質は例えば、小分子であり得る。例えば、かかる小分子には、ペプチド、ペプチド類似薬、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、約１０，０００グラム／モル未満の分子量をもつ有機又は無機化合物（すなわちヘテロ有機及び有機金属化合物を含む）、約５，０００グラム／モル未満の分子量をもつ有機又は無機化合物、約１０００グラム／モル未満の分子量をもつ有機又は無機化合物、約５００グラム／モル未満の分子量をもつ有機又は無機化合物並びにかかる化合物の塩、エステル及びその他の薬学的に受容可能な形態が含まれる。
小分子作用物質の適切な用量が、例えば医師などの当業者にとっては既知の数多くの要因により左右されるということは言うまでもない。小分子の用量（単複）は、例えば、処置中の対象又は試料の同一性、サイズ及び状態、さらには該当する場合には該組成物の投与経路、及び該発明の核酸又はポリペプチドに対して該小分子が有することを医師が望んでいる効果に応じて変動することになる。用量例としては、対象又は試料の重量１ｋｇあたりの小分子のミリグラム又はマイクログラム量（例えば、１キロあたり約１マイクログラムから約５００ミリグラム、約１００マイクログラム〜約５ミリグラム、又は約１マイクログラム〜約５０マイクログラム）。
本発明に従って使用するための医薬組成物は単数又は複数の生理学的に受容可能な担体又は賦形剤を用いて従来の要領で処方可能である。
従って、化合物並びにその生理学的に受容可能な塩及び溶媒和物は、吸入又は吸気（口又は鼻のいずれかを通して）による投与又は経口、口腔内、非経口又は直腸投与向けに処方することができる。
経口投与のためには、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば先にゼラチン化されたトウモロコシでんぷん、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微晶質セルロース、又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモでんぷん又はグリコール酸ナトリウムでんぷん）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）といった薬学的に受容可能な賦形剤と共に従来の手段によって調製された錠剤又はカプセルの形をとり得る。錠剤は、当該技術分野において周知の方法によってコーティング可能である。経口投与用の液体調製物は、例えば溶液、シロップ又は懸濁液の形をとることができ、そうでなければ使用前に水又はその他の適切なビヒクルで構成するため乾燥生成物の体裁をしていてもよい。かかる液体調製物は、懸濁剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は硬化食用油脂）；乳化剤（例えばレシチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は精留植物油）；及び防腐剤（例えばメチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアート又はソルビン酸）といったような薬学的に受容可能な添加剤と共に従来の手段により調製可能である。製剤は同様に、緩衝塩、着香剤、着色剤及び甘味料を適宜含有し得る。
経口投与のための製剤は、活性化合物の徐放性を提供するように適切に製剤され得る。
口腔内投与のためには、組成物は、従来の形で製剤された錠剤又はトローチ剤の形をとり得る。
吸入による投与のためには、本発明に従って使用するための化合物は、適切な噴霧剤例えばジクロロジフロロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適切なガスを用いて、加圧パック又は噴霧器からのエアゾルスプレー体裁の形で適切に送達される。加圧エアゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを具備することによって決定可能である。ラクトース又はでんぷんといった適切な粉末基剤及び化合物の粉末混合物が入った吸入器又は吸気装置内で使用するためのゼラチンなどのカプセル及びカートリッジを処方することができる。
