JP2007292481A - Antifungal property evaluation method - Google Patents
Antifungal property evaluation method Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007292481A JP2007292481A JP2006117567A JP2006117567A JP2007292481A JP 2007292481 A JP2007292481 A JP 2007292481A JP 2006117567 A JP2006117567 A JP 2006117567A JP 2006117567 A JP2006117567 A JP 2006117567A JP 2007292481 A JP2007292481 A JP 2007292481A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antifungal
- antifungal agent
- nail
- nail sample
- composition containing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、抗真菌剤又はこれを含む組成物の抗真菌性評価方法に関し、更に詳細には、特に爪真菌症に対する抗真菌剤またはこれを含む組成物の抗真菌性評価方法に関する。 The present invention relates to an antifungal evaluation method for an antifungal agent or a composition containing the same, and more particularly to an antifungal evaluation method for an antifungal agent or a composition containing the antifungal agent particularly against onychomycosis.
爪真菌症は、白癬菌によって引き起こされる、爪の混濁、肥厚、および変形などを来たす真菌感染症であり、難治性の疾患として知られている。この爪真菌症の治療法として、外用剤または経口剤による治療が行われているが、経口剤による治療は副作用や薬物相互作用の問題があり、治療できない患者も多く、そのような患者に対しては、外用剤による治療が行われている。 Onychomycosis is a fungal infection caused by ringworm fungus that causes nail turbidity, thickening, and deformation, and is known as an intractable disease. As a treatment method for this onychomycosis, treatment with an external preparation or an oral preparation is carried out. However, treatment with an oral preparation has problems of side effects and drug interactions, and there are many patients who cannot be treated. In some cases, treatment with an external preparation is performed.
しかしながら、爪甲は皮膚角質層に比べ薬物透過性に影響を与える脂質成分の含有量が著しく少ない等の特殊性を有しているため、爪真菌症に対する外用剤を評価する方法は、かかる爪の特殊性を考慮しなければ、適切に評価することが困難である。したがって、この様な爪の特殊性に鑑み、爪の真菌症用の抗真菌剤の評価法がいくつか提案されている。 However, since the nail plate has special properties such as the content of lipid components that affect drug permeability significantly lower than the skin stratum corneum, the method for evaluating external preparations for onychomycosis is It is difficult to evaluate appropriately without considering the special characteristics. Therefore, in view of such peculiarities of nails, several methods for evaluating antifungal agents for nail mycosis have been proposed.
例えば、真菌を接種した平板培地上に、これに接して爪試料を配置し、該爪の非接面に、平板培地上に漏れることなく抗真菌剤を含有する組成物をチャージし、爪と培地間の真菌の生育状況を指標とし、抗真菌剤を評価する方法が報告されている（特許文献１）。この方法によれば、爪真菌症の実態に即したものとなっているものの、評価に当たっては、抗真菌剤の薬効を、真菌の生育状況についてスコア化したり、爪と接する部分の培地の透過度を測定することによって評価するものであるため、客観的な定量性があるとはいい難く、また、わずかな薬効の差異を判別しづらいものであった。 For example, a nail sample is placed in contact with a plate medium inoculated with a fungus, and a non-contact surface of the nail is charged with a composition containing an antifungal agent without leaking onto the plate medium. A method for evaluating antifungal agents using the growth of fungi between the media as an index has been reported (Patent Document 1). According to this method, although it is in line with the actual condition of onychomycosis, the evaluation is based on scoring the efficacy of the antifungal agent with respect to the growth status of the fungus or the permeability of the medium in contact with the nail Therefore, it was difficult to say that there was objective quantitativeness, and it was difficult to discriminate slight differences in drug efficacy.
