JP2007261999A - Hypotensive peptide derived from royal jelly - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ローヤルゼリー由来の蛋白分解物及びその製造方法並びに、該蛋白分解物を含む食品、経口摂取用製剤に関する。本発明の蛋白分解物は、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、高血圧の予防ないし治療に有効である。 The present invention relates to a royal jelly-derived protein degradation product, a method for producing the same, a food containing the protein degradation product, and a preparation for oral consumption. The proteolysate of the present invention has an angiotensin converting enzyme inhibitory action and is effective for the prevention or treatment of hypertension.
高血圧症は、自覚症状が無く、放置すると心臓病、脳血管障害といった重大な疾患を二次的に引き起こす疾病であり、高血圧症の治療および予防が大きな課題となっている。高血圧症にはアンジオテンシン変換酵素（Angiotensin Converting Enzyme 、以下ＡＣＥという）が深く関与することが知られており、ＡＣＥを阻害することにより高血圧を予防ないし治療することが可能である。 Hypertension is a disease that has no subjective symptoms and, if left untreated, causes secondary diseases such as heart disease and cerebrovascular disorder, and the treatment and prevention of hypertension is a major issue. It is known that angiotensin converting enzyme (hereinafter referred to as ACE) is deeply involved in hypertension, and hypertension can be prevented or treated by inhibiting ACE.
一方、高血圧の予防ないし治療のための医薬品は長期間摂取することが必要となるため、副作用が極めて低いことが重要な要素となっている。予防医学的な健康管理の考え方が普及してきた現在、副作用の心配のない高血圧を予防する食品の開発が求められている。 On the other hand, since it is necessary to take medicines for the prevention or treatment of hypertension for a long period of time, it is an important factor that the side effects are extremely low. Now that the concept of preventive medical health management has become widespread, there is a need to develop foods that prevent high blood pressure without worrying about side effects.
ローヤルゼリーは、ミツバチが女王蜂を育てるために頭部の下咽頭腺と大腮腺から分泌した乳白色のゼリー状の物質で、人の食品としての摂取歴は長く、滋養、強壮、体質改善等の広範な作用があるといわれている。そのタンパク質の酵素分解物について研究され、ＡＣＥ阻害活性を有するローヤルゼリー由来のペプチドも知られている（特許文献１〜３、非特許文献１〜６）。 Royal jelly is a milky white jelly-like substance secreted from the hypopharyngeal gland and the greater vagina of the head to raise queen bees, and has a long history of human consumption as a food. It is said to have an effect. Studies have been made on enzymatic degradation products of the proteins, and royal jelly-derived peptides having ACE inhibitory activity are also known (Patent Documents 1 to 3, Non-Patent Documents 1 to 6).
しかしながら、これらのペプチドはローヤルゼリー素材の加水分解により得られる量とＡＣＥ阻害活性の強さ、即効性、副作用、作用の持続時間、摂取する形状、保存安定性のバランスの観点から、工業化に向けて改善の余地があった。 However, these peptides are for industrialization from the viewpoint of the balance of the amount obtained by hydrolysis of royal jelly material and the strength of ACE inhibitory activity, immediate effect, side effect, duration of action, ingested form, and storage stability. There was room for improvement.
特許文献4は、ローヤルゼリー由来のＡＣＥ阻害ペプチドを開示しているが、さらに強力なＡＣＥ阻害活性を有するペプチドが求められていた。
本発明は、副作用がなく、高血圧の予防作用を有する蛋白分解物、その製造方法、該蛋白分解物を含む食品及び経口摂取用製剤を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a proteolytic product having no side effects and having an effect of preventing hypertension, a method for producing the same, a food containing the proteolytic product, and a preparation for oral consumption.
本発明はまた、即効性、効果の持続性及び保存安定性を有するＡＣＥ阻害物質、該阻害物質を含む高血圧の予防ないし治療剤を提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide an ACE inhibitor having immediate effect, sustained effect, and storage stability, and a prophylactic or therapeutic agent for hypertension containing the inhibitor.
本発明者は、上記課題に鑑み検討を重ねた結果、生ローヤルゼリー、乾燥ローヤルゼリーをエタノール処理した変性タンパク質などのローヤルゼリー素材を蛋白分解酵素、例えばトリプシンで加水分解することにより、高血圧を予防することが可能な蛋白分解物が得られることを見出した。
また、本発明の蛋白分解物（単離された4種のペプチドを含む、以下同じ）は強力なＡＣＥ阻害作用を有するが、ＡＣＥ阻害作用から予想されるよりも強力な高血圧の予防または治療作用を有しており、その作用の一部は降圧作用を有するブラジキニンの分解抑制作用に基づくものと推測される。
As a result of repeated investigations in view of the above problems, the present inventor can prevent hypertension by hydrolyzing a royal jelly material such as raw royal jelly, denatured protein obtained by ethanol treatment of dried royal jelly with a proteolytic enzyme such as trypsin. It has been found that possible proteolytic products can be obtained.
In addition, the proteolysate of the present invention (including 4 isolated peptides, the same applies hereinafter) has a strong ACE inhibitory action, but has a stronger preventive or therapeutic action on hypertension than expected from the ACE inhibitory action. It is speculated that a part of the action is based on the action of inhibiting the degradation of bradykinin having an antihypertensive action.
該蛋白分解物は、アレルギー作用などの副作用が低く、ローヤルゼリー由来の安全な食品であり、正常高値或いは軽症高血圧などの血圧が高めのヒトに対し特に有用な降圧作用ないし高血圧予防作用を有しており、特定保健用食品などの食品として特に有用である。 The proteolytic product has low side effects such as allergic action, is a safe food derived from royal jelly, and has an antihypertensive action or antihypertensive action particularly useful for humans with high blood pressure such as normal high blood pressure or mild hypertension. It is particularly useful as a food product such as food for specified health use.
本発明の蛋白分解物を正常高値及び軽症高血圧のヒトに投与したところ、有意な血圧低下作用が確認され、しかも摂取終了後に血圧が緩やかに上昇し、摂取前値を超えるようなリバウンドはなく、脈拍、体重・BMI、血液検査、尿検査に異常はなく、空咳、皮膚症状、消化器症状などのローヤルゼリー分解物と因果関係があり得る副作用がなく、安全性の高いものであることが確認された。 When the proteolysate of the present invention was administered to a human with high normal and mild hypertension, a significant blood pressure lowering action was confirmed, and blood pressure increased slowly after the end of intake, there was no rebound exceeding the pre-intake value, No abnormalities in pulse rate, body weight / BMI, blood test, urinalysis, no side effects that may have causal relationship with royal jelly degradation products such as dry cough, skin symptoms, digestive symptoms, etc., confirmed to be highly safe It was.
本発明は、以下の発明を提供するものである。
１． ローヤルゼリー素材をトリプシンで処理してなるアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する蛋白分解物であって、以下の４種のペプチドの少なくとも１種を含む蛋白分解物：
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
２． ローヤルゼリー素材が、ローヤルゼリーのアルコール変性タンパク質である項１に記載の蛋白分解物。
３． ローヤルゼリー素材に由来する蛋白分解物であって、下記式
The present invention provides the following inventions.
1. A proteolytic product having an angiotensin converting enzyme inhibitory action obtained by treating a royal jelly material with trypsin, and comprising at least one of the following four peptides:
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe;
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr;
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr;
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg.
2. Item 2. The protein degradation product according to Item 1, wherein the royal jelly material is an alcohol-denatured protein of royal jelly.
3. Proteolysate derived from royal jelly material
で表されるＧｌｙを基準にしたときのＬｙｓの酵素分解後の残存率（モル比）が、ローヤルゼリー素材の７０％以下である蛋白分解物。
４． ローヤルゼリー素材に由来する蛋白分解物であって、下記式
A proteolysate having a residual ratio (molar ratio) after enzymatic degradation of Lys of 70% or less of the royal jelly material with respect to Gly represented by
4). Proteolysate derived from royal jelly material
で表されるＬｙｓを基準にしたときのＬｅｕの含有割合（モル比）が、ローヤルゼリー素材の１．３倍以上である蛋白分解物。
５． ローヤルゼリー素材に由来し(1)無機塩類および(2)酸性遊離アミノ酸、塩基性遊離アミノ酸、アルコール性水酸基を有する遊離アミノ酸、遊離Ａｌａおよび遊離Ｇｌｙからなる群から選ばれる少なくとも１種を実質的に含まない項３又は４に記載の蛋白分解物。
６． ローヤルゼリー素材に由来し、(1)無機塩類並びに(2)遊離酸性アミノ酸および遊離塩基性アミノ酸を実質的に含まない項５に記載の蛋白分解物。
７． ローヤルゼリー素材に由来し、(1)無機塩類並びに(2)酸性遊離アミノ酸（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）、塩基性遊離アミノ酸（Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ）、アルコール性水酸基を有する遊離アミノ酸（Ｔｈｒ，Ｓｅｒ）、遊離Ａｌａおよび遊離Ｇｌｙを実質的に含まない項６に記載の蛋白分解物。
８． 糖分の含有量が３５重量％以下であり、４０℃６ヶ月(アルミニウム袋)の加速試験条件下で実質的に変色しない項３〜５のいずれかに記載の蛋白分解物。
９． ゲル濾過カラムでの分析により分子量１００００以上の成分は実質的に認められず、分子量２００〜１５００程度の範囲に最大のピークを有し、分子量２００〜３００程度のシャープなピークを有する項３〜６のいずれかに記載の蛋白分解物。
１０． 平均分子量が７００〜６０００程度の範囲内にある項３〜６のいずれかに記載の蛋白分解物。
１１． 前記蛋白分解物を下記の特性を有するスチレン・ジビニルベンゼン共重合体のカラム（4.6mmφ×150mm）を通したとき、下記式で表される関与成分含量（％）が４０％以上である項１〜１０のいずれかに記載の蛋白分解物
・スチレン・ジビニルベンゼン共重合体の特性
粒度分布；30μm
細孔径；250Å
官能基；なし
適用pH範囲：全領域。
A proteolytic product in which the content ratio (molar ratio) of Leu is 1.3 times or more that of the royal jelly material, based on Lys represented by
5). It is derived from royal jelly material and substantially contains at least one selected from the group consisting of (1) inorganic salts and (2) acidic free amino acids, basic free amino acids, free amino acids having alcoholic hydroxyl groups, free Ala and free Gly Item 5. A proteolytic product according to item 3 or 4.
6). Item 6. The proteolysate according to Item 5, which is derived from a royal jelly material and contains substantially no (1) inorganic salts and (2) free acidic amino acids and free basic amino acids.
7). Derived from royal jelly material, (1) inorganic salts and (2) acidic free amino acids (Asp, Glu), basic free amino acids (Lys, His, Arg), free amino acids with alcoholic hydroxyl groups (Thr, Ser), free Item 7. The protein degradation product according to Item 6, which is substantially free of Ala and free Gly.
8). Item 6. The protein degradation product according to any one of Items 3 to 5, which has a sugar content of 35% by weight or less and does not substantially discolor under accelerated test conditions at 40 ° C. for 6 months (aluminum bag).
9. Item 3-6 having a maximum peak in the molecular weight range of about 200-1500 and a sharp peak of about 200-300 molecular weight, with substantially no component having a molecular weight of 10,000 or more by analysis with a gel filtration column. The protein degradation product in any one of.
10. Item 7. The protein degradation product according to any one of Items 3 to 6, wherein the average molecular weight is in the range of about 700 to 6000.
11. Item 1 wherein when the protein degradation product is passed through a column (4.6 mmφ × 150 mm) of a styrene / divinylbenzene copolymer having the following characteristics, the content (%) of the component concerned is represented by the following formula: -Proteolysate according to any one of 10 to 10 -Styrene / divinylbenzene copolymer properties Particle size distribution: 30 μm
Pore diameter: 250mm
Functional group; none Applicable pH range: Full range.
・関与成分含量（%）＝A1／AT×100
T1：トリプトファンの保持時間
T2：10-ハイドロキシ-δ-2-デセン酸の保持時間
A1：T1の溶出位置に検出されるピークの後ろから，T2の溶出位置に検出されるピークの前までのピーク面積の合計
AT：全てのピーク面積の合計。
１２． 前記関与成分含量が５８±５％である項１１に記載の蛋白分解物。
１３． 前記蛋白分解物を下記の特性を有するスチレン・ジビニルベンゼン共重合体のカラムを通し、水（フラクション１，２）、２０％メタノール（フラクション３）、４０％メタノール（フラクション４）、６０％メタノール（フラクション５）、８０％メタノール（フラクション６）、１００％メタノール（フラクション７）で溶出したときのフラクションのうち、フラクション３〜６を含む、項１〜１１のいずれかに記載の蛋白分解物：
粒度分布：＞250μm（250μmより大きい粒子径のものを90%以上含む）
細孔径：400Å
官能基：なし
適用pH範囲：全領域。
１４． フラクション４に
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；および
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
からなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチドを含み、フラクション５に、
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg
を含む、項１３に記載の蛋白分解物。
１５． 項１〜１４のいずれかに記載の蛋白分解物を有効成分とする高血圧の予防ないし治療剤。
１６． 項１〜１４のいずれかに記載の蛋白分解物を含む食品。
１７． 高血圧予防用食品である項１６に記載の食品。
１８． 項１〜１４のいずれかに記載の蛋白分解物を含む経口摂取用製剤。
１９． 次の４種ペプチドから選ばれる少なくとも一種のペプチドを有効成分として含有する高血圧の予防ないし治療剤：
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
２０． 明らか食品および／またはサプリメントからなる食品形態である項１８に記載の製剤。
２１． 項１〜１４のいずれかに記載の蛋白分解物を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
２２． ローヤルゼリー素材をブタトリプシンで処理することを特徴とする項１〜１４のいずれかに記載の蛋白分解物の製造方法。
２３． ブタトリプシン処理で得られた蛋白分解物を合成吸着剤で処理し、(1)無機塩類および(2)酸性遊離アミノ酸、塩基性遊離アミノ酸、アルコール性水酸基を有する遊離アミノ酸、遊離Ａｌａおよび遊離Ｇｌｙからなる群から選ばれる少なくとも１種を除去することを特徴とする項２２に記載の方法。
２４． ブタトリプシン処理で得られた蛋白分解物をスチレン・ジビニルベンゼン共重合体に吸着し、水洗して無機塩及び水溶性アミノ酸を除去し、次いで含水アルコールで溶出することを特徴とする項２２に記載の方法：
２５． スチレン・ジビニルベンゼン共重合体が下記の特性を有する項２４に記載の方法：
粒度分布：＞250μm（250μmより大きい粒子径のものを90%以上含む）
細孔径：400Å
官能基：なし
適用pH範囲：全領域。
２６． 以下の４種のペプチドのいずれかからなる新規ペプチド：
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
And involvement ingredient content (%) = A 1 / A T × 100
T 1 : Tryptophan retention time
T 2 : 10-hydroxy-δ-2-decenoic acid retention time
A 1 : Total peak area from the peak detected at the T 1 elution position to the peak detected at the T 2 elution position
A T : Sum of all peak areas.
