JP2007295844A - Evaluation method of crisis resistance and susceptibility of bovine mastitis - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To find out allele concerning to crisis resistance or susceptibility to bovine mastitis, and to provide an evaluation method and means of the resistance and susceptibility. <P>SOLUTION: The method for evaluating crisis resistance or susceptibility to bovine mastitis of a test bovine comprises detecting DQA1<SP>*</SP>1201 allele and/or DQA1<SP>*</SP>0101 allele of DQA1 gene encoding a bovine major histocompatible antigen DQ molecule α chain of a test bovine. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、ウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性の判定方法、並びにそのためのキットに関する。また本発明は、ウシ***炎に対する抵抗性を有するウシの作出方法に関する。   The present invention relates to a method for determining onset resistance or susceptibility to bovine mastitis, and a kit therefor. The present invention also relates to a method for producing bovines having resistance to bovine mastitis.

ウシ***炎は、５種類の原因菌（黄色ブドウ球菌、無乳性連鎖球菌、表皮ブドウ球菌、環境性連鎖球菌及び大腸菌群）の感染により発症する感染症であり、畜産界に多大な被害をもたらす。その発症には遺伝的要因が関与することが指摘されており、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）もその候補として知られている。ＭＨＣは、クラスＩとクラスＩＩがあり、抗原ペプチドをＴ細胞に提示し液性免疫や細胞性免疫応答を引き起こす非常に多型に富む分子である。そして、この高度な多型性が疾患感受性の個体差を生ずる原因となっている。ウシＭＨＣ（ＢｏＬＡ）と***炎との相関性が、クラスＩの遺伝子、クラスＩＩのＤＲＢ３アリル及びＤＱＡアリルで報告されている（非特許文献１）。   Bovine mastitis is an infectious disease caused by infection with five types of causative bacteria (Staphylococcus aureus, non-milk streptococci, Staphylococcus epidermidis, environmental streptococci, and coliforms), and has caused great damage to the livestock industry. Bring. It has been pointed out that genetic factors are involved in the onset, and major histocompatibility antigens (MHC) are also known as candidates. MHC is classified into class I and class II, and is a molecule rich in polymorphism that presents antigenic peptides to T cells and causes humoral immunity and cellular immune response. And this high polymorphism causes the individual difference of disease susceptibility. Correlation between bovine MHC (BoLA) and mastitis has been reported for class I genes, class II DRB3 alleles and DQA alleles (Non-patent Document 1).

ウシ***炎の診断は、乳中体細胞数の大小によって判定されている。今までに、乳中体細胞数とＢｏＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子との相関性が指摘されている（非特許文献２）。また近年、ＤＮＡチップを用いたタイピング法によって、ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子及びＢｏＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子が***炎の発症に関与することが示されている（非特許文献１）。しかしながら、ＤＮＡチップを用いたタイピング法についてはまだ正確性の検証はなされておらず、またこれは海外のホルスタインについての研究であるため、日本のホルスタインに適用可能であるかは不明であった。   The diagnosis of bovine mastitis is determined by the size of somatic cells in milk. Up to now, a correlation between the number of somatic cells in milk and the BoLA-DRB3 gene has been pointed out (Non-patent Document 2). In recent years, it has been shown that BoLA-DRB3 gene and BoLA-DQA1 gene are involved in the development of mastitis by a typing method using a DNA chip (Non-patent Document 1). However, the accuracy of the typing method using a DNA chip has not yet been verified, and since this is a study of overseas Holstein, it was unclear whether it could be applied to Japanese Holstein.

日本のホルスタインを用いた***炎の原因遺伝子の解明が行われており、その原因遺伝子としてＦＥＺＬ遺伝子（Forebrain embyronic zinc finger-like）の関与が報告され、その遺伝子の変異の検出を利用した***炎の発症抵抗性の判定も報告されている（特許文献１）。   The cause gene of mastitis using Holstein in Japan has been elucidated, and the involvement of FEZL gene (Forebrain embyronic zinc finger-like) has been reported as the cause gene, and mastitis using the detection of mutation of the gene The determination of the onset resistance has also been reported (Patent Document 1).

一方、本発明者は、ＢｏＬＡのクラスＩＩに存在するアリルを正確かつ迅速にタイピング可能なＰＣＲ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｔｙｐｉｎｇ（ＳＢＴ）法を開発している（特許文献２及び３）。このＰＣＲ−ＳＢＴ法を利用したウシ白血病の発症抵抗性の判定方法は開発されているが、***炎の発症抵抗性についての報告はまだない。   On the other hand, the present inventor has developed a PCR-Sequence based typing (SBT) method capable of accurately and rapidly typing alleles present in BoLA class II (Patent Documents 2 and 3). Although a method for determining the onset resistance of bovine leukemia using this PCR-SBT method has been developed, there is no report on the onset resistance of mastitis.

当該技術分野では、より効率的にかつ確実にウシ***炎に対する抵抗性を判定する方法が望まれている。   There is a desire in the art for a more efficient and reliable method of determining resistance to bovine mastitis.

特開２００６−６７９２８号公報JP 2006-67928 A 特開２００１−１７８４９９号公報JP 2001-178499 A ＷＯ２００５／０９５６４８号パンフレットWO2005 / 095648 pamphlet Park Y-H, et al. Characterization of lymphocyte subpopulations and major histocompatibility complex haplotypes of mastitis-resistant and susceptible cows. J. Vet. Sci. 第5(1)巻第29〜39頁、2004年Park Y-H, et al. Characterization of lymphocyte subpopulations and major histocompatibility complex haplotypes of mastitis-resistant and susceptible cows. J. Vet. Sci. 5 (1) 29-39, 2004 Sharif S, et al. Associations of the bovine major histocompatibility complex DRB3 (BoLA-DRB3) alleles with occurrence of disease and milk somatic cell score in Canadian dairy cattle. Anim Genet. 第29(3)巻第185〜193頁、1998年Sharif S, et al. Associations of the bovine major histocompatibility complex DRB3 (BoLA-DRB3) alleles with occurrence of disease and milk somatic cell score in Canadian dairy cattle. Year

本発明は、ウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性に関連するアリルを見出し、かかる抵抗性又は感受性を判定する方法及び手段を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to find an allele associated with onset resistance or susceptibility to bovine mastitis and to provide a method and means for determining such resistance or susceptibility.

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行い、日本全国から無作為に抽出したウシ検体の集団を対照群とし（以下「対照群」という）、当該対照群と***炎発症ウシとを用いてＢｏＬＡ−ＤＱＡ１におけるアリルを検出したところ、ＤＱＡ１＊１２０１アリルが対照群において有意に高頻度に存在し、ＤＱＡ１＊０１０１アリルが***炎発症ウシ群において有意に高頻度に存在するという知見を得、本発明を完成するに至った。 The present inventor has conducted intensive studies in order to solve the above problems, and a group of bovine specimens randomly extracted from all over Japan is used as a control group (hereinafter referred to as “control group”). Was used to detect alleles in BoLA-DQA1, and it was found that DQA1 * 1201 allele was significantly present in the control group and DQA1 * 0101 allele was significantly present in the mastitis-causing bovine group. As a result, the present invention has been completed.

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）である。
（１）被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することを含む、被験ウシにおけるウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定する方法。 That is, this invention is the following (1)-(4).
(1) Onset resistance to bovine mastitis in a test cow, comprising detecting DQA1 * 1201 allele and / or DQA1 * 0101 allele in a DQA1 gene encoding a bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain in a test cow Or a method of determining sensitivity.

