JP2007291057A - Harmful bacteria-controlling agent for human containing bacillus thuringiensis - Google Patents
Harmful bacteria-controlling agent for human containing bacillus thuringiensis Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007291057A JP2007291057A JP2006286093A JP2006286093A JP2007291057A JP 2007291057 A JP2007291057 A JP 2007291057A JP 2006286093 A JP2006286093 A JP 2006286093A JP 2006286093 A JP2006286093 A JP 2006286093A JP 2007291057 A JP2007291057 A JP 2007291057A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacteria
- bacillus thuringiensis
- harmful
- control agent
- bgsc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含むヒト用の有害菌の防除剤、並びにこれを含む医薬及び食品に関する。 The present invention relates to a human harmful fungus control agent including Bacillus thuringiensis, and a medicine and food containing the same.
胃腸の細菌叢は、胃腸管の機能及び全身の生理学的健康の維持に極めて重要な多くの役割を担う。プロバイオティクス療法とは、健康にとって有益となるよう微生物を積極的に使用することを示す。プロバイオティクスは、生きたまま宿主の腸に到達し、腸内フローラのバランスを改善するため、動物の消化活動を補助したり、腸内の有害な細菌の増殖を抑制したりするのに役立つ。このようなプロバイオティクスは、宿主の消化管内に恒常的にコロニーを形成することができないことから、プロバイオティクスの効果を持続させて、健康増進に役立てるためには、定期的に摂取する必要がある。近年では、乳酸菌及びビフィズス菌がプロバイオティクスとして広く用いられ、これらの細菌はヨーグルト及びその他の乳製品に広く利用されている。
細菌をプロバイオティクスとして利用する為には、胃液、胆汁酸などに耐性を有し、生きたまま腸に到達する能力を有すること、好気的な小腸上部のみでなく嫌気的な小腸下部や大腸でも増殖する能力を有すること、宿主に対して有用な作用をもたらすこと、医薬や食品の形態中で一定以上の菌数を維持できること、安全であることなどが要求される。従来利用されている乳酸菌やビフィズス菌のうち、特定の菌株は、胃酸や胆汁酸に対して耐性を有していることが知られている（特許文献１など）。
The gastrointestinal flora plays many vital roles in maintaining the function of the gastrointestinal tract and general physiological health. Probiotic therapy refers to the active use of microorganisms to be beneficial to health. Probiotics reach the intestines of the host alive and improve the balance of intestinal flora, thus helping animals digestive activities and inhibiting the growth of harmful bacteria in the intestines . Since such probiotics cannot form colonies constantly in the digestive tract of the host, it is necessary to ingest them regularly in order to maintain the effects of probiotics and to promote health. There is. In recent years, lactic acid bacteria and bifidobacteria have been widely used as probiotics, and these bacteria have been widely used in yogurt and other dairy products.
In order to use bacteria as probiotics, it must be resistant to gastric juices, bile acids, etc., and have the ability to reach the intestines alive, as well as anaerobic lower intestinal It is required to have the ability to proliferate in the large intestine, to provide useful effects on the host, to maintain a certain number of bacteria in a form of medicine or food, and to be safe. Among the lactic acid bacteria and bifidobacteria used conventionally, it is known that specific strains have resistance to gastric acid and bile acids (Patent Document 1, etc.).
このような技術背景において、乳酸菌及びビフィズス菌以外にもプロバイオティクスとして利用できる細菌について検討が行われている。例えば、哺乳動物に対して胆汁酸耐性であるバチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）を投与することが報告されている（特許文献２）。ヒト用のプロバイオティクスとしては、B. coagulans, B. subtilis, B. clausii, B. cereus, B. licheniformis, B. pumilus, B. polymyxa, B. vietnami, B. polyfermenticusが利用されている（非特許文献１）。 In such a technical background, in addition to lactic acid bacteria and bifidobacteria, bacteria that can be used as probiotics have been studied. For example, administration of Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, and Bacillus clausii, which are resistant to bile acids, has been reported to mammals (Patent Document 2). B. coagulans, B. subtilis, B. clausii, B. cereus, B. licheniformis, B. pumilus, B. polymyxa, B. vietnami, B. polyfermenticus are used as human probiotics ( Non-patent document 1).
一方、腸内感染症や皮膚損傷部位からの感染症についての問題も存在している。このような感染症を引き起こす病原菌は、動物の体内に定着するためのニッチを常に求めている。通常は、病原菌が体内に侵入した場合であっても、宿主の生体防御機構により排除されたり、他の細菌により増殖が抑制されたりする。その一方で、例えば、ピロリ菌や緑膿菌のように一定の菌数にまで増殖し、動物腸内に定着し宿主に慢性疾患を引き起こす細菌も存在する。このような細菌は、細菌の皮膚、粘膜への付着、腸内への侵入などの初期増殖の過程で宿主の生態防御機構に感知されることなく、十分に菌密度が高まってから、種々の病原性因子を一挙に生産して組織を破壊する。これを実現するしくみが細菌自身が産生する自己誘発因子を介した情報伝達機構（cell-to-cell signaling）、すなわち細菌自己誘発機構（菌体密度感知機構）である。この機構はビブリオ属細菌（Vibrio fischeri）の培養において、細菌の増殖に応じて蛍光物質が産生されるという現象の発見から見出されたものであり（非特許文献２）、その後、緑膿菌（Pseudomonas）をはじめとする多くの病原菌において本機構が発見され、病原因子の発現がコントロールされている事実が明らかとなっている。また、シュードモナス属以外にも、バークホリデリア（Burkholderia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、ビブリオ（Vibrio）属、セラチア（Serratia）属、サルモネラ（Salmonella）属など、臨床上重要な多くの細菌が自己誘発機構を有していることが報告されている（非特許文献３）。 On the other hand, there are problems with intestinal infections and infections from skin damage sites. Pathogens that cause such infections are constantly seeking a niche for colonization in animals. Normally, even when pathogenic bacteria enter the body, they are eliminated by the host's host defense mechanism, or growth is suppressed by other bacteria. On the other hand, there are also bacteria such as H. pylori and Pseudomonas aeruginosa that grow to a certain number of bacteria, settle in the intestines of animals, and cause chronic diseases in the host. Such bacteria are not recognized by the host's ecological defense mechanism during the initial growth process such as bacterial adhesion to the skin and mucous membranes and enter the intestine. Produce virulence factors at once and destroy tissues. The mechanism for realizing this is the cell-to-cell signaling via the self-inducing factor produced by the bacteria itself, that is, the bacterial self-inducing mechanism (cell density sensing mechanism). This mechanism was discovered from the discovery of the phenomenon that a fluorescent substance is produced in response to bacterial growth in the culture of Vibrio fischeri (Non-Patent Document 2). This mechanism was discovered in many pathogenic bacteria including (Pseudomonas), and it is clear that the expression of pathogenic factors is controlled. In addition to the genus Pseudomonas, there are many clinically important bacteria such as the genus Burkholderia, Enterobacter, Vibrio, Serratia, and Salmonella. It has been reported that it has a self-inducing mechanism (Non-patent Document 3).
このような細菌自己誘発機構のシグナル伝達を担うのが細菌自己誘発因子であり、グラム陰性細菌の細菌自己誘発因子としては、アシルホモセリンラクトンが広範囲に保存されている。細菌自己誘発因子は、細菌の外膜を自由に通過できる分子であり、環境中の細菌密度が低い場合には自己誘発因子濃度が低く、生物活性を示さない。ところが、細菌の増殖が進み環境中の細菌密度が高まるに従って細菌内外の自己誘発因子濃度も高まり、これがある一定の閾値に達したとき、各種病原因子などのターゲット遺伝子の発現を促進する。 Bacterial self-inducing factors are responsible for signal transduction of such bacterial self-inducing mechanisms, and acyl homoserine lactone is widely conserved as bacterial self-inducing factors of Gram-negative bacteria. Bacterial self-inducing factors are molecules that can freely pass through the outer membrane of bacteria, and when the density of bacteria in the environment is low, the concentration of self-inducing factors is low and does not exhibit biological activity. However, as the growth of bacteria progresses and the density of bacteria in the environment increases, the concentration of self-inducing factors inside and outside the bacteria also increases. When this reaches a certain threshold, expression of target genes such as various pathogenic factors is promoted.
このような病原菌による感染症の予防や治療の方法としては、細菌自己誘発因子不活性化タンパク質を動物に経口投与するか、又は動物の細胞に細菌自己誘発因子不活性化タンパク質をコードする核酸配列を導入し、該核酸配列を発現させて、病原菌の細菌自己誘発因子を不活性化することにより、病原性因子の生産を抑制する方法が報告されている(特許文献３)。しかしながら、細菌自己誘発因子不活性化タンパク質を動物に経口投与する方法は、該タンパク質が胃を通過する過程で消化分解されてしまい、腸管に到達しないという問題がある。また、核酸配列の導入は、ヒトに対して適用するのは困難である。 As a method for preventing or treating infections caused by such pathogenic bacteria, a bacterial self-inducing factor inactivating protein is orally administered to an animal, or a nucleic acid sequence encoding the bacterial self-inducing factor inactivating protein in an animal cell. Has been reported to suppress the production of virulence factors by infecting bacterial self-inducing factors of pathogenic bacteria by introducing a nucleic acid and expressing the nucleic acid sequence (Patent Document 3). However, the method of orally administering a bacterial self-inducing factor inactivating protein to an animal has a problem that the protein is digested and degraded in the process of passing through the stomach and does not reach the intestine. In addition, introduction of a nucleic acid sequence is difficult to apply to humans.
また、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）が、植物病原菌であるエルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）の菌体密度感知機構に依存した（quorum-sensing dependent）病原性を抑制することが報告されている（非特許文献４）。具体的には、バチルス・チューリンゲンシスが、菌体密度感知シグナル因子（アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ））を分解する酵素であるＡＨＬ−ラクトナーゼを産生し、ＡＨＬの蓄積を抑制することが報告されている。このようなバチルス・チューリンゲンシスは、安全な微生物殺虫剤として広く農業生産の場に受け入れられているが、ヒトなどの動物に投与することについては検討されていない。また、植物や動物宿主に寄生している線虫、吸虫や原虫に対し、バチルス・チューリンゲンシスが産生する結晶タンパク質が殺虫活性を有していることが報告されている（特許文献４、特許文献５)。しかしながら、ここでは、バチルス・チューリンゲンシスが動物の腸から分離した線虫などに対して殺虫性を有していることが示されているのみで、実際にヒトなどの動物に経口投与した場合の効果や安全性については確認されていない。また、微生物を含む医薬を、皮膚に塗布し、損傷を治癒することについては知られておらず、特にヒトに適用することについての検討は全く行われていない。 In addition, Bacillus thuringiensis has been reported to suppress the quorum-sensing dependent pathogenicity of the plant pathogen, Erwinia carotovora (quorum-sensing dependent) ( Non-patent document 4). Specifically, it has been reported that Bacillus thuringiensis produces AHL-lactonase, an enzyme that degrades cell density sensing signal factor (acyl homoserine lactone (AHL)), and suppresses the accumulation of AHL. . Such Bacillus thuringiensis is widely accepted in the field of agricultural production as a safe microbial insecticide, but it has not been studied for administration to animals such as humans. In addition, it has been reported that a crystalline protein produced by Bacillus thuringiensis has an insecticidal activity against nematodes, flukes and protozoa parasitic on plants and animal hosts (Patent Document 4, Patent Document) 5). However, here it is only shown that Bacillus thuringiensis has insecticidal activity against nematodes isolated from the intestines of animals, and when actually administered orally to animals such as humans. The effect and safety have not been confirmed. In addition, it is not known to apply a medicine containing microorganisms to the skin and cure the damage, and in particular, no study has been made on application to humans.
すなわち、これまでバチルス・チューリンゲンシスを含む医薬をヒトに用いて、病原菌による感染症を予防・治療したり、バチルス・チューリンゲンシスを含む食品を摂食することにより、腸内の有害菌の増殖を抑え、腸内フローラのバランスを改善することについては、全く検討されていなかった。 In other words, by using drugs containing Bacillus thuringiensis in humans to prevent and treat infections caused by pathogenic bacteria, and by eating foods containing Bacillus thuringiensis, No attempt has been made to suppress and improve the balance of intestinal flora.
本発明は、病原菌などの有害菌の増殖を抑制したり、病原菌細菌自己誘発因子を不活性化したりすることにより、腸内フローラのバランスを改善し、整腸を促進したり、感染症を予防・治療したりするための手段であって、ヒトに対して安全かつ簡便に用いることができる手段を提供することを課題とする。具体的には、ヒトに対して消化不良、軟便、便秘などを引き起こす有害菌、さらに感染症を引き起こす病原菌を防除するための手段を提供することを課題とする。また、ヒトの皮膚、粘膜、腸内などに投与することにより、病原菌による感染症を予防・治療するための医薬を提供すること、及び定期的に摂取することにより、有害菌を防除し、腸内フローラのバランスを改善するための食品を提供することを課題とする。 The present invention improves the balance of intestinal flora, promotes intestinal regulation, and prevents infectious diseases by inhibiting the growth of harmful bacteria such as pathogenic bacteria and inactivating pathogenic bacteria self-inducing factors. An object of the present invention is to provide a means for treatment, which can be used safely and easily for humans. Specifically, it is an object of the present invention to provide a means for controlling harmful bacteria that cause indigestion, loose stool, constipation, and pathogenic bacteria that cause infectious diseases. In addition, by administering to human skin, mucous membranes, intestines, etc., providing pharmaceuticals for preventing and treating infections caused by pathogenic bacteria, and taking them regularly, the harmful bacteria are controlled, It is an object to provide a food for improving the balance of the inner flora.
本発明者らは、上記課題を解決すべく、ヒトに対する有害菌を防除する能力を有する細菌種を探し求め、その有効性及びヒトに対する安全性について研究を行った結果、バチルス・チューリンゲンシスが有害菌の増殖を抑制する能力を有し、プロバイオティクスとして有用な特性を有することを見出した。さらに、バチルス・チューリンゲンシス細菌が動物の腸内において細菌自己誘発因子を不活性化する能力を有することを見出した。
そしてバチルス・チューリンゲンシスの細菌の胞子を経口投与することにより、細菌胞子は胃を生きたまま通過し、胆汁酸で死滅することなく腸内で発芽・増殖することにより、有害菌の増殖を抑制し、腸内フローラのバランスを改善したり、病原菌による病原因子の産生を抑制することにより、腸内感染症を予防・治療したりすることを見出した。さらに、バチルス・チューリンゲンシスの細菌の胞子を損傷皮膚に接触させることにより、損傷の治癒を促進することを見出した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
In order to solve the above problems, the present inventors searched for a bacterial species having the ability to control harmful bacteria to humans, and as a result of conducting research on its effectiveness and safety to humans, Bacillus thuringiensis was found to be harmful bacteria. It has been found that it has the ability to inhibit the growth of, and has useful properties as a probiotic. Furthermore, it has been found that Bacillus thuringiensis bacteria have the ability to inactivate bacterial autoinducers in the intestine of animals.
Bacterial thuringiensis bacterial spores are orally administered, and the bacterial spores pass through the stomach alive and germinate and proliferate in the intestine without being killed by bile acids, thereby suppressing the growth of harmful bacteria. The present inventors have found that intestinal infections can be prevented and treated by improving the balance of intestinal flora and suppressing the production of pathogenic factors by pathogenic bacteria. Furthermore, it has been found that the healing of damage is promoted by bringing bacterial spores of Bacillus thuringiensis into contact with the damaged skin.
That is, the present invention is as follows.
