JP2007312641A - 非ヒト哺乳動物、その作製方法及びそれを用いた筋疾患用治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)や遺伝性封入体ミオパチー(HIBM)等のGNE遺伝子の機能喪失型変異による筋疾患の病態解析と治療法開発に有用な非ヒト哺乳動物の提供、前記非ヒト哺乳動物の製造方法の提供、並びに前記非ヒト哺乳動物を用いたこれらの筋疾患の治療薬についてのスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】ミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物であって、GNE遺伝子の機能が染色体上で欠損し、かつ、ヒト変異GNEcDNAを染色体内に含むことを特徴とする非ヒト哺乳動物、その製造方法、並びにそれを用いた筋疾患用治療薬のスクリーニング方法を提供する。また、ヒト変異GNEcDNAを染色体内に含むことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物およびその製造方法を提供する。
【選択図】図3
Description
本発明は、新規なトランスジェニック非ヒト哺乳動物およびそれを用いて作製されたミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物に関し、特に、GNE遺伝子の変異により引き起こされる縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)や遺伝性封入体ミオパチー(HIBM)等の筋疾患の原因解明に利用する実験動物としてのみならず、治療薬の開発にも有用な非ヒト哺乳動物、その作製方法並びにそれを用いた筋疾患用治療薬のスクリーニング方法に関する。
縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)や遺伝性封入体ミオパチー(HIBM)等の筋疾患は、シアル酸生合成経路の律速段階酵素UDP−GlcNAc 2−epimerase/ManNAc−kinaseをコードするGNE遺伝子の機能喪失型変異によって生じる疾患(非特許文献1〜3参照)であり、罹患筋の病理観察からは、リソソーム酵素活性を示す縁取り空胞の形成に加え、筋線維の大小不同、核内封入体形成、βアミロイドタンパク質の沈着などの特徴が見られることが知られている。
西野一三,ゲノム医学Vol.4No.1(2004-2)p.21-26
Eisenberg, I., Avidan, N.,Potikha, T., Hochner, H., Chen, M., Olender, T., Barash, M., Shemesh, M.,Sadeh, M., Grabov-Nardini, G. Shmilevich, I., Friedmann, A., Karpati, G.,Bradley, W. G., Baumbach, L., Lancet, D., Asher, E. B., Beckmann, J. S., Argov,Z. and Mitrani-Rosenbaum, S. (2001) Nat. Genet., 29, 83-87.
Nishino, I., Noguchi, S.,Murayama, K., Driss, A., Sugie, K., Oya, Y., Nagata, T., Chida, K., Takahashi,T., Takusa, Y. Ohi, T., Nishimiya, J., Sunohara, N., Ciafaloni, E., Kawai, M.,Aoki, M. and Nonaka, I. (2002) Neurology, 59, 1689-1693.
DMRVは、諸外国では埜中ミオパチーあるいは埜中型遠位型ミオパチーとして知られており、15〜40歳にかけて発症する常染色体劣性の筋疾患で、男女とも同様に侵される。前脛骨筋が特に侵され易く、頸部屈筋群、傍脊柱筋、大腿後面の膝屈筋群も侵されやすい。進行すれば、下腿後面の筋群や上肢筋も侵されるが、比較的後期まで大腿四頭筋が保たれることが特徴である。
また、DMRVとHIBMは臨床病理学的にほぼ同一であり、遺伝子座も同一であることから、臨床病理学的に類似しているだけでなく、遺伝学的にも同一の疾患であると考えられる。
また、DMRVとHIBMは臨床病理学的にほぼ同一であり、遺伝子座も同一であることから、臨床病理学的に類似しているだけでなく、遺伝学的にも同一の疾患であると考えられる。
しかしながら、GNE遺伝子の変異に起因するこれらの病理像や筋萎縮に至るプロセスは全く不明であり、これらの筋疾患の根本的な原因の解明と治療法の確立が望まれている。そこで本発明者らは、日本人患者で発見された変異を持つ組み換えGNEタンパク質を発現させ、これらのタンパク質でUDP−GlcNAc 2−epimeraseとManNAc kinase活性を測定した(非特許文献4参照)。その結果、変異タンパク質は変異の部位に応じて、前記したどちらかの活性が著しく低下しているものの、全く活性が失われるような変異はないことが判明した。
Noguchi S., Keira Y., MurayamaK., Ogawa M., Fujita M., Kawahara G., Oya Y., Imazawa M., Goto Y., HayashiY.K., Nonaka I., Nishino I. (2004) J. Biol. Chem., 279, 11402-11407.
Noguchi S., Keira Y., MurayamaK., Ogawa M., Fujita M., Kawahara G., Oya Y., Imazawa M., Goto Y., HayashiY.K., Nonaka I., Nishino I. (2004) J. Biol. Chem., 279, 11402-11407.
また、DMRV患者からの骨格筋やその培養細胞では、シアル酸含量やシアリル化が減少していることから、GNE遺伝子の変異によるタンパク質産物の酵素機能の低下および、その酵素反応産物の低下が確認された。
しかしながら、DMRV患者に見られる筋病理症状を説明するには、これらのデータのみでは不十分であり、GNE遺伝子変異をもつ非ヒト哺乳動物を用いたin vivoでの解析の必要性が生じていた。
しかしながら、DMRV患者に見られる筋病理症状を説明するには、これらのデータのみでは不十分であり、GNE遺伝子変異をもつ非ヒト哺乳動物を用いたin vivoでの解析の必要性が生じていた。
一方、GNE遺伝子の機能解明のためノックアウトマウスなどのモデルマウスの作製も試みられているが、GNE遺伝子ノックアウトマウスは胎生致死であるために(非特許文献5)、未だこれらの筋疾患の病態解析や治療法の開発に役立つ非ヒト哺乳動物が作製されていないのが現状である。
Schwarzkopf, M., Knobeloch, K.P., Rohde, E., Hinderlich, S., Wiechens, N., Lucka, L., Horak, I., Reutter, W.and Horstkorte, R. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 5267-5270.