12 Item 12. The protein degradation product according to Item 11, wherein the content of the concerned component is 58 ± 5%.
13. The proteolysate is passed through a column of styrene-divinylbenzene copolymer having the following characteristics, and water (fractions 1, 2), 20% methanol (fraction 3), 40% methanol (fraction 4), 60% methanol ( The proteolysate according to any one of Items 1 to 11, comprising fractions 3 to 6 among fractions eluted with fraction 5), 80% methanol (fraction 6), and 100% methanol (fraction 7):
Particle size distribution:> 250μm (including more than 90% particles with a particle size larger than 250μm)
Pore diameter: 400mm
Functional group: None Application pH range: Full range.
14 In fraction 4
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe;
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr; and
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr;
At least one peptide selected from the group consisting of:
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg
Item 14. The protein degradation product according to Item 13, comprising
15. Item 15. A prophylactic or therapeutic agent for hypertension, comprising the protein degradation product according to any one of items 1 to 14 as an active ingredient.
16. Item 15. A food containing the protein degradation product according to any one of Items 1 to 14.
17. Item 17. The food according to Item 16, which is a food for preventing hypertension.
18. Item 15. A preparation for oral consumption containing the protein degradation product according to any one of Items 1 to 14.
19. A prophylactic or therapeutic agent for hypertension containing at least one peptide selected from the following four peptides as an active ingredient:
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe;
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr;
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr;
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg.
20. Item 19. The preparation according to Item 18, which is a food form comprising an apparent food and / or supplement.
21. Item 15. An angiotensin converting enzyme inhibitor comprising the protein degradation product according to any one of Items 1 to 14 as an active ingredient.
22. Item 15. The method for producing a proteolysate according to any one of Items 1 to 14, wherein the royal jelly material is treated with porcine trypsin.
23. The proteolysate obtained by the treatment with porcine trypsin is treated with a synthetic adsorbent. From (1) inorganic salts and (2) acidic free amino acids, basic free amino acids, free amino acids having alcoholic hydroxyl groups, free Ala and free Gly Item 23. The method according to Item 22, wherein at least one member selected from the group consisting of:
24. Item 23. The protein degradation product obtained by the treatment with porcine trypsin is adsorbed on a styrene / divinylbenzene copolymer, washed with water to remove inorganic salts and water-soluble amino acids, and then eluted with hydrous alcohol. the method of:
25. Item 25. The method according to Item 24, wherein the styrene-divinylbenzene copolymer has the following characteristics:
Particle size distribution:> 250μm (including more than 90% particles with a particle size larger than 250μm)
Pore diameter: 400mm
Functional group: None Applicable pH range: Full range.
26. A novel peptide consisting of any of the following four peptides:
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe;
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr;
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr;
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg.
本発明のローヤルゼリー素材由来の蛋白分解物は、経口摂取で強力なＡＣＥ阻害作用を示し、高血圧の予防ないし治療に有効である。
本発明の蛋白分解物は、抗原となり得る分子量２万以上のタンパク質含量が低下され、好ましい蛋白分解物では抗原となり得る分子量１万以上のタンパク質はほとんど或いは全く有しない。従って、本発明の蛋白分解物は、アレルギー反応をより強く抑制することができ、アレルギー反応はほとんど認められない。
さらに、本発明と蛋白分解物は、脈拍、体重・BMI、血液検査、表検査に異常はなく、空咳、皮膚症状、消化器症状などの副作用のない安全なものである。
The proteolysate derived from the royal jelly material of the present invention exhibits a strong ACE inhibitory action when taken orally and is effective in preventing or treating hypertension.
The protein degradation product of the present invention has a reduced protein content of a molecular weight of 20,000 or more that can be an antigen, and a preferred protein degradation product has little or no protein having a molecular weight of 10,000 or more that can be an antigen. Therefore, the protein degradation product of the present invention can suppress allergic reaction more strongly, and almost no allergic reaction is observed.
Furthermore, the present invention and the proteolysate are safe with no side-effects such as dry cough, skin symptoms, and digestive symptoms, with no abnormality in pulse, body weight / BMI, blood test, and surface test.
脱塩操作がなされた本発明の蛋白分解物は、昇圧物質となり得る塩類、特に塩化ナトリウムの含量が極めて低い。また、脱塩操作により遊離アミノ酸や糖質などの他の成分の含量が低下し、吸湿性やメイラード反応などの化学反応が抑制され、より安定性の高い蛋白分解物を得ることができる。 The proteolysate of the present invention that has been desalted has a very low content of salts, particularly sodium chloride, which can serve as pressurizing substances. In addition, the desalting operation reduces the content of other components such as free amino acids and sugars, suppresses chemical reactions such as hygroscopicity and Maillard reaction, and a more stable proteolysate can be obtained.
本発明の蛋白分解物を長期間摂取することにより、血圧を緩やかに且つ持続的に低下させることができ、正常血圧の被験者が高血圧さらには、高血圧に起因する各種の疾患を予防することができる。 By taking the proteolysate of the present invention for a long period of time, blood pressure can be lowered slowly and continuously, and normal blood pressure subjects can prevent high blood pressure and various diseases caused by high blood pressure. .
本発明の蛋白分解物は、作用持続時間（８〜１２時間）が長く、血圧が緩やかに低下するため、当該蛋白分解物を服用した場合、１日の血圧の変動が小さく、血圧のコントロールが容易である。例えば朝服用すれば、活動時間中は血圧を低下させ、就寝中は血圧を低下させないため、血圧が高めのヒトが服用した場合の理想的な作用パターンを有している。また、服用中止後は緩やかに血圧が上昇し、服用前の血圧を超えるようなリバウンドは観察されない。特に拡張期血圧を穏やかに下げる点において、本発明の蛋白分解物あるいは4種のペプチドは優れている。 Since the proteolytic product of the present invention has a long duration of action (8 to 12 hours) and blood pressure gradually decreases, when taking the proteolytic product, fluctuations in blood pressure per day are small, and blood pressure control is possible. Easy. For example, if it is taken in the morning, the blood pressure is lowered during the activity time, and the blood pressure is not lowered while sleeping, so that it has an ideal action pattern when taken by a person with higher blood pressure. In addition, the blood pressure rises slowly after discontinuation of administration, and no rebound that exceeds the blood pressure before administration is observed. In particular, the proteolysate or the four peptides of the present invention are excellent in that the diastolic blood pressure is gently lowered.
本発明の蛋白分解物は、変異原性や抗原性試験に対し陰性の結果が得られており、血圧変動が少ないことや心拍数・体重に及ぼす影響がほとんどなく、安全性に優れた素材である。 The proteolysate of the present invention has a negative result for mutagenicity and antigenicity tests, is a highly safe material with little blood pressure fluctuation and little effect on heart rate and body weight. is there.
本発明の蛋白分解物は、高血圧症の危険因子（遺伝的、環境的素因など）を有する正常高値または軽症高血圧の人ないし高血圧患者が摂取するのに適している。 The proteolysate of the present invention is suitable for ingestion by normal high- or mildly hypertensive persons or hypertensive patients who have risk factors for hypertension (genetic, environmental predisposition, etc.).
本発明において、ローヤルゼリー素材としては、ローヤルゼリーのタンパク質を含む素材を意味するものであり、この要件を満たしていれば特に限定されず、例えば生ローヤルゼリー、乾燥ローヤルゼリー、ローヤルゼリーをエタノール沈殿、硫安処理、加熱処理等の蛋白変性処理を行って得られた蛋白沈殿物（エタノール沈殿物を含む）、或いは、ローヤルゼリーを抽出、濾過、遠心分離、クロマトグラフィー等の種々の手段により分画後のタンパク質を含む素材を意味する。
ローヤルゼリーは、いかなるものであってもよく、女王蜂を育てるために蜜蜂が分泌するものを広く用いることができる。具体的には、ローヤルゼリーは、蜜蜂のうち働き蜂が下咽頭腺及び大腮腺から分泌する分泌物を混合してつくる乳白色のゼリー状物質である。
In the present invention, the royal jelly material means a material containing a protein of royal jelly, and is not particularly limited as long as this requirement is satisfied. For example, raw royal jelly, dried royal jelly, royal jelly is ethanol precipitated, ammonium sulfate treated, heated Protein precipitates (including ethanol precipitates) obtained by protein denaturation such as treatment, or materials containing proteins after fractionation by various means such as extraction, filtration, centrifugation, and chromatography of royal jelly Means.
The royal jelly may be anything, and widely used by bees secreted to grow queen bees. Specifically, the royal jelly is a milky white jelly-like substance produced by mixing secreted products of the bees from the hypopharyngeal gland and the greater vagina.
ローヤルゼリー由来のタンパク質画分としては、ローヤルゼリーをアルコール沈殿して採取した蛋白画分を好適に用いることができる。特にローヤルゼリー飲料の製造時に水不溶性タンパクとして副生するローヤルゼリーのエタノール変性タンパク質を使用するのが好ましい。エタノール変性タンパク質は、５０〜１００容量％程度のエタノールを使用してローヤルゼリーからデセン酸等の飲料用の生理活性物質を抽出した残渣の水に対する溶解度が小さいタンパク質として得ることができる。 As the protein fraction derived from royal jelly, a protein fraction collected by alcohol precipitation of royal jelly can be suitably used. In particular, it is preferable to use an ethanol-denatured protein of royal jelly that is by-produced as a water-insoluble protein during the production of a royal jelly beverage. The ethanol-denatured protein can be obtained as a protein having low solubility in water of a residue obtained by extracting a physiologically active substance for beverages such as decenoic acid from royal jelly using about 50 to 100% by volume of ethanol.
4種のペプチドを含む本発明のローヤルゼリー素材の酵素分解物は、トリプシンにより加水分解を行うことにより得ることができる。トリプシンは、トリプシノーゲンの限定加水分解によって生成する活性型のα−トリプシンとβ−トリプシンがあり、そのいずれを使用してもよい。また、トロンビン、プラスミン、カリクレイン、ウロキナーゼなどの基質特異性と触媒機構が類似するトリプシン類縁酵素をトリプシンとして使用することもできる。さらに、トリプシン（トリプシン類縁酵素を包含する）の１以上のアミノ酸を置換、付加、欠失、挿入等により改変した変異型酵素を使用してもよい。このような変異型トリプシン及びトリプシン類縁酵素も本発明のローヤルゼリー素材の酵素分解に使用されるトリプシンに包含される。トリプシンの由来としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヒトなどの哺乳動物が挙げられる。ローヤルゼリー素材の加水分解には、ウシ、ブタ等の哺乳動物の膵臓から抽出したトリプシンを使用してもよく、遺伝子組換えにより得られたトリプシンを使用してもよい。
ローヤルゼリー素材をトリプシンで処理する条件としては、例えば、水性溶媒中約１５℃から約６０℃、好ましくは約２０℃から約５０℃、特に３７℃前後で、１〜７２時間程度、好ましくは３〜４８時間程度処理することにより好ましく実施することができる。トリプシンの使用量は、例えばタンパク質１００ｇ当たり０．０１〜３ｇ程度、好ましくは０．０５〜１ｇ程度である。トリプシンは遊離の酵素を用いてもよく、担体に固定化した酵素を使用してもよい。トリプシンとしては、具体的にはNovozyme製のブタ由来トリプシンを好ましく使用できる。
酵素反応液のｐＨは、６〜１０程度、好ましくは７〜９程度である。ローヤルゼリー素材をトリプシンで加水分解すると、ｐＨが徐々に低下するので、アルカリ金属水酸化物（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、アルカリ金属炭酸塩（例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム）、アルカリ金属炭酸水素塩（例えば炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム）などの塩基を使用してｐＨを一定の範囲内に保持するのが好ましい。
反応液は水を好適に使用できるが、少量のエタノール等の水混和性有機溶媒を含む、含水エタノール等の水性溶媒中で行ってもよい。
酵素分解物の反応液は、加熱処理、必要に応じてさらに遠心分離、濾過、抽出、脱塩、凍結乾燥やスプレードライ（または、噴霧乾燥）などの後処理を行い、本発明の蛋白分解物を得ることができる。例えば、ローヤルゼリー素材として生ローヤルゼリー或いは乾燥ローヤルゼリーを使用した場合、ローヤルゼリー由来の糖質等の成分を除去することもできる。本発明の好ましい実施形態の１つにおいて、本発明のローヤルゼリー素材の蛋白分解物は、ゲル濾過カラムにより測定された分子量が２００〜７０００程度、特に２５０〜６０００程度を有し、分子量２００〜３００程度のシャープなピークと、分子量２００〜１５００程度の範囲に最大のピークを有する。ゲル濾過カラムの測定結果から推定される蛋白分解物の推定分子量は、７００〜６０００程度、好ましくは８００から５０００程度である。
The enzymatic degradation product of the royal jelly material of the present invention containing four kinds of peptides can be obtained by hydrolysis with trypsin. Trypsin includes active α-trypsin and β-trypsin produced by limited hydrolysis of trypsinogen, and either of them may be used. In addition, trypsin-related enzymes having similar substrate specificity and catalytic mechanism such as thrombin, plasmin, kallikrein, and urokinase can also be used as trypsin. Furthermore, a mutant enzyme obtained by modifying one or more amino acids of trypsin (including trypsin-related enzymes) by substitution, addition, deletion, insertion, or the like may be used. Such mutant trypsin and trypsin-related enzymes are also included in the trypsin used for enzymatic degradation of the royal jelly material of the present invention. Trypsin is derived from mammals such as cows, pigs, sheep, and humans. For the hydrolysis of the royal jelly material, trypsin extracted from the pancreas of a mammal such as cow or pig may be used, or trypsin obtained by gene recombination may be used.
The conditions for treating the royal jelly material with trypsin are, for example, about 15 ° C. to about 60 ° C., preferably about 20 ° C. to about 50 ° C., particularly around 37 ° C. in an aqueous solvent, about 1 to 72 hours, preferably 3 to It can be preferably carried out by treating for about 48 hours. The amount of trypsin used is, for example, about 0.01 to 3 g, preferably about 0.05 to 1 g, per 100 g of protein. Trypsin may be a free enzyme or an enzyme immobilized on a carrier. Specifically, trypsin from swine derived from Novozyme can be preferably used.
The pH of the enzyme reaction solution is about 6 to 10, preferably about 7 to 9. When royal jelly material is hydrolyzed with trypsin, the pH gradually decreases, so alkali metal hydroxides (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide), alkali metal carbonates (eg, sodium carbonate, potassium carbonate), alkali metal hydrogen carbonate It is preferred to use a base such as a salt (eg, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate) to keep the pH within a certain range.
