JP2007300932A - 病原微生物の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】クラミジアのクラミジア トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、クラミジアのクラミジア トラコマチス(Chlamydia trachomatis)を検出可能な特定な配列のプローブ、および、それらを使用するハイブリダイゼーションにより病原微生物の標的核酸を検出する方法。特定配列を含むキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する病原微生物の検出方法、ならびに該方法のためのキット。
【選択図】なし
Description
結核は、過去において人間の死因の上位を占める疾患であり、種々の治療法が開発された現在においてもなお多数の患者が存在する。
リン菌(すなわちナイセリア・ゴノルホエア、Neisseria gonorrhoeae)は、アメリカ合衆国において最も一般的に報告される細菌感染の1つである淋病の病原体である。Miyada and Born, 1991, Mol. Cell. Probes 5:327-335 (非特許文献7);アメリカ特許第5,256,536号(特許文献17);及びアメリカ特許第5,525,717号(特許文献18)は、N.ゴノルホエア シトシンDNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子(M.Ngo PII)の配列と有意な相同性を有するオープンリーディングフレーム(ORF1)を含むゲノムフラグメントに由来するDNAプローブを用いてのN.ゴノルホエアの検出を記載している。しかしながら、リン菌を特異的にかつ十分な感度で検出できる方法はなかった。
「クラミジア」とはクラミジア属に属する微生物をいう。クラミジア属の三つの種、クラミジア トラコマチス(C.trachomatis)、クラミジア シッタシ(C.psittaci)、クラミジア ニューモニエ(C.pneumoniae)はヒト宿主に感染し、疾患を起こしうることから臨床的に重要である。特にクラミジア トラコマチスは、男女両性で性器感染症を引き起こす、先進社会で最も一般的な性的伝染病であると報告されている。従って、クラミジア トラコマチスを特異的に、そして適時に検出できる方法および試薬が必要とされている。
従来より、血清等の試料中のHCVの検出は、逆転写PCR(RT−PCR)法により行われている。この方法は、(1)血清からのHCVのRNAの抽出、(2)抽出したRNAを鋳型としたcDNAの合成、(3)温度を上下させるPCR法による増幅、(4)固定化プローブとのハイブリダイゼーション、(5)未反応試薬の洗浄除去、(6)標識試薬との反応、(7)未反応試薬の洗浄除去、(8)発色試薬の添加、(9)発色停止薬の添加、(10)吸光度の測定の計10工程で行われている。また、J.Virol.Methods Vol.64,pp147−159(1997)(非特許文献8)記載のリアルタイム検出PCR法を用いたホモジニアス検出法によるHCV検出も検討されている。
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり、;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
に関する。本発明の第8の発明において、さらに鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する反応混合物を使用することが好ましい。また、当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーが下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーであるものが好適に使用できる。
一般式:5’−dNa−Nb−dNc−3’
(a:11以上の整数、b:1以上の整数、c:0または1以上の整数、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、dNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよい)
一般式:5’−dNa−Nb−dNc−3’
(a:11以上の整数、b:1以上の整数、c:0または1以上の整数、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、dNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよい)
(1)本発明のプローブ
本発明のプローブは、病原微生物、例えば結核菌群、リン菌、クラミジアあるいはHCVを検出しうることを特徴とする。本発明のプローブの好適な態様としては、アルカリ領域において標的核酸に安定してハイブリダイズできるものが例示される。すなわち本発明のアルカリ領域でハイブリダイズ可能なプローブとしては、特に限定はないが、例えばpH7.0を超えるアルカリ領域、好ましくはpH8〜14の範囲、特に好ましくはpH8〜pH10の範囲のアルカリ条件下においてその塩基配列に相補的な配列を有する標的核酸とハイブリダイズすることが可能なプローブ挙げられる。特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号11、20、21、34、35記載の塩基配列を含有するものが挙げられる。なお、本発明のプローブは従来の中性領域でのハイブリダイゼーションに用いることができる。