また、真菌で感染させ、抗真菌剤を含む組成物で処置した爪を削り取り、これを細片と為した後、平板培地へ移植、培養し、生育する菌の密度を指標とすることを特徴とする、爪用の抗真菌剤及び／又は爪真菌症用の医薬組成物の評価法が報告されている（特許文献２）。しかしながら、この方法においても、真菌の生育を目視により評価するものであるため、客観的な定量性がある方法とはいえなかった。 In addition, the nail treated with a fungus and scraped with a composition containing an antifungal agent is scraped off, made into small pieces, transplanted and cultured on a flat plate medium, and the density of the growing fungus is used as an index. An evaluation method of an antifungal agent for nail and / or a pharmaceutical composition for onychomycosis has been reported (Patent Document 2). However, even in this method, since the fungal growth is visually evaluated, it cannot be said that the method has objective quantitativeness.
このように、爪真菌症に対する抗真菌剤あるいはこれを含有する組成物の抗真菌効果を正確に評価しうる方法がないというのが実情であった。
従って、爪真菌症の実態に即し、客観的な定量性をもって評価できる爪用抗真菌剤又は爪用抗真菌剤を含む組成物の評価方法の開発が求められており、本発明はこのような爪用抗真菌剤又は爪用抗真菌剤を含む組成物を、爪真菌症の実態に即し、かつ客観的で定量性をもってその抗真菌性を評価する方法を提供することを課題とする。 Therefore, development of an evaluation method for an antifungal agent for nail or a composition containing an antifungal agent for nail that can be evaluated with objective quantitativeness in accordance with the actual state of onychomycosis is required. An object of the present invention is to provide a method for evaluating antifungal properties of an antifungal agent for nails or a composition containing an antifungal agent for nails in an objective and quantitative manner in accordance with the actual state of onychomycosis .
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、真菌を感染させた爪試料中に生存する真菌は、生体色素により染色可能であることに思い至った。そして、爪試料中に存在する生体色素量は、生存する真菌の数に比例するものであり、この色素量を指標とすることにより、爪真菌症の実態に即し、かつ客観的で定量性のある評価が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have come to realize that fungi that survive in nail samples infected with fungi can be stained with biological pigments. The amount of vital pigment present in the nail sample is proportional to the number of surviving fungi. By using this amount of pigment as an index, the amount of vital pigment is objective and quantitative. As a result, the present invention has been completed.
即ち、本発明は、爪試料に真菌を感染させた後、この爪試料に抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物を作用させ、ついで、当該爪試料を生体色素で処理した後、爪試料中の生体色素の量を測定することを特徴とする抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の抗真菌性評価方法を提供するものである。 That is, in the present invention, after a nail sample is infected with a fungus, an antifungal agent or a composition containing an antifungal agent is allowed to act on the nail sample, and then the nail sample is treated with a biological dye. It is intended to provide a method for evaluating antifungal properties of an antifungal agent or a composition containing an antifungal agent, characterized by measuring the amount of a living body pigment.
本発明の抗真菌性評価方法は、抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物を、爪真菌症の実態に即し、かつ客観的な定量性をもって評価することができるものである。 The antifungal evaluation method of the present invention can evaluate an antifungal agent or a composition containing an antifungal agent in accordance with the actual condition of onychomycosis and with objective quantitativeness.
また、本発明方法は、抗真菌剤又は抗真菌剤を含む組成物の爪への浸透性を、客観的な定量性をもって評価することができるものである。 Moreover, the method of this invention can evaluate the permeability to the nail | claw of the composition containing an antifungal agent or an antifungal agent with objective quantitative property.
さらに、本発明の評価方法は、爪真菌症に対する抗真菌剤の用量依存性についても、客観的かつ定量的に評価できるものである。 Furthermore, the evaluation method of the present invention can objectively and quantitatively evaluate the dose dependency of an antifungal agent against onychomycosis.
本発明の評価方法は、爪試料を真菌に感染させた後、この爪試料に抗真菌剤又はこれを含む組成物を作用させ、残存する真菌を生体色素により染色し、取り込まれた色素の量からその残存真菌数を評価する抗真菌性の評価方法である。 According to the evaluation method of the present invention, after a nail sample is infected with a fungus, an antifungal agent or a composition containing the same is allowed to act on the nail sample, the remaining fungus is stained with a living dye, and the amount of the incorporated dye Is an antifungal evaluation method for evaluating the number of remaining fungi.