（２）被験ウシにおけるウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定する方法であって、
（ａ）被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するステップ、
（ｂ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するステップ、
を含み、ＤＱＡ１＊１２０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ***炎に対する発症抵抗性を有することを示し、ＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ***炎に対する発症感受性を有することを示すものである、上記方法。
上記方法において、ステップ（ｂ）は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法（ＰＣＲ−ＳＢＴ）により行うことができる。このステップ（ｂ）は、
（ｂ１）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、又は
（ｂ２）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
あるいは（ｂ１）及び（ｂ２）の両方のステップを含むことが好ましい。またステップ（ｂ）は、（ｂ３）得られた増幅産物の塩基配列を決定するステップをさらに含むことが好ましい。 (2) A method for determining onset resistance or susceptibility to bovine mastitis in a test cow,
(A) preparing genomic DNA or mRNA from the test cow;
(B) detecting DQA1 * 1201 allele and / or DQA1 * 0101 allele of DQA1 gene encoding bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain in genomic DNA or mRNA;
And the presence of DQA1 * 1201 allele indicates that the test cow is resistant to onset of bovine mastitis, and the presence of DQA1 * 0101 allele indicates that the test cow is susceptible to onset of bovine mastitis. The method described above.
In the above method, step (b) can be performed, for example, by polymerase chain reaction-base sequence-based typing method (PCR-SBT). This step (b)
(B1) performing an amplification reaction using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28, or (b2) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 And performing an amplification reaction using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30;
Alternatively, it is preferable to include both steps (b1) and (b2). Step (b) preferably further includes the step (b3) of determining the base sequence of the obtained amplification product.

（３）前項（１）又は（２）に記載の方法を用いてウシ***炎に対する発症抵抗性を有すると判定されたウシを用いてウシを作出することを特徴とする、ウシ***炎に対する発症抵抗性を有するウシの作出方法。 (3) Onset for bovine mastitis characterized by producing a cow using a cow determined to have onset resistance to bovine mastitis using the method described in (1) or (2) above A method for producing resistant cows.

（４）ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段を含むことを特徴とする、ウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定するためのキット。
上記キットは、例えばＤＱＡ１遺伝子の第２エクソンを増幅するためのプライマー、及び／又はＤＱＡ１遺伝子の第２エクソンを配列決定するためのプライマーを含む。例えば、上記キットは、
（ａ）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマー、並びに／又は
（ｂ）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマー
を含むことができる。 (4) Onset resistance or susceptibility to bovine mastitis, comprising means for detecting DQA1 * 1201 allele and / or DQA1 * 0101 allele of the DQA1 gene encoding the bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain Kit for judging.
The kit includes, for example, a primer for amplifying the second exon of the DQA1 gene and / or a primer for sequencing the second exon of the DQA1 gene. For example, the kit is
(A) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28, and / or (b) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 A primer consisting of a base sequence can be included.

本発明により、ウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性の判定方法が提供される。該方法は、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在を検出することにより、被験ウシの発症抵抗性又は感受性を簡便かつ迅速に判定することができるため、ウシの***炎発症機構の研究、ウシ***炎に対する発症抵抗性を有するウシの作出などに有用である。 The present invention provides a method for determining the onset resistance or susceptibility to bovine mastitis. This method can easily and rapidly determine the onset resistance or sensitivity of a test cow by detecting the presence of DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele in the bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain. It is useful for the study of the onset mechanism of bovine mastitis, the production of bovines that are resistant to onset of bovine mastitis, and the like.

以下、本発明を詳細に説明する。
１．ウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性の判定
本発明は、ウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定する方法である。本発明の方法は、ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＱ分子のＤＱＡ１＊１２０１アリルをホモ又はヘテロに有するウシ個体が***炎の発症に対して抵抗性を示し、ＤＱＡ１＊０１０１アリルをホモ又はヘテロに有するウシ個体が***炎の発症に対して感受性を示すという知見に基づくものである。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Determination of Onset Resistance or Sensitivity to Bovine Mastitis The present invention is a method for determining onset resistance or sensitivity to bovine mastitis. In the method of the present invention, a bovine individual having the DQA1 * 1201 allele of the DQ molecule of bovine major histocompatibility antigen (BoLA) homo- or hetero-resistant is resistant to the development of mastitis and the DQA1 * 0101 allele is This is based on the finding that bovine individuals in heterogeneity are susceptible to the development of mastitis.

ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）とは、移植片や細菌、ウイルスなどの外来抗原ペプチドと結合してＴ細胞に提示する膜タンパク質であり、一般には主要組織適合性遺伝子複合体（Major histocompatibity complex；ＭＨＣ）分子と呼ばれるものである。ＢｏＬＡには、多くのアリルが存在することが知られており、これらの情報については、例えばＢｏＬＡ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｗｅｂ ｓｉｔｅ（インターネットサイトhttp://www.projects.roslin.ac.uk/bola/bolahome.html）において公開されている。   Bovine major histocompatibility antigen (BoLA) is a membrane protein that binds to a foreign antigen peptide such as a graft, a bacterium, or a virus and presents it to T cells, and is generally a major histocompatibility complex (Major histocompatibity complex; MHC) molecules. It is known that many alleles exist in BoLA. For such information, for example, BoLA Nomenclature Committee Web site (Internet site http://www.projects.roslin.ac.uk/bola/bolahome. html).

ウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＱ分子のα鎖は、ＤＱＡ１〜５によりコードされている。ＤＱ分子のα鎖のアミノ酸配列及びα鎖をコードする塩基配列は、それぞれアクセッション番号ＢＡＡ０９０４５．１及びＤ５０４５４として登録されている。α鎖をコードする遺伝子の第２エクソンの代表的なアリルの塩基配列を図１Ａ〜Ｃ（配列番号１〜２６及び３３〜３８）に、アミノ酸配列とそのアライメントを図１Ｄに示す。なお、ＤＱＡ１遺伝子の第２エクソンは、ＤＱ分子のα鎖の第６アミノ酸から第８７アミノ酸までをコードしている。   The α chain of the DQ molecule of bovine major histocompatibility antigen (BoLA) is encoded by DQA1-5. The amino acid sequence of the α chain of the DQ molecule and the base sequence encoding the α chain are registered under accession numbers BAA09045.1 and D504454, respectively. The base sequences of representative alleles of the second exon of the gene encoding the α chain are shown in FIGS. The second exon of the DQA1 gene encodes the 6th to 87th amino acids of the α chain of the DQ molecule.

本明細書において記載する「ＤＱＡ１＊１２０１アリル」とは、このＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１の第２エクソンのアリルの１種であり、ＤＱＡ１＊１２０１１アリル及びＤＱＡ１＊１２０１２アリルを含む（図１Ａ）。ＤＱＡ１＊１２０１１アリル及びＤＱＡ１＊１２０１２アリルは、それぞれ配列番号１及び３に示される塩基配列を有するが、ＤＱＡ１＊１２０１１アリル及びＤＱＡ１＊１２０１２アリルによってコードされるα鎖のアミノ酸配列は同じであり、それぞれ配列番号２及び４示される。また、本明細書において記載する別のＤＱＡ１の第２エクソンのアリルの１種である「ＤＱＡ１＊０１０１アリル」は、配列番号５に示される塩基配列及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するものである（図１Ａ）。 The “DQA1 * 1201 allyl” described in the present specification is one of the alleles of the second exon of DQA1 encoding this DQ molecule α chain, and includes DQA1 * 12011 allele and DQA1 * 12012 allele (FIG. 1A). ). DQA1 * 12011 allyl and DQA1 * 12012 allyl have the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively, but the amino acid sequences of the α chain encoded by DQA1 * 12011 allyl and DQA1 * 12012 allyl are the same, respectively SEQ ID NOs: 2 and 4 are shown. Further, “DQA1 * 0101 allyl”, which is one of alleles of the second exon of another DQA1 described in the present specification, has the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. (FIG. 1A).

