JP2007278902A - Parvovirus b19 antigen measurement method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料中のパルボウイルスB19抗原を高感度に検出若しくは測定する方法及び検出若しくは測定する試薬若しくはキットに関する。 The present invention relates to a method for detecting or measuring parvovirus B19 antigen in a sample with high sensitivity, and a reagent or kit for detecting or measuring.
パルボウイルスは飛沫感染し、赤芽球で増殖する病原性ウイルスであり、その症状・疾患として、(1)伝染性紅斑(りんご病)(2)関節炎(3)造血障害発作(4)胎児水腫(hydrops fetal)などが知られている。 Parvovirus is a pathogenic virus that spreads in droplets and propagates in erythroblasts. Its symptoms and diseases are as follows: (1) infectious erythema (apple disease) (2) arthritis (3) hematopoietic disorder (4) fetal edema (Hydrops fetal) is known.
パルボウイルスB19(parvovirus B19)は、1975年にCossartらによって発見されたウイルスである(非特許文献1参照)。当該ウイルスはパルボウイルス科のパルボウイルス属に位置する一本鎖DNAウイルスで20nmの正20面体構造でエンベロープを持たない小型のウイルスである。 Parvovirus B19 (parvovirus B19) is a virus discovered by Cossart et al. In 1975 (see Non-Patent Document 1). The virus is a single-stranded DNA virus located in the parvovirus genus of the Parvoviridae family, and is a small virus having an icosahedral structure of 20 nm and no envelope.
B19ウイルスは、加熱(60℃30 分)、酸(pH3)、クロロホルム,有機溶剤、界面活性剤処理に抵抗する。そのため血液製剤製造工程中でのB19除去が困難であることから、赤十字血液センターでは原料血漿へのB19ウイルス混入を減らすことを目的に、1997 年よりすべての献血血液についてReceptor Mediated Hemagglutination(RHA)検査法によるB19 スクリーニング検査を実施している(非特許文献2参照)。その他のパルボウイルスB19抗原の測定法としては、PCR法によりウイルス遺伝子を増幅して測定する方法がある(非特許文献3参照)。また微量の抗原を抗パルボウイルスB19抗体で測定する方法として、検体をpH4.0以下の酸性条件で処理した後、免疫反応にあたってアルカリで検体を中和してから行う方法(特許文献1参照)等が報告されている。
RHA検査はその原理上3〜5日間のウイルス血症期には有効だが、それに続いてB19抗体の産生が始まると(抗原抗体複合期)B19のreceptorであるP抗原と抗体が競合し、RHA反応は著しく阻害され、当該期間に献血されたパルボウイルスB19陽性検体はRHA検査では検出できない。 The RHA test is effective in the viremia period of 3 to 5 days in principle, but when the production of the B19 antibody starts (antigen-antibody complex phase), the P antigen which is the receptor of B19 competes with the antibody, and the RHA The reaction is markedly inhibited, and parvovirus B19 positive specimens donated during that period cannot be detected by RHA testing.
PCR法による検査は、ターゲットであるパルボウイルスB19遺伝子を増幅して測定する方法であり高感度な測定法ではあるが、測定するウイルスを抽出するための装置や増幅するための装置を必要とし、測定には多大な時間と高価な器機を必要とする。また、測定対象の検体へのコンタミネーションにより偽陽性が発生するおそれがある。 The PCR method is a method for amplifying and measuring the target parvovirus B19 gene and is a highly sensitive measurement method, but requires a device for extracting the virus to be measured and a device for amplifying it, The measurement requires a lot of time and expensive equipment. Moreover, there is a possibility that false positives may occur due to contamination on the sample to be measured.
B19抗原に対する抗体を用いた免疫測定法によっても、ヒトパルボウイルスを検出することが可能であるが、検体中に存在するB19に結合する因子、例えば抗体、Globoside(blood group antigen P)、Ku80、Integrin α5β1等の影響により十分な測定感度を得ることが困難である。 Human parvovirus can also be detected by an immunoassay using an antibody against the B19 antigen, but a factor that binds to B19 present in the specimen, such as an antibody, Globoside (blood group antigen P), Ku80, It is difficult to obtain sufficient measurement sensitivity due to the influence of Integrin α5β1.
