JP2007240425A - Electrochemical antigen detection method and device for same and detection chip - Google Patents
Electrochemical antigen detection method and device for same and detection chip Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007240425A JP2007240425A JP2006065744A JP2006065744A JP2007240425A JP 2007240425 A JP2007240425 A JP 2007240425A JP 2006065744 A JP2006065744 A JP 2006065744A JP 2006065744 A JP2006065744 A JP 2006065744A JP 2007240425 A JP2007240425 A JP 2007240425A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- enzyme
- electrochemical
- detection
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
Description
本発明は、酵素免疫測定法（Enzyme Immunoassay、EIA）を用いて抗原を電気化学的に検出する方法、特に、と畜牛のBSE診断において重要な、異常プリオンタンパク質を電気化学的手法により迅速に検出する方法とそれに用いる装置に関する。 The present invention is a method for electrochemically detecting an antigen using an enzyme immunoassay (EIA), particularly for detecting abnormal prion protein, which is important in BSE diagnosis of cattle, by an electrochemical method. And a device used therefor.
酵素免疫測定法（EIA）は、抗原抗体反応において、酵素の発色を利用して抗原やその他の物質（以下、本発明ではまとめて抗原という）を検出・測定する方法として広く知られている。EIA法のうちプレート等に抗体を固定した方法を、ELISA法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay、固相酵素免疫測定法）というが、ELISA法は、例えば、近年問題となっている狂牛病又は牛海綿状脳症(Bovine Spongiform Encephalopathy、以下BSEという)の検査にも適用されている。このBSEは伝染性海綿状脳症(Transmissible Spongiform Encephalopathy)という病気の一種であり、これに罹った牛の脳組織は、スポンジ状の変化を起こす。そして、結果として、起立不能等の症状を示す遅発性かつ悪性の中枢神経系の疾病を発症する。 Enzyme immunoassay (EIA) is widely known as a method for detecting and measuring antigens and other substances (hereinafter collectively referred to as antigens in the present invention) by utilizing the coloring of enzymes in antigen-antibody reactions. Among the EIA methods, the method in which an antibody is immobilized on a plate or the like is referred to as an ELISA method (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). It is also applied to testing for spongiform encephalopathy (Bovine Spongiform Encephalopathy, hereinafter referred to as BSE). BSE is a disease called Transmissible Spongiform Encephalopathy, and the brain tissue of cattle suffering from this disease undergoes a sponge-like change. As a result, late-onset and malignant diseases of the central nervous system exhibiting symptoms such as inability to stand up occur.
BSEを発症した牛の脳組織からは、プリオンと呼ばれるタンパク質の構造変化が観察される。BSE発症牛において特異的にみられる、構造変化したプリオンタンパク質は異常プリオンタンパク質と呼ばれ、BSE診断におけるマーカー（検査指標）として用いられている。従来のBSE診断は、一般的に、蛍光を利用したELISA法により行われている（例えば、非特許文献１、２参照）。
国内の食肉加工の現場では、先ず、と畜牛は各自治体の動物検査場に集められ、そこでと畜牛から延髄組織を取り出し、それを懸濁したサンプルをELISA法によって検査している。そして、検査で陰性とされたと畜牛のみが、食肉用等として出荷される。このように、BSE検査は食用肉の安全性に関わるものであり、畜産農家にとって、牛の飼育管理は非常に重要になる。この観点から、と畜前の生きた牛の状態で定期的検査できる手法が望まれている。しかしながら、BSE検査は、と畜後にのみ可能であるのが現状である。これは検査標的である異常プリオンが、脳や脊髄などの中枢神経系に集まりやすいためであり、血液や尿といったサンプル中の異常プリオンの量が少ないためである。 At domestic meat processing sites, slaughter cattle are first gathered at the local animal laboratory, where the medullary tissue is removed from the cattle and the suspended sample is examined by ELISA. Only cattle that are tested negative are shipped for meat and the like. Thus, BSE testing is related to the safety of edible meat, and cattle breeding management is very important for livestock farmers. From this point of view, there is a demand for a technique that can be periodically inspected in the state of live cattle before slaughter. However, at present, BSE inspection is possible only after slaughter. This is because the abnormal prion that is the test target tends to gather in the central nervous system such as the brain and spinal cord, and the amount of abnormal prion in the sample such as blood and urine is small.