Schwarzkopf, M., Knobeloch, K.P., Rohde, E., Hinderlich, S., Wiechens, N., Lucka, L., Horak, I., Reutter, W.and Horstkorte, R. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 5267-5270.
従って、本発明の第1の目的は、縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)や遺伝性封入体ミオパチー(HIBM)等の、GNE遺伝子の機能喪失型変異による筋疾患の病態解析と治療法開発に有用な、非ヒト哺乳動物を提供することにある。
本発明の第2の目的は、縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)や遺伝性封入体ミオパチー(HIBM)等の、GNE遺伝子の機能喪失型変異による筋疾患の病態解析と治療法開発に有用な、非ヒト哺乳動物の製造方法を提供することにある。
更に本発明の第3の目的は、前記非ヒト哺乳動物を用いた縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)や遺伝性封入体ミオパチー(HIBM)等の、GNE遺伝子の機能喪失型変異による筋疾患用治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
本発明の第2の目的は、縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)や遺伝性封入体ミオパチー(HIBM)等の、GNE遺伝子の機能喪失型変異による筋疾患の病態解析と治療法開発に有用な、非ヒト哺乳動物の製造方法を提供することにある。
更に本発明の第3の目的は、前記非ヒト哺乳動物を用いた縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)や遺伝性封入体ミオパチー(HIBM)等の、GNE遺伝子の機能喪失型変異による筋疾患用治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
本発明者らは、上記の諸目的を達成するために鋭意研究を行った結果、GNE遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物(GNE−/−)は胎生致死であるものの、ヘテロ接合体非ヒト哺乳動物またはその子孫(GNE+/−)とヒト変異GNEcDNAを染色体内に含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物(hmutGNETg)を掛け合わせて得られる非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE+/−)と、更に、前記へテロ接合体非ヒト哺乳動物またはその子孫(GNE+/−)とを掛け合わせることにより、ヒト変異GNEcDNAのみを発現する非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE−/−)が得られることを見出すと共に、該非ヒト哺乳動物が、ヒトの縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)や遺伝性封入体ミオパチー(HIBM)等の筋疾患と同様の症状を示すことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物であって、GNE遺伝子の機能が染色体上で欠損し、かつ、ヒト変異GNEcDNAを染色体内に含むことを特徴とする非ヒト哺乳動物、その作製方法および該非ヒト哺乳動物を用いた、GNE遺伝子の変異により引き起こされる筋疾患用治療薬のスクリーニング方法、並びに、ヒト変異GNEcDNAを染色体内に含むことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物およびその作製方法である。
また、本発明のミオパチーは縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチーであることが好ましく、前記ヒト変異GNEcDNAが、c.1714G>C変異を持つヒトGNEcDNAであることが好ましい。更に、本発明の非ヒト哺乳動物がマウスであることが好ましい。
また、本発明のミオパチーは縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチーであることが好ましく、前記ヒト変異GNEcDNAが、c.1714G>C変異を持つヒトGNEcDNAであることが好ましい。更に、本発明の非ヒト哺乳動物がマウスであることが好ましい。
本発明のGNE遺伝子の機能が染色体上で欠損し、かつ、ヒト変異GNEcDNAを染色体内に含むことを特徴とする非ヒト哺乳動物は、縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)や遺伝性封入体ミオパチー(HIBM)等のGNE遺伝子の機能喪失型変異による筋疾患と同様の臨床症状を示すことから、これらの筋疾患の病態解析と治療法開発に極めて有用である。
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物を作製するために有用である。
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物を作製するために有用である。
以下本発明について詳細に説明する。
本発明のGNE遺伝子は、シアル酸生合成経路の律速段階酵素UDP−GlcNAc 2−epimerase/ManNAc−kinaseをコードする遺伝子である(図1)。UDP−GlcNAc 2−epimerase/ManNAc−kinaseは、N末端側にUDP−GlcNAc 2−epimerase(GNE)の活性ドメインを有し、C端側にManNAc kinase(MNK)の活性ドメインを有している。前者のGNEドメインは、UDP−GlcNAcからManNAcへの反応を触媒し、後者のMNKドメインは、次の反応であるManNAcからManNAc−6−Pへの反応を触媒している。