本発明の標的核酸の検出方法は、上記(1)記載のプローブを用いることにより、標的核酸の2本鎖から1本鎖への変性工程に続く中和工程を省略できる。すなわち、本発明の標的核酸の検出方法においてpHが7を越えるアルカリ条件、特に好ましくはpH8〜14の範囲のアルカリ条件下においてその塩基配列に相補的な配列を有する核酸とハイブリダイズすることが可能である。当該ハイブリダイゼーションの条件としては、特に限定するものではないが、「厳密な条件」として当業者に知られている条件を挙げることができる。このような条件は、1989年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、T.マニアティス(T. Maniatis)ら編集、モレキュラー・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュアル第2版(Molecular Cloning : A Laboratory Manual 2nd ed.)に記載のものや、本願実施例に記載されたものが使用できる。
Tm=81.5−16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)−(600/N)
(式中、Nはプローブの鎖長、%G+Cはプローブ中のグアニンおよびシトシン残基の含量である)
により求められる。
Tm=(%A+T)×2+(%G+C)×4]
(式中、(%A+T)はプローブ中のアデニンおよびチミン残基の含量、(%G+C)はプローブ中のグアニンおよびシトシン残基の含量である)
として推定することができる。
一般式:5’−dNa−Nb−dNc−3’
(a:11以上の整数、b:1以上の整数、c:0または1以上の整数、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、dNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよい)
本発明の検出方法に用いられるプライマーとしては、キメラオリゴヌクレオチドプライマーが例示される。該プライマーは、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、非修飾あるいは修飾リボヌクレオチドから構成され、リボヌクレオチドがその3’末端又は3’末端側に配置されたものが使用される。例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドがICAN法のプライマーとして使用することができる。
一般式:5’−dNa−Nb−dNc−3’
(a:11以上の整数、b:1以上の整数、c:0または1以上の整数、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、dNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよい)
本発明は、前述(2)の本発明の検出方法に使用される組成物を提供する。該組成物としては、例えば、上記(1)に記載のプローブならびに上記(3)に記載のプライマーを含有するものが挙げられる。あるいは、上記プローブを含む検出用組成物及び上記プライマーを含む増幅用組成物の形態であってもよい。さらに、酢酸マグネシウムを含む組成物及びプライマーを含む組成物の形態であってもよい。さらに、緩衝成分やdNTP等を含んでいてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド3リン酸のアナログを含有していてもよい。さらに、本発明の組成物中の試薬の分解・失活等による非増幅状況(偽陰性)確認のための内部標準(IC;internal control)を含有していてもよい。当該内部標準は、本発明のプライマーにより増幅することができる。
本発明のキットは、病原微生物由来の標的核酸の検出のためのキットであり、特に限定はされないが、pH7を越えるアルカリ条件下で標的核酸とハイブリダイズ可能なプローブ、特に限定はされないが例えば、上記(1)記載のプローブを含有することを特徴とする。
本発明は、高感度に結核菌等を検出するための核酸抽出方法を提供する。すなわち、臨床標本からの核酸抽出は、デリケートで困難な工程であり、尿、胸水、髄液、血液などの液体検体から、膿、喀痰などのような濃厚粘性検体、さらには細胞、組織といったものまでその対象は幅広い。現在、これら検体から結核菌等の遺伝子を抽出するスタンダードな方法は存在せず、従って現在まで報告された結核菌等の遺伝子検査における報告では、様々な核酸抽出方法が用いられている。これら従来法では各種界面活性剤、アルカリ、有機溶媒、またはカオトロピック試薬を含む試薬中で混合したり、ガラスビーズ存在下で超音波処理をすることで実施されていた。
(1)ピロコッカス フリオサス ゲノムDNAの調製
