JP2007291081A - 骨吸収抑制に関連する作用を有する組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明の目的は、食習慣があり安全である食品成分を有効成分として、骨吸収の抑制に関与するＯＰＧ産生促進効果、ＲＡＮＫＬ発現抑制効果、破骨細胞分化抑制効果を促進する方法及びその組成物、剤を提供することである。
【解決手段】 Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｏｒｉｇａｎｕｍ属、Ｔｈｙｍｕｓ属、Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ属、Ａｒｃｔｉｕｍ属、Ｃａｍｅｌｌｉａ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｔｅｖｉａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属、Ｍａｌｖａ属、Ｉｌｅｘ属、Ｐｔｙｃｈｏｐｅｔａｌｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の植物の有機溶媒抽出物を有効成分とする破骨細胞分化抑制因子産生促進剤、破骨細胞分化抑制剤、破骨細胞分化因子発現抑制剤、又はこれらを含有する組成物を提供した。
【選択図】なし

Description

本発明は、骨吸収抑制に関連する作用、特に、破骨細胞分化抑制因子（ＯＰＧ）の産生促進作用、破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ）の発現抑制作用、破骨細胞の分化抑制作用を有する組成物に関する。

哺乳動物の骨は骨吸収と骨形成を繰り返しており、骨形成に関与する細胞が骨芽細胞であり、骨吸収に関与する細胞が破骨細胞である。骨の成長、維持及び修復は、これらの細胞の形成と吸収の速度バランスに依存しており、そのバランスが崩れることにより、骨吸収が骨形成を上回り、骨粗鬆症等の骨量が減少する骨代謝関連疾患がもたらされる。よって骨形成が骨吸収を下回らないことが骨量の維持や増強に重要である（非特許文献１）。

骨粗鬆症は、骨を形成するカルシウムやコラーゲンの減少による骨量低下と骨組織の退行を引き起こす全身性の骨疾患である。骨粗鬆症は、高齢者の、特に閉経後の女性に多く見られ、近年の高齢化に伴い増加し続けている。骨粗鬆症による骨の脆弱化は、疼痛や、骨折のリスク上昇を招くことから、寝たきりの原因となり、高齢者の生活の質に大きく影響を及ぼす問題となっている（非特許文献２）。

破骨細胞は、未分化の血球系細胞から多核化して分化することにより成熟破骨細胞となり骨吸収を行う。破骨細胞の分化は、骨芽細胞に発現する破骨細胞分化因子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ ｋａｐｐａ Ｂ ｌｉｇａｎｄ、以下ＲＡＮＫＬともいう）により促進されることが知られている。一方、破骨細胞分化抑制因子（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ、以下ＯＰＧともいう）も、骨芽細胞から分泌され、ＲＡＮＫＬに結合することによりＲＡＮＫＬの破骨細胞分化促進作用を抑制することが知られている（非特許文献３）。以上より、骨芽細胞でのＲＡＮＫＬの発現抑制とＯＰＧの分泌促進は、破骨細胞の分化抑制作用を有し、それにより骨吸収を抑制することが期待できる。また、骨芽細胞でのＲＡＮＫＬの発現抑制やＯＰＧ産生促進を介さずに、破骨細胞の分化を直接抑制するような化合物も発見されており、このような化合物も骨吸収を抑制することが期待できる（非特許文献４）。

特にＯＰＧに関しては様々な投与試験が行われており、閉経、不動化、ステロイド剤の使用、及び免疫抑制剤の使用による骨粗鬆症の他、慢性関節リウマチ、歯根膜炎等に対しても効果が確認されている（非特許文献５）。上記のとおり、ＯＰＧは様々な疾患に効果がある可能性があるが、ＯＰＧ自体はタンパク質であるため、経口投与してもそのまま体内に入る可能性が低いという問題がある。

そこで、経口投与によりＯＰＧの効果を得るために、生体内でＯＰＧ産生促進活性のある成分が探索されている。例えば、ＪｕｄｅらはＯＰＧ産生を促進する低分子化合物を骨粗鬆症やリウマチの病態モデルラットに投与し、これらの疾患の処置や予防に効果があることを報告している（非特許文献６）。また、食品成分にもＯＰＧ産生促進活性のあるものが見出されており、安全性や利便性から非常に有用である。このような食品成分として、ラクトフェリンやトレハロース等が挙げられる。なかでもラクトフェリンは骨芽細胞のみでなく、腸管由来細胞からもＯＰＧ産生を促進することからより優れた効果がある（特許文献１）。しかし、ラクトフェリンは乳を原料とするため高コストであるという問題があった。

キキョウは、咳や痰の治療に効能があるとされ、古くから生薬として利用されている他、韓国ではキムチとして食用されている。キキョウの熱水抽出物は、主に肝臓から生成される成長因子であるＩＧＦ−１の産生を促進することから、骨成長を促進する用途として提案されている（特許文献２）。

オレガノは、香辛料として広く食用とされている植物である。また、その葉の含水エタノール、エタノール、又はヘキサン等の有機溶媒で抽出された成分は抗菌作用があることから、日持向上を目的として食品添加物となっている（非特許文献７）。