本発明で用いる爪試料としては、一般に真菌が増殖する動物の爪であれば、特に制限無く使用でき、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、モルモット等の爪が例示できる。これらの爪は、真菌に非感染のものを爪試料として使用することができるが、予めＵＶ照射などにより生育している可能性のある真菌を殺菌して用いることが好ましい。また、爪試料は、定量的な評価を可能とするために、例えば、一定の直径及び厚みの円板状など、所定形状に加工して用いることが好ましい。 The nail sample used in the present invention can be used without particular limitation as long as it is an animal nail in which fungi generally grow, and examples thereof include humans, pigs, cows, guinea pigs and the like. As these nails, those not infected with fungi can be used as nail samples, but it is preferable to sterilize fungi that may have grown in advance by UV irradiation or the like. In addition, the nail sample is preferably used after being processed into a predetermined shape such as a disk shape having a constant diameter and thickness in order to enable quantitative evaluation.
次いで、上記爪試料に、真菌を感染させる。爪試料に対する真菌の感染方法は、特に限定されるものではないが、定量的な評価を可能とするため、例えば、真菌の分生子数を一定量に調整して接種した平板培地上に爪試料を載置し、一定期間培養する方法によって真菌に感染させることが望ましく、このような爪試料を、本発明で好ましく用いることができる。 The nail sample is then infected with fungi. The method for infecting the nail sample with the fungus is not particularly limited, but in order to enable quantitative evaluation, for example, the nail sample is inoculated on a plate medium inoculated with a fixed number of fungal conidia. It is desirable to infect a fungus by a method of placing and culturing for a certain period, and such a nail sample can be preferably used in the present invention.
爪試料に感染させる真菌は、通常爪に感染すると認められているものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans)などが例示できる。これらの真菌の爪試料への感染（接種）にあたっては、定量的な評価を可能とするため、真菌を予め他の液体培地で培養し、必要に応じて界面活性剤等を添加した燐酸緩衝生理食塩水などの分散媒を加え、分生子を分散媒中に分散させ、ガーゼなどで濾過して菌糸を除去して、分生子分散液とし、分生子数を、分散媒を加え調整して一定にした後、固化がまだ始まっていない平板培地に、この分生子を分散した液体培地を一定容量均一に混合させた平板培地を用いることが好ましく、こうすることにより、定量的な評価が行える。 The fungus that infects the nail sample is not particularly limited as long as it is normally recognized to infect the nail. For example, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes (Trichophyton) mentagrophytes) and Candida albicans. To infect (inoculate) these fungal nail samples, in order to enable quantitative evaluation, the fungus is cultured in advance in another liquid medium, and phosphate buffered physiology with surfactants added as necessary. Add a dispersion medium such as saline, disperse the conidia in the dispersion medium, filter with gauze to remove the mycelia, make a conidia dispersion, adjust the number of conidia by adding the dispersion medium, and keep it constant After that, it is preferable to use a plate medium in which a constant volume of the liquid medium in which the conidia are dispersed is mixed with a plate medium that has not yet solidified, whereby quantitative evaluation can be performed.
上記平板培地としては、平板を形成するものであれば特に限定されずに使用することができるが、真菌が爪のみを栄養源とできるように、他に栄養源となる物質を含まず、寒天を固化剤として用いた寒天培地を利用することが好ましい。また、この平板培地には、必要によりクロラムフェニコール等の抗生物質を添加することができる。 The above plate medium can be used without particular limitation as long as it forms a flat plate, but does not contain any other nutrient source substance and agar so that the fungus can only use the nail as a nutrient source. It is preferable to use an agar medium using as a solidifying agent. In addition, an antibiotic such as chloramphenicol can be added to the plate medium as necessary.