トリプトン(ディフコラボラトリーズ社製)1%、酵母エキス(ディフコラボラトリーズ社製)0.5%、可溶性でんぷん(ナカライテスク社製)1%、ジャマリンS・ソリッド(ジャマリンラボラトリー社製) 3.5%、ジャマリンS・リキッド(ジャマリンラボラトリー社製)0.5% 、MgSO4 0.003%、NaCl 0.001%、FeSO4・7H2O 0.0001%、CoSO4 0.0001%、CaCl2・7H2O 0.0001%、ZnSO4 0.0001%、CuSO4・5H2O 0.1ppm、KAl(SO4)2 0.1ppm、H3BO4 0.1ppm、Na2MoO4・2H2O 0.1ppm、NiCl2・6H2O 0.25ppmの組成の培地2リットルを2リットル容のメジュウムボトルにいれ、120℃、20分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス フリオサス(Pyrococcus furiosus、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメンより購入:DSM3638)を接種して、95℃、16時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。
ピロコッカス ホリコシ(Pyrococcus horikoshii)の全ゲノム配列が公開されており〔DNA リサーチ(DNA Research)、第5巻、第55−76頁(1998)〕、RNaseHIIのホモログをコードする遺伝子(PH1650)が1つ存在することが明らかになっている(配列番号1、日本国 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 ホームページ:http://www.nite.go.jp/)。
上記(2)で得られたpPFU220の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
上記(2)で得られたpPFU220を大腸菌HMS174(DE3)(ノバジェン社製)に形質転換し、得られたpPFU220を含む大腸菌HMS174(DE3)を100μg/mlのアンピシリンを含む2リットルのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を66.0mlのソニケーションバッファー〔50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を60℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、61.5mlの熱処理上清液を得た。
上記で得られたPfuRNaseHII標品を用いて下記の方法によりRNaseH活性を測定した。
アルカエオグロバス フルギダスのRNaseHII遺伝子のクローニング
(1)アルカエオグロバス フルギダス ゲノムDNAの調製
アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンGmbHより購入:DSM4139)8ml相当分の菌体を集め、100μlの25%ショ糖、50mMトリス−HCl(pH8.0)に懸濁し、20μlの0.5M EDTA、10μlの10mg/ml塩化リゾチーム(ナカライテスク社製)水溶液を加えて、20℃で1時間反応させた。反応終了後、この反応液に800μlの150mM NaCl、1mM EDTA、20mMトリス−HCl(pH8.0)、10μlの20mg/mlプロテイナーゼK(宝酒造社製)及び50μlの10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、37℃で1時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に50μlのTEに溶解してゲノムDNA溶液を得た。
アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)は全ゲノム配列が公開されており〔Klenk,HPら、ネイチャー(Nature)、第390巻、第364−370頁(1997)〕、RNaseHIIのホモログをコードする遺伝子(AF0621)が1つ存在することが明らかになっている(配列番号6、http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)。
上記(2)で得られたpAFU204の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
上記(2)で得られたpAFU204で大腸菌JM109を形質転換し、得られたpAFU204を含む大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む2リットルのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を37.1mlのソニケーションバッファー〔50mMトリス−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、40.3mlの熱処理上清液を得た。
単位(unit)=〔吸光度差×反応液量(ml)〕/0.0152×(110/100)×希釈率
本発明の方法に使用される常温性RNaseHのユニット数は、以下の方法で測定した。