タイムは、香辛料として広く食用とされている植物であり、抗菌作用のほか、貧血、咳、喉の痛み等にも効用があるとされている。タイムには骨吸収抑制効果があることが報告されている（非特許文献８）。

セルピルムは、タイムと同属のハーブであり、同様に食品として利用されている。

サンショウは、日本で広く食用とされている香辛料であり、健胃強壮、駆虫等の効能が知られている。また、サンショウは、パフィア属に属する植物、キランソウ属に属する植物及び、Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ属に属する植物との混合剤として、コラーゲン産生促進を有することが見出されており、その用途が提案されている（特許文献３）。加えて、エストロジェン生合成に関与するアロマターゼの活性化剤（特許文献４）としての作用や骨吸収抑制に関する用途も提案されている。

カショウは、中国で広く食用とされている香辛料である。

アボカドの実は、広く食用とされており、アボガド等の植物に含まれるトコトニエノールや、プロアントシアニジンは骨吸収抑制作用を有する成分であることから、アボカドを原料とした骨吸収を抑制する組成物が提案されている。また、アボカドの不ケン化性の成分、特にフラン脂質は、関節炎への効果があり、骨粗鬆症への用途が提案されている（特許文献５〜７）。

アニスは、種子をハーブティーや料理の香りつけとして古来より利用されている。

ステビアは、甘味成分であるステビオシドというテルペノイドの配糖体を含んでいるため、甘味料として用いられ食品添加物となっている。

マテはブラジル原産の植物であり、マテ茶として飲用されている。マテには少量のカフェインや、アルカロイドの一種とされるマテインが多く含まれている。

チャは、古来より我が国で飲料として利用されており、生又は乾燥物もしくは加熱、揉捻操作を経た加工物、あるいは生の葉を半発酵したもの、及び完全に発酵したものを煎じて飲用される。その種類は、緑茶、烏龍茶、紅茶等が挙げられる。チャには骨吸収抑制作用があり、その用途が提案されている（特許文献８）。

ブルーマローは、煎じてハーブティーとした場合、色が時間の経過により変化することから、ハーブティーとして好まれて飲用されている。

ゴボウは広く食用とされている。

ムイラプアマはブラジルで薬草として食用されている。

カモマイルは、主にハーブティーとして食用されており、不眠症等に効能があるとされている。
特開２００４−１１５５０９号公報 特表２００４−５１８６４７号公報 特開２００５−２５５５２７号公報 特開２００５−３４３８７２号公報 特表２００２−５２０２８０号公報 特開２００４−２６２８１８号公報 特表２００３−５０９５０６号公報 特開平６−１８３９８５号公報 日本臨床，２００２年，６０巻増刊号３，３４〜３７項 医学の歩み，２００１年，１９８巻，９号，５７４〜５７９項 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９９年，２０号，３巻，３４５〜３５７項 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２００４年，２４巻，４号，５０４〜５０９項 日本臨床，２００２年，６０巻増刊号３，６７９〜６８７項 Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３０９巻，１号，３６９〜３７９項 既存添加物名簿収載品目リスト注解書，１２６項，１９９９年，日本食品添加物協会 Ｂｏｎｅ，２０００年，３２巻，３７２〜３８０項

上述したような食経験のある植物の中には、骨吸収抑制や骨疾患への関与が示唆・提案されているものもあるが、そのメカニズムはほとんど明らかになっておらず、そのほとんどは実際の有効性も証明されていない。またその他、全く骨吸収抑制や骨疾患への作用が示唆すらされていない植物種も多い。本発明は、食習慣があり安全である食品成分を有効成分として、骨吸収の抑制に関与する、ＯＰＧ産生促進効果、ＲＡＮＫＬ発現抑制効果、破骨細胞分化抑制効果を促進する方法及びその組成物を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｏｒｉｇａｎｕｍ属、Ｔｈｙｍｕｓ属、Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ属、Ａｒｃｔｉｕｍ属、Ｃａｍｅｌｌｉａ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｔｅｖｉａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属、Ｍａｌｖａ属、Ｉｌｅｘ属、Ｐｔｙｃｈｏｐｅｔａｌｕｍ属の植物の有機溶媒抽出物に、ＯＰＧ産生促進効果、ＲＡＮＫＬ発現抑制効果、破骨細胞分化抑制効果等の骨吸収抑制に有用な効果があることを見出し、それを基に本発明を完成するに至った。

なお、上記に挙げた植物の有機溶媒抽出物が、上記効果を有することは、全く知られていなかった。

即ち本発明が提供するのは以下の通りである。

[１] Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｏｒｉｇａｎｕｍ属、Ｔｈｙｍｕｓ属、Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ属、Ａｒｃｔｉｕｍ属、Ｃａｍｅｌｌｉａ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｔｅｖｉａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属、Ｍａｌｖａ属、Ｉｌｅｘ属、Ｐｔｙｃｈｏｐｅｔａｌｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の植物の有機溶媒抽出物を有効成分とする破骨細胞分化抑制因子産生促進剤。

[２] Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｔｅｖｉａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属、Ｍａｌｖａ属からなる群より選択される少なくとも１種の植物の有機溶媒抽出物を有効成分とする破骨細胞分化抑制剤。