Water can be suitably used for the reaction solution, but it may be carried out in an aqueous solvent such as hydrous ethanol containing a small amount of a water-miscible organic solvent such as ethanol.
The reaction solution of the enzyme degradation product is subjected to heat treatment, and if necessary, further post-treatment such as centrifugation, filtration, extraction, desalting, freeze-drying and spray-drying (or spray-drying), and the protein degradation product of the present invention. Can be obtained. For example, when raw royal jelly or dried royal jelly is used as the royal jelly material, components such as saccharides derived from royal jelly can be removed. In one preferred embodiment of the present invention, the royal jelly material proteolysate of the present invention has a molecular weight measured by a gel filtration column of about 200 to 7000, particularly about 250 to 6000, and a molecular weight of about 200 to 300. And a maximum peak in the molecular weight range of about 200-1500. The estimated molecular weight of the protein degradation product estimated from the measurement result of the gel filtration column is about 700 to 6000, preferably about 800 to 5000.
本発明の他の好ましい実施形態の１つにおいて、本発明のローヤルゼリー素材の蛋白分解物は、糖類や塩類及び酸性遊離アミノ酸、塩基性遊離アミノ酸、アルコール性水酸基を有する遊離アミノ酸、遊離Ａｌａおよび遊離Ｇｌｙからなる群から選ばれる少なくとも１種を実質的に含まないものである。既述のように、ローヤルゼリー素材をトリプシン処理した場合、蛋白加水分解時、水酸化ナトリウムなどの塩基を加えて反応液のｐＨをトリプシンの好適なｐＨである６〜１０，特に７〜９程度に維持するのが好ましい。このようにして添加された塩基（例えば水酸化ナトリウム）は、酵素反応後に反応液に酸（例えば塩酸）を加えてｐＨを３．５〜７程度、好ましくは４〜５．５程度に調整し、塩基（例えば水酸化ナトリウム）を対応する塩（例えば塩化ナトリウム）に導く。この際に生成する多量の塩は、特に塩化ナトリウムのようなナトリウムを含有する塩の場合、ナトリウムが昇圧物質であるため、除去するのが望ましい。この脱塩は、例えば脱塩カラムを使用することにより実施することができ、具体的には、スチレン・ジビニルベンゼン共重合体を含む疎水性の合成吸着剤（例えばダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学製）、セパビーズＳＰ−７０（三菱化学製））を用いて蛋白分解物を吸着し、塩化ナトリウムのような塩を水で洗浄除去し、次いで、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどの適切な有機溶媒を用いて溶出することにより、脱塩され、無機塩類を実質的に含まない蛋白分解物を得ることができる。脱塩に合成吸着剤を使用すると、例えばＡｓｐ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ等の疎水性の合成吸着剤に吸着されにくい酸性又は塩基性の遊離アミノ酸等は無機塩類とともに除去され、一方、Ｐｈｅ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ等の疎水性であって、合成吸着剤に吸着されやすい遊離アミノ酸は、脱塩操作によっても除去されにくい。なお、Ｓｅｒ，Ｔｈｒなどのアルコール性水酸基を有する遊離アミノ酸、さらに遊離Ａｌａ，遊離Ｇｌｙなどについても疎水性の合成吸着剤に吸着されにくいため、酸性又は塩基性の遊離アミノ酸と同様に無機塩類とともに除去されやすい。 In another preferred embodiment of the present invention, the proteolysate of the royal jelly material of the present invention comprises saccharides and salts, acidic free amino acids, basic free amino acids, free amino acids having an alcoholic hydroxyl group, free Ala and free Gly. And at least one selected from the group consisting of: As described above, when the royal jelly material is trypsinized, a base such as sodium hydroxide is added at the time of proteolysis to adjust the pH of the reaction solution to about 6 to 10, particularly about 7 to 9, which is a suitable pH of trypsin. It is preferable to maintain. The thus added base (for example, sodium hydroxide) is adjusted to a pH of about 3.5 to 7, preferably about 4 to 5.5 by adding an acid (for example, hydrochloric acid) to the reaction solution after the enzyme reaction. , Leading a base (eg sodium hydroxide) to the corresponding salt (eg sodium chloride). It is desirable to remove a large amount of salt generated at this time, particularly in the case of a salt containing sodium such as sodium chloride, because sodium is a pressurizing substance. This desalting can be carried out, for example, by using a desalting column. Specifically, a hydrophobic synthetic adsorbent containing styrene / divinylbenzene copolymer (for example, Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical). ), Sepabeads SP-70 (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) is used to adsorb the proteolysate, and salts such as sodium chloride are washed away with water, and then an appropriate organic solvent such as methanol, ethanol, acetonitrile is removed. By elution, a protein degradation product that is desalted and substantially free of inorganic salts can be obtained. When a synthetic adsorbent is used for desalting, for example, acidic or basic free amino acids which are difficult to be adsorbed by a hydrophobic synthetic adsorbent such as Asp, Glu, Lys, and Arg are removed together with inorganic salts, while Phe, Leu , Ile, Trp, Val, etc., which are hydrophobic and easily adsorbed on the synthetic adsorbent, are not easily removed by a desalting operation. It should be noted that free amino acids having alcoholic hydroxyl groups such as Ser and Thr, and also free Ala and free Gly are not easily adsorbed by hydrophobic synthetic adsorbents, so they are removed together with inorganic salts like acidic or basic free amino acids. Easy to be.
本発明の１つの実施形態において、ローヤルゼリーの蛋白分解物中には、遊離Ｌｙｓが比較的多く産生するが、合成吸着剤カラムを用いた脱塩処理によって大部分が水洗除去されるので、エタノール等で溶出し回収した分画の蛋白分解物には、遊離Ｌｙｓは実質的に含まれない。 In one embodiment of the present invention, a relatively large amount of free Lys is produced in the proteolysate of royal jelly, but most of it is washed away with water by desalting using a synthetic adsorbent column. The proteolysate of the fraction eluted and recovered in step 3 is substantially free of free Lys.
本発明の他の実施形態において、ローヤルゼリーの蛋白分解物中には、遊離Ａｌａも多く存在し、遊離Ａｌａについても合成吸着剤カラムを用いた脱塩処理によって大部分が水洗除去されるので、エタノール等で溶出し回収した分画の蛋白分解物には、遊離Ａｌａは実質的に含まれない。 In another embodiment of the present invention, a large amount of free Ala is also present in the proteolysate of royal jelly, and most of the free Ala is also washed and removed by desalting using a synthetic adsorbent column. The proteolysate of the fraction eluted and collected by the above method does not substantially contain free Ala.
ここで、「遊離アミノ酸を実質的に含まない」とは、当該遊離アミノ酸の含量が、約０．０１μmol／10mg以下、好ましくは約０．００１μmol／10mg以下、より好ましくは０．０００１μmol／10mg以下であることを意味する。 Here, “substantially free of free amino acids” means that the content of free amino acids is about 0.01 μmol / 10 mg or less, preferably about 0.001 μmol / 10 mg or less, more preferably 0.0001 μmol / 10 mg or less. It means that.
本明細書において、「酸性アミノ酸」はＧｌｕおよびＡｓｐを意味し、塩基性アミノ酸はＬｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｒｇを意味し、アルコール性水酸基を有するアミノ酸としては、Ｔｈｒ，Ｓｅｒを意味する。
好ましい実施形態の１つにおいて、本発明の蛋白分解物における塩類（特に塩化ナトリウム）の含量は、１重量％以下、より好ましくは０．２重量％以下、さらに好ましくは０．１重量％以下、特に検出限界以下である。
In the present specification, “acidic amino acid” means Glu and Asp, basic amino acid means Lys, His, Arg, and amino acid having an alcoholic hydroxyl group means Thr, Ser.
In one preferred embodiment, the content of salts (particularly sodium chloride) in the proteolysate of the present invention is 1% by weight or less, more preferably 0.2% by weight or less, still more preferably 0.1% by weight or less, Especially below the detection limit.
上記のように、脱塩処理により、塩基性遊離アミノ酸、酸性遊離アミノ酸、アルコール性遊離アミノ酸、遊離Ａｌａ、遊離Ｇｌｙなどの濃度は低下するが、ＡＣＥ阻害活性の低下はほとんど或いは全くない。これは、塩基性遊離アミノ酸、酸性遊離アミノ酸、アルコール性遊離アミノ酸、遊離Ａｌａ、遊離ＧｌｙなどのＡＣＥ阻害活性に対する寄与率が低いためと考えられる。 As described above, the desalting treatment reduces the concentration of basic free amino acid, acidic free amino acid, alcoholic free amino acid, free Ala, free Gly, etc., but there is little or no decrease in ACE inhibitory activity. This is presumably because the contribution rate to the ACE inhibitory activity such as basic free amino acids, acidic free amino acids, alcoholic free amino acids, free Ala, and free Gly is low.
本発明の好ましい他の１つの実施形態において、本発明の蛋白分解物は、Ｇｌｙを基準にしたときのＬｙｓの残存率（モル数で比較）が、ローヤルゼリー素材の２５〜７０％、３０〜６０％、３５〜５５％、４０〜５０％である。例えば本発明の実施例で得られた蛋白分解物に関し、
酵素分解前のローヤルゼリー素材（エタノール沈殿物）
Ｇｌｙ（１モル）に対しＬｙｓ（１．１モル）
酵素分解物（合成吸着剤を充填したカラム処理で脱塩後、回収したサンプル）
Ｇｌｙ（１モル）に対しＬｙｓ（０．５モル）
になるので、数１に従いLysの残存率を計算すると、
１００×（０．５／１．１）＝約４５％となる。
In another preferred embodiment of the present invention, the proteolysate of the present invention has a Lys residual ratio (compared by the number of moles) based on Gly of 25 to 70%, 30 to 60% of the royal jelly material. %, 35-55%, and 40-50%. For example, regarding the protein degradation product obtained in the examples of the present invention,
Royal jelly material (ethanol precipitate) before enzymatic degradation
Lys (1.1 mol) with respect to Gly (1 mol)
Enzymatic degradation product (sample collected after desalting by column treatment packed with synthetic adsorbent)
Lys (0.5 mol) per Gly (1 mol)
So, when calculating the residual rate of Lys according to Equation 1,
100 × (0.5 / 1.1) = about 45%.
ローヤルゼリー素材、分解条件により多少の変動はあるが、蛋白分解物を合成吸着剤により吸着して脱塩した場合、遊離Ｌｙｓの含有濃度はもとの分解物と比較して低くなることが明らかである。 Although there are some fluctuations depending on the royal jelly material and degradation conditions, it is clear that when the protein degradation product is adsorbed with a synthetic adsorbent and desalted, the concentration of free Lys is lower than the original degradation product. is there.
本発明の好ましい他の１つの実施形態において、本発明の蛋白分解物は、Ｌｙｓを基準にしたときのＬｅｕの含有割合（モル比）が、ローヤルゼリー素材の１．３〜３．５倍程度、例えば１．５〜３倍程度、１．７〜２．７倍程度或いは２〜２．５倍程度である。例えば本発明の実施例で得られた蛋白分解物に関し、
酵素分解前のローヤルゼリー素材（エタノール沈殿物）
Ｌｙｓ（１モル）に対しＬｅｕ（約１．１モル）
酵素分解物（合成吸着剤を充填したカラム処理で脱塩後、回収したサンプル）
Ｌｙｓ（１モル）に対しＬｅｕ（約２．５モル）
になるので、数２に従いLeuの含有割合（モル基準）を計算すると、
２．５／１．１＝約２．３倍である。
In another preferred embodiment of the present invention, the proteolysate of the present invention has a Leu content (molar ratio) of about 1.3 to 3.5 times that of the royal jelly material, based on Lys. For example, it is about 1.5 to 3 times, about 1.7 to 2.7 times, or about 2 to 2.5 times. For example, regarding the protein degradation product obtained in the examples of the present invention,
Royal jelly material (ethanol precipitate) before enzymatic degradation
Leu (about 1.1 mol) with respect to Lys (1 mol)
Enzymatic degradation product (sample collected after desalting by column treatment packed with synthetic adsorbent)
Leu (about 2.5 mol) with respect to Lys (1 mol)
Therefore, when calculating the Leu content ratio (molar basis) according to Equation 2,
2.5 / 1.1 = about 2.3 times.
本発明の蛋白分解物において、分解されていないより高分子量のタンパク質、トリプシンなどが残存している場合、必要に応じて、限外濾過などにより除去することが可能である。 In the proteolysate of the present invention, when a higher molecular weight protein, trypsin or the like that has not been decomposed remains, it can be removed by ultrafiltration or the like, if necessary.
本発明の好ましい他の１つの実施形態において、本発明の蛋白分解物は、ローヤルゼリー由来の糖質含量が低いものが好ましい。糖質（糖分）含量としては、蛋白分解物の品質を損なわない限りにおいて特に限定されないが、通常３５重量％以下、好ましくは３０重量％以下、より好ましくは２５重量％以下である。糖分としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、スクロース、などの単糖或いは二糖が挙げられる。これら糖質は、保存中に蛋白分解物と徐々に反応（例えばメイラード反応）して蛋白分解物を褐変させたり吸湿性が高くなる原因となるので、できるだけ除かれていることが望ましい。 In another preferred embodiment of the present invention, the proteolysate of the present invention preferably has a low saccharide content derived from royal jelly. The saccharide (sugar content) is not particularly limited as long as the quality of the protein degradation product is not impaired, but is usually 35% by weight or less, preferably 30% by weight or less, more preferably 25% by weight or less. Examples of the sugar include monosaccharides or disaccharides such as glucose, fructose, galactose, maltose, and sucrose. These carbohydrates are preferably removed as much as possible because they cause a gradual reaction (for example, Maillard reaction) with the proteolytic product during storage and cause the proteolytic product to brown or become highly hygroscopic.
本発明の蛋白分解物は、酵素処理後の好ましくは脱塩処理をして製造してもよく、さらにカラムなどの処理によりＡＣＥ阻害活性がより強い分画を集めることも可能である。そして、必要ならば同様の精製を繰り返すことにより、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチドを分離し、当該生理活性ペプチドを単離ないし濃縮して、ＡＣＥ阻害作用を有する蛋白分解物として使用してもよい。 The proteolysate of the present invention may be produced by desalting treatment after the enzyme treatment, and it is also possible to collect fractions having stronger ACE inhibitory activity by treatment with a column or the like. Then, if necessary, the same purification may be repeated to separate a peptide having an ACE inhibitory action, and the physiologically active peptide may be isolated or concentrated and used as a proteolysate having an ACE inhibitory action.
