JP2007274901A - Method for producing optically active propargyl alcohol - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、各種医薬品の光学活性原料として、特に、プロスタグランジン系化合物に必須なω側鎖の原料として有用な光学活性プロパルギルアルコールを製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing optically active propargyl alcohol useful as an optically active raw material for various pharmaceuticals, particularly as a raw material for the ω side chain essential for prostaglandin compounds.
本明細書に定義する式２もしくは式５で示される光学活性プロパルギルアルコールの製造方法としては、
（１）式２もしくは式５で示されるプロパルギルアルコールのラセミ体混合物をフタル酸モノエステルとして光学活性アミンを光学分割剤として分割する方法（J. Am. Chem. Soc., 94, 7827 (1972)）、
（２）式２もしくは式５で示されるプロパルギルアルコールのラセミ体混合物のエステルをリパーゼ又はパン酵母などを用いた加水分解反応により反応速度論的分割を行い、光学活性プロパルギルアルコールを得る方法（特開平３−２５９０９４号公報）、
（３）式２もしくは式５で示されるプロパルギルアルコールのラセミ体混合物を光学分割カラムにより分割し、光学活性プロパルギルアルコールを得る方法（特開２００３−６４００９号公報）、
（４）本明細書に定義する式１で示されるプロパルギルケトンを不斉還元触媒を用いて不斉還元する方法（J. Am. Chem. Soc., 101, 5843 (1979)）、
（５）式１で示されるプロパルギルケトンを微生物により不斉還元する方法 （J. Am. Chem. Soc., 97, 865 (1975)）、
（６）式１で示されるプロパルギルケトンのα-ハロゲン置換体をラクトバチルス (Lactobacillus) 由来のアルコール脱水素酵素を用いて不斉還元し、光学活性なα-ハロゲン置換されたプロパルギルアルコールを得る方法（ＷＯ０２／６４５７９号公報）、
（７）γ−ヨウ化アリルアルコールをシャープレス光学分割法によって光学活性γ−ヨウ化アリルアルコールを得、脱ヨウ化水素を経て光学活性プロパルギルアルコールを得る方法（Tetrahedron Lett., 30, 7083 (1989)）、
などが知られている。
As a method for producing optically active propargyl alcohol represented by Formula 2 or Formula 5 as defined in the present specification,
(1) A method in which a racemic mixture of propargyl alcohol represented by Formula 2 or Formula 5 is used as a phthalic acid monoester and an optically active amine is used as an optical resolution agent (J. Am. Chem. Soc., 94, 7827 (1972) ),
(2) A method of obtaining an optically active propargyl alcohol by subjecting an ester of a racemic mixture of propargyl alcohol represented by formula 2 or formula 5 to a reaction kinetic resolution by a hydrolysis reaction using lipase, baker's yeast or the like 3-259094),
(3) A method of dividing a racemic mixture of propargyl alcohol represented by formula 2 or formula 5 with an optical resolution column to obtain optically active propargyl alcohol (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-64009),
(4) A method of asymmetric reduction of propargyl ketone represented by
(5) A method for asymmetrically reducing propargyl ketone represented by
(6) A method for obtaining an optically active α-halogen-substituted propargyl alcohol by asymmetric reduction of an α-halogen-substituted product of propargyl ketone represented by Formula 1 using an alcohol dehydrogenase derived from Lactobacillus (WO02 / 64579),
(7) A method of obtaining optically active γ-iodoallylic alcohol from γ-allyl iodide alcohol by the sharpless optical resolution method and obtaining optically active propargyl alcohol via dehydroiodination (Tetrahedron Lett., 30, 7083 (1989) )),
Etc. are known.
しかしながら、（１）の方法は低収率でかつ高価な分割剤が必要である、（２）の方法は光学純度が低い、未反応のエステルと加水分割されたアルコールの分離が困難である、（３）の方法は高価な光学分割カラムが必要であり、（４）の方法は高価な不斉還元触媒が必要、極低温が必要、（５）の方法は収率、光学純度共に低い、（６）の方法は生産性が低い、（７）の方法は高価な分割剤が必要かつ工程が複雑、など工業的な製造方法としては問題がある。 However, the method (1) requires a low yield and an expensive resolving agent, the method (2) has low optical purity, and it is difficult to separate the unreacted ester and the hydrolyzed alcohol. The method (3) requires an expensive optical resolution column, the method (4) requires an expensive asymmetric reduction catalyst, requires extremely low temperature, and the method (5) has low yield and optical purity. The method (6) has a low productivity, and the method (7) has a problem as an industrial production method such that an expensive resolving agent is required and the process is complicated.
本発明は、式２もしくは式５で示される光学活性プロパルギルアルコール、とりわけ、式４で示される（Ｓ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールもしくは式６で示される（Ｒ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造において、光学純度の高い生成物を収率良く与えることができる製造方法を提供することを課題とする。 The present invention relates to an optically active propargyl alcohol represented by formula 2 or formula 5, especially (S) -1-cyclohexyl-2-propyn-1-ol represented by formula 4 or (R) -1 represented by formula 6 An object of the present invention is to provide a production method capable of giving a product with high optical purity in a high yield in the production of -cyclohexyl-2-propyn-1-ol.
本発明者らは、理論収率が５０％を越えない分割手法ではなく、原料を１００％利用可能な、プロパルギルケトンを立体選択性の高い酵素を利用して不斉還元反応により高い光学純度の光学活性プロパルギルアルコールを製造する方法を検討した。
式１のＲがシクロヘキシル基である１−シクロヘキシルプロピノン(1-cyclohexylpropynone、以下CHPNと略す) を基質として多くのカルボニルを不斉還元する酵素を用い、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オール(1-cyclohexyl-2-propyn-1-ol、以下 CHPOと略す) 合成を検討した結果、ピキア・フィンランディカ (Pichia finlandica) 由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素（配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）が (S)-CHPOを生成し、サッカロマイセス・セレビジエ (
Saccharomyces cerevisiae) 由来のカルボニル還元酵素ScGRE2 （配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）及びScYGD9（配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、並びにトルラスポラ・デルブレッキー (Torulaspora delbrueckii) 由来のカルボニル還元酵素 TdCR1（配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）がいずれも (R)-CHPOを９９％ｅｅ以上の極めて高い立体選択性で生成することを見いだし、本発明を完成するに至った。
The inventors of the present invention are not a resolution method in which the theoretical yield exceeds 50%, but can use 100% of the raw material, and propargyl ketone has high optical purity by asymmetric reduction reaction using an enzyme having high stereoselectivity. A method for producing optically active propargyl alcohol was investigated.
1-Cyclohexyl-2-propyn-1-ol is used by using an enzyme that asymmetrically reduces many carbonyls using 1-cyclohexylpropynone (hereinafter abbreviated as CHPN) in which R in
Saccharomyces cerevisiae) -derived carbonyl reductase ScGRE2 (protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4) and ScYGD9 (protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6), and carbonyl derived from Torulaspora delbrueckii (Torulaspora delbrueckii) It was found that all of the reductases TdCR1 (protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8) produce (R) -CHPO with extremely high stereoselectivity of 99% ee or more, and the present invention has been completed. .
（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素は、アセト酢酸エチルを不斉還元し、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成することが知られているが（ＷＯ０１／６１０１４号公報）、CHPNに対して活性を有するか否か、どの程度の立体選択性を持って還元するか、いずれの立体を生成するかは予測不可能であり、９９％ｅｅ以上の高い選択性で(S)-CHPOを生成したことは驚くべき結果であった。 (R) -2-octanol dehydrogenase is known to asymmetrically reduce ethyl acetoacetate to produce ethyl (R) -3-hydroxybutyrate (WO01 / 61014), but CHPN It is unpredictable whether it has activity against it, how much stereoselectivity it will reduce, and which stereo form it produces, with a high selectivity of 99% ee or higher (S) -CHPO It was a surprising result.
同様に、ScGRE2（J. Org. Chem. 63, 4996-5000 (1998)）、ScYGD9及び TdCR1（いずれも特願２００３−１１３４０２号）は、アセト酢酸エチルを不斉還元し、（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成することが報告されているが、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の場合と同様、CHPNに対して活性を有するか否か、どの程度の立体選択性を持って還元するか、いずれの立体を生成するかは予測不可能であり、９９％ｅｅ以上の高い選択性で(R)-CHPOを生成したことは驚くべき結果であった。例えば、キャンディダ・パラプシロシス由来の（Ｓ）特異的２級アルコール脱水素酵素（特開平０７−２３１７８５号公報）は、アセト酢酸エチルを不斉還元し、（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成することが報告されているが、CHPNに対して実質的に活性を示さなかった。また、TdCR1に対して６１％のホモロジーを有するScYDR1（特願２００３−１１３４０２号）もまた、CHPNに対して実質的に活性を有しなかった。 Similarly, ScGRE2 (J. Org. Chem. 63, 4996-5000 (1998)), ScYGD9 and TdCR1 (all of Japanese Patent Application No. 2003-113402) asymmetrically reduce ethyl acetoacetate, and (S) -3 -It has been reported to produce ethyl hydroxybutyrate, but as in the case of (R) -2-octanol dehydrogenase, whether or not it has activity against CHPN, how much stereoselectivity is It was unpredictable whether to reduce or produce any stereo form, and it was a surprising result that (R) -CHPO was produced with high selectivity of 99% ee or higher. For example, (S) -specific secondary alcohol dehydrogenase (JP 07-231785 A) derived from Candida parapsilosis asymmetrically reduces ethyl acetoacetate to produce ethyl (S) -3-hydroxybutyrate Although it has been reported, it showed virtually no activity against CHPN. Further, ScYDR1 (Japanese Patent Application No. 2003-113402) having 61% homology to TdCR1 also had substantially no activity against CHPN.
また、上記反応に付随してNADHから生成するNAD+のNADHへの再生、及び、NADPHから生成するNADPHのNADP+への再生は、例えばグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素などによって行うことができるが、本発明者らは、これらの遺伝子を本発明で用いるアルコール脱水素酵素もしくはカルボニル還元酵素をコードするDNAと同時に宿主に導入することによって、アルコール脱水素酵素もしくはカルボニル酵素とNAD(P)H再生酵素を同時に発現し、該形質転換株またはその処理物を用いて還元反応を行うことにより、より効率的に光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造できることを見いだした。 In addition, regeneration of NAD + produced from NADH to NADH accompanying the above reaction, and regeneration of NADPH produced from NADPH to NADP + include, for example, glucose dehydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase. , Amino acid dehydrogenase, organic acid dehydrogenase, etc., the present inventors introduced these genes into the host simultaneously with the DNA encoding the alcohol dehydrogenase or carbonyl reductase used in the present invention. By simultaneously expressing alcohol dehydrogenase or carbonyl enzyme and NAD (P) H regenerating enzyme, and performing a reduction reaction using the transformed strain or its treated product, optically active propargyl alcohol is more efficiently produced. It has been found that derivatives can be produced.