化合物は、注射例えばボーラス注入法又は持続輸注による非経口投与用に処方可能である。注射用の製剤は、防腐剤を添加して、例えばアンプル又は多用量容器内といった単位剤形の体裁をとることができる。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンといったような形態をとり得、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤といった処方剤を含有し得る。或いは、活性成分は、使用前に例えば無菌で発熱物質を含まない水といった適切なビヒクルでの構成のため粉末形状であってよい。一般に、非経口溶液のためには、水、適切な油、食塩水、水性デキストロース（グルコース）及び関連糖溶液及びプロピレングリコール又はポリエチレングリコールといったようなグリコールが適切な担体である。非経口投与のための溶液は、好ましくは、活性成分の水溶性塩、適切な安定化剤そして必要とあらば緩衝物質を含有する。亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸といった単独又は組合せた形の酸化防止剤が、適切な安定化剤である。同様に使用されるのは、クエン酸及びその塩及びエチレンジアミン４酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）である。さらに非経口溶液は、例えば塩化ベンザルユニウム、メチル−又はプロピル−パラベン及びクロロブタノールといったような防腐剤を含有し得る。適切な薬学的担体は、この分野における標準的な基準テキストであるRemington's Pharmaceutical Sciencesの中で記述されている。
化合物は同様に、例えばココアバター又はその他のグリセリドといったような従来の座薬基剤を含有する。座薬又は保持浣腸剤といった直腸作用性組成物の形でも処方可能である。
前述した製剤に加えて、化合物はデポ−製剤としても処方可能である。このような長時間作用する製剤は、移植（例えば皮下又は筋内）によってか又は筋内注射により投与され得る。かくして、例えば化合物は、適切な重合体又は疎水性材料（例えば受容可能な油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂と共に、又はやや溶けにくい誘導体として、例えばやや溶けにくい塩として、製剤可能である。
さらに、標準的な薬学的方法を用いて作用持続時間を制御することができる。これらは、当該技術分野において周知であり、徐放性調製物を含み、例えば重合体、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又は硫酸プロタミンなどの適切な高分子を内含し得る。放出を制御するために、高分子の濃度ならびに取込み方法を調整することができる。
従って、作用物質を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）又はエチレン酢酸ビニル共重合体といった重合体材料の粒子内に取込むことができる。取込まれることに加えて、これらの作用物質は、マイクロカプセル内に化合物を捕獲するためにも使用可能である。
組成物は、望まれる場合、活性成分を含む単数又は複数の単位用量を収納し得るパック又はディスペンサ装置に入った体裁をとることができる。該パックは例えば、ブリスタパックといったような金属又はプラスチックホイルを含み得る。該パック又はディスペンサ装置には投与についての説明が伴っていてよい。
本発明の化合物の投与のための有用な医薬剤形を以下のように例示することができる。
カプセル：カプセルは、各々所望量の粉末活性成分、１７５ミリグラムのラクトース、２４ミリグラムのタルク及び６ミリグラムのステアリン酸マグネシウムを標準的ツーピースゼラチンカプセルに充填することによって調製される。
ソフトゼラチンカプセル：所望量の活性成分の入ったソフトゼラチンカプセルを形成するため、活性成分の大豆油中混合物が調製され、ゼラチンの中に容積移送式ポンプを用いて注入される。カプセルは次に洗浄され乾燥される。
錠剤：単位用量が所望量の活性成分、０．２ミリグラムのコロイド状二酸化ケイ素、５ミリグラムのステアリン酸マグネシウム、２７５ミリグラムの微結晶セルロース、１１ミリグラムのコーンスターチ及び９８．８ミリグラムのラクトースとなるように、慣用手順により錠剤が調製される。おいしさを増すか又は吸収を遅らせるために、適切なコーティングを適用することができる。
注射剤：注射による投与に適した非経口組成物が、１０体積％のプロピレングリコール及び水の中で１．５重量％の活性成分を攪拌することによって調製される。該溶液は、塩化ナトリウムで等張にされ、滅菌される。
懸濁液：各５ミリメートルが１００ミリグラムの細かく分割された活性成分、２００ミリグラムのナトリウムカルボキシメチルセルロース、５ミリグラムの安息香酸ナトリウム、１．０グラムのソルビトール溶液Ｕ．Ｓ．Ｐ及び０．０２５ミリメートルのバニリンを含むような形で、経口投与用に水性懸濁液が調製される。
遺伝子治療投与：適宜、そのそれぞれの投与経路のための通常のやり方で、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟こう、溶液、座薬、注射、吸入物質及びエアゾルといったような固体、半固体、液体又は気体形態の製剤に、遺伝子療法ベクターを製剤することができる。当該技術分野において既知の手段を利用して、標的器官に達するまで組成物の放出及び吸収を防ぐか又は組成物の時限放出を確保することができる。本発明の組成物の効能を消失させることのない薬学的に受容可能な形態を利用すべきである。医薬剤形においては、該組成物を単独で又はその他の薬学的に活性な化合物と適切に会合した状態ならびに組合わさった状態で使用することができる。