ＡＣＥ阻害ペプチドは、例えば、本発明の蛋白分解物について合成吸着剤やゲル濾過剤、分子ふるい、逆相クロマトグラフ等にかけ、水、メタノール、エタノール或いはこれらの混合溶液のような適当な溶出液で溶出して種々の分画に分け、ＡＣＥ阻害活性の強い分画について分取ＨＰＬＣ等の常法によりペプチドを単離し、構造決定することにより、ＡＣＥ阻害活性の強いペプチドを単離することもできる。 For example, the ACE-inhibiting peptide is subjected to a synthetic adsorbent, a gel filter, a molecular sieve, a reverse phase chromatograph, etc. with respect to the proteolytic product of the present invention, and an appropriate eluent such as water, methanol, ethanol or a mixed solution thereof. The peptide having strong ACE inhibitory activity can be isolated by eluting and dividing into various fractions, and isolating the peptide by a conventional method such as preparative HPLC for the fraction having strong ACE inhibitory activity, and determining the structure. .
本発明の好ましい１つの実施形態において、ローヤルゼリー素材をトリプシン処理した蛋白分解物を合成吸着剤の１つであるＨＰ−２０カラムに吸着させ、下記のスキーム１に従って、７つのフラクションに分画することができる。 In one preferred embodiment of the present invention, a proteolytic product obtained by trypsinizing a royal jelly material is adsorbed on an HP-20 column, which is one of the synthetic adsorbents, and fractionated into seven fractions according to the following scheme 1. Can do.
なお、本明細書において、フラクション（分画）を「Fr」または「P」と略記することがある。例えば、フラクション４は、「Fr4」または「P4」と記載され得る。
スキーム１
ローヤルゼリー蛋白加水分解液855mL（凍結乾燥物として50gに相当）
↓
ダイヤイオンHP20に負荷（カラムサイズ：φ11cm×20cm、容量：約1.9L）
↓ 洗浄液：水3260mL使用
↓ 溶出液：20%、40%、60%、80%、100%MeOH
↓ ・20% メタノール 2460mL使用
↓ ・40% メタノール 2340mL使用
↓ ・60% メタノール 2720mL使用
↓ ・80% メタノール 2300mL使用
↓ ・100% メタノール 3200mL使用
洗浄液及び各溶出液
↓ エバポレーター（４０℃）を用いて濃縮
各濃縮液
↓
凍結乾燥
水洗浄分画 ：フラクション１及び２
20%メタノール溶出分画：フラクション３
40%メタノール溶出分画：フラクション４
60%メタノール溶出分画：フラクション５
80%メタノール溶出分画：フラクション６
100%メタノール溶出分画：フラクション７
In the present specification, the fraction (fraction) may be abbreviated as “Fr” or “P”. For example, fraction 4 may be described as “Fr4” or “P4”.
Scheme 1
855 mL of royal jelly protein hydrolyzate (equivalent to 50 g as lyophilized product)
↓
Loaded on Diaion HP20 (column size: φ11cm × 20cm, capacity: about 1.9L)
↓ Cleaning solution: Use 3260 mL of water ↓ Eluent: 20%, 40%, 60%, 80%, 100% MeOH
↓ ・ 20% methanol 2460mL used ↓ ・ 40% methanol 2340mL used ↓ ・ 60% methanol 2720mL used ↓ ・ 80% methanol 2300mL used ↓ ・ 100% methanol 3200mL used cleaning solution and each eluate ↓ Concentrate using an evaporator (40 ℃) Each concentrate ↓
Lyophilized water-washed fraction: fractions 1 and 2
20% methanol elution fraction: fraction 3
40% methanol elution fraction: fraction 4
60% methanol elution fraction: fraction 5
80% methanol elution fraction: fraction 6
100% methanol elution fraction: fraction 7
上記のフラクションのうち、フラクション３〜６を含む製品が好ましい。フラクション７を含んでもよいが、フラクション７は収率が少ないため、フラクション３〜６を含む蛋白分解物は十分な降圧作用を示す。また、フラクション１，２はACE阻害作用を示し得るが、アミノ酸及び無機塩類（例えばNaCl）を含むので、本発明の蛋白分解物に含まれる必要はない。
本発明の蛋白分解物は、下記の特性を有するスチレン・ジビニルベンゼン共重合体（商品名：三菱化学社製ＭＣＩ−ＧＥＬ，ＣＨＰ５５Ｙ）のカラム（4.6mmφ×150mm）を通したとき、下記式で表される関与成分含量（％）が３５％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは５０〜７０％、特に好ましくは５８±５％、最も好ましくは５８±３％であるのがよい：
・関与成分含量（%）＝A1／AT×100
T1：トリプトファンの保持時間
T2：10-ハイドロキシ-δ-2-デセン酸の保持時間
A1：T1の溶出位置に検出されるピークの後ろから，T2の溶出位置に検出されるピークの前までのピーク面積の合計
AT：全てのピーク面積の合計。
・スチレン・ジビニルベンゼン共重合体の特性
粒度分布；30μm
細孔径；250Å
官能基；なし
適用pH範囲：全領域。
Of the above fractions, products containing fractions 3-6 are preferred. Although fraction 7 may be contained, since fraction 7 has a low yield, a proteolysate containing fractions 3 to 6 exhibits a sufficient antihypertensive action. Further, although fractions 1 and 2 can exhibit an ACE inhibitory action, they contain an amino acid and an inorganic salt (for example, NaCl), and therefore need not be included in the proteolysate of the present invention.
When the protein degradation product of the present invention is passed through a column (4.6 mmφ × 150 mm) of a styrene / divinylbenzene copolymer (trade name: MCI-GEL, CHP55Y, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) having the following characteristics, The component content (%) expressed is 35% or more, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 50 to 70%, particularly preferably 58 ± 5%, most preferably 58 ± 3%. Good to be:
And involvement ingredient content (%) = A 1 / A T × 100
T 1 : Tryptophan retention time
T 2 : 10-hydroxy-δ-2-decenoic acid retention time
A 1 : Total peak area from the peak detected at the T 1 elution position to the peak detected at the T 2 elution position
A T : Sum of all peak areas.
・ Characteristics of styrene / divinylbenzene copolymer Particle size distribution: 30μm
Pore diameter: 250mm
Functional group; none Applicable pH range: Full range.
カラム：4.6mmφ×150mm
上記A1には、主にフラクション４及びフラクション５が含まれる。
ローヤルゼリー蛋白加水分解物（検体）の関与成分含量の測定は、例えば以下の条件（試験方法）で実施することができる。
Column: 4.6mmφ × 150mm
A 1 mainly includes fraction 4 and fraction 5.
The measurement of the content of the components involved in the royal jelly protein hydrolyzate (specimen) can be carried out, for example, under the following conditions (test method).
試験方法
本品0.50gを量り，水／メタノール混液（1：1）10mLを加えて溶かし，50mLとする．この液をメンブランフィルター（0.45μL）でろ過し，ろ液を検液とする．
もしくは，本品0.50gを量り，水／メタノール混液（1：1）10mL及びリン酸緩衝液（pH8.0）1）10mLを加えて溶かし，更に水15mL及び希酢酸2）5mLを加えてよく振りまぜ，水を加えて50mLとする．この液をメンブランフィルター（0.45μL）でろ過し，ろ液を検液とする．
別に，トリプトファン3）1mg及びグリシル-L-ロイシル-L-チロシン4）5mgを量り，酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）5）5mLを加えて溶かし，更に水を加えて10mLとし，Ａ液とする．
10-ハイドロキシ-δ-2-デセン酸標準品6）5mgを量り，水／メタノール混液（1：1）0.5mLを加えて溶かす．この液にＡ液0.5mLを加えてよく混和し，比較液とする．
検液及び比較液それぞれ50μLにつき，次の操作条件で液体クロマトグラフィーを行う．比較液のトリプトファン及び10-ハイドロキシ-δ-2-デセン酸の保持時間をT1及びT2とし，検液におけるT1の溶出位置に検出されるピークの後ろから，T2の溶出位置に検出されるピークの前までのピーク面積の合計A1及び全てのピーク面積の合計ATを測定し，次式により関与成分含量を求める．
関与成分含量（%）＝A1／AT×100
操作条件
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：275nm）
カラム：内径4.6mm，長さ150mmのステンレス管に30μmのスチレン・ジビニルベンゼン共重合体逆相用ポリマー7）を充てんする．
カラム温度：50℃付近の一定温度
移動相A：水／メタノール混液（199：1）
B：メタノール／水混液（19：1）
流速＊：1mL／分
グラジエント条件＊
0分 → 10分 A:B=92:8 保持
10分 → 12分 A:B=92:8 → A:B=50:50 直線
12分 → 22分 A:B=50:50 保持
22分 → 30分 A:B=50:50 → A:B=10:90 直線
30分 → 45分 A:B=10:90 保持
45.01分 → 55分 A:B=92:8 保持
面積測定範囲：10-ハイドロキシ-δ-2-デセン酸の保持時間の約1.5倍の範囲
＊：流速及びグラジエント条件については，下記のシステム適合性が満たされるよう適宜調整する．
Test method Weigh 0.50 g of this product, add 10 mL of water / methanol mixture (1: 1) and dissolve to make 50 mL. Filter this solution through a membrane filter (0.45 μL), and use the filtrate as the test solution.
Alternatively, weigh 0.50 g of this product, dissolve with 10 mL of water / methanol mixture (1: 1) and phosphate buffer (pH 8.0) 1) 10 mL, and then add 15 mL of water and 5 mL of dilute acetic acid 2) Shake and add water to make 50 mL. Filter this solution through a membrane filter (0.45 μL), and use the filtrate as the test solution.
Separately, tryptophan 3) 1 mg and glycyl-L-leucyl-L-tyrosine 4) 5 mg are weighed, acetic acid / sodium acetate buffer solution (pH 4.0) 5) Add 5 mL to dissolve, and add water to make 10 mL. Use liquid.
10-Hydroxy-δ-2-decenoic acid standard 6) Weigh 5 mg and add 0.5 mL of water / methanol mixture (1: 1) to dissolve. Add 0.5 mL of solution A to this solution and mix well.
Perform liquid chromatography with 50 µL each of the test solution and comparative solution under the following operating conditions. The retention times of the tryptophan and 10-hydroxy-δ-2-decenoic acid in the comparison solution are defined as T 1 and T 2 and detected at the T 2 elution position after the peak detected at the T 1 elution position in the test solution. It is the total a T total a 1 and all the peak area of the peak area of before the peaks measured is, obtains the involvement ingredient content by the following equation.
Involved component content (%) = A 1 / A T × 100
Operation condition detector: UV absorption photometer (measurement wavelength: 275nm)
Column: A stainless steel tube with an inner diameter of 4.6 mm and a length of 150 mm is packed with 30 μm styrene / divinylbenzene copolymer reverse phase polymer 7) .
Column temperature: Constant temperature around 50 ° C Mobile phase A: Water / methanol mixture (199: 1)
B: Methanol / water mixture (19: 1)
Flow rate * : 1 mL / min Gradient condition *
0 min → 10 min A: B = 92: 8 hold
10 minutes → 12 minutes A: B = 92: 8 → A: B = 50: 50 straight line
12 minutes → 22 minutes A: B = 50: 50 hold
22 minutes → 30 minutes A: B = 50: 50 → A: B = 10: 90 straight line
30 minutes → 45 minutes A: B = 10: 90 Hold
45.01 minutes → 55 minutes A: B = 92: 8 Retention Area measurement range: Approximately 1.5 times the retention time of 10-hydroxy-δ-2-decenoic acid *: The following system suitability for flow rate and gradient conditions Adjust appropriately so that is satisfied.
システム適合性
システムの性能：比較液50μLにつき，上記の操作条件で液体クロマトグラフィーを行うとき，トリプトファン，グリシル-L-ロイシル-L-チロシン，10-ハイドロキシ-δ-2-デセン酸の順に溶出し，トリプトファンとグリシル-L-ロイシル-L-チロシンの分離度が3以上で，グリシル-L-ロイシル-L-チロシンと10-ハイドロキシ-δ-2-デセン酸の分離度が5以上である．
注：
1) リン酸緩衝液（pH8.0）：調製は，食品添加物公定書に準拠．
2) 希酢酸：調製は，食品添加物公定書に準拠．
3) L-トリプトファン： C11H12N2O2 和光純薬工業株式会社製 試薬特級又は同等の品質のものを用いる．
4) グリシル-L-ロイシル-L-チロシン：C17H25N3O5 フルカ（リーデル・デ・ハーン）社製 含量98%以上のもの又は同等の品質のものを用いる．
5) 酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）：酢酸ナトリウム三水和物5.44gを水900mLに溶かし，酢酸（100）を滴加し，pHを4.0に調整した後，水を加えて1000mLとする．
6) 10-ハイドロキシ-δ-2-デセン酸標準品：（E）-10-ヒドロキシ-2-デセン酸標準品（C10H18O3） 和光純薬工業株式会社製又は同等の品質のものを用いる．
7) スチレン・ジビニルベンゼン共重合体逆相用ポリマー：三菱化学社製MCI-GEL CHP55Y又は同等の品質のものを用いる．
次に、フラクション３〜６についての関与成分（ペプチド）の単離とその同定について、以下に記載する
System suitability System performance: When liquid chromatography is performed with 50 µL of the reference solution under the above operating conditions, tryptophan, glycyl-L-leucyl-L-tyrosine, and 10-hydroxy-δ-2-decenoic acid are eluted in this order. , The resolution of tryptophan and glycyl-L-leucyl-L-tyrosine is 3 or more, and the resolution of glycyl-L-leucyl-L-tyrosine and 10-hydroxy-δ-2-decenoic acid is 5 or more.
note:
1) Phosphate buffer solution (pH 8.0): The preparation conforms to the official food additives.
2) Dilute acetic acid: The preparation complies with the official food additives.
3) L-tryptophan: C 11 H 12 N 2 O 2 produced by Wako Pure Chemical Industries, used as a reagent manufactured by grade or equivalent quality Corporation.
4) Glycyl-L-Leucyl-L-tyrosine: C 17 H 25 N 3 O 5 Fruca (Riedel de Haan) Co., Ltd. Use 98% or more or equivalent quality.
5) Acetic acid / sodium acetate buffer (pH 4.0): Dissolve 5.44 g of sodium acetate trihydrate in 900 mL of water, add acetic acid (100) dropwise, adjust the pH to 4.0, add water to add 1000 mL Let's say.
6) 10-Hydroxy-δ-2-decenoic acid standard product: (E) -10-Hydroxy-2-decenoic acid standard product (C 10 H 18 O 3 ) Wako Pure Chemical Industries, Ltd. or equivalent quality Is used.
7) Styrene / divinylbenzene copolymer reverse phase polymer: Use MCI-GEL CHP55Y manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation or equivalent.
