JP2007271529A - Microscopic fluorescence observation device - Google Patents

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Tsutomu Okura
力 大倉
Kazuo Hijikata
和男 土方
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SOMA KOUGAKU KK
Tama TLO Co Ltd
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SOMA KOUGAKU KK
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a coaxial microscopic epifluorescence observation device capable of reducing luminous energy losses of an excitation beam and an observation beam, while sharing an optical axis in an excitation beam irradiation optical system and an observation optical system. <P>SOLUTION: In this coaxial microscopic epifluorescence observation device, a laser beam regulated in a prescribed diameter via a pinhole P is converged an intersection X of an optical axis K1 and an optical axis K2, using the laser beam with a magnified beam diameter as an excitation beam, and is reflected on a reflecting face of a turn-back reflecting part 18. A reflected beam is transmitted through an objective lens 20, and forms a laser beam having a prescribed beam diameter to irradiate the whole face of a sample 32. Fluorescence emitted from the irradiated sample is passed through the objective lens 20, an imaging lens 28 and the like, to be image-focused as a clear fluorescence image in an imaging system 30. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、顕微蛍光観測装置に関し、より詳細には、励起光ならびに観測光の光量損失が低減された同軸落射型顕微蛍光観測装置に関する。   The present invention relates to a microscopic fluorescence observation apparatus, and more particularly, to a coaxial epi-illumination type microscopic fluorescence observation apparatus in which loss of light amount of excitation light and observation light is reduced.

近年、癌などの遺伝子に起因する病気の検査等においてＤＮＡチップが用いられており、ＤＮＡチップとは、数ｍｍ〜数十ｍｍ四方のガラス等の基板の上に、既知の塩基配列を有するポリヌクレオチドを各スポットごとに固定して形成されるものをいう。ＤＮＡチップを用いた検査においては、まず、検査対象のポリヌクレオチドを蛍光色素でラベルしたのちに、ＤＮＡチップ上に固定されたポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせる。その後、ラベルした蛍光色素の吸収バンドに合致する波長の励起光をＤＮＡチップに対して照射し、その結果発せられる蛍光を観測することによって、所望の遺伝子の発現状態を解析することが可能となる。   In recent years, DNA chips have been used in the inspection of diseases caused by genes such as cancer, and the DNA chip is a polycrystal having a known base sequence on a substrate of several mm to several tens of mm square glass. It is formed by fixing nucleotides for each spot. In an inspection using a DNA chip, first, a polynucleotide to be inspected is labeled with a fluorescent dye, and then hybridized with a polynucleotide immobilized on the DNA chip. Then, it is possible to analyze the expression state of a desired gene by irradiating the DNA chip with excitation light having a wavelength matching the absorption band of the labeled fluorescent dye and observing the fluorescence emitted as a result. .

従来、このようなＤＮＡチップの全体の蛍光画像を撮像するために、いわゆる同軸落射顕微鏡が用いられてきた。図６は、一般的な同軸落射顕微鏡５０の光学系を概略的に示す図である。同軸落射顕微鏡５０は、励起光照射光学系と観測光学系とから構成されており、両光学系は光軸Ｋを共有する。励起光照射光学系は、光源５２、照明レンズ５４、ハーフミラー５６、および対物レンズ５８とを含んで構成されており、光源５２から照射された励起光は、照明レンズ５４を透過した後、ハーフミラー５６によって約半分の光が光軸Ｋに沿って光路を変更されて対物レンズ５８を透過し、サンプル６０を照射する。しかし、この際、光源５２から照射された励起光の残りの半分はハーフミラー５６を透過してしまうため、この励起光照射光学系においては、励起光がサンプル６０に到達するまでに光量の約５０％が損失することになる。   Conventionally, so-called coaxial episcopic microscopes have been used to capture the entire fluorescent image of such a DNA chip. FIG. 6 is a diagram schematically showing an optical system of a general coaxial incident microscope 50. The coaxial incident microscope 50 includes an excitation light irradiation optical system and an observation optical system, and both optical systems share an optical axis K. The excitation light irradiation optical system includes a light source 52, an illumination lens 54, a half mirror 56, and an objective lens 58. The excitation light emitted from the light source 52 passes through the illumination lens 54 and then is half-transmitted. About half of the light is changed along the optical axis K by the mirror 56, passes through the objective lens 58, and irradiates the sample 60. However, at this time, since the remaining half of the excitation light emitted from the light source 52 is transmitted through the half mirror 56, in this excitation light irradiation optical system, about the amount of light before the excitation light reaches the sample 60. 50% will be lost.