従って、本発明の医薬組成物は、特定の効果を達成するべく動物の体内のさまざまな部位に対し、さまざまな経路を介して送達可能である（例えばRosenfeld et al. （１９９１），上掲書；Rosenfeld et al., Clin. Res., ３９（２），３１１Ａ（１９９１ａ）；Jaffe et al., 上掲書；Berkner, 上掲書を参照のこと）。当業者であれば、複数の経路を投与のために使用できるものの、特定の経路が他の経路よりもさらに即時的でより有効な反応を提供し得る、ということを認識するであろう。体腔内への製剤の適用又は点滴注入、エアゾルの吸入又は吸気を含む投与によって、或いは筋内、静脈内、腹腔内、皮下、皮内ならびに局所的投与を含む非経口導入によって局所的又は全身的送達を達成することができる。
本発明の組成物は、各々の単位用量例えば小さじ１杯の錠剤、溶液又は座薬が、その他の活性作用物質と適切に組合わされた状態で又は単独で所定の量の当該組成物を含有している単位剤形の形で提供され得る。本書で使用する「単位剤形」という語は、適宜、薬学的に受容可能な希釈剤、担体又はビヒクルと会合させた状態で、所望の効果を生成するのに充分な量で計算されたその他の活性作用物質と組合わせてか又は単独で、所定の量の本発明の組成物を各々含有する、ヒト及び動物の対象のための単位用量として適切な物理的に離散した単位を意味する。本発明の単位剤形についての仕様は、達成すべき特定の効果及び特定の宿主内での該医薬組成物に関連する特定の薬力学に左右される。
従って、本発明は、上述の投与経路又は当業者にとって既知であり特定の利用分野に適している代替的経路のいずれかを用いて、好ましくは一つの組成物の一部分として本発明のベクターを投与することを含んで成る、１つの宿主に対し治療用遺伝子を移送する方法をも提供している。該組成物の「有効量」というのは、当業者にとって既知の複数の評価項目を用いてモニター可能である宿主において所望の効果を生成するようなものである。本発明によるベクターの宿主細胞への有効な遺伝子移入は、治療上の効果（例えば、治療対象の特定の疾病に付随するいくつかの症状の緩和）に関して、又さらには移入された遺伝子又は宿主内の遺伝子の発現の証拠（例えば宿主細胞内の核酸を検出するため配列決定と併わせたポリメラーゼ連鎖反応、ノーザン又はサザンハイブリダイゼーション又は転写アッセイを用いるか、或いは、移入された核酸によりコードされたか又はかかる移入のせいでレベル又は機能に影響を受けたタンパク質又はポリペプチドを検出するための免疫ブロット分析、抗体媒介検出、ｍＲＮＡ又はタンパク質半減期研究或いは特殊化されたアッセイを用いることによる）によってモニター可能である。
本書に記述されているこれらの方法は決して包括的なものではなく、特定の利用分野に適合させるさらなる方法が当業者には明らかとなることだろう。その上、組成物の有効量は、所望の効果を及ぼすものとして知られている化合物に対する類似性を通して近似可能である。
さらに、実際の用量及び計画は、組成物がその他の医薬組成物と組合せて投与されるか否かによって、又は薬物動態、薬物体内動態及び代謝の個々の差異によって変動し得る。同様にして、インビトロでの利用分野では、量は、利用される特定の細胞系列に応じて（例えば細胞表面上に存在するアデノウイルスレセプタの数又は遺伝子移入のために利用される特定のベクターがもつその細胞系列内で複製する能力に基づく）変動し得る。さらに、細胞あたりの添加されるべきベクターの量は、ベクター内に挿入された治療用遺伝子の長さ及び安定性、ならびに配列の性質に伴っても変動する確率が高く、特に、経験的に決定される必要のあるパラメータであり、本発明の方法に固有でない要因（例えば合成に付随するコスト）に起因して改変され得る。当業者であれば、特定の状況の要求に従って必要なあらゆる調整を容易に行なうことができる。
以下の実施例は一例として示され、いかなる形であれ該発明の範囲を制限することを意図したものではない。
ネコエンドスタチン遺伝子の同定及びクローニング
本節で提示されている実施例においては、癌などの血管新生関連障害に関与する、本書でエンドスタチンと呼ばれている新規のネコ遺伝子を同定する研究について記述されている。
材料と方法
１． ネコの肝組織由来のＲＮＡの単離。５０ｍｇのネコ肝組織を分断し、回転子−固定子ホモジナイザ（Kontes, Vineland, NJ）により均質化させ、総ＲＮＡを、メーカー（Qiagen Inc., Santa Clarita,CA）からの指示事項に従ってR Neasy Mini kitを用いて精製した。３０μｇのＲＮＡを単離し、０．５μｇ／μｌでＨ2Ｏ中で懸濁させた。