上記特許文献1は、パルボウイルスB19抗原を高感度に測定する免疫測定方法を開示しているが、当該測定方法では検体を塩酸等の酸で処理した後、アルカリ性溶液で所望のpHに中和する必要がある。このような工程は、全自動血液スクリーニングシステムに本方法を適用する上で大きな障害となる。 Patent Document 1 discloses an immunoassay method for measuring parvovirus B19 antigen with high sensitivity. In this assay method, a sample is treated with an acid such as hydrochloric acid and then neutralized to a desired pH with an alkaline solution. There is a need to. Such a process is a major obstacle to the application of this method to a fully automated blood screening system.
本願発明は、上記のようなRHA検査およびPCR法に伴う問題点を有さないヒトパルボウイルスB19抗原の免疫測定方法であって、酸性溶液による処理工程およびアルカリ性溶液による中和工程を含まない、簡便且つ高感度な測定方法を提供するものである。 The present invention is an immunoassay method for human parvovirus B19 antigen that does not have the problems associated with the RHA test and PCR method as described above, and does not include a treatment step with an acidic solution and a neutralization step with an alkaline solution. A simple and highly sensitive measurement method is provided.
本発明者らは、B19抗原の免疫学的測定に際して予め検体をグアニジンで処理することにより、高感度にパルボウイルスB19抗原を測定し得ることを見出した。 The present inventors have found that parvovirus B19 antigen can be measured with high sensitivity by treating a specimen with guanidine in advance for immunological measurement of B19 antigen.
本発明はかかる知見に基づいて、検体をグアニジン、グアニジン塩またはその誘導体を含む溶液で処理することを特徴とするヒトパルボウイルスB19抗原の免疫学的測定方法を提供するものである。 The present invention provides an immunoassay method for human parvovirus B19 antigen, which comprises treating a specimen with a solution containing guanidine, a guanidine salt or a derivative thereof based on such findings.
本発明において使用されるグアニジン塩としては、グアニジン塩酸塩、グアニジン炭酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジンリン酸塩、グアニジンスルファミン酸塩等があげられ、グアニジン誘導体としては、グアニジノ安息香酸、グアニジノグルタル酸、グアニジノコハク酸、グアニジノ酢酸、グアニジノプロピオン酸、グアニジノベンズイミダゾール等があげられる。 Examples of the guanidine salt used in the present invention include guanidine hydrochloride, guanidine carbonate, guanidine nitrate, guanidine phosphate, guanidine sulfamate, and the like, and guanidine derivatives include guanidinobenzoic acid, guanidinoglutaric acid, guanidino Succinic acid, guanidinoacetic acid, guanidinopropionic acid, guanidinobenzimidazole and the like.
検体処理のために添加するグアニジン、グアニジン塩またはその誘導体の濃度は最終濃度として0.1〜1Mの範囲であることが好ましく、また、そのpHは4.5〜6.5の範囲であることが好ましい。 The concentration of guanidine, guanidine salt or a derivative thereof added for sample treatment is preferably in the range of 0.1 to 1M as the final concentration, and the pH is preferably in the range of 4.5 to 6.5. .
本発明において使用する免疫測定方法は、競合法、サンドイッチ法等の公知のいずれの方法であってもよいが、特にサンドイッチ法が好ましい。 The immunoassay method used in the present invention may be any known method such as a competitive method or a sandwich method, but the sandwich method is particularly preferred.
本測定方法において用いる抗ヒトパルボウイルスB19抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、これら抗体はFab’、F(ab’)2等の抗体フラグメントであってもよい。 The anti-human parvovirus B19 antibody used in this measurement method may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. These antibodies may be antibody fragments such as Fab ′ and F (ab ′) 2 .
抗ヒトパルボウイルスB19抗体の作製用抗原または測定標準として用いられるヒトパルボウイルスB19抗原は、公知の方法、例えば特開平7−147986号に記載されている方法にしたがって作製することができる。 Antigen for producing anti-human parvovirus B19 antibody or human parvovirus B19 antigen used as a measurement standard can be produced according to a known method, for example, the method described in JP-A-7-147986.
サンドイッチ法で用いる固相としては、周知のマイクロプレート、ポリスチレンビーズ、ガラスビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子等が挙げられる。標識抗体への標識剤としては、蛍光物質、発光物質、酵素、放射性同位元素等が挙げられる。固相又は標識物への抗体を結合させる方法としては、周知の物理的吸着方法、化学的な反応による結合方法が挙げられる。 Examples of the solid phase used in the sandwich method include known microplates, polystyrene beads, glass beads, latex particles, and magnetic particles. Examples of the labeling agent for the labeled antibody include fluorescent substances, luminescent substances, enzymes, and radioisotopes. Examples of a method for binding an antibody to a solid phase or a label include a well-known physical adsorption method and a binding method using a chemical reaction.