一方、観測光学系は、対物レンズ５８、ハーフミラー５６、結像レンズ６２、およびＣＣＤ素子などを備える撮像系６４を含んで構成されており、上述した励起光によって照射されたサンプル６０が発光する蛍光が対物レンズ５８を透過した後、約半分の光がハーフミラー５６を透過して直進し、結像レンズ６２によって集光され撮像系６４にサンプル６０の蛍光像を結像する。しかし、この観測光学系においても、サンプル６０が発光する蛍光の約半分がハーフミラー５６によって反射されてしまい結像レンズ６２に入射することができないため、観測光の光量の約５０％が損失することになる。したがって、同軸落射顕微鏡５０の光学系全体について総合的にみると、光源５２から励起光をサンプル６０を直接照射して観測する場合に比較して、結果的に観測光の光量の約７５％を損失することになる。ＤＮＡチップ上のサンプルが発する蛍光は一般に微弱であり、図６に示した光学系による同軸落射顕微鏡５０では、遺伝子の発現状態を解析するために充分な鮮明度をもってサンプルを撮像することが困難であった。   On the other hand, the observation optical system is configured to include an imaging system 64 including an objective lens 58, a half mirror 56, an imaging lens 62, a CCD element, and the like, and the sample 60 irradiated with the excitation light described above emits light. After the fluorescence passes through the objective lens 58, about half of the light passes through the half mirror 56 and travels straight, and is collected by the imaging lens 62 and forms a fluorescence image of the sample 60 on the imaging system 64. However, also in this observation optical system, about half of the fluorescence emitted by the sample 60 is reflected by the half mirror 56 and cannot enter the imaging lens 62, so that about 50% of the amount of observation light is lost. It will be. Therefore, when the entire optical system of the coaxial incident microscope 50 is viewed comprehensively, about 75% of the light amount of the observation light is consequently obtained as compared with the case where the sample 60 is directly irradiated with the excitation light from the light source 52 and observed. You will lose. The fluorescence emitted from the sample on the DNA chip is generally weak, and it is difficult for the coaxial epi-illumination microscope 50 using the optical system shown in FIG. 6 to image the sample with sufficient sharpness to analyze the gene expression state. there were.

この点につき、特開２００５−６２０２３号公報（特許文献１）は、励起光および蛍光の損失を抑えて検出精度を向上させることのできる落射型蛍光測定装置を開示する。特許文献１が開示する落射型蛍光測定装置は、サンプルを斜め下方から照射する励起光照射光学系と、該励起光照射光学系とその光軸を異にする観測光学系とを含んで構成されており、上述した励起光ならびに観測光の光量損失の問題は解決するものの、各光学系の光軸が同軸でないため装置構成が複雑であり、また、そのサンプルの形態が下方から照射することができるものに限定され、なにより、サンプルの全面を蛍光像として同時に結像させることができない。
特開２００５−６２０２３号公報 In this regard, Japanese Patent Laid-Open No. 2005-62023 (Patent Document 1) discloses an epi-illumination type fluorescence measuring apparatus that can improve the detection accuracy by suppressing loss of excitation light and fluorescence. An epi-illumination type fluorescence measuring apparatus disclosed in Patent Document 1 includes an excitation light irradiation optical system that irradiates a sample obliquely from below, and an observation optical system that has a different optical axis from the excitation light irradiation optical system. Although the above-mentioned problem of the loss of the light intensity of the excitation light and the observation light is solved, the apparatus configuration is complicated because the optical axes of the optical systems are not coaxial, and the form of the sample may be irradiated from below. In particular, the entire surface of the sample cannot be simultaneously formed as a fluorescent image.
JP 2005-62023 A

本発明は、上記従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、本発明は、励起光照射光学系と観測光学系がその光軸を共有しながら、励起光ならびに観測光の光量損失が低減された同軸落射型顕微蛍光観測装置を提供することを目的とする。   The present invention has been made in view of the above problems in the prior art, and the present invention reduces the light loss of excitation light and observation light while sharing the optical axis between the excitation light irradiation optical system and the observation optical system. It is an object of the present invention to provide a coaxial epi-illumination microscopic fluorescence observation apparatus.

本発明者らは、上述した技術課題に鑑み、同軸落射型顕微蛍光観測装置の光学系の構成につき鋭意検討した結果、従来、励起光として用いられてきたレーザー光の指向性に着目し、所定のビーム径に調整されたレーザー光を、一旦、レンズ系によって極小領域に集光させた後反射させ、その反射光を再び別のレンズ系を通してサンプルの全面を照射可能な所定のビーム径を有するレーザー光とする構成を採用することにより、励起光ならびに観測光の光量損失の低減を同時に実現しうることを見出し、本発明に至ったのである。   In view of the technical problems described above, the present inventors have intensively studied the configuration of the optical system of the coaxial epi-illumination microscopic fluorescence observation apparatus. As a result, the inventors focused on the directivity of laser light that has been conventionally used as excitation light. The laser beam adjusted to the beam diameter is once condensed by a lens system onto a minimal region and then reflected, and the reflected light has a predetermined beam diameter that can irradiate the entire surface of the sample again through another lens system. It has been found that by adopting a configuration that uses laser light, it is possible to simultaneously reduce the light loss of excitation light and observation light, and the present invention has been achieved.

すなわち、本発明によれば、レーザー光を発生する励起光源と、開口部が形成されたピンホール形成部と、第１の光軸を有するレーザー集光レンズと、反射面を有する折り返し反射部と、第２の光軸を有する対物レンズとを含む同軸落射型顕微蛍光観測装置であって、前記開口部が前記第１の光軸上であって前記励起光源と前記レーザー集光レンズとの間に配置され、前記反射面が前記第１の光軸と前記第２の光軸の交点を含み、前記レーザー集光レンズの物体側主点と前記交点の離間距離が、前記レーザー集光レンズの物体側焦点距離に等しく、前記対物レンズの光源側主点と前記交点の離間距離が前記対物レンズの光源側焦点距離に等しい同軸落射型顕微蛍光観測装置が提供される。   That is, according to the present invention, an excitation light source that generates laser light, a pinhole forming portion in which an opening is formed, a laser condensing lens having a first optical axis, and a folded reflecting portion having a reflecting surface, A coaxial epi-illumination microscopic fluorescence observation apparatus including an objective lens having a second optical axis, wherein the opening is on the first optical axis and between the excitation light source and the laser condenser lens. The reflecting surface includes an intersection of the first optical axis and the second optical axis, and a distance between the object-side principal point of the laser condenser lens and the intersection is a distance of the laser condenser lens A coaxial epi-illumination type microscopic fluorescence observation device is provided which is equal to the object-side focal length and whose distance between the light source side principal point of the objective lens and the intersection is equal to the light source side focal length of the objective lens.