Next, the isolation and identification of participating components (peptides) for fractions 3 to 6 are described below.
(a) 大口径カラムによる分画
HPLC条件
カラム ：TSK-gel ODS 120T 55mmφ×300mm 東ソー
ガードカラム：TSK-gel ODS 120T 45mmφ×55mm 東ソー
移動相 ：水／アセトニトリル混液＊／0.05%TFA
流量 ：42mL/分
カラム温度 ：室温
検出波長 ：220nm
＊ ：アセトニトリル濃度 ７〜25%、50%（洗い出し）
(a) Fractionation with large-diameter column
HPLC condition column: TSK-gel ODS 120T 55mmφ × 300mm Tosoh Guard column: TSK-gel ODS 120T 45mmφ × 55mm Tosoh Mobile phase: Water / acetonitrile mixture * / 0.05% TFA
Flow rate: 42mL / min Column temperature: Room temperature Detection wavelength: 220nm
*: Acetonitrile concentration: 7-25%, 50% (washed out)
(b) 中口径カラムによる分画
HPLC条件
カラム ：COSMOSIL-5C18-AR II 20mmφ×250mm ナカライテスク
および／または COSMOSIL-5C18-AR II 10mmφ×250mm ナカライテスク
移動相 ：水／メタノール混液＊／0.05%TFA
流量 ：8mL/分 または 2mL/分
カラム温度 ：40℃
検出波長 ：220nm
＊ ：メタノール濃度
イソクラティックモード 2〜35%、50%（洗い出し）
グラジエントモード A液0% (0.05%TFA)、B液50%
(b) Fractionation with medium-diameter column
HPLC condition column: COSMOSIL-5C18-AR II 20 mmφ × 250 mm Nacalai Tesque and / or COSMOSIL-5C18-AR II 10 mmφ × 250 mm Nacalai Tesque Mobile phase: Water / methanol mixture * / 0.05% TFA
Flow rate: 8mL / min or 2mL / min
Column temperature: 40 ° C
Detection wavelength: 220nm
*: Methanol concentration Isocratic mode 2 to 35%, 50% (wash out)
Gradient mode A solution 0% (0.05% TFA), B solution 50%
(c) 各分取液の純度の確認
＜HPLC条件＞
検出器 ：紫外分光光度計（測定波長：220nm）
カラム ：COSMOSIL-5C18-AR II 4.6mmφ×250mm ナカライテスク
移動相 ：水／メタノール混液＊／0.05%TFA
流量 ：0.4mL/分
カラム温度 ：40℃
＊ ：メタノール濃度 2〜40%
(c) Confirmation of purity of each fraction <HPLC conditions>
Detector: UV spectrophotometer (measurement wavelength: 220 nm)
Column: COSMOSIL-5C18-AR II 4.6mmφ × 250mm Nacalai Tesque Mobile phase: Water / methanol mixture * / 0.05% TFA
Flow rate: 0.4 mL / min Column temperature: 40 ° C
*: Methanol concentration 2-40%
ACE阻害率の測定
純度が85%以上の分画についてACE阻害率の測定を行った。
なお、純度が85%以下のサンプルも一部測定を行った。
Measurement of ACE inhibition rate The ACE inhibition rate was measured for a fraction having a purity of 85% or more.
A part of the sample having a purity of 85% or less was also measured.
ACE阻害率の測定方法
試料溶液（反応液中濃度：0.1mg/mL） 25μＬ
↓ ACE溶液（ウサギ肺由来アンジオテンシンI変換酵素：25mU/mL） 50μＬ
プレインキュベート37℃−5 分
↓ 基質溶液(Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine：12.5mM) 50μＬ
インキュベート37℃−60 分
↓ 塩酸(9→200) 125μＬ
↓ 内標準溶液（m-馬尿酸：0.625mM） 100μL
↓ 酢酸エチル 750μL
↓ ボルテックスミキサー 10sec×2
遠心分離 (2000rpm, 5分)
↓
有機層 500μL
↓ 60℃、窒素ガス気流下で乾固
↓ 移動相 500μL
↓ ボルテックスミキサーで溶解
20μLをHPLCに注入
＜HPLC条件＞
検出器 ：紫外分光光度計（測定波長：228nm）
カラム ：L-column ODS 4.6mmφ×150mm 化学物質評価研究機構
移動相 ：0.01Mリン酸緩衝液(pH3.0)／アセトニトリル混液(17:3)
流量 ：1.0mL/分
カラム温度 ：40℃
注入量 ：20μL
ACE inhibition rate measurement method Sample solution (concentration in reaction solution: 0.1 mg / mL) 25 μL
↓ ACE solution (rabbit lung derived angiotensin I converting enzyme: 25mU / mL) 50μL
Preincubation at 37 ° C for 5 minutes ↓ Substrate solution (Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine: 12.5 mM) 50 μL
Incubation 37 ℃ -60 minutes ↓ Hydrochloric acid (9 → 200) 125μL
↓ Internal standard solution (m-hippuric acid: 0.625 mM) 100 μL
↓ Ethyl acetate 750μL
↓ Vortex mixer 10sec × 2
Centrifugation (2000rpm, 5min)
↓
Organic layer 500μL
↓ Dry at 60 ℃ under nitrogen gas flow ↓ Mobile phase 500μL
↓ Dissolve with vortex mixer
Inject 20 μL into HPLC
<HPLC conditions>
Detector: UV spectrophotometer (measurement wavelength: 228nm)
Column: L-column ODS 4.6mmφ × 150mm Chemical Substance Evaluation and Research Organization Mobile phase: 0.01M phosphate buffer (pH3.0) / acetonitrile mixture (17: 3)
Flow rate: 1.0 mL / min Column temperature: 40 ° C
Injection volume: 20μL
(d) 構成アミノ酸の測定
単離量が2mg以上またはACE阻害率が20%以上の分画について、酸加水分解後にアミノ酸濃度を測定し、構成アミノ酸を求めた。
構成アミノ酸の測定方法
＜酸加水分解法−１：トリプトファンを含まない単離ペプチド＞
試料溶液（1mg/mL 50%メタノール溶液） 50μL
↓ Pico-Tag (Waters)を用いて減圧乾固（室温）
残留物
↓ +6mol/L塩酸溶液(1%フェノール含有) 0.2mL （反応バイアル内に入れる）
↓ Pico-Tag法により加水分解(110℃、22時間)
↓ 冷後
↓ Pico-Tag を用いて減圧乾固（室温）
残留物
↓ +0.02mol/L塩酸試液 0.25mL（5倍希釈）
20μL／アミノ酸分析
＜酸加水分解法−２：トリプトファンを含む単離ペプチド＞
試料溶液（1mg/mL 50%メタノール溶液） 50μL
↓ Pico-Tag (Waters)を用いて減圧乾固（室温）
残留物
↓ +4mol/Lメタンスルホン酸溶液(0.2%トリプタミン含有) 20μL
↓ +水0.2mL（反応バイアル内に入れる）
↓ Pico-Tag法により加水分解(110℃、22時間)
↓ 冷後
↓ +4mol/L水酸化カリウム溶液 22μL
↓ Pico-Tag を用いて減圧乾固（室温）
残留物
↓ +0.05mol/L塩酸試液 0.25mL（5倍希釈）
20μL／アミノ酸分析
＜アミノ酸分析条件＞
（ニンヒドリン反応によるポストラベル法）
装置：L-8500形日立高速アミノ酸分析計
カラム：4.6mmID×80mm日立カスタムイオン交換樹脂（＃2622SC・LotNo.K99272）
（Na型・高分離分析・グラジエント法
緩衝液：日立高速アミノ酸分析計用緩衝液L-8500PH-KIT（三菱化学又は和光純薬社製）
V1：PH-1(PH-1 500mLにエタノール(99.5)65mL及び水を加えて1000mLとする)
V2：PH-2
V3：PH-3（未使用）
V4：PH-4
V5：PH-RG
反応液：ニンヒドリン試液-L8500セット（和光純薬社製）
流 量：緩衝液 0.26mL/分
反応液 0.30mL/分
注入量：20μL
測定波長：570nm（Pro：440nm）
(d) Measurement of constituent amino acids For fractions with an isolated amount of 2 mg or more or an ACE inhibition rate of 20% or more, the amino acid concentration was measured after acid hydrolysis to determine the constituent amino acids.
Method for measuring constituent amino acids <Acid hydrolysis method-1: isolated peptide not containing tryptophan>
Sample solution (1mg / mL 50% methanol solution) 50μL
↓ Vacuum dry using Pico-Tag (Waters) (room temperature)
Residue ↓ + 6mol / L hydrochloric acid solution (containing 1% phenol) 0.2mL (put in reaction vial)
↓ Hydrolysis by Pico-Tag method (110 ° C, 22 hours)
↓ After cooling ↓ Use Pico-Tag to dry under reduced pressure (room temperature)
Residue ↓ + 0.02mol / L Hydrochloric acid test solution 0.25mL (5-fold dilution)
20 μL / Amino acid analysis <Acid hydrolysis method-2: isolated peptide containing tryptophan>
Sample solution (1mg / mL 50% methanol solution) 50μL
↓ Vacuum dry using Pico-Tag (Waters) (room temperature)
Residue ↓ + 4mol / L methanesulfonic acid solution (containing 0.2% tryptamine) 20μL
↓ + water 0.2mL (put in reaction vial)
↓ Hydrolysis by Pico-Tag method (110 ° C, 22 hours)
↓ After cooling ↓ + 4mol / L potassium hydroxide solution 22μL
↓ Use Pico-Tag to dry under reduced pressure (room temperature)
Residue ↓ + 0.05mol / L Hydrochloric acid test solution 0.25mL (5-fold dilution)
20μL / Amino acid analysis
<Amino acid analysis conditions>
(Post-label method using ninhydrin reaction)
Equipment: Hitachi L-8500 Hitachi High-Speed Amino Acid Analyzer Column: 4.6mm ID x 80mm Hitachi Custom Ion Exchange Resin (# 2622SC / LotNo. K99272)
(Na-type, high-resolution analysis, gradient method buffer: Hitachi High-Speed Amino Acid Analyzer Buffer L-8500PH-KIT (Mitsubishi Chemical or Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
V1: PH-1 (PH-1 500mL with ethanol (99.5) 65mL and water to 1000mL)
V2: PH-2
V3: PH-3 (unused)
V4: PH-4
V5: PH-RG
Reaction solution: Ninhydrin sample solution-L8500 set (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Flow rate: Buffer 0.26mL / min Reaction solution 0.30mL / min Injection volume: 20μL
Measurement wavelength: 570nm (Pro: 440nm)
(e) アミノ酸配列の決定
ACE阻害率及び構成アミノ酸の測定結果を基に、ACE阻害活性率が高く、含有量が多いと推察され、なおかつ純度が高いペプチドについて、N-末端アミノ酸分析法（エドマン分解法）によりアミノ酸配列の解析を試みた。
エドマン分解法の操作条件
試料溶液の調製法
各試料は一定量を量りとり、それぞれに精製水を添加して溶解し、1nmol/μLとした。さらに精製水で10倍に希釈し、100pmol/μLとした。このうち、各2μL(200pmol)を用い、下記装置で測定した。
装置：プロテインシーケンサー(PPSQ-23A、SHIMADZU)
PTHアナライザー（SPD-10A、SHIMADZU)
シーケンススケジュールファイル(Standard GFD)
測定結果
ACE阻害活性率が高く、含有量が多いと推察されるペプチドについて、エドマン分解によるアミノ酸配列の解析を試みた。
その結果、構造を同定することができたのは４検体（A1〜A4）であり、HP-20の粗分画のFr４部分から３種のペプチド、Fr５部分から１種のペプチドの構造を同定することができた。
それらの構造式およびACE阻害率の測定結果より求めたACE阻害活性IC50値を、下記の表１に示す。
(e) Determination of amino acid sequence
Based on the measurement results of ACE inhibition rate and constituent amino acids, it is assumed that the ACE inhibition activity rate is high, the content is high, and the purity of the peptide is high, and the amino acid sequence of N-terminal amino acid analysis method (Edman degradation method) is used. I tried to analyze.
Operating conditions of Edman degradation method Preparation method of sample solution Each sample was weighed in a certain amount and dissolved by adding purified water to each sample to make 1 nmol / μL. Furthermore, it diluted 10 times with purified water, and was set to 100 pmol / microliter. Of these, 2 μL (200 pmol) of each was used, and measurement was performed using the following apparatus.
Equipment: Protein sequencer (PPSQ-23A, SHIMADZU)
PTH analyzer (SPD-10A, SHIMADZU)
Sequence schedule file (Standard GFD)
Measurement result
For peptides presumed to have a high ACE inhibitory activity and a high content, analysis of amino acid sequences by Edman degradation was attempted.
As a result, it was possible to identify the structures of 4 specimens (A1 to A4), and identified the structures of three peptides from the Fr4 portion and one peptide from the Fr5 portion of the HP-20 crude fraction. We were able to.
Table 1 below shows the ACE inhibitory activity IC50 values obtained from the structural formulas and the measurement results of the ACE inhibition rate.
本発明の蛋白分解物（有効成分乃至関与成分として同定された前記4個のペプチドを含む。以下、同じ）は、等電点のｐＨに調整して遊離（フリー）のタンパク質分解物として使用してもよく、または等電点より酸性側または塩基性側のｐＨに調整後、溶媒を凍結乾燥、噴霧乾燥等により除去するか、またはエタノール等の溶媒を加えて沈殿させるなどの方法により、酸付加塩（塩酸塩等の無機酸塩またはフマル酸塩等の有機酸塩）あるいは塩基塩（例えばＮａ，Ｋ等のアルカリ金属塩）の形態で取得することができる。塩基塩は、昇圧物質であるナトリウムの含量をできるだけ抑えるのが好ましい。このような蛋白分解物は、溶液の形態で使用してもよいが、通常固形物、例えば結晶、アモルファス或いは粉末の形態で単離し、使用するのが望ましい。 The proteolytic product of the present invention (including the above four peptides identified as active or involved components, the same shall apply hereinafter) is used as a free (free) proteolytic product by adjusting the pH to the isoelectric point. Or after adjusting the pH to the acidic or basic side from the isoelectric point, the solvent may be removed by freeze drying, spray drying, or the like, or precipitated by adding a solvent such as ethanol. It can be obtained in the form of an addition salt (an inorganic acid salt such as hydrochloride or an organic acid salt such as fumarate) or a base salt (for example, an alkali metal salt such as Na or K). The base salt preferably suppresses the content of sodium as a pressurizing substance as much as possible. Such a proteolysate may be used in the form of a solution, but it is usually desirable to isolate and use it in the form of a solid, for example, a crystal, amorphous or powder.