力価測定用反応液:最終濃度がそれぞれ40mM トリス−塩酸(pH7.7、37℃)、4mM 塩化マグネシウム、1mM DTT、0.003% BSA、4%グリセロール、24μM ポリ(dT)になるように滅菌水で調製した。
ポリ[8−3H]アデニル酸溶液:370kBqのポリ[8−3H]アデニル酸溶液を200μlの滅菌水に溶解した。
ポリアデニル酸溶液:ポリアデニル酸を3mMになるように滅菌超純水で希釈した。
酵素希釈液:最終濃度がそれぞれ25mM トリス−塩酸(pH7.5、37℃)、5mM 2−メルカプトエタノール、0.5mM EDTA(pH7.5、37℃)、30mM 塩化ナトリウム、50%グリセロールになるように滅菌水で調製した。
熱変性子牛胸腺DNAの調製:子牛胸腺DNA 200mgをTEバッファー100mlに懸濁し、膨潤させた。該溶液のUV260nmの吸光度を測定し、1mg/mlの濃度に滅菌超純水で希釈した。次に、該溶液を100℃で10分間加熱後、氷浴中で急冷した。
上記(1)で調製した力価測定用反応液985μlにポリ[8−3H]アデニル酸溶液7μlを加え37℃で10分間保持した。次にポリアデニル酸を最終濃度が24μMになるように8μl加え、さらに37℃で5分間保持した。このようにしてポリ[8−3H]rA−ポリdT反応液1000μlを調製した。次に、該反応液200μlを分取し、30℃で5分間保持した後、任意の希釈系列で希釈した酵素液1μlを加え、これらの反応液を経時的に50μlずつサンプリングして、後の測定に用いた。酵素添加からサンプリングまでの間の時間をY分とした。また、全CPM用反応液50μlおよびブランク用反応液50μlは、酵素液の代わりに酵素希釈液を1μl加えて調製した。該サンプリング溶液に100mMピロリン酸ナトリウム100μl、熱変性子牛胸腺DNA溶液50μlおよび10%トリクロロ酢酸300μl(全CPM測定の場合は、超純水300μl)を加え、0℃で5分間保持後、10000rpmで10分間遠心した。遠心後、得られた上清250μlをバイアルに入れ、アクアゾルー2(NENライフサイエンスプロダクツ社製) 10mlを加え、液体シンチレーションカウンターでCPMを測定した。
各酵素のユニット(Unit)数は、以下の計算式で算出した。
Unit/ ml ={(測定したCPM−ブランクCPM)×1.2*×20×1000×希釈率}×200(μl)/(全CPM×Y分×50(μl)×9**)
1.2*:全CPM中に含まれるポリ[8−3H]rA−ポリdTの50μl当たりのnmol数
9**:補正係数
(1)喀痰からのDNA抽出
米国CDC(Centers for Diseases Control and Prevention)が推奨するNALC法により喀痰を処理した。すなわち、喀痰を50ml容のスクリューキャップ付チューブに入れ、等量のNALC液(0.1M クエン酸ナトリウム 50mlと4%水酸化ナトリウム 50mlの混合液に0.5gのN−アセチル−L−システインを加えたもの)を加え、試験管ミキサーで20秒間良くかき混ぜ検体を液状にした。室温で15分間放置した後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で全量を50mlとし、次いで3000g以上で20分遠心し沈殿を採取した。この沈殿に50μlの溶解緩衝液[lysis buffer;1単位のムタノリシン(mutanolysin、シグマ社製)を含有する10mM HEPES緩衝液(pH7.8)]を加えよく混和する。37℃で30分反応し、ついで5分間水浴中煮沸または96℃のヒートブロック中で加熱処理した。必要な場合は微量高速遠心器により遠心し、その上清を分取した。以上の操作により調製された上清を喀痰からのDNA抽出液として以降の操作に用いた。さらに、Genとるくん酵母用(宝酒造社製)も使用取扱説明書に従い、核酸抽出に使用した。
結核菌群由来のIS6110遺伝子を検出するための特異的オリゴヌクレオチドプローブをGenBank Accession No.X52471記載の塩基配列をもとに作製した。すなわち、配列表の配列番号11に示す塩基配列からなり、5’末端にFITC(フルオレセインイソチオシアネート)が付されたオリゴヌクレオチドプローブMTIS―2BFをDNA合成機により合成した。
表1に示すICAN反応のための反応液を調製し、60℃で30分インキュベートした。
100mM HEPES−水酸化カリウム(pH7.8)
500mM 酢酸カリウム
5% ジメチルスルフォキシド(DMSO)
0.05% ウシ血清アルブミン(BSA)
ストレプトアビジン(ナカライ社製)をPBSに2μg/mlの濃度に溶解し、この溶液を白色発光検出用96ウェルマイクロタイタープレートに150μl/ウェルとなるように添加し、4℃で一晩放置し、固定化した。ストレプトアビジン溶液を捨てた後、1% BSA−PBS溶液を200μl/ウェルとなるように分注して4℃で一晩放置し、ブロッキングを行った。この溶液を捨てたものをストレプトアビジンコートプレートとして以下の実験に使用した。
0、5および10コピー相当の結核菌群ゲノムを含む喀痰由来DNA試料につき、上記のとおり結核菌群DNAの検出を実施した。その結果、表2に示すように5コピーにおいてもS/N比で約300倍という強い発光が検出できた。