本発明のGNE遺伝子は、シアル酸生合成経路の律速段階酵素UDP−GlcNAc 2−epimerase/ManNAc−kinaseをコードする遺伝子である(図1)。UDP−GlcNAc 2−epimerase/ManNAc−kinaseは、N末端側にUDP−GlcNAc 2−epimerase(GNE)の活性ドメインを有し、C端側にManNAc kinase(MNK)の活性ドメインを有している。前者のGNEドメインは、UDP−GlcNAcからManNAcへの反応を触媒し、後者のMNKドメインは、次の反応であるManNAcからManNAc−6−Pへの反応を触媒している。
DMRV、HIBM患者でこれまでに同定されている変異は、オープンリーディングフレームのほぼ全長に幅広く分布しており(図2)、GNEドメインあるいはMNKドメインの単独障害の場合だけでなく、両者が組み合わさった複合へテロ接合体の場合にも発症する。日本人のDMRV患者では、c.1714G>C(V572L)変異が最も多く、ユダヤ人のHIBM患者の場合には、殆どが2135T>C(M712T)変異を有している。
ここで、c.1714G>Cは、数字がスタートコドンのAからのオープンリーディングフレームの塩基番号を、アルファベットが塩基を示しており、野生株の塩基Gが塩基Cに変異していることを示している。すなわち、スタートコドンのAから数えて1714番目のグアニンがシトシンに変異していることを意味している。また、V572Lは、数字がN末端のメチオニンからのアミノ酸番号を、アルファベットがアミノ酸を示しており(一文字表記)、野生株のアミノ酸Vがアミノ酸Lに変異していることを示している。すなわち、N末端のメチオニンから数えて572番目のバリンがロイシンに変異していることを意味している。
ここで、c.1714G>Cは、数字がスタートコドンのAからのオープンリーディングフレームの塩基番号を、アルファベットが塩基を示しており、野生株の塩基Gが塩基Cに変異していることを示している。すなわち、スタートコドンのAから数えて1714番目のグアニンがシトシンに変異していることを意味している。また、V572Lは、数字がN末端のメチオニンからのアミノ酸番号を、アルファベットがアミノ酸を示しており(一文字表記)、野生株のアミノ酸Vがアミノ酸Lに変異していることを示している。すなわち、N末端のメチオニンから数えて572番目のバリンがロイシンに変異していることを意味している。
本発明におけるヒト変異GNEcDNAとは、GNE遺伝子の変異により引き起こされる筋疾患の患者で認められる、変異したヒトGNE遺伝子のcDNAを意味する。具体的には、R11W、C13S、P27L、P36L、G89S、R129Q、H132Q、G135V、R162C、M171V、D176V、R177C、D187G、I200F、R202L、G206S、V216A、T224I、D225N、R246Q、R246W、M265T、P283S、G295R、R306Q、V331A、V367I、D378Y、L379H、P390S、V421A、A460V、G469R、I472T、P511L、N519S、A524V、F528C、I557T、G559R、V572L、G576L、I587T、A630T、A631V、A631T、Y675H、V696M、G708S、M712Tの何れかの変異を有するヒトGNE遺伝子のcDNAを意味する。変異は1箇所に限定されるものではなく、2箇所以上の変異を有するGNE遺伝子のcDNAを用いることも可能である。本発明においては、DMRV患者やHIBM患者に多く見られる変異である、c.1714G>C(V572L)または2135T>C(M712T)を有するGNA遺伝子のcDNAを用いることが特に好ましい。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物(hmutGNETg)は、ヒト変異GNEcDNAを挿入したベクターを作製し、前記ベクターを受精卵に導入し発生させることにより作製することができる。
ヒト変異GNE遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドなど、公知の発現ベクターを用いることができる。
ヒト変異GNE遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドなど、公知の発現ベクターを用いることができる。
また、ヒト変異GNE遺伝子の発現を調節するプロモーターは特に制限されるものではなく、例えば、CAGプロモーター、CMVプロモーター、RSVプロモーター、TKプロモーター、PGKプロモーター、EF1αプロモーターなど、公知のプロモーターの中から適宜選択して使用することができる。なお、ヒト変異GNE遺伝子を各種臓器で全身性に発現させることができるという理由から、本発明においては特にCAGプロモーターを用いることが好ましい。
ベクターの受精卵への導入方法としては、マイクロインジェクション法などを用いることができる。
ベクターの受精卵への導入方法としては、マイクロインジェクション法などを用いることができる。
本発明のヒト変異GNE遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物から抽出したゲノムDNAを用いて特定した。特定の方法は、特異的な標識化プローブを用いたサザンブロット法や、特異的なプライマーを用いたPCR法などにより行なうことができる。
なお、本発明のトランスジェニック非ヒト動物としては、上記の方法により得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその子孫を用いることができる。
なお、本発明のトランスジェニック非ヒト動物としては、上記の方法により得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその子孫を用いることができる。
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物の作製に際しては、先ず、GNE遺伝子またはその発現領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、および/または他の配列の挿入を起こすようにターゲティングベクターを構築し、前記ターゲティングベクターをES細胞に導入することによりGNE遺伝機能を欠損した組換えES細胞を得る。
ターゲティングベクターは、GNE遺伝子またはその発現領域上、少なくとも一部の配列の欠失、置換、および/または他の配列の挿入を起こすように設計される。その際、組み換えES細胞の選別のために、ポジティブおよび/またはネガティブ選別を行うマーカーとして機能する遺伝子の配列が挿入されるように、ターゲットベクターを設計することができる。この場合、GNE遺伝子又はその発現制御領域に挿入される前記他の配列の挿入場所は、内在性GNE遺伝子の発現を抑制しうる位置であれば、特に限定されることはない。