これらの背景から、と畜前診断を可能とすることを目的として、血液や尿から異常プリオンを濃縮するリンタングステン酸沈澱法（非特許文献３)や、異常プリオンを増幅するPMCA法（非特許文献４）等が研究されている。これらの手法が完成すれば、と畜前診断が可能となると期待される。
一方、ELISA法を含むEIA法自体は臨床検査において一般化はしているが、専用の分析装置は高価・大型であるため、その場（オンサイド）診断を行う目的としては適していないという問題もある。以上のような状況から、例えば、と畜前診断のために畜産農家が導入可能な、小型・簡便で安価な測定装置としては、未だ開発されたものは存在しない。 On the other hand, the EIA method itself including the ELISA method has been generalized in clinical examinations, but the dedicated analyzer is expensive and large, so it is not suitable for the purpose of on-site diagnosis. There is also. From the above situation, for example, there has not yet been developed a small, simple and inexpensive measuring apparatus that can be introduced by livestock farmers for pre-slaughter diagnosis.
本発明の課題は、通常のEIA法に電気化学的検出法を導入し、抗原、例えば、BSEの異常プリオンタンパク質である抗原を、その場（オンサイド）診断で検出するための簡易な方法、及びそのために小型化及び低価格化した装置を提供することにある。 An object of the present invention is to introduce an electrochemical detection method into a normal EIA method, and to detect an antigen, for example, an antigen that is an abnormal prion protein of BSE, in situ (onside) diagnosis, Another object of the present invention is to provide a device that is reduced in size and price.
本発明は、酵素免疫測定法により抗原、例えば、異常プリオンタンパク質を検出するに際し、酵素反応により分解されると電気化学的に活性化される基質を用い、この活性化基質の電気化学的応答を測定することを特徴とする電気化学的抗原検出法である。 In the present invention, when detecting an antigen, for example, an abnormal prion protein, by an enzyme immunoassay, a substrate that is electrochemically activated when it is decomposed by an enzymatic reaction is used. It is an electrochemical antigen detection method characterized by measuring.
本発明はまた、前記検出方法を実施するための装置、即ち、酵素免疫測定法を実行するための手段と、酵素免疫測定法において形成された酵素反応産物の応答を電気化学的に測定する手段とからなる抗原検出装置も含むものである。この装置において、酵素反応産物の応答を電気化学的に測定する手段としては、ディファレンシャルパルスボルタンメトリー等のボルタンメトリー又はアンペロメトリーが好ましく採用される。 The present invention also provides a device for carrying out the detection method, that is, a means for performing the enzyme immunoassay and a means for electrochemically measuring the response of the enzyme reaction product formed in the enzyme immunoassay. And an antigen detection device comprising: In this apparatus, voltammetry such as differential pulse voltammetry or amperometry is preferably employed as a means for electrochemically measuring the response of the enzyme reaction product.
更に、本発明は、前記検出方法あるいは装置の一部として用いられる、電気化学的に抗原を検出するために用いられる検出チップであって、試料注入部、試薬注入部、洗浄液注入部、反応部、検出部及び廃液部と、これらを連結するマイクロ流路から構成された検出チップをも含むものである。 Furthermore, the present invention is a detection chip used for electrochemically detecting an antigen used as a part of the detection method or apparatus, comprising a sample injection part, a reagent injection part, a cleaning liquid injection part, a reaction part. The detection chip includes a detection section and a waste liquid section, and a microchannel connecting them.