本願発明は、B19抗原の免疫学的測定に際して予め検体をグアニジンで処理することにより、高感度にパルボウイルスB19抗原を測定し得るとの予期せぬ効果を奏するものである。 The present invention has an unexpected effect that parvovirus B19 antigen can be measured with high sensitivity by treating a specimen with guanidine in advance for immunological measurement of B19 antigen.
特開平11−344493号公報は、測定可能な濃度域が一定濃度範囲に限定される凝集反応を利用した免疫的測定法において、グアニジン、グアニジン塩またはその誘導体を反応系に共存させることにより測定可能な範囲が拡大することを教示している。 JP-A-11-344493 can measure by coexisting guanidine, a guanidine salt or its derivative in the reaction system in an immunoassay utilizing an agglutination reaction in which the measurable concentration range is limited to a certain concentration range. Teaches that this range is expanded.
本発明においてグアニジン類を用いる目的はあくまで凝集法特有の問題を解決するものであり、凝集法に限らず免疫測定法一般においてヒトパルボウイルスの測定感度を改善する本願発明の効果は特開平11−344493により予見し得るものではない。 The purpose of using guanidines in the present invention is merely to solve problems peculiar to the aggregation method, and the effect of the present invention for improving the measurement sensitivity of human parvovirus is not limited to the aggregation method, but in general immunoassay. This is not foreseeable by 344493.
特開平2001−33445号公報には、ウイルス抗原試薬の調製において、ウイルス抗原をタンパク質変性剤で処理した後に酸化剤で希釈または透析することにより当該ウイルス抗原の抗原活性を改善し得ることが記載されている。 JP-A-2001-33445 describes that in the preparation of a virus antigen reagent, the antigen activity of the virus antigen can be improved by treating the virus antigen with a protein denaturant and then diluting or dialyzing with an oxidizing agent. ing.
本願発明は、検体をグアニジン類で処理することにより、検体中に含まれる免疫反応に影響する因子を排除することによってパルボウイルス抗原の免疫測定方法の検出感度を改善するものであり、その目的、機作および構成が異なることから本願発明の効果は特開平2001−33445により予見し得るものではない。 The present invention improves the detection sensitivity of an immunoassay method for parvovirus antigens by treating a sample with guanidines to eliminate factors that affect the immune reaction contained in the sample. The effects of the present invention cannot be foreseen by Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-33445 because the mechanism and configuration are different.
特開平11−108932号公報には、ウイルスを含む検体を陰イオン界面活性剤とグアニジンを含む蛋白変性剤との並存下で処理する方法が示されている。かかる方法は、検体中の蛋白質のみならずウイルスのエンベロープ膜蛋白質を強力に破壊し、膜内中の抗原蛋白質を曝露させ、中和処理後に免疫反応により当該抗原蛋白質を測定する方法に関するもので、その明細書中にはパルボウイルスの記載も認められるが、実施例に列挙されているのはC型肝炎ウイルスのみであり、本願発明のグアニジンのみによるエンベロープ膜を有さないパルボウイルス含有検体処理の有効性を何ら示唆するものではない。 Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-108932 discloses a method for treating a specimen containing a virus in the presence of an anionic surfactant and a protein denaturant containing guanidine. This method relates to a method of strongly destroying not only the protein in the sample but also the viral envelope membrane protein, exposing the antigen protein in the membrane, and measuring the antigen protein by an immune reaction after neutralization treatment, Although the description of parvovirus is also found in the specification, only hepatitis C virus is listed in the examples, and the treatment of parvovirus-containing specimens having no envelope membrane by guanidine of the present invention alone is listed. It does not suggest any effectiveness.
特開平8−50133号公報は、外殻を有するウイルス、B型肝炎ウイルスの殻内タンパク質HBcAgの免疫測定方法において、HBcAg抗体に結合し、免疫測定を阻害する内因性の抗HBcAg抗体を予めタンパク質変性剤で不活性化した後に外殻を破壊し、露出したHBcAgを検出する方法を開示している。 JP-A-8-50133 discloses a method for immunoassay of a protein having an outer shell, HBcAg, a protein in the shell of hepatitis B virus, in which an endogenous anti-HBcAg antibody that binds to HBcAg antibody and inhibits immunoassay is preliminarily protein Disclosed is a method for destroying the outer shell after inactivation with a denaturant and detecting exposed HBcAg.