ポジティブ選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子(G418耐性により選択)などを用いることができる。また、ネガティブ選択マーカー遺伝子としては、チミジンキナーゼ遺伝子(ガンシクロビル耐性により選択)などを用いることができる。
このようなターゲティングベクターを構築する際に、ターゲティングベクター構築用として市販されているプラスミドベクターを利用してもよい。
ベクターの導入方法としては、電気パルス法などの公知の方法を用いることができる。
このようなターゲティングベクターを構築する際に、ターゲティングベクター構築用として市販されているプラスミドベクターを利用してもよい。
ベクターの導入方法としては、電気パルス法などの公知の方法を用いることができる。
得られた組み換えES細胞の選別は、例えば、GNE遺伝子またはその発現領域上に挿入されたポジティブ/ネガティブ選別を行なうためのマーカーにより行なうことができる。さらに、これらのマーカーにより選別したES細胞の組み換え確認は、PCR法、サザンブロット法等の公知の遺伝子解析法により行うことができる。
次に、前記組み換えES細胞を初期胚に導入し発生させてキメラ動物を作製し、上記キメラ動物と野生型動物とを交配させてへテロ接合体非ヒト哺乳動物(GNE+/−)を得る。
さらに該ヘテロ接合体非ヒト哺乳動物またはその子孫(GNE+/−)と本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物(hmutGNETg)と交配させて非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE+/−)を得る。
次いで、得られた非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE+/−)と前記へテロ接合体非ヒト哺乳動物(GNE+/−)を交配させることにより本発明の非ヒト哺乳動物を得ることができる(図3参照)。
さらに該ヘテロ接合体非ヒト哺乳動物またはその子孫(GNE+/−)と本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物(hmutGNETg)と交配させて非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE+/−)を得る。
次いで、得られた非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE+/−)と前記へテロ接合体非ヒト哺乳動物(GNE+/−)を交配させることにより本発明の非ヒト哺乳動物を得ることができる(図3参照)。
本発明の非ヒト哺乳動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、サルなどのヒト以外の哺乳動物が挙げられるが、特にマウスが好ましい。
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物は、ヒトでみられるGNE遺伝子の変異により引き起こされる縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)や遺伝性封入体ミオパチー(HIBM)等の筋疾患と同様の症状を示すことから、上記の筋疾患モデル用非ヒト哺乳動物として用いることができる。
これらの筋疾患モデル用非ヒト哺乳動物について種々の分析や観察を行なうことにより、前記筋疾患の病態解析を行なうことができる。分析や観察の方法は、特に制限されるものではないが、例えば、各臓器における血清シアル酸量の測定、骨格筋の測定、筋力測定、血清クレアチニンキナーゼ活性測定、ヘマトキシリン−エオジン染色、改良型ゴモリートリクローム染色、酸フォスファターゼ活性染色、NADH活性染色、免疫組織染色などによる組織標本の筋病理観察、電子顕微鏡での観察等が挙げられる。
また、様々な週齢・月齢・年齢における分析データを得ることも可能であり、前記筋疾患の病態解析・解明に非常に有効である。
また、様々な週齢・月齢・年齢における分析データを得ることも可能であり、前記筋疾患の病態解析・解明に非常に有効である。
さらに、本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物に筋疾患治療候補薬を投与し、薬効を確認することによって、筋疾患の治療薬のスクリーニングを行なうことができる。投与の方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、腹腔内注射、経皮投与等、公知の方法を挙げることができる。
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
本発明のヒト変異GNEcDNAを染色体内に含むトランスジェニックマウス(hmutGNETg)の作製
(1)ヒト変異GNEcDNAの合成
ヒト骨格筋RNAを鋳型として、oligo−dT15プライマーを用いて、Superscript II リバーストランスフェラーゼ(インビトロジェン)で、42℃、2時間RT反応させた。次に、PCRによりオープンリーディングフレーム全長を増幅し、ヒトGNEcDNAを得た。
PCR反応は、Takara LA−Taq(タカラバイオ株式会社製)を使用し、熱変性94℃,2分、[熱変性94℃,40秒;アニーリング62℃,30秒;伸張反応72℃,2分]×35サイクル、伸張反応72℃,10分の条件で行なった。使用したプライマー配列は以下の通りである。F:CGGCGTCTCCAACTCTATTTTAAGAA;R:CGGTCATCCTAAAGACAAGAACTTGA。
得られたヒトGNEcDNAは、pCR−bluntベクターにクローニングした。ヒトGNEcDNAの配列を確認した後、Stratageneのマニュアルに従って、PCRを用いたsite−directed mutagenesisにより変異を導入し、c.1714G>C(V572L)変異を有する変異GNEcDNAを得た。
(1)ヒト変異GNEcDNAの合成
ヒト骨格筋RNAを鋳型として、oligo−dT15プライマーを用いて、Superscript II リバーストランスフェラーゼ(インビトロジェン)で、42℃、2時間RT反応させた。次に、PCRによりオープンリーディングフレーム全長を増幅し、ヒトGNEcDNAを得た。