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） 下記（ａ）から（ｅ）；
（ａ）配列番号１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を、式１：
で示されるプロパルギルケトン誘導体に作用させ、該ケトンを還元して式２：
で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造することを含む、光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
(1) From (a) to (e) below;
(A) a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(C) a protein composed of amino acids in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the propargyl ketone derivative represented by
(D) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the propargyl ketone derivative represented by
A protein encoded by the polynucleotide according to any one of the above, a microorganism or a transformant functionally expressing the protein, or a processed product thereof, is represented by the formula 1:
Is reacted with a propargyl ketone derivative represented by formula (2), and the ketone is reduced to give a compound of formula 2:
A process for producing an optically active propargyl alcohol derivative, comprising producing an optically active propargyl alcohol derivative represented by the formula:
（２） 式１で示されるプロパルギルケトン誘導体が式３：
（３） （ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を、対応する補酵素、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)を再生する活性を有する脱水素酵素を共に発現する形質転換株、若しくは該形質転換株の処理物を用いて、式１で示されるプロパルギルケトンを還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコールを製造する、（１）又は（２）に記載の方法。 (3) A protein encoded by the polynucleotide according to any one of (a) to (e), a corresponding coenzyme, reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) or reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate An optical activity represented by Formula 2 is obtained by reducing propargyl ketone represented by Formula 1 using a transformant that expresses a dehydrogenase having an activity of regenerating (NADPH), or a processed product of the transformant. The method according to (1) or (2), wherein propargyl alcohol is produced.
（４） NADHもしくはNADPH再生活性を有する脱水素酵素がグルコース脱水素酵素若しくはギ酸脱水素酵素である、（３）に記載の方法。 (4) The method according to (3), wherein the dehydrogenase having NADH or NADPH regeneration activity is glucose dehydrogenase or formate dehydrogenase.
（５） 下記（ａ）から（ｅ）；
（ａ）配列番号３、５又は７に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３、５又は７に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を、式１：
で示されるプロパルギルケトン誘導体に作用させ、該ケトンを還元して式５：
で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造することを含む、光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。
(5) The following (a) to (e);
(A) a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7;
(B) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 6 or 8;
(C) a protein comprising amino acids in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, 6 or 8, and a propargyl ketone derivative represented by formula 1 A polynucleotide that encodes a protein having an activity to produce an optically active propargyl alcohol derivative represented by formula 5;
(D) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7, wherein the propargyl ketone derivative represented by
A protein encoded by the polynucleotide according to any one of the above, a microorganism or a transformant functionally expressing the protein, or a processed product thereof, is represented by the formula 1:
And reacting with a propargyl ketone derivative represented by
A process for producing an optically active propargyl alcohol derivative, comprising producing an optically active propargyl alcohol derivative represented by the formula:
（６） 式１で示されるプロパルギルケトン誘導体が式３：
（７） （ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を、対応する補酵素、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)を再生する活性を有する脱水素酵素を共に発現する形質転換株、若しくは該形質転換株の処理物を用いて、式１で示されるプロパルギルケトンを還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコールを製造する、（５）又は（６）に記載の方法。 (7) A protein encoded by the polynucleotide according to any one of (a) to (e), a corresponding coenzyme, reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) or reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate An optical activity represented by Formula 5 is obtained by reducing propargyl ketone represented by Formula 1 using a transformant that coexpresses a dehydrogenase having an activity to regenerate (NADPH), or a processed product of the transformant. The method according to (5) or (6), wherein propargyl alcohol is produced.
（８） NADHもしくはNADPH再生活性を有する脱水素酵素がグルコース脱水素酵素若しくはギ酸脱水素酵素である、（７）に記載の方法。 (8) The method according to (7), wherein the dehydrogenase having NADH or NADPH regeneration activity is glucose dehydrogenase or formate dehydrogenase.
本発明により、高い光学純度を有する光学活性プロパルギルアルコールを効率よく製造する方法を提供することが可能になった。 The present invention has made it possible to provide a method for efficiently producing optically active propargyl alcohol having high optical purity.
本発明は、下記（ａ）から（ｅ）；
（ａ）配列番号１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を用いて、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造する方法に関するものである。
The present invention provides the following (a) to (e);
(A) a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(C) a protein composed of amino acids in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the propargyl ketone derivative represented by
(D) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the propargyl ketone derivative represented by
A propargyl ketone derivative represented by
配列番号２に記載の蛋白質としては、例えば、ピキア・フィンランディカ由来の (R)-２-オクタノール脱水素酵素が挙げられる。該酵素は、ＷＯ０１／６１０１４号公報に記載の方法により、ピキア・フィンランディカの菌体より調製することができる。ピキア・フィンランディカとしては、特に、ピキア・フィンランディカDSM 70280株が好適に利用できる。また、ピキア・フィンランディカDSM 70280株由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素のアミノ酸配列である配列番号２に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを、ピキア・フィンランディカDSM 70280株などからクローニングし、若しくは配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを化学合成し、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いて、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素を発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。 Examples of the protein described in SEQ ID NO: 2 include (R) -2-octanol dehydrogenase derived from Pichia finlandica. The enzyme can be prepared from Pichia finlandica cells by the method described in WO01 / 61014. As the Pichia finlandica, the Pichia finlandica DSM 70280 strain can be preferably used. In addition, DNA encoding the protein of SEQ ID NO: 2 which is the amino acid sequence of (R) -2-octanol dehydrogenase derived from Pichia finlandica DSM 70280 is cloned from Pichia finlandica DSM 70280. Alternatively, (R) -2-octanol dehydrogenase can be obtained by chemically synthesizing a DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and introducing it in a form that can be expressed in a heterologous host such as E. coli. It can also be expressed and the enzyme can be obtained from the recombinant.
本発明で用いる（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の酵素活性の測定は次のように確認することができる。100 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 9.0）、2.5 mM 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、5 mM （Ｒ）−２−オクタノール及び酵素を含む反応液中、30℃で反応させ、NADHの増加に由来する３４０ｎｍの吸光度の増加を測定する。１Ｕは、1分間に1μmolのNADH の生成を触媒する酵素量とした。 The measurement of the enzyme activity of (R) -2-octanol dehydrogenase used in the present invention can be confirmed as follows. Derived from an increase in NADH in a reaction solution containing 100 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0), 2.5 mM oxidized nicotinamide adenine dinucleotide, 5 mM (R) -2-octanol and enzyme at 30 ° C. Measure the increase in absorbance at 340 nm. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 μmol NADH per minute.
さらに本発明は、下記（ａ）から（ｅ）；
（ａ）配列番号３、５又は７に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３、５又は７に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を用いて、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造するする方法に関するものである。
Furthermore, the present invention provides the following (a) to (e);
(A) a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7;
(B) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 6 or 8;
(C) a protein comprising amino acids in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, 6 or 8, and a propargyl ketone derivative represented by formula 1 A polynucleotide that encodes a protein having an activity to produce an optically active propargyl alcohol derivative represented by formula 5;
(D) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7, wherein the propargyl ketone derivative represented by
A propargyl ketone derivative represented by
本発明で利用されるカルボニル還元酵素ScGRE2は、J. Org. Chem. 63, 4996-5000 (1998) に記載の方法によりパン酵母より調製することができる。また、サッカロマイセス・セレビジエ由来のScGRE2をコードする配列番号３に記載のDNAを、サッカロマイセス・セレビジエ（例えば X2180-1B株） (Yeast Genetic Stock Center)などからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてScGRE2を発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。 The carbonyl reductase ScGRE2 utilized in the present invention can be prepared from baker's yeast by the method described in J. Org. Chem. 63, 4996-5000 (1998). In addition, the DNA described in SEQ ID NO: 3 encoding ScGRE2 derived from Saccharomyces cerevisiae is cloned by PCR or the like from Saccharomyces cerevisiae (for example, X2180-1B strain) (Yeast Genetic Stock Center), etc. ScGRE2 can be expressed using a recombinant introduced in an expressible form, and the enzyme can be obtained from the recombinant.
本発明で用いるScGRE2の酵素活性の測定は次のように確認することができる。100 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、0.2 mM 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、NADPH と略す）、20 mM アセト酢酸エチル及び酵素を含む反応液中で30℃で反応させ、NADPHの減少に由来する340nmの吸光度の減少を測定する。1Uは、1分間に1μmolのNADPH の減少を触媒する酵素量とした。 The measurement of the enzyme activity of ScGRE2 used in the present invention can be confirmed as follows. In a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 0.2 mM reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter abbreviated as NADPH), 20 mM ethyl acetoacetate and an enzyme, the reaction is performed at 30 ° C. The decrease in absorbance at 340 nm resulting from the decrease in NADPH is measured. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the decrease of 1 μmol of NADPH per minute.
本発明で利用されるカルボニル還元酵素ScYGD9は、サッカロマイセス・セレビジエ由来のScYGD9をコードする配列番号５に記載のＤＮＡを、例えば、特願２００３−１１３４０２号に記載の方法などにより、サッカロマイセス・セレビジエ（例えば X2180-1B株）(Yeast Genetic Stock Center) などからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてScYGD9を発現し、組換え体より該酵素を得ることにより調製できる。本発明で用いるScYGD9の酵素活性は、ScGRE2と同じ方法により確認することができる。 The carbonyl reductase ScYGD9 used in the present invention is a Saccharomyces cerevisiae (for example, Saccharomyces cerevisiae (for example, Saccharomyces cerevisiae), for example, by the method described in Japanese Patent Application No. 2003-113402. X2180-1B) (Yeast Genetic Stock Center), etc., and cloned by PCR, etc., and expressed ScYGD9 using a recombinant introduced in a form that can be expressed in a heterogeneous host such as E. coli. It can be prepared by obtaining. The enzyme activity of ScYGD9 used in the present invention can be confirmed by the same method as ScGRE2.