本願発明の測定対象であるパルボウイルスは外殻タンパク質を有さず、したがって特開平8−50133号に記載されたタンパク質変性剤による前処理をパルボウイルスの免疫測定において適用する合理的理由はない。 The parvovirus to be measured in the present invention does not have a shell protein, and therefore there is no reasonable reason to apply the pretreatment with a protein denaturant described in JP-A-8-50133 in immunoassay of parvovirus.
特開平7−151753号公報は、同一アッセイ系における抗原抗体反応時間の相違に起因する測定誤差、即ち「アッセイドリフト」の影響を回避することを目的として反応系にグアニジンを添加することを開示している。 Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-151753 discloses that guanidine is added to a reaction system for the purpose of avoiding the influence of a measurement error caused by a difference in antigen-antibody reaction time in the same assay system, that is, “assay drift”. ing.
特開平7−151753号公報に記載された発明の目的は、パルボウイルス抗原の簡便且つ高感度な測定方法を提供する本願発明の目的と全く異なるものであり、したがって本願発明の効果は特開平7−151753号公報の記載に基づき予見し得るものではない。 The object of the invention described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-151753 is completely different from the object of the present invention which provides a simple and highly sensitive method for measuring parvovirus antigens. -151753 is not predictable based on the description.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
ABBOTT PRISM システム
米国Abbott LaboratoriesのPRISM アナライザーを用いて実施した実施例を示す。システムは、輸血用血液の安全性を向上させ、効率的な血液供給を行うために開発された全自動血液スクリーニングシステムである。独自の化学発光免疫測定法による優れた感度と特異性に加え、160検体/時という大量検体の処理を実現する。
ABBOTT PRISM system An example carried out using the PRISM analyzer of Abbott Laboratories in the USA is shown. The system is a fully automatic blood screening system developed to improve the safety of blood for transfusion and to provide an efficient blood supply. In addition to the excellent sensitivity and specificity of our original chemiluminescence immunoassay, we can process a large number of samples at 160 samples / hour.
本システムでは、1検体あたり2つのウエル(インキュベーションウエルとリアクションウエル)を有するリアクショントレイ(16検体用)にて、化学発光免疫測定を実施する。 In this system, chemiluminescence immunoassay is performed in a reaction tray (for 16 samples) having two wells (incubation well and reaction well) per sample.
本法の原理は、インキュベーションウエル上で、検体、検体希釈液、及び抗原あるいは抗体を固相化したマイクロパーティクル懸濁液をインキュベーションし、検体中の抗体あるいは抗原を特異的にマイクロパーティクル上の抗原あるいは抗体に反応させる(一次反応)。反応生成物は、リアクションウエルに移送され、リアクションウエル中のグラスファイバーマトリックスに吸着される。この反応生成物は、アクリジニウム標識コンジュゲートにより検出される(二次反応)。このコンジュゲートは、アクチベータ溶液の存在下で化学発光を引き起こし、それを光電子増倍管で検出するものである。 The principle of this method is to incubate the specimen, specimen diluent, and the microparticle suspension on which the antigen or antibody is solid-phased in the incubation well, and specifically cause the antibody or antigen in the specimen to react with the antigen on the microparticle. Alternatively, it is reacted with an antibody (primary reaction). The reaction product is transferred to the reaction well and adsorbed on the glass fiber matrix in the reaction well. This reaction product is detected by an acridinium labeled conjugate (secondary reaction). This conjugate causes chemiluminescence in the presence of an activator solution and detects it with a photomultiplier tube.
以下、[パルボウイルス測定プロトコール]PRISMアナライザー上でのステップを示す。 [Parvovirus measurement protocol] The steps on the PRISM analyzer are shown below.
1)一次反応 リアクショントレイのインキュベーションウエル上で、以下に示す容量の検体、検体希釈液、及び抗パルボウイルス抗体を固相化したマイクロパーティクル懸濁液を混合する。 1) On the incubation well of the primary reaction reaction tray, a sample of the following volume, a sample diluent, and a microparticle suspension in which an anti-parvovirus antibody is immobilized are mixed.