本発明の蛋白分解物はそれ自体食品として利用することができ、或いは単独で、もしくは適当な無毒性の経口摂取用担体、希釈剤または賦形剤とともに、タブレット（素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠など）、カプセル、トローチ、粉末、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、ペースト、クリーム、注射剤（アミノ酸輸液、電解質輸液等の輸液に配合する場合を含む）、或いは腸溶性の錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの徐放性製剤などの食品用もしくは医薬用の製剤にすることが可能である。前記製剤中の蛋白分解物の含有量は適宜選択が可能であるが一般に、０．０１〜１００重量％の範囲である。 The proteolytic product of the present invention can be used as a food by itself, or alone or together with a suitable non-toxic carrier for ingestion, diluent or excipient (tablet, uncoated tablet, sugar-coated tablet, effervescent tablet, Film-coated tablets, chewable tablets, etc.), capsules, troches, powders, fine granules, granules, solutions, suspensions, emulsions, pastes, creams, injections (amino acid infusions, electrolyte infusions, etc.) Or a preparation for food or medicine such as sustained release preparations such as enteric tablets, capsules and granules. The content of the proteolysate in the preparation can be appropriately selected, but is generally in the range of 0.01 to 100% by weight.
また、本発明に係る蛋白分解物（ローヤルゼリー酵素分解物）を添加・配合して調製しうる食品の具体的形態としては、例えば、飲料類（清涼飲料（コーヒー、ココア、ジュース、ミネラル飲料、茶飲料、緑茶、紅茶、烏龍茶等）、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料、酒類（日本酒、洋酒、果実酒、はちみつ酒等）等）、スプレッド（カスタードクリーム、バタークリーム、ピーナツクリーム、チョコレートクリーム、チーズクリーム等）、ペースト（フルーツペースト、野菜ペースト、ゴマペースト、海藻ペースト等）、洋菓子（チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、エクレア、マフィン、ワッフル、ガム、グミ、ゼリー、キャンデー、クッキー、クラッカー、ビスケット、スナック菓子、ケーキ、プリン等）、和菓子（飴、煎餅、かりんとう、あられ、団子、おはぎ、大福、豆もち、餅、餡、饅頭、カステラ、あんみつ、羊かん等）、氷菓（アイスクリーム、アイスキャンディ、シャーベット、かき氷等）、レトルト食品（カレー、牛丼、中華丼、雑炊、おかゆ、味噌汁、スープ、ミートソース、デミグラスソース、ミートボール、ハンバーグ、おでん種、赤飯、焼き鳥、茶碗蒸し等）、即席食品（即席ラーメン、即席うどん、即席そば、即席焼きそば、即席スパゲティ、即席ワンタン麺、即席しるこ、味噌汁の素、粉末スープの素、粉末ジュースの素、ホットケーキミックス等）、瓶詰・缶詰、ゼリー状食品（ゼリー、寒天、テリーヌ、ゼリー状飲料等）、調味料（食塩、天然塩、醤油、みりん、酢、砂糖、蜂蜜、味噌、ドレッシング、旨味調味料、複合調味料、ソース、マヨネーズ、ケチャップ、ふりかけ、天つゆ、麺つゆ、だしの素、中華スープの素、中華の素（麻婆豆腐の素、チンジャオロースの素）、ブイヨン、焼肉のたれ、冷しゃぶのたれ、カレールー、シチューのルー等）、養蜂産品（はちみつ、ローヤルゼリー、プロポリス、花粉荷（花粉だんご）、蜂の子等）、乳製品（牛乳、チーズ、ヨーグルト、生クリーム等）、加工果実（ジャム、マーマレード、シロップ漬、干し果実等）、加工野菜（野菜ジャム等）、穀類加工食品（麺、パスタ、パン、ビーフン等）、漬物（たくあん、奈良漬、キムチ漬、福神漬、らっきょう漬、白菜漬、からし漬、しば漬、浅漬け、ピクルス等）、漬物の素（即席漬けのもと、キムチ漬のもと等）、魚肉製品（かまぼこ、ちくわ、はんぺん等）、畜肉製品（ハム、ソーセージ、サラミ、ベーコン等）、珍味（さきするめ、さきタラ、ウニの塩辛、イカの塩辛、タコの塩辛、カワハギのみりんぼし、フグのみりんぼし、イカの薫製、コノワタの塩漬等）、乾物（味付け海苔等）、惣菜類（あえもの、揚げ物、炒め物、焼き物、煮物、酢の物等）、冷凍食品（エビフライ、コロッケ、春巻き、とんかつ、シューマイ、餃子、ハンバーグ、たこ焼き、今川焼き（回転焼き）、肉まん、あんまん等）、油脂食品（サラダオイル、マーガリン、バター）等を挙げることができる。本発明のローヤルゼリー蛋白分解物を添加・配合して調製しうる食品としては、いわゆる健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、特定保健用食品、病者用食品・病者用組合わせ食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）又は高齢者用食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）としてもよく、その場合であれば、素錠、フィルムコート錠、糖衣錠、顆粒、粉末、タブレット、カプセル（ハードカプセルとソフトカプセルとのいずれも含む。）、チュアブルタイプ、シロップタイプ、ドリンクタイプ等とすることもできる。本発明に係るローヤルゼリー酵素分解物を添加・配合した食品の調製は、それ自体公知の方法で行うことができる。 Specific examples of foods that can be prepared by adding and blending the protein degradation product (royal jelly enzyme degradation product) according to the present invention include, for example, beverages (soft drinks (coffee, cocoa, juice, mineral beverages, tea Beverages, green tea, black tea, oolong tea, etc.), milk drinks, lactic acid bacteria drinks, yogurt drinks, carbonated drinks, alcoholic beverages (sake, western liquor, fruit liquor, honey liquor, etc.), spreads (custard cream, butter cream, peanut cream, chocolate) Cream, cheese cream, etc.), paste (fruit paste, vegetable paste, sesame paste, seaweed paste, etc.), pastry (chocolate, donut, pie, cream puff, eclair, muffin, waffle, gum, gummy, jelly, candy, cookies, crackers , Biscuits, snacks, cakes, puddings, etc.) Japanese sweets (rice cakes, rice crackers, karinto, arabe, dumplings, rice cakes, daifuku, bean glutinous rice cakes, rice cakes, buns, castella, anmitsu, sheep kan, etc.), ice confectionery (ice cream, ice candy, sorbet, shaved ice, etc.), retort food ( Curry, beef bowl, Chinese rice bowl, miso soup, rice porridge, miso soup, soup, meat sauce, demiglace sauce, meatball, hamburger, oden seeds, red rice, yakitori, steamed rice bowl, etc.) , Instant spaghetti, instant wonton noodles, instant shirako, miso soup, powdered soup, powdered juice, hot cake mix, etc.), bottled / canned, jelly-like foods (jelly, agar, terrine, jelly-like beverages, etc.) , Seasoning (salt, natural salt, soy sauce, mirin, vinegar, sugar, honey, miso, dressing, umami seasoning , Complex seasoning, sauce, mayonnaise, ketchup, sprinkle, tentsuyu, noodle soup, dashi soup, Chinese soup base, Chinese soup base (meat tofu base, chinjaoulose base), bouillon, grilled meat sauce, cold shabu Soy sauce, curry roux, stew roux, etc.), beekeeping products (honey, royal jelly, propolis, pollen cargo (pollen dango), bees, etc.), dairy products (milk, cheese, yogurt, fresh cream, etc.), processed fruits ( Jam, marmalade, pickled syrup, dried fruits, etc.), processed vegetables (vegetable jam, etc.), processed cereals (noodles, pasta, bread, rice noodles, etc.), pickles (takuan, Nara pickled, kimchi pickled, fukujin pickled, ryakyoko pickled, Chinese cabbage) Pickles, mustard pickles, shiba pickles, shallow pickles, pickles, etc.), pickles (immediate pickles, kimchi pickles, etc.), fish products (kamaboko, chikuwa, hanpen, etc.) ), Livestock products (ham, sausage, salami, bacon, etc.), delicacies (sakisume, saki cod, sea urchin salt, squid salty, octopus salty, scallops, puffed fish, smoked squid ), Dried food (seasoned seaweed, etc.), side dishes (seafood, fried food, fried food, grilled food, boiled food, vinegared food, etc.), frozen food (fried shrimp, croquette, spring roll, tonkatsu, shumai, dumplings, hamburger steak) , Takoyaki, Imagawa-yaki (rotary roasting), meat buns, buns, etc.), fat and oil foods (salad oil, margarine, butter) and the like. Foods that can be prepared by adding and blending the royal jelly proteolysate of the present invention include so-called health foods, functional foods, dietary supplements, supplements, foods for specified health use, combined foods for the sick and the sick. (Ministry of Health, Labor and Welfare, special-purpose food) or elderly food (Ministry of Health, Labor and Welfare, special-purpose food). In that case, uncoated tablets, film-coated tablets, sugar-coated tablets, granules, powders, tablets, Capsule (including both hard capsule and soft capsule), chewable type, syrup type, drink type and the like can also be used. Preparation of the food which added and mix | blended the royal jelly enzyme degradation product based on this invention can be performed by a publicly known method.
本発明の蛋白分解物を含む特定保健用食品等の食品は、血圧が正常高値（収縮期血圧が１３０−１３９ｍｍＨｇ、拡張期血圧が８５−８９ｍｍＨｇ）及び軽症高血圧（収縮期血圧１４０−１５９ｍｍＨｇないし拡張期血圧９０−９９ｍｍＨｇ）の両方のヒトに対して高血圧を予防する効果を有する。 Foods such as foods for specified health use containing the protein degradation product of the present invention have normal high blood pressure (systolic blood pressure is 130-139 mmHg, diastolic blood pressure is 85-89 mmHg) and mild hypertension (systolic blood pressure 140-159 mmHg or dilated). It has the effect of preventing hypertension for both humans with a blood pressure of 90-99 mmHg.
本発明の蛋白分解物は、軽症高血圧及び正常高値の被験者には、特に有効に降圧作用を示すが、正常ないし低血圧の被験者の血圧に対してはほとんど影響しないか、マイルドな作用しか示さないという理想的な特性を有している。 The proteolysate of the present invention exhibits an effective antihypertensive effect particularly in subjects with mild hypertension and normal high levels, but has little or no effect on the blood pressure of normal to low blood pressure subjects. It has the ideal characteristics.
本発明の蛋白分解物は、経口摂取により口腔粘膜或いは小腸から直接吸収されるか、胃腸管で加水分解を受けて吸収された後で強力で持続的なＡＣＥ阻害作用を示し、高血圧症の予防、高血圧傾向の緩和または血圧調節を目的として、継続的に摂取することが可能であり、高血圧予防のための機能性食品、特に特定保健用食品等として有用である。この目的に本発明の蛋白分解物ないし製剤を用いる場合、一般的に体重６０ｋｇの成人では、１日あたり１０mg〜１０ｇ、好ましくは０．１〜５ｇ、より好ましくは０．５〜３ｇ、特に０．５〜１ｇの範囲で経口摂取する。 The proteolytic product of the present invention is absorbed directly from the oral mucosa or small intestine by oral ingestion, or shows a strong and sustained ACE inhibitory action after being hydrolyzed and absorbed in the gastrointestinal tract, thereby preventing hypertension. It can be ingested continuously for the purpose of alleviating the tendency of hypertension or regulating blood pressure, and is useful as a functional food for preventing hypertension, particularly a food for specified health use. When the proteolysate or preparation of the present invention is used for this purpose, it is generally 10 mg to 10 g per day, preferably 0.1 to 5 g, more preferably 0.5 to 3 g, especially 0 for an adult weighing 60 kg. Ingested in the range of 5 to 1 g.
また、本発明の蛋白分解物をローヤルゼリー、プロポリス、蜂蜜、花粉、蜂の子等と併用もしくは混合して使用することも可能である。 In addition, the proteolysate of the present invention can be used in combination with or mixed with royal jelly, propolis, honey, pollen, honey, etc.
本発明の蛋白分解物は、アレルギー反応などの副作用をほとんど或いは全く有しないこと、作用持続時間が長く、１日１回の摂取（投与）で十分な降圧作用が期待できる。さらに、即効性も有するが、急速な血圧低下や、多量に飲用した場合の大きな血圧低下はなく、安全性の高い降圧作用を有している。また、ヒトにおける降圧作用が優れている。 The proteolysate of the present invention has little or no side effects such as allergic reactions, has a long duration of action, and can be expected to have a sufficient antihypertensive action when taken (administered) once a day. Furthermore, although it has an immediate effect, it does not cause a rapid decrease in blood pressure or a large decrease in blood pressure when swallowed in large quantities, and has a highly safe antihypertensive action. In addition, the antihypertensive action in humans is excellent.
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
実施例１
エタノールを加えて沈殿したローヤルゼリーのエタノール変性タンパク質1gを用いてブタトリプシン250mgを添加し、pＨ8.0で24時間処理した。反応終了後、100℃で10分加熱して酵素失活させた。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
Example 1
250 mg of porcine trypsin was added using 1 g of ethanol-denatured protein of royal jelly precipitated by adding ethanol and treated with pH 8.0 for 24 hours. After completion of the reaction, the enzyme was inactivated by heating at 100 ° C. for 10 minutes.
この反応液をｐＨ４．５に調整し、合成吸着剤(セパビーズSP-70（三菱化学製）)にかけ、水洗して塩化ナトリウム及び酸性又は塩基性の遊離アミノ酸、および糖類等を除去した後、エタノールで溶出し、脱塩した本発明の蛋白分解物を得た。 The reaction solution was adjusted to pH 4.5, applied to a synthetic adsorbent (Separbeads SP-70 (Mitsubishi Chemical)), washed with water to remove sodium chloride, acidic or basic free amino acids, saccharides, etc., and then ethanol. To obtain a protein degradation product of the present invention which was eluted and desalted.
脱塩後の蛋白分解物は、塩基性遊離アミノ酸、酸性遊離アミノ酸、アルコール性遊離アミノ酸、遊離Ａｌａ、遊離Ｇｌｙを実質的に含まないものであり、数１に従いLysの残存率を計算すると約４５％、数2に従いLeuの含有割合（モル基準）を計算すると、約2．3倍であった。また、糖分の含有量は35重量％以下であり、アルミニウムの袋に入れて40℃、６ヶ月の加速試験でも変色しないことが明らかになった。 The proteolytic product after desalting is substantially free of basic free amino acid, acidic free amino acid, alcoholic free amino acid, free Ala, and free Gly. When the residual ratio of Lys is calculated according to Equation 1, it is about 45. %, The content ratio of Leu (based on mole) according to the number 2 was calculated to be about 2.3 times. In addition, it was revealed that the sugar content was 35% by weight or less, and it was not discolored even in an accelerated test at 40 ° C. for 6 months in an aluminum bag.