本発明においては、前記開口部と前記第１の光軸の交点と前記レーザー集光レンズの光源側主点の離間距離を前記レーザー集光レンズの光源側焦点距離に等しくすることができ、さらに、前記対物レンズの物体側主点と前記レーザー光の照射表面の離間距離を前記対物レンズの物体側焦点距離に等しくすることができる。   In the present invention, the separation distance between the intersection of the opening and the first optical axis and the light source side principal point of the laser condenser lens can be made equal to the light source side focal length of the laser condenser lens, The distance between the object side principal point of the objective lens and the surface irradiated with the laser light can be made equal to the object side focal length of the objective lens.

また、本発明においては、前記励起光源と前記ピンホール形成部と間にさらにビームエクスパンダを備えることができ、さらに２以上の前記励起光源と前記ピンホール形成部と間にさらにレーザー切替光学系を備えることができる。   In the present invention, a beam expander can be further provided between the excitation light source and the pinhole forming unit, and a laser switching optical system is further provided between the two or more excitation light sources and the pinhole forming unit. Can be provided.

上述したように、本発明によれば、励起光照射光学系と観測光学系がその光軸を共有しながら、励起光ならびに観測光の光量損失が低減された同軸落射型顕微蛍光観測装置が提供される。   As described above, according to the present invention, there is provided a coaxial epi-illumination type microscopic fluorescence observation apparatus in which the excitation light irradiation optical system and the observation optical system share the optical axis, and the light loss of the excitation light and the observation light is reduced. Is done.

以下、本発明を図面に示した実施の形態をもって説明するが、本発明は、図面に示した実施の形態に限定されるものではない。図１は、本発明の顕微蛍光観測光学系を含む顕微蛍光観測装置１０を示す図である。本発明の顕微蛍光観測装置１０は、同軸落射照明を採用するものであり、励起光照射光学系と観測光学系とを含んで構成される。   Hereinafter, the present invention will be described with reference to embodiments shown in the drawings, but the present invention is not limited to the embodiments shown in the drawings. FIG. 1 is a diagram showing a microscopic fluorescence observation apparatus 10 including a microscopic fluorescence observation optical system of the present invention. The microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention employs coaxial epi-illumination and includes an excitation light irradiation optical system and an observation optical system.

本発明の顕微蛍光観測装置１０における励起光照射光学系は、光源としてのレーザー装置１２、ピンホール形成部１４、レーザー集光レンズ１６、折り返し反射部１８、対物レンズ２０を含んで構成されている。光源としてのレーザー装置は、検査対象が含有する蛍光物質の吸収バンドに合致した波長のレーザー光を発生させるものであれば、固体レーザー、気体レーザー、半導体レーザーなど公知のレーザー装置を用いることができる。また、図１に示すように、たとえば、Ｈｅ−Ｎｅレーザー１２aとＹＡＧレーザー１２ｂとを同光軸上に配置し、両レーザー装置の間にレーザー切替光学系２２を配置することによって、検査対象によって２種類以上のレーザー光を切替え可能に構成することもできる。なお、レーザー装置１２から発生したレーザー光は、ビームエクスパンダ２４によってそのビーム径を増大させることができ、照射したいサンプルの面積に関連して適宜その倍率を選択することができる。   The excitation light irradiation optical system in the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention includes a laser device 12 as a light source, a pinhole forming unit 14, a laser condensing lens 16, a folding reflection unit 18, and an objective lens 20. . As the laser device as the light source, a known laser device such as a solid-state laser, a gas laser, or a semiconductor laser can be used as long as it generates laser light having a wavelength that matches the absorption band of the fluorescent substance contained in the inspection target. . Further, as shown in FIG. 1, for example, a He-Ne laser 12a and a YAG laser 12b are arranged on the same optical axis, and a laser switching optical system 22 is arranged between the two laser devices, thereby depending on the inspection object. Two or more kinds of laser beams can be switched. The beam diameter of the laser beam generated from the laser device 12 can be increased by the beam expander 24, and the magnification can be appropriately selected in relation to the area of the sample to be irradiated.

レーザー装置１２から発生し、ビームエクスパンダ２４によってそのビーム径が増大されたレーザー光は、ピンホール形成部１４に形成された開口部Ｐを通過する際、開口部Ｐの形状と同じ形状の断面を有する光束に調整される。励起光照射光学系におけるピンホール形成部１４のさらに物体側には、Ｋ１を光軸とするレーザー集光レンズ１６が配設され、またそのさらに物体側には光軸Ｋ１と直交する軸を光軸Ｋ２として対物レンズ２０が配設されている。なお、本発明の励起光照射光学系においては、レーザー集光レンズ１６と対物レンズ２０との間に折り返し反射部１８が配設されており、折り返し反射部１８の後述する反射面が光軸Ｋ１と光軸Ｋ２の交点Ｘを含むように構成されている。   The laser beam generated from the laser device 12 and whose beam diameter is increased by the beam expander 24 passes through the opening P formed in the pinhole forming portion 14 and has a cross section having the same shape as the shape of the opening P. Is adjusted to a luminous flux having A laser condensing lens 16 having K1 as an optical axis is disposed further on the object side of the pinhole forming unit 14 in the excitation light irradiation optical system, and an axis orthogonal to the optical axis K1 is further lighted on the object side. An objective lens 20 is disposed as the axis K2. In the excitation light irradiating optical system of the present invention, a folded reflection portion 18 is disposed between the laser condenser lens 16 and the objective lens 20, and a later-described reflective surface of the folded reflection portion 18 has an optical axis K1. And an intersection X of the optical axis K2.