上記の爪試料に対する真菌の感染は、例えば、２７℃程度の温度条件で、７日間程度培養を行えばよく、感染が十分に行われたことは、例えば、爪試料周囲の菌の発育により判断することができる。 The above-mentioned infection of the fungus on the nail sample may be carried out, for example, by culturing for about 7 days under a temperature condition of about 27 ° C. can do.
このようにして、真菌で感染された爪試料に、次いで、抗真菌剤又はこれを含む組成物（以下、「抗真菌製剤」という）を作用させる。この作用させる抗真菌製剤の剤型は、外用剤として通常爪に用いられる剤型であれば特に限定されず、例えば、液剤、クリーム剤、軟膏剤として塗布したり、貼付け剤として貼付ける等により作用させることができる。 In this way, the antifungal agent or a composition containing the same (hereinafter referred to as “antifungal preparation”) is allowed to act on the nail sample infected with the fungus. The dosage form of the antifungal preparation to be acted on is not particularly limited as long as it is a dosage form usually used for nails as an external preparation. For example, it can be applied as a liquid, cream, ointment, or pasted as an adhesive. Can act.
爪試料に抗真菌製剤を作用させるに当たっては、抗真菌製剤と真菌を接種、培養した平板培地とが直接接触しないようにすることが、定量性ある評価のために好ましい。このためには、例えば、平板培地上に載置した爪試料上に、塗布等した抗真菌性剤が漏出しないよう、漏出防止壁を設けることが好ましい。このような漏出防止壁としては、例えば、ゴム、シリコンゴム、樹脂などでできたＯリングを、爪試料の上面に接着することが挙げられる。中でも、シリコンゴム製のＯリングが好ましい。Ｏリングを平板培地に接着する方法としては、Ｏリングの外周部に、シリコンボンドを厚く塗布して接着させると、爪用抗真菌製剤の漏出をより防止できる。 When an antifungal preparation is allowed to act on a nail sample, it is preferable for quantitative evaluation to prevent direct contact between the antifungal preparation and a plate medium inoculated and cultured with the fungus. For this purpose, for example, it is preferable to provide a leakage prevention wall on the nail sample placed on the flat plate medium so that the applied antifungal agent does not leak. As such a leakage preventing wall, for example, an O-ring made of rubber, silicon rubber, resin or the like is adhered to the upper surface of the nail sample. Of these, an O-ring made of silicon rubber is preferable. As a method for adhering the O-ring to the plate medium, leakage of the antifungal preparation for nails can be further prevented by applying a thick silicon bond to the outer periphery of the O-ring and adhering it.
上記のようにして、一定時間爪培地に抗真菌剤を作用させた後、爪試料から抗真菌製剤と付着した真菌を除去し、これを生体染料により染色する。 As described above, after an antifungal agent is allowed to act on the nail culture medium for a certain period of time, the antifungal preparation and the attached fungus are removed from the nail sample, and this is stained with a biological dye.
本発明で用いる生体色素は、真菌の生菌に取り込まれるものであれば、特に制限なく用いることができるが、好ましくはニュートラルレッドである。ニュートラルレッドは、水溶性色素で正常な原形質膜を通り生細胞のリソゾームに蓄積され、生細胞のみに取り込まれ、リソゾーム膜や原形質膜の損傷した細胞には取り込まれないという性質を有する。このため、抗真菌製剤の効果が高いほど、爪試料中のニュートラルレッドの取り込み量は少なくなるため、この取り込み量を測定することによって、抗真菌製剤の効果を定量的に評価することができる。 The biological pigment used in the present invention can be used without particular limitation as long as it can be taken in by viable fungi, but is preferably neutral red. Neutral red is a water-soluble dye that passes through the normal plasma membrane, accumulates in living cell lysosomes, is taken up only by living cells, and is not taken up by lysosomal membranes or cells damaged by the plasma membrane. For this reason, the higher the effect of the antifungal preparation, the smaller the amount of neutral red taken up in the nail sample. By measuring this amount of uptake, the effect of the antifungal preparation can be quantitatively evaluated.
