JP2007297282A - Influence caused by midkine when endometriosis appear - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an agent, used for preventing or treating endometriosis, targeting midkine (MK) and to provide a method for examining endometriosis and to provide an examination medicine. <P>SOLUTION: By studying the mitogen activity of MK on cultured endometrial stromal cells, it is clarified that MK stimulates the proliferation of ESC. By evaluating the MK concentration in the peritoneal fluid (PF), it is clarified that the MK level is elevated in a female with the progress of endometriosis. It is further found out that the MK concentration in the PF of a female under the therapy with GnRH agonist is significantly lower than the concentration in another group. It is indicated that MK mRNA is expressed in cells originating in peritoneal bone marrow, the peritoneal membrane and an intrauterine tissue. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、ミッドカインを抑制する化合物を有効成分として含有する子宮内膜症を予防または治療するための薬剤並びにミッドカインの発現を指標とする子宮内膜症の検査方法および検査薬に関する。   TECHNICAL FIELD The present invention relates to a drug for preventing or treating endometriosis containing a compound that suppresses midkine as an active ingredient, and a test method and test drug for endometriosis using midkine expression as an index.

子宮内膜症は、生殖可能年齢の女性の健康を悪化させる不可解な疾患である（Momoedaら、2002；Osugaら、2002）。この疾患の原因は、逆行性月経における子宮内膜組織片が腹腔において定着、生存および増殖することにあると広く考えられている。しかし、この仮説は、女性のほとんどに逆行性月経が認められるにも関わらず、なぜごく一部の女性のみが子宮内膜症に罹患するのかとの疑問に答えられない（Halmeら、1984）。子宮内膜症を患う女性で認められる様々な異常の中で、疾患の発症に腹腔環境の変化が極めて重要であることを、多くの証拠が示唆している（Haradaら、2001；Lebovicら、2001）。また、TNF、HGF、SCF、IFN-γのような成長因子もしくはサイトカインの濃度が、子宮内膜症の女性の腹腔液（以下PFと称す）では、健常な女性と比較して、変化することが示されている（Kogaら、2000；Osugaら、1999；Osugaら、2000；Yoshinoら、2003）。これらの物質は、細胞の生存、細胞増殖、および血管新生において様々な役割を有し、子宮内膜症の進行を刺激することが示唆されている。   Endometriosis is a mysterious disease that worsens the health of women of reproductive age (Momoeda et al., 2002; Osuga et al., 2002). It is widely believed that the cause of this disease is that endometrial tissue fragments in retrograde menstruation settle, survive and proliferate in the abdominal cavity. However, this hypothesis does not answer the question of why only a few women suffer from endometriosis despite the fact that most women have retrograde menstruation (Halme et al., 1984). . Among the various abnormalities observed in women with endometriosis, much evidence suggests that changes in the abdominal environment are crucial for the onset of the disease (Harada et al., 2001; Lebovic et al., 2001). Also, the concentration of growth factors or cytokines such as TNF, HGF, SCF, and IFN-γ changes in the peritoneal fluid of endometriosis women (hereinafter referred to as PF) compared to healthy women (Koga et al., 2000; Osuga et al., 1999; Osuga et al., 2000; Yoshino et al., 2003). These substances have been suggested to have various roles in cell survival, cell proliferation, and angiogenesis and to stimulate the progression of endometriosis.

ミッドカイン（以下MKと称す）は、細胞増殖、細胞遊走、血管新生、炎症の誘導および線維素溶解のような多面的活性を有する分子である（Muramatsu、2002；Horibaら、2000；Takadaら、1997）。細胞増殖の促進、血管新生および炎症などの機能は全て、腫瘍および子宮内膜症のような腫瘍様病変の発症において重要であることが示唆されている。実際に、多くの悪性腫瘍において高レベルのMKが報告されており、癌の発症に関係することが示唆されている（Garver, Jr.ら1994；Tsutsuiら、1993；Nakagawaら、1995；O'Brienら、1996；Koideら、1999；Aridomeら、1995；Katoら、2000；Konishiら、1999）。MKはまた、子宮内膜症においても検出され、そのレベルは健常な女性と比較して子宮内膜症の女性における正所子宮内膜細胞では高い（非特許文献１参照）。
一方、正所子宮内膜と比較して、異所子宮内膜が顕著に低レベルのMKを発現するということが知られている（非特許文献１参照）。
Chung HW et al, Mol Hum Reprod 8, 350-355(2002) Midkine (hereinafter referred to as MK) is a molecule with pleiotropic activities such as cell proliferation, cell migration, angiogenesis, induction of inflammation and fibrinolysis (Muramatsu, 2002; Horiba et al., 2000; Takada et al., 1997). Functions such as promoting cell proliferation, angiogenesis and inflammation have all been suggested to be important in the development of tumor-like lesions such as tumors and endometriosis. Indeed, high levels of MK have been reported in many malignancies and have been suggested to be involved in the development of cancer (Garver, Jr. et al. 1994; Tsutsui et al., 1993; Nakagawa et al., 1995; O ′ Brien et al., 1996; Koide et al., 1999; Aridome et al., 1995; Kato et al., 2000; Konishi et al., 1999). MK is also detected in endometriosis, and its level is higher in orthotopic endometrial cells in women with endometriosis compared to healthy women (see Non-Patent Document 1).
On the other hand, it is known that the ectopic endometrium expresses significantly lower levels of MK compared to the orthotopic endometrium (see Non-Patent Document 1).
Chung HW et al, Mol Hum Reprod 8, 350-355 (2002)

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、MKが子宮内膜症の発症に関与することを明らかにし、MKをターゲットとした子宮内膜症を予防または治療するための薬剤、並びに子宮内膜症の検査方法および検査薬を提供することにある。   The present invention has been made in view of such circumstances, and its purpose is to clarify that MK is involved in the development of endometriosis, and to prevent or treat endometriosis targeting MK. It is to provide a drug for the endometriosis, and a test method and test drug for endometriosis.

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。本発明者らは、まず、子宮内膜細胞が、子宮内膜細胞由来のMKのみならず、他の起源からのMKによって刺激されると考え、培養された子宮内膜間質細胞（以下ESCと称す）に及ぼすMKのマイトゲン活性を調べることにより、MKがESCの増殖を刺激することを明らかにした。次に、PFにおけるMK濃度を評価することにより、進行子宮内膜症の女性のPFにおいてMKレベルが増加していることを明らかにした。さらに、GnRHアゴニストによる治療を受けている女性のPFにおけるMK濃度は、他の群の濃度より有意に低いことが分かった。また、MK mRNAが、腹腔骨髄由来細胞（以下PBMCと称す）、腹膜および子宮内膜組織において発現していることが判明した。
以上の知見は、MKが子宮内膜症の発症や進行に関与することを示唆している。従って、MKの阻害により、子宮内膜症を予防または治療でき、またMKの発現を指標として子宮内膜症を検査できると考えられる。 The inventors of the present invention have intensively studied to solve the above problems. The inventors first considered that endometrial cells are stimulated not only by endometrial cell-derived MKs but also by MKs from other sources, and cultured endometrial stromal cells (hereinafter ESCs). It was clarified that MK stimulates ESC proliferation by examining the mitogenic activity of MK. Next, we evaluated the MK level in PF of women with advanced endometriosis by evaluating the MK concentration in PF. Furthermore, MK concentrations in PF in women receiving treatment with GnRH agonists were found to be significantly lower than those in other groups. It was also found that MK mRNA is expressed in peritoneal bone marrow-derived cells (hereinafter referred to as PBMC), peritoneum and endometrial tissue.
These findings suggest that MK is involved in the development and progression of endometriosis. Therefore, it is considered that endometriosis can be prevented or treated by inhibiting MK, and endometriosis can be examined using MK expression as an index.

すなわち本発明は、以下の〔１〕〜〔４〕を含む発明を提供するものである。
〔１〕ミッドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分とする、子宮内膜症を予防または治療するための薬剤。
〔２〕被検者より採取した試料中のミッドカイン遺伝子の発現を測定する工程を含む、子宮内膜症の検査方法。
〔３〕抗ミッドカイン抗体を含む子宮内膜症検査用試薬。
〔４〕ミッドカイン遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、子宮内膜症検査用試薬。 That is, the present invention provides an invention including the following [1] to [4].
[1] A drug for preventing or treating endometriosis comprising a compound that suppresses the expression of the midkine gene as an active ingredient.
[2] A method for examining endometriosis, comprising a step of measuring the expression of a midkine gene in a sample collected from a subject.
[3] A reagent for endometriosis testing comprising an anti-midkine antibody.
[4] A reagent for endometriosis testing, comprising an oligonucleotide that hybridizes to the midkine gene region and has a chain length of at least 15 nucleotides.