２． エンドスタチンを包含するネココラーゲンＸＶＩＩＩ領域のＲＴ−ＰＣＲ増幅及びクローニング。エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端フラグメント（マウスコラーゲンＸＶＩＩＩ中のアミノ酸Ｈ１１３２−Ｋ１３１５）である。ヒト（受入れ番号Ｌ２２５４８）、マウス（受入れ番号Ｕ０３７１４）及びニワトリ（受入れ番号ＡＦ０８３４４０）由来のコンセンサス配列に基づいてネココラーゲンＸＶＩＩＩｃＤＮＡの領域を増幅するように一対のプライマを設計した。マウス部分コラーゲンＸＶＩＩＩｃＤＮＡのヌクレオチド＃７６６−７９２に対応する５’プライマＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣ（配列番号５）及びマウス部分コラーゲンＸＶＩＩＩｃＤＮＡのヌクレオチド＃１５６９−１６０３に対応する３’プライマＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＡＴ（配列番号６）を増幅反応のために使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、Boehringer Mannheim GmbH（ドイツ）社製のTITAN ONE TUBE ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて実施した。１．５分間、９０℃で０．５μｇのネコ肝臓ＲＮＡを変性した。３０分間５０℃で逆転写反応を実施し、ＰＣＲプログラムは、９４℃で３分間保持し、その後９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒、６８℃で１．５分、そして６８℃で５分の伸長を３５サイクル、というものであった。ＰＣＲ産物を電気泳動により分析した。ＰＣＲ産物を、メーカーの指示事項に従って真核生物ＴＡクローニングベクターｐＣＲ３．１（Invitrogen, Carlsbad, CA）内にクローニングし、ｐＣＲ３．１−ｐｒｏ−ｆｅ−エンドスタチンと呼称した。予想されたサイズ（０．８ｋｂ）のインサートを含有する３つの独立したクローンを配列決定した（Advanced Genetic Analysis Center, St. Paul, MN）。配列を組立て、ＤＮＡＳｔａｒ（DNAStar Inc. Madison, WI）を用いて分析した。
３． ＨＡタグ付けされたネコエンドスタチンのサブクローニング。エンドスタチンに対応するネココラーゲンＸＶＩＩＩの正確なフラグメントを、５’プライマＡＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＡＣＧＣＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＣＣＧ（配列番号７）、３’プライマＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＣＡＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＣ（配列番号８）といったプライマを用いてｐＣＲ３．１−ｐｒｏ−ｆｅ−エンドスタチンからＰＣＲ増幅によりpDisplayベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）内にサブクローニングさせた。クローニングを容易にするため、２つの制限酵素部位ＢｇｌＩＩ（５’プライマ）及びＳａｃＩＩ（３’プライマ）を下線で示されているようなプライマ配列内に取込んだ。ベクター内に存在するＨＡエピトープ配列とシグナルペプチドに対し、インサートを枠内で融合させた。エンドスタチンの停止コドンＴＡＧ（ボールド体表示）を３’ プライマ内に内含させて翻訳を終結させ、従って、インサートの下流側のベクターコード化されたＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインは、最終的なプラスミド構築物pDisplay−ＨＡ−ｆｅ−エンドスタチン内で翻訳されないものと思われる。
４． ネコエンドスタチンのサブクローニング（ＨＡタグ無し）。５’プライマＧＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＧＣＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＣＣ（配列番号９）、３’プライマＧＡＡＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＡＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＣＡＴＧＡ（配列番号１０）といったプライマを用いてｐＣＲ３．１−ｐｒｏ−ｆｅ−エンドスタチンからＰＣＲ増幅によりｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）内にネコエンドスタチンをサブクローニングした。クローニングを容易にするため、２つの制限酵素部位ＨｉｎｄＩＩＩ（５’ プライマ）及びＸｈｏＩ（３’ プライマ）を、下線で示されているようなプライマ配列内に取込んだ。ベクター内に存在するシグナルペプチド配列に対しインサートを枠内で融合させた。エンドスタチンの停止コドンＴＡＧ（ボールド体表示）を３’ プライマ内に内含させて翻訳を終結させた。最終的なプラスミド構築物をｐＳｅｃＴａｇ２−ｆｅ−エンドスタチンと呼称した。