従って、本発明においては、被験ウシにおいてＢｏＬＡ−ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する。そして、その判定結果（検出結果）に基づいて該被験ウシがウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性を示すか否かを判定する。ここで、本明細書においては、「ＤＱＡ１＊１２０１アリルの検出」とは、被験ウシが配列番号１又は３に示される塩基配列を有するＤＱＡ１を有するか否か、及び配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むＤＱ分子α鎖を発現するか否かを判定することを意味し、「ＤＱＡ１＊０１０１アリルの検出」とは、被験ウシが配列番号５に示される塩基配列を有するＤＱＡ１を有するか否か、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＤＱ分子α鎖を発現するか否かを判定することを意味する。また「発症抵抗性」とは、ウシ***炎への罹りにくさ（抵抗性）を意味し、「抵抗性を有する」とは、他の被験ウシと比較して、ウシ***炎を発症する確率が低いことを意味する。一方、「発症感受性」とは、ウシ***炎への罹りやすさ（感受性）を意味し、「感受性を有する」とは、他の被験ウシと比較して、ウシ***炎を発症する確率が高いことを意味する。 Therefore, in the present invention, DQA1 * 1201 allele and / or DQA1 * 0101 allele in the DQA1 gene encoding the BoLA-DQ molecule α chain is detected in the test cow. Then, based on the determination result (detection result), it is determined whether or not the test cow shows onset resistance or sensitivity to bovine mastitis. Here, in this specification, “detection of DQA1 * 1201 allele” means whether or not the test cow has DQA1 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, and shown in SEQ ID NO: 2 or 4. Means to determine whether or not to express a DQ molecule α chain containing the amino acid sequence to be detected, and “detecting DQA1 * 0101 allele” means that the test cow has DQA1 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5. And whether or not to express a DQ molecule α chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. “Onset resistance” means the difficulty of developing bovine mastitis (resistance), and “having resistance” means the probability of developing bovine mastitis compared to other test cows. Means low. On the other hand, “susceptibility” means susceptibility (susceptibility) to bovine mastitis, and “having susceptibility” has a higher probability of developing bovine mastitis than other test cows. Means that.

本発明において、被験ウシにおけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの検出は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルで行うことができる。例えば、被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製し、塩基配列に基づいて、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することができる。また、被験ウシからウシ主要組織適合抗原（ＢｏＬＡ）のＤＱ分子タンパク質を調製し、例えば抗体などを用いてＤＱ分子におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することができる。これらの方法について、以下簡単に説明する。 In the present invention, detection of DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele in a test cow can be performed at a gene level or a protein level. For example, genomic DNA or mRNA can be prepared from a test cow, and DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele in genomic DNA or mRNA can be detected based on the nucleotide sequence. Moreover, DQ molecular protein of bovine major histocompatibility antigen (BoLA) can be prepared from a test cow, and DQA1 * 1201 allele and / or DQA1 * 0101 allele in DQ molecule can be detected using, for example, an antibody. These methods will be briefly described below.

（１）被験ウシからのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ調製
本発明の方法では、ウシ***炎発症に対する抵抗性または感受性を判定しようとするウシ（被験ウシ）からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡの調製は、公知の方法、例えばフェノール／クロロホルム法、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法などにより調製することができる。また、ｍＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばグアニジンイソチオシアネート法などにより調製することができる。ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するためのキットも市販されており、ゲノムＤＮＡの調製用には例えばWizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）など、ｍＲＮＡの調製用には例えばNucleoTrap(登録商標)mRNA Kit（Clontech）などを使用することができる。 (1) Preparation of genomic DNA or mRNA from test cow In the method of the present invention, genomic DNA or mRNA is prepared from a cow (test cow) whose resistance or sensitivity to the onset of bovine mastitis is to be determined. The genomic DNA can be prepared by a known method such as a phenol / chloroform method, a cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method, or the like. In addition, mRNA can be prepared by a known method such as guanidine isothiocyanate method. Kits for preparing genomic DNA or mRNA are also commercially available, such as Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) for preparing genomic DNA, and NucleoTrap (registered trademark) mRNA Kit (Clontech) for preparing mRNA. ) Etc. can be used.

また、後述するアリルの検出のため、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成してもよい。ｃＤＮＡの合成方法は当技術分野で公知であり、例えば、ＲＮＡから、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりランダムプライマー又はポリＴプライマーを使用してｃＤＮＡを合成することができる。   In addition, cDNA may be synthesized from mRNA for the detection of allele described later. Methods for synthesizing cDNA are known in the art, and for example, cDNA can be synthesized from RNA by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) using random primers or poly-T primers.

ＤＮＡ又はＲＮＡを調製する供与源もまた特に限定されるものではなく、細胞又は組織、血液、唾液、鼻腔粘膜からこすりとった細胞などを用いることができる。   The source for preparing DNA or RNA is not particularly limited, and cells or tissues scraped from blood, saliva, nasal mucosa, or the like can be used.

被験ウシは、反芻類に属するウシ（Bos Taurus、Bos indicus）であればその種は特に限定されるものではない。例えば、エアーシア（Ayrshire）、ブリティッシュフリージアン（British Friesian）、デンマーク黒肢（Danish Black Pied）、デンマーク赤毛（Danish Red）、ヘレフォード（Hereford）、ホルスタインフリージアン（Holstein Friesian）、ジャージー（Jersey）、リムーザン（Limousin）、黒毛和種、日本短角、及びそれらの混血種などが挙げられる。好ましくは、被験ウシは、ホルスタイン又はホルスタインの混血種である。   The species of the test cow is not particularly limited as long as it belongs to ruminants (Bos Taurus, Bos indicus). For example, Ayrshire, British Friesian, Danish Black Pied, Danish Red, Hereford, Holstein Friesian, Jersey, Examples include Limousin, Japanese black bream, Japanese short angle, and mixed races thereof. Preferably, the test cow is Holstein or a mixed race of Holstein.

（２）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるアリルの検出
ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの検出は、例えば、当技術分野で公知の遺伝子多型検出手段により行うことができ、限定するものではないが、直接配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用した方法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用した方法、ハイブリダイゼーション法を利用した方法、プライマー伸長反応を利用する方法、質量分光法などが挙げられる。これらの方法はいずれも当業者に周知である。以下にその概要を説明する。 (2) Detection of allele in genomic DNA or mRNA Detection of DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele in genomic DNA or mRNA can be performed by, for example, genetic polymorphism detection means known in the art, and is limited. Although not, direct sequencing method, method using polymerase chain reaction (PCR), method using restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP), method using hybridization method, method using primer extension reaction And mass spectroscopy. Both of these methods are well known to those skilled in the art. The outline will be described below.