本発明では、子宮内膜細胞が、子宮内膜細胞由来のMKのみならず、他の起源からのMKによって刺激されることを初めて明らかにした。さらに、PF中のMKレベルは、軽度の子宮内膜症を有するまたは子宮内膜症を有しない女性と比較して、進行子宮内膜症の女性では増加することを証明し、PF中のMKが子宮内膜症の発症や進行に関与することを示した。
以上の知見に基づき、MKをターゲットとした子宮内膜症を予防または治療するための薬剤、並びにMKの発現を指標とした子宮内膜症の検査方法および検査薬を提供することができる。 In the present invention, it was revealed for the first time that endometrial cells are stimulated not only by MKs derived from endometrial cells but also by MKs from other sources. In addition, MK levels in PF have been shown to increase in women with advanced endometriosis compared to women with mild endometriosis or no endometriosis, and MK levels in PF Have been shown to be involved in the development and progression of endometriosis.
Based on the above knowledge, it is possible to provide a drug for preventing or treating endometriosis targeting MK, and an endometriosis test method and test drug using MK expression as an index.

本発明は、MK遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分とする、子宮内膜症を予防または治療するための薬剤を提供するものである。
子宮内膜症関連因子としてのMK遺伝子は、好適には、配列番号：１に示すヒトMK遺伝子を挙げることができるが、これに限定されるものではなく、MK遺伝子と同等に子宮内膜症を発生・誘導し得るタンパク質をコードした類似のDNAも「子宮内膜症関連因子」としてのMK遺伝子に含まれる。配列番号：１に記載のDNAと機能的に同等な配列は、同種由来の変異体や異種由来のMK遺伝子ホモログなどが含まれる。例えば、既に報告されているマウスMK遺伝子（Kadomatu, K., et al., Biochem. Biophy. Res. Commun., 151, 1312(1988)）は配列番号：１に記載のDNAと機能的に同等な配列の一例であり、本発明の子宮内膜症関連因子としてのMK遺伝子に含まれる。 The present invention provides a drug for preventing or treating endometriosis comprising a compound that suppresses the expression of the MK gene as an active ingredient.
Suitable examples of the MK gene as an endometriosis-related factor include, but are not limited to, the human MK gene shown in SEQ ID NO: 1, and endometriosis is equivalent to the MK gene. Similar DNA encoding a protein capable of generating and inducing erythrocytes is also included in the MK gene as “endometriosis-related factor”. The sequence functionally equivalent to the DNA described in SEQ ID NO: 1 includes mutants derived from the same species, MK gene homologues derived from different species, and the like. For example, the previously reported mouse MK gene (Kadomatu, K., et al., Biochem. Biophy. Res. Commun., 151, 1312 (1988)) is functionally equivalent to the DNA described in SEQ ID NO: 1. And is included in the MK gene as an endometriosis-related factor of the present invention.

このような配列番号：１に記載のDNAと機能的に同等の配列は、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ子宮内膜症誘導活性を有するポリペプチドをコードしたDNAを挙げることができる。このようなDNAには、配列番号：１に記載のDNAの縮重変異体も含まれる。   Such a sequence functionally equivalent to the DNA described in SEQ ID NO: 1, for example, hybridizes with a DNA containing the base sequence described in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and endometriosis Mention may be made of DNA encoding a polypeptide having inductive activity. Such DNA also includes degenerate variants of the DNA set forth in SEQ ID NO: 1.

上記配列番号：１に記載のヒト由来のMK遺伝子の調製は、ヒトcDNAライブラリーより配列番号：１に記載された配列またはその一部と相同性の高い配列を保持するクローンを選択し、選択されたクローンより回収することにより実施することができる。MK遺伝子を得るためのヒトcDNAライブラリーは、たとえば、ヒトの腎臓、ヒトの胎児の腎臓、脳、結合組織又はこれらの培養細胞由来トータルRNAに基づき構築されたものを用いることができる。また、天然から取得する以外に、配列番号：１に記載の配列に基づいてDNA合成器により合成してもよい。   The human-derived MK gene described in SEQ ID NO: 1 is prepared by selecting a clone having a sequence highly homologous to the sequence described in SEQ ID NO: 1 or a part thereof from a human cDNA library and selecting it. It can carry out by collect | recovering from the cloned clone. As the human cDNA library for obtaining the MK gene, for example, those constructed based on human kidney, human fetal kidney, brain, connective tissue, or total RNA derived from these cultured cells can be used. Moreover, you may synthesize | combine with a DNA synthesizer based on the sequence | arrangement of sequence number 1 besides acquiring from nature.

また、配列番号：１に記載のDNAと機能的に同等の配列の調製は、ヒト以外の哺乳動物細胞（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ）由来のｃDNAライブラリーより配列番号：１記載の配列またはその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするクローンを選択することにより実施することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、ハイブリダイゼーションの条件として、好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1％SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAが効率的に得られると期待される。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、配列番号：１に記載のDNAと機能的に同等の配列の調製は、上述のように天然に存在するものから選抜する方法の他に、配列番号：１に記載の配列からなるDNAを適宜、遺伝子工学的に改変して調製することもできる。 In addition, a sequence functionally equivalent to the DNA described in SEQ ID NO: 1 is prepared from a cDNA library derived from a mammalian cell other than human (eg, human, monkey, mouse, rat, pig, bovine). 1 can be carried out by selecting clones that hybridize under stringent conditions with the described sequence or a part thereof. Hybridization conditions can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, the conditions for hybridization preferably include highly stringent conditions. High stringent conditions are, for example, conditions of 65 ° C., 0.1 × SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, it is expected that DNA having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize the same stringency by appropriately selecting these factors. .
In addition, the preparation of a sequence functionally equivalent to the DNA described in SEQ ID NO: 1 is carried out by using a DNA comprising the sequence described in SEQ ID NO: 1 in addition to the method of selecting from naturally occurring ones as described above. As appropriate, it can also be prepared by genetic engineering modification.

子宮内膜症関連因子としてのMKポリペプチドは、好ましくは、配列番号：１に記載のDNAがコードするMKポリペプチドを挙げることができるが、これに限定されるものではなく、配列番号：１に記載のDNAがコードするMKポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、子宮内膜症誘導活性を有するポリペプチドを含めることができる。   The MK polypeptide as an endometriosis-related factor preferably includes, but is not limited to, the MK polypeptide encoded by the DNA described in SEQ ID NO: 1. A polypeptide having an endometriosis-inducing activity, comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of the MK polypeptide encoded by the DNA described in 1. .

上記MKと機能的に同等なポリペプチドは、通常、MKとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも50％以上の同一性、好ましくは75％以上の同一性、さらに好ましくは85％以上の同一性、さらに好ましくは95％以上の同一性を指す。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)などによって決定することができる。   A polypeptide functionally equivalent to the above MK usually has high homology in amino acid sequence with MK. High homology generally refers to at least 50% identity, preferably 75% identity, more preferably 85% identity, more preferably 95% identity at the amino acid level. . The identity of amino acid sequences and base sequences can be determined by BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993).

MKのアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドもまた本発明に含まれる。変異するアミノ酸数は、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、より好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であり、さらに好ましくは2アミノ酸以内である。これら変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。   A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated in the amino acid sequence of MK and functionally equivalent to the polypeptide is also included in the present invention. The number of amino acids to be mutated is usually within 30 amino acids, preferably within 15 amino acids, more preferably within 5 amino acids (for example, within 3 amino acids), and even more preferably within 2 amino acids. These mutated amino acid residues are preferably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain. For example, amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G , H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y), sulfur atom-containing side Amino acids with chains (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with base-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side chains (H, F, Y, W) can be mentioned (all parentheses represent single letter symbols of amino acids).

本発明におけるMK遺伝子の発現を抑制する化合物の一つとしては、MK遺伝子の発現を抑制し得るヌクレオチドを挙げることができる。
MK遺伝子の発現を抑制し得るヌクレオチドの第一の態様としては、MK遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１の塩基配列中の連続する少なくとも15個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも15個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 One example of a compound that suppresses the expression of the MK gene in the present invention is a nucleotide that can suppress the expression of the MK gene.
The first embodiment of the nucleotide capable of suppressing the expression of the MK gene includes an MK gene antisense oligonucleotide.
Examples of the antisense oligonucleotide include an antisense oligonucleotide that hybridizes to any position in the base sequence of SEQ ID NO: 1. This antisense oligonucleotide is preferably an antisense oligonucleotide against at least 15 or more consecutive nucleotides in the base sequence of SEQ ID NO: 1. More preferably, it is an antisense oligonucleotide in which at least 15 or more consecutive nucleotides contain a translation initiation codon.