[３] Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｏｒｉｇａｎｕｍ属、Ｔｈｙｍｕｓ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｉｌｅｘ属からなる群より選択される少なくとも１種の植物の有機溶媒抽出物を有効成分とする破骨細胞分化因子発現抑制剤。

[４] 請求項１記載の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤、請求項２記載の破骨細胞分化抑制剤または請求項３記載の破骨細胞分化因子発現抑制剤を含有する飲食用組成物。

[５] 請求項１記載の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤、請求項２記載の破骨細胞分化抑制剤または請求項３記載の破骨細胞分化因子発現抑制剤を含有する医薬用組成物。

[６] 破骨細胞分化抑制因子、破骨細胞分化因子、または破骨細胞分化抑制のいずれかの作用が関連する疾患の改善または予防を目的とした請求項４または５記載の組成物。

[７] 骨粗鬆症の改善または予防を目的とした請求項４または５記載の組成物。

本発明の組成物及び方法は、骨芽細胞でのＯＰＧ産生促進、ＲＡＮＫＬ発現抑制、破骨細胞分化抑制等の効果を有し、間接的又は直接的に破骨細胞分化を抑制することができ、骨吸収が抑制される。従って、骨粗鬆症をはじめとする骨吸収を伴う疾患の改善及び予防に有用である。さらに、食経験のある材料から本発明の組成物を製造することが可能であるので、当該組成物は摂取しても安全である。

さらに、食経験のある材料から本発明の組成物を製造することが可能であるので、当該組成物は摂取しても安全である。

本発明の骨吸収抑制に関連する作用を有する組成物は、特定の植物の有機溶媒抽出物を有効成分として含有してなる組成物である。具体的には、Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｏｒｉｇａｎｕｍ属、Ｔｈｙｍｕｓ属、Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ属、Ａｒｃｔｉｕｍ属、Ｃａｍｅｌｌｉａ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｔｅｖｉａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属、Ｍａｌｖａ属、Ｉｌｅｘ属、Ｐｔｙｃｈｏｐｅｔａｌｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の植物の有機溶媒抽出物を有効成分として含有してなる破骨細胞分化抑制因子（ＯＰＧ）産生促進剤；Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｔｅｖｉａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属、Ｍａｌｖａ属からなる群より選択される少なくとも１種の植物の有機溶媒抽出物を有効成分として含有してなる破骨細胞分化抑制剤；Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｏｒｉｇａｎｕｍ属、Ｔｈｙｍｕｓ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｉｌｅｘ属からなる群より選択される少なくとも１種の植物の有機溶媒抽出物を有効成分として含有してなる破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ）発現抑制剤；及びそれらを含有する組成物である。

本発明において使用しうるＰｌａｔｙｃｏｄｏｎ属の植物としては、好ましくはキキョウ、より好ましくはＰｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ等が挙げられる。用いる部位は、全草でもよいが、可食部である根が好ましい。Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属には、サポニン類やポリフェノール類が多く含まれる。

本発明において使用しうるＯｒｉｇａｎｕｍ属の植物としては、好ましくはオレガノ、より好ましくはＯｒｉｇａｎｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ等が挙げられる。用いる部位は、全草でも良いが、食品添加物の原料となる葉が好ましい。Ｏｒｉｇａｎｕｍ属には、チモールやカルバクロール等の成分が多く存在する。

本発明において使用しうるＴｈｙｍｕｓ属の植物としては、好ましくはタイム、セルピルム、より好ましくはＴｈｙｍｕｓ Ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｔｈｙｍｕｓ Ｓｅｒｐｙｌｌｕｍ等が挙げられる。用いる部位は、全草でもよいが、地上部が好ましい。Ｔｈｙｍｕｓ属には、チモール、ボルネオール、リナロール、カルバクロール、ポリフェノール類、サポニン類等の成分が含まれる。

本発明において使用しうるＺａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ属の植物としては、好ましくはカショウ、サンショウ、より好ましくはＺａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｂｕｎｇｅａｎｕｍ、Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ等が挙げられる。用いる部位は、全草でも良いが、広く食用とされている実が好ましい。Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ属には、サンショオール、サンショアミド等の辛味成分、ゲラニオール等の芳香精油、ジペンテン、シトラール等が含まれる。

本発明において使用しうるＡｒｃｔｉｕｍ属の植物としては、好ましくはゴボウ、より好ましくはＡｒｃｔｉｕｍ ｌａｐｐａ等が挙げられる。用いる部位は、広く食用とされている根が好ましい。

本発明において使用しうるＣａｍｅｌｌｉａ属の植物としては、好ましくはチャ、より好ましくはＣａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ等が挙げられる。用いる部位は、全草でもよいが、広く利用されている葉が好ましい。また、葉の加工形態は限定されず、生又は乾燥物もしくは加熱、揉捻操作を経た加工物、あるいは生の葉を半発酵したもの、及び完全に発酵したものでもよい。

本発明において使用しうるＰｅｒｓｅａ属の植物としては、好ましくはアボカド、より好ましくはＰｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ等が挙げられる。用いる部位は、全草でもよいが、実が好ましく、可食部である果肉がより好ましい。