（２−１）直接配列決定法
ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルは、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを用いて直接配列決定法により検出することができる。直接配列決定法においては、最初に、被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを調製し、検出対象となるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域をベクターにクローニングし、宿主細胞（例えば細菌）において増幅させる。あるいは、検出対象のＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域内のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することも可能である。増幅後、検出対象領域内のＤＮＡを配列決定する。配列決定法としては、限定されるものではないが、手動式配列決定法又は自動配列決定法が挙げられる。手動配列決定法としては、例えば放射性マーカーヌクレオチドを使用する方法などが挙げられ、自動配列決定法としては、ダイターミネーターを使用する方法などが挙げられる。配列決定の結果に基づいて、被験ウシがＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するか否かを判定する。 (2-1) Direct sequencing method DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele can be detected by direct sequencing using genomic DNA or cDNA derived from mRNA. In the direct sequencing method, first, genomic DNA or mRNA-derived cDNA is prepared from a test cow, a region containing DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele to be detected is cloned into a vector, and a host cell (for example, Bacteria). Alternatively, DNA in a region containing DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele to be detected can be amplified by PCR. After amplification, the DNA in the detection target region is sequenced. Sequencing methods include, but are not limited to, manual sequencing methods or automated sequencing methods. Examples of the manual sequencing method include a method using a radioactive marker nucleotide, and examples of the automatic sequencing method include a method using a dye terminator. Based on the sequencing results, it is determined whether the test cow has DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele.

本発明においては、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域を増幅した後、得られた増幅産物の塩基配列決定を行う、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法（ＰＣＲ−ＳＢＴ）を利用することが好ましい。ＰＣＲ−ＳＢＴ法によりＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する方法について、以下詳述する。 In the present invention, in particular, polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify a region containing DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele, and then base sequence determination of the obtained amplification product is performed. It is preferable to use a typing method based on a base sequence (PCR-SBT). A method for detecting DQA1 * 1201 allyl or DQA1 * 0101 allyl by PCR-SBT method will be described in detail below.

最初に、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅可能なプライマーを用いて、調製したゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行い、第２エクソンの塩基配列を有する核酸断片を増幅する。ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅可能なプライマーは、第２エクソンの全領域を増幅できることが好ましい。従って、第２エクソンの両側に位置するイントロンの配列に基づいてプライマーを設計することができる。あるいは、イントロンとエクソンとの境界領域の配列に基づいてプライマーを設計することもできる。   First, using a primer capable of amplifying the second exon of BoLA-DQA1, an amplification reaction is performed using the prepared genomic DNA as a template to amplify a nucleic acid fragment having the base sequence of the second exon. The primer capable of amplifying the second exon of BoLA-DQA1 is preferably capable of amplifying the entire region of the second exon. Therefore, a primer can be designed based on the sequence of the intron located on both sides of the second exon. Alternatively, primers can be designed based on the sequence of the border region between intron and exon.

プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。例えば、プライマーとしての機能を有する長さとしては、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。また設計の際には、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型となるＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができる。設計されたプライマーは、公知のオリゴヌクレオチド合成手法により化学合成することができるが、通常は、市販の化学合成装置を使用して合成される。   Primer design methods are well known in the art, and primers that can be used in the present invention satisfy conditions that allow specific annealing, such as length and base composition (melting temperature) at which specific annealing is possible. Designed to have For example, the length having a function as a primer is preferably 10 bases or more, more preferably 16 to 50 bases, and further preferably 20 to 30 bases. In designing, it is preferable to confirm the melting temperature (Tm) of the primer. Tm means a temperature at which 50% of an arbitrary nucleic acid strand forms a hybrid with its complementary strand. In order to anneal a template DNA and a primer to form a double strand, the annealing temperature must be Need to optimize. On the other hand, if this temperature is lowered too much, a non-specific reaction occurs, so it is desirable that the temperature be as high as possible. For confirmation of Tm, known primer design software can be used. The designed primer can be chemically synthesized by a known oligonucleotide synthesis method, but is usually synthesized using a commercially available chemical synthesizer.

本発明において使用可能な、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅することができるプライマーセットとしては、限定するものではないが、以下の（ａ）及び（ｂ）が挙げられる：
（ａ）配列番号２７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示す塩基配列からなるプライマー
5’-CAC AAA TGA AGC CCA CAA TG-3’（配列番号２７）
5’-CCC TAG GGA AAA GGG AGT GA-3’（配列番号２８）
（ｂ）配列番号２９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示す塩基配列からなるプライマー
5’-GCC CAC AAT GTT TGA TAG TC-3’（配列番号２９）
5’-GGG RAC ACA TAC TGT TGG T-3’（配列番号３０）
（配列中、ＲはＡ又はＧを表す）。 Primer sets that can amplify the second exon of BoLA-DQA1 that can be used in the present invention include, but are not limited to, the following (a) and (b):
(A) A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28
5'-CAC AAA TGA AGC CCA CAA TG-3 '(SEQ ID NO: 27)
5'-CCC TAG GGA AAA GGG AGT GA-3 '(SEQ ID NO: 28)
(B) A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30
5'-GCC CAC AAT GTT TGA TAG TC-3 '(SEQ ID NO: 29)
5'-GGG RAC ACA TAC TGT TGG T-3 '(SEQ ID NO: 30)
(In the sequence, R represents A or G).

増幅反応は、特に限定されないが、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行う。   The amplification reaction is not particularly limited, but is preferably performed by a polymerase chain reaction (PCR) method.

また、増幅の特異性を高めるために、２組以上のプライマーを用いて２回以上増幅反応を行うことが好ましい。具体的には、最初に、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅する。次いで、増幅された核酸断片を鋳型として、さらにＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を増幅する。このように２回以上増幅反応を行う場合には、各増幅反応で使用するプライマーを、同じ位置に設計してもよいし、あるいは、最初の増幅におけるプライマーの位置よりも内側に設計することができる。   In order to increase the specificity of amplification, it is preferable to perform the amplification reaction twice or more using two or more sets of primers. Specifically, first, a nucleic acid fragment containing the base sequence of the second exon of BoLA-DQA1 is amplified using genomic DNA derived from the test cow as a template. Next, using the amplified nucleic acid fragment as a template, a nucleic acid fragment further containing the base sequence of the second exon of BoLA-DQA1 is amplified. When amplification reactions are performed twice or more in this way, the primers used in each amplification reaction may be designed at the same position, or may be designed inside the position of the primer in the first amplification. it can.

ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１のＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するために２回増幅反応を行う場合のプライマーセットの例としては、限定するものではないが、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応において以下の（ａ）のプライマーセットを用い、増幅された核酸断片を鋳型とした増幅反応において以下の（ｂ）のプライマーセットを用いることができる：
（ａ）配列番号２７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号２９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示す塩基配列からなるプライマー。 An example of a primer set for performing amplification reaction twice to detect DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele of BoLA-DQA1 is not limited, but genomic DNA derived from a test cow is used as a template. In the amplification reaction, the following primer set (a) can be used, and in the amplification reaction using the amplified nucleic acid fragment as a template, the following primer set (b) can be used:
(A) A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28 (b) A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30.

上述のようにして、被験ウシに由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンの塩基配列を含む核酸断片を特異的に増幅することができる。   As described above, a nucleic acid fragment containing the base sequence of the second exon of BoLA-DQA1 can be specifically amplified using genomic DNA derived from the test cow as a template.

続いて、増幅した核酸断片の塩基配列を決定し、決定した塩基配列と、既知のＤＱＡ１＊１２０１アリルの塩基配列（配列番号１及び３）又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの塩基配列（配列番号５）とを比較する。これにより、被験ウシのＢｏＬＡ−ＤＱＡ１がＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するかを決定することができる。 Subsequently, the base sequence of the amplified nucleic acid fragment was determined, and the determined base sequence and the known DQA1 * 1201 allele base sequence (SEQ ID NOs: 1 and 3) or DQA1 * 0101 allele base sequence (SEQ ID NO: 5) Compare Thereby, it can be determined whether BoLA-DQA1 of a test cow has DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele.