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的となるMK DNA又はmRNAの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、オリゴヌクレオチドと配列番号：１に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、1 又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。   Antisense oligonucleotides are specific not only for nucleotides corresponding to nucleotides constituting a predetermined region of target MK DNA or mRNA, but also for the oligonucleotide and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. As long as they can be hybridized with each other, one having a mismatch of one or a plurality of nucleotides is also included.

MK遺伝子発現を抑制し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドの分子設計については、例えば、MK mRNAの一次配列を基に、最小のエネルギーを持つ二次構造をコンピュータープログラムで予測する。この予測される二次構造に基づいて、塩基対を作らないループ部分をアンチセンスオリゴヌクレオチド配列候補として選択することができる。一例を示せば、ヒトMKのmRNA（GenBank Accession No. M69148：Tsutsui J. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:792-797, 1991）の二次構造予測をコンピュータ解析により行うと、（ヒトMK mRNA配列の塩基番号15番目から32番目に基づく）（配列番号：２）、および5'末端近傍でループを作らない配列に対応するアンチセンスDNA、（ヒトMK mRNA配列の塩基番号1番目から18番目に基づく）（配列番号：３）を設計することができる。
配列番号：２ 5’−AGGGTGAGGAGGAGGAAG−3’
配列番号：３ 5’−GAAGCCTCGGTGCTGCAT−3’ Regarding the molecular design of an antisense oligonucleotide capable of suppressing MK gene expression, for example, a secondary structure having the minimum energy is predicted by a computer program based on the primary sequence of MK mRNA. Based on this predicted secondary structure, a loop portion that does not form a base pair can be selected as an antisense oligonucleotide sequence candidate. For example, when secondary structure prediction of human MK mRNA (GenBank Accession No. M69148: Tsutsui J. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 176: 792-797, 1991) is performed by computer analysis, , (Based on base numbers 15 to 32 of human MK mRNA sequence) (SEQ ID NO: 2), and antisense DNA corresponding to a sequence that does not form a loop near the 5 'end (base number of human MK mRNA sequence) (Based on 1st to 18th) (SEQ ID NO: 3) can be designed.
SEQ ID NO: 2 5′-AGGGTGAGGAGGAGGAAG-3 ′
SEQ ID NO: 3 5′-GAAGCCTCGGTGCTGCAT-3 ′

しかし、本発明のオリゴヌクレオチドは上記具体的に示された配列に限定されるものではなく、配列番号：１の配列に基づいて、適宜設計することができる。そして、設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列がMKの発現抑制活性を有するか否かの判定は、次の通り行うことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を持つ物質を、MKを合成分泌している細胞に投与し、培養液中に分泌されるMKを免疫生化学的に定量する。MKの免疫生化学的定量法としては酵素免疫法（Muramatsu, H. et al.：J. Biochem., 119：1171-1175, 1996）あるいはSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後のウェスタンブロッティング（Muramatsu, H. et al.：Dev. Biol., 159；392-402， 1993）そしてデンシトメーターによる定量がある。この定量によりMK遺伝子産物の産生を低下させ得るアンチセンスオリゴヌクレオチドはMKの遺伝子発現を抑制し得るものとして選択することができる。   However, the oligonucleotide of the present invention is not limited to the sequence specifically shown above, and can be appropriately designed based on the sequence of SEQ ID NO: 1. And it can be determined as follows whether the designed antisense oligonucleotide sequence has MK expression suppression activity. A substance having an antisense oligonucleotide sequence is administered to cells secreting and secreting MK, and MK secreted into the culture medium is quantified immunobiochemically. As immunobiochemical quantification of MK, enzyme immunoassay (Muramatsu, H. et al .: J. Biochem., 119: 1171-1175, 1996) or Western blotting after SDS polyacrylamide gel electrophoresis (Muramatsu, H et al .: Dev. Biol., 159; 392-402, 1993) and quantitation by densitometers. An antisense oligonucleotide that can reduce the production of the MK gene product by this quantification can be selected as one that can suppress the gene expression of MK.

また上記「オリゴヌクレオチド」という用語は、DNAおよびRNAのデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド構造のような天然に存在するオリゴマーの核酸部分、ならびに天然に存在する核酸に結合する能力のある人工アナログの両方を包含する。人工アナログとしては、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体、モルホリノ修飾体、逆向きチミジン修飾体等が挙げられる。したがって、上記設計されたオリゴヌクレオチドは必要に応じて、これらいずれかにより修飾されてもよい。こうした修飾体は既に開発されており、既に開発されている修飾体を本発明の子宮内膜症治療薬に応用してもよい。例えば、モルホリノ修飾体は特開2003-210170に、ホスホロチオエート修飾体は特開2002-142778に、逆向きチミジン修飾体は特開2003-210171に開示されている。   The term "oligonucleotide" also encompasses both naturally occurring oligomeric nucleic acid moieties, such as deoxyribonucleotide and ribonucleotide structures of DNA and RNA, and artificial analogs capable of binding to naturally occurring nucleic acids. To do. Examples of the artificial analog include lower alkyl phosphonate modified products such as methyl phosphonate type or ethyl phosphonate type, phosphorothioate modified products or phosphoramidate modified products, morpholino modified products, reverse-oriented thymidine modified products, and the like. Therefore, the designed oligonucleotide may be modified by any of these as required. Such modified substances have already been developed, and the already developed modified substances may be applied to the therapeutic agent for endometriosis of the present invention. For example, morpholino modified products are disclosed in JP2003-210170, phosphorothioate modified products are disclosed in JP2002-142778, and reverse thymidine modified products are disclosed in JP2003-210171.

これら修飾体のうちホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドは、血清でまたは細胞内部でヌクレアーゼの作用を特に受けやすい。そのため本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの好適な態様としては、ヌクレアーゼ抵抗性であるホスホロチオエート結合あるいはメチロホスホネート結合したアナログなどである（Stein et al., Cancer Research 48: 2659, 1998）。
なお、このようなオリゴヌクレオチドの人工アナログは、当業者らに周知の方法、例えば、市販の機械およびPerkin-Elmer/Applieds Biosystem（Foster City, CA）より入手できる試薬を用いる方法によって調製することができる。 Among these modifications, phosphodiester-linked oligonucleotides are particularly susceptible to nuclease action in serum or inside cells. Therefore, a preferred embodiment of the antisense oligonucleotide of the present invention is a phosphorothioate-linked or methylophosphonate-linked analog that is nuclease resistant (Stein et al., Cancer Research 48: 2659, 1998).
Such an oligonucleotide artificial analog can be prepared by a method well known to those skilled in the art, for example, a method using a commercially available machine and a reagent available from Perkin-Elmer / Applieds Biosystem (Foster City, CA). it can.

本発明の他の態様において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドそのものの形態でなくともよく、例えば、発現ベクターなどに搭載させた発現構築物として標的細胞を感染させた後にアンチセンスRNA分子として生成させてもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ-L-リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、0.1〜100mg/kg、好ましくは0.1〜50mg/kgの範囲で投与することができる。 In another embodiment of the present invention, the antisense oligonucleotide does not have to be in the form of the oligonucleotide itself, for example, it is generated as an antisense RNA molecule after infecting a target cell as an expression construct mounted on an expression vector or the like. You may let them.
The antisense oligonucleotide of the present invention is applied directly to the affected area of the patient, or applied to the patient so that it can reach the affected area as a result, for example, by intravascular administration. Furthermore, an antisense encapsulating material that enhances durability and membrane permeability can also be used. For example, liposome, poly-L-lysine, lipid, cholesterol, lipofectin or derivatives thereof can be mentioned.
The dosage of the antisense oligonucleotide of the present invention can be appropriately adjusted according to the patient's condition, and a preferred amount can be used. For example, it can be administered in the range of 0.1 to 100 mg / kg, preferably 0.1 to 50 mg / kg.