本発明で利用されるカルボニル還元酵素TdCR1は、特願２００３−１１３４０２に記載の方法によりトルラスポラ・デルブレッキー (Torulaspora delbrueckii) より調製することができる。また、トルラスポラ・デルブレッキー由来のTdCR1をコードする配列番号７に記載のDNAを、トルラスポラ・デルブレッキー（例えば IFO 0381株）などからPCRなどによりクローニングし、大腸菌など異種の宿主に発現可能な形態において導入した組換え体を用いてTdCR1を発現し、組換え体より該酵素を得ることもできる。 The carbonyl reductase TdCR1 used in the present invention can be prepared from Torulaspora delbrueckii by the method described in Japanese Patent Application No. 2003-113402. In addition, the DNA described in SEQ ID NO: 7 that encodes TdCR1 derived from Torlas pora delbrecki is cloned from Torlas pora delbrecki (eg, IFO 0381 strain) by PCR or the like, and can be expressed in heterologous hosts such as E. coli. TdCR1 can be expressed using the introduced recombinant and the enzyme can be obtained from the recombinant.
本発明によるTdCR1の酵素活性の測定は次のように確認することができる。100 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、0.2 mM NADPH、5 mM 3,4-ジメトキシフェニルアセトン及び酵素を含む反応液中で30℃で反応させ、NADPHの減少に由来する３４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。１Ｕは、1分間に1μmolのNADPH の減少を触媒する酵素量とした。 The measurement of the enzyme activity of TdCR1 according to the present invention can be confirmed as follows. Decrease in absorbance at 340 nm due to reduction of NADPH by reaction at 30 ° C in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 0.2 mM NADPH, 5 mM 3,4-dimethoxyphenylacetone and enzyme Measure. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the decrease of 1 μmol of NADPH per minute.
上記酵母（サッカロマイセス・セレビジエ、トルラスポラ・デルブレッキー）は、YM培地等の酵母の培養に用いられる一般的な培地で培養される。十分に増殖させた後に菌体を回収し、２−メルカプトエタノールやフェニルメタンフルホニルフルオリド等の還元剤やプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製することができる。例えば、フェニル−セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチル−セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトを用いた吸着クロマトグラフィー等を経て電気泳動的に単一バンドにまで精製することができる。 The yeast (Saccharomyces cerevisiae, Torrus pora delbrecky) is cultured in a general medium used for yeast culture such as YM medium. After sufficiently growing, the cells are collected and crushed in a buffer solution containing a reducing agent such as 2-mercaptoethanol or phenylmethanesulfonyl fluoride or a protease inhibitor to obtain a cell-free extract. From cell-free extracts, fractionation by protein solubility (precipitation with organic solvents, salting out with ammonium sulfate, etc.), cation exchange, anion exchange, gel filtration, hydrophobic chromatography, chelates, dyes, antibodies, etc. It can be purified by appropriately combining affinity chromatography using For example, electrophoretic single band through hydrophobic chromatography using phenyl-sepharose, anion exchange chromatography using MonoQ, hydrophobic chromatography using butyl-sepharose, adsorption chromatography using hydroxyapatite, etc. Can be purified.
本発明における1もしくは複数（好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列は、配列番号１、３、５又は７に記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加などの変異を導入することにより得ることが可能である。 The amino acid sequence in which one or more (preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5) amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the present invention is: Site-directed mutagenesis method (Nucleic Acid Res. 10, pp. 6487 (1982), Methods in Enzymol. 100, pp. 448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991)), etc., by appropriately introducing mutations such as substitution, deletion, insertion, and / or addition. It is possible to obtain.
本発明におけるポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、より好ましくは９０%以上のホモロジーを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質のホモロジー検索は、例えばSWISS-PROT, PIR,DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST, FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。本発明のホモロジーとは、例えば、BLASTプログラムを用いてidentity で示される数値を指す。 The polynucleotide homologue in the present invention is a polynucleotide encoding a protein having at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8. Contains nucleotides. Protein homology searches include, for example, databases related to amino acid sequences of proteins such as SWISS-PROT, PIR, and DAD, databases related to DNA sequences such as DDBJ, EMBL, and Gene-Bank, databases related to predicted amino acid sequences based on DNA sequences, etc. For example, it can be performed through the Internet using programs such as BLAST and FASTA. The homology of the present invention refers to a numerical value indicated by identity using, for example, the BLAST program.
本発明における配列番号１、３、５又は７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、いずれかのポリヌクレオチド配列番号に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、例えばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを示す。より具体的な「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、42℃、2×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1％SDSの条件であり、さらに好ましくは、65℃、0.1×SSCおよび0.1％SDSの条件であるが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。 The polynucleotide capable of hybridizing under stringent conditions with the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 in the present invention is any at least 20 in any polynucleotide SEQ ID NO: DNA, preferably at least 30, for example, 40, 60 or 100, one or a plurality of contiguous sequences is used as a probe DNA, for example, using ECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech) The polynucleotide that hybridizes under the conditions described in the manual (for example, wash: 42 ° C., primary wash buffer containing 0.5 × SSC) is shown. More specific “stringent conditions” are, for example, usually 42 ° C., 2 × SSC, 0.1% SDS conditions, preferably 50 ° C., 2 × SSC, 0.1% SDS conditions, The conditions are preferably 65 ° C., 0.1 × SSC and 0.1% SDS, but are not particularly limited to these conditions. A plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize optimum stringency by appropriately selecting these factors.
本発明において利用可能なアルコール脱水素酵素又はカルボニル還元酵素をコードするポリヌクレオチドを、公知の発現ベクターに挿入することにより、各酵素の発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明において利用可能なアルコール脱水素酵素、カルボニル還元酵素を組換え体から得ることができる。本発明においてアルコール脱水素酵素、カルボニル還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、それぞれの酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、それぞれの酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。 An expression vector for each enzyme is provided by inserting a polynucleotide encoding an alcohol dehydrogenase or carbonyl reductase that can be used in the present invention into a known expression vector. Further, by culturing a transformant transformed with this expression vector, an alcohol dehydrogenase and a carbonyl reductase that can be used in the present invention can be obtained from the recombinant. In order to express alcohol dehydrogenase and carbonyl reductase in the present invention, a microorganism to be transformed is transformed with a recombinant vector containing a polynucleotide encoding each enzyme and expresses each enzyme activity. There is no particular limitation as long as it is an organism that can be used. Examples of the microorganisms that can be used include the following microorganisms.
エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、及びラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌；
ロドコッカス(Rhodococcus)属、及びストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、及びキャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母；
ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、及びトリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ：
Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus, and Lactobacillus Bacteria for which host vector systems such as (Lactobacillus) are developed;
Actinomycetes for which host vector systems have been developed, such as the genus Rhodococcus and the genus Streptomyces;
The genus Saccharomyces, the genus Kluyveromyces, the genus Schizosaccharomyces, the genus Zygosaccharomyces, the genus Yarrowia, the genus Trichosporon, the genus Yeasts for which host vector systems such as the genus Pichia and the genus Candida have been developed;
Molds for which host vector systems such as the genus Neurospora, Aspergillus, Cephalosporium, and Trichoderma have been developed:
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物中などにおいて、本発明で用いるNADPHを電子供与体とするカルボニル還元酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。 The procedure for producing transformants and the construction of a recombinant vector suitable for the host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering (for example, Sambrook et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratories). In order to express a carbonyl reductase gene using NADPH used in the present invention as an electron donor in microorganisms, the DNA is first introduced into a plasmid vector or a phage vector that is stably present in the microorganism, It is necessary to transcribe and translate information. For that purpose, a promoter corresponding to a unit controlling transcription / translation may be incorporated upstream of the 5′-side of the DNA strand of the present invention, more preferably a terminator downstream of the 3′-side. As the promoter and terminator, it is necessary to use a promoter and terminator known to function in a microorganism used as a host. Regarding the vectors, promoters, and terminators that can be used in these various microorganisms, “Basic Course of Microbiology 8 Genetic Engineering / Kyoritsu Shuppan”, especially regarding yeast, Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990), Yeast 8, 423-488 (1992), etc.
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。 In addition to microorganisms, various host and vector systems have been developed in plants and animals, especially in insects using moths (Nature 315, 592-594 (1985)), rapeseed, corn, potatoes and other plants. A system for expressing a large amount of heterologous protein has been developed and can be suitably used.
本明細書に記載の式２もしくは式５に示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造の好ましい態様においては、酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体を反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることによって、光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造を行うことができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。 In a preferred embodiment of the production of the optically active propargyl alcohol derivative represented by Formula 2 or Formula 5 described in the present specification, the characteristics of enzyme molecules, processed products thereof, cultures containing the enzyme molecules, microorganisms that produce the enzymes, etc. The optically active propargyl alcohol derivative can be produced by bringing the converted body into contact with the reaction solution to cause the target enzyme reaction. The contact form between the enzyme and the reaction solution is not limited to these specific examples.
本発明におけるアルコール脱水素酵素もしくはカルボニル還元酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。 Specifically, the microorganism treated product containing alcohol dehydrogenase or carbonyl reductase in the present invention is a microorganism whose glass membrane permeability has been changed by treatment with an organic solvent such as a surfactant or toluene, or a glass bead or enzyme. A cell-free extract obtained by crushing bacterial cells by treatment or a partially purified product thereof is included.
本発明における式１で示されるプロパルギルケトン誘導体において、Ｒは、Ｃ１−Ｃ１０の置換若しくは未置換の直鎖、分岐鎖又は環状のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、あるいはＣ６−Ｃ２０のアリール基を表す。Ｒとしては例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、イソプロピル、イソブチル、t-ブチル、２−メチルペンチル、３−メチルヘキシル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、フェニルなどが挙げられ、これらの置換基は更に、塩素、臭素、ヨウ素、トリアルキルシリル、トリアルキル錫などにより置換されていてもよい。
In the propargyl ketone derivative represented by the
本発明の好ましい態様においては、（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性を有するタンパク質、該酵素またはタンパク質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物を式３に示される１−シクロヘキシルプロピノン (CHPN) に作用させ、式４に示される（Ｓ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オール ((S)-CHPO)を製造することを特徴とする、（Ｓ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造方法が提供される。また、ScGRE2, ScYGD9、TdCR1又はそれらの変異体から選択されるカルボニル還元酵素活性を有するタンパク質、該酵素またはタンパク質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物を式３に示される１−シクロヘキシルプロピノン (CHPN) に作用させ、式６に示される（Ｒ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オール ((R)-CHPO)を製造することを特徴とする、（Ｒ）−１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造方法が提供される。 In a preferred embodiment of the present invention, a protein having (R) -2-octanol dehydrogenase activity, a microorganism producing the enzyme or protein, or a processed product of the microorganism is represented by 1-cyclohexylpropinone represented by Formula 3 ( (S) -1-cyclohexyl-, characterized in that (S) -1-cyclohexyl-2-propyn-1-ol ((S) -CHPO) represented by formula 4 is produced by acting on (CHPN) A method for producing 2-propyn-1-ol is provided. In addition, a protein having a carbonyl reductase activity selected from ScGRE2, ScYGD9, TdCR1, or a variant thereof, a microorganism that produces the enzyme or protein, or a processed product of the microorganism, is represented by 1-cyclohexylpropinone represented by Formula 3. (R) -1-cyclohexyl characterized by producing (R) -1-cyclohexyl-2-propyn-1-ol ((R) -CHPO) represented by formula 6 by acting on (CHPN) A process for producing 2-propyn-1-ol is provided.