５． マウスエンドスタチンのクローニング。クローニングされたネコエンドスタチンの抗血管新生活性をそのマウス対応物のものと比較するために、マウス肝臓ＲＮＡからマウスエンドスタチンをコードするｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ増幅させ、pDisplayベクター内にクローニングさせた。マウスエンドスタチンを増幅するのに用いられるプライマは、５’−ＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣＡＧＣ（配列番号１１）、３’−ＧＣＴＡＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＧ（配列番号１２）であった。フランキング制限部位ＢｇｌＩＩ（５’ プライマ）及びＳａｌＩ（３’ プライマ）は下線がほどこされ、停止コドンはボールド体で示されている。結果としてのプラスミドは、pDisplay−ＨＡ−mu−エンドスタチンと呼称された。
結果
エンドスタチンのコーディング領域及びアンギオスタチンのコーディング領域をそれぞれ含むネココラーゲンＸＶＩＩＩ及びネコプラスミノーゲンのフラグメントをコードするｃＤＮＡを、複数の種に由来するコンセンサス配列から設計されたプライマを用いてネコ肝臓ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。プロ−エンドスタチンのヌクレオチド配列は図１に示されており（配列番号１）、予測されたアミノ酸配列は図２（配列番号２）に示されている。相同性に基づいたエンドスタチンに対応する領域は、図２にボールド体で示され、ネコエンドスタチンの正確なヌクレオチド配列及び予測されたアミノ酸配列（１８５アミノ酸）は図３（配列番号３）及び図４（配列番号４）にそれぞれ示されている。図５は、エンドスタチンの全ての既知のアミノ酸配列のアラインメントを示しており、ネコのエンドスタチンとヒト、マウス、及びニワトリのものとの間の同一性度はそれぞれ８５％、８４％及び７６％である。
エンドスタチン遺伝子の発現
本節で提示する実施例においては、新規のネコエンドスタチン遺伝子を発現しアッセイするための方法を同定する研究が記述されている。
材料と方法
１． エンドスタチンのトランスフェクション。６ウェルプレート内で成長したヒト２９３細胞を、CalPhos 哺乳動物トランスフェクションキット（CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, ＣＡ）を用いてネコ又はマウスエンドスタチンをコードする２．５μｇのプラスミドでトランスフェクトした。
２． イムノブロット分析によるエンドスタチンの検出。トランスフェクションから２日後に、トリス−グリシンＳＤＳ試料緩衝液（NOVEX, San Diego, CA）内での溶解により細胞を収獲した。培養上清を１５分間、３０００ｒｐｍでの遠心分離により収獲した。タンパク質を４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜（NOVEX, San Diego, CA）に移した。イムノブロット分析のためには、ＨＡエピトープに対するＨＡ抗体を１対５００で希釈し、１．５時間ブロットと共にインキュベートした。アルカリホスファターゼで結合させた抗マウスＩｇＧ（１：１０，０００；Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）と共に３０分間インキュベートした後、結合した抗体をホスファターゼ基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＫＰＬ、Gaithersburg, Maryland）を用いて検出した。