（１）バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含む、ヒト用の有害菌の防除剤。
（２）前記バチルス・チューリンゲンシスが、胆汁酸耐性であることを特徴とする、（１）に記載の有害菌の防除剤。
（３）前記バチルス・チューリンゲンシスが、さらに細菌自己誘発因子不活性化能を有することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の有害菌の防除剤。
（４）バチルス・チューリンゲンシスが、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis） ＢＧＳＣ
４Ａ３株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・クルスターキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki） ＢＧＳＣ ４Ｄ１株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai） ＢＧＳＣ ４Ｊ４株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・イスラエレンシス（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis） ＢＧＳＣ ４Ｑ７株、若しくはこれらの変異株を含む、（１）〜（３）の何れか一に記載の有害菌の防除剤。
（５）前記有害菌が、グラム陰性細菌に属することを特徴とする、（１）〜（４）の何れか一に記載の有害菌の防除剤。
（６）前記有害菌が、感染症を引き起こす病原菌であることを特徴とする、（１）〜（５）の何れか一に記載の有害菌の防除剤。
（７）前記病原菌が、ビブリオ(Vibrio)属細菌、サルモネラ（Salmonella）属細菌、カンピロバクター（Campylobacter）属細菌、エルシニア(Yersinia)属細菌、エロモナス(Aeromonas)属細菌、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌、大腸菌及び赤痢菌のうち少なくと
も一種である（１）〜（６）の何れか一に記載の有害菌の防除剤。
（８）（１）〜（７）の何れか一に記載の有害菌の防除剤を含む、医薬。
（９）病原菌による感染症の予防・治療用であることを特徴とする、（８）に記載の医薬。
（１０）（１）〜（７）の何れか一に記載の有害菌の防除剤を含む、食品。
(1) A harmful fungus control agent for humans, including Bacillus thuringiensis.
(2) The control agent for harmful bacteria according to (1), wherein the Bacillus thuringiensis is resistant to bile acids.
(3) The harmful bacteria control agent according to (1) or (2), wherein the Bacillus thuringiensis further has the ability to inactivate bacterial self-inducing factors.
(4) Bacillus thuringiensis subsp. Thuringiensis BGSC
4A3 strain, Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki BGSC 4D1, strain Bacillus thuringiensis subsp. Aizawai BGSC 4J4 strain, Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki -Islaelensis (Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis) The harmful fungus control agent according to any one of (1) to (3), including BGSC 4Q7 strain or a mutant thereof.
(5) The harmful bacteria control agent according to any one of (1) to (4), wherein the harmful bacteria belong to Gram-negative bacteria.
(6) The harmful bacteria control agent according to any one of (1) to (5), wherein the harmful bacteria are pathogenic bacteria that cause infectious diseases.
(7) The pathogen is a bacterium belonging to the genus Vibrio, Salmonella, Campylobacter, Yersinia, Aeromonas, Pseudomonas, E. coli And the control agent for harmful bacteria according to any one of (1) to (6), which is at least one of Shigella and Shigella.
(8) A medicament comprising the harmful fungus control agent according to any one of (1) to (7).
(9) The medicament according to (8), which is used for prevention / treatment of infectious diseases caused by pathogenic bacteria.
(10) A food comprising the harmful fungus control agent according to any one of (1) to (7).
本発明の有害菌の防除剤をヒトに経口投与することにより、腸内でバチルス・チューリンゲンシスが増殖し、腸内フローラのバランスを改善し、健康増進に役立つ。また、病原菌の細菌自己誘発因子を不活性化することにより、病原菌による病原因子の産生を抑制し、感染症を予防・治療する。さらに、本発明の有害菌の防除剤を含む医薬を皮膚に投与することにより、損傷部位の感染症を予防し、治癒を促進する。このように、本発明の有害菌の防除剤は、ヒトの腸内、皮膚、粘膜などの部位において、病原菌の増殖を抑え、これらの菌による感染症を予防・治療する効果を有する。 By orally administering the harmful bacteria control agent of the present invention to humans, Bacillus thuringiensis grows in the intestine, improves the balance of intestinal flora, and helps to promote health. In addition, by inactivating bacterial self-inducing factors of pathogenic bacteria, the production of pathogenic factors by pathogenic bacteria is suppressed, and infectious diseases are prevented and treated. Further, by administering a medicine containing the harmful fungus control agent of the present invention to the skin, infection at the damaged site is prevented and healing is promoted. As described above, the harmful bacteria control agent of the present invention has the effect of suppressing the growth of pathogenic bacteria in the human intestine, skin, mucous membrane, and the like, and preventing and treating infections caused by these bacteria.
本発明のヒト用の有害菌の防除剤は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含むことを特徴とする。本発明において、有害菌とは、ヒト腸内などの体内、又は皮膚や粘膜において増殖することにより、ヒトに対して好ましくない影響を及ぼす菌や細菌をいう。例えば、腸内で増殖することにより、消化不良、下痢、軟便、便秘などを引き起こす細菌、腸内で病原因子を産生することにより、腸内感染症を引き起こす病原菌、皮膚表面や粘膜に付着することにより、疾患を引き起こす病原菌などが挙げられる。有害菌の増殖を抑制するとは、有害菌の細胞***を直接阻害すること及び有害菌の細菌自己誘発因子を不活性化することにより、これらの細菌による病原因子の産生を抑制し、結果として有害菌の定着及び増殖を抑制することを含む概念である。 The human harmful fungus control agent of the present invention is characterized by containing Bacillus thuringiensis. In the present invention, harmful bacteria refer to bacteria and bacteria that adversely affect humans by growing in the body of human intestines and the like, or in the skin and mucous membranes. For example, bacteria that cause indigestion, diarrhea, loose stool, constipation, etc. by growing in the intestine, and pathogenic bacteria that cause intestinal infections by producing pathogenic factors in the intestine, adhere to the skin surface and mucous membrane By way of example, pathogenic bacteria that cause disease can be mentioned. Inhibiting the growth of harmful bacteria directly inhibits the cell division of harmful bacteria and inactivates the bacterial self-inducing factors of harmful bacteria, thereby suppressing the production of pathogenic factors by these bacteria It is a concept that includes suppression of colonization and growth of bacteria.
バチルス・チューリンゲンシスとは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第９版（１９９４）において「バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）」に分類される細菌である。 Bacillus thuringiensis is a bacterium classified as "Bacillus thuringiensis" in the 9th edition (1994) of Bergey's Manual of Determinative Bacteriology .
本発明の有害菌の防除剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスの亜種は、特に制限されない。例えば、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis）、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・クルスターキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai）、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・イスラエレンシス（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis）などを好ましく用いることができる。この中では、例えば、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・チューリンゲンシス ＢＧＳＣ ４Ａ３株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・クルスターキ ＢＧＳＣ ４Ｄ１株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・アイザワイ ＢＧＳＣ ４Ｊ４株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・イスラエレンシス ＢＧＳＣ ４Ｑ７株などを好ましく用いることができる。ＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４、ＢＧＳＣ ４Ｑ７はBacillus Genetic Stock Center（ＢＧＳＣ）（The Department of Biochemist）に登録されている菌株である。 The subspecies of Bacillus thuringiensis used for the harmful bacteria control agent of the present invention is not particularly limited. For example, Bacillus thuringiensis subsp. Thuringiensis, Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai), Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, and the like can be preferably used. Among them, for example, Bacillus thuringiensis sub-species Thuringiensis BGSC 4A3 strain, Bacillus thuringiensis sub-species Kurstaki BGSC 4D1 strain, Bacillus thuringiensis sub-species Izawa BGSC 4J4 strain, Bacillus thuringen -Subspecies Isla Ellensis BGSC 4Q7 strain etc. can be used preferably. BGSC 4A3, BGSC 4D1, BGSC 4J4, and BGSC 4Q7 are strains registered in the Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) (The Department of Biochemist).
また、本発明の有害菌の防除剤には、ＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４、ＢＧＳＣ ４Ｑ７の変異株を用いることができる。変異株としては、上記各菌株が自然変異したものや各菌株を化学的変異剤や紫外線等で変異処理することにより得たものを用いることができる。本発明においては、このような変異株から、上記各菌株と同じ
胆汁酸耐性、細菌自己誘発因子不活性化能、殺菌活性、通性嫌気性、耐酸性の少なくとも一つを有する変異株を用いることが好ましい。これらの菌学的性質については、後述する。さらに上記以外の菌学的性質も上記各菌株と同様である変異株を用いることも好ましい。
また、上記各菌株と同じ有害菌の防除能を示す上記各菌株の変異株を用いることも好ましい。
In addition, mutants of BGSC 4A3, BGSC 4D1, BGSC 4J4, and BGSC 4Q7 can be used as the harmful fungus control agent of the present invention. As the mutant strain, those obtained by spontaneously mutating each of the above strains or those obtained by subjecting each strain to mutation treatment with a chemical mutagen, ultraviolet light or the like can be used. In the present invention, a mutant strain having at least one of the same bile acid resistance, bacterial self-inducing factor inactivation ability, bactericidal activity, facultative anaerobic property, and acid resistance is used from such a mutant strain. It is preferable. These bacteriological properties will be described later. Furthermore, it is also preferable to use a mutant strain having the same mycological properties as those of the above strains.
Moreover, it is also preferable to use the mutant of each said strain which shows the same harmful bacteria control ability as each said strain.
本発明の有害菌の防除剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスは、胆汁酸耐性であることが好ましい。
「胆汁酸耐性である」とは、高濃度の胆汁酸を含有する培地において、発芽・増殖する能力を有する胞子を形成することをいう。
胆汁酸とは、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類の胆汁中に広く見出される４環構造のステロイドをいい、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸及びウルソデオキシコール酸が含まれる。通常、動物の体内では、胆汁酸は、胆汁中でグリシンやタウリンとアミド結合した抱合型として存在し、ナトリウム塩となっている。本明細書において単に「胆汁酸」という場合は、上記胆汁酸及びこれらの塩並びにこれらの抱合体を含む。
The Bacillus thuringiensis used as the harmful fungus control agent of the present invention is preferably resistant to bile acids.
“Resistant to bile acids” means forming spores having the ability to germinate and grow in a medium containing a high concentration of bile acids.
Bile acid means a tetracyclic steroid widely found in the bile of mammals, birds, reptiles, amphibians and fish, and includes cholic acid, chenodeoxycholic acid, deoxycholic acid, lithocholic acid and ursodeoxycholic acid. Usually, in an animal body, bile acid exists as a conjugated form in which glycine or taurine is amide-bonded in bile and is a sodium salt. In the present specification, the term “bile acid” includes the bile acids and salts thereof and conjugates thereof.
高濃度の胆汁酸を含有する培地とは、例えば、新鮮胆汁を１０倍に濃縮・乾固した胆汁末（Ｏｘｇａｌｌ、Ｄｉｆｃｏ製）を含む培地であって、胆汁末の濃度が、０．３質量％以上、好ましくは１質量％以上、さらに好ましくは３質量％以上であるものが挙げられる。また、「発芽・増殖する能力を有する」とは、上記のような高濃度の胆汁酸を含有する培地に胞子を接種し、胆汁酸濃度以外の条件をバチルス・チューリンゲンシスの培養に好適な条件にした場合に、細菌が発芽し、増殖***を再開し、コロニーが形成されることをいう。 The medium containing a high concentration of bile acid is a medium containing bile powder (Oxgal, manufactured by Difco) obtained by concentrating and drying fresh bile 10 times, and the concentration of bile powder is 0.3 mass. % Or more, preferably 1% by mass or more, more preferably 3% by mass or more. Further, “having the ability to germinate and proliferate” means that a spore is inoculated into a medium containing a high concentration of bile acid as described above, and conditions other than the bile acid concentration are suitable for culturing Bacillus thuringiensis. In this case, it means that bacteria germinate, proliferation and division resume, and colonies are formed.
胆汁酸耐性であるバチルス・チューリンゲンシスは、例えば、以下のようにして得ることができる。バチルス・チューリンゲンシスを含む分離源を胞子形成に適した条件で培養し、胞子を形成させる。得られた胞子を、上記高濃度の胆汁酸添加培地に接種し、培養を行った後、形成したコロニーを分離する。このコロニーの中から、バチルス・チューリンゲンシスの菌学的性質を有するものを選抜する。 Bacillus thuringiensis which is resistant to bile acids can be obtained, for example, as follows. A separation source containing Bacillus thuringiensis is cultured under conditions suitable for sporulation to form spores. The obtained spores are inoculated into the above-mentioned high-concentration bile acid-added medium and cultured, and then the formed colonies are separated. From these colonies, those having the bacteriological properties of Bacillus thuringiensis are selected.
本発明の有害菌の防除剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスは、細菌自己誘発因子不活性化能を有するものを用いることが好ましい。「細菌自己誘発因子」とは、細菌自己誘発機構の細胞間伝達を担うシグナル分子であって、細菌が増殖したときに特定の物質を生産する遺伝子の発現を促進するシグナル分子をいう。細菌自己誘発因子としては、例えば、N-butanoyl-L-homoserine lactone (BHL)、N-(3-hydroxybutanoyl)-L-homoserine lactone (HBHL)、N-(3-oxobutanoyl)-L-homoserine lactone (OBHL)、N-hexanoyl-L-homoserine lactone (HHL)、N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone (OHHL)、N-octanoyl-L-homoserine lactone (OHL)、N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone(OOHL)、N-(3-oxodecanoyl)-L-homoserine lactone (ODHL)、N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (OdDHL)が挙げられる。「細菌自己誘発因子不活性化能を有する」とは、例えば細菌自己誘発因子の分解酵素を産生する能力を有することをいう。「酵素を産生する」とは、菌体を培養した場合、培地中に酵素活性が検出できる程度に、産生することをいう。
また、「細菌自己誘発因子不活性化能を有する」とは、細菌自己誘発因子により誘導される病原性因子などの特定の物質が、産生されることを抑制することをいう。
As the Bacillus thuringiensis used for the harmful fungus control agent of the present invention, it is preferable to use those having the ability to inactivate bacterial self-inducing factors. A “bacterial self-inducing factor” refers to a signal molecule that is responsible for cell-to-cell transmission of a bacterial self-inducing mechanism and that promotes the expression of a gene that produces a specific substance when the bacterium grows. Examples of bacterial self-inducing factors include N-butanoyl-L-homoserine lactone (BHL), N- (3-hydroxybutanoyl) -L-homoserine lactone (HBHL), N- (3-oxobutanoyl) -L-homoserine lactone ( OBHL), N-hexanoyl-L-homoserine lactone (HHL), N- (3-oxohexanoyl) -L-homoserine lactone (OHHL), N-octanoyl-L-homoserine lactone (OHL), N- (3-oxooctanoyl) -L-homoserine lactone (OOHL), N- (3-oxodecanoyl) -L-homoserine lactone (ODHL), N- (3-oxododecanoyl) -L-homoserine lactone (OdDHL). “Having the ability to inactivate bacterial self-inducing factors” means having the ability to produce, for example, a bacterial self-inducing factor degrading enzyme. “Enzyme production” means production of bacterial cells to such an extent that enzyme activity can be detected in the medium.
Further, “having the ability to inactivate bacterial self-inducing factor” means to suppress the production of a specific substance such as a pathogenic factor induced by the bacterial self-inducing factor.
バチルス・チューリンゲンシスの細菌自己誘発因子不活性能は、例えば以下の方法で確認することができる。検体であるバチルス・チューリンゲンシスを細菌自己誘発因子を含む培養液で培養し、この培養液を細菌自己誘発機構を有する細菌を接種した培地に添加し
、一定時間培養した場合に、細菌自己誘発機構を有する細菌が細菌自己誘発因子の影響により特定物質を生産するか否かを適当なマーカーを用いて確認する。特定物質が検出された場合には、細菌自己誘発因子が不活性化されていないことが分かり、一方で特定物質が検出されない場合には、細菌自己誘発因子が不活性化され細菌自己誘発機構が誘導されていないことが分かる。細菌自己誘発機構を有する細菌として、例えば、細菌自己誘発因子が一定濃度に達すると色素物質を生産する細菌種を用いることができる。例えば、検体であるバチルス・チューリンゲンシスをＯＨＨＬを含む培養液で一定時間培養した後、培養液を細菌自己誘発機構により紫色の色素(ビオラセイン、violacein)を合成するクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）の細菌自己誘発因子生合成遺伝子欠損株が生育する培地に添加して、ビオラセインの誘導の有無を試験する方法が挙げられる（McClean,K. et al, 「マイクロバイオロジー（Microbiology）」１９９７年, 第１４３巻, ｐ．３７０３−３７１１）。
The ability of Bacillus thuringiensis to inactivate bacterial autoinducers can be confirmed, for example, by the following method. Bacteria self-inducing mechanism when Bacillus thuringiensis, a specimen, is cultured in a culture medium containing a bacterial self-inducing factor, added to a medium inoculated with bacteria having a bacterial self-inducing mechanism, and cultured for a certain period of time. It is confirmed by using an appropriate marker whether or not a bacterium having a bacterium produces a specific substance under the influence of a bacterial self-inducing factor. If a specific substance is detected, it can be seen that the bacterial self-inducing factor is not inactivated, whereas if no specific substance is detected, the bacterial self-inducing factor is inactivated and the bacterial self-inducing mechanism is activated. It can be seen that it has not been induced. As a bacterium having a bacterial self-inducing mechanism, for example, a bacterial species that produces a pigment substance when a bacterial self-inducing factor reaches a certain concentration can be used. For example, after culturing Bacillus thuringiensis, which is a specimen, in a culture solution containing OHHL for a certain period of time, the culture solution synthesizes a purple pigment (violacein) by a bacterial self-induction mechanism (Chromobacterium violaceum) Can be added to the medium in which the bacterial self-inducing factor biosynthesis gene deficient strain grows to test for the induction of violacein (McClean, K. et al, “Microbiology” 1997, 143, p. 3703-3711).