PCR反応は、Takara LA−Taq(タカラバイオ株式会社製)を使用し、熱変性94℃,2分、[熱変性94℃,40秒;アニーリング62℃,30秒;伸張反応72℃,2分]×35サイクル、伸張反応72℃,10分の条件で行なった。使用したプライマー配列は以下の通りである。F:CGGCGTCTCCAACTCTATTTTAAGAA;R:CGGTCATCCTAAAGACAAGAACTTGA。
得られたヒトGNEcDNAは、pCR−bluntベクターにクローニングした。ヒトGNEcDNAの配列を確認した後、Stratageneのマニュアルに従って、PCRを用いたsite−directed mutagenesisにより変異を導入し、c.1714G>C(V572L)変異を有する変異GNEcDNAを得た。
(2)ヒト変異GNEトランスジェニックマウス作製用ベクターの構築
ヒト変異GENトランスジェニックマウス作製用ベクターは、c.1714G>C(V572L)の変異を有するヒト変異GNEをすべての臓器で発現できるように、pCAGGSベクターのEcoRIサイトにヒト変異GNEcDNAを挿入することによって構築した(図4参照)。なお、後で遺伝子欠失ができるように、cDNAの両端にloxP配列を挿入した。
ヒト変異GENトランスジェニックマウス作製用ベクターは、c.1714G>C(V572L)の変異を有するヒト変異GNEをすべての臓器で発現できるように、pCAGGSベクターのEcoRIサイトにヒト変異GNEcDNAを挿入することによって構築した(図4参照)。なお、後で遺伝子欠失ができるように、cDNAの両端にloxP配列を挿入した。
(3)ヒト変異GNEトランスジェニックマウス作製用ベクターの受精卵への導入
SalIにて直鎖状にしたベクターを、200個以上のC57Black6の受精卵にインジェクションした。受精卵は、ICRマウスに移植され、その結果、40匹のF0マウスが得られた。これらのマウスの尾から調整したゲノムDNAについてPCR法により増幅を行い、導入した遺伝子組み込みの有無を検出してトランスジェニックマウスの同定を行なった。
PCR反応は、Takara Ex−Taq(タカラバイオ株式会社製)を使用し、サーマルサイクラー9700(アプライドバイオシステムズ製)を用い、熱変性94℃,5分,[熱変性94℃,30秒;アニーリング56℃,30秒;伸張反応72℃,1分]×35サイクル、伸張反応72℃,5分の条件で行なった。使用したプライマー配列は、次の通りである。F:CTCCCTGTGTGGGTAGACAAT;R:CAATTCCTTCCCGAGGATTT。なお、DNAフラグメントの検出には、アガロース電気泳動を用いた。
40匹中9匹がヒト変異GNE遺伝子導入マウス(F0)であることが確認された。
SalIにて直鎖状にしたベクターを、200個以上のC57Black6の受精卵にインジェクションした。受精卵は、ICRマウスに移植され、その結果、40匹のF0マウスが得られた。これらのマウスの尾から調整したゲノムDNAについてPCR法により増幅を行い、導入した遺伝子組み込みの有無を検出してトランスジェニックマウスの同定を行なった。
PCR反応は、Takara Ex−Taq(タカラバイオ株式会社製)を使用し、サーマルサイクラー9700(アプライドバイオシステムズ製)を用い、熱変性94℃,5分,[熱変性94℃,30秒;アニーリング56℃,30秒;伸張反応72℃,1分]×35サイクル、伸張反応72℃,5分の条件で行なった。使用したプライマー配列は、次の通りである。F:CTCCCTGTGTGGGTAGACAAT;R:CAATTCCTTCCCGAGGATTT。なお、DNAフラグメントの検出には、アガロース電気泳動を用いた。
40匹中9匹がヒト変異GNE遺伝子導入マウス(F0)であることが確認された。
(4)トランスジェニックマウスの同定
上記ヒト変異GNE遺伝子導入マウス(F0)9匹と野生型C57Black6マウスとを掛け合わせて本発明のトランスジェニックマウス(F1)を得た。得られたトランスジェニックマウス(F1)の尾から調製したゲノムDNAについてPCR法により増幅を行い、導入した遺伝子組み込みの有無を検出して、トランスジェニックマウスの同定を行なった。なお、トランスジェニックマウスの同定は、上記のトランスジェニックマウスの同定と同様の方法により行なった。
上記9匹のうち、4匹に産仔個体が得られたが、それらF1世代にトランスジーンが継代されていることが確認された。
上記ヒト変異GNE遺伝子導入マウス(F0)9匹と野生型C57Black6マウスとを掛け合わせて本発明のトランスジェニックマウス(F1)を得た。得られたトランスジェニックマウス(F1)の尾から調製したゲノムDNAについてPCR法により増幅を行い、導入した遺伝子組み込みの有無を検出して、トランスジェニックマウスの同定を行なった。なお、トランスジェニックマウスの同定は、上記のトランスジェニックマウスの同定と同様の方法により行なった。
上記9匹のうち、4匹に産仔個体が得られたが、それらF1世代にトランスジーンが継代されていることが確認された。
(5)トランスジェニックマウスにおけるトランスジーン(humtGNETg)の発現
トランスジェニックマウスの各組織から、totalRNAを抽出した後、hmutGNETgの量をリアルタイムRT−PCR法により測定した。
リアルタイムRT−PCR法は、SYBR Green kit(株式会社キアゲン製)を使用し、サーマルサイクラーI Cycler−IQ(バイオラット社製)を用い、熱変性94℃,15分、[熱変性94℃,15秒;アニーリング58℃,30秒;伸張反応72℃,30秒]×45サイクルの条件で行なった。
hmutGNETg mRNA増幅用プライマーとしては、F:CTTCAAGAGCCACTGCAA、R:CAATTCCTTCCCGAGGATTを用い、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)mRNAの発現を内部標準として用いた。また、GAPDHプライマーとしては、F:CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG、R:TTGAAGTCGCAGGAGACAACCTGを用いた。
トランスジェニックマウスの各組織から、totalRNAを抽出した後、hmutGNETgの量をリアルタイムRT−PCR法により測定した。