さらに、２４時間処理したブタトリプシン分解物25mgを取り、移動相２０mLを加えて超音波処理して溶かし正確に２５mLとし、その１０μLにつき下記のゲル濾過クロマトグラフィー（GFC）分析を行い、分子量分布を調査した。 Furthermore, 25 mg of porcine trypsin degradation product treated for 24 hours was taken, 20 mL of mobile phase was added and sonicated to dissolve to 25 mL accurately, and the gel filtration chromatography (GFC) analysis described below was performed on 10 μL of the molecular weight distribution. investigated.
＜GFC分析＞
カラム：TSKgel G2000SWXL7.8mmI.D.×30cm
移動相：0.1%TFA/アセトニトリル
流速：1.0mL/分
カラム温度：２５℃
検出：UV(220nm)
GFC分析結果を図１に示す。
<GFC analysis>
Column: TSKgel G2000SW XL 7.8mmI.D. × 30cm
Mobile phase: 0.1% TFA / acetonitrile flow rate: 1.0 mL / min Column temperature: 25 ° C
Detection: UV (220nm)
The GFC analysis results are shown in FIG.
実施例２：ローヤルゼリー（ＲＪ）蛋白加水分解物の関与成分の構造解析
ローヤルゼリーのエタノール変性蛋白100gを採取し、pH8.0でブタトリプシン（Novozyme製のブタ由来トリプシン）により37℃で24時間酵素分解した。反応液を沸騰水浴中で３０分間加熱して酵素を失活させた後、塩酸でpH4.5に調整し、遠心分離(10000rpm、20分間)して得られた上清をメンブランフィルター（0.8μm）で濾過し、ＲＪ蛋白加水分解物1160mLを得た。
Example 2: Structural analysis of components involved in royal jelly (RJ) protein hydrolyzate 100 g of ethanol-denatured protein of royal jelly was collected and enzymatically digested at 37 ° C with porcine trypsin (porcine trypsin from Novozyme) at pH 8.0. did. The reaction solution was heated in a boiling water bath for 30 minutes to inactivate the enzyme, adjusted to pH 4.5 with hydrochloric acid, and centrifuged (10000 rpm, 20 minutes) to obtain a supernatant obtained from a membrane filter (0.8 μm). ) To obtain 1160 mL of RJ protein hydrolyzate.
得られたＲＪ蛋白加水分解液を上記スキーム１に従い、ダイヤイオンHP20を使用し、水、20%、40%、60%、80%メタノール及びメタノール（100%）で溶出して、フラクション１(Fr1)〜フラクション７(Fr７)を得た。
次に、フラクション３〜６より同定された４個の関与成分（ペプチド）の単離と同定の詳細を以下に示す：
ローヤルゼリー蛋白加水分解物の関与成分の単離・同定
1. 単離同定ペプチド
HP20 Fr 4画分
単離ペプチドA1：Thr-Ser-Asn-Thr-Phe
単離ペプチドA2：Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr
単離ペプチドA3：Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr
HP20 Fr ５画分
単離ペプチドA4：Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg
2. 関与成分同定用検体の調製
（1）ローヤルゼリー蛋白加水分解物の調製
ローヤルゼリーエタノール変性蛋白100gに水1200ｍLを加え，37℃の水浴中で撹拌しながら20％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐH8.0に調整し，ブタトリプシン250mgを加えて37℃で24時間酵素分解した後，沸騰水浴中で30分間加熱した。これに薄めた塩酸を加えてｐH4.5に調整し，遠心分離（10000rpm，20分間）した後，得られた上清液をメンブランフィルターでろ過し，ローヤルゼリー蛋白加水分解液1160mLを得た。
The obtained RJ protein hydrolyzate was eluted with water, 20%, 40%, 60%, 80% methanol and methanol (100%) using Diaion HP20 according to Scheme 1 above, and fraction 1 (Fr1 ) To Fraction 7 (Fr7).
Next, details of the isolation and identification of the four participating components (peptides) identified from fractions 3-6 are shown below:
Isolation and identification of components involved in royal jelly protein hydrolyzate
1. Isolated identification peptide
HP20 Fr 4 fraction isolated peptide A1: Thr-Ser-Asn-Thr-Phe
Isolated peptide A2: Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr
Isolated peptide A3: Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr
HP20 Fr 5 fraction isolated peptide A4: Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg
2. Preparation of specimens for identification of participating components (1) Preparation of royal jelly
（2）ダイヤイオンHP20による粗分画
ローヤルゼリー蛋白加水分解液855mLを合成吸着剤であるダイヤイオンHP20を充填したガラスカラム（11cmφ×20cm，容量：約1.9L）に負荷し，水，20％，40％，60％，80％及び100%メタノールの順で溶出し，水溶出画分をフラクション（以下Fr）1，2とし，20％，40％，60％，80％及び100%メタノール溶出画分をそれぞれFr3，4，5，6及び7とした。各分画液をエバポレーターで濃縮した後，凍結乾燥し，得られた Fr4画分およびFr5画分を関与成分同定用の検体とした。
(2) Coarse fractionation with Diaion HP20 Load 855 mL of royal jelly protein hydrolyzate onto a glass column (11 cmφ x 20 cm, capacity: approx. 1.9 L) filled with Diaion HP20, a synthetic adsorbent, and add 20% water, Elution is performed in the order of 40%, 60%, 80% and 100% methanol, and the fraction eluted with water (hereinafter referred to as Fr) 1 and 2 is eluted with 20%, 40%, 60%, 80% and 100% methanol. Minutes were Fr3, 4, 5, 6 and 7, respectively. Each fraction was concentrated with an evaporator and then lyophilized. The obtained Fr4 and Fr5 fractions were used as specimens for identifying the components involved.
3. ローヤルゼリー蛋白加水分解物の関与ペプチドの単離・同定
（1）Fr４画分からの関与ペプチドの単離・同定
単離ペプチドA1：Thr-Ser-Asn-Thr-Phe
HP20により粗分画したFr4画分約5gについて，大口径の分取用ODSカラムを用いた高速液体クロマトグラフ法〔カラム：TSK-gel ODS 120T（55mmφ×300mm），移動相：10％及び50%アセトニトリル（0.05％TFA含有），流量：42mL/分，カラム温度：室温，検出波長：UV 220nm．以下，HPLC〕により再分画を行った。
3. Isolation and identification of peptides involved in royal jelly protein hydrolyzate (1) Isolation and identification of peptides involved from Fr4 fraction Isolated peptide A1: Thr-Ser-Asn-Thr-Phe
About 5 g of Fr4 fraction roughly fractionated by HP20, high-performance liquid chromatography using a large-diameter preparative ODS column [column: TSK-gel ODS 120T (55 mmφ × 300 mm), mobile phase: 10% and 50 % Acetonitrile (containing 0.05% TFA), flow rate: 42 mL / min, column temperature: room temperature, detection wavelength: UV 220 nm. The following fractionation was performed by HPLC].
得られた各分画液を濃縮・凍結乾燥してP4(1),, P4(2)(0.536g), P4(3), P4(4)(凍結乾燥を行わず、濃縮後、ペプチド-A3の単離に供した)を得た。 Each fraction obtained was concentrated and freeze-dried to obtain P4 (1), P4 (2) (0.536g), P4 (3), P4 (4) (without lyophilization, after concentration, peptide- A3 was subjected to isolation).
P4(2)(0.536g)について、再度、大口径の分取用ODSカラムを用い、移動相として8％及び50%アセトニトリル（0.05％TFA含有）を用いて7分画に再分画し、各分画液を濃縮・凍結乾燥し、P4012-11〜P40121-13、P4012-14(95.4mg)、P4012-15(44.5mg)、P4012-16及びP4012-17を得た。 For P4 (2) (0.536 g), again using a large-diameter preparative ODS column, re-fractionation into 7 fractions using 8% and 50% acetonitrile (containing 0.05% TFA) as the mobile phase, Each fraction was concentrated and freeze-dried to obtain P4012-11 to P40121-13, P4012-14 (95.4 mg), P4012-15 (44.5 mg), P4012-16 and P4012-17.
P4012-14(95.4mg)について，さらに，中口径のセミ分取用ODSカラムにより、分取・精製を行った。カラムにCOSMOSIL 5C18 AR-II 20mmφ×250mmを用い，移動相：12.5％及び50%メタノール（0.05％TFA含有）、流量：8mL/分，カラム温度：40℃，検出波長：UV220nmの条件下で，6分画に再分画し、各分画液を濃縮・凍結乾燥し、P40409-1、P40409-2、P40409-3(26.7mg)及びP40409-4〜P40409-6を得た。 P4012-14 (95.4 mg) was further fractionated and purified using a medium-diameter semi-preparative ODS column. Using COSMOSIL 5C18 AR-II 20mmφ × 250mm as the column, mobile phase: 12.5% and 50% methanol (containing 0.05% TFA), flow rate: 8mL / min, column temperature: 40 ° C, detection wavelength: UV220nm, Fractions were re-fractionated, and each fraction was concentrated and freeze-dried to obtain P40409-1, P40409-2, P40409-3 (26.7 mg) and P40409-4 to P40409-6.
得られたP40409-3(26.7mg)について，再度、中口径のセミ分取用ODSカラムにより、分取・精製を行った。移動相Aに0.05％TFA、移動相Bに50%メタノール（0.05％TFA含有）を用いた濃度勾配法(0分：B 10%→360分：B 100%)により、保持時間69.7分〜76.3分のピーク部分を分取し、得られた分画液を濃縮・凍結乾燥し、P40409-3-1(8.6mg)を得た。 The obtained P40409-3 (26.7 mg) was again fractionated and purified using a medium-diameter semi-preparative ODS column. Retention time 69.7 min-76.3 by concentration gradient method (0 min: B 10% → 360 min: B 100%) using 0.05% TFA for mobile phase A and 50% methanol (containing 0.05% TFA) for mobile phase B Was collected, and the obtained fraction was concentrated and freeze-dried to obtain P40409-3-1 (8.6 mg).
得られたP40409-3-1について、HPLCによる純度の測定，並びに酸加水分解後のアミノ酸分析による構成アミノ酸の測定を実施した後、エドマン分解によるN末端アミノ酸配列分析法により、P40409-3-1(A1)の構造をThr-Ser-Asn-Thr-Pheと決定した。 About the obtained P40409-3-1, after measuring the purity by HPLC and measuring the constituent amino acids by amino acid analysis after acid hydrolysis, P40409-3-1 was analyzed by N-terminal amino acid sequence analysis by Edman degradation. The structure of (A1) was determined as Thr-Ser-Asn-Thr-Phe.
単離ペプチドA2：Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr
先の大口径の分取用ODSカラムによる再分画操作を二回実施して得られたP4012-15(44.5mg)について、さらに、中口径のセミ分取用ODSカラムにより分取・精製を行った。移動相に12.5％メタノール（0.05％TFA含有）を用い、保持時間95.5分〜103.4分のピーク部分を分取し、得られた分画液を濃縮・凍結乾燥し、P40410-4(6.1mg)を得た。
Isolated peptide A2: Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr
The P4012-15 (44.5 mg) obtained by performing the re-fractionation operation twice with the large-diameter preparative ODS column was further subjected to fractionation and purification with a medium-diameter semi-preparative ODS column. went. Using 12.5% methanol (containing 0.05% TFA) as the mobile phase, the peak part with a retention time of 95.5 minutes to 103.4 minutes was collected, and the obtained fraction was concentrated and lyophilized to obtain P40410-4 (6.1 mg) Got.
得られたP40410-4について、HPLCによる純度の測定，並びに酸加水分解後のアミノ酸分析による構成アミノ酸の測定を実施した後、エドマン分解によるN末端アミノ酸配列分析法により、P40410-4(A2)の構造をTyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thrと決定した。 About the obtained P40410-4, after measuring the purity by HPLC and measuring the constituent amino acids by amino acid analysis after acid hydrolysis, by the N-terminal amino acid sequence analysis by Edman degradation, P40410-4 (A2) The structure was determined to be Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr.
単離ペプチドA3：Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr
大口径の分取用ODSカラムによる再分画で得られたP4(4)について、再度、大口径の分取用ODSカラムを用い、同一条件下で6分画に分画し、各分画液を濃縮・凍結乾燥し、P41206-3、P41206-4(177.8mg)及びP41206-5〜P41206-8を得た。
Isolated peptide A3: Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr
For P4 (4) obtained by re-fractionation using a large-diameter preparative ODS column, again using a large-diameter preparative ODS column, fractionated into 6 fractions under the same conditions. The liquid was concentrated and freeze-dried to obtain P41206-3, P41206-4 (177.8 mg) and P41206-5 to P41206-8.
P41206-4(177.8mg)の100mgについて，さらに，中口径のセミ分取用ODSカラムにより、分取・精製を行った。移動相に12.5％及び50%メタノール（0.05％TFA含有）を用い、流量：7.6mL/分，カラム温度：40℃，検出波長：UV220nmの条件下で分取し、得られた分画液を濃縮・凍結乾燥し、P41219-2、P41219-3(11.12mg)及びP41219-4を得た。 About 100 mg of P41206-4 (177.8 mg), it was further separated and purified using a semi-preparative ODS column with a medium diameter. Using 12.5% and 50% methanol (containing 0.05% TFA) as the mobile phase, fractionation was performed under the conditions of flow rate: 7.6 mL / min, column temperature: 40 ° C., detection wavelength: UV 220 nm. Concentration and lyophilization gave P41219-2, P41219-3 (11.12 mg) and P41219-4.
得られたP41219-3(11.12mg)について、再度、中口径のセミ分取用ODSカラムにより、分取・精製を行った。移動相に17.5％メタノール（0.05％TFA含有）を用い、保持時間63.5分〜70.6分のピーク部分を分取し、得られた分画液を濃縮・凍結乾燥し、P41219-3-2(5.25mg)を得た。 The obtained P41219-3 (11.12 mg) was again subjected to separation and purification using a medium-diameter semi-preparative ODS column. Using 17.5% methanol (containing 0.05% TFA) as the mobile phase, the peak portion with a retention time of 63.5 minutes to 70.6 minutes was collected, and the obtained fraction was concentrated and lyophilized to obtain P41219-3-2 (5.25 mg).
得られたP41219-3-2について、HPLCによる純度の測定，並びに酸加水分解後のアミノ酸分析による構成アミノ酸の測定を実施した後、エドマン分解によるN末端アミノ酸配列分析法により、P41219-3-2 (A3)の構造をThr-Asn-Asn-Leu-Tyrと決定した。 The obtained P41219-3-2 was subjected to measurement of purity by HPLC, and measurement of constituent amino acids by amino acid analysis after acid hydrolysis, and then P41219-3-2 by N-terminal amino acid sequence analysis by Edman degradation. The structure of (A3) was determined as Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr.