本発明の励起光照射光学系におけるレーザー集光レンズ１６および対物レンズ２０は、充分に離れた波長、たとえば青と赤の波長領域における色収差が最小限に抑制されたレンズを用いることが好ましい。すなわち、使用する励起光の波長領域にわたって焦点距離の変化を最小限に抑えるように設計されたレンズを用いることが好ましく、さらに、球面収差を最小限に抑えるように設計されたレンズを用いることが好ましい。本発明におけるレンズ系としては、アクロマティックレンズを用いることができる。   As the laser condensing lens 16 and the objective lens 20 in the excitation light irradiation optical system of the present invention, it is preferable to use a lens in which chromatic aberration in a sufficiently separated wavelength, for example, a blue and red wavelength region is suppressed to a minimum. That is, it is preferable to use a lens designed to minimize the change in focal length over the wavelength range of the excitation light to be used, and further to use a lens designed to minimize spherical aberration. preferable. An achromatic lens can be used as the lens system in the present invention.

本発明の顕微蛍光観測装置１０における観測光学系は、対物レンズ２０、干渉フィルター２６、結像レンズ２８、およびＣＣＤ素子などを備える撮像系３０を含んで構成されている。対物レンズ２０と結像レンズ２８は、光軸Ｋ２を共通の光軸としており、対物レンズ２０と結像レンズ２８との間には、干渉フィルター２６が配設されている。本発明においては、干渉フィルター２６を２以上含んで構成することができ、検査対象によって手動または自動にて差替え可能に構成することができる。サンプル３２から発光した蛍光を含む光は、対物レンズ２０を透過し、干渉フィルター２６によって所望の波長成分のみが選択的に透過された後、結像レンズ２８によって集光され撮像系３０において蛍光像が結像するように構成されている。なお、本発明の顕微蛍光観測装置１０は、さらに、ＬＥＤなどによって形成された補助照明３４を設けることができ、また、サンプル３２が固定される手動あるいは電動のＸＹＺ移動ステージを設けることもできる。本発明の顕微蛍光観測装置１０は、上述した光学系の構成を採用することによって、同軸落射照明方式を採用しながらも光量損失を最大限に防止する。以下、その機構を詳細に説明する。   The observation optical system in the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention includes an imaging system 30 including an objective lens 20, an interference filter 26, an imaging lens 28, a CCD element, and the like. The objective lens 20 and the imaging lens 28 have an optical axis K2 as a common optical axis, and an interference filter 26 is disposed between the objective lens 20 and the imaging lens 28. In the present invention, two or more interference filters 26 can be included, and can be configured to be replaced manually or automatically depending on the inspection object. Light including fluorescence emitted from the sample 32 is transmitted through the objective lens 20, and only a desired wavelength component is selectively transmitted by the interference filter 26, and then condensed by the imaging lens 28, and is captured by the imaging system 30. Is configured to form an image. The microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention can further be provided with an auxiliary illumination 34 formed by LEDs or the like, and can be provided with a manual or electric XYZ moving stage to which the sample 32 is fixed. The microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention employs the above-described configuration of the optical system, thereby preventing light loss to the maximum while adopting the coaxial epi-illumination method. Hereinafter, the mechanism will be described in detail.

図２は、本発明の顕微蛍光観測装置１０の励起光照射光学系の一部を拡大して示す図である。上述したように、ピンホール形成部１４に形成された開口部Ｐによって、開口部Ｐの形状と同じ形状の断面を有する光束幅に調整されたレーザー光Ｌは、レーザー集光レンズ１６に入射する。レーザー集光レンズ１６は、上述したようにレーザー光Ｌと光軸Ｋ１を共有するものであり、光軸Ｋ１は、対物レンズ２０の光軸Ｋ２と交点Ｘにおいて直交する。   FIG. 2 is an enlarged view showing a part of the excitation light irradiation optical system of the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention. As described above, the laser light L adjusted to have a light beam width having a cross section having the same shape as the shape of the opening P by the opening P formed in the pinhole forming portion 14 enters the laser condenser lens 16. . The laser condensing lens 16 shares the laser beam L and the optical axis K1 as described above, and the optical axis K1 is orthogonal to the optical axis K2 of the objective lens 20 at the intersection point X.