MK遺伝子の発現を抑制するヌクレオチドの第二の態様としては、MK遺伝子を標的としたdsRNAが挙げられる。
「MK遺伝子を標的としたdsRNA」とは、MK遺伝子の発現をRNA干渉（RNAi）により抑制し得るdsRNAを意味する。MK遺伝子発現をRNAiで抑制するためのdsRNAは、一方の鎖は少なくともMK mRNAと相補する配列を備える。発現抑制し得る部位であれば、MK mRNAのいずれの領域において相補関係を有してもよい。また、この相補性は、RNAiを誘導しMK遺伝子発現を抑制し得る限り、完全である必要はなく、標的配列との間で数塩基程度のミスマッチを有しても良い。 The second embodiment of the nucleotide that suppresses the expression of the MK gene includes dsRNA targeting the MK gene.
The “dsK targeting the MK gene” means a dsRNA that can suppress the expression of the MK gene by RNA interference (RNAi). One strand of dsRNA for suppressing MK gene expression with RNAi has a sequence complementary to at least MK mRNA. As long as it can suppress expression, it may have a complementary relationship in any region of MK mRNA. This complementarity need not be perfect as long as it can induce RNAi and suppress MK gene expression, and may have a mismatch of about several bases with the target sequence.

dsRNAは、人工的に合成されたdsRNAそのもの、あるいは発現ベクターにより哺乳動物細胞内で発現させたdsRNAの双方の形態を採用することができる。
dsRNAを人工的に合成し、哺乳動物細胞に導入する場合、発現ベクターからdsRNAを発現させる場合のいずれの場合にも、長鎖dsRNAによる哺乳動物細胞への細胞毒性を考慮する必要がある。そのため、人工的に合成したdsRNA（以下「合成dsRNA」という）、発現により生成されるdsRNAのいずれも、鎖長は例えば19〜30塩基対とすることがよいが、これよりも長いdsRNAであっても細胞毒性を与えないものであれば用いることができる。
上記MK mRNAを標的としたdsRNAは、生体内でMK mRNAと対合し、生体内の酵素によりMK mRNAの切断を誘導する。そのため、MKのmRNAからタンパク質への翻訳を阻害し、結果としてMKの発現を抑制し、子宮内膜症発症を抑制することが可能となる。 As the dsRNA, both forms of artificially synthesized dsRNA itself or dsRNA expressed in mammalian cells by an expression vector can be adopted.
When dsRNA is artificially synthesized and introduced into mammalian cells, it is necessary to consider the cytotoxicity of long-chain dsRNA to mammalian cells in any case where dsRNA is expressed from an expression vector. Therefore, both the artificially synthesized dsRNA (hereinafter referred to as “synthetic dsRNA”) and the dsRNA generated by expression may have a chain length of, for example, 19 to 30 base pairs. However, any substance that does not give cytotoxicity can be used.
The above dsRNA targeting MK mRNA is paired with MK mRNA in vivo and induces cleavage of MK mRNA by an enzyme in the living body. Therefore, translation of MK mRNA into protein can be inhibited, and as a result, expression of MK can be suppressed and the development of endometriosis can be suppressed.

本発明の第二の側面として、MKタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分とする、子宮内膜症を予防または治療するための薬剤が提供される。
MKの機能を抑制する化合物としては、MKに結合する抗体が挙げられる。
MKの作用を抑え得る既に開発されている抗MK抗体（Muramatsu H. et al., Dev. Biol. 159: 392-402, 1993）を本発明の子宮内膜症治療・予防用に応用してもよい。また、ヒトMKに対するモノクローナル抗体も開発されており（特開2002-085058）、これを応用してもよい。しかし、本発明の抗体はこれら既に報告されている抗体に限定されるものではなく、後述の検査方法において説明する抗MK抗体の作製方法により作製された抗MKポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いることもできる。 As a second aspect of the present invention, there is provided a drug for preventing or treating endometriosis comprising a compound that suppresses the function of MK protein as an active ingredient.
The compound that suppresses the function of MK includes an antibody that binds to MK.
Applying an already developed anti-MK antibody (Muramatsu H. et al., Dev. Biol. 159: 392-402, 1993) capable of suppressing the action of MK to the treatment and prevention of endometriosis of the present invention Also good. A monoclonal antibody against human MK has also been developed (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-085058), and this may be applied. However, the antibodies of the present invention are not limited to these already reported antibodies, and anti-MK polyclonal antibodies or monoclonal antibodies prepared by the anti-MK antibody preparation method described in the later-described test method may be used. it can.

また、治療剤に使用するMK抗体は組み換え型抗体や改変抗体を用いることも有効である。組み換え型抗体としては、例えば、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んでこれを宿主に導入し、遺伝子組み換え技術を用いて産生させた組み換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. & Larrick J. W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990）。改変抗体としては、例えばキメラ抗体、ヒト型化抗体が使用できる。キメラ抗体は、ヒト抗体以外の抗体V領域をコードするDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し、産生させることにより得ることができる（EP 125023, PCT WO96/02576）。
本発明で使用される抗体は、MKに結合しMKの活性を阻害するかぎり、抗体の断片や修飾物であってもよい。例えば、抗体の断片として、Fab、F(ab')2、FvまたはH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェイン Fv(scFv)が挙げられる。 It is also effective to use a recombinant antibody or a modified antibody as the MK antibody used as a therapeutic agent. As the recombinant antibody, for example, as a monoclonal antibody, a recombinant antibody produced by cloning a antibody gene from a hybridoma, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and using a gene recombination technique can be used. (For example, Borrebaeck CAK & Larrick JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). As the modified antibody, for example, a chimeric antibody or a humanized antibody can be used. A chimeric antibody can be obtained by linking a DNA encoding an antibody V region other than a human antibody and a DNA encoding a human antibody C region, incorporating this into an expression vector, introducing it into a host, and producing it ( EP 125023, PCT WO96 / 02576).
The antibody used in the present invention may be an antibody fragment or modified product as long as it binds to MK and inhibits the activity of MK. For example, antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2 , Fv, or single chain Fv (scFv) in which the H chain and the L chain Fv are linked by an appropriate linker.

本発明の第三の側面として、被検者より採取した試料中のMK遺伝子の発現を測定する工程を含む子宮内膜症の検査方法が提供される。
MKは後述の実施例でも説明するように、子宮内膜症の発生に関与すると考えられる。従って、患者における子宮内膜症の発生原因を調査し、患者に対して適切な処理を行うためには、子宮内膜症の検査としてMK遺伝子の発現を測定することが有用となる。
被検者より採取される試料としては、例えば、PF、PBMC、腹膜組織または子宮内膜組織などを用いることができる。 As a third aspect of the present invention, there is provided a method for examining endometriosis comprising the step of measuring the expression of MK gene in a sample collected from a subject.
MK is considered to be involved in the development of endometriosis, as will be described in the examples below. Therefore, in order to investigate the cause of endometriosis in a patient and perform appropriate treatment on the patient, it is useful to measure the expression of the MK gene as a test for endometriosis.
As a sample collected from the subject, for example, PF, PBMC, peritoneal tissue or endometrial tissue can be used.

MK遺伝子発現の測定における第一の態様として、翻訳産物であるMKタンパク質を測定する。先ず、上述した被検者の試料よりタンパク質試料を調製する。次いで、該タンパク質試料からMKタンパク質量を測定する。測定されたタンパク質量を健常者などのMK発現量に基づいた対照値などと比較する。この比較の結果、被検者のMKタンパク質が対照に比べて有意に上昇している場合には、被験者が子宮内膜症を発症する可能性がある、または、すでに発症していると判定される。
上記MKタンパク質の測定は、SDSポリアクリルアミド電気泳動法、並びにMKタンパク質に対する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法(ELISA)、および免疫蛍光法を例示することができる。 As a first embodiment in the measurement of MK gene expression, the translation product MK protein is measured. First, a protein sample is prepared from the above-described subject sample. Next, the amount of MK protein is measured from the protein sample. The measured amount of protein is compared with a control value based on the expression level of MK such as that of a healthy person. As a result of this comparison, if the subject's MK protein is significantly elevated compared to the control, it is determined that the subject has or has already developed endometriosis. The
The measurement of MK protein is exemplified by SDS polyacrylamide electrophoresis and Western blotting, dot blotting, immunoprecipitation, enzyme-linked immunoassay (ELISA), and immunofluorescence using antibodies against MK protein. can do.

また、MK遺伝子の発現を測定するための別の方法としては、転写産物であるMK mRNAを測定する。先ず、上記被検者試料からトータルRNA試料を調製する。トータルRNAの調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。例えば、トータルRNA調製用のキット"Isogen"（ニッポンジーン社）を用いて実施することができる。次いで、該トータルRNA試料に含まれるMK mRNA量を測定する。測定されたRNAの量を対照と比較する。   As another method for measuring the expression of the MK gene, MK mRNA that is a transcription product is measured. First, a total RNA sample is prepared from the subject sample. Total RNA can be prepared by methods well known to those skilled in the art. For example, it can be carried out using a kit “Isogen” (Nippon Gene) for total RNA preparation. Next, the amount of MK mRNA contained in the total RNA sample is measured. The amount of RNA measured is compared to the control.