配列決定法は当技術分野で周知であり、任意の方法を使用することができる。例えば限定されるものではないが、増幅した核酸断片をベクターにクローニングすることなく配列を決定することができるダイレクト・シーケンス法が挙げられる。かかる配列決定法は、市販のキット、例えばCEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ABI310（Applied Biosystems）などを用いて簡便に行うことができる。 Sequencing methods are well known in the art and any method can be used. Examples include, but are not limited to, a direct sequence method capable of determining a sequence without cloning an amplified nucleic acid fragment into a vector. Such a sequencing method can be easily performed using a commercially available kit such as CEQ ™ DTCS Quick Start Kit (BECKMAN), BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ABI310 (Applied Biosystems) and the like.

ダイレクト・シーケンス法を行う場合には、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを特異的に配列決定することが可能なプライマーを用いることが好ましい。   When performing the direct sequencing method, it is preferable to use a primer capable of specifically sequencing the second exon of BoLA-DQA1.

本発明の方法において、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンの塩基配列を決定するために使用可能なプライマーとしては、限定するものではないが、以下の（ｃ）のプライマーセットが挙げられる：
（ｃ）配列番号３１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３２に示す塩基配列からなるプライマー
5’-ACA ATG TTT GAT AGT CAA TTT C-3’（配列番号３１）
5’-GGG RAC ACA TAC TGT TGG TAG-3’（配列番号３２）
（配列中、ＲはＡ又はＧを表す）。 In the method of the present invention, primers that can be used to determine the base sequence of the BoLA-DQA1 second exon include, but are not limited to, the following primer set (c):
(C) A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32
5'-ACA ATG TTT GAT AGT CAA TTT C-3 '(SEQ ID NO: 31)
5'-GGG RAC ACA TAC TGT TGG TAG-3 '(SEQ ID NO: 32)
(In the sequence, R represents A or G).

核酸断片の塩基配列（すなわち第２エクソンの塩基配列）を決定した後、その塩基配列と、ＤＱＡ１＊１２０１アリルの塩基配列（配列番号１及び３）又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの塩基配列（配列番号５）を比較する。 After determining the nucleotide sequence of the nucleic acid fragment (that is, the nucleotide sequence of the second exon), the nucleotide sequence and the nucleotide sequence of DQA1 * 1201 allele (SEQ ID NOs: 1 and 3) or the nucleotide sequence of DQA1 * 0101 allele (SEQ ID NO: 5) ).

（２−２）ＰＣＲ法
ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルは、ＰＣＲ法を利用して検出することもできる。ＰＣＲは、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有する配列又は他のアリルを有する配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを利用して行う。そのＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリル用及びその他のアリル用の両方のプライマーセットを使用して被験ウシ由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅する。ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、被験ウシはＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルをホモで有し、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリル用プライマーと他のアリル用プライマーからのＰＣＲ産物が生成された場合には、被験ウシはＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルをヘテロで有することになる。他のアリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、被験ウシはＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有しない。 (2-2) PCR method DQA1 * 1201 allyl or DQA1 * 0101 allyl can also be detected using the PCR method. PCR is performed using oligonucleotide primers that hybridize only to sequences with DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele or sequences with other alleles. The DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele and other allele primer sets are used to amplify genomic DNA or mRNA derived from the test cow. If only DQA1 * 1201 allyl or DQA1 * 0101 allele primer produces a PCR product, the test cow has a DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele homologous, for DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele If PCR products are generated from primers and other allele primers, the test cow will have DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele in heterogeneity. If only the other allele primer produces a PCR product, the test cow does not have DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele.

（２−３）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルは、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。まず、検出対象のＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域をＰＣＲで増幅する。続いてこのＰＣＲ産物を、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルに独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたＰＣＲ産物は、一般的にはゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化する。断片の長さを、分子量マーカー、並びに他のアリル及びＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの対照により生じた断片の長さと比較することによって、被験ウシにおけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することができる。 (2-3) PCR-RFLP method DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele can also be detected using restriction fragment length polymorphism (RFLP). First, a region containing DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele to be detected is amplified by PCR. The PCR product is then cleaved with a restriction enzyme known to produce fragments of a length unique to DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele. PCR products digested with restriction enzymes are generally separated by gel electrophoresis and visualized by ethidium bromide staining. By comparing the length of the fragment with the molecular weight marker and the length of the fragment produced by the other allyl and DQA1 * 1201 allyl or DQA1 * 0101 allyl controls, the DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele in the test cow Can be detected.

（２−４）ハイブリダイゼーション法
ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルは、ハイブリダイゼーションを利用して検出することもできる。ハイブリダイゼーション法は、被験ウシ由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡが、それに対し相補的なＤＮＡ分子（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする能力に基づいて、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの有無を決定する方法である。ハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。 (2-4) Hybridization method DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele can also be detected using hybridization. The hybridization method determines the presence or absence of DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele based on the ability of genomic DNA or mRNA derived from the test cow to hybridize to a complementary DNA molecule (eg, oligonucleotide probe) thereto. It is a method to do. This hybridization method can be performed using various techniques for hybridization and detection.

プローブが検出対象のＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルに対しハイブリダイズしたか否かは、その結合したプローブを可視化することにより直接検出することができる。これは、例えば、ノーザン又はサザンアッセイとして知られている（例えば、Ausabel et al. (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1991)参照）。サザンアッセイの場合にはゲノムＤＮＡを、ノーザンアッセイの場合にはＲＮＡを被験ウシから単離する。続いて、単離したＤＮＡ又はＲＮＡを、一連の制限酵素群で切断する。次に、ＤＮＡ又はＲＮＡを分離し、膜に転写する。この分離操作は、例えばアガロースゲル上で行うことができる。膜への転写は、標識化プローブ、又は検出対象のＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルに特異的なプローブを、好適なストリンジェンシー条件下で膜に転写して行う。標識は、例えば放射性ヌクレオチドを導入することにより行うことができる。未結合のプローブを除去した後、標識化プローブを可視化することにより、結合の存在を検出することができ、その結合の有無により、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するか否かについて判断しうる。 Whether the probe is hybridized to DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele to be detected can be directly detected by visualizing the bound probe. This is known, for example, as the Northern or Southern assay (see, eg, Ausabel et al. (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1991)). For the Southern assay, genomic DNA is isolated from the test cow, and for the Northern assay, RNA is isolated. Subsequently, the isolated DNA or RNA is cleaved with a series of restriction enzymes. Next, DNA or RNA is separated and transferred to a membrane. This separation operation can be performed, for example, on an agarose gel. The transfer to the membrane is performed by transferring a labeled probe or a probe specific to DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele to be detected to the membrane under suitable stringency conditions. Labeling can be performed, for example, by introducing radioactive nucleotides. After removing the unbound probe, the labeled probe can be visualized to detect the presence of the binding, and whether or not it has DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele is determined by the presence or absence of the binding. Yes.

あるいは、ハイブリダイゼーションはＤＮＡチップを利用して検出することもできる。この方法においては、オリゴヌクレオチドプローブを固相支持体に貼り付ける。このプローブは、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルに特異的なものとなるように設計する。被験ウシ由来のＤＮＡサンプルをＤＮＡチップと接触させ、ハイブリダイゼーションを検出する。 Alternatively, hybridization can be detected using a DNA chip. In this method, an oligonucleotide probe is attached to a solid support. This probe is designed to be specific for DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele. A DNA sample derived from a test cow is brought into contact with a DNA chip, and hybridization is detected.