３． 内皮細胞増殖アッセイ。クローニングされたネコエンドスタチンの抗増殖効果をウシ肺動脈内皮細胞（Ｃ−ＰＡＥ、ＡＴＣＣ、Manassas, VA）を用いてテストした。細胞（１０４細胞／ウェル）を２％のウシ胎児血清（Nova-Tech Inc., Grand Island, NE）を含むＯｐｔｉＭＥＭ（商標）培地（GIBCO BRL, Rockville, MD）中で、２４ウェルのコラーゲンＩでコーティングされたプレート（Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA）内に播いた。２４時間インキュベーションの後、培地を、１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA）を補足したトランスフェクション済みの２９３細胞からのならし培地と交換した。４８時間後に細胞をトリプシン処理し、生存細胞をトリパンブルー染色及び血球計を用いて計数した。結果をＰｒｉｚｍ２，０１（Graphpad Software Inc. San Diego, CA）を用いて分析した。
結果
ネコエンドスタチンの発現。ネコエンドスタチンをコードするｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターpDisplay内にサブクローニングした。エンドスタチンは分泌されたタンパク質のフラグメントであり、通常血液中を循環していることから、タンパク質は、それを分泌経路へと導くマウスＩｇＫ−鎖リーダー配列に対しＮ末端で枠内で融合させ、その後、発現されたタンパク質の検出を可能にするヘマグルチニンＡエピトープタグ（ＨＡ）に対し融合させた。ヒト２９３細胞を、ネコ及びマウスからのＨＡタグ付け済みエンドスタチン及びシグナル配列をコードするプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションから４８時間後に分析のために細胞を収獲した。図６及び７は、イムノブロット分析の結果を示している。トランスフェクションを受けたエンドスタチンの発現は、培養上清（図６）及び細胞可溶化物（図７）の両方から検出された。
内皮細胞増殖の阻害。エンドスタチンの１つの独特な特長は、内皮細胞増殖を特異的に阻害するその能力にある（O'Reilly et al., １９９７，Cell ８８（２）：２７７−８５；O'Reilly et al., １９９４，Cell ７９（２）：３１５−２８）。ウシ肺動脈内皮細胞（ＣＰＡＥ細胞）（Dhanabal et al., １９９９，J. Biol Chem ２７４（１７）：１１７２１−６）を、トランスフェクションを受けた２９３細胞からのならし培地から産生されたエンドスタチンタンパク質の存在下又は不在下で、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）で刺激した。増殖速度を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でのトランスフェクションを受けた細胞からのならし培地及びｂＦＧＦで処理された対照細胞に対し正規化させた。４つの独立した実験からの結果を、図８に要約する。ＣＰＡＥ細胞は、ｂＦＧＦの活性化無くゆっくりと増殖した（ｂＦＧＦで刺激された対照細胞のものの５２％）。ＨＡタグ付けしたネコエンドスタチンの添加によりｂＦＧＦの刺激効果が阻害され、ＣＰＡＥ細胞はｂＦＧＦ刺激した対照細胞のものの６５％で増殖していた。ＨＡタグ付けされたネコエンドスタチンで見られた阻害活性は、マウスのタンパク質の場合に匹敵するものであった（対照のレベルの６１％）。両方の対照グループと各々の処置されたグループの間の増殖速度の差は、全て統計的に有意であった（Ｐ＜０．０２）。これとは対照的に、エンドスタチンでの処置は、上皮２９３細胞の増殖を阻害せず、このことは、エンドスタチンの阻害効果が内皮細胞に特異的であることを示唆していた。タグ付けしていないネコエンドスタチンを用いても類似の結果が得られた（図９）。ネコエンドスタチンの添加は、ｂＦＧＦの刺激効果を特異的に阻害し、ＣＰＡＥ細胞は対照のものの５４％で増殖していた。陽性対照と処置グループの間の増殖速度の差は、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０００１）。
論述
ネコの血管新生阻害物質エンドスタチンのクローニングがここで報告されている。これは、アミノ酸レベルでそのヒト及びマウス対応物と７６〜８５％の同一性を共有している。クローニングされたタンパク質の分泌を容易にするため、マウスＩｇＫ−鎖からのシグナル配列をエンドスタチンのＮ末端に融合させた。免疫蛍光研究及びイムノブロットアッセイは、タンパク質が分泌経路に局在化され、ならし培地内に分泌されることを確認した。ネコエンドスタチンは、そのマウス対応物に匹敵するレベルで内皮細胞増殖を特異的に阻害することも示された。