本発明において使用しうるＳｔｅｖｉａ属の植物としては、好ましくはステビア、より好ましくはＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ等が挙げられる。用いる部位は、全草でもよいが、食品添加物の原料となっている葉が好ましい。Ｓｔｅｖｉａ属には、ステビオシドという甘味成分や、フラボノイド類が含まれる。

本発明において使用しうるＰｉｍｐｉｎｅｌｌａ属の植物としては、好ましくはアニス、より好ましくはＰｉｍｐｉｎｅｌｌａ ａｎｉｓｕｍ等が挙げられる。用いる部位は、全草でもよいが、可食部である実が好ましい。Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属には、アネトール、カビコール、アニス酸アルデヒド、アニス酸、テルペン、クマリン等の成分が含まれる。

本発明において使用しうるＭａｔｒｉｃａｒｉａ属の植物としては、好ましくはカモマイル、より好ましくはＭａｔｒｉｃａｒｉａ ｒｅｃｕｔｉｔａ等が挙げられる。用いる部位は、全草でもよいが、花部が好ましい。Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属には、アズレン、ビサボロール、ファルネセン、フラボノイド類、クマリン等が主に含まれる。

本発明において使用しうるＭａｌｖａ属の植物としては、好ましくはブルーマロー、より好ましくはＭａｌｖａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ等が挙げられる。用いる部位は、全草でもよいが、花部が好ましい。

本発明において使用しうるＩｌｅｘ属の植物としては、好ましくはマテ、より好ましくはＩｌｅｘ ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ等が挙げられる。用いる部位は、全草でもよいが、煎じて飲用されている葉が好ましい。Ｉｌｅｘ属には、カフェイン、テオブロミン、テオフィリン、サポニン、クロロゲン酸等が主に含まれる。

本発明において使用しうるＰｔｙｃｈｏｐｅｔａｌｕｍ属の植物としては、好ましくはムイラプアマ、より好ましくはＰｔｙｃｈｏｐｅｔａｌｕｍ ｏｌａｃｏｉｄｅｓ等が挙げられる。用いる部位は、全草でもよいが、通常、食品として利用される部位（根以外）が好ましく、樹皮がより好ましい。

本発明において、上記植物の抽出物は、有機溶媒抽出物であれば特に限定されず、骨吸収抑制に関連する作用を発揮できる抽出物であれば良い。また、本発明において、有機溶媒抽出物とは、有機溶媒を主体とする溶媒によって抽出された抽出物をいう。

抽出に用いる有機溶媒としては、効率よく抽出する観点から、両親媒性有機溶媒が好ましい。両親媒性有機溶媒とは、親水性溶媒及び疎水性溶媒の両者と混和可能である有機溶媒をいう。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール；酢酸エチル等のエステル；アセトン等のケトン；ヘプタン、ヘキサン等の脂肪族炭化水素が挙げられ、また、食用油等の油脂類を用いることもできる。このうち両親媒性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール等が挙げられる。前記有機溶媒は、１種で用いても、２種以上混合したものを用いてもよい。また、上記有機溶媒は、有機溶媒が主体であれば、つまり抽出溶媒中の有機溶媒の割合が５０重量％以上であれば、水との混合溶媒として使用しても良い。好ましくは、食品用途の使用が可能であり、かつ溶媒除去が容易な、エタノール、含水エタノール等が挙げられる。

本発明における抽出物としては、抽出により得た抽出液そのもの、もしくはそれから溶媒を除去したもの、のいずれをも含む。

本発明の組成物の有効成分である各種植物の有機溶媒抽出物を得る方法としては、特に限定されないが、例えば以下の溶媒抽出法等を用いることができる。上記植物材料を、約１〜２０倍量、好ましくは約１〜１０倍量の上記溶媒に浸す等して溶媒に接触させ、攪拌又は放置し、濾過又は遠心分離等を行うことにより、抽出物を得ることができる。次いで、必要に応じて、得られた抽出物を、減圧下での濃縮、凍結乾燥、スプレードライ等の方法により乾燥させても良い。

溶媒に接触させる際の材料は、生のまま又は乾燥させたものでもよいが、保存の点から乾燥させたものが好ましい。また、上記材料の形態は、原型、粉砕したもの、切断したもの又は粉末のいずれを用いてもよい。溶媒に接触させる温度は、一般に約０〜１３０℃、好ましくは約１〜８０℃であるが、室温からやや加熱した温度、つまり約２０〜６０℃で、より好適に本発明における抽出物を得ることができる。溶媒に接触させる時間は、普通約０．１時間〜１ヶ月間、好ましくは約０．５時間〜７日間である。

本発明における抽出物は、飲食品や医薬品として不適当な物質を含有しない限り、抽出物のまま、又は、精製抽出物あるいは半精製抽出物として使用できる。精製は、各種クロマトグラフィー法（例えばアフィニティークロマトグラフィー精製法等）、濾過法、沈殿法、遠心分離法等を使用することができる。