結核菌感染の疑いを持たれた患者26例から喀痰を採取し、実施例1記載の操作に従って結核菌DNAの検出を行った。また、同一検体を用いて、既存の16S rRNAをコードするDNAをターゲットとしたPCR法に基づくキットであるアンプリコア マイコバクテリウムツベルクロシス(ロシュ社製)を用いた検出、小川培地による培養法による結核菌検査を実施した。その結果を表3に示す。
本発明の検出方法の結核菌群に対する特異性について検討した。ゲノムDNAは、表4に示す37株を使用した。
(1)磁気ビーズを用いた結核菌群の検出について検討した。プライマーは、MTIS―2Fプライマー及びMTIS―2RBioプライマーを用いた。次に、鋳型として実施例2での陽性検体由来の抽出ゲノムを滅菌水にて30倍、300倍、3000倍となるように希釈調製した。反応は以下のようにして行った。即ち、最終濃度32mM ヘペス−水酸化カリウムバッファー(pH7.8)、100mM 酢酸カリウム、1%DMSO、0.01%BSA、4mM 酢酸マグネシウム、各500μM dNTPs、各50pmolのMTIS―2F及びMTIS―2Rプライマー、8.75UのAfu由来RNaseH、8UのBcaBEST DNAポリメラーゼ、各鋳型量1μlを添加し滅菌水で最終容量を50μlにした。該反応液はあらかじめ60℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、60分間保持した。得られた増幅断片を自動検出装置、ルミパルス(富士レビオ社製)にセットし、ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ(ピアス社製)による検出を行った。ビオチン結合能100pmol相当のストレプトアビジン固層化磁気ビーズをキュベット第1層でビオチン化増幅断片と5分間反応させ、次いで0.1N NaOHを加えてFITC標識プローブMTISBFと5分間ハイブリダイズさせ、洗浄後POD標識抗FITC抗体を加え、5分間反応後洗浄し発光基質を加えた。この結果、既存の自動化検出装置において磁気ビーズを用いて20分間という短時間で半定量可能であることが示された。なお、試薬は実施例1と同様のものを用いた。検出は、発光量をフォトカウンティングすることで測定した。その結果を表6に示す。
実施例1〜4の結果を踏まえ、結核菌群のキットを構築した。各コンポーネントについて以下に示す。
5×反応緩衝液 500 μl
100mM 酢酸マグネシウム 100 μl
10mM dNTPミックス 125 μl
0.1mM MTIS―2Fプライマー 25 μl
0.1mM MTIS−SRBioプライマー 25 μl
Afu RNaseHII(17.5U/μl) 25 μl
BcaBEST DNAポリメラーゼ(16U/μl) 25 μl
ストレプトアビジン固相化96穴プレート 50個
ハイブリバッファー(5×SSC、1% TritonX100、
1% BSA) 2.5ml
変性剤(0.1N NaOH) 0.5ml
検出用MTプローブ溶液(25nM MTIS―2BFプローブ)5ml
検出用ICプローブ溶液(25nM ICFプローブ) 5ml
標識抗体液(ブロックエース(大日本製薬社製):PBS=1:3、
500Unit POD−抗FITC抗体) 5ml
10×洗浄液(250mM トリス緩衝溶液(pH7.5)、
1.5M NaCl、1%BSA、0.5% Tween20)
20ml
発光試薬A(SuperSignal ELISA Pico Substrate A液(ピアス社製)) 2.5ml
発光試薬B(SuperSignal ELISA Pico Substrate B液(ピアス社製)) 2.5ml
内部標準液(ICプラスミド、TE緩衝液) 0.1ml
陽性コントロール液(IS6110含有プラスミド、TE緩衝液)
0.02ml
陰性コントロール液(TE緩衝液) 0.02ml
(1)スワブ検体からのDNA抽出
男子尿道ならびに女子子宮頚部を綿棒で拭い取ったスワブ検体に界面活性剤を含む抽出バッファー(アンプリコアSTD用検体処理試薬(ロシュ社))を加え95℃〜100℃で10分間加熱処理した。
クラミジアのクリプティック・プラスミドを検出するための特異的オリゴヌクレオチドプローブを作製した。すなわち、配列表の配列番号20に示す塩基配列からなり、5’末端にFITC(フルオレセインイソチオシアネート)が付されたオリゴヌクレオチドプローブCT1234をDNA合成機により合成した。また、リン菌のcppB遺伝子を検出するための特異的オリゴヌクレオチドプローブを作製した。すなわち、配列表の配列番号21に示す塩基配列からなり、5’末端にFITC(フルオレセインイソチオシアネート)が付されたオリゴヌクレオチドプローブCppB3をDNA合成機により合成した。
表7に示すICAN反応のための反応液を調製し、55℃で60分インキュベートした。
100mM HEPES−水酸化カリウム(pH7.8)
500mM 酢酸カリウム
5% ジメチルスルフォキシド(DMSO)
0.05% ウシ血清アルブミン(BSA)
ストレプトアビジン(ナカライ社製)をPBSに2μg/mlの濃度に溶解し、この溶液を白色発光検出用96ウェルマイクロタイタープレートに150μl/ウェルとなるように添加し、4℃で一晩放置し、固定化した。ストレプトアビジン溶液を捨てた後、1% BSA−PBS溶液を200μl/ウェルとなるように分注して4℃で一晩放置し、ブロッキングを行った。この溶液を捨てたものをストレプトアビジンコートプレートとして以下の実験に使用した。