上記生体色素により爪試料を染色した後、固定液によって、染色された真菌細胞を固定化する。固定液としては、例えば、ホルマリン・塩化カルシウム水溶液が例示できる。 After staining the nail sample with the biological dye, the stained fungal cells are immobilized with a fixing solution. Examples of the fixing solution include a formalin / calcium chloride aqueous solution.
このように染色され、上記固定液によって、固定化処理された爪試料は、次いで適切な抽出液により処理され、真菌内に取り込まれた生体色素が抽出される。この場合、添加する抽出液の量を一定とすることが定量的な測定のために便利ではある。また、抽出液としては、例えば、酸性エタノール溶液が例示できる。 The nail sample thus dyed and fixed with the fixing solution is then treated with an appropriate extraction solution to extract the vital pigment incorporated into the fungus. In this case, it is convenient for quantitative measurement to keep the amount of the extract to be added constant. Moreover, as an extract, an acidic ethanol solution can be illustrated, for example.
以上のようにして上記抽出液中に抽出された生体色素の量は、例えば、分光光度計を用いて吸光度を測定することによって、定量することができ、これから爪試料中の真菌数を求めることができる。 The amount of the vital pigment extracted into the extract as described above can be quantified, for example, by measuring the absorbance using a spectrophotometer, and from this, the number of fungi in the nail sample is obtained. Can do.
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がこれら実施例にのみ限定を受けないことは言うまでもない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but it goes without saying that the present invention is not limited only to these examples.
実施例１
１．爪試料の調製
直径５ｍｍの円板型に加工したヒトの爪に、シリコンゴム製Ｏリングを、Ｏリングの外周側にシリコンボンドを塗布し接着させた。これを、消毒用アルコールで洗浄した後、滅菌済みプラスティックシャーレに入れ、ＵＶ照射して滅菌して爪試料とした。
Example 1
1. Preparation of Nail Sample A silicon rubber O-ring was applied to a human nail processed into a disk shape having a diameter of 5 mm, and a silicon bond was applied to the outer peripheral side of the O-ring and adhered. This was washed with disinfecting alcohol, placed in a sterilized plastic petri dish, sterilized by UV irradiation to obtain a nail sample.
２．真菌の調製
Ｋ培地は、バクト・ペプトン０．１％、グルコース０．１％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１％、バクト・アガー１．５％となるように蒸留水に添加、攪拌後、オートクレーブで滅菌（１２０℃、１５分）し作製した。培地の温度が７０℃程度まで低下したら７５ｃｍ２培養フラスコに１００ｍｌずつ分注し、斜面平板培地を調製した。トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）（ＴＩＭＭ１１８９株）の分生子をＫ培地に播種し、２７℃で２週間培養した。この培養フラスコ内に１０ｍｌの０．０５％ツィーン８０を加えた生理食塩水を添加した。軽くピペッティングして分生子を遊離させた後、４重ガーゼで濾過し菌糸を除去した。３０００ｒｐｍ、５分間遠心で分生子を集め、０．０５％ツィーン８０−生理食塩水で３回洗浄し、４ｍｌの０．０５％ツィーン８０−生理食塩水に懸濁した。この懸濁液を血球計算板にて菌量を測定した。０．０５％ツィーン８０−生理食塩水で濃度が２×１０７個／ｍｌになるよう調整し、接種菌液とした。
2. Preparation K medium fungi, 0.1% Bacto-peptone, 0.1% glucose, KH 2 PO 4 0.1%, MgSO 4 · 7H 2 O0.1%, so as to be 1.5% Bacto agar The solution was added to distilled water, stirred, and then sterilized (120 ° C., 15 minutes) by an autoclave. When the temperature of the medium decreased to about 70 ° C., 100 ml each was dispensed into a 75 cm 2 culture flask to prepare a slanted plate medium. Conidia of Trichophyton mentagrophytes (TIMM1189 strain) were seeded in K medium and cultured at 27 ° C. for 2 weeks. 10 ml of physiological saline supplemented with 0.05% Tween 80 was added to the culture flask. The conidia was released by light pipetting, and then filtered through quadruple gauze to remove the mycelium. Conidia were collected by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes, washed 3 times with 0.05% Tween 80-saline, and suspended in 4 ml of 0.05% Tween 80-saline. The bacterial mass of this suspension was measured with a hemocytometer. 0.05% Tween 80-physiological saline was used to adjust the concentration to 2 × 10 7 cells / ml to obtain an inoculum.