本発明の励起光照射光学系において、レーザー集光レンズ１６の図示しない物体側主点から交点Ｘまでの離間距離が、レーザー集光レンズ１６の物体側焦点距離ｆ２と等しくなるように配置されており、さらに、対物レンズ２０は、対物レンズ２０の図示しない光源側主点から交点Ｘまでの離間距離が、対物レンズ２０の光源側焦点距離ｆ３と等しくなるように配置されている。なお、レーザー光Ｌは、ほとんど平行光線であるが、厳密にはわずかに発散光になっているため、本発明においては、レーザー集光レンズ１６は、ピンホール形成部１４の開口部Ｐと光軸Ｋ１との交点Ｙからレーザー集光レンズ１６の図示しない光源側主点までの離間距離が、レーザー集光レンズ１６の光源側焦点距離ｆ１と等しくなるように配置することが好ましい。このように配置することによって、ピンホール形成部１４に形成された開口部Ｐの像を、サンプル３２の被照射表面において鮮明に結像させることが可能になり、サンプル３２の被照射表面に均一な密度のレーザー光Ｌを照射することが可能になる。 In the excitation light irradiation optical system of the present invention, the laser condensing lens 16 is arranged such that the distance from the object-side principal point (not shown) to the intersection X is equal to the object-side focal length f 2 of the laser condensing lens 16. and, further, the objective lens 20, the distance from the light source side principal point (not shown) of the objective lens 20 to the intersection point X is positioned to be equal to the source-side focal length f 3 of the objective lens 20. Although the laser light L is almost a parallel light beam, strictly speaking, it is slightly divergent light. Therefore, in the present invention, the laser condensing lens 16 is formed by the light beam and the opening P of the pinhole forming portion 14. distance from the intersection Y of the shaft K1 to the light source side principal point (not shown) of the laser focusing lens 16 is preferably disposed so as to be equal to the source-side focal length f 1 of the laser condenser lens 16. By arranging in this way, the image of the opening P formed in the pinhole forming part 14 can be clearly formed on the irradiated surface of the sample 32, and uniform on the irradiated surface of the sample 32. It becomes possible to irradiate laser beam L with a high density.

さらに、本発明においては、サンプル３２を、対物レンズ２０の図示しない物体側主点からサンプル３２の被照射表面までの離間距離が、対物レンズ２０の物体側焦点距離ｆ４と等しくなるように配置することが好ましい。このように配置することによって、対物レンズ２０と図示しない結像レンズとの間を平行光線とすることが可能になり、観測光学系の構成の単純化を図ることができる。 Furthermore, in the present invention, the sample 32 is arranged such that the distance from the object side principal point (not shown) of the objective lens 20 to the irradiated surface of the sample 32 is equal to the object side focal length f 4 of the objective lens 20. It is preferable to do. By arranging in this way, it becomes possible to make parallel light between the objective lens 20 and an imaging lens (not shown), and the configuration of the observation optical system can be simplified.

加えて、本発明の励起光照射光学系は、レーザー集光レンズ１６と対物レンズ２０との間に折り返し反射部１８を含んで構成される。折り返し反射部１８は、支持体１８ａに固着された反射ロッド１８ｂから構成されており、反射ロッド１８ｂの端面は、反射率の高いミラーなどによって反射面Ｔとして形成され、反射面Ｔが光軸Ｋ１に対して４５°の角度をもって傾斜している。本発明においては、折り返し反射部１８は、光軸Ｋ２が、反射ロッド１８ｂの反射面と光軸Ｋ１との交点Ｘを通って、光軸Ｋ１と直交するように位置決めされ固定される。   In addition, the excitation light irradiation optical system of the present invention is configured to include a folded reflection portion 18 between the laser condenser lens 16 and the objective lens 20. The folded reflecting portion 18 is composed of a reflecting rod 18b fixed to a support 18a. The end surface of the reflecting rod 18b is formed as a reflecting surface T by a mirror having a high reflectivity, and the reflecting surface T is an optical axis K1. It is inclined at an angle of 45 ° to the angle. In the present invention, the folded reflecting portion 18 is positioned and fixed so that the optical axis K2 passes through the intersection X between the reflecting surface of the reflecting rod 18b and the optical axis K1 and is orthogonal to the optical axis K1.

なお、本発明においては、光軸Ｋ１、光軸Ｋ２、および反射面Ｔの位置構成は、上述した構成に限定されるものではなく、反射面Ｔが光軸Ｋ１と光軸Ｋ２の交点Ｘを含み、かつ、交点Ｘを通る反射面Ｔの垂線が光軸Ｋ１と光軸Ｋ２によって形成される角の二等分線となるように構成されるものであればよい。すなわち、本発明においては、光軸Ｋ１に沿って反射面Ｔに入射した光線が光軸Ｋ２に沿って反射される光学構成を適宜設計することができる。   In the present invention, the positional configuration of the optical axis K1, the optical axis K2, and the reflecting surface T is not limited to the above-described configuration, and the reflecting surface T defines the intersection point X between the optical axis K1 and the optical axis K2. It is only necessary that the perpendicular line of the reflection surface T including the intersection point X is a bisector of an angle formed by the optical axis K1 and the optical axis K2. That is, in the present invention, it is possible to appropriately design an optical configuration in which light rays incident on the reflecting surface T along the optical axis K1 are reflected along the optical axis K2.