マウスエンドスタチンは、様々な原発性及び転移性腫瘍の成長を阻害することが示されてきた。その上、エンドスタチンでの処置は、薬物耐性又は副作用を誘発することなく何度も反復可能である。これらの血管新生阻害物質は新規の標的（内皮細胞）に向かっていることから、より優れた治療的効果を達成するべく、外科手術、化学療法、放射線療法及び免疫療法といったようなその他の癌療法と適切に組合わせることもできる。これらの特性のため、エンドスタチンは、安全で効能の高い広域療法が強く求められているネコの癌を治療するためのきわめて魅力ある候補となっている。しかしながら、癌療法としてのエンドスタチンの利用の成功には、長期にわたる腫瘍の抑制及び休眠を達成するための反復的かつ連続した処置が含まれるであろう（Boehm et al., １９９７，Nature ３９０（６６５８）：４０４−４０７）。ネコエンドスタチンのクローニング及び同定は、種特異的な血管新生阻害物質を使用するネコの腫瘍の治療を可能にし、かくして、反復的投与下での免疫応答の惹起の危険性を最小限におさえる。最後に、自然発生的なネコの腫瘍は、組織病理学的及び生物学的挙動においてそのヒトの相関物と非常に類似しており（Mac Ewen, １９９０，Cancer Metastasis Rev９（２）：１２５−３６）、従って、ネコの腫瘍から得られた実験結果は、ヒトの癌生物学及び治療のための貴重な情報も提供することになる。
本発明は、該発明の個別の態様の単一の例示として意図されている本書で記述された特定の実施態様によりその範囲が制限されるべきものではなく、機能的に等価の方法及び構成要素が、該発明の範囲内に入る。実際、本書で示され記述されたものに加えて、該発明のさまざまな修正が、以上の記述及び添付図面から当業者には明らかになることだろう。かかる修正は、添付のクレームの範囲内に入るものと意図されている。
本明細書中に言及されている全ての刊行物及び特許出願は、各々個々の刊行物又は特許出願が特定的かつ個別に参考として内含されるべきものとして指示された場合と同じレベルで、本書に参考として内含されるものである。
ネコのプロエンドスタチンのヌクレオチド配列（配列番号１）。 図１の配列から翻訳されたネコのプロエンドスタチンのアミノ酸配列（配列番号２）。エンドスタチンに対応する領域は太字である（アミノ酸残基３６−２２０）。停止コドンは＊により示されている。 ネコのエンドスタチンのヌクレオチド配列（配列番号３）。 図３の配列から翻訳されたネコのエンドスタチンのアミノ酸配列（配列番号４）。停止コドンは＊により示されている。 ネコ、ヒト、マウス及びニワトリ由来のエンドスタチンのアミノ酸アラインメント。使用されるプログラムは、Clustal方法によって整列させられたLasergene Meg Alignである（ＤＮＡ Star Inc. Madison, WI）。 ネコのエンドスタチン（Ｆｅ−Endo）のＨＡタグ付けされたバージョン及びＨＡタグ付けされたマウスエンドスタチン（Ｍｕ−Endo）を発現するプラスミドでトランスフェクトされた２９３細胞のイムノブロット分析。培養上清からの分泌されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ＨＡタグに対する抗体及びアルカリホスファターゼ結合二次抗体を用いたウェスタンブロット法によって検出された。 ネコのエンドスタチン（Ｆｅ−Endo）のＨＡタグ付けされたバージョン及びＨＡタグ付けされたマウスエンドスタチン（Ｍｕ−Endo）を発現するプラスミドでトランスフェクトされた２９３細胞のイムノブロット分析。全細胞可溶化物からの細胞内タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ＨＡタグに対する抗体及びアルカリホスファターゼ結合二次抗体を用いたウェスタンブロット法によって検出された。 内皮細胞増殖アッセイ。図は、ＨＡタグ付けされたネコのエンドスタチン（ＨＡ−ｆｅ−ｅｎｄｏ）ならびにマウスエンドスタチン（ＨＡ−ｍｕ−ｅｎｄｏ）による内皮細胞増殖阻害の要約を示している。２９３細胞を血管新生阻害物質又は対照としての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でトランスフェクトした。上清をトランスフェクションから４８時間後に収獲し、ｂＦＧＦで刺激されたＣＰＡＥウシ内皮細胞又は２９３の細胞と共に７２時間インキュベートした。細胞の合計数を計数しプロットした。４つの独立した実験を実施し、各実験をデュプリケートで行なった。黒色バーは刺激されたＣＰＡＥ細胞の百分率を表わし、一方白色バーは刺激された２９３細胞の百分率を表わしている。 内皮細胞増殖アッセイ。図は、タグ付けされていないバージョンのネコのエンドスタチン（ｆｅ−ｅｎｄｏ）による内皮細胞増殖の阻害の要約を示している。２９３細胞を血管新生阻害物質又は対照としての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でトランスフェクトした。上清をトランスフェクションから４８時間後に収獲し、ｂＦＧＦで刺激されたＣＰＡＥウシ内皮細胞又は２９３細胞と共に７２時間インキュベートした。細胞の合計数を計数しプロットした。４つの独立した実験を実施し、各実験をデュプリケートで行なった。黒色バー及び白色バーは図８で上述された通りである。

Claims (15)