上記還元反応に付随してNADH もしくはNADPHから生成するNAD+ もしくはNADP+の、NADH もしくはNADPHへの再生は、微生物の持つNAD+, NADP+還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらNAD+, NADP+還元能は、反応系にグルコースやエタノールなどを添加することにより増強することが可能である。また、NAD+, NADP+からNADH, NADPHを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてNADHもしくはNADPHの再生を行うことができる。これらのNADH, NADPH再生に必要な反応を構成する成分は、本発明による光学活性アルコールの製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいはNADH、NADPHの交換が可能な膜を介して接触させることができる。 The regeneration of NAD + or NADP + produced from NADH or NADPH in association with the above reduction reaction to NADH or NADPH is due to NAD + , NADP + reducing ability of the microorganism (glycolytic system, C1 compound utilization pathway of methylotroph) Etc.). These NAD + and NADP + reducing ability can be enhanced by adding glucose or ethanol to the reaction system. It can also be carried out by adding a microorganism having the ability to produce NADH and NADPH from NAD + and NADP + , a treated product thereof, and an enzyme to the reaction system. For example, microorganisms including glucose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, formate dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, organic acid dehydrogenase (malate dehydrogenase, etc.), processed products thereof, and partially purified or purified enzymes Can be used to regenerate NADH or NADPH. The components constituting the reaction necessary for the regeneration of NADH and NADPH can be added to the reaction system for the production of the optically active alcohol according to the present invention, can be added, or can be exchanged for NADH and NADPH. It can be contacted through a membrane.
また本発明は、本発明に利用可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程を含むことができる。本方法において、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターで形質転換した微生物の生菌体を前記光学活性アルコールの製造方法に利用する場合には、NADH, NADPH再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、NADH, NADPH再生活性の高い微生物を宿主として用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、NADH, NADPH再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、NADH、NADPH再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明のNADH もしくはNADPH依存性アルコール脱水素酵素もしくはカルボニル還元酵素をコードするDNAと同時に宿主に導入することによって、より効率的なNADH, NADPH再生酵素とNADPH依存性カルボニル還元酵素の発現、還元反応を行うことも可能である。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、両方、もしくは、片方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。 Moreover, this invention can also include the process of culture | cultivating the transformant transformed by the recombinant vector containing the polynucleotide which codes the polypeptide which can be used for this invention. In this method, when a living cell of a microorganism transformed with a recombinant vector containing the polynucleotide of the present invention is used in the method for producing an optically active alcohol, an additional reaction system for regeneration of NADH and NADPH May be unnecessary. That is, by using a microorganism having high NADH and NADPH regeneration activity as a host, an efficient reaction can be performed in the reduction reaction using the transformant without adding an enzyme for NADH and NADPH regeneration. In addition, genes such as NADH, glucose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, formate dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, organic acid dehydrogenase (malate dehydrogenase, etc.) that can be used for regeneration of NADP and the like are disclosed in the present invention. More efficient NADH, NADPH regenerating enzyme and NADPH-dependent carbonyl reductase expression and reductive reaction by introducing into the host simultaneously with DNA encoding NADH or NADPH-dependent alcohol dehydrogenase or carbonyl reductase It is also possible. In order to introduce these two or more genes into the host, a method of transforming the host with a recombinant vector in which genes are separately introduced into a plurality of vectors different from the origin of replication in order to avoid incompatibility, A method of introducing both genes into a single vector, a method of introducing both genes into a chromosome, or the like can be used.
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。 When introducing multiple genes into a single vector, methods such as linking promoter- and terminator-related regions related to expression control to each gene, or expressing as an operon containing multiple cistrons such as the lactose operon. Is possible.
例えば、NADH及びNADPH再生用酵素として、バシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）やサーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）に由来するグルコース脱水素酵素が利用可能である。また、NADH再生用酵素として、マイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素およびその変異体が好適に利用可能である。 For example, glucose dehydrogenase derived from Bacillus subtilis or Thermoplasma acidophilum can be used as an enzyme for regeneration of NADH and NADPH. As the NADH regenerating enzyme, formate dehydrogenase derived from Mycobacterium baccae and its mutants can be suitably used.
具体的には、(S)-CHPO合成には、ピキア・フィンランディカ由来の（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素の遺伝子とマイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の遺伝子を共に導入した共発現プラスミド、pSF-PFO2（ＷＯ０１／６１０１４号公報）や、バシラス・サブチルス由来グルコース脱水素酵素遺伝子を共に導入した共発現プラスミド pSG-PFO1（ＷＯ０１／６１０１４号公報）、pSG-PFO2（ＷＯ ０１／６１０１４号公報）が挙げられる。また、(R)-CHPO合成には、ScGRE2、ScYGD9、TdCR1のいずれかのカルボニル還元酵素の遺伝子とバシラス・サブチルス由来グルコース脱水素酵素遺伝子を共に導入した共発現プラスミド（それぞれ、pSG-YOL1 (本発明実施例に記載), pSG-YGD9 (特願2003-113402), pSG-TDR1(特願2003-113402)）が挙げられる。 Specifically, the (R) -2-octanol dehydrogenase gene derived from Pichia finlandica and the formate dehydrogenase gene derived from Mycobacterium baccae were introduced into the (S) -CHPO synthesis. Co-expression plasmids, pSF-PFO2 (WO01 / 61014), co-expression plasmids pSG-PFO1 (WO01 / 61014) and pSG-PFO2 (WO01 / 61014) into which a glucose dehydrogenase gene derived from Bacillus subtilis has been introduced No. 61014). For (R) -CHPO synthesis, co-expression plasmids (both pSG-YOL1 (this) were introduced together with either the ScGRE2, ScYGD9, or TdCR1 carbonyl reductase gene and the Bacillus subtilis-derived glucose dehydrogenase gene). Inventive Examples), pSG-YGD9 (Japanese Patent Application 2003-113402), pSG-TDR1 (Japanese Patent Application 2003-113402)).
本発明の酵素を用いた還元反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエステルなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系、もしくは水に溶解する有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシドなどとの混合系により行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。 The reduction reaction using the enzyme of the present invention is an organic solvent that is difficult to dissolve in water or water, for example, an organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, toluene, chloroform, n-hexane, methyl isobutyl ketone, and methyl tertiary butyl ester. It can be carried out in a medium or in a two-phase system with an aqueous medium, or in a mixed system with an organic solvent that dissolves in water, for example, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetonitrile, acetone, dimethyl sulfoxide and the like. The reaction of the present invention can also be performed using an immobilized enzyme, a membrane reactor, or the like.
本発明の反応は、反応温度４−６０℃、好ましくは１０−４０℃、ｐＨ３−９、好ましくはｐＨ５−７、基質濃度０．０１−５０%、好ましくは０．１−１０%、さらに好ましくは０．１−５％で行うことができる。本発明の反応の基質である式1に示されるプロパルギルケトンは一般に水中、特に、アルカリ側で不安定なため、反応は弱酸性領域で低い温度で実施することが望ましい。また、反応系には必要に応じて補酵素NAD+, NADH, NADP+もしくはNADPHが０．００１mM−１００mM、好ましくは、０．０１−１０mM添加できる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
In the reaction of the present invention, the reaction temperature is 4-60 ° C, preferably 10-40 ° C, pH 3-9, preferably pH 5-7, substrate concentration 0.01-50%, preferably 0.1-10%, more preferably Can be carried out at 0.1-5%. Since the propargyl ketone represented by
NADH, NADPHの再生のために、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノール、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アミノ酸脱水素酵素を利用する場合のアミノ酸、リンゴ酸脱水素酵素を利用する場合のリンゴ酸、グリセロール脱水素酵素を利用する場合のグリセロールなどが反応系に添加される。これらの化合物は、基質ケトンに対してモル比で０．１〜２０、好ましくは１〜５倍過剰に添加することができる。一方、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素などの、NADH, NADPH再生用の酵素は、本発明のNADH, NADPH依存性酵素に比較して酵素活性で０．１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度添加することができる。 For regeneration of NADH, NADPH, for example, glucose when using glucose dehydrogenase, ethanol or isopropanol when using alcohol dehydrogenase, formate when using formate dehydrogenase, amino acid dehydrogenase when using formate dehydrogenase Amino acid when using malate, malic acid when using malate dehydrogenase, glycerol when using glycerol dehydrogenase, and the like are added to the reaction system. These compounds can be added in an excess of 0.1 to 20, preferably 1 to 5 times in molar ratio to the substrate ketone. Meanwhile, NADH and NADPH regeneration enzymes such as glucose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, formate dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, malate dehydrogenase, and glycerol dehydrogenase are NADH and NADPH of the present invention. The enzyme activity can be added in an amount of 0.1 to 100 times, preferably 0.5 to 20 times that of the dependent enzyme.
基質であるプロパルギルケトンは、例えば文献（J. Org. Chem., 52, 2860 (1987).）に記載の方法などで合成することができる。 The substrate, propargyl ketone, can be synthesized, for example, by the method described in the literature (J. Org. Chem., 52, 2860 (1987)).
本発明のプロパルギルケトンの還元により生成する光学活性プロパルギルアルコールの精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理などによる分離、溶媒抽出、蒸留などを適当に組み合わせることにより行うことができる。 The optically active propargyl alcohol produced by the reduction of the propargyl ketone of the present invention can be purified by appropriately combining microbial cells and proteins, separation by membrane treatment, solvent extraction, distillation and the like.
例えば、(S)-CHPO合成では、微生物菌体を含む反応液に直接有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、ヘキサン、ベンゼン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエーテル、ブタノール、ヘキサン、ヘプタンなどを添加して抽出後、これを減圧濃縮することにより、光学活性プロパルギルアルコールとして、採取することができる。さらに反応生成物の純度を上げるには、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、蒸留、結晶化などを行うことにより、さらに高度に精製することができる。
以下の実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
For example, in (S) -CHPO synthesis, an organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, toluene, hexane, benzene, methyl isobutyl ketone, methyl tertiary butyl ether, butanol, hexane, heptane is directly added to the reaction solution containing microbial cells. After adding and extracting, etc., it can extract | collect as optically active propargyl alcohol by concentrating under reduced pressure. In order to further increase the purity of the reaction product, it can be further purified by performing silica gel column chromatography, distillation, crystallization, or the like.