検体(血清、または血漿) 50uLまたは、100uL
検体希釈液(Guanidine 溶液) 50uL
抗パルボウイルス抗体固相化マイクロパーティクル懸濁液 50uL
Sample (serum or plasma) 50uL or 100uL
Sample dilution (Guanidine solution) 50uL
Anti-parvovirus antibody immobilized microparticle suspension 50uL
2)インキュベーション 37℃、18分間インキュベーションし、検体中の抗体あるいは抗原を特異的にマイクロパーティクル上の抗原あるいは抗体に反応させる。 2) Incubation At 37 ° C. for 18 minutes, the antibody or antigen in the specimen reacts specifically with the antigen or antibody on the microparticle.
3)移送/洗浄 移送/洗浄液(トランスファーウォッシュ液)300uLを2回で、反応生成物をインキュベーションウエルからリアクションウエルに移送し、リアクションウエル中のグラスファイバーマトリックスに吸着させると同時に洗浄する。 3) Transfer / wash transfer / wash solution (transfer wash solution) 300 uL is transferred twice from the incubation well to the reaction well and adsorbed on the glass fiber matrix in the reaction well and washed at the same time.
4)二次反応 アクリジニウム標識コンジュゲート(アクリジニウム化抗パルボウイルス抗体)溶液 50uLをリアクションウエル中のグラスファイバーマトリックスに吸着し洗浄された反応生成物に滴下する。 4) Secondary reaction Acridinium-labeled conjugate (acridinized anti-parvovirus antibody) solution 50 uL is adsorbed onto the glass fiber matrix in the reaction well and added dropwise to the washed reaction product.
5)インキュベーション 37℃、22.7分間インキュベーションし、反応生成物とアクリジニウム標識コンジュゲートの反応を進行させ、検体中にパルボウイルス抗原が存在した場合、抗体固相化マイクロパーティクル−パルボウイルス抗原−コンジュゲート複合体を形成させる。 5) Incubation Incubate at 37 ° C for 22.7 minutes to allow the reaction product to react with the acridinium-labeled conjugate. When parvovirus antigen is present in the sample, antibody-immobilized microparticle-parvovirus antigen-conjugate complex Form the body.
6)洗浄 コンジュゲート浄液(コンジュゲートウォッシュ液)200uLを1回、次いで100uLを3回で、未反応のコンジュゲートを洗い流し、複合体を浄化する。 6) Wash conjugate conjugate solution (conjugate wash solution) 200 uL once, then 100 uL 3 times to wash away unreacted conjugate and purify the complex.
7)アクリジニウムの活性化 アクチベータ溶液 50uLを滴下し、複合体上のアクリジニウムを活性化する。 7) Activate the acridinium on the complex by adding 50uL of acridinium activation activator solution dropwise.
8)検出 アクリジニウムの活性化により引き起こされた化学発光を光電子増倍管で検出する(化学発光度は、RLU(相対的化学発光単位)値として数値化される)。 8) The chemiluminescence caused by the activation of the detected acridinium is detected with a photomultiplier tube (the chemiluminescence is quantified as an RLU (relative chemiluminescence unit) value).
実施例1 以下に実施例1で用いる試薬の調製に関して記述する。 Example 1 The following describes the preparation of the reagents used in Example 1.
1)パネル検体の調製:陽性検体(パルボウイルス B19 DNAレベル1013 IU/mL)を陰性検体(パルボウイルス B19 DNAレベル0 IU/mL)にて希釈し、1011、1010、109、108、107 IU/mLの感度パネルを調製した。 1) Preparation of panel sample: A positive sample (parvovirus B19 DNA level 10 13 IU / mL) is diluted with a negative sample (parvovirus B19 DNA level 0 IU / mL), and 10 11 , 10 10 , 10 9 , 10 A sensitivity panel of 8 , 10 7 IU / mL was prepared.
2)検体希釈液(Guanidine 溶液)の調製:クエン酸/リン酸緩衝液にグアニジン濃度が2Mとなるようにグアニジン塩酸塩を溶解させ、pHを5.5に調整した。 2) Preparation of specimen diluent (Guanidine solution): Guanidine hydrochloride was dissolved in a citrate / phosphate buffer so that the guanidine concentration was 2 M, and the pH was adjusted to 5.5.