本発明の顕微蛍光観測装置１０においては、図示しないレーザー装置から図示しないビームエクスパンダを経てビーム径が拡大されたレーザー光Ｌは、光軸Ｋ１に対し垂直に設置されたピンホール形成部１４に向けて照射される。レーザー光Ｌの一部は、ピンホール形成部１４に形成された開口部Ｐを通過し、開口部Ｐの形状と同じ形状の断面を有する光束となってレーザー集光レンズ１６に入射する。その後、平行光線であるレーザー光Ｌは、レーザー集光レンズ１６によってレーザー集光レンズ１６の物体側焦点、すなわち交点Ｘに集光される。上述したように、交点Ｘは、反射ロッド１８ｂの端面に形成されたミラーである反射面Ｔに位置するため、交点Ｘに集光されたレーザー光Ｌは、反射ロッド１８ｂの反射面Ｔにおいて全反射して光路を９０°変更して対物レンズ２０に入射する。レーザー光Ｌは、対物レンズ２０によって再び集光されＫ２を光軸とする平行光線の光束となってサンプル３２に照射される。上述した機構においては、光源から発せられた励起光がサンプル３２に到達するまでの過程において、反射ロッド１８ｂの反射面Ｔにおける乱反射等に起因する損失以外に励起光の光量を損失することがなく、所定のスポット範囲ＳＡは、高密度のレーザー光Ｌによって均一に照射されることが可能となる。   In the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention, the laser beam L whose beam diameter has been expanded from a laser device (not shown) through a beam expander (not shown) is applied to the pinhole forming unit 14 installed perpendicular to the optical axis K1. Irradiated toward. A part of the laser light L passes through the opening P formed in the pinhole forming part 14 and enters the laser condenser lens 16 as a light beam having a cross section having the same shape as the shape of the opening P. Thereafter, the laser light L which is a parallel light beam is condensed by the laser condenser lens 16 on the object side focal point of the laser condenser lens 16, that is, the intersection point X. As described above, since the intersection point X is located on the reflection surface T that is a mirror formed on the end face of the reflection rod 18b, the laser light L condensed at the intersection point X is totally reflected on the reflection surface T of the reflection rod 18b. The light is reflected and the optical path is changed by 90 ° to enter the objective lens 20. The laser light L is condensed again by the objective lens 20 and is irradiated onto the sample 32 as a parallel light beam having K2 as an optical axis. In the mechanism described above, in the process until the excitation light emitted from the light source reaches the sample 32, the light amount of the excitation light is not lost other than the loss due to irregular reflection or the like on the reflection surface T of the reflection rod 18b. The predetermined spot range SA can be uniformly irradiated by the high-density laser beam L.

本発明の顕微蛍光観測装置１０において、励起光は照射されるスポット範囲ＳＡの面積と開口領域ＰＡの面積との関係は、下記式に示す関係にあり、スポット範囲ＳＡの面積は、開口部Ｐの開口領域ＰＡの面積を調整することによって適宜設定することができる。下記式中、ｆ１は、レーザー集光レンズ１６の光源側焦点距離を示し、ｆ４は、対物レンズ２０の物体側焦点距離を示す。本発明の顕微蛍光観測装置１０における像倍率は、ｆ４／ｆ１であり、スポット範囲ＳＡと開口領域ＰＡの面積比は、像倍率の二乗となる。 In the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention, the relationship between the area of the spot range SA irradiated with the excitation light and the area of the opening region PA is as shown in the following equation, and the area of the spot range SA is the opening P It can be set as appropriate by adjusting the area of the opening area PA. In the following formulas, f 1 denotes a light source side focal length of the laser condenser lens 16, f 4 represents the object-side focal distance of the objective lens 20. The image magnification in the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention is f 4 / f 1 , and the area ratio between the spot area SA and the opening area PA is the square of the image magnification.

Figure 2007271529
Figure 2007271529

図３は、本発明の顕微蛍光観測装置１０の観測光学系の一部を拡大して示す図である。上述した励起光照射光学系によってレーザー光Ｌを均一に照射されたサンプル３２は、励起した後、蛍光ＦＬを発光する。蛍光ＦＬは、対物レンズ２０を透過した後、図示しない結像レンズによって集光され、図示しない撮像系にサンプル３２の蛍光像を結像する。本発明においては、対物レンズ２０と結像レンズとの間の光軸Ｋ２上に、折り返し反射部１８が設置されている。折り返し反射部１８の支持体１８ａは、フリントガラスなどに代表される透過性が高く、屈折率の低い材質によって形成されており、蛍光ＦＬの大部分は、支持体１８ａを透過して結像レンズ２８に入射することができる。一方、支持体１８ａには反射面Ｔが形成された反射ロッド１８ｂが固着されており、その反射面Ｔが光軸Ｋ２に対し４５°の角度をもって傾斜するように配置されているため、蛍光ＦＬの一部は、矢印ｆｌが示すように反射ロッド１８ｂによって光路を変更される結果、観測光学系は、観測光の光量の一部を損失する。すなわち、本発明の観測光学系においては、蛍光ＦＬの光路上に存在する反射ロッド１８ｂに起因する光量損失が発生する。   FIG. 3 is an enlarged view showing a part of the observation optical system of the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention. The sample 32 irradiated uniformly with the laser light L by the excitation light irradiation optical system described above emits fluorescence FL after being excited. The fluorescent light FL is transmitted through the objective lens 20 and then condensed by an imaging lens (not shown) to form a fluorescent image of the sample 32 on an imaging system (not shown). In the present invention, the folding reflection portion 18 is installed on the optical axis K2 between the objective lens 20 and the imaging lens. The support 18a of the folded reflection portion 18 is made of a material having high transmissivity represented by flint glass or the like and a low refractive index, and most of the fluorescent light FL is transmitted through the support 18a to form an imaging lens. 28 can be incident. On the other hand, a reflecting rod 18b having a reflecting surface T is fixed to the support 18a, and the reflecting surface T is disposed so as to be inclined at an angle of 45 ° with respect to the optical axis K2. As a result, the observation optical system loses a part of the light amount of the observation light. That is, in the observation optical system of the present invention, a light amount loss caused by the reflecting rod 18b existing on the optical path of the fluorescence FL occurs.