別の態様としては、被検者試料からcDNA試料を調製する。cDNA試料の調製は、上述したトータルRNAを鋳型として、逆転写酵素を用いてcDNAの合成を行うことで実施し得る。次いで、該cDNA試料に含まれるMK cDNA量を測定する。測定されたcDNAの量を対照と比較する。
これらmRNAやcDNAを基に遺伝子発現を測定する方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を挙げることができる。
mRNAまたはcDNAの比較の結果、被検者のMKタンパクmRNAまたはcDNAのが対照に比べて有意に上昇している場合には、被験者が子宮内膜症を発症する可能性がある、または、すでに発症していると判定される。 In another embodiment, a cDNA sample is prepared from a subject sample. A cDNA sample can be prepared by synthesizing cDNA using reverse transcriptase using the above-mentioned total RNA as a template. Next, the amount of MK cDNA contained in the cDNA sample is measured. The amount of cDNA measured is compared to a control.
Examples of methods for measuring gene expression based on these mRNAs and cDNAs include methods well known to those skilled in the art, such as Northern blotting, RT-PCR, and DNA array.
If the mRNA or cDNA comparison shows that the subject's MK protein mRNA or cDNA is significantly elevated compared to the control, the subject may develop endometriosis, or already It is determined that the disease has developed.

本発明の第四の側面として、子宮内膜症の検査方法に用いるための検査用試薬が提供される。このような検査用試薬としては、上記検査方法に使用し得るMK遺伝子の一部配列を含むオリゴヌクレオチドを主成分とする検査薬（オリゴヌクレオチドプローブが固定された基板を含む）や、抗MK抗体を含む検査薬が挙げられる。これら抗体やオリゴヌクレオチドは、検査方法に応じて、標識が付加されていてもよい。   As a fourth aspect of the present invention, a test reagent for use in an endometriosis test method is provided. Examples of such a test reagent include a test agent (including a substrate on which an oligonucleotide probe is immobilized) containing an oligonucleotide containing a partial sequence of the MK gene that can be used in the above test method, and an anti-MK antibody. Test drugs containing These antibodies and oligonucleotides may be labeled according to the test method.

子宮内膜症の検査方法に用いるための検査用試薬における第一の態様として、抗MK抗体を含む子宮内膜症検査用試薬が挙げられる。上記検査薬としての抗MK抗体は、例えば、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、MKを検出し得る抗体であればよい。例えば、ポリクローナル抗体であれば、既に本願発明者らにより開発されている抗体を用いてもよい（Muramatsu H. et al., Dev. Biol. 159: 392-402, 1993）。モノクローナル抗体もまた既に開発されており（特開2002-085058）、これを好適に利用することができる。   A first embodiment of the test reagent for use in the endometriosis test method includes an endometriosis test reagent containing an anti-MK antibody. The anti-MK antibody as the test agent may be, for example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, as long as it is an antibody that can detect MK. For example, in the case of a polyclonal antibody, an antibody already developed by the present inventors may be used (Muramatsu H. et al., Dev. Biol. 159: 392-402, 1993). Monoclonal antibodies have also been developed (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-085058), and can be suitably used.

MKに対する特異抗体の作製は、公知の方法に準じて実施することができる。モノクローナル抗体は、例えば、配列番号：１に記載のDNAがコードするヒトMKポリペプチド全体を感作抗原として、または抗原性を保持し得る長さを有する一部配列を感作抗原として用いて作製してもよい。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には、ケーラーとミルスタインの方法（Kohler G. & C. Milstein, Nature 256: 495-497, 1975）に準じて、以下のようにして作製できる。すなわち、上述したMKタンパク質またはその一部を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般には、齧歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。 Preparation of a specific antibody against MK can be performed according to a known method. A monoclonal antibody is prepared using, for example, the entire human MK polypeptide encoded by the DNA represented by SEQ ID NO: 1 as a sensitizing antigen or a partial sequence having a length capable of retaining antigenicity as a sensitizing antigen. May be. A hybridoma producing a monoclonal antibody can be basically produced as follows according to the method of Kohler and Milstein (Kohler G. & C. Milstein, Nature 256: 495-497, 1975). That is, using the above-described MK protein or a part thereof as a sensitizing antigen, this is immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cell is fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells by a screening method.
The mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of the compatibility with the parent cell used for cell fusion. For example, mouse, rat, hamster and the like are used.

第二の態様としては、MK遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む子宮内膜症検査用試薬である。
該オリゴヌクレオチドは、MK遺伝子領域を含むDNA（正常型DNAまたは変異型DNA）に特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第2版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、MK遺伝子領域を含むDNAに対し、完全に相補的である必要はない。 As a second embodiment, there is provided a reagent for endometriosis testing comprising an oligonucleotide that hybridizes to the MK gene region and has a chain length of at least 15 nucleotides.
The oligonucleotide specifically hybridizes to DNA (normal DNA or mutant DNA) containing the MK gene region. Here, “specifically hybridize” means normal hybridization conditions, preferably stringent hybridization conditions (for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, The condition described in the second edition 1989) means that cross-hybridization does not occur significantly with DNA encoding other proteins. If specific hybridization is possible, the oligonucleotide need not be completely complementary to the DNA containing the MK gene region.

MK遺伝子領域を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブ（該プローブが固定された基板を含む）やプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーはMK遺伝子領域の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。   Oligonucleotides that hybridize to DNA containing the MK gene region and have a chain length of at least 15 nucleotides can be used as probes (including the substrate on which the probe is immobilized) and primers in the test method of the present invention. When the oligonucleotide is used as a primer, the length is usually 15 bp to 100 bp, preferably 17 bp to 30 bp. The primer is not particularly limited as long as it can amplify at least a part of the MK gene region.

また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、MK遺伝子領域を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15bp以上の鎖長を有する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。 In addition, when the oligonucleotide is used as a probe, the probe is not particularly limited as long as it specifically hybridizes to DNA containing the MK gene region. The probe may be a synthetic oligonucleotide and usually has a chain length of at least 15 bp.
The oligonucleotide of the present invention can be prepared, for example, by a commercially available oligonucleotide synthesizer. The probe can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.

本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドとして、配列番号：２または配列番号：３に記載のオリゴヌクレオチドを利用することができるが、本発明のオリゴヌクレオチドは上記具体的に示された配列に限定されるものではなく、配列番号：１の配列に基づいて、適宜設計することができる。 When the oligonucleotide of the present invention is used as a probe, it is preferably used after appropriately labeling. As a labeling method, a method of labeling by phosphorylating the 5 ′ end of the oligonucleotide with 32 P using T4 polynucleotide kinase, and a random hexamer oligonucleotide or the like using a DNA polymerase such as Klenow enzyme are used. Examples of the primer include a method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin (random prime method or the like).
As the oligonucleotide of the present invention, the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 can be used, but the oligonucleotide of the present invention is not limited to the sequence specifically shown above. Based on the sequence of SEQ ID NO: 1, it can be designed as appropriate.

以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
１．ESCの単離、精製および培養
ESCの初代培養は、Ryan, IP et al.に記載されている方法に、多少の改変を加えた方法により、生検から調製した。子宮内膜組織をその下の柔組織から切り離し、小片に細分化し、DMEM/F12においてI型コラゲナーゼ（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）およびデオキシリボヌクレアーゼI（タカラ（Takara）、東京、日本）と共に37℃で1〜2時間インキュベートして、連続濾過を用いて分離した。細胞片を100 μmのナイロン製細胞濾過器（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、リンカーンパーク、ニュージャージー州）によって除去して、上皮腺のいくつかを70 μmのナイロン製細胞濾過器（ベクトンディッキンソン）によって除去した。濾液に残っている間質細胞を遠心によって回収し、DMEM/F12培地に再浮遊させ、100 mm皿に播種して37℃で30分間接着させた後、リン酸緩衝生理食塩液ですすぐことにより非接着上皮細胞および血球を除去した。細胞を、10％活性炭処理したFBS（ハイクローン（HyClone）、ローガン、ユタ州）および抗生物質（シグマ）を添加したDMEM/F12培地で培養した。細胞がコンフルエントに達した後、0.25％トリプシンによって細胞を解離して、遠心によって回収し、ファルコン96マルチウェルプレート（ベクトンディッキンソン）に1×104個/ウェルで播種して、加湿された5％CO2/95％空気の環境で37℃で維持した。24時間後、間質細胞集団が精製されたことを、以下の抗体（ダコ（Dako））による免疫細胞化学染色によって確認した；ビメンチン（間質細胞）、サイトケラチン（上皮細胞）およびCD45（単球および他の白血球）。間質細胞の純度は、ビメンチンに関する細胞染色が陽性であったことと、サイトケラチンおよびCD45に関する細胞染色が陰性であったことから判断して、98％以上であった。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
1. ESC isolation, purification and culture
ESC primary cultures were prepared from biopsies by the method described in Ryan, IP et al. With some modifications. Endometrial tissue is dissected from the underlying soft tissue, subdivided into small pieces, and type I collagenase (Sigma, St. Louis, MO) and deoxyribonuclease I (Takara, Tokyo, Japan) in DMEM / F12 And incubated at 37 ° C. for 1-2 hours and separated using continuous filtration. Cell debris is removed with a 100 μm nylon cell strainer (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ), and some of the epithelial glands are removed with a 70 μm nylon cell strainer (Becton Dickinson) did. The stromal cells remaining in the filtrate are collected by centrifugation, resuspended in DMEM / F12 medium, seeded in a 100 mm dish, allowed to adhere for 30 minutes at 37 ° C, and then rinsed with phosphate buffered saline. Non-adherent epithelial cells and blood cells were removed. Cells were cultured in DMEM / F12 medium supplemented with 10% activated carbon treated FBS (HyClone, Logan, Utah) and antibiotics (Sigma). After cells reach confluence, dissociate the cells with 0.25% trypsin, collect by centrifugation, seed at 1 × 10 4 cells / well in a Falcon 96 multiwell plate (Becton Dickinson), and humidify 5% Maintained at 37 ° C. in a CO 2 /95% air environment. After 24 hours, the stromal cell population was confirmed by immunocytochemical staining with the following antibodies (Dako); vimentin (stromal cells), cytokeratin (epithelial cells) and CD45 (single Spheres and other white blood cells). The purity of the stromal cells was 98% or more, judging from the positive cell staining for vimentin and the negative cell staining for cytokeratin and CD45.