  1. ａ）エンドスタチンをコードするヌクレオチド配列であって、該エンドスタチンが配列番号２又は配列番号４に示すポリペプチドを含んでいる、前記ヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号１又は配列番号３に示すヌクレオチド配列；
    ｃ）ニワトリ、イヌ、ヒト又はマウスエンドスタチンをコードしないことを条件として、ａ）又はｂ）のヌクレオチド配列の相補体にハイブリッド形成するヌクレオチド配列；及び
    ｄ）ａ）、ｂ）及びｃ）から選択されたヌクレオチド配列の相補体、
    から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
  2. 請求項１に記載の核酸を含むベクター。
  3. 請求項１に記載の核酸を含有するべく遺伝子工学処理された宿主細胞。
  4. 前記核酸が、前記宿主細胞内の前記核酸によりコードされるポリペプチドの発現を導く能力をもつ制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項３に記載の宿主細胞。
  5. 請求項１に記載の核酸を含むトランス遺伝子を含有するように遺伝子工学処理された、非ヒトトランスジェニック動物。
  6. 配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  7. 請求項１に記載の単離された核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
  8. 請求項６又は７に記載の単離ポリペプチドに結合する抗体。
  9. 融合ペプチド、及び配列番号２及び配列番号４から選択されるアミノ酸配列又は請求項１に記載の単離核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、単離された融合ポリペプチド。
  10. 対象におけるエンドスタチンの機能、活性及び／又は発現を調節する化合物を前記対象に投与することを含む、対象における血管新生関連の障害を治療するための方法。
  11. 前記血管新生関連障害が、癌；固形腫瘍、白血病などの血液性腫瘍及び腫瘍転移を含む血管新生依存性癌；血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫を含む良性腫瘍；関節リウマチ；乾癬；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシスといった眼の血管新生疾患；オスラー・ウェーバー症候群；心筋血管新生；プラーク新血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節症；血管線維腫；創傷肉芽発生；冠動脈側枝；脳側枝；動静脈奇形；虚血性四肢血管新生；糖尿病性新血管形成；黄斑変性症；骨折；血管形成；造血；***；月経及び胎盤形成から成る群の中から選択されている、請求項１０に記載の方法。
  12. エンドスタチンの発現を調節する化合物を同定する方法であって、以下のステップ：
    ａ）エンドスタチンを発現する細胞とテスト化合物を接触させること；
    ｂ）上記細胞内のエンドスタチン発現レベルを測定すること；
    ｃ）上記テスト化合物の不在下での細胞内のエンドスタチン発現レベルに対して、該テスト化合物の存在下での細胞内のエンドスタチン発現レベルを比較すること；
    を含み、ここで、上記テスト化合物の存在下での上記細胞内のエンドスタチン発現レベルが上記テスト化合物の不在下での上記細胞内のエンドスタチン発現レベルと異なる場合に、エンドスタチンの発現を調節する化合物が同定される、前記方法。
  13. エンドスタチンの産物の活性を調節する化合物を同定する方法であって、以下のステップ：
    ａ）エンドスタチンを発現する細胞とテスト化合物を接触させること；
    ｂ）上記細胞内の前記エンドスタチンの活性レベルを測定すること；
    ｃ）上記テスト化合物の不在下での細胞内の前記エンドスタチンの活性レベルに対して、該テスト化合物の存在下での細胞内の前記エンドスタチンの活性レベルを比較すること；
    を含み、ここで、上記テスト化合物の存在下での上記細胞内の前記エンドスタチンの活性レベルが上記テスト化合物の不在下での上記細胞内の前記エンドスタチンの活性レベルと異なる場合に、前記エンドスタチンの活性を調節する化合物が同定される、前記方法。
  14. 細胞内のエンドスタチンの活性及び／又は発現を調節する化合物を細胞に投与することを含む、上記細胞内の上記エンドスタチンの活性及び／又は発現を調節するための方法。
  15. 前記エンドスタチンが配列番号２及び配列番号４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
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