しかしながら、本発明の顕微蛍光観測装置１０においては、その励起光に指向性が高く波長の揃った単色性のレーザー光Ｌを採用しており、さらにそのレンズ系は、球面収差が最小限に抑制されているため、上述した交点Ｘにおいて、レーザー光Ｌを非常に小さい回析限界となるサイズまでに集光することができる。したがって、反射面Ｔについても非常に小さく設計することが可能となり、反射面Ｔの表面積について最適化を図ることにより反射ロッド１８ｂに起因する観測光の光量損失を低減することができる。本発明においては、観測光の光量損失を１０％以下に低減することが可能となる。   However, in the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention, monochromatic laser light L with high directivity and uniform wavelength is used for the excitation light, and the lens system suppresses spherical aberration to the minimum. Therefore, the laser beam L can be condensed to a size that is a very small diffraction limit at the intersection point X described above. Therefore, it is possible to design the reflection surface T to be very small, and by optimizing the surface area of the reflection surface T, it is possible to reduce the light amount loss of the observation light caused by the reflection rod 18b. In the present invention, it is possible to reduce the light loss of the observation light to 10% or less.

上述したように、本発明の顕微蛍光観測装置１０の光学系全体における光量損失は、反射ロッド１８ｂに起因する光量損失に限定されるため、従来のハーフミラーを用いた同軸落射顕微鏡に比較すると、光量損失が好適に低減される。   As described above, the light quantity loss in the entire optical system of the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention is limited to the light quantity loss caused by the reflecting rod 18b, and therefore, compared with a coaxial episcopic microscope using a conventional half mirror, The light loss is suitably reduced.

図４は、本発明の顕微蛍光観測装置１０の光学系における光路図を示す。なお、説明の便宜のため、図４（ａ）は、励起光照射光学系におけるレーザー光Ｌの光路のみを示し、図４（ｂ）は、観測光学系における蛍光ＦＬの光路のみを示す。図４（ａ）に示されるように、ピンホール形成部１４の開口部Ｐを通過したレーザー光Ｌは、Ｋ１を光軸とする所定の断面積を有する光束となってレーザー集光レンズ１６に入射した後、交点Ｘに集光する。交点Ｘに集光したレーザー光Ｌは、折り返し反射部１８の反射ロッド１８ｂの端面に形成された図示しない反射ミラーによって光路を９０°変更されて拡散し、対物レンズ２０に入射する。レーザー光Ｌは、対物レンズ２０によって集光されて再びＫ２を光軸とする平行光線となり、サンプル３２を照射する。   FIG. 4 shows an optical path diagram in the optical system of the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention. For convenience of explanation, FIG. 4A shows only the optical path of laser light L in the excitation light irradiation optical system, and FIG. 4B shows only the optical path of fluorescence FL in the observation optical system. As shown in FIG. 4A, the laser light L that has passed through the opening P of the pinhole forming portion 14 becomes a light beam having a predetermined cross-sectional area with K1 as the optical axis, and is applied to the laser condenser lens 16. After entering, the light is condensed at the intersection point X. The laser light L condensed at the intersection point X is diffused by changing its optical path by 90 ° by a reflection mirror (not shown) formed on the end face of the reflection rod 18 b of the folded reflection portion 18 and enters the objective lens 20. The laser beam L is condensed by the objective lens 20 and becomes a parallel beam having the optical axis K2 again, and irradiates the sample 32.

図４（ｂ）に示されるように、サンプル３２から発光された蛍光ＦＬは、対物レンズ２０を透過したのち、折り返し反射部１８の透過性の支持体１８ａを透過し、干渉フィルター２６によって所望の波長成分のみが選択的に透過された後、結像レンズ２８によって集光され、撮像系３０の撮像素子３１に蛍光像を結像する。   As shown in FIG. 4B, the fluorescent light FL emitted from the sample 32 passes through the objective lens 20 and then passes through the transparent support 18a of the folded reflection portion 18 and is transmitted by the interference filter 26 as desired. After only the wavelength component is selectively transmitted, it is condensed by the imaging lens 28 and forms a fluorescent image on the imaging device 31 of the imaging system 30.

以下、本発明の顕微蛍光観測装置１０について、実施例を用いてより具体的に説明を行なうが、本発明は、後述する実施例に限定されるものではない。図５は、３ｍｍ×３ｍｍのサンプル３２を、８ｍｍ×８ｍｍの受光面を備える撮像素子３１によって撮像する場合、すなわち、本発明の顕微蛍光観測装置１０において、観測系像倍率が２．５倍の光学設計を示す図である。図５に示す顕微蛍光観測装置１０においては、上述したのと共通する構成については同じ符合を付す。顕微蛍光観測装置１０を構成する各部材のスペックについては下記表に示す。   Hereinafter, the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention will be described more specifically using examples, but the present invention is not limited to the examples described later. FIG. 5 shows a case where a sample 32 of 3 mm × 3 mm is imaged by an image sensor 31 having a light receiving surface of 8 mm × 8 mm, that is, in the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention, the observation system image magnification is 2.5 times. It is a figure which shows an optical design. In the microscopic fluorescence observation apparatus 10 shown in FIG. 5, the same reference numerals are given to the configurations common to those described above. The specifications of each member constituting the microscopic fluorescence observation apparatus 10 are shown in the following table.

Figure 2007271529
Figure 2007271529

以上、説明したように、本発明によれば、励起光照射光学系と観測光学系がその光軸を共有しながら、励起光ならびに観測光の光量損失が低減された同軸落射型顕微蛍光観測装置が提供される。本発明の顕微蛍光観測装置１０においては、従来型に比べて観測光の光量の増加が見込まれるため、ＤＮＡチップなどに代表される蛍光発光性のサンプルを充分な鮮明度をもって撮像することが可能になり、種々の解析精度の向上に資することが期待される。   As described above, according to the present invention, the coaxial epi-illumination micro-fluorescence observation apparatus in which the excitation light irradiation optical system and the observation optical system share the optical axis, and the light loss of the excitation light and the observation light is reduced. Is provided. In the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of the present invention, since the amount of observation light is expected to increase as compared with the conventional type, it is possible to image a fluorescent sample represented by a DNA chip or the like with sufficient definition. Therefore, it is expected to contribute to improvement of various analysis accuracy.