0、10および100コピー相当のクラミジアゲノムを含むDNA試料につき、上記のとおりクラミジアDNAの検出を実施した。その結果、表8に示すように10コピーにおいてもS/N比で約30倍という強い発光が検出できた。また、0、10および100コピー相当のリン菌ゲノムを含むDNA試料につき、上記のとおりリン菌DNAの検出を実施した。その結果、表9に示すように10コピーにおいてもS/N比で約300倍という強い発光が検出できた。
クラミジアとリン菌の混合感染の疑いを持たれた検体12例から実施例1記載の操作に従ってクラミジアならびにリン菌DNAの同時増幅検出を行った。
プライマー及びプローブの調製
HCVゲノムの塩基配列に従って、配列表の配列番号30及び31に記載の塩基配列を有するHCV−F及びHCV−R1キメラオリゴヌクレオチドプライマー及び配列表の配列番号32及び33に記載の塩基配列を有する逆転写反応用オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。さらに、配列表の配列番号34及び35に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、上記オリゴヌクレオチドプローブの5'末端にTAMRA(N, N, N', N'-tetramethyl-6-carboxy-rhodamine、ABI社製)を自動DNA合成機によって作製し、蛍光標識プローブとした。
インフォームド コンセントの得られたHCV−RNA陽性血清をアンプリコアHCVモニターキット(ロッシュ社製)でコピー数を算出し、これをキットに付属の検体希釈液で、1×107コピーから1コピー/μlまで10倍希釈系列を作製し、HCV−RNAとした。
上記(1)で作製した逆転写反応用プライマーならびにFirst−strand cDNA Synthesis Kit(宝酒造社製)を用いて上記(2)で調製したHCV−RNAからcDNAを合成した。
上記cDNA溶液を用いてICAN反応を行った。1チューブあたりの反応液組成を表10に示す。
反応チューブ1本あたり、上記反応液47μlを加え、そこに(4)で作製したcDNA溶液3μlを添加し、56℃で30分間保持した。反応終了後、この反応液に上記(1)で調製した蛍光標識プローブを終濃度が300nMとなるように添加し、98℃で2分間処理後、氷冷却により25℃にし、保持した。該反応液を、蛍光検出器、フルオロスキャン(ラバオシステムズ社製)にて蛍光強度を測定した。さらに、対照として、市販のPCR法によるアンプリコアHCVキット(ロシュ社製)でも同一の検体を用いて測定した。その結果を図1に示す。図1は、各種HCVーRNA濃度を測定した場合の蛍光強度の変化及び従来法との測定範囲の比較を示すグラフであり、左縦軸はOD450値、右縦軸は蛍光強度(SN比)、横軸は、HCV−RNA量を示す。また、図1の黒四角は、本発明の方法による結果を示し、黒丸は、アンプリコアHCVキットによる結果を示す。
(1)患者血清からのHCV−RNAの調製
臨床検体からのHCVの検出について検討した。インフォームドコンセントの得られたHCV患者の血清28検体各100μlからアンプリコアHCVキット附属のHCV−RNA抽出試薬(ロシュ社製)を用いてRNAを調製した。
実施例1(3)及び(4)記載の方法と同じ方法でHCV−RNAを増幅し、本発明の検出方法に供した。本実施例においては、対照のHCV−RNAを含まない試料について行ったネガティブコントロール10本の蛍光強度の平均値+3SD(標準偏差値の3倍)をカットオフ値とし、このカットオフ値を超えた蛍光強度を示す検体を陽性とした。一方、同一の検体を市販のアンプリコアHCVキットにより測定し、キットの取扱説明書に従って陽性・陰性を判定した。本発明の検出方法と従来法のアンプリコアHCVキットの結果の比較を表11に示す。
SEQ ID NO:3: PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus
SEQ ID NO:7: PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus
SEQ ID NO:8: PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus
SEQ ID NO:11: Oligonucleotide probe to detect the DNA derived from Mycobacterium tuberculosis
SEQ ID NO:13: Chymeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium tuberculosis.“nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
SEQ ID NO:14: Chymeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium tuberculosis.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