リアルタイムRT−PCR法は、SYBR Green kit(株式会社キアゲン製)を使用し、サーマルサイクラーI Cycler−IQ(バイオラット社製)を用い、熱変性94℃,15分、[熱変性94℃,15秒;アニーリング58℃,30秒;伸張反応72℃,30秒]×45サイクルの条件で行なった。
hmutGNETg mRNA増幅用プライマーとしては、F:CTTCAAGAGCCACTGCAA、R:CAATTCCTTCCCGAGGATTを用い、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)mRNAの発現を内部標準として用いた。また、GAPDHプライマーとしては、F:CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG、R:TTGAAGTCGCAGGAGACAACCTGを用いた。
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE−/−)の作製
(1)GNE遺伝子破壊マウス作製用ベクターの構築
GNE遺伝子破壊マウス作製用のベクター(pBluescript)は、マウスGNE遺伝子の86番アミノ酸でフレームシフトを起こすように設計した。具体的には、マウスGNE遺伝子のエクソン3からエクソン5までを含む10.5kbpフラグメントを用い、エクソン3をNeo遺伝子で置換するように(エクソン3の1.4kbp上流から124bp下流まで)、EcoRI−PacIサイトにPGK−Neoカセットを導入することによって構築した(図5参照)。
(1)GNE遺伝子破壊マウス作製用ベクターの構築
GNE遺伝子破壊マウス作製用のベクター(pBluescript)は、マウスGNE遺伝子の86番アミノ酸でフレームシフトを起こすように設計した。具体的には、マウスGNE遺伝子のエクソン3からエクソン5までを含む10.5kbpフラグメントを用い、エクソン3をNeo遺伝子で置換するように(エクソン3の1.4kbp上流から124bp下流まで)、EcoRI−PacIサイトにPGK−Neoカセットを導入することによって構築した(図5参照)。
(2)GNE遺伝子破壊マウス作製用ベクターのマウスES細胞への導入、キメラマウスの作製およびヘテロマウス(GNE+/−)の作製
NotI消化した直鎖状ベクターを、129svjマウスiTL1ES細胞(129Sv/Ev)に電気穿孔法で導入した後、G418で選択することにより、遺伝子組み換え体を得た。なお、組み換え体は、PCR法によって確認した。
定法に従い、得られた組み換えES細胞をブラストシストにインジェクションし、更に、胚を仮親へ移植することによりキメラマウスを作製した。
得られたキメラマウスと野生型マウスとの交配によりへテロマウス(GNE+/−)を得た。なお、マウスの維持、交配は定法に従って行った。
NotI消化した直鎖状ベクターを、129svjマウスiTL1ES細胞(129Sv/Ev)に電気穿孔法で導入した後、G418で選択することにより、遺伝子組み換え体を得た。なお、組み換え体は、PCR法によって確認した。
定法に従い、得られた組み換えES細胞をブラストシストにインジェクションし、更に、胚を仮親へ移植することによりキメラマウスを作製した。
得られたキメラマウスと野生型マウスとの交配によりへテロマウス(GNE+/−)を得た。なお、マウスの維持、交配は定法に従って行った。
(3)PCR法によるへテロマウスの同定
得られたへテロマウス(GNE+/−)の遺伝子を確認するために、尾から調整したゲノムDNAを用いてPCR法により増幅を行い、同定を行なった。
PCR反応は、Takara Ex−Taq(タカラバイオ株式会社製)を使用し、熱変性94℃,5分、[熱変性94℃,30秒;アニーリング60℃,30秒;伸張反応72℃,1分]×35サイクル、伸張反応72℃,5分の条件で行なった。使用したプライマー配列は、次の通りである。GNE−S2:5’−TGGCGTTCTTACACTCTCTAGG−3’;Neo1:5’−TGCGAGGCCAGAGGCCACTTGTGTAGC−3’;UDP WT3:5’−GGGAGTCAGATCTCATTACGGA−3’なお、増幅DNAフラグメントの検出には、アガロース電気泳動を用いた。
野生型遺伝子の生成物は1150bp、破壊された遺伝子は750bpの産物を与えることから、得られた上記へテロマウスは、GNE+/−を有するへテロマウスであることが確認された。
得られたへテロマウス(GNE+/−)の遺伝子を確認するために、尾から調整したゲノムDNAを用いてPCR法により増幅を行い、同定を行なった。
PCR反応は、Takara Ex−Taq(タカラバイオ株式会社製)を使用し、熱変性94℃,5分、[熱変性94℃,30秒;アニーリング60℃,30秒;伸張反応72℃,1分]×35サイクル、伸張反応72℃,5分の条件で行なった。使用したプライマー配列は、次の通りである。GNE−S2:5’−TGGCGTTCTTACACTCTCTAGG−3’;Neo1:5’−TGCGAGGCCAGAGGCCACTTGTGTAGC−3’;UDP WT3:5’−GGGAGTCAGATCTCATTACGGA−3’なお、増幅DNAフラグメントの検出には、アガロース電気泳動を用いた。
野生型遺伝子の生成物は1150bp、破壊された遺伝子は750bpの産物を与えることから、得られた上記へテロマウスは、GNE+/−を有するへテロマウスであることが確認された。
(4)本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE−/−)の作製
実施例1で得られたトランスジェニックマウス(hmutGNETg)と上で得られたへテロマウス(GNE+/−)を掛け合わせることにより、産出動物として、ヒト変異GNEトランスジェニック−GNE遺伝子へテロ破壊マウス(hmutGNETg−GNE+/−)を得た。
実施例1で得られたトランスジェニックマウス(hmutGNETg)と上で得られたへテロマウス(GNE+/−)を掛け合わせることにより、産出動物として、ヒト変異GNEトランスジェニック−GNE遺伝子へテロ破壊マウス(hmutGNETg−GNE+/−)を得た。
遺伝子型が確かめられたヒト変異GNEトランスジェニック−GNE遺伝子へテロ破壊マウス(hmutGNETg−GNE+/−)と上で得られたへテロマウス(GNE+/−)の掛け合わせにより、本発明のヒト変異GNEトランスジェニック−GNE遺伝子破壊マウス(hmutGNETg−GNE−/−)が得られた(図3)。本発明のヒト変異GNEトランスジェニック−GNE遺伝子破壊マウス(hmutGNETg−GNE−/−)には、大きさや形態上の異変などは見られなかった。