２．PF試料の採取
本試験の被験者は、疼痛および／または不妊のために腹腔鏡検査を受けた年齢20〜48歳の子宮内膜症を患う女性（n＝106）および健常な女性（n＝33）の、全体で139人である。子宮内膜症は腹腔鏡および組織学の双方によって診断した。疾患の程度は、改訂アメリカ生殖医学会（r-ASRM）分類システム（アメリカ生殖医学会、1997）に従って採点した。非子宮内膜症群において、女性14人が卵胞期で、19人が黄体期であった。子宮内膜症群には、腹腔鏡検査まで3ヶ月を超える期間GnRHアゴニストによる治療を受けた女性12人を含む（GnRHa群）。GnRHa群を除く女性は全て、月経周期が規則的であった；そのうち、女性49人が卵胞期であり、45人が黄体期であった。GnRHa治療を受けていない子宮内膜症群では、子宮内膜症の状態は、軽度の子宮内膜症（r-ASRMスコア、1〜5；n＝25）、および進行子宮内膜症（r-ASRMスコア≧6、n＝69）であると分類され、軽度の子宮内膜症は疾患の開始段階であると仮定した。子宮内膜症群の女性の年齢は32.7±4.1歳（平均値±SD）であり、非子宮内膜症群の女性の年齢と本質的に同じであった（31.1±5.6歳）。本研究は、東京大学学内倫理委員会の承認を受け、試料の採取に関しては各女性から署名された同意書を得た。 2. PF Sample Collection Subjects in this study were women with endometriosis between 20-48 years of age who underwent laparoscopic examination for pain and / or infertility (n = 106) and healthy women (n = 33) ) Of 139 people in total. Endometriosis was diagnosed by both laparoscope and histology. The degree of disease was scored according to the revised American Society for Reproductive Medicine (r-ASRM) classification system (American Society for Reproductive Medicine, 1997). In the non-endometriosis group, 14 women were in the follicular phase and 19 were in the luteal phase. The endometriosis group includes 12 women treated with GnRH agonist for more than 3 months before laparoscopy (GnRHa group). All women except the GnRHa group had a regular menstrual cycle; of these, 49 women were in the follicular phase and 45 were in the luteal phase. In the endometriosis group not receiving GnRHa treatment, the endometriosis status is mild endometriosis (r-ASRM score, 1-5; n = 25), and advanced endometriosis (r -ASRM score ≧ 6, n = 69), assuming mild endometriosis is the onset stage of the disease. The age of women in the endometriosis group was 32.7 ± 4.1 years (mean ± SD), essentially the same as that of women in the non-endometriosis group (31.1 ± 5.6 years). This study was approved by the University of Tokyo Internal Ethics Committee, and consent was signed from each woman regarding the collection of samples.

PFは、何らかの操作技法の前にダグラス窩に導入した腹腔鏡カニューレから採取した。PFを400×gで10分間遠心して、上清をアッセイするまで-80℃で凍結保存した。腹膜および子宮内膜組織も同様に採取した。
PBMCは、周知の方法で採取した（Yoshinoら、2003）。簡単に説明すると、採取したPFを200×gで5分間遠心して、上清を除去した。細胞沈降物をリン酸緩衝生理食塩液（PBS）に再浮遊させて、フィコール-パック（アマシャムバイオサイエンシズ（Amersham Biosciences）、アップサラ、スウェーデン）に重層して、150×gで30分間遠心した。PBMCを界面から回収した。 PF was collected from a laparoscopic cannula introduced into the Douglas fossa prior to any manipulation technique. PF was centrifuged at 400 × g for 10 minutes and the supernatant was stored frozen at −80 ° C. until assayed. Peritoneal and endometrial tissues were also collected.
PBMC were collected by a well-known method (Yoshino et al., 2003). Briefly, the collected PF was centrifuged at 200 × g for 5 minutes to remove the supernatant. Cell pellets were resuspended in phosphate buffered saline (PBS), overlaid on Ficoll-Pak (Amersham Biosciences, Upsala, Sweden) and centrifuged at 150 xg for 30 minutes. PBMC were collected from the interface.

３．細胞増殖アッセイ
細胞増殖アッセイは、本発明者らが先に報告した方法で実施した（Tangら、2002）。バイオトラック細胞増殖ELISAシステム（アマシャムバイオサイエンシズ）を用いて製造元の説明書に従って、DNAへの5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）取り込みを測定することによって、ESCの増殖に及ぼすMKの作用を調べた。簡単に説明すると、ESCをファルコン96マルチウェルプレートに1×104個/ウェルの密度で、異なる濃度（0、10、100および1000 ng/ml）のMKと共に培養培地100 μlにおいて播種した。24時間後、BrdU溶液100 μlを加えて37℃でさらに2時間インキュベートした。 培養培地を除去した後、細胞を固定して、固定液200 μl/ウェルを加えてDNAを変性させた。ペルオキシダーゼ標識抗BrdU抗体は、新たに合成された細胞DNAに取り込まれたBrdUに結合した。その後の基質反応によって免疫複合体を検出し、得られた色をディジスキャンマイクロプレートリーダー（ASYSハイテクGmbH、オイゲンドルフ、オーストリア）において450 nmで読み取った。 3. Cell proliferation assay The cell proliferation assay was performed as previously reported by the inventors (Tang et al., 2002). Effect of MK on ESC proliferation by measuring 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation into DNA using Biotrack Cell Proliferation ELISA system (Amersham Biosciences) according to manufacturer's instructions I investigated. Briefly, ESCs were seeded in Falcon 96 multiwell plates at a density of 1 × 10 4 cells / well in 100 μl culture medium with different concentrations (0, 10, 100 and 1000 ng / ml) of MK. After 24 hours, 100 μl of BrdU solution was added and incubated at 37 ° C. for another 2 hours. After removing the culture medium, the cells were fixed, and 200 μl / well of a fixing solution was added to denature the DNA. Peroxidase-labeled anti-BrdU antibody bound to BrdU incorporated into newly synthesized cellular DNA. Subsequent substrate reactions detected immune complexes and the resulting color was read at 450 nm in a Digiscan microplate reader (ASYS Hi-Tech GmbH, Eugendorf, Austria).

４．MKの測定
PFにおけるMK濃度は、明治乳業（小田原、日本）から寄贈され、またはセルシグナルズ（Cell Signals、横浜、日本）所用の酵素結合イムノアッセイ（EIA）を用いて決定した。このEIAの検出限界は、0.1 ng/ml/試料であった。 4). MK measurement
MK concentrations in PF were donated by Meiji Dairies (Odawara, Japan) or determined using an enzyme-linked immunoassay (EIA) for Cell Signals (Yokohama, Japan). The detection limit for this EIA was 0.1 ng / ml / sample.