（２−５）タンパク質レベルでの検出
本発明の方法においては、タンパク質レベルでＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することも可能である。具体的には、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するＤＱ分子のα鎖を特異的に認識することができる抗体を用いることにより、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することができる。 (2-5) Detection at the protein level In the method of the present invention, it is also possible to detect DQA1 * 1201 allyl or DQA1 * 0101 allyl at the protein level. Specifically, DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele can be detected by using an antibody that can specifically recognize the α chain of DQ molecule having DQA1 * 1201 allyl or DQA1 * 0101 allele. it can.

ＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するＤＱ分子のα鎖を特異的に認識することができる抗体は、配列番号１２に示すアミノ酸配列において、７５番目のアミノ酸残基を含み、かつ少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、好ましくは６〜１０個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として動物の免疫に用いることにより、作製することができる。 An antibody capable of specifically recognizing the α chain of a DQ molecule having DQA1 * 0101 allele comprises the 75th amino acid residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and has at least 5 consecutive amino acid residues. It can be prepared by using a group, preferably a peptide consisting of 6 to 10 consecutive amino acid residues, as an antigen for immunization of animals.

抗体の作製方法、及び抗体を用いたＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを有するＤＱ分子のα鎖の検出方法は、当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。 A method for producing an antibody and a method for detecting an α chain of a DQ molecule having DQA1 * 1201 allyl or DQA1 * 0101 allyl using the antibody can be performed using methods known in the art.

（３）ウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性の判定
ＤＱＡ１＊１２０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ***炎に対する発症抵抗性を有する可能性を示し、ＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ***炎に対する発症感受性を有する可能性を示すものである。このＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在は、ホモ又はヘテロのいずれでもよい。 (3) Determination of onset resistance or susceptibility to bovine mastitis The presence of DQA1 * 1201 allele indicates that the test cow may have onset resistance to bovine mastitis, and the presence of DQA1 * 0101 allele This indicates the possibility that cattle are susceptible to the onset of bovine mastitis. The presence of this DQA1 * 1201 allyl or DQA1 * 0101 allyl may be either homo or hetero.

２．キット
本発明のキットは、ウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定するために用いることができ、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段を含むものである。 2. Kits The kits of the present invention can be used to determine onset resistance or susceptibility to bovine mastitis and provide a means for detecting DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele in bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain. Is included.

ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段としては、例えば限定されるものではないが、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域を増幅することができるプライマー、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含む領域を配列決定することができるプライマー、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルに特異的に結合することができるプライマー又はプローブ、ＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを含むＢｏＬＡ−ＤＱ分子に対して特異的に結合することができる抗体、などが含まれる。 As a means for detecting DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele in bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain, for example, without limitation, a region containing DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele is amplified. primers capable, DQAl * 1201 allyl or DQAl * 0101 primer capable of sequencing the region containing the allyl, DQAl * 1201 allyl or DQAl * 0101 allyl capable of specifically binding a primer or probe, DQAl * Antibodies capable of specifically binding to BoLA-DQ molecules including 1201 allele or DQA1 * 0101 allele are included.

ＰＣＲ−ＳＢＴ法によりＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する場合には、本発明のキットは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを増幅するためのプライマーセットとして、以下の（ａ）又は（ｂ）の少なくとも１つのプライマーセットを含むことが好ましく、また、（ａ）及び（ｂ）の両方のプライマーセットを含むことがさらに好ましい：
（ａ）配列番号２７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示す塩基配列からなるプライマー
（ｂ）配列番号２９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示す塩基配列からなるプライマー。
さらに本発明のキットは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソンを配列決定するためのプライマーセットとして、以下の（ｃ）のプライマーセットを含むことが好ましい：
（ｃ）配列番号３１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３２に示す塩基配列からなるプライマー。 In the case of detecting DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele by PCR-SBT method, the kit of the present invention is used as a primer set for amplifying the second exon of BoLA-DQA1 as the following (a) or ( It is preferred to include at least one primer set of b), and more preferred to include both (a) and (b) primer sets:
(A) A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28 (b) A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30.
Furthermore, the kit of the present invention preferably contains the following primer set (c) as a primer set for sequencing the second exon of BoLA-DQA1:
(C) A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32.

本発明のキットは、特定のアリルを検出する手段のほか、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（ポリメラーゼなど）などを含んでもよい。   The kit of the present invention may further include a buffer constituting the reaction solution, a dNTP mixture, enzymes (such as a polymerase) and the like in addition to the means for detecting a specific allyl.

３．ウシ***炎に対する発症抵抗性を有するウシの作出
上述のように、ＤＱＡ１＊１２０１アリルを検出することにより、ウシ***炎に対する発症抵抗性を判定することができるため、この判定結果を利用して、ウシ***炎に対する発症抵抗性を有するウシを作出することができる。 3. Production of cattle with onset resistance to bovine mastitis As described above, the onset resistance to bovine mastitis can be determined by detecting DQA1 * 1201 allele. Cattle that are resistant to onset of bovine mastitis can be produced.

例えば、ウシの受精卵においてＤＱＡ１＊１２０１アリルを検出し、ＤＱＡ１＊１２０１アリルを有する受精卵を選択して雌ウシの子宮に移植することによって、ウシ***炎に対する発症抵抗性を有するウシを作出することができる。また、ウシ***炎に対する発症抵抗性を有すると判定された雄ウシ及び雌ウシ由来の***及び卵子を用いることによって、ウシ***炎に対する発症抵抗性を有するウシを作出することも可能である。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 For example, DQA1 * 1201 allele is detected in a fertilized bovine egg, and a fertilized egg having DQA1 * 1201 allele is selected and transplanted to the uterus of a cow, thereby producing a cow having resistance to onset of bovine mastitis. be able to. It is also possible to produce cattle that are resistant to onset of bovine mastitis by using sperm and eggs derived from bulls and cows that have been determined to have onset resistance to bovine mastitis.
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to these Examples.

本実施例においては、ウシのＤＱＡ１アリルを検出した。
（１）供試ウシ血液
千葉県下の４地区に飼育されている乳牛（ホルスタイン種）について、採血前に各個体の***の望診と触診による臨床診断、並びに乳汁の培養と染色による細菌同定検査によって***炎と判断された発症ウシ１９５頭を用いた。各個体の尾静脈より凝固防止剤を用いて採血されたものを供試血液とした。供試血液はＤＮＡを抽出するまで−２０℃で冷凍保存した。
対照群として、全国から無作為に抽出したウシ１０５頭（ホルスタイン種）のＤＮＡを家畜改良事業団から分与された。 In this example, bovine DQA1 allele was detected.
(1) Test bovine blood For dairy cows (Holstein) bred in four districts under Chiba Prefecture, clinical diagnosis by clinical examination and palpation of each individual breast before blood collection, and bacterial identification test by milk culture and staining 195 onset cattle determined to have mastitis by The blood sampled from the tail vein of each individual using an anticoagulant was used as test blood. The test blood was stored frozen at −20 ° C. until DNA was extracted.
As a control group, DNA of 105 cattle (Holstein) randomly extracted from the whole country was distributed from the Livestock Improvement Corporation.