The following examples further illustrate the present invention in detail but are not to be construed to limit the scope thereof.
[実施例１]ピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とバチルス・サブチルス由来グルコース脱水素酵素の同時発現
特許文献（ＷＯ０１／６１０１４号公報）に示された方法で得たピキア・フィンランディカ由来の(R)−オクタノール脱水素酵素とバチルス・サブチリス由来のグルコース脱水素酵素を共発現するプラスミドpSG-PFO1を保持する大腸菌HB101株（HB101 (pSG-PFO1)）を2×YT培地（Difco-Tryptone 20g/L、Difco-Yeast extract 10g/L、 NaCl 10g/L、 pH 7.2）50mLで培養し、0.1mM IPTGで遺伝子の発現を誘導した。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
[Example 1] Simultaneous expression of (R) -2-octanol dehydrogenase derived from Pichia finlandica and glucose dehydrogenase derived from Bacillus subtilis Pichia obtained by the method shown in the patent document (WO01 / 61014) -E. coli HB101 strain (HB101 (pSG-PFO1)) carrying plasmid pSG-PFO1 coexpressing (R) -octanol dehydrogenase derived from Finrandica and glucose dehydrogenase derived from Bacillus subtilis in 2 × YT medium The cells were cultured in 50 mL (Difco-Tryptone 20 g / L, Difco-Yeast extract 10 g / L, NaCl 10 g / L, pH 7.2), and gene expression was induced with 0.1 mM IPTG. The obtained microbial cells were collected, crushed with a sealed ultrasonic crusher UCD-200TM (Cosmo Bio), and the centrifuged supernatant was used as a cell-free extract.
[実施例２]ピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とバチルス・サブチルス由来グルコース脱水素酵素の酵素活性
実施例１で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を測定した。（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素活性の測定は、50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.5）、2.5 mM NAD+、5 mM （Ｒ）−２−オクタノール及び酵素を含む反応液中、30 ℃で反応させ、NADHの増加に由来する340 nmの吸光度の増加を測定した。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NAD+依存的に（Ｒ）−２−オクタノール酸化活性を示し、その比活性は、35.9 U/mg−タンパク質であった。また、CHPN還元活性の測定は、100 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、0.2 mM NADH、1% ジメチルスルホキシド、2 mM CHPN及び酵素を含む反応液中で30 ℃で反応させ、NADHの減少に由来する340 nmの吸光度の減少を測定した。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NADH依存的にCHPN還元活性を示し、その比活性は、8.01 U/ mg−タンパク質であった。
[Example 2] Enzymatic activity of (R) -2-octanol dehydrogenase derived from Pichia finlandica and glucose dehydrogenase derived from Bacillus subtilis Using the cell-free extract obtained in Example 1, enzyme activity was measured did. The (R) -2-octanol dehydrogenase activity was measured at 30 ° C. in a reaction solution containing 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 2.5 mM NAD +, 5 mM (R) -2-octanol and the enzyme. The increase in absorbance at 340 nm resulting from the increase in NADH was measured. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 μmol NADH per minute. The cell-free extract obtained from recombinant Escherichia coli showed (R) -2-octanol oxidation activity in a NAD + dependent manner, and the specific activity was 35.9 U / mg-protein. In addition, CHPN reduction activity was measured by reacting at 30 ° C in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 0.2 mM NADH, 1% dimethyl sulfoxide, 2 mM CHPN, and enzyme. The decrease in absorbance at 340 nm derived from was measured. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 μmol NADH per minute. The cell-free extract obtained from recombinant Escherichia coli exhibited CHPN reduction activity in a NADH-dependent manner, and the specific activity was 8.01 U / mg protein.
グルコース脱水素酵素活性の測定は、100 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、2.5 mM NAD+、100 mM D−グルコース及び酵素を含む反応液中で30 ℃で反応させ、NADHの増加に由来する340 nmの吸光度の増加を測定した。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、その比活性は、1.18 U/ mg−タンパク質であった。 Glucose dehydrogenase activity was measured by reacting at 30 ° C in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 2.5 mM NAD + , 100 mM D-glucose and enzyme, and derived from an increase in NADH. The increase in absorbance at 340 nm was measured. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 μmol NADH per minute. In the cell-free extract obtained from recombinant E. coli, the specific activity was 1.18 U / mg protein.
[実施例３]ピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とバチルス・サブチルス由来グルコース脱水素酵素による(S)-CHPOの合成
実施例１で得られた形質転換した大腸菌を2×YT培地（Difco-Tryptone 20 g/L、Difco-Yeast extract 10 g/L、 NaCl 10 g/L、 pH 7.2）50mLで培養し、0.1mM IPTGで遺伝子の発現を誘導した後、集菌した。得られた菌体の半量を400 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、1% CHPN（73 mM）、1% ジメチルスルホキシド、1.6% グルコース（88mM）を含む50 mLの反応液に加えて、振盪下20 ℃で反応を開始した。反応開始から1時間後に集菌体の半量を更に添加し、一晩反応を継続した。
[Example 3] Synthesis of (S) -CHPO by (R) -2-octanol dehydrogenase derived from Pichia finlandica and glucose dehydrogenase derived from Bacillus subtilis 2 transformed E. coli obtained in Example 1 × Cultured in 50 mL of YT medium (Difco-Tryptone 20 g / L, Difco-Yeast extract 10 g / L, NaCl 10 g / L, pH 7.2), induced gene expression with 0.1 mM IPTG, and collected . Add half of the resulting bacterial mass to a 50 mL reaction solution containing 400 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 1% CHPN (73 mM), 1% dimethyl sulfoxide, 1.6% glucose (88 mM), The reaction was started at 20 ° C. with shaking. One hour after the start of the reaction, half of the collected cells were further added, and the reaction was continued overnight.
[実施例４]反応液からの(S)-CHPOの単離
実施例３で調製した反応液に対し、150 mLのヘキサンを用いて3回抽出を行った。このヘキサン抽出液の一部を取り、ガスクロマトグラフィーで変換率の測定を行った。分析には、FFAP 20％ Chromosorb W (AW)、80−100メッシュ（直径0.32×210cm、信和化工）を用いた。カラム室温度と注入口温度は200 ℃、検出器温度は230 ℃、キャリアガスには窒素、検出には水素炎イオン化検出器を用いた。各化合物の保持時間は、CHPNで5.0分、CHPOで8.5分であった。定量の結果、変換率は100％であった。有機層をろ過して不溶成分を除去した後、減圧下に溶媒を留去した。得られた油状物を冷却することにより、結晶が析出した。析出した結晶をろ過によって回収し、目的物である(S)-CHPOの結晶380 mgを得た。収率は75%であった。
[Example 4] Isolation of (S) -CHPO from reaction solution The reaction solution prepared in Example 3 was extracted three times with 150 mL of hexane. A portion of this hexane extract was taken and the conversion rate was measured by gas chromatography. For the analysis, FFAP 20% Chromosorb W (AW), 80-100 mesh (diameter 0.32 × 210 cm, Shinwa Kako) was used. The column chamber temperature and inlet temperature were 200 ° C., the detector temperature was 230 ° C., nitrogen was used as the carrier gas, and a hydrogen flame ionization detector was used for detection. The retention time for each compound was 5.0 minutes for CHPN and 8.5 minutes for CHPO. As a result of quantification, the conversion rate was 100%. The organic layer was filtered to remove insoluble components, and then the solvent was distilled off under reduced pressure. Crystals were precipitated by cooling the obtained oil. The precipitated crystals were collected by filtration to obtain 380 mg of (S) -CHPO crystals as the target product. The yield was 75%.
[実施例５]合成した(S)-CHPOの光学純度
実施例４記載のヘキサン抽出液を用い、光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを用いて光学純度の測定を行った。分析には、CHIRALCEL OD（φ0.46×25cm、ダイセル化学工業）を用いた。カラム室温度は40 ℃、溶出はヘキサン／2−プロパノール（97/3、流速1 mL／分）、検出波長は220 nmとした。各対掌体の保持時間は、(S)体で13.0分、(R)体で14.9分であった。その結果、生成物の光学純度は100％ee (S)であった。
[Example 5] Optical purity of synthesized (S) -CHPO Using the hexane extract described in Example 4, optical purity was measured using high performance liquid chromatography using an optical resolution column. For the analysis, CHIRALCEL OD (φ0.46 × 25 cm, Daicel Chemical Industries) was used. The column chamber temperature was 40 ° C., elution was hexane / 2-propanol (97/3, flow
[実施例６]ピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の同時発現
特許文献（ＷＯ０１／６１０１４号公報）に示された方法で得たピキア・フィンランディカ由来の(R)−オクタノール脱水素酵素とマイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素を共発現するプラスミドpSF-PFO3を保持する大腸菌HB101株（HB101 (pSF-PFO3)）を2×YT培地（Difco-Tryptone 20 g/L、Difco-Yeast extract 10 g/L、 NaCl 10 g/L、pH 7.2）50 mLで培養し、0.1 mM IPTGで遺伝子の発現を誘導した。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
[Example 6] Simultaneous expression of (R) -2-octanol dehydrogenase derived from Pichia finlandica and formate dehydrogenase derived from Mycobacterium baccae Obtained by the method shown in the patent document (WO01 / 61014) E. coli strain HB101 (HB101 (pSF-PFO3)) carrying plasmid pSF-PFO3 that co-expresses (R) -octanol dehydrogenase derived from Pichia finlandica and formate dehydrogenase derived from Mycobacterium baccae The cells were cultured in 50 mL of 2 × YT medium (Difco-Tryptone 20 g / L, Difco-Yeast extract 10 g / L, NaCl 10 g / L, pH 7.2), and gene expression was induced with 0.1 mM IPTG. The obtained microbial cells were collected, crushed with a sealed ultrasonic crusher UCD-200TM (Cosmo Bio), and the centrifuged supernatant was used as a cell-free extract.
[実施例７]ピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の酵素活性
実施例６で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を測定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NAD+依存的に（Ｒ）−２−オクタノール酸化活性を示し、その比活性は、18.2 U/ mg−タンパク質であった。
[Example 7] Enzymatic activity of (R) -2-octanol dehydrogenase derived from Pichia finlandica and formate dehydrogenase derived from Mycobacterium baccae Using the cell-free extract obtained in Example 6, enzyme activity Was measured. The cell-free extract obtained from recombinant Escherichia coli exhibited (R) -2-octanol oxidation activity in a NAD + dependent manner, and the specific activity was 18.2 U / mg-protein.