本発明の有害菌の防除剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスは、さらに嫌気的条件下で増殖できる通性嫌気性であることが好ましい。嫌気的条件とは、例えば、動物の腸内に含まれる気体中の酸素濃度以下の条件を意味する。実験室的には、例えば、２０℃で測定した酸化還元電位が通常−１０ｍＶ以下、好ましくは−５０ｍＶ以下である条件をいう。酸化還元電位は、通常用いられる市販の酸化還元電位計で測定することができる。ヒトの消化管は、微好気的条件又は嫌気的条件であるため、このような細菌を用いることにより、腸管内の環境下でも十分に細菌が増殖する。 The Bacillus thuringiensis used as the harmful fungus control agent of the present invention is preferably facultative anaerobic that can grow under anaerobic conditions. An anaerobic condition means the conditions below the oxygen concentration in the gas contained in the intestine of an animal, for example. In the laboratory, for example, the oxidation-reduction potential measured at 20 ° C. is usually −10 mV or less, preferably −50 mV or less. The oxidation-reduction potential can be measured with a commonly used commercially available oxidation-reduction potentiometer. Since the human digestive tract is in a microaerobic condition or an anaerobic condition, the use of such a bacterium allows the bacterium to grow sufficiently even in an intestinal environment.
本発明の有害菌の防除剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスは、さらに耐酸性であることが好ましい。このような細菌を用いることにより、胃内部においても細菌が死滅することなく、腸まで到達する。「耐酸性である」とは、細菌をヒトに投与した場合に、胃内部の条件下（食物を摂取した状態で通常ｐＨ３．５〜６）でも死滅せず、腸に達した場合に増殖可能な程度の菌数を維持していることをいう。バチルス・チューリンゲンシスの胞子は通常耐酸性であるため、胞子を用いる場合は、特に問題とならない。
バチルス・チューリンゲンシスが、細菌が胃内部で死滅することなく腸まで到達していることは、例えば、***物中の菌体の濃度を測定することによって確認することができる。
It is preferable that Bacillus thuringiensis used for the harmful bacteria control agent of the present invention is further acid resistant. By using such bacteria, the bacteria reach the intestine without being killed even in the stomach. "Acid-resistant" means that when bacteria are administered to humans, they do not die even under conditions inside the stomach (normally pH 3.5 to 6 when food is ingested) and can grow when they reach the intestines It means that the number of bacteria is maintained at a certain level. Since Bacillus thuringiensis spores are usually acid-resistant, there is no particular problem when using spores.
Whether Bacillus thuringiensis reaches the intestine without killing the bacteria inside the stomach can be confirmed, for example, by measuring the concentration of bacterial cells in the excreta.
本発明の有害菌の防除剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスを培養する方法は特に制限されず、細菌の性質に応じた適当な条件下で常法により行うことができる。例えば、培養温度は１５〜４５℃で培養することができるが、好ましくは２０〜４２℃、さらに好ましくは２５℃〜３８℃で培養するのがよい。また、培養方法は、静置培養、往復動式振とう培養、回転動式振とう培養、ジャーファーメンター培養などによる液体培養法や固体培養法を用いることができる。 The method for culturing Bacillus thuringiensis used as the harmful fungus control agent of the present invention is not particularly limited, and can be carried out by a conventional method under appropriate conditions according to the properties of the bacteria. For example, the culture can be performed at a temperature of 15 to 45 ° C, preferably 20 to 42 ° C, more preferably 25 to 38 ° C. In addition, as a culture method, a liquid culture method or a solid culture method such as stationary culture, reciprocating shake culture, rotary shake culture, or jar fermenter culture can be used.
培養に用いる培地成分も特に制限されず、炭素源としてグルコース、ガラクトース、ラクトース、アラビノース、マンノース、シュークロース、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜などの糖類、クエン酸などの有機酸類、グリセリンなどのアルコール類を、窒素源としてアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類や硝酸塩類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄などの無機塩類、ペプトン、大豆粉、脱脂大豆粕、肉エキス、酵母エキス等を用いることができる。 The medium components used for the culture are not particularly limited, and the carbon source is glucose, galactose, lactose, arabinose, mannose, sucrose, starch, starch hydrolysates, sugars such as molasses, organic acids such as citric acid, alcohols such as glycerin, etc. As a nitrogen source, ammonium salts such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, nitrates, sodium chloride, potassium chloride, potassium phosphate, magnesium sulfate, calcium chloride, calcium nitrate, manganese chloride, ferrous sulfate, etc. Inorganic salts, peptone, soybean powder, defatted soybean meal, meat extract, yeast extract, and the like can be used.
本発明の有害菌の防除剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスは、保存安定性、耐酸性の観点から、胞子の状態であることが好ましい。胞子の状態では、熱、乾燥に強いため、医薬や食品を製造する際に十分に乾燥させることができ、保存安定性が向上する。細菌に胞子を形成させるためには、培養の周期において、培地の組成、培地のｐＨ、培養温度
、培養湿度、培養する際の酸素濃度などの培養条件を、その胞子形成条件に適合させるように調整することができる。このような方法として、例えば、Schaeffer, P., J. Millet, J.P. Aubert, 「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス(Proceedings of the National Academy of Science)」米国，１９６５年，第５４巻，ｐ． ７０４−７１１に記載されている方法が挙げられる。
The Bacillus thuringiensis used for the harmful fungus control agent of the present invention is preferably in the form of spores from the viewpoint of storage stability and acid resistance. In the spore state, since it is resistant to heat and drying, it can be sufficiently dried when producing pharmaceuticals and foods, and storage stability is improved. In order to allow bacteria to form spores, the culture conditions such as the composition of the medium, the pH of the medium, the culture temperature, the culture humidity, and the oxygen concentration during the culture should be adapted to the spore formation conditions during the culture cycle. Can be adjusted. Examples of such methods include Schaeffer, P., J. Millet, JP Aubert, “Proceedings of the National Academy of Science”, USA, 1965, Vol. 54, p. The method described in 704-711 is mentioned.
また、上記の方法により得た培養物や菌体は、保存性の観点から乾燥粉末としておくことが好ましい。乾燥は、例えば、有害菌の防除剤の水分含有量が２０質量％以下となるように行うことが好ましい。
乾燥方法は、特に制限されず、自然乾燥、通風乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などが挙げられるが、この中でも噴霧乾燥及び通風乾燥が好ましく用いられる。乾燥する際には、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム及び糖類などの保護剤を用いることができる。糖類を用いる場合は、グルコースやトレハロースを用いることができる。さらに、乾燥後は、得られた乾燥物に、脱酸素剤、脱水剤を加えて、ガスバリアー性のアルミ袋に入れて密封し、室温から低温で貯蔵することが好ましい。これにより、細菌を長期間生きたまま保存することが可能となる。
Moreover, it is preferable to make the culture and microbial cell obtained by said method into a dry powder from a preservative viewpoint. The drying is preferably performed so that the moisture content of the harmful fungus control agent is 20% by mass or less, for example.
The drying method is not particularly limited, and includes natural drying, ventilation drying, spray drying, freeze drying, and the like. Among these, spray drying and ventilation drying are preferably used. When drying, protective agents such as skim milk, sodium glutamate and sugars can be used. When sugar is used, glucose or trehalose can be used. Further, after drying, it is preferable to add an oxygen scavenger and a dehydrating agent to the obtained dried product, put it in a gas barrier aluminum bag, seal it, and store it at room temperature to a low temperature. This makes it possible to store the bacteria alive for a long time.
本発明の有害菌の防除剤は、通常医薬に用いられる担体や増量剤などの任意成分を適宜配合し、製剤化することにより、有害菌を防除するためのヒト用の医薬とすることができる。本発明の医薬は特に、病原菌による感染症を予防・治療するために好ましく用いられる。医薬の剤形は、医薬を投与する部位、予防・治療の対象となる疾患等に応じて適宜選択して用いることができる。以下、具体的に医薬の用途、剤形について説明する。 The harmful bacteria control agent of the present invention can be made into a human medicine for controlling harmful bacteria by appropriately blending and formulating optional components such as carriers and extenders usually used in medicine. . The medicament of the present invention is particularly preferably used for preventing and treating infectious diseases caused by pathogenic bacteria. The pharmaceutical dosage form can be appropriately selected and used according to the site where the pharmaceutical is administered, the disease to be prevented or treated, and the like. Hereinafter, specific uses and dosage forms of the medicine will be described.
本発明の医薬は、腸内フローラのバランスを改善するための整腸剤として用いたり、病原菌による腸内感染症を予防・治療するために用いたりすることができる。この場合の医薬の剤形としては、経口投与用の錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固体製剤及び水溶剤、シロップ剤、又は非経口投与用の注射剤、坐薬、経皮吸収剤などが挙げられる。また、結腸洗浄用に、浣腸による投与のための水溶剤としてもよい。この場合には、バチルス・チューリンゲンシスを生理食塩水と混合することにより製造することができる。 The medicament of the present invention can be used as an intestinal agent for improving the balance of intestinal flora, or can be used for preventing or treating intestinal infections caused by pathogenic bacteria. In this case, pharmaceutical dosage forms include solid preparations such as tablets, granules, powders and capsules for oral administration and aqueous solvents, syrups, injections for parenteral administration, suppositories, transdermal absorption agents, etc. Is mentioned. It may also be an aqueous solvent for administration by enema for colon lavage. In this case, it can be produced by mixing Bacillus thuringiensis with physiological saline.
また、本発明の医薬は、皮膚や粘膜の有害な細菌増殖を抑制し、皮膚や粘膜への病原菌の感染を予防・治療するために用いることができる。
具体的には、本発明の医薬は、口腔細菌の増殖を抑制し、虫歯、歯肉炎などの歯周部疾患や口臭を予防するために用いることができる。この場合の医薬の剤形としては、咀嚼が可能な錠剤、歯磨き剤、うがい薬、口腔点滴剤などが好ましく挙げられる。
また、本発明の医薬は、皮膚や角皮において病原菌を防除するために用いることもできる。特に、皮膚損傷の治癒を促進するために用いることが好ましい。この場合の医薬の剤形としては、軟膏剤、クリーム、スプレー、ローション、ジェル、貼付剤などが挙げられる。
また、本発明の医薬は、膣内フローラの改善をしたり、膣内への病原菌の感染を予防・治療するために用いることができる。膣内フローラを改善することにより、膣の酵母感染や細菌性膣疾患を予防することができると期待される。この場合の医薬の剤形としては、クリーム、ローション、ジェルなどが挙げられる。
また、本発明の医薬は、眼、鼻腔、耳の炎症などに用いることもでき、この場合の剤形も適宜選択することができる。
Moreover, the medicament of the present invention can be used for suppressing harmful bacterial growth in the skin and mucous membranes, and preventing and treating infection of pathogenic bacteria in the skin and mucous membranes.
Specifically, the medicament of the present invention can be used to suppress oral bacterial growth and prevent periodontal diseases such as caries and gingivitis and bad breath. Preferable pharmaceutical dosage forms in this case include chewable tablets, dentifrices, mouthwashes, and oral drops.
The medicament of the present invention can also be used for controlling pathogenic bacteria in the skin and cuticle. In particular, it is preferably used for promoting the healing of skin damage. Examples of pharmaceutical dosage forms in this case include ointments, creams, sprays, lotions, gels, patches and the like.
The medicament of the present invention can be used for improving vaginal flora and preventing / treating infection of pathogenic bacteria into the vagina. It is expected that vaginal yeast infection and bacterial vaginosis can be prevented by improving the vaginal flora. Examples of pharmaceutical dosage forms in this case include creams, lotions, and gels.
The medicament of the present invention can also be used for inflammation of the eye, nasal cavity, ear, etc. The dosage form in this case can also be appropriately selected.
本発明の医薬は、特に以下のような病原菌の増殖を抑制し、これらの病原菌による感染症を予防・治療するために好ましく用いることができる。本発明の医薬は特に、グラム陰性細菌に属する細菌による感染症の予防・治療に好ましく用いることができる。このような病原菌としては、腸内感染症を引き起こすビブリオ(Vibrio)属、サルモネラ（Salmonel
la）属、カンピロバクター（Campylobacter）属、エルシニア(Yersinia)属、エロモナス(Aeromonas)属に属する細菌、大腸菌（Escherichia coli）、赤痢菌(Shigella)が挙げられる。ビブリオ属に属する細菌としては、V. parahaemolyticus、V. choleraeなどが挙げられる。サルモネラ属に属する細菌としては、S. typhimurium、S. enteritidisなどが挙げられる。カンピロバクター属に属する細菌としては、C. jejuni、C. coli、C. fetusなどが挙げられる。エルシニア属に属する細菌としては、Y. enterocolitica、Y. pseudotuberculosisなどが挙げられる。エロモナス属に属する細菌としては、A. hydrophila、A. caviae、A. veronii、A. jandaei、A. schubertiiなどが挙げられる。大腸菌としては、腸管侵入性大腸菌(enteroinvasive E. coli: EIEC)、腸管毒素原性大腸菌(enterotoxigenic
E. coli: ETEC)、腸管病原性大腸菌(enteropathogenic E. coli: EPEC)、志賀毒素産生性大腸菌(Shiga toxin producing E. coli: STEC)、腸管凝集接着性大腸菌(Enteroaggregative E. coli: EAEC)などが挙げられる。赤痢菌としては、S. dysenteriae、S. flexneri、S. boydii、S. sonneiなどが挙げられる。
また、皮膚、角皮、粘膜などにおいて増殖し、感染症を引き起こす病原菌としては、シュードモナス(Pseudmonas)属に属する細菌が挙げられる。このような細菌として例えば、P. aeruginosaが挙げられる。
The medicament of the present invention can be preferably used for inhibiting the growth of the following pathogenic bacteria and preventing / treating infections caused by these pathogenic bacteria. In particular, the medicament of the present invention can be preferably used for prevention / treatment of infectious diseases caused by bacteria belonging to Gram-negative bacteria. These pathogens include the genus Vibrio and Salmonel that cause intestinal infections.
Examples include bacteria belonging to the genus la), Campylobacter genus, Yersinia genus, Aeromonas genus, Escherichia coli, Shigella. Examples of bacteria belonging to the genus Vibrio include V. parahaemolyticus and V. cholerae. Examples of bacteria belonging to the genus Salmonella include S. typhimurium and S. enteritidis. Examples of bacteria belonging to the genus Campylobacter include C. jejuni, C. coli, and C. fetus. Examples of bacteria belonging to the genus Yersinia include Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis. Examples of bacteria belonging to the genus Aeromonas include A. hydrophila, A. caviae, A. veronii, A. jandaei, A. schubertii and the like. Examples of E. coli include enteroinvasive E. coli (EIEC) and enterotoxigenic E. coli (enterotoxigenic E. coli).
E. coli: ETEC), enteropathogenic E. coli: EPEC, Shiga toxin producing E. coli: STEC, enteroaggregative E. coli: EAEC, etc. Is mentioned. Examples of Shigella include S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, and S. sonnei.