なお、上記かけ合わせによる離乳マウスは合計325匹であり、そのうち28匹がhmutGNETg−GNE−/−であった。
なお、上記かけ合わせによる離乳マウスは合計325匹であり、そのうち28匹がhmutGNETg−GNE−/−であった。
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE−/−)の各臓器におけるシアル酸量の測定
原ら(Hara S et al. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids.(1987)Analytical Biochemistry 164,138-145)の方法に準じて、蛍光ラベル後、HPLC、2080ポンプシステム、FO−2020検出器(日本分光社製)及びC18逆相カラム(Zorbax300SB;アジレント製)を用いて測定した。測定には血清1μlを用い、標準として、N−アセチルノイラミン酸とN−グリコリルノイラミン酸を用いた。
原ら(Hara S et al. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids.(1987)Analytical Biochemistry 164,138-145)の方法に準じて、蛍光ラベル後、HPLC、2080ポンプシステム、FO−2020検出器(日本分光社製)及びC18逆相カラム(Zorbax300SB;アジレント製)を用いて測定した。測定には血清1μlを用い、標準として、N−アセチルノイラミン酸とN−グリコリルノイラミン酸を用いた。
その結果、野生株マウスに比べ、ヒト変異GNEトランスジェニック−GNE遺伝子破壊マウス(hmutGNETg−GNE−/−)におけるシアル酸量は顕著に低下しており、骨格筋においても有意な低下が見られた(図6)。
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE−/−)における血清クレアチンキナーゼの測定
血清クレアチニンキナーゼ測定は、協和メディックスの試薬キット(商品名:デタミナーLCPK)を使用して行なった。測定には血清1μlを用い、37℃において、クレアチンリン酸とADPから一連の反応で生成するNADPHの量を、波長340nmの吸光度増加測定により行なった。なお、吸光度増加測定には、DU640(ベックマン社製)を使用した。
血清クレアチニンキナーゼ測定は、協和メディックスの試薬キット(商品名:デタミナーLCPK)を使用して行なった。測定には血清1μlを用い、37℃において、クレアチンリン酸とADPから一連の反応で生成するNADPHの量を、波長340nmの吸光度増加測定により行なった。なお、吸光度増加測定には、DU640(ベックマン社製)を使用した。
30週齢マウスにおいては、野生株マウスに比べ、ヒト変異GNEトランスジェニック−GNE遺伝子破壊マウス(hmutGNETg−GNE−/−)の血清クレアチニンキナーゼ活性が高値を示した(図7)。
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE−/−)における筋力測定
マウスの筋力測定は、前肢での鉄棒よじ上りテストにより行なった。3mm径の金属棒に、マウスを上肢でつかまらせ、水平位置にマウスを保持したのち手を離す。その後、マウスが上肢のみで、3秒以内に体を金属棒の上に持ち上げることができた場合を「成功」として数えた。連続15回の試技での成功回数で評価を行なった。
マウスの筋力測定は、前肢での鉄棒よじ上りテストにより行なった。3mm径の金属棒に、マウスを上肢でつかまらせ、水平位置にマウスを保持したのち手を離す。その後、マウスが上肢のみで、3秒以内に体を金属棒の上に持ち上げることができた場合を「成功」として数えた。連続15回の試技での成功回数で評価を行なった。
3−17週齢マウスにおいては、ヒト変異GNEトランスジェニック−GNE遺伝子破壊マウス(hmutGNETg−GNE−/−)の成功回数は、野生型マウスの成功回数より低かった(図8)。
また、ヒト変異GNEトランスジェニック−GNE遺伝子破壊マウス(hmutGNETg−GNE−/−)をテイルでつり下げた場合には、神経疾患マウスに通常見られる後肢のホールドが観察された(図9A)。なお、後肢のホールドとは、体の中に上下肢を丸めて保持する姿勢をいい、これは「huggers」とも呼ばれる。野生型マウスでは、テイルでつり下げた場合、上下肢を伸ばす姿勢をとる(図9B)のに対し、ある神経性の欠損マウスでは体の中に上下肢を丸めて保持する前記ホールド姿勢をとることが知られている。
また、ヒト変異GNEトランスジェニック−GNE遺伝子破壊マウス(hmutGNETg−GNE−/−)をテイルでつり下げた場合には、神経疾患マウスに通常見られる後肢のホールドが観察された(図9A)。なお、後肢のホールドとは、体の中に上下肢を丸めて保持する姿勢をいい、これは「huggers」とも呼ばれる。野生型マウスでは、テイルでつり下げた場合、上下肢を伸ばす姿勢をとる(図9B)のに対し、ある神経性の欠損マウスでは体の中に上下肢を丸めて保持する前記ホールド姿勢をとることが知られている。
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE−/−)における骨格筋の病理解析
ヒト変異GNEトランスジェニック−GNE遺伝子破壊マウス(hmutGNETg−GNE−/−)について、骨格筋の病理解析を行なった。
骨格筋(主に、腓腹筋および大腿四頭筋)の凍結試料を作製し、更に、クリオスタット(CM3050Sライカ社製)を用いて6−10μmの横断切片を作製した。
作製した横断切片について、臨床のための筋病理(埜中征哉著,日本医事新報社)に従って、ヘマトキシリン−エオジン染色、改良型ゴモリートリクローム染色、酸フォスファターゼ活性染色及びNADH活性染色を行なった。