５．RNA抽出、MK mRNAの逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
RNイージーミニキット（キアゲン（QIAGEN）、ヒルデン、ドイツ）を用いて、総RNAをPBMC、腹膜、および子宮内膜組織から抽出した。RT-PCRは、レバー・トラ・ダッシュ（東洋紡、東京、日本）を用いて行った。総RNA 1 μgを全量20 μl中で逆転写して、ヒトMK配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いてcDNAを増幅した。ヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）プライマー（東洋紡、東京、日本）を用いて、RNAの質および量を確認した。320 bp断片を増幅するために、MKプライマー（センス、5’-CCTGCAACTGGAAGAAGGAG-3’（配列番号：４）；アンチセンス、5’-AGCAGACAGAAGGCACTGGT-3’（配列番号：５））を選択した。MKおよびGAPDHの増幅に関するPCR条件は、98℃で10秒、60℃で2秒および74℃で20秒を30サイクルであった。PCR産物を、エチジウムブロマイドを用いるアガロースゲル電気泳動によって分析した。それぞれのPCR産物を、QIAEX IIゲル抽出キット（キアゲン）によって精製し、ABI PRISM（商標）310遺伝子アナライザ（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いてその同一性を確認した。 5). RNA extraction, reverse transcription of MK mRNA-polymerase chain reaction (RT-PCR)
Total RNA was extracted from PBMC, peritoneum, and endometrial tissue using the RN Easy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany). RT-PCR was performed using Lever Tora Dash (Toyobo, Tokyo, Japan). 1 μg of total RNA was reverse transcribed in a total volume of 20 μl and cDNA was amplified using oligonucleotide primers based on human MK sequences. Human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) primer (Toyobo, Tokyo, Japan) was used to confirm RNA quality and quantity. To amplify the 320 bp fragment, MK primers (sense, 5′-CCTGCAACTGGAAGAAGGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 4); antisense, 5′-AGCAGACAGAAGGCACTGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 5)) were selected. PCR conditions for amplification of MK and GAPDH were 30 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 2 seconds and 74 ° C. for 20 seconds. PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis using ethidium bromide. Each PCR product was purified by QIAEX II gel extraction kit (Qiagen) and its identity was confirmed using ABI PRISM ™ 310 gene analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) .

６．統計分析
ANOVAを用いて培養細胞のBrdU取り込みを比較した。PF中のMKのデータは、中央値と四分位数間範囲（IQR）として記述した。マン-ホイトニー検定を用いてPF中のMK濃度を比較した。p<0.05は、統計学的に有意であると考えられる。 6). Statistical analysis
ANOVA was used to compare BrdU incorporation of cultured cells. MK data in PF was described as median and interquartile range (IQR). MK concentration in PF was compared using Mann-Whitney test. p <0.05 is considered statistically significant.

〔実施例１〕
培養されたESCに及ぼすMKのマイトゲン活性を、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）取り込みを測定することによって調べた。子宮内膜症を患う女性または健常な女性のPFにおけるMK濃度と、GnRHアゴニストにより治療中の女性の場合の濃度を、特異的酵素イムノアッセイを用いて測定した。PBMC、腹膜および子宮内膜組織におけるMK mRNAの発現を、RT-PCRによって評価した。
ESCにおけるDNA合成に及ぼすMKの作用を図1に示す。DNAへのBrdU取り込みは、100および1000 ng/mlのMKによって有意に増加した。1000 ng/mlのMKはBrdU取り込みレベルを対照の125％まで増強した。 [Example 1]
The mitogenic activity of MK on cultured ESCs was examined by measuring 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) incorporation. MK concentrations in PF of women suffering from endometriosis or healthy women and in women being treated with GnRH agonists were determined using specific enzyme immunoassays. The expression of MK mRNA in PBMC, peritoneum and endometrial tissue was assessed by RT-PCR.
The effect of MK on DNA synthesis in ESC is shown in FIG. BrdU incorporation into DNA was significantly increased by 100 and 1000 ng / ml MK. 1000 ng / ml of MK enhanced BrdU incorporation level to 125% of control.

調べたPF試料は全て、アッセイ限度を超える検出可能な濃度のMKを含んでいた。軽度の子宮内膜症（I期）を患う女性のPF中のMK濃度（0.93 ng/ml、0.87〜1.17；中央値、IQR）は、健常な女性のMK濃度と実質的に同じであった（0.97 ng/ml、0.67〜1.27）。従って、本発明者らは、健常な女性と軽度の子宮内膜症を患う女性のデータとを合わせて、進行子宮内膜症（II、III、およびIV期）（r-ASRMスコア≧6）の女性のデータと比較した。図2に示すように、進行子宮内膜症の女性のPFにおけるMK濃度（1.21 ng/ml、0.80〜2.27）は、健常な女性および軽度の子宮内膜症である女性のMK濃度（0.96 ng/ml、0.67〜1.26、p<0.05）より有意に高かった。GnRHアゴニスト治療を受けている女性のMK濃度は、他の二群の濃度より有意に低かった（p<0.001）。PF中のMK濃度を月経期に従って比較すると、黄体期の濃度（1.32 ng/ml、0.72〜2.21）は、卵胞期の濃度（0.95 ng/ml、0.68〜1.24、p<0.05）より有意に高かった。
図3に示すように、MK mRNAの発現は、PBMC、腹膜、および子宮内膜組織において320 bpで明確なバンドとして検出された。 All PF samples examined contained detectable concentrations of MK above the assay limit. MK concentrations in PF (0.93 ng / ml, 0.87-1.17; median, IQR) in women with mild endometriosis (stage I) were substantially the same as those in healthy women (0.97 ng / ml, 0.67-1.27). Therefore, we combined the data of healthy women and women with mild endometriosis to develop advanced endometriosis (stage II, III, and IV) (r-ASRM score ≧ 6) Compared with data for women. As shown in Figure 2, the MK concentration (1.21 ng / ml, 0.80-2.27) in the PF of women with advanced endometriosis is 0.96 ng in healthy women and women with mild endometriosis / ml, 0.67-1.26, p <0.05). MK concentrations in women receiving GnRH agonist treatment were significantly lower than those in the other two groups (p <0.001). When comparing MK concentrations in PF according to the menstrual period, the concentrations in the luteal phase (1.32 ng / ml, 0.72 to 2.21) were significantly higher than those in the follicular phase (0.95 ng / ml, 0.68 to 1.24, p <0.05) It was.
As shown in FIG. 3, MK mRNA expression was detected as a distinct band at 320 bp in PBMC, peritoneum, and endometrial tissue.

本発明において、本発明者らは、MKがESCの増殖を刺激することを示した。さらに、PF中のMKレベルは、軽度の子宮内膜症を患う女性または健常な女性と比較して、進行子宮内膜症の女性では増加した。
興味深いことに、子宮内膜症の女性における正所子宮内膜細胞は、健常な女性と比較して高いレベルのMKを発現する（Chungら、2002）。しかし、同時に、異所子宮内膜病変は、正所子宮内膜と比較してMKの有意に低いレベルを発現することも証明された（Chungら、2002）。本発明者らの知見は、MKが疾患の開始および進行の双方を促進することを考慮すれば、このジレンマを解決するために何らかの役に立つかも知れない。特に、異所子宮内膜以外の他の起源に由来するMKは、疾患の進行に関与する可能性があるが、正所子宮内膜において増加したMKは非常に初期段階の子宮内膜症における逆流子宮内膜細胞の定着および生存に役立つ可能性がある。 In the present invention, we have shown that MK stimulates ESC proliferation. In addition, MK levels in PF were increased in women with advanced endometriosis compared to women with mild endometriosis or healthy women.
Interestingly, orthotopic endometrial cells in women with endometriosis express high levels of MK compared to healthy women (Chung et al., 2002). At the same time, however, ectopic endometrial lesions have also been demonstrated to express significantly lower levels of MK compared to orthotopic endometrium (Chung et al., 2002). Our findings may be of some use to resolve this dilemma given that MK promotes both disease initiation and progression. In particular, MKs from other sources other than ectopic endometrium may be involved in disease progression, but increased MK in orthotopic endometrium is very early in endometriosis It may be helpful for colonization and survival of reflux endometrial cells.

最近の報告から、マウスの腹腔損傷モデルにおいてMKが腹腔内癒着を刺激することが示されている（Inohら、2004）。子宮内膜症は疾患の進行に伴って腹腔内癒着を形成しやすいことを考慮すると、MKはまた癒着の形成にも関与する可能性がある。
PFにおけるMK起源は広く分布しているように思われる。本発明者らのRT-PCR分析は、MKがPBMC、腹膜および子宮内膜組織において発現されることを証明した。さらに、***時に放出される卵胞液中のMKは、卵胞液が大量のMKを含むことから、PFにおけるMKの一部を構成すると仮定される（Ohyamaら、1994）。卵胞液中のMK濃度が高いことは、PF中のMKが卵胞期と比較して黄体期では増加しているという知見を部分的に説明する可能性がある。 A recent report shows that MK stimulates intraperitoneal adhesions in a murine abdominal injury model (Inoh et al., 2004). Given that endometriosis tends to form intraperitoneal adhesions as the disease progresses, MK may also be involved in adhesion formation.
The MK origin in PF seems to be widely distributed. Our RT-PCR analysis demonstrated that MK is expressed in PBMC, peritoneum and endometrial tissue. Furthermore, the MK in the follicular fluid released upon ovulation is hypothesized to form part of the MK in PF since the follicular fluid contains a large amount of MK (Ohyama et al., 1994). High MK concentration in the follicular fluid may partially explain the finding that MK in PF is increased in the luteal phase compared to the follicular phase.