Examples of pathogenic bacteria that grow on the skin, horny skin, mucous membrane, etc., and cause infections include bacteria belonging to the genus Pseudmonas. An example of such a bacterium is P. aeruginosa.
また、本発明の医薬は、バチルス・チューリンゲンシスの他に、さらに有害菌の増殖を抑制する作用を有する成分を含むものであってもよい。これらの成分も、バチルス・チューリンゲンシスを死滅させないものであり、ヒトに対する安全性が確認されているものであれば特に制限されない。 In addition to Bacillus thuringiensis, the medicament of the present invention may further contain a component having an action of suppressing the growth of harmful bacteria. These components are not particularly limited as long as they do not kill Bacillus thuringiensis and have been confirmed to be safe for humans.
また、本発明の医薬における、バチルス・チューリンゲンシスの菌体濃度は、医薬の用途及び剤形に応じて、有効量を投与するのに適した濃度とすることができる。通常は、１×１０4〜１×１０12ＣＦＵ／ｇ、好ましくは、１×１０5〜１×１０11ＣＦＵ／ｇ、さらに好ましくは、１×１０6〜１×１０10ＣＦＵ／ｇの範囲とすることができる。 Moreover, the bacterial cell concentration of Bacillus thuringiensis in the medicament of the present invention can be set to a concentration suitable for administering an effective amount according to the use and dosage form of the medicament. Usually in the range of 1 × 10 4 to 1 × 10 12 CFU / g, preferably 1 × 10 5 to 1 × 10 11 CFU / g, more preferably 1 × 10 6 to 1 × 10 10 CFU / g It can be.
本発明の医薬の投与方法も、有効量のバチルス・チューリンゲンシスを投与できるように医薬の剤形、用途、患者の年齢、性別、体重、体調、適用部位の疾患の状態などに応じて適当な方法で行えばよい。例えば、整腸促進を目的として、ヒトに経口投与する場合には、通常は、１×１０5〜１×１０10ＣＦＵ／ｋｇ体重／日の範囲で投与することが好ましい。また、皮膚、角皮、粘膜において有害菌を防除する目的でヒトに外用する場合は、塗布範囲によって適宜調節することができるが、通常、１×１０5〜１×１０10ＣＦＵ／１０〜１０００ｍｇ／日の範囲で投与することが好ましい。 The pharmaceutical administration method of the present invention is also suitable according to the pharmaceutical dosage form, use, patient age, sex, weight, physical condition, disease state of the application site, etc. so that an effective amount of Bacillus thuringiensis can be administered. It can be done by the method. For example, when orally administered to humans for the purpose of promoting intestinal regulation, it is usually preferable to administer in the range of 1 × 10 5 to 1 × 10 10 CFU / kg body weight / day. In addition, when externally applied to humans for the purpose of controlling harmful bacteria on the skin, cuticle, and mucous membrane, it can be appropriately adjusted depending on the application range, but usually 1 × 10 5 to 1 × 10 10 CFU / 10 to 1000 mg. / Day is preferred.
本発明の有害菌の防除剤は、飲食品に添加、混合することにより、又は通常飲食品に用いられる任意成分を適宜配合し、加工することにより、腸内フローラのバランスの改善効果、整腸効果を有する食品とすることができる。任意成分や食品の形態は、バチルス・チューリンゲンシスの菌体が死滅しない限りにおいて特に制限されず、通常食品に用いられているものであれば特に制限されない。例えば、ドリンク剤や粉末、錠剤、カプセルなどのサプリメントに加工することができる。また、パン類、麺類、ビスケット、チョコレート、キャンディー等の菓子類、ティーバッグ類、オートミールなどの温かいシリアル、スープ類、温かい飲料、甘味料、調味料、香味料、インスタントコーヒー、乾燥クリーム等の乾燥製品又は凍結乾燥製品、ハム、ソーセージ等の畜肉加工品、かまぼこ、はんぺん等の水産加工品に利用してもよい。本発明の食品は、保存安定性の観点から、特にサプリメントの形態とすることが好ましい。 The harmful bacteria control agent of the present invention can be added to and mixed with foods and drinks, or by appropriately blending and processing arbitrary components usually used in foods and drinks, and improving the balance of intestinal flora, intestinal regulation It can be set as the food which has an effect. The form of the optional ingredient or food is not particularly limited as long as the cells of Bacillus thuringiensis do not die, and are not particularly limited as long as they are usually used in food. For example, it can be processed into supplements such as drinks, powders, tablets, and capsules. Also, baked goods such as breads, noodles, biscuits, chocolates and candies, tea bags, hot cereals such as oatmeal, soups, hot beverages, sweeteners, seasonings, flavors, instant coffee, dried cream, etc. It may be used for products or freeze-dried products, processed meat products such as ham and sausage, and processed fishery products such as kamaboko and hampen. The food of the present invention is particularly preferably in the form of a supplement from the viewpoint of storage stability.
本発明の食品におけるバチルス・チューリンゲンシスの菌体濃度は、有効量を摂取するのに適した範囲であればよく、食品の形態に応じて選択することができる。例えば、通常は、１×１０5〜１×１０10ＣＦＵ／ｋｇ体重／日の範囲で摂取するのに適した範囲とす
ることが好ましい。
The bacterial cell concentration of Bacillus thuringiensis in the food of the present invention may be in a range suitable for taking an effective amount, and can be selected according to the form of the food. For example, it is usually preferable to set a range suitable for ingestion in the range of 1 × 10 5 to 1 × 10 10 CFU / kg body weight / day.
また、本発明の食品の製造は、本発明の有害菌の防除剤を混合すること以外は、食品加工の常法により行えばよい。本発明の有害菌の防除剤が、例えば、粉末状、固形状である場合には、食品成分との混合を容易にするために液状又はゲル状の形態にして使用することもできる。この場合は、水、大豆油、菜種油、コーン油などの植物油、液体動物油、ポリビニルアルコールやポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物を液体担体として用いることができる。また、食品中の菌体濃度の均一性を保つために、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、カゼインナトリウム、アラビアゴム、グアーガム、タマリンド種子多糖類などの水溶性多糖類を配合することも好ましい。また、雑菌の繁殖を防ぐために有機酸を配合し、液体生菌剤を酸性にすることもできる。 Moreover, what is necessary is just to perform manufacture of the foodstuff of this invention by the conventional method of food processing except mixing the control agent of the harmful bacteria of this invention. When the harmful fungus control agent of the present invention is, for example, in the form of powder or solid, it can be used in liquid or gel form for easy mixing with food ingredients. In this case, water, vegetable oils such as soybean oil, rapeseed oil and corn oil, liquid animal oils, water-soluble polymer compounds such as polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone and polyacrylic acid can be used as the liquid carrier. In order to maintain the uniformity of the bacterial cell concentration in the food, it is also preferable to add a water-soluble polysaccharide such as alginic acid, sodium alginate, xanthan gum, sodium caseinate, gum arabic, guar gum, tamarind seed polysaccharide. Moreover, in order to prevent propagation of various bacteria, an organic acid can be blended to make the liquid viable agent acidic.
（１）胆汁酸耐性及び嫌気性の試験
脱イオン水１，０００ｍｌに普通寒天培地「ニッスイ」（日水製薬（株）製）を３５g加え、オートクレーブで滅菌した。滅菌後４５℃まで冷却してから、胆汁末（Ｏｘｇａｌｌ、Ｄｉｆｃｏ製）をセルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター（孔径０．４５μｍ、アドバンテック東洋（株）製）で濾過滅菌してから加え、胆汁末濃度が０．３質量％、１質量％及び３質量％である、胆汁末添加普通寒天平板培地を作製した。
バチルス・チューリンゲンシスに属する、ＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４、及びＢＧＳＣ ４Ｑ７をそれぞれ、胆汁末無添加普通寒天平板培地（脱イオン水１，０００ｍｌ、「ニッスイ」３５ｇ）に接種し３７℃で一夜培養した。培養後、平板培地に形成されたコロニーから、菌体を分離し、滅菌済みディスポループを用いて上記で作製した胆汁末添加平板培地に接種した。３７℃で２日間培養し、コロニー形成の有無を確認した（実施例１〜４）。
(1) Bile acid resistance and anaerobic test 35 g of a normal agar medium “Nissui” (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to 1,000 ml of deionized water, and sterilized by an autoclave. After sterilization and cooling to 45 ° C., bile powder (Oxgall, manufactured by Difco) is sterilized by filtration through a cellulose mixed ester type membrane filter (pore size 0.45 μm, manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd.). A bile powder-added normal agar plate medium with 0.3% by mass, 1% by mass and 3% by mass was prepared.
BGSC 4A3, BGSC 4D1, BGSC 4J4, and BGSC 4Q7 belonging to Bacillus thuringiensis were inoculated on a normal agar plate medium without dehydrated bile powder (1,000 ml of deionized water, 35 g of “Nissui”) overnight at 37 ° C. Cultured. After the culture, the cells were isolated from the colonies formed on the plate medium, and inoculated into the bile powder-added plate medium prepared above using a sterilized disposable loop. Cultivation was performed at 37 ° C. for 2 days, and the presence or absence of colony formation was confirmed (Examples 1 to 4).
また、ＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４、及びＢＧＳＣ ４Ｑ７の嫌気条件下での増殖能を確認する目的で、上記で作製した胆汁末無添加平板培地に各菌株を接種し、アネロパックケンキ（三菱ガス化学株式会社製）を用いて、嫌気条件下３７℃で２日間培養し、コロニー形成の有無を確認した。 In addition, for the purpose of confirming the growth ability of BGSC 4A3, BGSC 4D1, BGSC 4J4, and BGSC 4Q7 under anaerobic conditions, each strain was inoculated into the above-prepared bile powder-free plate culture medium, and Aneropackenki (Mitsubishi Using Gas Chemical Co., Ltd.), the cells were cultured at 37 ° C. for 2 days under anaerobic conditions, and the presence or absence of colony formation was confirmed.
一方、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans） ＡＴＣＣ８０３８株、バチルス・コアギュランス ＮＢＲＣ１２５８３株、バチルス・コアギュランス ＤＳＭ２３１２株、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis） ＮＢＲＣ３００９株、バチルス・サブチルス ＮＢＲＣ３０２５株、バチルス・サブチルス ＮＢＲＣ３１０８株、バチルス・サブチルス ＮＢＲＣ３３３６株、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii） ＤＳＭ２５１２株、バチルス・クラウジ ＤＳＭ２５１５株、バチルス・クラウジ ＤＳＭ２５２５株、及びバチルス・クラウジ ＤＳＭ８７１６株をそれぞれ、同様に胆汁末添加培地に接種し、３７℃で２日間培養した。また、嫌気条件下での増殖試験も同様に行った（比較例１〜１１）。
なお、ＡＴＣＣ８０３８はAmerican Type Culture Collection (ＡＴＣＣ)に、ＮＢＲＣ１２５８３、ＮＢＲＣ３００９、ＮＢＲＣ３０２５、ＮＢＲＣ３１０８、及びＮＢＲＣ３３３６は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門(ＮＢＲＣ)に、ＤＳＭ２３１２、ＤＳＭ２５１２、ＤＳＭ２５１５、ＤＳＭ２５２５、及びＤＳＭ８７１６はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）にそれぞれ登録されている株である。
結果を表１に示す。
Meanwhile, Bacillus coagulans ATCC 8038, Bacillus coagulans NBRC12583, Bacillus coagulans DSM2312, Bacillus subtilis NBRC3009, Bacillus subtilis NBRC3025, Bacillus subtilis NBRC3025, Strains, Bacillus clausii DSM2512 strain, Bacillus claus DSM2515 strain, Bacillus claus DSM2525 strain, and Bacillus claus DSM8716 strain were similarly inoculated into a bile powder-added medium and cultured at 37 ° C. for 2 days. . Moreover, the proliferation test under anaerobic conditions was also performed similarly (Comparative Examples 1 to 11).
Note that ATCC 8038 is the American Type Culture Collection (ATCC), NBRC12583, NBRC3009, NBRC3025, NBRC3108, and NBRC3336 are the DSM2312, DSM2512, DSM2515, DSM2525 to the Biogenetic Resource Department (NBRC) of the National Institute of Technology and Evaluation. , And DSM8716 are stocks registered with Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), respectively.
The results are shown in Table 1.
実施例１〜４のバチルス・チューリンゲンシスは、胆汁末濃度が０．３質量％、１質量％及び３質量％である普通寒天平板培地の全てにおいてコロニーを形成し、嫌気条件下でも増殖できることが確認された。
一方、比較例１〜３のバチルス・コアギュランスは、嫌気条件下では増殖できることが確認されたが、胆汁末濃度が０．３質量％の普通寒天培地平板に僅かにコロニーを形成するに止まり、胆汁末濃度が１質量％及び３質量％では全くコロニーを形成できず、実施例１〜４のバチルス・チューリンゲンシスに比べ胆汁酸耐性に劣ることが示された。また、比較例４〜７のバチルス・サブチルスは、胆汁酸には耐性を示したが嫌気条件下では増殖できなかった。さらに、比較例８〜１１のバチルス・クラウジＤＳＭ２５１２、ＤＳＭ２５１５、ＤＳＭ２５２５、ＤＳＭ８７１６は、胆汁酸には耐性を示したが嫌気条件下では増殖できなかった。
The Bacillus thuringiensis of Examples 1 to 4 can form colonies on all the normal agar plates having a bile powder concentration of 0.3% by mass, 1% by mass and 3% by mass, and can grow even under anaerobic conditions. confirmed.
On the other hand, the Bacillus coagulans of Comparative Examples 1 to 3 were confirmed to be able to grow under anaerobic conditions, but only slightly formed colonies on a normal agar medium plate having a bile powder concentration of 0.3% by mass. When the final concentrations were 1% by mass and 3% by mass, no colonies could be formed, indicating that the bile acid resistance was inferior to that of Bacillus thuringiensis of Examples 1-4. Further, Bacillus subtilis of Comparative Examples 4 to 7 showed resistance to bile acids but could not grow under anaerobic conditions. Furthermore, Bacillus claudie DSM2512, DSM2515, DSM2525, and DSM8716 of Comparative Examples 8 to 11 were resistant to bile acids but could not grow under anaerobic conditions.
（２）細菌自己誘発因子不活性化能の試験
細菌自己誘発因子産生遺伝子を破壊したクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ＣＶ０２６株を用いて細菌自己誘発機構の誘導の有無を確認する試験を行った(McClean,K. et al., Microbiology, 143, 3703-3711 (1997))。ＣＶ０２６株は、細菌自己誘発因子であるＮ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＨＨＬ）の生
合成遺伝子が破壊された菌株であり、外部からＨＨＬなどのアシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）を添加しなければ、細菌自己誘発機構を発現しないため、紫色の色素(ビオラセイン、violacein)を合成しない。ＡＨＬとしては、ＨＨＬ以外にＮ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＯＨＨＬ）を添加しても細菌自己誘発機構を発現させることができる。本試験の具体的な方法は、以下の通りである。
(2) Testing of the ability to inactivate bacterial self-inducing factors Testing to confirm the induction of bacterial self-inducing mechanism using Chromobacterium violaceum CV026 strain with disrupted bacterial self-inducing factor producing gene (McClean, K. et al., Microbiology, 143, 3703-3711 (1997)). CV026 strain is a strain in which the biosynthetic gene of N-hexanoyl-L-homoserine lactone (HHL), which is a bacterial self-inducing factor, is disrupted, and if acyl homoserine lactone (AHL) such as HHL is not added from the outside, Because it does not express bacterial self-induction mechanism, it does not synthesize purple pigment (violacein). As AHL, a bacterial self-inducing mechanism can be expressed by adding N- (3-oxohexanoyl) -L-homoserine lactone (OHHL) in addition to HHL. The specific method of this test is as follows.
クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ＣＶ０２６株をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に接種し、２８℃で一夜振とう培養した。次いで、オートクレーブで滅菌後４５℃まで冷却した半流動ＬＢ寒天培地(０．３％)５ｍｌに、上記で得たＣＶ０２６の培養液を５０μｌ、濾過滅菌したカナマイシンの２％水溶液を５０μｌ加え、この半流動ＬＢ寒天培地５ｍｌを、あらかじめ直径９ｃｍのシャーレに用意しておいたＬＢ寒天培地に重層した。寒天を固化させた後に、このＬＢ寒天培地にコルクポーラーを用いて直径６ｍｍの穴をあけた。
なお、ＣＶ０２６はＮＣＴＣ１３２７８としてNational Collection of Type Cultures
（ＮＣＴＣ）に登録されている株である。
Chromobacterium violaceum CV026 strain was inoculated into Luria-Bertani (LB) medium and cultured overnight at 28 ° C. with shaking. Next, 50 μl of the culture solution of CV026 obtained above and 50 μl of a 2% aqueous solution of kanamycin sterilized by filtration were added to 5 ml of a semi-fluid LB agar medium (0.3%) cooled to 45 ° C. after sterilization in an autoclave. 5 ml of fluidized LB agar medium was layered on an LB agar medium prepared in advance in a petri dish having a diameter of 9 cm. After solidifying the agar, a 6 mm diameter hole was made in the LB agar medium using a cork polar.
CV026 is National Collection of Type Cultures as NCTC13278.
(NCTC) registered strains.
ＬＢ培地１０ｍｌに５００μＭのＯＨＨＬ（Ｓｉｇｍａ製）を０．５ｍｌ加え、２８℃で４時間置いたものをポジティブコントロールとした。また、何も加えないＬＢ培地を同様に処理したものをネガティブコントロールとした。それぞれのコントロールを５０μｌずつ、上記で作製したＣＶ０２６を含むＬＢ培地の穴に添加し、２８℃で２４時間培養した。その結果、ＯＨＨＬを添加したポジティブコントロールを添加したものでは、培地の穴の周りにビオラセインの誘導が確認され、ＯＨＨＬを添加しないネガティブコントロールを添加したものでは、ビオラセインの誘導は確認されなかった。これより、ＣＶ０２６は、ＯＨＨＬの存在下で培養すると、細菌自己誘発機構を発現しビオラセインを誘導する一方で、ＯＨＨＬの非存在下で培養しても、細菌自己誘発機構が発現せず、ビオラセインを誘導しないことが確認された。 0.5 ml of 500 μM OHHL (manufactured by Sigma) was added to 10 ml of LB medium and placed at 28 ° C. for 4 hours as a positive control. Moreover, what processed similarly the LB culture medium which does not add anything was made into the negative control. 50 μl of each control was added to the well of the LB medium containing CV026 prepared above and cultured at 28 ° C. for 24 hours. As a result, in the case where the positive control added with OHHL was added, the induction of violacein was confirmed around the hole in the medium, and in the case where the negative control not added with OHHL was added, the induction of violacein was not confirmed. Thus, when CV026 is cultured in the presence of OHHL, it expresses a bacterial self-induction mechanism and induces violacein. On the other hand, even when cultured in the absence of OHHL, CV026 does not express a bacterial self-induction mechanism, It was confirmed not to induce.
次に、バチルス属細菌のＯＨＨＬ不活性化能を調べるために、以下の手順でバチルス属細菌とＯＨＨＬを反応させた。
バチルス・チューリンゲンシスＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４、ＢＧＳＣ ４Ｑ７（実施例１〜４）、及び表２に示すバチルス・コアギュランス、バチルス・サブチルス、バチルス・クラウジをそれぞれＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜振とう培養した（比較例１〜１１）。次いで、吸光度(６６０ｎｍ)を１．０に調整した培養液１０ｍｌに、ＯＨＨＬを０．５ｍｌ加え、２８℃で４時間反応を行った。それぞれの反応液を５０μｌずつ、上記で作製したＣＶ０２６を含むＬＢ培地の穴に添加し、２８℃で２４時間培養した。培養後、それぞれの培地の穴の周りのビオラセインの誘導の有無を観察した。
結果を表２に示す。
Next, in order to examine the OHHL inactivation ability of Bacillus bacteria, Bacillus bacteria and OHHL were reacted according to the following procedure.
Bacillus thuringiensis BGSC 4A3, BGSC 4D1, BGSC 4J4, BGSC 4Q7 (Examples 1 to 4), and Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, and Bacillus claudia shown in Table 2 were inoculated in LB medium at 37 ° C, respectively. Cultured with shaking overnight (Comparative Examples 1 to 11). Next, 0.5 ml of OHHL was added to 10 ml of the culture solution whose absorbance (660 nm) was adjusted to 1.0, and the reaction was performed at 28 ° C. for 4 hours. 50 μl of each reaction solution was added to the well of the LB medium containing CV026 prepared above and cultured at 28 ° C. for 24 hours. After the culture, the presence or absence of induction of violacein around the holes of each medium was observed.
The results are shown in Table 2.
実施例１〜４のバチルス・チューリンゲンシスの全ての株において、ビオラセインの誘導が認められなかった。一方、比較例１〜３のバチルス・コアギュランス、比較例４〜７のバチルス・サブチルス、比較例８〜１１のバチルス・クラウジの全ての株においては、ビオラセインの誘導が認められた。この結果から、これらのバチルス・チューリンゲンシスは、ＯＨＨＬの分解酵素を産生することによりＯＨＨＬを不活性化し、ＣＶ０２６の細菌自己誘発機構の発現を抑制した一方で、比較例１〜１１のバチルス属細菌は、ＯＨＨＬを不活性化しなかったと考えられる。 In all strains of Bacillus thuringiensis of Examples 1 to 4, no induction of violacein was observed. On the other hand, in all strains of Bacillus coagulans in Comparative Examples 1 to 3, Bacillus subtilis in Comparative Examples 4 to 7, and Bacillus claudius in Comparative Examples 8 to 11, induction of violacein was observed. From these results, these Bacillus thuringiensis inactivated OHHL by producing an OHHL degrading enzyme and suppressed the expression of the bacterial self-inducing mechanism of CV026, while the Bacillus bacteria of Comparative Examples 1-11 Did not inactivate OHHL.
（３）有害菌の防除剤の製造
下記組成の胞子形成培地を用いて、ＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４及びＢＧＳＣ ４Ｑ７をそれぞれ３７℃で７２時間液体培養した（「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）」米国，１９６５年，第５４巻，ｐ．７０４−７１１）。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集めた。胞子密度が１×１０9ＣＦＵ／ｍｌになる
ように滅菌水を加え、有害菌の防除剤を製造し、それぞれ実施例５〜８とした。胞子密度は、製造した有害菌の防除剤を適当な濃度まで滅菌水で希釈し、７０℃で３０分間加熱することにより栄養細胞のみを死滅させてから普通寒天培地に接種し、形成されたコロニー数を計数することにより測定した。
(3) Production of control agent for harmful bacteria BGSC 4A3, BGSC 4D1, BGSC 4J4 and BGSC 4Q7 were each subjected to liquid culture at 37 ° C. for 72 hours using a sporulation medium having the following composition (“Proceedings of the National Academy of Science (Proceedings of the National Academy of Sciences), USA, 1965, Vol. 54, p. 704-711). The obtained culture broth was centrifuged to collect microbial cells. Sterile water was added so that the spore density would be 1 × 10 9 CFU / ml to produce harmful fungus control agents, which were designated as Examples 5 to 8, respectively. The spore density is determined by diluting the produced harmful fungus control agent to an appropriate concentration with sterilized water and heating at 70 ° C. for 30 minutes to kill only vegetative cells and then inoculating a normal agar medium. The number was measured by counting.
（胞子形成培地成分）
ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製） ８．０ ｇ
ＫＣｌ １．０ ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２５ ｇ
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．００２ｇ
ｐＨを７．０に調整し、全量 １，０００ｍｌ
上記成分をオートクレーブ滅菌した後、滅菌済みＣａＣｌ2溶液及びＦｅＳＯ4溶液をそれぞれ５×１０-4 Ｍ及び １×１０-6 Ｍになるように添加した。
(Spore formation medium component)
Nutrient broth (Difco) 8.0 g
KCl 1.0 g
MgSO 4 · 7H 2 O 0.25 g
MnCl 2 .4H 2 O 0.002 g
Adjust pH to 7.0, total volume 1,000ml
After autoclaving the above components, sterilized CaCl 2 solution and FeSO 4 solution were added to 5 × 10 −4 M and 1 × 10 −6 M, respectively.
一方、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans） ＮＢＲＣ１２５８３株及びバチルス・サブチルス（Bacillus subtilis） ＮＢＲＣ３００９株を用いて上記と同様にして有害菌の防除剤を製造し、それぞれ比較例１２及び１３とした。 On the other hand, a bacillus coagulans NBRC12583 strain and a Bacillus subtilis NBRC3009 strain were used in the same manner as described above to produce harmful bacteria control agents, which were designated as Comparative Examples 12 and 13, respectively.
（４）ラット飼養試験
ＳＤラット（オリエンタル酵母工業（株）、オス、導入時１２０ｇ）を、飼育温度２３℃、自由給水、実験動物用飼料ＭＦ（オリエンタル酵母工業（株）製品）の自由給餌で一週間予備飼育を行い、外観や行動の異常が無いことを確認した。次に、実施例５の胞子懸濁液を滅菌水で希釈し、それぞれ胞子濃度が１×１０6ＣＦＵ／ｍｌ、１×１０7ＣＦＵ／ｍｌ、及び１×１０8ＣＦＵ／ｍｌとなるように有害菌の防除剤を調製した。ラット１０匹を一群として、実施例５の各濃度の有害菌の防除剤を１日１回、１匹当たり１ｍｌを胃ゾンデを用いて経口投与した。同様に、実施例６〜８の胞子懸濁液を含む有害菌の防除剤、比較例１２及び１３の胞子懸濁液を含む組成物についても試験を行った。また、胞子懸濁液の代わりに滅菌水を含む組成物を対照例とし、同様に試験を行った。
３週間後に、各群のラットの体重を測定し、それぞれの群の増加体重の平均値を算出した。また、一日分の糞を採取し、添加菌の菌体濃度を測定し、それぞれの平均濃度を算出した。
結果を表３及び４に示す。
(4) Rat feeding test SD rats (Oriental Yeast Industry Co., Ltd., male, 120 g at the time of introduction) were reared at 23 ° C, free water supply, and MF for experimental animals (Oriental Yeast Industry Co., Ltd. product) free feeding. Pre-breeding was conducted for one week, and it was confirmed that there was no abnormality in appearance or behavior. Next, the spore suspension of Example 5 was diluted with sterile water so that the spore concentrations would be 1 × 10 6 CFU / ml, 1 × 10 7 CFU / ml, and 1 × 10 8 CFU / ml, respectively. A harmful fungus control agent was prepared. A group of 10 rats was orally administered once a day with 1 ml of harmful bacteria control agent of each concentration of Example 5 using a stomach tube. Similarly, tests were also conducted on harmful fungus control agents containing the spore suspensions of Examples 6-8 and compositions containing the spore suspensions of Comparative Examples 12 and 13. In addition, a test was similarly conducted using a composition containing sterile water instead of the spore suspension as a control example.
Three weeks later, the weight of the rats in each group was measured, and the average value of the increased weights in each group was calculated. Moreover, the feces for one day were extract | collected, the microbial cell density | concentration of the addition microbe was measured, and each average density | concentration was computed.
The results are shown in Tables 3 and 4.
試験期間中、いずれの投与群においても死亡、病気、下痢等の異常な変化は認められなかった。さらに、実施例５〜８のバチルス・チューリンゲンシスの胞子を含む有害菌の防除剤を投与したラットは、比較例１２及び１３のラットに比べて体重の増加が大きかった。また、実施例５〜８の有害菌の防除剤を投与したラットの糞からは、６．５×１０7ＣＦＵ／匹／日以上の添加菌が検出され、比較例に比べて明らかに菌数が増加していた。また、投与する菌体濃度を高くすることにより、ラットの体重の増加も大きくなった。これより、本発明のバチルス・チューリンゲンシスの胞子は、ラットの胃や腸の消化管内で死滅することなく、腸内でコロニーを形成し、ラットの体重増加を促進することが示された。 No abnormal changes such as death, illness, and diarrhea were observed in any of the treatment groups during the study period. Further, the rats administered with the harmful fungus control agent containing Bacillus thuringiensis spores of Examples 5 to 8 had a larger increase in body weight than the rats of Comparative Examples 12 and 13. In addition, 6.5 × 10 7 CFU / animal / day or more of added bacteria was detected from the feces of rats administered with the harmful bacteria control agent of Examples 5 to 8, and the number of bacteria was clearly higher than that of the comparative example. Had increased. Moreover, the increase in the body weight of a rat also became large by making high the density | concentration of the microbial cell to administer. From this, it was shown that the spores of Bacillus thuringiensis of the present invention formed colonies in the intestine and promoted the weight gain of the rat without being killed in the gastrointestinal tract of the stomach or intestine of the rat.
（５）サルモネラ菌の感染に対する防御試験
７週齢のＳＰＦマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オリエンタル酵母工業(株)、オス）を、飼育温
度２３℃、自由給水、実験動物用飼料ＭＦ（オリエンタル酵母工業(株)製品）の自由給餌で一週間予備飼育を行い、外観や行動の異常が無いことを確認した。マウス１０匹を一群として、実施例５の胞子験濁液を含む有害菌の防除剤を１日１回、１匹当たり１００μｌ、胃ゾンデを用いて経口投与した。同様に、実施例６〜８の胞子懸濁液を含む有害菌の防除剤、比較例１２及び１３の胞子懸濁液を含む組成物についても試験を行った。また、胞子懸濁液の代わりに滅菌水を含む組成物を対照例とし、同様に試験を行った。
胞子懸濁液の投与開始後７日目に１匹当たり１．４×１０4のSalmonella Typhimurium（ＳＴ）を胃ゾンデを用いて経口投与した。ＳＴの経口投与１４日目に盲腸内容物を採取した。ＳＴの生菌数は以下の方法で測定した。盲腸内容物１ｇを滅菌リン酸緩衝生理食塩水を加えて１０倍に希釈し、十分混合して試料原液とした。ついで、試料原液を滅菌生理食塩水を用いて１０倍で段階希釈した。試料原液及び段階希釈液をそれぞれＳＳ寒天平板培地「ニッスイ」（日水製薬(株)製品）及びブリリアントグリーン寒天平板培地(Difco Laboratories製品)に０．１ｍｌずつ塗沫し３７℃で２４時間培養し、各平板培地に生育した典型的なＳＴのコロニー数を測定した。さらに、コロニーより釣菌してリジン脱炭酸試験用、ＳＩＭ寒天培地「ニッスイ」（日水製薬(株)製品）及びＴＳＩ寒天培地「ニッスイ」（日水製薬(株)製品）に接種して３７℃で２４時間培養して性状の確認を行った。ＳＴと認められたコロニー数に希釈液の希釈倍率を乗じて糞１ｇ当たりのＳＴ生菌数を算出した。
(5) Protection Test against Salmonella Infection Seven-week-old SPF mice (BALB / c, Oriental Yeast Co., Ltd., male) were raised at 23 ° C., free water supply, MF for experimental animals (Oriental Yeast Co., Ltd.) ) The product was free-fed for one week, and it was confirmed that there was no abnormality in appearance or behavior. A group of 10 mice was orally administered once a day with 100 μl of a harmful bacteria control agent containing the spore test suspension of Example 5 using a stomach tube. Similarly, tests were also conducted on harmful fungus control agents containing the spore suspensions of Examples 6-8 and compositions containing the spore suspensions of Comparative Examples 12 and 13. In addition, a test was similarly conducted using a composition containing sterile water instead of the spore suspension as a control example.