３．平板培地の調製
バクト・アガー６．０ｇ、シクロヘキシミド２００ｍｇ、蒸留水４００ｍｌを加熱溶解した後、三角フラスコに２００ｍｌずつ２本に分注した。これをオートクレーブで１２０℃、１５分間滅菌し、ウォーターバスで５０℃に保温した。この寒天液２００ｍｌあたりに１００ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール２００μｌと５０ｍｇ／ｍｌ硫酸シソマイシン２００μｌを添加し、すばやく撹拌した。
3. Preparation of Plate Medium Bacto Aggar 6.0 g, cycloheximide 200 mg, and distilled water 400 ml were dissolved by heating, and then dispensed into two Erlenmeyer flasks in 200 ml portions. This was sterilized at 120 ° C. for 15 minutes in an autoclave and kept at 50 ° C. in a water bath. To 200 ml of this agar solution, 200 μl of 100 mg / ml chloramphenicol and 200 μl of 50 mg / ml sisomycin sulfate were added and stirred rapidly.
上記２．で調製した接種菌液を培地２００ｍｌあたり２ｍｌ添加し、すばやく撹拌した後、５０ｍｌずつシャーレに注ぎ、静置して固めた。陰性コントロールとして、菌液を含まない平板プレートを調製した。 2. 2 ml of the inoculum prepared in (2) per 200 ml of the medium was added and stirred rapidly, and then 50 ml was poured into a petri dish and allowed to stand to harden. As a negative control, a flat plate containing no bacterial solution was prepared.
４．爪試料及び被験物質の設置
寒天培地上に１．で調製したヒト爪試料を、Ｏリング側を上にして設置し、２７℃で８日間培養した。培養８日目に、Ｏリング内に、被験物質を漏れないように添加した。被験物質は、市販品（アスタットクリーム；１％ラノコナゾール製剤、（株）ツムラ製）１０ｍｇ、５％ピリチオンナトリウム（シグマアルドリッチ社製）１０μｌ、表１の処方及び下記製法により製造した抗真菌組成物１、並びに対照品各１０ｍｇを用いた。対照品は、抗真菌剤を含有しない基材のみの処方とした。
4). Installation of nail sample and test substance 1. On the agar medium. The human nail sample prepared in (1) was placed with the O-ring side up, and cultured at 27 ° C. for 8 days. On the 8th day of culture, the test substance was added into the O-ring so as not to leak. The test substance was a commercial product (ASTAT CREAM; 1% Ranoconazole formulation, manufactured by Tsumura Co., Ltd.) 10 mg, 5% sodium pyrithione (Sigma Aldrich) 10 μl, antifungal composition 1 prepared by the formulation shown in Table 1 and the following production method As well as 10 mg each of the control product. The control product was a formulation of only the base material containing no antifungal agent.