（２）Fr５画分からの関与ペプチドの単離・同定
単離ペプチドA4：Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg
HP20により粗分画したFr５画分約5gについて，大口径の分取用ODSカラムを用いた高速液体クロマトグラフ法〔カラム：TSK-gel ODS 120T（55mmφ×300mm），移動相：15%,20%及び50%アセトニトリル（0.05％TFA含有），流量：42mL/分，カラム温度：室温，検出波長：UV 220nm〕により再分画を行った。
(2) Isolation and identification of participating peptides from Fr5 fraction Isolated peptide A4: Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg
About 5g of Fr5 fraction roughly fractionated by HP20, high-performance liquid chromatography using a large-diameter preparative ODS column [column: TSK-gel ODS 120T (55mmφ × 300mm), mobile phase: 15%, 20 % And 50% acetonitrile (containing 0.05% TFA), flow rate: 42 mL / min, column temperature: room temperature, detection wavelength: UV 220 nm].
得られた各分画液を濃縮・凍結乾燥してP5(1)〜P5(5)、P5(6)(0.379g)及びP5(7)〜P5(9)を得た。 The obtained fractions were concentrated and freeze-dried to obtain P5 (1) to P5 (5), P5 (6) (0.379 g) and P5 (7) to P5 (9).
P5(6)(0.379g)について、さらに、中口径のセミ分取用ODSカラムにより、分取・精製を行った。移動相Aに0.05％TFA、移動相Bに50%メタノール（0.05％TFA含有）を用いた濃度勾配法(0分：B 45%→240分：B 100%)により、流量：8mL/分，カラム温度：40℃，検出波長：UV220nmの条件下で，13分画に再分画し、各分画液を濃縮・凍結乾燥し、P5(vi)-1、P5(vi)-2、P5(vi)-3(20.3mg)及びP5(vi)-4〜P5(vi)-13を得た。 P5 (6) (0.379 g) was further fractionated and purified using a medium-diameter semi-preparative ODS column. Flow rate: 8 mL / min by concentration gradient method (0 min: B 45% → 240 min: B 100%) using 0.05% TFA for mobile phase A and 50% methanol (containing 0.05% TFA) for mobile phase B Re-fractionate into 13 fractions under the conditions of column temperature: 40 ° C and detection wavelength: UV220nm, and concentrate and freeze-dry each fraction. P5 (vi) -1, P5 (vi) -2, P5 (vi) -3 (20.3 mg) and P5 (vi) -4 to P5 (vi) -13 were obtained.
得られたP5(vi)-3(20.3mg)について，さらに，口径の小さいODSカラムにより、分取・精製を行った。カラムにCOSMOSIL 5C18 AR-II 10mmφ×250mmを用い，移動相：25％メタノール（0.05％TFA含有）、流量：2mL/分，カラム温度：40℃，検出波長：UV220nmの条件下で，保持時間41.7分〜46.3分のピーク部分を分取し、得られた分画液を濃縮・凍結乾燥し、P5(vi)-3-2 (5.3mg)を得た。 The obtained P5 (vi) -3 (20.3 mg) was further fractionated and purified using an ODS column having a small diameter. COSMOSIL 5C18 AR-II 10mmφ × 250mm is used for the column, mobile phase: 25% methanol (containing 0.05% TFA), flow rate: 2mL / min, column temperature: 40 ° C, detection wavelength: UV 220nm, retention time 41.7 The peak portion from min to 46.3 min was collected, and the obtained fraction was concentrated and lyophilized to obtain P5 (vi) -3-2 (5.3 mg).
得られたP5(vi)-3-2について， HPLCによる純度の測定，並びに酸加水分解後のアミノ酸分析による構成アミノ酸の測定を実施した後、エドマン分解によるN末端アミノ酸配列分析法により、P5(vi)-3-2(A4)の構造をVal-Pro-Ile-Phe-Asp-Argと決定した。
実施例３；蛋白分解物の臨床試験
実施例１と同様にしてＲＪエタノール変性蛋白のブタトリプシン分解物(本発明の4つの新規ペプチドを含む)を得、これを上記スキーム１に従い、ダイヤイオンHP20に吸着後、水洗してフラクション１と２を除き、次に８０％エタノールで溶出してフラクション３〜６を含む本発明の蛋白分解物を調製し、以下の実験に供した。
After measuring the purity of the obtained P5 (vi) -3-2 by HPLC and the measurement of constituent amino acids by amino acid analysis after acid hydrolysis, P5 (vi) was determined by N-terminal amino acid sequence analysis by Edman degradation. The structure of vi) -3-2 (A4) was determined as Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg.
Example 3; Clinical test of proteolysate In the same manner as in Example 1, an RJ ethanol-denatured protein porcine trypsin hydrolyzate (including four novel peptides of the present invention) was obtained. After adsorbing, the protein was washed with water to remove fractions 1 and 2, and then eluted with 80% ethanol to prepare the proteolysate of the present invention containing fractions 3 to 6, and subjected to the following experiment.
得られたローヤルゼリータンパク質加水分解物（RJPH）含有錠の長期間摂取による血圧降下作用と安全性を検討するために、血圧が高めの人（正常高値血圧者および軽症高血圧者でいずれも未治療）に対してプラセボを対照とした二重盲検試験を実施した。被験者を、性別、年齢、収縮期血圧、拡張期血圧、脈拍数、体重、BMIに差がないように、被験食群（男/女＝26/28、平均年齢49.7±11.2、収縮期血圧140.1±6.9 mmHg、拡張期血圧81.7±7.1 mmHg）とプラセボ群（男/女＝24/29、平均年齢52.6±10.5、収縮期血圧140.5±6.6 mmHg、拡張期血圧83.0±7.8 mmHg）に分け、被験食群にはRJPHを含有する錠剤（250 mg/錠）を1日4錠（RJPH 1000 mg/day）、プラセボ群にはRJPHを含有しない錠剤を1日4錠、それぞれ1日1回、12週間連続で摂取させた。 To examine the blood pressure lowering effect and safety of long-term ingestion of the tablets containing the royal jelly protein hydrolyzate (RJPH) obtained, people with high blood pressure (both normal high blood pressure and mild hypertensive patients are not treated) A double-blind study was conducted with placebo as the control. Test subjects (male / female = 26/28, mean age 49.7 ± 11.2, systolic blood pressure 140.1 so that there is no difference in gender, age, systolic blood pressure, diastolic blood pressure, pulse rate, body weight, BMI Divided into ± 6.9 mmHg, diastolic blood pressure 81.7 ± 7.1 mmHg) and placebo group (male / female = 24/29, mean age 52.6 ± 10.5, systolic blood pressure 140.5 ± 6.6 mmHg, diastolic blood pressure 83.0 ± 7.8 mmHg) In the diet group, tablets containing RJPH (250 mg / tablet) 4 tablets a day (RJPH 1000 mg / day), and in the placebo group, 4 tablets daily without RJPH, once daily, 12 Ingested continuously for a week.
その結果は、下表に示すように、収縮期血圧および拡張期血圧においては、被験食群は、10、12週間後にプラセボ群に対して有意な降圧作用を示し顕著な低下を示した。また、12週間の摂取を終えた観察期間4週後に血圧は穏やかにプラセボ群と同程度に復帰し、摂取前値を過度に超えるようなリバウンド現象は認められなかった。 As a result, as shown in the table below, in the systolic blood pressure and the diastolic blood pressure, the test food group exhibited a significant antihypertensive effect on the placebo group after 10 and 12 weeks and showed a marked decrease. In addition, blood pressure gently returned to the same level as in the placebo group 4 weeks after the 12-week intake period, and there was no rebound phenomenon that exceeded the pre-intake value.
また、摂取期間中、試験食に起因すると考えられる血液および尿検査値の変動や、ACE阻害剤で報告されている空咳などの有害事象は認められなかった。 During the intake period, there were no adverse events such as fluctuations in blood and urine test values that were attributed to the test meal, and dry cough reported with ACE inhibitors.
以上から、RJPH含有食品は12週間の長期投与においても安全性が高く、正常高値血圧者および軽症高血圧者に対して適度な降圧作用を有することが明らかとなった。 From the above, it became clear that RJPH-containing foods are highly safe even after long-term administration for 12 weeks, and have an appropriate antihypertensive effect on normal high blood pressure and mild hypertensives.
以下に、本発明の蛋白分解物を含む処方例を示す。
処方例１（粒）
下記の原料を常法により混合し、打錠機器で成型して、８ｍｍ径の素錠を製造した。この素錠を常法により食品用にフィルムコートして、粒状の健康食品を完成した。
（１粒当たりの組成）
Below, the formulation example containing the protein degradation product of this invention is shown.
Formulation Example 1 (grain)
The following raw materials were mixed by a conventional method and molded with a tableting machine to produce an 8 mm diameter uncoated tablet. This uncoated tablet was film-coated for food by a conventional method to complete a granular health food.
(Composition per grain)
処方例２（ドリンク）
下記の材料を水に十分攪拌後、全量を１００ｍｌとした。
（１本分の組成）
Formulation Example 2 (Drink)
After thoroughly stirring the following materials in water, the total amount was 100 ml.
(Composition for one bottle)
処方例３（カプセル剤）
下記の材料を均一に混合し、６０メッシュのふるいを通した後、この粉末全量を２号ゼラチンカプセルに充填した。
（１カプセル剤の組成）
Formulation Example 3 (Capsule)
The following ingredients were uniformly mixed, passed through a 60 mesh sieve, and the whole powder was filled into a No. 2 gelatin capsule.
(Composition of one capsule)
処方例４（顆粒）
下記の材料を常法に従い顆粒状にし、スティック状のアルミ分包とした。
（１本分の組成）
Formulation Example 4 (Granule)
The following materials were granulated according to a conventional method to obtain sticky aluminum sachets.
(Composition for one bottle)
処方例５（ソース）
下記の材料を十分に混合し、使用時に十分攪拌してサラダやフライに用いた。
（１人分の組成）
Formulation example 5 (source)
The following ingredients were mixed thoroughly and stirred well at the time of use, and used for salads and fries.
(Composition for one person)
Claims (26)
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。 A proteolytic product having an angiotensin converting enzyme inhibitory action obtained by treating a royal jelly material with trypsin, and comprising at least one of the following four peptides:
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe;
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr;
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr;
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg.
・スチレン・ジビニルベンゼン共重合体の特性
粒度分布；30μm
細孔径；250Å
官能基；なし
適用pH範囲：全領域。
・関与成分含量（%）＝A1／AT×100
T1：トリプトファンの保持時間
T2：10-ハイドロキシ-δ-2-デセン酸の保持時間
A1：T1の溶出位置に検出されるピークの後ろから，T2の溶出位置に検出されるピークの前までのピーク面積の合計
AT：全てのピーク面積の合計。 When the proteolysate is passed through a column (4.6 mmφ × 150 mm) of a styrene / divinylbenzene copolymer having the following characteristics, the content (%) of the component concerned represented by the following formula is 40% or more: Proteolytic product according to any one of 1 to 10-Characteristics of styrene / divinylbenzene copolymer Particle size distribution: 30 μm
Pore diameter: 250mm
Functional group; none Applicable pH range: Full range.
And involvement ingredient content (%) = A 1 / A T × 100
T 1 : Tryptophan retention time
T 2 : 10-hydroxy-δ-2-decenoic acid retention time
A 1 : Total peak area from the peak detected at the T 1 elution position to the peak detected at the T 2 elution position
A T : Sum of all peak areas.
粒度分布：＞250μm（250μmより大きい粒子径のものを90%以上含む）
細孔径：400Å
官能基：なし
適用pH範囲：全領域。 The protein degradation product is passed through a column of a styrene / divinylbenzene copolymer having the following characteristics, and water (fractions 1, 2), 20% methanol (fraction 3), 40% methanol (fraction 4), 60% methanol ( The proteolysate according to any one of claims 1 to 11, comprising fractions 3 to 6 among fractions eluted with fraction 5), 80% methanol (fraction 6), and 100% methanol (fraction 7):
Particle size distribution:> 250μm (including more than 90% particles with a particle size larger than 250μm)
Pore diameter: 400mm
Functional group: None Application pH range: Full range.
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；および
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
からなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチドを含み、フラクション５に、
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg
を含む、請求項１３に記載の蛋白分解物。 In fraction 4
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe;
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr; and
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr;
At least one peptide selected from the group consisting of:
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg
The protein decomposition product of Claim 13 containing this.
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。 A prophylactic or therapeutic agent for hypertension containing at least one peptide selected from the following four peptides as an active ingredient:
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe;
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr;
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr;
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg.
粒度分布：＞250μm（250μmより大きい粒子径のものを90%以上含む）
細孔径：400Å
官能基：なし
適用pH範囲：全領域。 The method of claim 24, wherein the styrene-divinylbenzene copolymer has the following properties:
Particle size distribution:> 250μm (including more than 90% particles with a particle size larger than 250μm)
Pore diameter: 400mm
Functional group: None Applicable pH range: Full range.
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。 A novel peptide consisting of any of the following four peptides:
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe;
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr;
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr;
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg.
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010051313A (en) * | 2008-08-01 | 2010-03-11 | Kobayashi Pharmaceut Co Ltd | Composition for oral ingestion containing larva of bee, propolis, and royal jelly |
| JP2012046450A (en) * | 2010-08-27 | 2012-03-08 | Unitika Ltd | Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide, and method for producing the peptide |
| WO2013047128A1 (en) * | 2011-09-28 | 2013-04-04 | 森永乳業株式会社 | Peptide and angiotensin-converting enzyme inhibitor |
| CN113913485A (en) * | 2021-09-30 | 2022-01-11 | 吉林农业大学 | Modification method for improving flavor and functionality of active peptide |
| CN114868843A (en) * | 2022-06-28 | 2022-08-09 | 睿迪生物科技（深圳）有限公司 | Special artificial milk for aseptic young mice and preparation method thereof |
| CN117482209A (en) * | 2023-11-13 | 2024-02-02 | 北京金王健康科技有限公司 | Queen bee embryo active peptide composition with ACE inhibition effect, and preparation method and application thereof |
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010051313A (en) * | 2008-08-01 | 2010-03-11 | Kobayashi Pharmaceut Co Ltd | Composition for oral ingestion containing larva of bee, propolis, and royal jelly |
| JP2012046450A (en) * | 2010-08-27 | 2012-03-08 | Unitika Ltd | Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide, and method for producing the peptide |
| WO2013047128A1 (en) * | 2011-09-28 | 2013-04-04 | 森永乳業株式会社 | Peptide and angiotensin-converting enzyme inhibitor |
| CN113913485A (en) * | 2021-09-30 | 2022-01-11 | 吉林农业大学 | Modification method for improving flavor and functionality of active peptide |
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