また、該抽出物中の成分は、所望により飲食用又は医薬用に許容される物質の塩、エステル又は配糖体の形態であってもよい。

ここで、本明細書でいう骨吸収抑制に関連する作用とは、ＯＰＧ産生促進、ＲＡＮＫＬ発現抑制、破骨細胞分化抑制のことをいう。これらの作用は、骨を吸収する細胞である破骨細胞の分化抑制に関与することから、生体内の骨吸収の抑制、ひいては骨粗鬆症をはじめとする骨量の減少を伴う疾患の改善又は予防に有用である。本発明の組成物は、骨芽細胞もしくは破骨細胞の前駆細胞に作用し、骨芽細胞からのＯＰＧ産生促進、骨芽細胞でのＲＡＮＫＬ発現抑制を介した破骨細胞分化抑制により、また、それらの作用を介さない破骨細胞分化抑制により、生体内の骨吸収を抑制することができる。

ＯＰＧ産生促進活性は、評価物質を直接動物に投与して評価することもできるが、骨芽細胞を用いて評価することもできる。細胞を用いた評価では、細胞もしくは培養上清を用いて、ＯＰＧ量を定量する方法や、ＯＰＧのメッセンジャーＲＮＡを定量する方法等が挙げられる。具体的にはＯＰＧ量は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）や、ウエスタンブロッティング法等で測定することができる。メッセンジャーＲＮＡの定量法としては、ノザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、及びＤＮＡアレイ法等が挙げられる。これらのうち少なくとも１種の測定において、サンプルの活性が一般に溶媒対照と比較し、高い値を示す場合、そのサンプルを「ＯＰＧ産生促進活性あり」と評価する。

ＲＡＮＫＬ発現抑制活性は、評価物質を直接動物に投与して評価することもできるが、骨芽細胞を用いて評価することもできる。細胞を用いた評価では、細胞に発現したＲＡＮＫＬ量を定量する方法や、ＲＡＮＫＬのメッセンジャーＲＮＡを定量する方法等が挙げられる。具体的にはＲＡＮＫＬ量は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）や、ウエスタンブロッティング法等で測定することができる。メッセンジャーＲＮＡの定量法としては、ノザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、及びＤＮＡアレイ法等が挙げられる。これらのうち少なくとも１種の測定において、サンプルの活性が一般に溶媒対照と比較し、低い値を示す場合、そのサンプルを「ＲＡＮＫＬ発現抑制活性あり」と評価する。

破骨細胞分化抑制活性は、評価物質を直接動物に投与して評価することもできるが、骨髄細胞、脾臓細胞、マクロファージ等の細胞を用いて評価することもできる。これら細胞を用いた評価では、破骨細胞を分化させる作用を有するＲＡＮＫＬやＭ−ＣＳＦを添加した培地を用いて破骨細胞の分化抑制を評価する方法や、骨芽細胞と共培養してプロスタグランジンＥ２、副腎皮質ホルモン、インターロイキン−１β、活性型ビタミンＤ３や、リポポリサッカライド等の破骨細胞分化刺激試薬を添加した培地を用いて、破骨細胞の分化抑制を評価する方法等が挙げられる。これらの培養法において、破骨細胞分化の評価は、破骨細胞に特異的に発現する酒石酸耐性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現により評価することができる。具体的には、ＴＲＡＰにより発色する基質を用いた染色法による破骨細胞数のカウント法や、ＴＲＡＰにより発色する基質を用いた比色法等が挙げられる。これらのうち少なくとも１種の測定において、サンプルの活性が一般に溶媒対照と比較し、低い値を示す場合、そのサンプルを「破骨細胞分化抑制活性あり」と評価する。

本発明の組成物における上記植物の有機溶媒抽出物の含有量は、特に限定されず、骨吸収抑制に関連する作用を発揮できる範囲で当該抽出物が含まれていれば良い。当該抽出物の含有量は、組成物１００重量％中、例えば０．０１〜１００重量％が好ましく、０．１〜１００重量％がより好ましい。つまり、本発明の組成物には、必要に応じて、上記抽出物以外に、例えば、後述の各種添加剤等を含有させることができる。

本発明の飲食用組成物は、上記のＯＰＧ産生促進剤、ＲＡＮＫＬ発現抑制剤又は破骨細胞分化抑制剤を含有する組成物であり、これらを一般的な食品に混合したものである。また、公知の食品として適当な担体や助剤等を使用して、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等の服用しやすい形態にしたものでもよい。ここに言う飲食用とは、例えば、一般食品、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、健康食品、栄養補助食品等である。ここにいう一般食品とは、飲料、乳製品、加工乳、発酵乳、乳酸菌飲料、コーヒー飲料、ジュース、アイスクリーム、飴、ビスケット、ウェハース、ゼリー、スープ、麺類等であるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、飲料、乳製品、加工乳、発酵乳、乳酸菌飲料、ウェハース、ゼリーである。