ギ酸脱水素酵素活性の測定は、100 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、2.5 mM NAD+、100 mM ギ酸ナトリウム及び酵素を含む反応液中で30℃で反応させた。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、その比活性は、1.11 U/ mg−タンパク質であった。 Formate dehydrogenase activity was measured at 30 ° C. in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 2.5 mM NAD + , 100 mM sodium formate and enzyme. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 μmol NADH per minute. In the cell-free extract obtained from recombinant E. coli, the specific activity was 1.11 U / mg protein.
[実施例８] ピキア・フィンランディカ由来（Ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素とマイコバクテリウム・バッカエ由来ギ酸脱水素酵素による(S)-CHPOの合成
実施例６で得られた形質転換した大腸菌を2×YT培地（Difco-Tryptone 2 0g/L、Difco-Yeast extract 10 g/L、 NaCl 10 g/L、 pH 7.2）50mLで培養し、0.1 mM IPTGで遺伝子の発現を誘導した後、集菌した。得られた菌体の半量を400 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、1％CHPN（73 mM）、１％ジメチルスルホキシド、1.6% グルコース（88 mM）、1 mM NAD+を含む25 mLの反応液に加えて、振盪下20 ℃で一晩反応を継続した。反応液に対し、75 mLの酢酸エチルを用いて2回抽出を行い、ガスクロマトグラフィーで定量した結果、変換率は84％であった。
[Example 8] Synthesis of (S) -CHPO by (R) -2-octanol dehydrogenase derived from Pichia finlandica and formate dehydrogenase derived from Mycobacterium baccae. Transformed Escherichia coli obtained in Example 6 Is cultured in 50 mL of 2 × YT medium (Difco-Tryptone 20 g / L, Difco-Yeast extract 10 g / L, NaCl 10 g / L, pH 7.2), and the expression of the gene is induced with 0.1 mM IPTG. Fungus. Half of the resulting cells were added to 25 mL of 400 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 1% CHPN (73 mM), 1% dimethyl sulfoxide, 1.6% glucose (88 mM), 1 mM NAD + In addition to the reaction solution, the reaction was continued overnight at 20 ° C. with shaking. The reaction solution was extracted twice with 75 mL of ethyl acetate and quantified by gas chromatography. As a result, the conversion rate was 84%.
［実施例９］サッカロマイセス・セレビジエからの染色体DNAの精製
サッカロマイセス・セレビジエ X2180-1B (Yeast Genetic Stock Center) をYM培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体DNAの精製は、Meth. Cell Biol. 29, 39-44 (1975) に記載の方法により行った。
[Example 9] Purification of chromosomal DNA from Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae X2180-1B (Yeast Genetic Stock Center) was cultured in a YM medium to prepare bacterial cells. Purification of chromosomal DNA from the bacterial cells was performed by the method described in Meth. Cell Biol. 29, 39-44 (1975).
［実施例１０］カルボニル還元酵素のScGRE2 のクローニング
DDBJに登録されている予想タンパク質YOL151w (SWISS-PROT Accession No. Z74893-1) に対応するDNA配列 (DDBJ Accession No. Z74893) を基にPCR用プライマーYOL1-ATG1（配列番号：9）、YOL-XbaIR（配列番号：10）、YOL-XbaIF（配列番号：11）、YOL1-TAA1 （配列番号：12）を合成した。
配列番号９：
YOL-ATG1: GACACATGTCAGTTTTTGTTTCAGGTGCTAAC
配列番号１０：
YOL-XbaIR: TCCTCTAGAAATTCCCAAGCTG
配列番号１１：
YOL-XbaIF：CTGTCTAGAGGAGAATCGTGACTCTGTAAAATTC
配列番号１２：
YOL-TAA1: GTCGAATTCCTCTATTAAATACGGCCCTCAAATTTTAAAATTTGGGAG
[Example 10] Cloning of carbonyl reductase ScGRE2
PCR primer YOL1-ATG1 (SEQ ID NO: 9), YOL- based on DNA sequence (DDBJ Accession No. Z74893) corresponding to predicted protein YOL151w (SWISS-PROT Accession No. Z74893-1) registered in DDBJ XbaIR (SEQ ID NO: 10), YOL-XbaIF (SEQ ID NO: 11), and YOL1-TAA1 (SEQ ID NO: 12) were synthesized.
SEQ ID NO: 9
YOL-ATG1: GACACATGTCAGTTTTTGTTTCAGGTGCTAAC
SEQ ID NO: 10
YOL-XbaIR: TCCTCTAGAAATTCCCAAGCTG
SEQ ID NO: 11
YOL-XbaIF: CTGTCTAGAGGAGAATCGTGACTCTGTAAAATTC
SEQ ID NO: 12
YOL-TAA1: GTCGAATTCCTCTATTAAATACGGCCCTCAAATTTTAAAATTTGGGAG
プライマーYOL-ATG1, YOL-XbaIRを各２５ｐｍｏｌ、dNTP１０ｎｍｏｌ、サッカロマイセス・セレビジエ由来染色体DNA５０ｎｇ、Pfu DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu DNA polymerase 2Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、４５秒）、アニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、１分２０秒）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いてPCRを行った結果、特異的な増幅産物が得られた。 Denature using 50 μL of the primer YOL-ATG1 and YOL-XbaIR each containing 25 pmol, dNTP 10 nmol, Saccharomyces cerevisiae-derived chromosomal DNA 50 ng, Pfu DNA polymerase buffer (STRATAGENE), Pfu DNA polymerase 2U (STRATAGENE) (95 ° C, 45 seconds), annealing (55 ° C, 30 seconds), extension (72 ° C, 1 minute 20 seconds) 30 cycles, PCR was performed using GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer). Amplification product was obtained.
増幅産物をフェノール処理後、制限酵素BspLU11I, XbaIで2重消化し、得られた断片を精製した。 The amplified product was treated with phenol, then double digested with restriction enzymes BspLU11I and XbaI, and the resulting fragment was purified.
次に、プライマーYOL-Xba1F, YOL-TAA1を各２５ｐｍｏｌ、dNTP１０ｎｍｏｌ、サッカロマイセス・セレビジエ由来染色体DNA５０ｎｇ、Pfu DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu DNA polymerase 2Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、４５秒）、アニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、１分２０秒）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いてPCRを行った結果、特異的な増幅産物が得られた。 Next, 50 μL of the reaction solution containing primers YOL-Xba1F and YOL-TAA1 each containing 25 pmol, dNTP 10 nmol, Saccharomyces cerevisiae-derived chromosomal DNA 50 ng, Pfu DNA polymerase buffer (STRATAGENE), and Pfu DNA polymerase 2U (STRATAGENE) PCR was performed using GeneAmp PCR System 2400 (manufactured by PerkinElmer) using 30 cycles of denaturation (95 ° C., 45 seconds), annealing (55 ° C., 30 seconds), extension (72 ° C., 1 minute 20 seconds). As a result, a specific amplification product was obtained.
得られた増幅産物をフェノール処理後、制限酵素XbaI, EcoRIで2重消化し、得られた断片を精製した。 The obtained amplification product was treated with phenol, then double digested with restriction enzymes XbaI and EcoRI, and the resulting fragment was purified.
得られた2種類の制限酵素消化済みＰＣＲ増幅DNA断片を、制限酵素NcoI, EcoRIで2重消化したベクターpSE420D（特開2000-189170号公報）とTAKARA Ligation Kitによりライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製した。得られたプラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析した結果、プライマー部分を除き、DDBJに登録されている塩基配列と完全に一致した。得られたプラスミドをpSE-YOL1とした。プラスミド構築の過程を図1に示した。 The obtained two kinds of PCR-amplified DNA fragments digested with restriction enzymes were ligated with a vector pSE420D (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-189170) double-digested with restriction enzymes NcoI and EcoRI and TAKARA Ligation Kit. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the ligated DNA, grown on LB medium containing ampicillin (50 mg / L), and the plasmid was purified by FlexiPrep from the obtained transformant. As a result of analyzing the base sequence of the inserted DNA portion of the obtained plasmid, the base sequence registered in DDBJ was completely identical except for the primer portion. The obtained plasmid was designated as pSE-YOL1. The process of plasmid construction is shown in FIG.
［実施例１１］カルボニル還元酵素ScGRE2と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSG-SCR1の構築
pSE-YOL1をNheI, Csp45Iで2重消化し、719 bpからなるDNA断片を精製した。更に、同プラスミドをCsp45I, EcoRIで2重消化し、469 bpからなるDNA断片を精製した。枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドpSE-BSG1（特願2000-374593号）をNheI、EcoRIの2つの制限酵素で二重消化し、pSE-YOL1から切り出した上記２DNA断片とTakara Ligation Kitを用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製し、グルコース脱水素酵素とScGRE2を同時に発現可能なプラスミドであるpSG-SCR1を得た。プラスミド構築の過程を図２に示した。
[Example 11] Construction of plasmid pSG-SCR1 co-expressing carbonyl reductase ScGRE2 and a glucose dehydrogenase gene derived from Bacillus subtilis
pSE-YOL1 was double-digested with NheI and Csp45I, and a DNA fragment consisting of 719 bp was purified. Further, this plasmid was double-digested with Csp45I and EcoRI, and a DNA fragment consisting of 469 bp was purified. Plasmid pSE-BSG1 (Japanese Patent Application No. 2000-374593) containing the glucose dehydrogenase gene derived from Bacillus subtilis was double digested with two restriction enzymes NheI and EcoRI, and the above 2 DNA fragment excised from pSE-YOL1 and Takara Ligation Ligation was performed using Kit. Escherichia coli JM109 is transformed with the ligated DNA, grown in LB medium containing ampicillin (50 mg / L), and the resulting transformant can be purified with FlexiPrep to simultaneously express glucose dehydrogenase and ScGRE2. PSG-SCR1, a novel plasmid, was obtained. The process of plasmid construction is shown in FIG.
[実施例１２]カルボニル還元酵素ScGRE2と枯草菌由来グルコース脱水素酵素の同時発現
実施例１１で得られたpSG-SCR1で形質転換した大腸菌 HB101株（E.coli HB101 (pSG-SCR1)） をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で終夜培養後、IPTGを0.1 mM添加して遺伝子の発現を誘導し、更に４時間培養した。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
[Example 12] Simultaneous expression of carbonyl reductase ScGRE2 and glucose dehydrogenase derived from Bacillus subtilis Escherichia coli HB101 transformed with pSG-SCR1 obtained in Example 11 (E. coli HB101 (pSG-SCR1)) was treated with ampicillin. After overnight culture in LB medium containing 50 mg / L, 0.1 mM IPTG was added to induce gene expression, followed by further incubation for 4 hours. The obtained cells were collected and then crushed with a closed ultrasonic crusher UCD-200TM (manufactured by Cosmo Bio), and the centrifuged supernatant was used as a cell-free extract.