本発明の顕微蛍光観測装置１０を示す図。The figure which shows the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of this invention. 本発明の顕微蛍光観測装置１０の励起光照射光学系の一部を拡大して示す図。The figure which expands and shows a part of excitation light irradiation optical system of the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of this invention. 本発明の顕微蛍光観測装置１０の観測光学系の一部を拡大して示す図。The figure which expands and shows a part of observation optical system of the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of this invention. 本発明の顕微蛍光観測装置１０の光学系における光路図を示す図。The figure which shows the optical path figure in the optical system of the microscopic fluorescence observation apparatus 10 of this invention. 本発明の顕微蛍光観測装置１０において、観測系像倍率が２．５倍の光学設計を示す図。The figure which shows the optical design whose observation system image magnification is 2.5 times in the micro fluorescence observation apparatus 10 of this invention. 一般的な同軸落射顕微鏡５０の光学系を概略的に示す図。The figure which shows schematically the optical system of the common coaxial incident microscope 50.

符号の説明Explanation of symbols

１０…顕微蛍光観測装置、１２…レーザー装置、１４…ピンホール形成部、１６…集光レンズ、１８…折り返し反射部、１８ａ…支持体、１８ｂ…反射ロッド、２０…対物レンズ、２２…レーザー切替光学系、２４…ビームエクスパンダ、２６…干渉フィルター、２８…結像レンズ、３０…撮像系、３１…撮像素子、３２…サンプル、３４…補助照明、５０…同軸落射顕微鏡、５２…光源、５４…照明レンズ、５６…ハーフミラー、５８…対物レンズ、６０…サンプル、６２…結像レンズ、６４…撮像系
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Microscopic fluorescence observation apparatus, 12 ... Laser apparatus, 14 ... Pinhole formation part, 16 ... Condensing lens, 18 ... Folding reflection part, 18a ... Supporting body, 18b ... Reflecting rod, 20 ... Objective lens, 22 ... Laser switching Optical system 24 ... Beam expander 26 ... Interference filter 28 ... Imaging lens 30 ... Imaging system 31 ... Imaging device 32 ... Sample 34 ... Auxiliary illumination 50 ... Coaxial episcopic microscope 52 ... Light source 54 ... illumination lens, 56 ... half mirror, 58 ... objective lens, 60 ... sample, 62 ... imaging lens, 64 ... imaging system

Claims (5)

レーザー光を発生する励起光源と、開口部が形成されたピンホール形成部と、第１の光軸を有するレーザー集光レンズと、反射面を有する折り返し反射部と、第２の光軸を有する対物レンズとを含む同軸落射型顕微蛍光観測装置であって、
前記開口部が前記第１の光軸上であって前記励起光源と前記レーザー集光レンズとの間に配置され、
前記反射面が前記第１の光軸と前記第２の光軸の交点を含み、
前記レーザー集光レンズの物体側主点と前記交点の離間距離が、前記レーザー集光レンズの物体側焦点距離に等しく、
前記対物レンズの光源側主点と前記交点の離間距離が前記対物レンズの光源側焦点距離に等しい
同軸落射型顕微蛍光観測装置。 An excitation light source that generates laser light, a pinhole forming part in which an opening is formed, a laser condensing lens having a first optical axis, a folded reflection part having a reflecting surface, and a second optical axis A coaxial epi-fluorescence observation apparatus including an objective lens,
The opening is disposed on the first optical axis and between the excitation light source and the laser condenser lens;
The reflecting surface includes an intersection of the first optical axis and the second optical axis;
The distance between the object-side principal point of the laser condenser lens and the intersection is equal to the object-side focal length of the laser condenser lens,
A coaxial epi-illumination type microscopic fluorescence observation apparatus in which the distance between the principal point on the light source side of the objective lens and the intersection is equal to the focal length on the light source side of the objective lens. 前記開口部と前記第１の光軸の交点と前記レーザー集光レンズの光源側主点の離間距離が、前記レーザー集光レンズの光源側焦点距離に等しい、
請求項１に記載の同軸落射型顕微蛍光観測装置。 The distance between the intersection of the opening and the first optical axis and the light source side principal point of the laser condenser lens is equal to the light source side focal length of the laser condenser lens,
The coaxial epifluorescence observation apparatus according to claim 1. 前記対物レンズの物体側主点と前記レーザー光の照射表面の離間距離が、前記対物レンズの物体側焦点距離に等しい、
請求項１または２のいずれか１項に記載の同軸落射型顕微蛍光観測装置。 The distance between the object side principal point of the objective lens and the irradiation surface of the laser light is equal to the object side focal length of the objective lens,
The coaxial epi-illumination microscopic fluorescence observation apparatus according to any one of claims 1 and 2. 前記励起光源と前記ピンホール形成部との間にさらにビームエクスパンダを備える、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の同軸落射型顕微蛍光観測装置。 A beam expander is further provided between the excitation light source and the pinhole forming unit.
The coaxial epi-illumination microscopic fluorescence observation apparatus according to any one of claims 1 to 3. ２以上の前記励起光源と前記ピンホール形成部と間にさらにレーザー切替光学系を備える、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の同軸落射型顕微蛍光観測装置。
A laser switching optical system is further provided between the two or more excitation light sources and the pinhole forming unit;
The coaxial epi-illumination microscopic fluorescence observation apparatus according to any one of claims 1 to 4.
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