3)抗パルボウイルス抗体固相化マイクロパーティクルの調製:反応pH 6.1(50mM MES緩衝液)容量10mLで、Merck社製蛋白質固相化用マイクロパーティクル(顆経0.4ミクロン)固形分1.0%、EDAC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride)0.3mg/mL、Sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) 0.45mg/mLの存在下、抗体0.5mg/mLを固相化した。室温で2時間反応後10mM リン酸、150mM NaClで洗浄し、オーバーコート緩衝液(10mM リン酸、150mM NaCl、1% BSA、5%ショ糖、0.1% Proclin 300, pH 7.2)中に固形分1.0%で保管した。PRISMアッセイ時は、マイクロパーティクル希釈液(10mM リン酸、150 mM NaCl, 13.6%ショ糖、0.05% Tween20, 0.1% NaN3、pH 7.0)にて固形分0.2%に調製した。 3) Preparation of anti-parvovirus antibody-immobilized microparticles: Reaction pH 6.1 (50 mM MES buffer) volume 10 mL, Merck protein-immobilized microparticles (condyle warp 0.4 micron) solid content 1.0%, EDAC ( In the presence of N- (3-Dimethylaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) 0.3 mg / mL and Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) 0.45 mg / mL, 0.5 mg / mL of antibody was immobilized. After 2 hours of reaction at room temperature, wash with 10 mM phosphoric acid and 150 mM NaCl, and add 1.0% solids in overcoat buffer (10 mM phosphoric acid, 150 mM NaCl, 1% BSA, 5% sucrose, 0.1% Proclin 300, pH 7.2) %. During the PRISM assay, the solid content was adjusted to 0.2% with a microparticle diluent (10 mM phosphoric acid, 150 mM NaCl, 13.6% sucrose, 0.05% Tween20, 0.1% NaN3, pH 7.0).
4)トランスファーウォッシュ液の調製:50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, 0.1% NaN3, pH 8.0の溶液を調製した。 4) Preparation of transfer wash solution: A solution of 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.1% NaN3, pH 8.0 was prepared.
5)アクリジニウム標識コンジュゲートの調製:反応pH 8.0(100mM PBS緩衝液)容量0.2mLで、Acridinium ester、250ug/mLと抗体5mg/mLを室温で3時間反応させた。10mM リン酸、150 mM NaClで透析後、TSKgel G300SWXL(トーソー株式会社)のカラムクロマトグラフィー、移動相0.1%CHAPS/PBS,pH6.3、流速1.0mL/分で主要ピークを分取して精製した。PRISMアッセイ時は、アクリジニウム標識コンジュゲート希釈液(10mM リン酸、150 mM NaCl、1% BSA、0.05% Tween20、0.1% NaN3、pH 7.0)にて蛋白質濃度100ng/mLに調製した。 5) Preparation of acridinium labeled conjugate: Acridinium ester, 250 ug / mL and antibody 5 mg / mL were reacted at room temperature for 3 hours at a reaction pH of 8.0 (100 mM PBS buffer) volume of 0.2 mL. After dialysis with 10 mM phosphoric acid and 150 mM NaCl, the main peak was separated and purified by column chromatography using TSKgel G300SWXL (Tosoh Corporation), mobile phase 0.1% CHAPS / PBS, pH 6.3, flow rate 1.0 mL / min. . During PRISM assay, the protein concentration was adjusted to 100 ng / mL with acridinium-labeled conjugate diluent (10 mM phosphoric acid, 150 mM NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween20, 0.1% NaN 3 , pH 7.0).
6)コンジュゲートウォッシュ液の調製:60mM Borate, 150 mM NaCl, 0.01% Lithium Dodecyl Sulfate, 0.1% NaN3, pH 8.5の溶液を調製した。 6) Preparation of conjugate wash solution: A solution of 60 mM Borate, 150 mM NaCl, 0.01% Lithium Dodecyl Sulfate, 0.1% NaN3, pH 8.5 was prepared.
7)アクチベータ溶液の調製:A液(0.4% Hydrogen Peroxide/0.06% Diethylenetriaminepentaacetic acid)とB液(0.3N Sodium Hydroxide)を等量、用事混合して調製した。 7) Preparation of activator solution: A solution (0.4% Hydrogen Peroxide / 0.06% Diethylenetriaminepentaacetic acid) and B solution (0.3N Sodium Hydroxide) were mixed in equal amounts and prepared.