[実施例１３]カルボニル還元酵素ScGRE2の酵素活性
実施例１２で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を測定した。CHPN還元活性の測定は、100 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、0.2 mM NADPH、2 mM CHPN、1% ジメチルスルホキシド及び酵素を含む反応液中で、25 ℃で反応させた。1Uは、1分間に1 μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NADPH依存的にCHPN還元活性を示し、その比活性は、10.8 U/mg-抽出液であった。
[Example 13] Enzyme activity of carbonyl reductase ScGRE2 Using the cell-free extract obtained in Example 12, the enzyme activity was measured. The measurement of CHPN reduction activity was performed at 25 ° C. in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 0.2 mM NADPH, 2 mM CHPN, 1% dimethyl sulfoxide and an enzyme. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 μmol NADH per minute. The cell-free extract obtained from recombinant Escherichia coli showed CHPN reduction activity in a NADPH-dependent manner, and the specific activity was 10.8 U / mg-extract.
[実施例１４]カルボニル還元酵素ScGRE2を用いた(R)-CHPOの合成
200 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、1 mM NADP+、CHPN 50 mM、D-グルコース 250 mM、BSA 0.1%、グルコース脱水素酵素（アマノ製）2 U、及びScGRE2酵素溶液 1 Uを含む反応液を振盪下、25 ℃で一晩反応させた。
[Example 14] Synthesis of (R) -CHPO using carbonyl reductase ScGRE2
Contains 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 1 mM NADP + , CHPN 50 mM, D-glucose 250 mM, BSA 0.1%, glucose dehydrogenase (manufactured by Amano) 2 U, and ScGRE2 enzyme solution 1 U The reaction was allowed to react overnight at 25 ° C. with shaking.
［実施例１５］(R)-CHPOの光学純度
実施例１４で調整した反応液に対し、２倍容の酢酸エチルで抽出を行った。減圧下に溶媒を留去し、残渣を1倍容のヘキサン／２−プロパノール（97/3）に溶解した。このサンプルの光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを用いた光学純度の測定を行った。分析は、実施例５に記載の方法により行った。その結果、生成物の光学純度は99.8％ee (R)であった。
[Example 15] Optical purity of (R) -CHPO The reaction solution prepared in Example 14 was extracted with 2 volumes of ethyl acetate. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was dissolved in 1 volume of hexane / 2-propanol (97/3). The optical purity of this sample was measured using high performance liquid chromatography using an optical resolution column. The analysis was performed by the method described in Example 5. As a result, the optical purity of the product was 99.8% ee (R).
［実施例１６］(R)-CHPOの変換率
実施例１４で調整したサンプルを用い、実施例４に記載の方法によりガスクロマトグラフィーで変換率の測定を行った。ピーク面積から算出した変換率は28.4％であった。
[Example 16] Conversion rate of (R) -CHPO Using the sample prepared in Example 14, the conversion rate was measured by gas chromatography according to the method described in Example 4. The conversion rate calculated from the peak area was 28.4%.
［実施例１７］カルボニル還元酵素ScYGD9のクローニング及びカルボニル還元酵素ScYGD9と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSG-YGD9の構築
特願2003-113402号の記載の方法に従って、以下の通り行った。
（１）カルボニル還元酵素のホモログ YGL039w のクローニング
DDBJに登録されている予想タンパク質YGL039w (SWISS-PROT Accession No.P53183) に対応するDNA配列 (DDBJ Accession No. Z72561) を基にPCR用プライマーYGL2-ATG2（配列番号１３）、YGL2-TAA2（配列番号１４）を合成した。プライマーを各２５ｐｍｏｌ、dNTP１０ｎｍｏｌ、サッカロマイセス・セレビジエ由来染色体DNA５０ｎｇ、Pfu DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu DNApolymerase 2Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、４５秒）、アニール（５０℃、３０秒）、伸長（７２℃、１分１５秒）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いてPCRを行った結果、特異的な増幅産物が得られた。
増幅産物をフェノール処理後、制限酵素BspHI, NheIで2重消化し、制限酵素NcoI,XbaIで2重消化したベクターpSE420DとTAKARA Ligation Kit によりライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製した。プラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解析し、その結果を配列番号１５に示した。得られた塩基配列は、DDBJに登録されている塩基配列と完全に一致した。得られたプラスミドをpSE-YGD9とした。
[Example 17] Cloning of carbonyl reductase ScYGD9 and construction of plasmid pSG-YGD9 co-expressing carbonyl reductase ScYGD9 and a glucose dehydrogenase gene derived from Bacillus subtilis according to the method described in Japanese Patent Application No. 2003-113402, I went there.
(1) Cloning of carbonyl reductase homolog YGL039w
Primers for PCR YGL2-ATG2 (SEQ ID NO: 13), YGL2-TAA2 (sequence) based on the DNA sequence (DDBJ Accession No. Z72561) corresponding to the predicted protein YGL039w (SWISS-PROT Accession No. P53183) registered in DDBJ No. 14) was synthesized. Using a 50 μL reaction solution containing 25 pmol of each primer, 10 nmol of dNTP, 50 ng of chromosomal DNA derived from Saccharomyces cerevisiae, buffer solution for Pfu DNA polymerase (manufactured by STRATAGENE), Pfu DNApolymerase 2U (manufactured by STRATAGENE), denaturation (95 ° C., 45 seconds), PCR was performed using GeneAmp PCR System 2400 (manufactured by PerkinElmer) for 30 cycles of annealing (50 ° C., 30 seconds) and extension (72 ° C., 1 minute 15 seconds). As a result, a specific amplification product was obtained. .
The amplified product was treated with phenol, double-digested with restriction enzymes BspHI and NheI, and ligated with vectors pSE420D and TAKARA Ligation Kit double-digested with restriction enzymes NcoI and XbaI. Escherichia coli JM109 strain was transformed with the ligated DNA, grown on LB medium containing ampicillin (50 mg / L), and the plasmid was purified by FlexiPrep from the obtained transformant. The nucleotide sequence of the inserted DNA portion of the plasmid was analyzed, and the result is shown in SEQ ID NO: 15. The obtained base sequence completely matched the base sequence registered in DDBJ. The obtained plasmid was designated as pSE-YGD9.
（２）カルボニル還元酵素のホモログYGL039wと枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSG-YGD9の構築
pSE-YGD9をEcoRI、HindIIIの2つの制限酵素で二重消化し、枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドpSE-BSG1（特開2000-189170）から同酵素で切り出したグルコース脱水素遺伝子を含むDNA断片とTakara Ligation Kitを用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むLB培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製し、グルコース脱水素酵素とYGL039wを同時に発現可能なプラスミドであるpSG-YGD9を得た。
(2) Construction of plasmid pSG-YGD9 co-expressing carbonyl reductase homolog YGL039w and glucose dehydrogenase gene from Bacillus subtilis
Glucose dehydrogenation gene obtained by double digestion of pSE-YGD9 with two restriction enzymes EcoRI and HindIII and excised from plasmid pSE-BSG1 (JP 2000-189170) containing the glucose dehydrogenase gene derived from Bacillus subtilis Ligation was performed using a DNA fragment containing and Takara Ligation Kit. Escherichia coli JM109 is transformed with the ligated DNA, grown in LB medium containing ampicillin (50 mg / L), and the resulting transformant is purified by FlexiPrep to allow simultaneous expression of glucose dehydrogenase and YGL039w PSG-YGD9, a novel plasmid, was obtained.
［実施例１８］カルボニル還元酵素ScYGD9の発現
実施例１７で得られたpSG-YGD9で形質転換した大腸菌 HB101株（E.coli HB101 (pSG-YGD9)） をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で終夜培養後、IPTGを0.1 mM添加して遺伝子の発現を誘導し、更に４時間培養した。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
[Example 18] Expression of carbonyl reductase ScYGD9 E. coli strain HB101 transformed with pSG-YGD9 obtained in Example 17 (E. coli HB101 (pSG-YGD9)) was cultured in LB medium containing 50 mg / L of ampicillin. After overnight culture, 0.1 mM IPTG was added to induce gene expression, and the culture was further continued for 4 hours. The obtained cells were collected and then crushed with a closed ultrasonic crusher UCD-200TM (manufactured by Cosmo Bio), and the centrifuged supernatant was used as a cell-free extract.
［実施例１９］カルボニル還元酵素ScYGD9の酵素活性
実施例１８で得られた無細胞抽出液を用い、実施例１３の方法に従って酵素活性を測定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NADPH依存的にCHPN還元活性を示し、その比活性は、22.7 U/mg-抽出液であった。
[Example 19] Enzyme activity of carbonyl reductase ScYGD9 Using the cell-free extract obtained in Example 18, the enzyme activity was measured according to the method of Example 13. The cell-free extract obtained from recombinant Escherichia coli exhibited CHPN reduction activity in a NADPH-dependent manner, and the specific activity was 22.7 U / mg-extract.
[実施例２０]カルボニル還元酵素ScYGD9を用いた(R)-CHPOの合成
200 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、1 mM NADP+、CHPN 50 mM、D-グルコース 250 mM、BSA 0.1%、グルコース脱水素酵素（アマノ製）2U、及びScYGD9酵素溶液 1Uを含む反応液を振盪下、25℃で一晩反応させた。
[Example 20] Synthesis of (R) -CHPO using carbonyl reductase ScYGD9
Reaction solution containing 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 1 mM NADP + , CHPN 50 mM, D-glucose 250 mM, BSA 0.1%, glucose dehydrogenase (Amano) 2U, and ScYGD9 enzyme solution 1U Was reacted overnight at 25 ° C. with shaking.
［実施例２１］(R)-CHPOの光学純度
実施例２０で調整した反応液に対し、実施例５と同様の方法で光学純度の測定を行った。その結果、生成物の光学純度は99.3％ee (R)であった。
[Example 21] Optical purity of (R) -CHPO The optical purity of the reaction solution prepared in Example 20 was measured in the same manner as in Example 5. As a result, the optical purity of the product was 99.3% ee (R).
［実施例２２］(R)-CHPOの変換率
実施例２０で調整したサンプルを用い、実施例４と同様の方法で変換率の測定を行った。その結果、ピーク面積から算出した変換率は11.6%であった。
[Example 22] (R) -CHPO conversion rate Using the sample prepared in Example 20, the conversion rate was measured in the same manner as in Example 4. As a result, the conversion rate calculated from the peak area was 11.6%.