SEQ ID NO:15: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium tuberculosis.“nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
SEQ ID NO:16: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium tuberculosis.“nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
SEQ ID NO:17: Oligonucleotide primer C4-MT2F-S100 to amplify the DNA fragment of metaroprotease gene from human
SEQ ID NO:18: Oligonucleotide primer C4-MT2R-A to amplify the DNA fragment of metaroprotease gene from human
SEQ ID NO:19: Oligonucleotide probe to detect the internal control DNA
SEQ ID NO:20: Oligonucleotide probe CT1234 to detect the Chramydia criptic plasmid
SEQ ID NO:21: Oligonucleotide probe CppB3 to detect Neisseria gonorrhoeae cppB gene
SEQ ID NO:23: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. “nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
SEQ ID NO:24: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. “nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
SEQ ID NO:25: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. “nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
SEQ ID NO:26: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Chramydia criptic plasmid. “nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
SEQ ID NO:28: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Neisseria gonorrhoeae cppB gene. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
SEQ ID NO:29: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of Neisseria gonorrhoeae cppB gene. “nucleotides 15 to 17 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
SEQ ID No:30: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV-F to amplify a portion of HCV. “nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
SEQ ID No:31: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as HCV-R3 to amplify a portion of HCV. “nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides”
SEQ ID No:32:Designed oligonucleotide primer to synthsize cDNA of HCV
SEQ ID No:33:Designed oligonucleotide primer to synthsize cDNA of HCV
SEQ ID No:34: Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of HCV
SEQ ID No:35: Designed oligonucleotide probe to detect a DNA fragment amplifying a portion of HCV
SEQ ID No:36: Oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium tuberculosis