Seven days after the start of administration of the spore suspension, 1.4 × 10 4 Salmonella Typhimurium (ST) per mouse was orally administered using a stomach tube. The contents of the cecum were collected on the 14th day after oral administration of ST. The viable count of ST was measured by the following method. 1 g of cecal contents was diluted 10-fold with sterile phosphate buffered saline and mixed well to obtain a sample stock solution. Subsequently, the sample stock solution was serially diluted 10 times with sterile physiological saline. The sample stock solution and serially diluted solution are smeared in 0.1 ml each on SS agar plate “Nissui” (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and brilliant green agar plate (Difco Laboratories product) and incubated at 37 ° C. for 24 hours. The number of typical ST colonies grown on each plate medium was measured. Further, the fungus from the colony is inoculated into the lysine decarboxylation test, inoculated into the SIM agar medium “Nissui” (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and the TSI agar medium “Nissui” (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.). The culture was confirmed at 24 ° C. for 24 hours. The number of viable ST per gram of feces was calculated by multiplying the number of colonies recognized as ST by the dilution factor of the diluent.
さらに、盲腸内容物中のホモセリンラクトンの有無を調べた。Chromobacterium violaceum ＣＶ０２６株をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に接種し、２８℃で一夜振とう培養した。次いで、オートクレーブ滅菌後４５℃まで冷却した半流動ＬＢ寒天培地(０．３％)５ｍｌに、上記で得たＣＶ０２６の培養液を５０μｌ、濾過滅菌したカナマイシンの２％水溶液を５０μｌ加え、この半流動ＬＢ寒天培地５ｍｌを、あらかじめ直径９ｃｍのシャーレに用意しておいたＬＢ寒天培地に重層した。寒天を固化させた後に、５００μＭ及び５０μＭのＯＨＨＬ（Sigma製）の５０μｌを、おのおのＣＶ０２６を重層したＬＢ培地の表面に滴下し３０分間乾燥させた後、２８℃で２４時間培養した結果、滴下した周辺にビオラセインの誘導が認められたが、５μＭのＯＨＨＬをＣＶ０２６を重層したＬＢ培地の表面に滴下し同様に培養した結果、滴下した周辺にビオラセインの誘導は認められなかった。次に、盲腸内容物の滅菌リン酸緩衝生理食塩水懸濁液原液を、４℃・２０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、得られた上清に２倍量のジクロロメタン（試薬特級、和光純薬工業(株)製品）を加え１時間振とうすることにより抽出を行った。抽出は２回行った。有機層を集め、無水硫酸ナトリウム（試薬特級、和光純薬工業(株)製品）で水分を除き、有機層をエバポレートして除いた後、５０μｌの滅菌水を加えた。この５０μｌを、ＣＶ０２６を重層したＬＢ培地の表面に滴下し３０分間乾燥させた後、２８℃で２４時間培養した。培養後、滴下した周辺におけるビオラセインの誘導の有無を観察した。
結果を表５に示した。
Furthermore, the presence or absence of homoserine lactone in the cecal contents was examined. Chromobacterium violaceum CV026 strain was inoculated into Luria-Bertani (LB) medium and cultured overnight at 28 ° C. with shaking. Next, 50 μl of the culture solution of CV026 obtained above and 50 μl of 2% aqueous solution of kanamycin sterilized by filtration were added to 5 ml of semi-fluid LB agar medium (0.3%) cooled to 45 ° C. after sterilization by autoclave. 5 ml of LB agar medium was layered on LB agar medium prepared in a petri dish having a diameter of 9 cm in advance. After solidifying the agar, 50 μl of 500 μM and 50 μM OHHL (manufactured by Sigma) was dropped on the surface of each LB medium overlaid with CV026, dried for 30 minutes, and cultured at 28 ° C. for 24 hours. Violacein induction was observed in the vicinity, but 5 μM OHHL was dropped onto the surface of the LB medium overlaid with CV026 and cultured in the same manner. As a result, no induction of violacein was observed in the surrounding area. Next, a sterile phosphate buffered saline suspension stock solution of the cecum contents was centrifuged at 20,000 × g for 30 minutes at 4 ° C., and twice the amount of dichloromethane (reagent grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and shaken for 1 hour for extraction. Extraction was performed twice. The organic layer was collected, water was removed with anhydrous sodium sulfate (special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the organic layer was evaporated and removed, and 50 μl of sterilized water was added. 50 μl of this was dropped on the surface of LB medium overlaid with CV026, dried for 30 minutes, and then cultured at 28 ° C. for 24 hours. After the culture, the presence or absence of induction of violacein was observed in the vicinity of the dripping.
The results are shown in Table 5.
実施例５〜８のバチルス・チューリンゲンシスの胞子を含む本発明の有害菌の防除剤を投与したマウスは比較例１２及び１３の組成物を投与したマウスに比して、盲腸内容物のＳＴの生菌数が極めて低く、脾臓、腸間膜リンパ節の小肉芽腫の形成、盲腸の炎症性変化は全く認められなかったかった。比較例の組成物を投与したマウスは、対照例と比較するとわずかにＳＴの増殖が抑制されているのみであり、脾臓、腸間膜リンパ節の小肉芽腫の形成、盲腸の炎症性変化が認められた。また、対照例では脾臓、腸間膜リンパ節の小肉芽腫の形成、盲腸の炎症性変化が認められた。これにより、バチルス・チューリンゲンシスの胞子を投与することにより、ＳＴの増殖が抑制されること、細菌自己誘発因子の発現が抑制されることが示された。すなわち、バチルス・チューリンゲンシスの胞子を投与することによりＳＴによる腸内感染症を予防・治療する効果が奏されることが分かる。 The mice administered with the harmful fungus control agent of the present invention containing the spores of Bacillus thuringiensis of Examples 5 to 8 were compared with the mice administered with the compositions of Comparative Examples 12 and 13, and the ST of cecal contents was ST. The number of viable bacteria was extremely low, and the formation of small granuloma in the spleen and mesenteric lymph nodes and inflammatory changes in the cecum were not observed at all. In mice administered with the composition of the comparative example, the growth of ST was slightly suppressed as compared with the control example, and the formation of small granulomas of the spleen and mesenteric lymph nodes and inflammatory changes of the cecum were observed. Admitted. In the control, the formation of small granuloma in the spleen and mesenteric lymph nodes and inflammatory changes in the cecum were observed. Thus, it was shown that administration of Bacillus thuringiensis spores suppresses the growth of ST and suppresses the expression of bacterial self-inducing factors. That is, it can be seen that administration of Bacillus thuringiensis spores has the effect of preventing and treating enteric infections caused by ST.
（６）ビブリオ菌の感染に対する防御試験
前記（５）の試験と同様にして７週齢のＳＰＦマウス（ＩＣＲ、オリエンタル酵母工業（株）、オス）の予備飼育を行い、外観や行動の異常が無いことを確認した。マウス１０匹を一群として、実施例５の胞子験濁液を含む有害菌の防除剤を１日１回、１匹当たり１００μｌ、胃ゾンデを用いて経口投与した。同様に、実施例６〜８の胞子懸濁液を含む有害菌の防除剤、比較例１２及び１３の胞子懸濁液を含む組成物についても試験を行った。また、胞子懸濁液の代わりに滅菌水を含む組成物を対照例とし、同様に試験を行った。
胞子懸濁液の投与開始後７日目に１匹当たり２．１×１０7のVibrio parahaemolyticus(ＶＰ)を胃ゾンデを用いて経口投与した。ＶＰの経口投与１４日目に小腸内容物を採取した。ＶＰの生菌数は以下の方法で測定した。小腸内容物１ｇを食塩ポリミキシンブイヨン「ニッスイ」（日水製薬(株)製品）を加えて１０倍に希釈し、十分混合して試料原液とした。ついで、試料原液を食塩ポリミキシンブイヨンを用いて１０倍で段階希釈した。試料原液及び段階希釈液をそれぞれＴＣＢＳ寒天培地「ニッスイ」（日水製薬(株)製品）に０．１ｍｌずつ塗まつし３７℃で１８時間培養し、各平板培地に生育した典型的なＶＰのコロニー数を測定した。コロニー数に希釈液の希釈倍率を乗じて小腸内容物１g当たりのＶＰ菌数を算出した。
(6) Protection test against Vibrio infection In the same manner as in the test of (5) above, 7 weeks old SPF mice (ICR, Oriental Yeast Co., Ltd., male) were preliminarily raised, and abnormal appearance and behavior were observed. I confirmed that there was no. A group of 10 mice was orally administered once a day with 100 μl of a harmful bacteria control agent containing the spore test suspension of Example 5 using a stomach tube. Similarly, tests were also conducted on harmful fungus control agents containing the spore suspensions of Examples 6-8 and compositions containing the spore suspensions of Comparative Examples 12 and 13. In addition, a test was similarly conducted using a composition containing sterile water instead of the spore suspension as a control example.
Seven days after the start of administration of the spore suspension, 2.1 × 10 7 Vibrio parahaemolyticus (VP) per mouse was orally administered using a stomach tube. The contents of the small intestine were collected on the 14th day after oral administration of VP. The viable count of VP was measured by the following method. 1 g of the contents of the small intestine was added to a salt polymyxin bouillon “Nissui” (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), diluted 10 times, and mixed well to prepare a sample stock solution. Subsequently, the sample stock solution was serially diluted 10 times with a saline polymyxin broth. Apply 0.1 ml each of the sample stock solution and serially diluted solution to TCBS agar medium “Nissui” (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), incubate at 37 ° C. for 18 hours, and grow typical VP grown on each plate medium. The number of colonies was measured. The number of colonies was multiplied by the dilution factor of the diluent to calculate the number of VP bacteria per gram of contents of the small intestine.
さらに、小腸内容物中のホモセリンラクトンの有無を調べた。上記（５）における方法と同様にして、小腸内容物の抽出物を、ＣＶ０２６を重層したＬＢ培地の表面に滴下し、培養した後、滴下した周辺におけるビオラセインの誘導の有無を観察した。
結果を表６に示した。
Furthermore, the presence or absence of homoserine lactone in the small intestine contents was examined. In the same manner as in the above method (5), the extract of the small intestine contents was dropped on the surface of the LB medium overlaid with CV026, cultured, and then the presence or absence of induction of violacein was observed around the dropped area.
The results are shown in Table 6.
実施例５〜８のバチルス・チューリンゲンシスの胞子を含む本発明の有害菌の防除剤を投与したマウスは、小腸内容物のＶＰの生菌数が低く、小腸の膨満や腸内容物の充満はほとんど認められなかった。一方、比較例１２及び１３の細菌を投与したマウスは、対照例と比較するとわずかにＶＰの増殖が抑制されているのみであり、小腸が赤く膨満し腸内容物の充満が認められた。また、対照例では小腸が赤く膨満し腸内容物の充満が認められた。これにより、バチルス・チューリンゲンシスの胞子を投与することにより、ＶＰの増殖が抑制されること、細菌自己誘発因子の発現が抑制されることが示された。すなわち、バチルス・チューリンゲンシスの胞子を投与することによりＶＰによる腸内感染症を予防・治療する効果が奏されることが分かる。 In mice administered with the harmful fungus control agent of the present invention containing Bacillus thuringiensis spores of Examples 5 to 8, the viable count of VP in the small intestine contents is low, and the small intestine is full and the intestinal contents are full. Almost not recognized. On the other hand, in the mice administered with the bacteria of Comparative Examples 12 and 13, the growth of VP was slightly suppressed as compared with the control example, and the small intestine was swollen in red and the intestinal contents were filled. In the control example, the small intestine swelled red and the intestinal contents were filled. Thus, it was shown that administration of Bacillus thuringiensis spores suppresses the growth of VP and suppresses the expression of bacterial self-inducing factors. That is, it can be seen that administration of Bacillus thuringiensis spores has the effect of preventing and treating enteric infections caused by VP.
（７）キャンピロバクター菌の感染に対する防御試験
前記（５）の試験と同様にして７週齢のＳＰＦマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オリエンタル酵母工業（株）、オス）の予備飼育を行い、外観や行動の異常が無いことを確認した。マウス１０匹を一群として、実施例５の胞子験濁液を含む有害菌の防除剤を１日１回、１匹当たり１００μｌ、胃ゾンデを用いて経口投与した。同様に、実施例６〜８の胞子懸濁液を含む有害菌の防除剤、比較例１２及び１３の胞子懸濁液を含む組成物についても試験を行った。また、胞子懸濁液の代わりに滅菌水を含む組成物を対照例とし、同様に試験を行った。
胞子懸濁液の投与開始後７日目に１匹当たり１．７×１０7のCampylobacter jejuni (ＣＪ)を胃ゾンデを用いて経口投与した。ＣＪの経口投与１４日目に小腸内容物を採取した。ＣＪの生菌数は以下の方法で測定した。小腸内容物１ｇを滅菌リン酸緩衝生理食塩水を加えて１０倍に希釈し、十分混合して試料原液とした。ついで、試料原液を滅菌生理食塩水を用いて１０倍で段階希釈した。試料原液及び段階希釈液をそれぞれ変法スキロー培地（日水製薬(株)製品）に０．１ｍｌずつ塗まつしアネロパックキャンピロ（三菱ガス化学(株)製）を用いて、微好気条件下４２℃で２〜３日間培養し、各平板培地に生育した典型的なＣＪのコロニー数を測定した。ＣＪと認められたコロニー数に希釈液の希釈倍率を乗じて小腸内容物１ｇ当たりのＣＪ菌数を算出した。
(7) Protection test against Campylobacter infection In the same manner as in the test of (5) above, 7 weeks old SPF mice (BALB / c, Oriental Yeast Co., Ltd., male) were preliminarily raised, It was confirmed that there were no behavioral abnormalities. A group of 10 mice was orally administered once a day with 100 μl of a harmful bacteria control agent containing the spore test suspension of Example 5 using a stomach tube. Similarly, tests were also conducted on harmful fungus control agents containing the spore suspensions of Examples 6-8 and compositions containing the spore suspensions of Comparative Examples 12 and 13. In addition, a test was similarly conducted using a composition containing sterile water instead of the spore suspension as a control example.
Seven days after the start of administration of the spore suspension, 1.7 × 10 7 Campylobacter jejuni (CJ) per mouse was orally administered using a stomach tube. The contents of the small intestine were collected on the 14th day after oral administration of CJ. The viable count of CJ was measured by the following method. 1 g of the contents of the small intestine was diluted 10-fold by adding sterile phosphate buffered saline, and mixed well to obtain a sample stock solution. Subsequently, the sample stock solution was serially diluted 10 times with sterile physiological saline. Apply 0.1 ml each of the sample stock solution and serial diluted solution to modified skilow medium (product of Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and use anero-pack campyro (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.), microaerobic conditions The cells were cultured at 42 ° C. for 2 to 3 days, and the number of colonies of typical CJ grown on each plate medium was measured. The number of colonies recognized as CJ was multiplied by the dilution factor of the diluent to calculate the number of CJ bacteria per gram of the small intestine contents.
さらに、小腸内容物中のホモセリンラクトンの有無を調べた。上記（５）における方法
と同様にして、小腸内容物の抽出物を、ＣＶ０２６を重層したＬＢ培地の表面に滴下し、培養した後、滴下した周辺におけるビオラセインの誘導の有無を観察した。
結果を表７に示した。
Furthermore, the presence or absence of homoserine lactone in the small intestine contents was examined. In the same manner as in the above method (5), the extract of the small intestine contents was dropped on the surface of the LB medium overlaid with CV026, cultured, and then the presence or absence of induction of violacein was observed around the dropped area.
The results are shown in Table 7.
実施例５〜８のバチルス・チューリンゲンシスの胞子を含む本発明の有害菌の防除剤を投与したマウスは、小腸内容物のＣＪの菌体濃度が低く、小腸の腸粘膜に浮腫と出血性病変は認められなかった。一方、比較例１２及び１３の細菌を投与したマウスは、対照例と比較するとわずかにＣＪの増殖が抑制されているのみであり、小腸の腸粘膜に浮腫と出血性病変が認められた。また、対照例では小腸の腸粘膜に浮腫と出血性病変が認められた。これにより、バチルス・チューリンゲンシスの胞子を投与することにより、ＣＪの増殖が抑制されること、細菌自己誘発因子の発現が抑制されることが示された。すなわち、バチルス・チューリンゲンシスの胞子を投与することによりＣＪによる腸内感染症を予防・治療する効果が奏されることが分かる。 The mice administered with the harmful fungus control agent of the present invention containing Bacillus thuringiensis spores of Examples 5 to 8 had a low CJ cell concentration in the small intestine contents, and edema and hemorrhagic lesions in the intestinal mucosa of the small intestine Was not recognized. On the other hand, in the mice administered with the bacteria of Comparative Examples 12 and 13, CJ proliferation was only slightly suppressed as compared with the control examples, and edema and hemorrhagic lesions were observed in the intestinal mucosa of the small intestine. In the control, edema and hemorrhagic lesions were found in the intestinal mucosa of the small intestine. Thus, it was shown that administration of Bacillus thuringiensis spores suppresses the growth of CJ and suppresses the expression of bacterial self-inducing factors. In other words, it can be seen that administration of Bacillus thuringiensis spores has the effect of preventing and treating intestinal infections caused by CJ.