５．ニュートラルレッド染色と吸光度測定
被験物質設置後１１日目に、爪を寒天上からはぎ取り、Ｏリングとシリコンボンドを爪から除去した。アルコール綿で爪表面を清拭した。４ｍｌの燐酸緩衝生理食塩水に５ｍｇ／ｍｌニュートラルレッドを１００μｌ添加して調製した染色液に、爪を入れて４時間室温で撹拌した。４ｍｌの固定液（４％ホルマリン−１％塩化カルシウム溶液）で液が着色しなくなるまで、繰り返し洗浄及び固定した。２ｍｌの抽出液（１％酢酸−５０％エタノール溶液）に交換し、室温で一晩撹拌した。９６穴プレートに抽出液を１００μｌずつ分注し、５４０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を表２及び図１に示す。
5). Neutral red staining and absorbance measurement On the 11th day after the test substance was placed, the nail was removed from the agar, and the O-ring and silicon bond were removed from the nail. The nail surface was wiped with alcohol cotton. Nails were placed in a staining solution prepared by adding 100 μl of 5 mg / ml neutral red to 4 ml of phosphate buffered saline and stirred at room temperature for 4 hours. Washing and fixing were repeated with 4 ml of fixing solution (4% formalin-1% calcium chloride solution) until the solution was not colored. The extract was replaced with 2 ml of extract (1% acetic acid-50% ethanol solution) and stirred overnight at room temperature. 100 μl of the extract was dispensed into a 96-well plate, and the absorbance at 540 nm was measured. The results are shown in Table 2 and FIG.
（製法）
ラノコナゾールをＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解させ、これにポリエチレングリコール（平均分子量４００）、プロピレングリコールを加えた後、ポリアクリル酸部分中和物、乾燥水酸化アルミニウムゲル、軽質無水ケイ酸を加えて充分に攪拌して分散させた。この分散させた溶液に、あらかじめ半量の精製水に溶解しておいたポリビニルアルコールの水溶液を少量ずつ加えて、充分に練合した。これに、更に残り半量の精製水に溶解した乳酸を少量ずつ加えて、充分に練合し架橋させ、ゲルとし、抗真菌組成物１を得た。
また、ラノコナゾールを使用しない以外は、上記製法と同様にして、対照品を得た。
(Manufacturing method)
Ranoconazole is dissolved in N-methyl-2-pyrrolidone, and after adding polyethylene glycol (average molecular weight 400) and propylene glycol, polyacrylic acid partial neutralized product, dry aluminum hydroxide gel, and light anhydrous silicic acid are added. The mixture was sufficiently stirred and dispersed. To this dispersed solution, an aqueous solution of polyvinyl alcohol previously dissolved in half of purified water was added little by little and kneaded sufficiently. To this, lactic acid dissolved in the remaining half of purified water was added little by little, and kneaded sufficiently to crosslink to obtain a gel, whereby antifungal composition 1 was obtained.
Further, a control product was obtained in the same manner as in the above production method, except that lanoconazole was not used.
ピリチオンＮａ、抗真菌組成物１、アスタットクリームの吸光度は、抗真菌剤を含まない対照品と真菌を含まない陰性コントロールの間の値をとるものであり、それぞれの爪真菌症に対する効果を客観的かつ定量的に評価することができた。 The absorbance of pyrithione Na, antifungal composition 1, and aster cream takes a value between a control product that does not contain an antifungal agent and a negative control that does not contain a fungus. And it was possible to evaluate quantitatively.
本発明方法によれば、抗真菌製剤の抗真菌活性を爪真菌症の実態に即し、客観的かつ定量的に評価することができるものである。例えば、新しい抗真菌性物質について、その爪真菌症に対する抗真菌活性を評価することもできるし、あるいは同じ抗真菌性物質について、基材の変化に伴う爪真菌症に対する抗真菌活性の変化を評価することもできる。 According to the method of the present invention, the antifungal activity of an antifungal preparation can be objectively and quantitatively evaluated in accordance with the actual condition of onychomycosis. For example, a new antifungal substance can be evaluated for its antifungal activity against onychomycosis, or the same antifungal substance can be evaluated for changes in antifungal activity against onychomycosis associated with changes in the substrate. You can also
従って本発明は、抗真菌製剤の開発、特に爪真菌症に対する薬剤の開発に極めて有利に利用できるものである。 Therefore, the present invention can be used extremely advantageously for the development of antifungal preparations, particularly for the development of drugs for onychomycosis.