SEQ ID No:37: Oligonucleotide primer to amplify the DNA fragment of IS6110 gene derived from Mycobacterium tuberculosis
SEQ ID No:41: Primer area to amplify a portion of HCV
SEQ ID No:42: Primer area to amplify a portion of HCV
SEQ ID No:43: Probe area to detect a DNA fragment amplifying a portion of HCV
Claims (21)
- 配列表の配列番号20記載の塩基配列で示される、クラミジアのクラミジア トラコマチス(Chlamydia trachomatis)を検出可能なプローブ。
- 配列表の配列番号21記載の塩基配列で示される、リン菌のナイセリア・ゴノルホエア(Neisseria gonorrhoeae)を検出可能なプローブ。
- 標識を付加されている請求項1又は2記載のプローブ。
- 蛍光物質、色素、酵素、ビオチン、金コロイド、および放射性同位体から選択される標識を付加されている請求項3記載のプローブ。
- 標的核酸とハイブリダイズした場合には蛍光強度が抑制されず、標的核酸とハイブリダイズしない場合は蛍光強度が抑制されるように蛍光標識された請求項4記載のプローブ。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のプローブを使用するハイブリダイゼーションにより、病原微生物の標的核酸を検出する工程を包含する病原微生物の検出方法。
- アルカリ領域で病原微生物の標的核酸とハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする請求項6記載の病原微生物の検出方法。
- 標的核酸の断片を増幅した後に、増幅物とプローブとの間でハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする請求項6又は7記載の病原微生物の検出方法。
- 配列表の配列番号23〜26記載の塩基配列でそれぞれ示されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーから選択されるプライマーを使用してクラミジア由来のpLGV440の断片を増幅し、クラミジア トラコマチスを検出する請求項8記載の病原微生物の検出方法。
- 配列表の配列番号28、29記載の塩基配列でそれぞれ示されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用してリン菌由来のcppB遺伝子の断片を増幅し、ナイセリア・ゴノルホエアを検出する請求項8記載の病原微生物の検出方法。
- 増幅が、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、病原微生物の標的核酸を含む可能性のある鋳型となる核酸を含有する試料、エンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド3リン酸(dNTP)を含む反応液を適切な温度で反応産物が生成するのに十分な時間保温することによって行われる、請求項8〜10のいずれか1項に記載の病原微生物の検出方法。
- 配列表の配列番号23〜26、28、29でそれぞれ表される、請求項8記載の病原微生物の検出方法のためのキメラオリゴヌクレオチドプライマー。
- 標識を付加されている請求項12記載のプライマー。
- 蛍光物質、色素、酵素、ビオチン、および金コロイドから選択される標識を付加されている請求項13記載のプライマー。
- 請求項7記載の病原微生物の検出方法に使用するための組成物であって、請求項1〜5のいずれか1項に記載のプローブを含有することを特徴とする病原微生物検出用組成物。
- 請求項8記載の病原微生物の検出方法に使用するための組成物であって、請求項12〜14のいずれか1項に記載のプライマーを含有することを特徴とする病原微生物検出用組成物。
- さらに鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseH、及びデオキシリボヌクレオチド3リン酸から選択される試薬を含有する請求項16記載の病原微生物検出用組成物。
- 請求項7記載の病原微生物の検出方法に使用するためのキットであって、請求項1〜5のいずれか1項に記載のプローブを含有することを特徴とする病原微生物検出用キット。
- 請求項8記載の病原微生物の検出方法に使用するためのキットであって、請求項12〜14のいずれか1項に記載のプライマーを含有することを特徴とする病原微生物検出用キット。
- さらに鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、RNaseH、及びデオキシリボヌクレオチド3リン酸から選択される試薬を含有する請求項19記載のキット。
- さらに、マイクロタイタープレート、ビーズ、マグネチックビーズ、メンブラン、およびガラスから選択される増幅産物を捕捉するための担体を含有する請求項19または20記載のキット。
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