（８）バチルス・チューリンゲンシスを含む医薬
（Ａ）軟膏剤
前述の胞子形成培地を用いてバチルス・チューリンゲンシスＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４及びＢＧＳＣ ４Ｑ７を３７℃で７２時間液体培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集めた。得られた菌体を凍結乾燥した後に粉砕した後、胞子密度が１×１０9ＣＦＵ／ｇになるようにＤ（＋）トレハロース二水和物（試薬特級、和光純薬工業(株)製品）を加えた。このようにして得たバチルス・チューリンゲンシス細菌の胞子を含むトレハロース１ｇと６０℃に加温したポリエチレン樹脂・流動パラフィン軟膏（商品名：プラスチベース、大正製薬製）を５ｇ添加し、十分混和し、さらにポリエチレン樹脂・流動パラフィン軟膏を加え全量を１００ｇに合わせた後、均一に練り合わせ軟膏剤を得てそれぞれ実施例９〜１２とした。実施例９〜１２の軟膏剤の胞子密度は、おのおの１．１×１０7ＣＦＵ／ｇ、１．２×１０7ＣＦＵ／ｇ、１．０×１０7ＣＦＵ／ｇ、及び１．１×１０7ＣＦＵ／ｇであった。胞子密度は、軟膏剤をツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０、登録商標）を０．１質量％含む滅菌水で適当な濃度まで希釈し、７０℃で３０分加熱することにより栄養細胞のみを死滅させてから普通寒天培地に接種し、形成されたコロニー数を計数することにより測定した。一方、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)ＮＢＲＣ１２５８３株及びバチルス・サブチルス(Bacillus subtilis) Ｎ
ＢＲＣ３００９株を用いて上記と同様にして軟膏剤を製造し、 おのおの比較例１４及び１５とした。得られた比較例１４及び１５の軟膏剤の胞子密度は、おのおの１．０×１０7ＣＦＵ／ｇ及び１．１×１０7ＣＦＵ／ｇであった。また、バチルス菌を添加していないＤ（＋）トレハロース二水和物を用いて上記と同様にして製造した軟膏剤を対照例とした。
(8) Pharmaceutical (A) Ointment containing Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis BGSC 4A3, BGSC 4D1, BGSC 4J4 and BGSC 4Q7 were liquid cultured at 37 ° C. for 72 hours using the above-mentioned sporulation medium. The obtained culture broth was centrifuged to collect microbial cells. The obtained cells are freeze-dried and then pulverized, and then D (+) trehalose dihydrate (reagent special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. product) so that the spore density is 1 × 10 9 CFU / g. Was added. Add 1 g of trehalose containing spores of Bacillus thuringiensis bacteria thus obtained and 5 g of polyethylene resin / liquid paraffin ointment (trade name: Plastibase, manufactured by Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.) heated to 60 ° C., and mix well. After adding polyethylene resin and liquid paraffin ointment to make the total amount 100g, it knead | mixed uniformly and obtained the ointment and it was set as Examples 9-12, respectively. The spore densities of the ointments of Examples 9-12 were 1.1 × 10 7 CFU / g, 1.2 × 10 7 CFU / g, 1.0 × 10 7 CFU / g, and 1.1 × 10, respectively. 7 CFU / g. The spore density is usually determined after diluting only the vegetative cells by diluting the ointment to an appropriate concentration with sterile water containing 0.1% by weight of Tween 80 (registered trademark) and heating at 70 ° C. for 30 minutes. It was measured by inoculating an agar medium and counting the number of colonies formed. On the other hand, Bacillus coagulans NBRC12583 strain and Bacillus subtilis N
An ointment was produced in the same manner as described above using BRC3009 strain, and designated as Comparative Examples 14 and 15, respectively. The spore densities of the obtained ointments of Comparative Examples 14 and 15 were 1.0 × 10 7 CFU / g and 1.1 × 10 7 CFU / g, respectively. In addition, an ointment produced in the same manner as described above using D (+) trehalose dihydrate to which no Bacillus was added was used as a control example.
ＳＤラット（オリエンタル酵母工業(株)、オス、導入時１２０ｇ）を、１０匹を１群として、７群について、飼育温度２３℃、自由給水、実験動物用飼料ＭＦ（オリエンタル酵母工業(株)製品）の自由給餌で一週間予備飼育を行い、外観や行動の異常の無いことを確認した。ラットをペントバルビタールで麻酔し、右大腿部を除毛してから固定台に固定し、ディスポシリンジの底部（直径１６ｍｍ）で１日６時間、６日間連続して圧迫（圧力：１．０ｋｇ／ｃｍ2)した。シリンジの底部とラットの大腿部の間には、シリコンの薄いクッションを入れた。 SD rats (Oriental Yeast Co., Ltd., male, 120 g at the time of introduction), 10 animals as one group, 7 groups, breeding temperature 23 ° C., free water supply, laboratory animal feed MF (Oriental Yeast Industry Co., Ltd. product) ) Free-feeding for 1 week and confirmed that there was no abnormality in appearance or behavior. Rats were anesthetized with pentobarbital, the right thigh was removed, and then fixed to a fixed base, and pressed at the bottom of the disposable syringe (diameter 16 mm) for 6 hours a day for 6 consecutive days (pressure: 1.0 kg) / Cm 2 ). A thin cushion of silicon was placed between the bottom of the syringe and the rat's thigh.
圧迫試験終了後、上記で得た実施例、比較例及び対照例の軟膏剤を各群の褥瘡部に１日当たり１００ｍｇ投与し、それぞれの軟膏剤について薬効評価を行った。薬効判定は、肉眼的観察及び病理組織学的観察により行った。
肉眼的観察は、ノギスを用いて褥瘡部の長径と短径を測定し、経過日数に対する褥瘡部の面積変化及び治療日数を測定することにより行った。
まず、褥瘡作成２日目の褥瘡部の長径と短径の積を１００％として、これに対する３日目以降の長径と短径の積の比率（面積比）を次式より算出した。
面積比（％）＝（褥瘡部の長径×短径［観測日］）×１００／（褥瘡部の長径×短径［褥瘡作成２日目］）
この面積比ｙを経過日数ｘに対してプロットして曲線ｆ（ｘ）を得て、
０≦ｙ≦ｆ（ｘ）
５≦ｘ≦２０
で表される領域のおよその面積を下記式より求め、治癒経過の指標とした。すなわち、褥瘡部が小さくなるまでに、日数がかかるほど、治癒経過の指標は大きくなる。
After completion of the compression test, 100 mg per day of the ointments of Examples, Comparative Examples and Control Examples obtained above were administered to the pressure ulcers of each group, and the efficacy of each ointment was evaluated. The drug efficacy was determined by visual observation and histopathological observation.
Macroscopic observation was performed by measuring the major axis and minor axis of the pressure ulcer using calipers, and measuring the change in the area of the pressure ulcer with respect to the number of days elapsed and the number of treatment days.
First, assuming that the product of the major axis and minor axis of the pressure sore part on the second day of pressure sore creation was 100%, the ratio (area ratio) of the product of major axis and minor axis on and after day 3 was calculated from the following equation.
Area ratio (%) = (major axis of acne part × minor axis [observation date]) × 100 / (minor axis of acne part × minor axis [second day of acne creation])
The area ratio y is plotted against the elapsed days x to obtain a curve f (x),
0 ≦ y ≦ f (x)
5 ≦ x ≦ 20
The approximate area of the region represented by is obtained from the following formula and used as an index of healing progress. That is, the longer the number of days it takes for the pressure ulcer to become smaller, the larger the index of healing progress.
また、褥瘡部が上皮形成を完了し、治癒するまでに要した日数を治癒日数とした。
結果を表８に示した。
In addition, the number of days required for the pressure ulcer part to complete epithelialization and heal was defined as the number of days to heal.
The results are shown in Table 8.
表８より、実施例９〜１２の軟膏剤を塗布した場合は、比較例１４及び１５の軟膏剤を塗布した場合に比して、治癒日数が短くなった。また、治癒経過の指標も小さく、早期に高い治癒率が得られた。 From Table 8, when the ointments of Examples 9 to 12 were applied, the number of healing days was shorter than when the ointments of Comparative Examples 14 and 15 were applied. In addition, the index of healing progress was small, and a high healing rate was obtained early.
また、軟膏剤塗布開始５日目及び１０日目に褥瘡部皮膚を摘出し、１０％中性緩衝フォルマリン液で固定した後、常法に従ってパラフィン切片を作製しヘマトキシリン・エオジン染色を行い、病理組織学的観察を行った。
病理組織学的観察の結果、実施例９〜１２の軟膏剤を塗布した群では、塗布開始５日目に、残存した毛嚢細胞の上皮組織の再生が認められ、辺縁より痂皮の剥離が見られた。再生上皮の下層では肉芽組織形成が著明で、比較例１４及び１５と比較して組織修復が著明であった。さらに塗布開始１０日目には、辺縁より上皮伸長が著明に認められ、細胞湿潤は上層のみに限局され、再生上皮で繊維形成も見られ、治癒に向かっていた。一方、比較例１４及び１５の軟膏剤を塗布した褥瘡部の辺縁は再生上皮の被覆が認められ、欠損部は厚い痂皮に覆われ、上皮伸長が抑制されていた。これらの結果より、実施例９〜１２のバチルス・チューリンゲンシスを含む軟膏剤は、損傷治癒促進効果を有することが分かった。
On the 5th and 10th days after the start of ointment application, the skin of the pressure ulcer was removed, fixed with 10% neutral buffered formalin solution, paraffin sections were prepared according to a conventional method, and hematoxylin / eosin staining was performed. Histological observations were made.
As a result of histopathological observation, in the group to which the ointments of Examples 9 to 12 were applied, regeneration of the epithelial tissue of the remaining hair follicle cells was observed on the fifth day from the start of application, and the scab peeled off from the margin It was observed. Granulation tissue formation was remarkable in the lower layer of the regenerative epithelium, and tissue repair was remarkable as compared with Comparative Examples 14 and 15. Furthermore, on the 10th day from the start of application, epithelial elongation was clearly observed from the margin, cell wetting was limited only to the upper layer, fiber formation was also observed in the regenerated epithelium, and he was heading for healing. On the other hand, the margin of the pressure ulcer part to which the ointment of Comparative Examples 14 and 15 was applied was found to be covered with regenerated epithelium, the defective part was covered with a thick scab, and epithelial elongation was suppressed. From these results, it was found that the ointment containing Bacillus thuringiensis of Examples 9 to 12 had an effect of promoting damage healing.
（Ｂ）整腸剤
前述の胞子形成培地を用いてバチルス・チューリンゲンシスＢＧＳＣ ４Ｄ１を３７℃で７２時間液体培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集めた。得られた菌体を凍結乾燥し、粉砕した後、胞子密度が２×１０7ＣＦＵ／ｇになるようにＤ（＋）トレハロース二水和物（試薬特級、和光純薬工業(株)製品）を加えた。このようにして得たバチルス・チューリンゲンシス細菌の胞子を含むトレハロース５０質量部とバレイショデンプン５０質量部を混合し、一錠あたり３５０ｍｇの錠剤に製剤化することにより、整腸剤を製造し、実施例１３とした。実施例１３の整腸剤の胞子密度は１．１×１０7ＣＦＵ／ｇであった。胞子密度は、整腸剤を適当な濃度まで滅菌水で希釈し、７０℃で３０分加熱することにより栄養細胞のみを死滅させてから普通寒天培地に接種し、形成されたコロニー数を計数することにより測定した。一方、バチルス・コアギュランスＮＢＲＣ１２５８３を用いて上記と同様にして整腸剤を製造し、比較例１６とした。比較例１６の整腸剤の胞子密度は１．２×１０7ＣＦＵ／ｇであった。また、バチルス菌を添加していないＤ（＋）トレハロース二水和物を用いて上記と同様にして製造した組成物を対照例とした。
(B) Intestinal agent Bacillus thuringiensis BGSC 4D1 was liquid-cultured at 37 ° C. for 72 hours using the above-mentioned sporulation medium. The obtained culture broth was centrifuged to collect microbial cells. The microbial cells obtained were freeze-dried and pulverized, and then D (+) trehalose dihydrate (reagent special grade, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. product) so that the spore density was 2 × 10 7 CFU / g. Was added. Example 13 An intestinal preparation was prepared by mixing 50 parts by mass of trehalose containing spores of Bacillus thuringiensis bacteria thus obtained and 50 parts by mass of potato starch, and preparing a tablet of 350 mg per tablet. It was. The spore density of the intestinal regulating agent of Example 13 was 1.1 × 10 7 CFU / g. Spore density is determined by diluting the intestinal preparation with sterilized water to an appropriate concentration, killing only vegetative cells by heating at 70 ° C. for 30 minutes, and then inoculating a normal agar medium and counting the number of colonies formed. It was measured. On the other hand, an intestinal regulating agent was produced in the same manner as described above using Bacillus coagulans NBRC12583, and Comparative Example 16 was obtained. The spore density of the intestinal regulating agent of Comparative Example 16 was 1.2 × 10 7 CFU / g. Moreover, the composition manufactured by carrying out similarly to the above using D (+) trehalose dihydrate which does not add a Bacillus bacterium was made into the control example.
（ａ）軟便の改善試験
軟便の成人を対象として、バチルス・チューリンゲンシスを含む整腸剤が、便性に及ぼ
す影響について検討した。４０代男性１１人、及び５０代の男性７人に、前記の実施例１３の整腸剤を朝食、昼食、及び夕食後におのおの３錠、２週間摂取させた。次の２週間は、対照例の組成物を摂取させた。さらに次の２週間は、比較例１６の整腸剤を摂取させた。摂取期間開始前の２週間を非摂取期間とし、非摂取期間及びそれぞれの摂取期間について便性に関するアンケート調査を実施した。すなわち便の形状及び硬さについて下記の評価に従って記録させた。
便の形状：１．水状 ２．泥状 ３．半練り状 ４．バナナ状 ５．カチカチ状６．コロコロ状
便の硬さ：１．非常に柔らかい ２．軟らかい ３．ふつう ４．硬い ５．非常に硬い
結果を表９に示した。
(A) Soft stool improvement test The effect of an intestinal regulating agent containing Bacillus thuringiensis on fecal characteristics was studied in adults with soft stool. 11 men in their 40s and 7 men in their 50s were given 3 tablets of the above-mentioned intestinal preparation of Example 13 for 2 weeks after breakfast, lunch, and dinner, respectively. For the next two weeks, the control composition was ingested. Further, for the next 2 weeks, the intestinal preparation of Comparative Example 16 was ingested. Two weeks before the start of the intake period were defined as a non-intake period, and a questionnaire survey on the convenience of the non-intake period and each intake period was conducted. That is, the feces shape and hardness were recorded according to the following evaluation.
Stool shape: 1. Water state 2. Mud Semi-kneaded 4 Banana shape 5. Tick-like 6 Hardness of stool stool: 1. Very soft 2. Soft Usually 4. 4. Hard The very hard results are shown in Table 9.
実施例１３の整腸剤を摂取することにより便の形状及び硬さについて、保形性が改善された。一方、比較例１６の整腸剤を摂取することによる便の形状及び硬さは対照例とほぼ同等であった。 Ingestion of the intestinal preparation of Example 13 improved the shape retention of the stool shape and hardness. On the other hand, the shape and hardness of the stool by ingesting the intestinal preparation of Comparative Example 16 was almost the same as that of the control example.