本発明は、測定手法に電気化学を採用することで装置の小型化を可能とし、臨床診断をその場（オンサイド）で行うことを可能にする。 The present invention makes it possible to reduce the size of the apparatus by employing electrochemistry as a measurement technique, and to perform clinical diagnosis on the spot.
酵素免疫測定法（EIA）には、直接法、間接法、競合法、サンドイッチ法、その他の変法など多くの方法が知られている。厳密には、EIA法のうちプレート等に抗体を固定した方法を、ELISA法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay、固相酵素免疫測定法）というが、ELISA法は、抗原を２種類の抗体で挟み込み定量するサンドイッチ法と同義に使われる場合もある。EIA法は、免疫反応即ち抗原抗体反応と、酵素基質反応の二つを組み合わせたものである。即ち、抗原抗体反応で捕捉された抗原を、酵素と発色基質による発色反応を利用して検出する。この際、二つの反応を関連付けるための手段として、抗体酵素複合体を用いるサンドイッチ法等の方法と、抗原酵素複合体を用いるいわゆる競合法がある。本発明において酵素免疫測定法とは、上記全ての方法を含むものである。 There are many known methods for enzyme immunoassay (EIA), including direct methods, indirect methods, competitive methods, sandwich methods, and other modified methods. Strictly speaking, an EIA method in which an antibody is immobilized on a plate or the like is called an ELISA method (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Sometimes used interchangeably with sandwich method. The EIA method is a combination of an immune reaction, that is, an antigen-antibody reaction, and an enzyme substrate reaction. That is, the antigen captured by the antigen-antibody reaction is detected by using a color reaction with an enzyme and a color substrate. At this time, as means for relating the two reactions, there are a sandwich method using an antibody-enzyme complex and a so-called competition method using an antigen-enzyme complex. In the present invention, the enzyme immunoassay includes all the above methods.
通常のEIA法においては、酵素と発色基質による発色反応を起こさせるためには、発色基質として蛍光等の発色物質が用いられる。例えば、アルカリホスファターゼを標識した抗体の場合、基質としてのp-ニトロフェニルリン酸を作用させると、p-ニトロフェノールが遊離し発色するので、４０５ｎｍの波長を吸光度計で測定し発色量を求める。 In the normal EIA method, a color developing substance such as fluorescence is used as the color developing substrate in order to cause a color developing reaction between the enzyme and the color developing substrate. For example, in the case of an antibody labeled with alkaline phosphatase, when p-nitrophenyl phosphate as a substrate is allowed to act, p-nitrophenol is liberated and color develops.
これに対し、本発明は、上記酵素基質反応を、従来のEIA法における酵素と発色基質による発色反応を利用する方法に替えて、電気化学的変化を利用して測定することに特徴がある。即ち、本発明は、抗原、例えば、異常プリオンである抗原を、酵素免疫測定法により検出するに際し、酵素反応により分解されると電気化学的に活性化される基質を用い、この活性化された基質の電気化学的応答を測定して、間接的に抗原を検出・測定するものである。EIA法において、酵素反応により分解されると電気化学的に活性化される基質としては何でも良い。また、電気化学的応答を測定する方法についても特に制限はない。 In contrast, the present invention is characterized in that the enzyme substrate reaction is measured using an electrochemical change in place of the conventional EIA method using a chromogenic reaction with an enzyme and a chromogenic substrate. That is, the present invention uses a substrate that is electrochemically activated when it is decomposed by an enzymatic reaction when detecting an antigen, for example, an antigen that is an abnormal prion, by an enzyme immunoassay. The antigen is indirectly detected and measured by measuring the electrochemical response of the substrate. In the EIA method, any substrate that is electrochemically activated when decomposed by an enzymatic reaction may be used. There is no particular limitation on the method for measuring the electrochemical response.