Claims (5)
5. The nail sample is immobilized with an immobilizing agent, and then a biological pigment is extracted from the immobilized nail sample, and the amount of the biological pigment in the nail sample is measured by measuring the absorbance of the extract. The antifungal property evaluation method of the composition containing the antifungal agent or antifungal agent according to any one of the above.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006117567A JP2007292481A (en) | 2006-04-21 | 2006-04-21 | Antifungal property evaluation method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006117567A JP2007292481A (en) | 2006-04-21 | 2006-04-21 | Antifungal property evaluation method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007292481A true JP2007292481A (en) | 2007-11-08 |
Family
ID=38763238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006117567A Pending JP2007292481A (en) | 2006-04-21 | 2006-04-21 | Antifungal property evaluation method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007292481A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013099318A (en) * | 2011-10-14 | 2013-05-23 | Taisho Pharmaceutical Co Ltd | Antifungal property evaluation method |
-
2006
- 2006-04-21 JP JP2006117567A patent/JP2007292481A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013099318A (en) * | 2011-10-14 | 2013-05-23 | Taisho Pharmaceutical Co Ltd | Antifungal property evaluation method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Panagoda et al. | Adhesion of Candida parapsilosis to epithelial and acrylic surfaces correlates with cell surface hydrophobicity | |
| Freire et al. | Action of silver nanoparticles towards biological systems: cytotoxicity evaluation using hen's egg test and inhibition of Streptococcus mutans biofilm formation | |
| Sachivkina et al. | The evaluation of intensity of formation of biomembrane by microscopic fungi of the Candida genus | |
| JP5881599B2 (en) | Rapid sterile microassay | |
| JP2015051000A (en) | Method for modulating cell surface receptors for preventing or reducing inflammation | |
| CN101322746B (en) | Secondary fermentation method natural medicinal preparation, preparation and use | |
| Nakano et al. | Effects of β-thujaplicin on anti-Malassezia pachydermatis remedy for canine otitis externa | |
| JP2007292481A (en) | Antifungal property evaluation method | |
| Ellepola et al. | Investigative methods for studying the adhesion and cell surface hydrophobicity of Candida species: an overview | |
| Parmar et al. | Antimicrobial Study of Chitosan-Based Crosslinked Hydrogel Against Staphylococcus aureus, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, and Streptococcus mutans | |
| US11331356B2 (en) | Preparation with the mycoparasitic microorganism pythium oligandrum for the treatment of dermaphytoses and yeast infections on the skin and mucouses, method of determing the cell's viability of the microorganism pythium oligandrum and method of applying the preparation | |
| US20040023907A1 (en) | Infection model | |
| Vignesh et al. | Iodine-glycerol as an alternative to lactophenol cotton blue for identification of fungal elements in clinical laboratory | |
| JP2001133449A (en) | Method for evaluating antifungal agent for nail | |
| JP5458368B2 (en) | Manufacturing method of onychomycosis model | |
| RU2181144C1 (en) | Method to release dermatophytes out of clinical material | |
| Ohnemus et al. | An ex‐vivo oral mucosa infection model for the evaluation of the topical activity of antifungal agents | |
| Ouzounova-Raykova | Green nail syndrome on the nail plate and bed related with Enterococcus and Fusarium coinfection | |
| JP7462411B2 (en) | A method for producing a three-dimensional gingival epithelium model induced in a periodontal disease-like state | |
| Al-Ameri et al. | Isolation of Mucorspp from patients with otitis media and its sensitivity to antifungals | |
| JP5980062B2 (en) | Antifungal evaluation method | |
| Jowel et al. | Characterization and antibiogram study of Clostridium Chauvoei isolated from field cases of black leg in cattle | |
| JP2013190410A (en) | Method for preparing coexistence system of trichophyton and three-dimensional cultured skin and evaluation of antifungal agent using the same | |
| CZ307642B6 (en) | A preparation containing the viable mycoparasitic microorganism Pythium oligandrum for the treatment of dermatophytoses and yeast infections on the skin and mucous membranes and a method of application of the preparation | |
| Marashdeh | Exploration of Degradative Activities of Enterococcus faecalis and Determinants of Bacterial Biofilm Proliferation within the Sealer-Dentin Interfacial Margins |