実施例1: パルボウイルス陰性、パルボウイルス B19 DNAレベル:1011、1010、109、108、107 IU/mLの感度パネルを上述のABBOTT PRISMシステム[パルボウイルス測定プロトコール]に従いPRISM上で測定した。グアニジン処理の有無で比較した結果を表1に示す。抗体は抗パルボウイルスB19マウスモノクローナル抗体Mab−8およびMab−10を用いた。 Example 1: Parvovirus negative, parvovirus B19 DNA levels: 10 11 , 10 10 , 10 9 , 10 8 , 10 7 IU / mL of sensitivity panel on PRISM according to ABBOTT PRISM system [Parvovirus measurement protocol] described above It was measured. The results of comparison with and without guanidine treatment are shown in Table 1. Anti-parvovirus B19 mouse monoclonal antibodies Mab-8 and Mab-10 were used as antibodies.
抗体Mab−8/Mab−10およびMab−10/Mab−10いずれの組合わせにおいてもグアニジン溶液で希釈することにより検出感度が大きく改善されることが確認された。 It was confirmed that the detection sensitivity was greatly improved by diluting the antibody Mab-8 / Mab-10 and Mab-10 / Mab-10 with a guanidine solution.
実施例2: パルボウイルス B19陽性検体(パルボウイルス B19 DNA陽性検体21種)を上述のABBOTT PRISMシステム[パルボウイルス測定プロトコール]に従いPRISM上で測定した。グアニジン処理の有無で比較した結果を表2に示す。 測定に使用した各試薬は、実施例1で作製したものものを用いた。 各検体中の抗パルボウイルス B19抗体(IgG及びIgM)の陽性・陰性の判定を併せて示す。尚、抗体測定方法は、デンカ生研株式会社製キットの添付文書に従った。 Example 2: Parvovirus B19 positive specimens (21 parvovirus B19 DNA positive specimens) were measured on PRISM according to the above-mentioned ABBOTT PRISM system [Parvovirus measurement protocol]. Table 2 shows the results of comparison with and without guanidine treatment. The reagents used in Example 1 were used for each measurement. The positive / negative determination of anti-parvovirus B19 antibody (IgG and IgM) in each specimen is also shown. The antibody measurement method was in accordance with the package insert of the kit manufactured by Denka Seken Co., Ltd.
抗パルボウイルス抗体陽性検体中では、パルボウイルス抗原(主にキャプシド構造蛋白質VP1、VP2)に抗体が結合していると予想されるが、本願発明の方法ではグアニジン処理によりこれら因子間相互作用が破壊され、検査用抗体(抗パルボウイルス抗体固相化マイクロパーティクル、及びアクリジニウム標識コンジュゲート)による抗原の直接的な認識が可能になった。 In anti-parvovirus antibody-positive specimens, it is expected that antibodies bind to parvovirus antigens (mainly capsid structure proteins VP1 and VP2), but in the method of the present invention, the interaction between these factors is destroyed by guanidine treatment. As a result, the antigen can be directly recognized by the test antibody (anti-parvovirus antibody-immobilized microparticle and acridinium-labeled conjugate).
実施例3: 検体希釈液(Guanidine 溶液)の濃度並びにpHの最適化検討
実施例1の2)に示す検体希釈液(Guanidine 溶液)のグアニジン濃度とリン酸緩衝液又はクエン酸/リン酸緩衝液によるpH調整を検討した。2)以外の試薬は、実施例1で作製したものものを用いた。検討に用いたのはパルボウイルス B19陽性パネル( DNAレベル:1010)並びに陰性パネルを用いた。pH5.5〜6.5の検討は、クエン酸緩衝液で実施、pH4.5〜6.0はクエン酸/リン酸緩衝液で実施した。
Example 3: Examination of optimization of concentration and pH of sample diluent (Guanidine solution) Guanidine concentration and phosphate buffer solution or citrate / phosphate buffer solution of sample diluent (Guanidine solution) shown in 2) of Example 1 The pH adjustment by was investigated. The reagents other than 2) were the same as those prepared in Example 1. Parvovirus B19 positive panel (DNA level: 10 10 ) and negative panel were used for the examination. The examination of pH 5.5 to 6.5 was carried out with citrate buffer, and pH 4.5 to 6.0 was carried out with citrate / phosphate buffer.
pH4.5〜6.5の範囲で所望の効果が得られ、好ましくは5.5〜6.5の範囲であることが確認された。 It was confirmed that the desired effect was obtained in the range of pH 4.5 to 6.5, and preferably in the range of 5.5 to 6.5.
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