（ｂ）便秘の改善試験
便秘傾向を有する成人を対象として、バチルス・チューリンゲンシスの胞子を含む整腸剤が、便性に及ぼす影響について検討した。３０代女性１７人、及び４０代の女性５人に、前記の実施例１３の整腸剤を朝食、昼食、及び夕食後におのおの３錠、２週間摂取させた。次の２週間は、対照例の組成物を摂取させた。さらに次の２週間は、比較例１６の整腸剤を摂取させた。摂取期間の前に２週間非摂取期間を設け、便性に関するアンケート調査を実施した。排便回数、便の形状、すっきり感について下記の評価に従って記録させた。
排便回数：回／一週間
便の形状：１．水状 ２．泥状 ３．半練り状 ４．バナナ状 ５．カチカチ状６．コロコロ状
すっきり感：１．非常に悪い ２．悪い ３．ふつう ４．良い ５．非常に良い
結果を表１０に示した。
(B) Improvement test of constipation The effect of an intestinal preparation containing spores of Bacillus thuringiensis on stool properties was studied for adults with a tendency to constipation. Seventeen women in their 30s and five women in their 40s were allowed to take 3 tablets of the above-mentioned intestinal preparation of Example 13 for 2 weeks after breakfast, lunch, and dinner. For the next two weeks, the control composition was ingested. Further, for the next 2 weeks, the intestinal preparation of Comparative Example 16 was ingested. A 2-week non-intake period was set before the intake period, and a questionnaire survey on stool properties was conducted. The number of defecations, the shape of the stool, and a refreshing feeling were recorded according to the following evaluation.
Defecation frequency: times / week Stool shape: 1. Water state 2. Mud Semi-kneaded 4 Banana shape 5. Tick-like 6 A feeling of crispness: 1. Very bad Bad Usually 4. Good Very good results are shown in Table 10.
実施例１３の整腸剤を摂取することにより排便回数、便の形状、すっきり感について改善された。一方、比較例１６の整腸剤を摂取することによる排便回数、便の形状、すっき
り感は対照例とほぼ同等であった。
以上の結果より、バチルス・チューリンゲンシスの胞子を含む整腸剤は、便通、便性の改善に有用であることが明らかになった。
By ingesting the intestinal preparation of Example 13, the number of bowel movements, the shape of the stool, and a refreshing feeling were improved. On the other hand, the number of defecations, the shape of the stool, and a refreshing sensation due to the intake of the intestinal preparation of Comparative Example 16 were almost the same as the control example.
From the above results, it was revealed that an intestinal preparation containing spores of Bacillus thuringiensis is useful for improving bowel movement and stool property.
（９）バチルス・チューリンゲンシスを含む食品
前述の胞子形成培地を用いてバチルス・チューリンゲンシスＢＧＳＣ ４Ｄ１を３７℃で２４時間液体培養した。極小大豆を水道水で４℃、１晩浸漬し、圧力蒸煮釜で１２１℃、３０分滅菌した。このようにして調製した滅菌大豆に対して、上記のバチルス菌培養液の１０００倍希釈液を、滅菌大豆１００ｇあたり２ｍｌ植菌し、３７℃で４８時間培養した。更に、４℃で７２時間冷蔵熟成を行い、実施例１４とした。胞子密度は２．９×１０9ＣＦＵ／ｇであった。胞子密度は、大豆培養物１０ｇに滅菌水９０ｍｌを加え、ホモジナイザー（（株）日本精機製作所製）を用いて、１０，０００ｒｐｍで２分間ホモジナイズした後、さらに適当な濃度まで滅菌水で希釈し、７０℃で３０分加熱することにより栄養細胞のみを死滅させてから普通寒天培地に接種し、形成されたコロニー数を計数することにより測定した。バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis) ＮＢＲＣ３００９株を用いて上記と同様にして製造し、比較例１７とした。胞子密度は１．０×１０9ＣＦＵ／ｇであった。また、バチルス菌を添加していない滅菌大豆を対照例とした。
(9) Food containing Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis BGSC 4D1 was liquid-cultured at 37 ° C. for 24 hours using the aforementioned sporulation medium. Minimal soybeans were immersed in tap water at 4 ° C. overnight and sterilized in a pressure steamer at 121 ° C. for 30 minutes. The sterilized soybean thus prepared was inoculated with 2 ml of a 1000-fold diluted solution of the aforementioned Bacillus bacteria culture solution per 100 g of sterilized soybean and cultured at 37 ° C. for 48 hours. Furthermore, refrigerated aging was carried out at 4 ° C. for 72 hours to obtain Example 14. The spore density was 2.9 × 10 9 CFU / g. The spore density was determined by adding 90 ml of sterilized water to 10 g of soybean culture, homogenizing at 10,000 rpm for 2 minutes using a homogenizer (manufactured by Nippon Seiki Seisakusho), and further diluting with sterile water to an appropriate concentration. Only vegetative cells were killed by heating at 70 ° C. for 30 minutes, then inoculated on a normal agar medium, and the number of colonies formed was counted. A Bacillus subtilis NBRC3009 strain was used in the same manner as described above to obtain Comparative Example 17. The spore density was 1.0 × 10 9 CFU / g. In addition, a sterilized soybean to which no Bacillus was added was used as a control example.
（ａ）軟便の改善試験
軟便の成人を対象として、バチルス・チューリンゲンシスを含む食品が、便性に及ぼす影響について検討した。４０代男性１１人、及び５０代の男性７人に、前記の実施例１４の食品を一日当たり１００ｇを、２週間喫食させた。次の２週間は、対照例の食品を喫食させた。さらに次の２週間は、比較例１７の食品を喫食させた。喫食期間の前に２週間非喫食期間を設け、便性に関するアンケート調査を実施した。便の形状及び硬さについて下記の評価に従って記録させた。
便の形状：１．水状 ２．泥状 ３．半練り状 ４．バナナ状 ５．カチカチ状６．コロコロ状
便の硬さ：１．非常に柔らかい ２．軟らかい ３．ふつう ４．硬い ５．非常に硬い
結果を表１１に示した。
(A) Soft stool improvement test The effects of foods containing Bacillus thuringiensis on fecal characteristics were examined in adults with soft stool. Eleven men in their 40s and seven men in their 50s were allowed to eat 100 g of the food of Example 14 per day for two weeks. For the next two weeks, the control food was consumed. Further, for the next two weeks, the food of Comparative Example 17 was eaten. A 2-week non-eating period was set up before the eating period, and a questionnaire survey on convenience was conducted. The shape and hardness of the stool was recorded according to the following evaluation.
Stool shape: 1. Water state 2. Mud Semi-kneaded 4 Banana shape 5. Tick-like 6 Hardness of stool stool: 1. Very soft 2. Soft Usually 4. 4. Hard The very hard results are shown in Table 11.
実施例１４の食品を摂取することにより便の形状及び硬さについて、保形性が改善された。一方、比較例１７の食品を摂取することによる便の形状及び硬さは対照例とほぼ同等であった。 By ingesting the food of Example 14, shape retention was improved with respect to the shape and hardness of the stool. On the other hand, the shape and hardness of the stool by ingesting the food of Comparative Example 17 was almost the same as the control example.
（ｂ）便秘の改善試験
便秘傾向を有する成人を対象として、バチルス・チューリンゲンシスの胞子を含む食品が、便性に及ぼす影響について検討した。３０代女性１７人、及び４０代の女性５人に、前記の実施例１４の食品を一日当たり１００ｇ、２週間喫食させた。次の２週間は、対照例の食品を喫食させた。さらに次の２週間は、比較例１７の食品を喫食させた。喫食期間の前に２週間非喫食期間を設け、便性に関するアンケート調査を実施した。排便回数、便の形状、すっきり感について下記の評価に従って記録させた。
排便回数：回／一週間
便の形状：１．水状 ２．泥状 ３．半練り状 ４．バナナ状 ５．カチカチ状６．コロコロ状
すっきり感：１．非常に悪い ２．悪い ３．ふつう ４．良い ５．非常に良い
結果を表１２に示した。
(B) Improvement test of constipation The effect of a food containing Bacillus thuringiensis spores on feces was studied for adults with a tendency to constipation. 17 women in their 30s and 5 women in their 40s were allowed to eat 100 g of the food of Example 14 for 2 weeks. For the next two weeks, the control food was consumed. Further, for the next two weeks, the food of Comparative Example 17 was eaten. A 2-week non-eating period was set up before the eating period, and a questionnaire survey on convenience was conducted. The number of defecations, the shape of the stool, and a refreshing feeling were recorded according to the following evaluation.
Defecation frequency: times / week Stool shape: 1. Water state 2. Mud Semi-kneaded 4 Banana shape 5. Tick-like 6 A feeling of crispness: 1. Very bad Bad Usually 4. Good Very good results are shown in Table 12.
実施例１４の食品を喫食することにより排便回数、便の形状、すっきり感について改善された。一方、比較例１７の食品を喫食することによる排便回数、便の形状、すっきり感は対照例とほぼ同等であった。
以上の結果より、バチルス・チューリンゲンシスの胞子を含む食品は、便通、便性の改善に有用であることが明らかになった。
By eating the food of Example 14, the number of defecations, the shape of the stool, and a refreshing feeling were improved. On the other hand, the number of defecations, the shape of the stool, and a refreshing feeling due to eating the food of Comparative Example 17 were almost the same as the control example.
From the above results, it was revealed that foods containing spores of Bacillus thuringiensis are useful for improving bowel movements and stool properties.
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006286093A JP2007291057A (en) | 2006-03-29 | 2006-10-20 | Harmful bacteria-controlling agent for human containing bacillus thuringiensis |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006090766 | 2006-03-29 | ||
| PCT/JP2006/319957 WO2007058027A1 (en) | 2005-11-18 | 2006-10-05 | Harmful bacterium control agent containing bacillus thuringiensis |
| JP2006286093A JP2007291057A (en) | 2006-03-29 | 2006-10-20 | Harmful bacteria-controlling agent for human containing bacillus thuringiensis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007291057A true JP2007291057A (en) | 2007-11-08 |
| JP2007291057A5 JP2007291057A5 (en) | 2009-08-20 |
Family
ID=38762046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006286093A Pending JP2007291057A (en) | 2006-03-29 | 2006-10-20 | Harmful bacteria-controlling agent for human containing bacillus thuringiensis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007291057A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007297365A (en) * | 2006-04-05 | 2007-11-15 | Idemitsu Kosan Co Ltd | Harmful bacterium control agent containing bacillus thuringiensis |
| JP2012016320A (en) * | 2010-07-09 | 2012-01-26 | Yukijirushi Shubyo Kk | Serotonin-metabolic bacillus |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000103740A (en) * | 1997-11-27 | 2000-04-11 | Taki Seibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | Drug and feed for fishes and shellfishes |
| JP2000102378A (en) * | 1997-08-18 | 2000-04-11 | Taki Seibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | High-density bacillus sp and highly concentrated bacillus sp metabolite-including material, and production and utilization thereof |
| JP2000143521A (en) * | 1997-12-08 | 2000-05-23 | Taki Seibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | Biological material for animal, feed and chemical for plant |
| JP2002284800A (en) * | 2001-03-27 | 2002-10-03 | Fukuoka Prefecture | Protein having antitrichomonal activity and derived from bacillus thuringiensis and method for preparing the same |
| JP2007159563A (en) * | 2005-11-18 | 2007-06-28 | Idemitsu Kosan Co Ltd | Feed additive containing bacillus thuringiensis |
| JP2007244372A (en) * | 2006-02-16 | 2007-09-27 | Idemitsu Kosan Co Ltd | Feed additive for preventing/treating intestinal infectious disease of animal, containing bacillus thuringiensis |
-
2006
- 2006-10-20 JP JP2006286093A patent/JP2007291057A/en active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000102378A (en) * | 1997-08-18 | 2000-04-11 | Taki Seibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | High-density bacillus sp and highly concentrated bacillus sp metabolite-including material, and production and utilization thereof |
| JP2000103740A (en) * | 1997-11-27 | 2000-04-11 | Taki Seibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | Drug and feed for fishes and shellfishes |
| JP2000143521A (en) * | 1997-12-08 | 2000-05-23 | Taki Seibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk | Biological material for animal, feed and chemical for plant |
| JP2002284800A (en) * | 2001-03-27 | 2002-10-03 | Fukuoka Prefecture | Protein having antitrichomonal activity and derived from bacillus thuringiensis and method for preparing the same |
| JP2007159563A (en) * | 2005-11-18 | 2007-06-28 | Idemitsu Kosan Co Ltd | Feed additive containing bacillus thuringiensis |
| JP2007244372A (en) * | 2006-02-16 | 2007-09-27 | Idemitsu Kosan Co Ltd | Feed additive for preventing/treating intestinal infectious disease of animal, containing bacillus thuringiensis |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007297365A (en) * | 2006-04-05 | 2007-11-15 | Idemitsu Kosan Co Ltd | Harmful bacterium control agent containing bacillus thuringiensis |
| JP2012016320A (en) * | 2010-07-09 | 2012-01-26 | Yukijirushi Shubyo Kk | Serotonin-metabolic bacillus |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2007058027A1 (en) | Harmful bacterium control agent containing bacillus thuringiensis | |
| KR101100043B1 (en) | Antiinflammatory composition containing Lactobacillus plantarum HY7711 as an effective factor | |
| Jampaphaeng et al. | Selection and evaluation of functional characteristics of autochthonous lactic acid bacteria isolated from traditional fermented stinky bean (Sataw-Dong) | |
| Poppi et al. | Effect of Lactobacillus sp. isolates supernatant on Escherichia coli O157: H7 enhances the role of organic acids production as a factor for pathogen control | |
| JP2007518693A (en) | Stable liquid probiotic composition, its preparation and application | |
| CN102533618A (en) | Lactobacillus plantarum CCFM8724 and application thereof | |
| WO2008023580A1 (en) | Animal feed additive | |
| CN111011856A (en) | Composition for relieving gastropathy, preparation method thereof and food for relieving gastropathy | |
| CN113040390B (en) | Probiotic salt-tolerant lactobacillus johnsonii and application thereof in preventing and treating pathogenic bacteria in livestock and poultry aquiculture | |
| WO2008067827A1 (en) | Bacillus smithii strain tbmi12 mscl p737 and use of endospores thereof as a probiotic or a food supplement | |
| WO1993013666A1 (en) | Probiotic for control of salmonella | |
| KR102251295B1 (en) | A composition for preventing or relieving hangover of the comprising heat-killed lactobacillus salivarius v133 as an active ingredient | |
| KR20230086639A (en) | Novel lactobacillus paracasei subsp. tolerans wikim0148 with potent anti-inflammatory activity and uses thereof | |
| CN114468306A (en) | Application of bacillus coagulans BC99 in preparing colitis relieving product or immunoregulation product | |
| CN101309696A (en) | Harmful bacterium control agent containing bacillus thuringiensis | |
| KR101446309B1 (en) | Bifidobacterium animalis strain producing conjugated linoleic acid and uses thereof | |
| JP2007291057A (en) | Harmful bacteria-controlling agent for human containing bacillus thuringiensis | |
| Koščová et al. | Effect of two plant extracts and Lactobacillus fermentum on colonization of gastrointestinal tract by Salmonella enterica var. Düsseldorf in chicks | |
| KR20240037981A (en) | Physiologically acceptable yeast compositions and uses thereof | |
| JP2007244372A (en) | Feed additive for preventing/treating intestinal infectious disease of animal, containing bacillus thuringiensis | |
| KR102262646B1 (en) | A composition for preventing or relieving hangover of the comprising heat-killed lactobacillus plantarum v135 as an active ingredient | |
| RU2605626C2 (en) | Method of producing bacterial preparation with probiotic activity | |
| JP2007159563A (en) | Feed additive containing bacillus thuringiensis | |
| JP2007117004A (en) | Animal feed additive containing bile acid tolerance bacterium | |
| Jaber et al. | Genetic and Morphological Effects of Lactobacillus Acidophillus on Some Virulence Factors of Proteus Mirabilis That Isolated From Diabetic Foot Ulcers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090706 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090706 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120403 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120731 |