本発明の医薬用組成物は、上記のＯＰＧ産生促進剤、ＲＡＮＫＬ発現抑制剤又は破骨細胞分化抑制剤を含有する組成物であり、上記剤そのものであってもよいし、所望により医薬的に許容される担体を含有する組成物であってもよい。その用途は限定されず、例えば一般用医薬品（ＯＴＣ）等の容易に入手可能な医薬品又は医薬部外品等が挙げられる。医薬用組成物の形態は限定されず、例えば、丸薬剤、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、エリクシル、カシェ、坐薬等である。好ましくは、カプセル剤、錠剤、液剤、エリクシル、カシェ、坐薬等である。また、医薬的に許容される担体とは、経口、経腸、経皮及び皮下投与のために好適である任意の材料であり、例えば、水、ゼラチン、アラビアガム、ラクトース、微結晶性セルロース、スターチ、ナトリウムスターチグリコレート、燐酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイド性二酸化ケイ素等が挙げられる。

本発明の上記組成物は、骨粗鬆症やリウマチ等の、ＯＰＧ産生促進、ＲＡＮＫＬ発現抑制、又は破骨細胞分化抑制に関連する疾患に対して効果があるとされる食品や食品添加物、例えば、大豆、ザクロ等の抽出物、カルシウム、マグネシウム、ビタミンＤ、ビタミンＫ、グルコサミン、コンドロイチン及びコラーゲン等を含む組成物とすることもできる。また、当該組成物の形態は特に限定されず、飲食物、医薬品等が挙げられる。

本発明の組成物を用いることにより、破骨細胞分化抑制因子（ＯＰＧ）、破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ）、破骨細胞分化抑制作用のいずれかが関連する疾患を改善又は予防することができる。

破骨細胞分化抑制因子、破骨細胞分化因子、破骨細胞分化抑制作用のいずれかが関連する疾患とは、生体内でのＯＰＧ産生促進、ＲＡＮＫＬ発現抑制、破骨細胞分化抑制により症状が改善又は予防される任意の疾患を意味する。具体的には、閉経、不動化、ステロイド剤の使用及び免疫抑制剤の使用による骨粗鬆症の他、慢性関節リウマチ、歯槽膿漏、歯根膜炎等が挙げられる。

また、本発明は、上記植物の有機溶媒抽出物を有効成分として含有してなる組成物を対象に投与することを特徴とする、破骨細胞分化抑制因子の産生を促進する方法、破骨細胞の分化を抑制する方法、破骨細胞分化因子の発現を抑制する方法、さらに、本発明の破骨細胞分化抑制因子、破骨細胞分化因子、破骨細胞分化抑制作用のいずれかが関連する疾患を改善又は予防する方法と捉えることもできる。

投与対象としては、特に限定されず、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類等のあらゆる動物が挙げられ、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物としては、特に限定されず、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット等が挙げられ、好ましくはヒトである。

また、投与方法としては、特に限定されず、経口、経腸、経皮及び皮下投与等が挙げられるが、経口投与が好ましい。

なお、上記組成物を飲食物として投与する場合、その投与量は特に限定されないが、各抽出物換算で成人一人一日当たり、例えば０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。他の動物に投与する場合も同様である。

また、上記組成物を医薬品として投与する場合、その投与量は特に限定されないが、各抽出物換算で成人一人一日当たり、例えば０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重を、１回ないし数回に分けて投与する。他の動物に投与する場合も同様である。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例１）各材料の抽出物の調製
各植物材料１重量部をエタノール５重量部に浸し、常温（２３℃）で７日間抽出した後、濾過により抽出液を得た。その抽出液の溶媒をエバポレーターにより除去し、粉末抽出物を得た。表１に各材料の使用部位及び抽出率（重量％）を示す。なお、抽出率（重量％）とは、使用材料を１００重量％とした場合の粉末抽出物の重量％を意味する。

（実施例２）骨芽細胞によるＯＰＧ産生促進活性の測定
実施例１で得られた各種エタノール抽出物について骨芽細胞でのＯＰＧ産生促進活性を評価した。ヒト骨芽細胞（ＭＧ６３細胞）を９６ｗｅｌｌプレートに２×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１％の非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を含むイーグル−ＭＥＭ培地（日水製薬）で、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％空気で３日間培養した。

３日後、１％の非必須アミノ酸、０．１２５％牛血清アルブミンを含むイーグル−ＭＥＭ培地に培地を交換して、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％空気で１日間培養した後、実施例１の抽出物を３０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌで溶解した培地に交換した。なお、各サンプルを溶解した培地は、１％の非必須アミノ酸、０．１２５％牛血清アルブミンを含むイーグル−ＭＥＭ培地とした。

培地交換３日後、培養上清のＯＰＧ量をＯＰＧ測定キット（Ｈｕｍａｎ Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ ＥＬＩＳＡ：Ｂｉｏ Ｖｅｎｄｏｒ社）を用いてＥＬＩＳＡ法により測定した。測定はメーカー推奨の方法に従った。

ＯＰＧ産生促進活性は、平行してＯＰＧ量を測定した溶媒対照の平均値を１とした時における、抽出物添加処理のＯＰＧ量の割合（ＯＰＧ産生促進率）により評価した。測定は３回繰り返して行った。ＯＰＧ産生促進率が統計的に有意に１を超えたサンプルを「ＯＰＧ産生促進活性あり」と評価した。表２にＯＰＧ産生促進活性が認められた抽出物を示す。値は平均値±標準偏差とした。