また、免疫組織染色については、Sasaoka T., Imamura M., Araishi K., Noguchi S., Mizuno Y., Takagoshi N., Hama H., Wakabayashi-Takai E., Yoshimoto-Matsuda Y., Nonaka I., Kaneko K., Yoshida M., Ozawa E.: Pathological analysis of muscle hypertrophy and degeneration in muscular dystrophy in γ-sarcoglycan-deficient mice. Neuromus. Disord., 13, 193-206, 2003.に記載された方法に従って、β−アミロイドタンパク質、タウタンパク質、リソソーム結合タンパク質、ポリユビキチンや筋鞘膜タンパク質ジストログリカンに対する抗体、及び、蛍光ラベル二次抗体を用いて間接蛍光抗体法で行なった。
ヒト変異GNEトランスジェニック−GNE遺伝子破壊マウス(hmutGNETg−GNE−/−)について、骨格筋の病理解析を行なった。
骨格筋(主に、腓腹筋および大腿四頭筋)の凍結試料を作製し、更に、クリオスタット(CM3050Sライカ社製)を用いて6−10μmの横断切片を作製した。
作製した横断切片について、臨床のための筋病理(埜中征哉著,日本医事新報社)に従って、ヘマトキシリン−エオジン染色、改良型ゴモリートリクローム染色、酸フォスファターゼ活性染色及びNADH活性染色を行なった。
また、免疫組織染色については、Sasaoka T., Imamura M., Araishi K., Noguchi S., Mizuno Y., Takagoshi N., Hama H., Wakabayashi-Takai E., Yoshimoto-Matsuda Y., Nonaka I., Kaneko K., Yoshida M., Ozawa E.: Pathological analysis of muscle hypertrophy and degeneration in muscular dystrophy in γ-sarcoglycan-deficient mice. Neuromus. Disord., 13, 193-206, 2003.に記載された方法に従って、β−アミロイドタンパク質、タウタンパク質、リソソーム結合タンパク質、ポリユビキチンや筋鞘膜タンパク質ジストログリカンに対する抗体、及び、蛍光ラベル二次抗体を用いて間接蛍光抗体法で行なった。
その結果、筋線維の大小不同が観察されるとともに、筋線維内にβアミロイドタンパク質の蓄積が観察された。さらに、50週齢以上のマウスの腓腹筋及び大腿四頭筋では縁取り空胞が観察され、リソソーム結合タンパク質の筋繊維内での強い免疫反応も観察された(図10)。また、ポリユビキチン、筋鞘膜タンパク質についても同様に筋線維内での強い免疫反応が観察された。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて作製された、本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物は、ヒトの縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)や遺伝性封入体ミオパチー(HIBM)等の筋疾患と同様の症状を示すことから、これらの筋疾患の病態解析と治療法開発に極めて有用である。
Claims (10)
- ミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物であって、GNE遺伝子の機能が染色体上で欠損し、かつ、ヒト変異GNEcDNAを染色体内に含むことを特徴とする非ヒト哺乳動物。
- 前記ミオパチーが縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチーであることを特徴とする請求項1に記載された非ヒト哺乳動物。
- 前記ヒト変異GNEcDNAが、c.1714G>C変異を持つヒトGNEcDNAであることを特徴とする請求項1に記載された非ヒト哺乳動物。
- 前記非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項1に記載された非ヒト哺乳動物。
- GNE遺伝子の変異により引き起こされる筋疾患の疾病モデルとする、請求項1に記載された非ヒト哺乳動物の使用方法。
- ヒト変異GNEcDNAを染色体内に含むことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項6に記載されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記ヒト変異GNEcDNAを挿入したベクターを作製し、前記ベクターを受精卵に導入し発生させることを特徴とする、請求項6に記載されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
- (1)GNE遺伝子またはその発現領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、および/または他の配列の挿入を起こすようにターゲティングベクターを構築し、
(2)前記ベクターをES細胞に導入してGNE遺伝機能を欠損した組換えES細胞を得た後、該組換えES細胞を初期胚に導入し発生させてキメラ動物を作製し、
(3)前記キメラ動物と野生型動物とを交配させてへテロ接合体非ヒト哺乳動物(GNE+/−)を得、
(4)得られたへテロ接合体非ヒト哺乳動物またはその子孫(GNE+/−)と請求項6に記載されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物とを交配させて非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE+/−)を得、
(5)得られた非ヒト哺乳動物(hmutGNETg−GNE+/−)と前記へテロ接合体非ヒト哺乳動物またはその子孫(GNE+/−)とを交配させることを特徴とする請求項1に記載された非ヒト哺乳動物の作製方法。 - 請求項1に記載された非ヒト哺乳動物に筋疾患治療候補薬を投与し、薬効を確認することを特徴とするGNE遺伝子の変異により引き起こされる筋疾患用治療薬のスクリーニング方法。
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2006
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2012180291A (ja) * | 2011-02-28 | 2012-09-20 | Satoru Noguchi | タンパク質蓄積性筋疾患を治療するための医薬 |
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