（２）ＤＮＡ抽出
ＤＮＡ抽出は、凍結血液（１ｍｌ）より、Blood Cell Lysis Buffer（ｐＨ７．５）を用いて有核細胞を選別し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ−バッファー（ｐＨ８．０）、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）、１０％ＳＤＳ混合液によるタンパク質分解、並びにフェノール・クロロホルム法によるタンパク質除去を行い、エタノール塩析法によって、ゲノムＤＮＡを抽出及び精製した。ＤＮＡの濃度及び純度は分光高度計により測定した。その後、４℃で保存した。 (2) DNA extraction For DNA extraction, nucleated cells were selected from frozen blood (1 ml) using Blood Cell Lysis Buffer (pH 7.5), Tris-EDTA-buffer (pH 8.0), proteinase K (10 mg). / Ml) Proteolysis with 10% SDS mixed solution and protein removal by phenol / chloroform method were performed, and genomic DNA was extracted and purified by ethanol salting-out method. The concentration and purity of DNA were measured with a spectrophotometer. Thereafter, it was stored at 4 ° C.

（３）遺伝子のタイピング法
***炎発症ウシ及び対照群のウシのＢｏＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子を、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１ ＰＣＲ−ＳＢＴ法（特許文献３）を用いてタイピングした。
（３−１）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１ １ｓｔＰＣＲ
１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び１．２５ユニットのｒＴａｑ ＤＮＡ伸長酵素（TOYOBO）、１μｌのゲノムを含む２５μｌの1×rTaq緩衝液を９４℃で２分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６０℃で２０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして１５サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１第２エクソンをＰＣＲ法により特異的に増幅できる配列番号２７及び２８を用いた。 (3) Gene typing method BoLA-DQA1 gene of bovine mastitis and control bovine was typed using BoLA-DQA1 PCR-SBT method (Patent Document 3).
(3-1) BoLA-DQA1 1st PCR
Denaturation of 25 μl of 1 × rTaq buffer containing 120 μM of each dNTP, 1.5 mM MgCl 2 , 400 nM primer, and 1.25 units of rTaq DNA elongation enzyme (TOYOBO), 1 μl of genome at 94 ° C. for 2 minutes After the treatment, the treatment at 94 ° C. for 20 seconds; 60 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 40 seconds was treated as one cycle, followed by 15 cycles of treatment, followed by extension at 72 ° C. for 4 minutes. As the primers, SEQ ID NOs: 27 and 28 capable of specifically amplifying BoLA-DQA1 exon 2 by PCR were used.

（３−２）ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１ ２ｎｄＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲ産物のうち１μｌを１２０μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００ｎＭのプライマー、及び０．５ユニットのAmpliTaq Gold TM DNA伸長酵素（Applied Biosystems）を含む２４μｌのGene AmpR Gold緩衝液を９５℃で１０分間の変性処理後、９４℃で２０秒；６０℃で２０秒、及び７２℃で４０秒の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理の後、７２℃で４分間伸長させた。プライマーは、さらに内側を特異的に増幅できる配列番号２９及び３０を用いた。これによって、３５５ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ＰＣＲ産物をエチヂウムブロマイド入り２％アガロースゲルで電気泳動をして、ＤＮＡが増幅されているか確認した。 (3-2) BoLA-DQA1 2ndPCR
1 μl of 1st PCR product is 95 μg with 24 μl Gene Amp R Gold buffer containing 120 μM of each dNTP, 1.5 mM MgCl 2 , 400 nM primer, and 0.5 units of AmpliTaq Gold ™ DNA extension enzyme (Applied Biosystems). After denaturation treatment at 10 ° C. for 10 minutes, treatment at 94 ° C. for 20 seconds; treatment at 60 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 40 seconds was followed by 30 cycles of treatment, followed by extension at 72 ° C. for 4 minutes. As primers, SEQ ID NOs: 29 and 30 that can specifically amplify the inside were used. As a result, a 355 bp DNA fragment was obtained. The PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel containing ethidium bromide to confirm whether the DNA was amplified.

（３−３）ダイレクト・シーケンス法
シーケンスプライマーとして配列番号３１及び３２を用いた。CEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）をシーケンス反応に用いた。１μｌのＰＣＲ産物、２μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー、４μｌのDTCS Quick Start Mix（BECKMAN）、４μｌの2.5×Sequencing Buffer（Edge Biosystems）、及び滅菌水９μｌを混和し、９５℃で２０秒；５０℃で２０秒；６０℃で４分間の処理を１サイクルとして３０サイクルの処理を行った。シーケンスＰＣＲ産物は、説明書に従ってCENTRI-SEP COLUMNS（PRINCETON SEPARATIONS）を用いて精製し、その後CEQTM 2000XL DNA Analysis Systemシーケンサー（BECKMAN COULTER）用のSample Loading Solution（BECKMAN）２０μｌに溶解し、CEQTM2000XL DNA Analysis System（BECKMAN COULTER）でシーケンスを行った。決定された塩基配列からプライマー部位を除去し、National Center for Biotechnology Information上のホモロジー検索プログラム、ＢＬＡＳＴを使用してアリルの塩基配列をデータベースに登録されている塩基配列と照合し、アリルを決定した。
その結果、全てのサンプルにおいてＤＱＡ１の増幅が確認できた。また、図２に示すようなアリルが検出された。 (3-3) Direct Sequence Method SEQ ID NOS: 31 and 32 were used as sequence primers. CEQ ™ DTCS Quick Start Kit (BECKMAN) was used for the sequencing reaction. Mix 1 μl PCR product, 2 μl 10 pmol / μl primer, 4 μl DTCS Quick Start Mix (BECKMAN), 4 μl 2.5 × Sequencing Buffer (Edge Biosystems), and 9 μl sterile water, 95 ° C. for 20 seconds; 20 seconds; 30 cycles of treatment at 60 ° C. for 4 minutes. Sequence PCR products were purified using CENTRI-SEP COLUMNS (PRINCETON SEPARATIONS) according to the instructions, then dissolved in 20 μl of Sample Loading Solution (BECKMAN) for CEQ TM 2000XL DNA Analysis System sequencer (BECKMAN COULTER), and CEQ TM 2000XL Sequencing was performed with DNA Analysis System (BECKMAN COULTER). The primer site was removed from the determined base sequence, and the allele base sequence was collated with the base sequence registered in the database using the homology search program on the National Center for Biotechnology Information, BLAST, to determine the allele.
As a result, amplification of DQA1 was confirmed in all samples. Moreover, allyl as shown in FIG. 2 was detected.

本実施例においては、ウシが有するアリルの比較を行った。実施例１の結果、***炎発症ウシ１９５頭及び対照群のウシ１０５頭のアリルの検出に成功し、ＤＱＡ１の既知アリル３１種類のうち、***炎発症ウシで１２種類、対照群のウシでも１２種類が検出された（図２）。これらの２つの群に特異的なアリルが２種類ずつ見出された（図２中下線で示す）。   In this example, allyls in cattle were compared. As a result of Example 1, alleles of 195 mastitis-causing cows and 105 control cows were successfully detected. Of 31 known alleles of DQA1, 12 kinds of mastitis-causing cows and 12 cows of the control group The type was detected (Figure 2). Two types of alleles specific to these two groups were found (indicated by the underline in FIG. 2).