表２の結果から、Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｏｒｉｇａｎｕｍ属、Ｔｈｙｍｕｓ属、Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ属、Ａｒｃｔｉｕｍ属、Ｃａｍｅｌｌｉａ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｔｅｖｉａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属、Ｍａｌｖａ属、Ｉｌｅｘ属、Ｐｔｙｃｈｏｐｅｔａｌｕｍ属の植物の抽出物に、骨芽細胞に対するＯＰＧ産生促進活性があることを確認した。

（参考例１）抽出溶媒の違いによるＰｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ抽出物の骨芽細胞に対するＯＰＧ産生促進活性の比較
特許文献２に従い、実施例１で用いたＰｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ根部の粉末１重量部を蒸留水３０重量部に浸し、８５℃で２時間抽出した後、濾過により抽出液を得た。その抽出液の１部を限外濾過処理し、分子量５０００以下の画分を得た。該画分を凍結乾燥処理して、Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ水抽出物の分子量５０００以下の画分の乾燥粉末を得た。

次に、実施例２と同様の方法で、実施例１で得たＰｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍエタノール抽出物と、上記で得たＰｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ水抽出物のＯＰＧ産生促進活性を評価した。表３にその結果を示す。

表３のデータに「＊」が記載されたサンプルは、Ｄｕｎｎｅｔ法による統計解析により有意な（Ｐ＜０．０１）ＯＰＧ産生促進活性が認められたサンプルであることを示す。表３の結果から、本発明におけるＰｌａｔｙｃｏｄｏｎ属抽出物のＯＰＧ産生促進活性に関わる成分は、水ではなく、有機溶媒であるエタノールで好適に抽出できる成分であることが示された。

（実施例３）骨芽細胞によるＲＡＮＫＬ発現抑制活性の測定
実施例１で得られた各種エタノール抽出物について、骨芽細胞でのＲＡＮＫＬ発現抑制活性を評価した。ヒト骨芽細胞（ＭＧ６３細胞）を１２ｗｅｌｌプレートに２×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１％の非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）、１０％ＦＢＳを含むイーグル−ＭＥＭ培地（日水製薬）で、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％空気で２日間培養した。

２日後、１％の非必須アミノ酸、０．１２５％牛血清アルブミンを含むイーグル−ＭＥＭ培地に培地を交換して、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％空気で１日間培養した後、実施例１の抽出物を１００μｇ／ｍｌで溶解した培地に交換した。なお、各サンプルを溶解した培地は、１％の非必須アミノ酸、０．１２５％牛血清アルブミンを含むイーグル−ＭＥＭ培地とした。

培地交換１日後、細胞内のｔｏｔａｌＲＮＡをＲＮＡ抽出キット（Ｒｎｅａｓｙ ｍｉｎｉキット：キアゲン社）で抽出した。次に、得られたｔｏｔａｌＲＮＡの１μｇを用いて、ｃＤＮＡをｃＤＮＡ合成キット（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ キット：アプライドバイオシステムズ社）で合成した。得られたｃＤＮＡの５０分の１量をリアルタイムＰＣＲに供し、ＲＡＮＫＬ遺伝子及び内部標準遺伝子であるＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現量を測定した。リアルタイムＰＣＲに用いる酵素等の反応試薬及びプライマー、タックマンプローブは、アプライドバイオシステムズ社の製品を用いた（Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ）。全ての操作はメーカー推奨のプロトコールに従った。

次に、得られたＲＡＮＫＬとＧＡＰＤＨの測定値から、各抽出物処理におけるＲＡＮＫＬ相対発現量（ＲＡＮＫＬ測定値／ＧＡＰＤＨ測定値）を求めた。

ＲＡＮＫＬ発現抑制活性は、平行してＲＡＮＫＬ相対発現量を測定した溶媒対照の平均値を１とした時の抽出物添加処理でのＲＡＮＫＬ相対発現量の割合（ＲＡＮＫＬ発現抑制率）により評価した。測定は３回繰り返して行った。ＲＡＮＫＬ発現抑制率が統計的に有意に１未満となったサンプルを「ＲＡＮＫＬ発現抑制活性あり」と評価した。表４にＲＡＮＫＬ発現抑制活性が認められた抽出物を示す。値は平均値±標準偏差とした。

表４の結果から、Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｏｒｉｇａｎｕｍ属、Ｔｈｙｍｕｓ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｉｌｅｘ属の植物の抽出物に骨芽細胞に対するＲＡＮＫＬ発現抑制活性があることを確認した。