本研究における顕著な知見は、GnRHa治療を受けている女性のMKレベルは、進行子宮内膜症および軽度の子宮内膜症を患う女性または健常な女性と比較して有意に低いということである。エストラジオールは、子宮内膜上皮細胞においてMK mRNA発現を誘導することが報告された（Zhangら、1995）。MK遺伝子（Ueharaら、1992）のプロモーター領域に存在するいくつかのERE半パリンドロームモチーフ（Katoら、1992）が、エストラジオールの作用を引き起こすことが示唆された（Zhangら、1995）。GnRHa治療によって誘導される低エストロゲン状態は、様々な細胞においてMKの遺伝子転写を抑制する可能性がある。さらに、GnRHa治療によって引き起こされた無***は、PFにおけるMKレベルを抑制して、腹腔への卵胞液の流入を妨害するように関与しうる。   A striking finding in this study is that MK levels in women receiving GnRHa treatment are significantly lower compared to women with advanced endometriosis and mild endometriosis or healthy women . Estradiol has been reported to induce MK mRNA expression in endometrial epithelial cells (Zhang et al., 1995). It has been suggested that several ERE semi-palindromic motifs (Kato et al., 1992) present in the promoter region of the MK gene (Uehara et al., 1992) cause estradiol action (Zhang et al., 1995). The hypoestrogenic state induced by GnRHa treatment may repress MK gene transcription in various cells. Furthermore, anovulation caused by GnRHa treatment may be involved in suppressing the influx of follicular fluid into the peritoneal cavity by suppressing MK levels in PF.

MKは、線維芽細胞、腫瘍細胞、およびケラチノサイトを含むいくつかの細胞を増殖させることが示されている（Inazumiら、1997；Muramatsu and Muramatsu、1991；Muramatsuら、1993）。しかし、MKの作用機序は、増殖因子シグナルを伝達することができる明確に定義されたMK受容体がないことから、あまり明確ではない（Muramatsu、2002）。このように、MKが子宮内膜細胞を刺激するメカニズムを解明することは現時点では困難であるように思われる。とは言え、MKが疾患の発症を刺激することを考慮すれば、MK阻害剤により、子宮内膜症を治療することができると考えられる。マウス直腸癌細胞では、MKに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫瘍の形成を抑制することが示されている（Takeiら、2001）。   MK has been shown to proliferate several cells including fibroblasts, tumor cells, and keratinocytes (Inazumi et al., 1997; Muramatsu and Muramatsu, 1991; Muramatsu et al., 1993). However, the mechanism of action of MK is less clear because there is no well-defined MK receptor capable of transmitting growth factor signals (Muramatsu, 2002). Thus, elucidating the mechanism by which MK stimulates endometrial cells appears to be difficult at this time. However, given that MK stimulates the onset of the disease, it is thought that endometriosis can be treated with MK inhibitors. In mouse rectal cancer cells, antisense oligonucleotides against MK have been shown to suppress tumor formation (Takei et al., 2001).

培養ESCのMK誘発増殖を示す図である。ESCの増殖に及ぼすMKの作用を、細胞増殖ELISAを用いることによって、BrdUのDNAへの取り込みを測定することによって調べた。ESCを異なる濃度のMKによって24時間処置した。値は1試料あたり5個ずつの平均値±SEMである。示したデータは、異なるESC調製物を用いた3実験の代表である。*；p<0.05、**；p<0.001（いずれも対照に対して）。It is a figure which shows MK induction proliferation of culture | cultivation ESC. The effect of MK on ESC proliferation was examined by measuring BrdU incorporation into DNA by using a cell proliferation ELISA. ESCs were treated with different concentrations of MK for 24 hours. The value is an average value ± SEM of 5 pieces per sample. Data shown are representative of three experiments with different ESC preparations. *; P <0.05, **; p <0.001 (both relative to the control). 健常な女性、軽度の子宮内膜症を患う女性（r-ASRMスコア、0〜5、n＝58）、進行子宮内膜症を患う女性（r-ASRMスコア、≧6、n＝69）、およびGnRHアゴニストによって治療した女性（GnRHa、n＝12）のPFにおけるMK濃度を示す図である。四角の枠は、第一四分位（25％）から第三四分位（75％）までの距離を表し、四角の中の水平線は中央値を表す。バーは下限での10パーセンタイルおよび上限での90パーセンタイルを表す。Healthy women, women with mild endometriosis (r-ASRM score, 0-5, n = 58), women with advanced endometriosis (r-ASRM score, ≧ 6, n = 69), And MK concentration in PF of women treated with GnRH agonists (GnRHa, n = 12). The square frame represents the distance from the first quartile (25%) to the third quartile (75%), and the horizontal line in the square represents the median. The bar represents the 10th percentile at the lower limit and the 90th percentile at the upper limit. PBMC、腹膜および子宮内膜組織におけるMK mRNAの発現を示す写真である。骨髄由来細胞、腹膜、および子宮内膜組織から単離した総RNAを逆転写して、MKのプライマーを用いてPCRによって増幅した。GAPDHの増幅を用いてRNAの質および量を確認した。レーン1〜3：PF中の骨髄由来細胞。レーン4〜6：腹腔組織。レーン7〜9：子宮内膜組織。レーン10：cDNAを含まない陰性対照。レーン11：DNA分子量マーカー。It is a photograph which shows the expression of MK mRNA in PBMC, a peritoneum, and endometrial tissue. Total RNA isolated from bone marrow-derived cells, peritoneum, and endometrial tissue was reverse transcribed and amplified by PCR using MK primers. GAPDH amplification was used to confirm RNA quality and quantity. Lanes 1-3: Bone marrow derived cells in PF. Lanes 4-6: Abdominal tissue. Lanes 7-9: endometrial tissue. Lane 10: negative control without cDNA. Lane 11: DNA molecular weight marker.

Claims (10)

ミッドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分とする、子宮内膜症を予防または治療するための薬剤。 A drug for preventing or treating endometriosis comprising a compound that suppresses the expression of the midkine gene as an active ingredient. ミッドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物がオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の薬剤。 The drug according to claim 1, wherein the compound that suppresses the expression of the midkine gene is an oligonucleotide. ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得るオリゴヌクレオチドが以下の（ａ）または（ｂ）である、請求項２に記載の薬剤。
（ａ）ミッドカイン遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ｂ）ミッドカイン遺伝子を標的とするdsRNA The drug according to claim 2, wherein the oligonucleotide capable of suppressing the expression of the midkine gene is the following (a) or (b).
(A) Midkine gene antisense oligonucleotide (b) dsRNA targeting midkine gene ミッドカインタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分とする、子宮内膜症を予防または治療するための薬剤。 A drug for preventing or treating endometriosis comprising a compound that suppresses the function of midkine protein as an active ingredient. ミッドカインタンパク質の機能を抑制する化合物がミッドカインに結合する抗体である、請求項４に記載の薬剤。 The drug according to claim 4, wherein the compound that suppresses the function of midkine protein is an antibody that binds to midkine. 被検者より採取した試料中のミッドカイン遺伝子の発現を測定する工程を含む、子宮内膜症の検査方法。 A method for examining endometriosis, comprising a step of measuring the expression of a midkine gene in a sample collected from a subject. 被検者より採取した試料が腹腔液、腹腔骨髄由来細胞、腹膜組織または子宮内膜組織である、請求項６に記載の検査方法。 The test method according to claim 6, wherein the sample collected from the subject is peritoneal fluid, peritoneal bone marrow-derived cells, peritoneal tissue or endometrial tissue. ミッドカイン遺伝子発現の測定がミッドカインタンパク質またはミッドカインタンパク質をコードしたmRNAを基に測定される、請求項６または７に記載の検査方法。 The test method according to claim 6 or 7, wherein midkine gene expression is measured based on midkine protein or mRNA encoding midkine protein. 抗ミッドカイン抗体を含む子宮内膜症検査用試薬。 A reagent for testing endometriosis containing an anti-midkine antibody. ミッドカイン遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、子宮内膜症検査用試薬。 A reagent for testing endometriosis, comprising an oligonucleotide that hybridizes to a midkine gene region and has a chain length of at least 15 nucleotides.
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