続いて、検出されたアリルの頻度を、***炎発症ウシと対照群のウシとで比較した（図３）。その結果、ＤＱＡ１＊１２０１アリル及びＤＱＡ１＊１２０３アリルが、対照群のウシと比較して***炎発症ウシにおいて有意に低下していることが明らかとなった（図３）。特に、ＤＱＡ１＊１２０１アリルの頻度は強い相関が見られた（ｐ＝０．００９）。 Subsequently, the frequency of alleles detected was compared between cows with mastitis and control cows (FIG. 3). As a result, it was revealed that DQA1 * 1201 allyl and DQA1 * 1203 allyl were significantly decreased in mastitis-causing cows as compared to control cows (FIG. 3). In particular, a strong correlation was observed between the frequencies of DQA1 * 1201 allele (p = 0.0099).

次に、検出された全てのＤＱＡ１アリルについて、そのアリルをホモ又はヘテロで有する個体の頻度を、***発症ウシと対照群のウシとで比較した（図４）。その結果、ＤＱＡ１＊０１０１アリルを有する個体は、対照群のウシよりも***発症ウシにおいて有意に高く（ｐ＝０．０３）、ＤＱＡ１＊０１０１アリルが***炎に対して感受性アリルである可能性が示された（図４）。また、ＤＱＡ１＊１２０１アリルを有する個体の頻度は対照群のウシで有意に高く（ｐ＝０．０１６）、ＤＱＡ１＊１２０１アリルが***炎に対する抵抗性アリルである可能性が示された（図４）。 Next, for all DQA1 alleles detected, the frequency of individuals having the allele homozygous or heterozygous was compared between the breast-onset cattle and the control cattle (FIG. 4). As a result, individuals with DQA1 * 0101 allele were significantly higher in breast-onset cattle than in control cows (p = 0.03), and DQA1 * 0101 allele may be an allele susceptible to mastitis (Figure 4). In addition, the frequency of individuals having DQA1 * 1201 allele was significantly higher in the control bovine (p = 0.016), indicating that DQA1 * 1201 allele may be a resistant allele against mastitis (FIG. 4). ).

本発明により、ウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性の判定方法が提供される。該方法は、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル又はＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在を検出することにより、被験ウシの発症抵抗性又は感受性を簡便かつ迅速に判定することができるため、ウシの***炎発症機構の研究、ウシ***炎に対する発症抵抗性を有するウシの作出などに有用である。 The present invention provides a method for determining the onset resistance or susceptibility to bovine mastitis. This method can easily and rapidly determine the onset resistance or sensitivity of a test cow by detecting the presence of DQA1 * 1201 allele or DQA1 * 0101 allele in the bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain. It is useful for the study of the onset mechanism of bovine mastitis, the production of bovines that are resistant to onset of bovine mastitis, and the like.

ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子の代表的なアリルの塩基配列を示す。A representative allele base sequence of the DQA1 gene encoding the bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain is shown. ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子の代表的なアリルの塩基配列を示す。A representative allele base sequence of the DQA1 gene encoding the bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain is shown. ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子の代表的なアリルの塩基配列を示す。A representative allele base sequence of the DQA1 gene encoding the bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain is shown. ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子の代表的なアリルのアミノ酸配列とそのアライメントを示す。The amino acid sequence of a representative allele of the DQA1 gene encoding the bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain and its alignment are shown. 対照群のウシ及び***炎発症ウシにおけるＤＱＡ１アリルの分布を示す。The distribution of DQA1 allele in control cows and mastitis-causing cows is shown. 対照群のウシ及び***炎発症ウシにおける各ＤＱＡ１アリルの存在頻度を示す。The frequency of each DQA1 allele in the control group cow and the mastitis-causing cow is shown. 対照群のウシ及び***炎発症ウシにおける各ＤＱＡ１アリルを有する個体の頻度を示す。The frequency of individuals with each DQA1 allele in control cows and mastitis cows is shown.

配列番号２７〜３２：プライマー（配列中、ＲはＡ又はＧを表す）   SEQ ID NOs: 27 to 32: Primer (wherein R represents A or G)

Claims (9)

被験ウシにおいて、ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子におけるＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出することを含む、被験ウシにおけるウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定する方法。 In a test cow, resistance to susceptibility or susceptibility to bovine mastitis in a test cow comprising detecting DQA1 * 1201 allele and / or DQA1 * 0101 allele in a DQA1 gene encoding a bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain How to judge. 被験ウシにおけるウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定する方法であって、
（ａ）被験ウシからゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製するステップ、
（ｂ）ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出するステップ、
を含み、ＤＱＡ１＊１２０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ***炎に対する発症抵抗性を有することを示し、ＤＱＡ１＊０１０１アリルの存在は、該被験ウシがウシ***炎に対する発症感受性を有することを示すものである、上記方法。 A method for determining onset resistance or susceptibility to bovine mastitis in a test cow, comprising:
(A) preparing genomic DNA or mRNA from the test cow;
(B) detecting DQA1 * 1201 allele and / or DQA1 * 0101 allele of DQA1 gene encoding bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain in genomic DNA or mRNA;
The presence of DQA1 * 1201 allele indicates that the test cow is resistant to onset of bovine mastitis, and the presence of DQA1 * 0101 allele indicates that the test cow is susceptible to onset of bovine mastitis. The method described above. ステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応−塩基配列に基づくタイピング法（ＰＣＲ−ＳＢＴ）により行われる、請求項２記載の方法。   The method according to claim 2, wherein step (b) is performed by polymerase chain reaction-base sequence-based typing method (PCR-SBT). ステップ（ｂ）が、
（ｂ１）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、又は
（ｂ２）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーを用いた増幅反応を行うステップ、
あるいは（ｂ１）及び（ｂ２）の両方のステップを含む、請求項２又は３記載の方法。 Step (b)
(B1) performing an amplification reaction using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28, or (b2) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 And performing an amplification reaction using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30;
4. The method according to claim 2 or 3, comprising both steps (b1) and (b2). ステップ（ｂ）が、
（ｂ３）得られた増幅産物の塩基配列を決定するステップ、
をさらに含む、請求項４記載の方法。 Step (b)
(B3) determining the base sequence of the amplification product obtained;
The method of claim 4, further comprising: 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を用いてウシ***炎に対する発症抵抗性を有すると判定されたウシを用いてウシを作出することを特徴とする、ウシ***炎に対する発症抵抗性を有するウシの作出方法。   Onset resistance against bovine mastitis, comprising producing a cow using a cow determined to have onset resistance to bovine mastitis using the method according to any one of claims 1 to 5. A method for producing a bovine having sex. ウシ主要組織適合抗原ＤＱ分子α鎖をコードするＤＱＡ１遺伝子のＤＱＡ１＊１２０１アリル及び／又はＤＱＡ１＊０１０１アリルを検出する手段を含むことを特徴とする、ウシ***炎に対する発症抵抗性又は感受性を判定するためのキット。 Determine the onset resistance or susceptibility to bovine mastitis, comprising means for detecting DQA1 * 1201 allele and / or DQA1 * 0101 allele of the DQA1 gene encoding the bovine major histocompatibility antigen DQ molecule α chain Kit for. ＤＱＡ１遺伝子の第２エクソンを増幅するためのプライマー、及び／又はＤＱＡ１遺伝子の第２エクソンを配列決定するためのプライマーを含む、請求項７記載のキット。   The kit according to claim 7, comprising a primer for amplifying the second exon of the DQA1 gene and / or a primer for sequencing the second exon of the DQA1 gene. （ａ）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマー、並びに／又は
（ｂ）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマー
を含む、請求項７又は８記載のキット。 (A) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28, and / or (b) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 The kit of Claim 7 or 8 containing the primer which consists of a base sequence.
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