［実施例２３］カルボニル還元酵素TdCR1のクローニング及びカルボニル還元酵素TdCR1と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSG-TDR1の構築
文献（特願2003-113402）記載の方法に従って、以下の通り行った。
[Example 23] Cloning of carbonyl reductase TdCR1 and construction of plasmid pSG-TDR1 that co-expresses carbonyl reductase TdCR1 and a glucose dehydrogenase gene derived from Bacillus subtilis according to the method described in the literature (Japanese Patent Application 2003-113402). I went there.
（１）カルボニル還元酵素遺伝子TdCR1の一部を含むプラスミドpUC-TDXの構築
カルボニル還元酵素遺伝子のORFのXbaI部位から3'末端までをクローニングするために、プライマーTd-XbaF（配列番号１６）、Td-TAA1（配列番号１７）を合成した。
プライマーTd-XbaFとTd-TAA1を各50 pmol、dNTP10 nmol、トルラスポラ・デルブレッキー由来染色体DNA 50ng、Pfu Turbo DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu Turbo DNA polymerase 3.75 U (STRATAGENE製)を含む50μLの反応液を用い、変性（95℃、2分30秒）、アニール（55℃、1分）、伸長（72℃、1分）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いて行った。得られたPCR産物をTd-PCR2とした。
(1) Construction of plasmid pUC-TDX containing a part of the carbonyl reductase gene TdCR1 In order to clone from the XbaI site to the 3 ′ end of the ORF of the carbonyl reductase gene, primers Td-XbaF (SEQ ID NO: 16), Td -TAA1 (SEQ ID NO: 17) was synthesized.
50 μL each containing primers Td-XbaF and Td-TAA1, 50 pmol each, dNTP10 nmol, 50 ng chromosomal DNA derived from Torlas pora delbrecki, Pfu Turbo DNA polymerase buffer (STRATAGENE), Pfu Turbo DNA polymerase 3.75 U (STRATAGENE) 30 cycles of denaturation (95 ° C, 2 minutes 30 seconds), annealing (55 ° C, 1 minute), extension (72 ° C, 1 minute), using GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer) went. The obtained PCR product was designated as Td-PCR2.
得られたPCR産物を、フェノール-クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。Td-PCR2をXbaIで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Sephaglas BandPrep Kit(ファルマシア製)により精製した。
制限酵素消化されたTd-PCR2は、XbaIで消化したpUC18（宝酒造製）とTakaraLigation Kitを用いてライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。形質転換株をアンピシリンを含むLB培地で生育させ、挿入断片の塩基配列を解析した。ここで得られたプラスミドをpUC-TDXとした。
The obtained PCR product was recovered as an ethanol precipitate after phenol-chloroform extraction. Td-PCR2 was digested with XbaI, and then subjected to agarose gel electrophoresis. The target band was excised and purified by Sephaglas BandPrep Kit (Pharmacia).
The restriction enzyme-digested Td-PCR2 was ligated using pUC18 (Takara Shuzo) digested with XbaI and TakaraLigation Kit to transform Escherichia coli JM109 strain. The transformed strain was grown on LB medium containing ampicillin, and the nucleotide sequence of the inserted fragment was analyzed. The plasmid obtained here was designated as pUC-TDX.
（２）カルボニル還元酵素遺伝子TdCR1と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSG-TDR1の構築
プラスミドpUC-TDXを制限酵素XbaIで消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動を行い、TdCR1遺伝子の一部を含む約0.8 bpのバンドを切り出し、SephaglasBandPrep (Amersham Pharmacia Biotech製)により精製、回収した。得られたDNA断片と、同制限酵素で消化し、アルカリフォスファターゼ処理後、フェノール抽出、フェノール-クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿したプラスミドpSG-TDXを、TaKaRa Ligation Kitを用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製した。その結果、グルコース脱水素酵素とTdCR1を同時に発現可能なプラスミドであるpSG-TDR1を得た。
(2) Construction of plasmid pSG-TDR1 that co-expresses carbonyl reductase gene TdCR1 and glucose dehydrogenase gene derived from Bacillus subtilis Plasmid pUC-TDX is digested with restriction enzyme XbaI, ethanol precipitated, and then subjected to agarose electrophoresis. A band of about 0.8 bp containing a part of the TdCR1 gene was excised, purified and collected by SephaglasBandPrep (Amersham Pharmacia Biotech). The obtained DNA fragment was digested with the same restriction enzyme, and after alkaline phosphatase treatment, the plasmid pSG-TDX obtained by phenol extraction, phenol-chloroform extraction, chloroform extraction and ethanol precipitation was ligated using TaKaRa Ligation Kit. Escherichia coli JM109 was transformed with the ligated DNA, grown in LB medium containing ampicillin (50 mg / L), and the plasmid was purified from the resulting transformant by FlexiPrep. As a result, pSG-TDR1, which is a plasmid capable of simultaneously expressing glucose dehydrogenase and TdCR1, was obtained.
［実施例２４］カルボニル還元酵素TdCR1と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素の同時発現
実施例２３で得られたpSG-TDR1で形質転換した大腸菌 HB101株（E.coli HB101 (pSG-TDR1)） をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で終夜培養後、IPTGを0.1 mM添加して遺伝子の発現を誘導し、更に４時間培養した。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
[Example 24] Simultaneous expression of carbonyl reductase TdCR1 and glucose dehydrogenase derived from Bacillus subtilis Escherichia coli HB101 transformed with pSG-TDR1 obtained in Example 23 (E.coli HB101 (pSG-TDR1)) After overnight culture in LB medium containing 50 mg / L of ampicillin, 0.1 mM of IPTG was added to induce gene expression, and further cultured for 4 hours. The obtained cells were collected and then crushed with a closed ultrasonic crusher UCD-200TM (manufactured by Cosmo Bio), and the centrifuged supernatant was used as a cell-free extract.
［実施例２５］カルボニル還元酵素TdCR1の酵素活性
実施例２４で得られた無細胞抽出液を用い、実施例１３の方法に従って酵素活性を測定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NADPH依存的にCHPN還元活性を示し、その比活性は、5.7 U/mg-蛋白質であった。
[Example 25] Enzyme activity of carbonyl reductase TdCR1 Using the cell-free extract obtained in Example 24, the enzyme activity was measured according to the method of Example 13. The cell-free extract obtained from recombinant Escherichia coli exhibited CHPN reduction activity in a NADPH-dependent manner, and the specific activity was 5.7 U / mg protein.
[実施例２６]カルボニル還元酵素TdCR1を用いた(R)-CHPOの合成
200 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、1 mM NADP+、CHPN 50 mM、D-グルコース 250 mM、BSA 0.1%、グルコース脱水素酵素（アマノ製）1U、及びTdCR1酵素溶液 0.5Uを含む反応液を振盪下、25℃で一晩反応させた。
[Example 26] Synthesis of (R) -CHPO using carbonyl reductase TdCR1
Reaction solution containing 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 1 mM NADP +, CHPN 50 mM, D-glucose 250 mM, BSA 0.1%, glucose dehydrogenase (manufactured by Amano) 1U, and TdCR1 enzyme solution 0.5U Was reacted overnight at 25 ° C. with shaking.
［実施例２７］(R)-CHPOの光学純度
実施例２６で調整した反応液に対し、実施例５と同様の方法で光学純度の測定を行った。その結果、生成物の光学純度は99.7％ee (R)であった。
[Example 27] Optical purity of (R) -CHPO The optical purity of the reaction solution prepared in Example 26 was measured in the same manner as in Example 5. As a result, the optical purity of the product was 99.7% ee (R).
［実施例２８］(R)-CHPOの変換率
実施例２６で調整したサンプルを用い、実施例４と同様の方法で変換率の測定を行った。その結果、ピーク面積から算出した変換率は9.0％であった。
[Example 28] (R) -CHPO conversion rate Using the sample prepared in Example 26, the conversion rate was measured in the same manner as in Example 4. As a result, the conversion rate calculated from the peak area was 9.0%.
Claims (8)
（ａ）配列番号１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式２で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を、式１：
で示されるプロパルギルケトン誘導体に作用させ、該ケトンを還元して式２：
で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造することを含む、光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。 The following (a) to (e);
(A) a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(C) a protein composed of amino acids in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the propargyl ketone derivative represented by formula 1 is reduced; A polynucleotide encoding a protein having an activity to produce an optically active propargyl alcohol derivative represented by Formula 2:
(D) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the propargyl ketone derivative represented by Formula 1 is reduced, and the optical activity represented by Formula 2 A polynucleotide encoding a protein having an activity of producing a propargyl alcohol derivative; or (e) a propargyl ketone represented by formula 1 having an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A polynucleotide encoding a protein having an activity of reducing the derivative to produce an optically active propargyl alcohol derivative represented by formula 2:
A protein encoded by the polynucleotide according to any one of the above, a microorganism or a transformant functionally expressing the protein, or a processed product thereof, is represented by the formula 1:
Is reacted with a propargyl ketone derivative represented by formula (2), and the ketone is reduced to give a compound of formula 2:
A process for producing an optically active propargyl alcohol derivative, comprising producing an optically active propargyl alcohol derivative represented by the formula:
（ａ）配列番号３、５又は７に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質であって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３、５又は７に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号４、６又は８に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、式１で示されるプロパルギルケトン誘導体を還元し、式５で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：
のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、該タンパク質を機能的に発現する微生物もしくは形質転換株、またはその処理物を、式１：
で示されるプロパルギルケトン誘導体に作用させ、該ケトンを還元して式５：
で示される光学活性プロパルギルアルコール誘導体を製造することを含む、光学活性プロパルギルアルコール誘導体の製造方法。 The following (a) to (e);
(A) a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7;
(B) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 6 or 8;
(C) a protein comprising amino acids in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, 6 or 8, and a propargyl ketone derivative represented by formula 1 A polynucleotide that encodes a protein having an activity to produce an optically active propargyl alcohol derivative represented by formula 5;
(D) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7, wherein the propargyl ketone derivative represented by formula 1 is reduced; A polynucleotide encoding a protein having activity to produce the optically active propargyl alcohol derivative shown; or (e) having an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 6 or 8 A polynucleotide encoding a protein having an activity of reducing the propargyl ketone derivative represented by formula 1 to produce an optically active propargyl alcohol derivative represented by formula 5:
A protein encoded by the polynucleotide according to any one of the above, a microorganism or a transformant functionally expressing the protein, or a processed product thereof, is represented by the formula 1:
And reacting with a propargyl ketone derivative represented by
A process for producing an optically active propargyl alcohol derivative, comprising producing an optically active propargyl alcohol derivative represented by the formula:
The method according to claim 7, wherein the dehydrogenase having NADH or NADPH regeneration activity is glucose dehydrogenase or formate dehydrogenase.
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