（実施例４）骨芽細胞、骨髄細胞の共培養による破骨細胞分化抑制効果の測定
１〜３日齢のＤＤＹマウスの頭頂骨から採取した骨芽細胞（１×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）及び、５週齢のＤＤＹマウスの大腿骨及び脛骨から採取した骨髄細胞（２×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を４８ｗｅｌｌプレートに播種した。また細胞の播種と同時に各ｗｅｌｌに、実施例１で得られた各種エタノール抽出物及びプロスタグランジンＥ２を、５０μｇ／ｍｌ（抽出物）、１×１０^−６Ｍ（プロスタグランジンＥ２）の濃度になるように添加した。培地は１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培地（ｓｉｇｍａ社）とした。培養開始３〜４日後に各ｗｅｌｌの培地交換を経て、合計７日間、各抽出物とプロスタグランジンＥ２存在下で細胞培養を行った。培養終了後、細胞をホルマリン固定し、酒石酸耐性酸フォスファターゼ染色（ＴＲＡＰ染色）を定法に従って行った。次に、ＴＲＡＰ染色により染まった細胞（ＴＲＡＰ陽性細胞）を顕微鏡下でカウントすることにより、破骨細胞分化を評価した。

破骨細胞分化抑制活性は、平行してＴＲＡＰ陽性細胞数を測定した溶媒対照の平均値を１とした時の、抽出物添加処理でのＴＲＡＰ陽性細胞数の割合（破骨細胞分化抑制率）により評価した。測定は４回繰り返して行った。破骨細胞分化抑制率が統計的に有意に１未満となったサンプルを「破骨細胞分化抑制活性あり」と評価した。表５に破骨細胞分化抑制活性が認められた抽出物を示す。値は平均値±標準偏差とした。

表５の結果から、Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｔｅｖｉａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属、Ｍａｌｖａ属の植物の抽出物に破骨細胞分化抑制効果があることを確認した。

（実施例５）動物投与による骨粗鬆症改善効果の確認
８週令のＳＤ系メスラットを１週間飼育後、卵巣摘出手術を行うことにより骨粗鬆症を発症させた。卵巣摘出手術からさらに６週間飼育を行った後にラットを安楽死させ、大腿骨を摘出して骨幹端部の海面骨密度をｐＱＣＴ法（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）により測定した。飼料はＡＩＮ９３Ｇに準拠した精製飼料を用いた。ただしカルシウム含量は０．３％に調整した。各抽出物サンプルは、飼料に１．２５重量％混合することにより実験開始日から投与し、抽出物サンプルを混合しない飼料を与えた群を対照（コントロール）とすることにより骨粗鬆症改善効果を確認した。骨粗鬆症改善効果は、コントロール群の骨密度を１００％とした時の、抽出物投与群の骨密度の値（平均値±標準誤差）として表した。尚、各群は８頭とした。骨粗鬆症改善効果を評価した抽出物は、実施例１のアニス抽出物、ステビア抽出物、キキョウ抽出物とした。

各抽出物投与群は、コントロール群と比較して海面骨密度が高値であり、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｓｔｅｖｉａ属、Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属の植物の抽出物の骨粗鬆症改善効果が確認された。また、各抽出物群とコントロール群との間の有意性をＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定により評価した結果、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属抽出物はＰ値が０.００９、Ｓｔｅｖｉａ属抽出物はＰ値が０.１１５、Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属抽出物はＰ値が０.３５７であり、特にＰｉｍｐｉｎｅｌｌａ属抽出物が高い骨粗鬆症改善効果を有することが確認された。

本発明の組成物及び方法は、骨芽細胞でのＯＰＧ産生促進、ＲＡＮＫＬ発現抑制、破骨細胞分化抑制等の効果を有し、間接的又は直接的に破骨細胞分化を抑制することができ、骨吸収が抑制される。従って、骨粗鬆症をはじめとする骨吸収を伴う疾患の改善及び予防に有用である。さらに、食経験のある材料から本発明の組成物を製造することが可能であるので、当該組成物は摂取しても安全である。

Claims (7)

1. Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｏｒｉｇａｎｕｍ属、Ｔｈｙｍｕｓ属、Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ属、Ａｒｃｔｉｕｍ属、Ｃａｍｅｌｌｉａ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｔｅｖｉａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属、Ｍａｌｖａ属、Ｉｌｅｘ属、Ｐｔｙｃｈｏｐｅｔａｌｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の植物の有機溶媒抽出物を有効成分とする破骨細胞分化抑制因子産生促進剤。
2. Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｔｅｖｉａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ属、Ｍａｌｖａ属からなる群より選択される少なくとも１種の植物の有機溶媒抽出物を有効成分とする破骨細胞分化抑制剤。
3. Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ属、Ｏｒｉｇａｎｕｍ属、Ｔｈｙｍｕｓ属、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ属、Ｉｌｅｘ属からなる群より選択される少なくとも１種の植物の有機溶媒抽出物を有効成分とする破骨細胞分化因子発現抑制剤。
4. 請求項１記載の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤、請求項２記載の破骨細胞分化抑制剤または請求項３記載の破骨細胞分化因子発現抑制剤を含有する飲食用組成物。
5. 請求項１記載の破骨細胞分化抑制因子産生促進剤、請求項２記載の破骨細胞分化抑制剤または請求項３記載の破骨細胞分化因子発現抑制剤を含有する医薬用組成物。
6. 破骨細胞分化抑制因子、破骨細胞分化因子、または破骨細胞分化抑制のいずれかの作用が関連する疾患の改善または予防を目的とした請求項４または５記載の組成物。
7. 骨粗鬆症の改善または予防を目的とした請求項４または５記載の組成物。