本発明の手法を、いわゆるサンドイッチ法を例にして説明すると次の通りになる。（１）プリオン抗体を固定化する(プリオン抗体の固相化、チップ化)。用いる固相は一般的にELISA法で用いられているもので良く、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、金薄膜が挙げられる。（２）固相化プリオン抗体によって検体中のプリオンを捕捉する。（３）酵素標識プリオン抗体、即ち、（１）のプリオン抗体とは認識部位が異なっている二次抗体をプリオンに結合させ、次いで、基質と酵素標識抗体中の酵素を反応させる。かかる反応の結果、基質は構造的に変化して酵素反応産物を形成し、その変化に際して電気シグナルが発生する。（４）酵素反応産物の応答を電気化学的に測定する。例えば、酵素反応産物の電気化学的応答を、電圧や電流の変化として検出する。電気化学的な測定法としては、特に限定されるものではないが、各種アンペロメトリーやボルタンメトリーが好適である。 The method of the present invention will be described below by taking a so-called sandwich method as an example. (1) Immobilization of a prion antibody (immobilization of a prion antibody, formation of a chip). The solid phase to be used may be one generally used in the ELISA method, and examples thereof include polypropylene, polystyrene, and gold thin film. (2) The prion in the sample is captured by the immobilized prion antibody. (3) An enzyme-labeled prion antibody, that is, a secondary antibody having a recognition site different from that of the prion antibody in (1) is bound to prion, and then the substrate and the enzyme in the enzyme-labeled antibody are reacted. As a result of such a reaction, the substrate structurally changes to form an enzyme reaction product, and an electrical signal is generated upon the change. (4) The response of the enzyme reaction product is measured electrochemically. For example, the electrochemical response of the enzyme reaction product is detected as a change in voltage or current. The electrochemical measurement method is not particularly limited, but various amperometry and voltammetry are suitable.
アンペロメトリーは、電位ステップに対して電極に流れる電流を時間に対して測定、解析する手法であり、溶液中の電気化学活性種の定量分析に、広く用いられている方法である。ボルタンメトリーは、電極電位を変化させた時の応答電流を測定する手法として、広く用いられている。電極電位を直線的に変化させるサイクリックボルタンメトリーや、パルスにより変化させるパルスボルタンメトリーがある。得られる応答電流値は、溶液中の電気化学活性種の濃度に依存する。本発明においては、このような公知の電気化学的方法・手段を用いて、溶液中に生成した活性化基質の電気化学的応答を測定し、元の抗原の定性あるいは定量分析を行うものである。 Amperometry is a method for measuring and analyzing the current flowing through an electrode with respect to time with respect to a potential step, and is a method widely used for quantitative analysis of electrochemically active species in a solution. Voltammetry is widely used as a method for measuring the response current when the electrode potential is changed. There are cyclic voltammetry for changing the electrode potential linearly and pulse voltammetry for changing by pulse. The response current value obtained depends on the concentration of the electrochemically active species in the solution. In the present invention, the electrochemical response of the activated substrate generated in the solution is measured using such known electrochemical methods and means, and the qualitative or quantitative analysis of the original antigen is performed. .
本発明のEIA法における酵素としては、特に限定されるものではないが、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼが好適である。本発明で用いられる基質も特に限定されるものではないが、例えば、アルカリホスファターゼ用基質としては、p-アミノフェニルリン酸やp-アミノナフチルリン酸が好ましく、西洋わさびペルオキシダーゼ用基質としては、o-フェニレンジアミンが好ましい。これら化合物は、酵素との反応で、電気化学測定に好ましい構造の酵素反応産物に変化する。 The enzyme in the EIA method of the present invention is not particularly limited, and for example, alkaline phosphatase and horseradish peroxidase are suitable. Although the substrate used in the present invention is not particularly limited, for example, as the substrate for alkaline phosphatase, p-aminophenyl phosphate and p-aminonaphthyl phosphate are preferable, and as the substrate for horseradish peroxidase, o -Phenylenediamine is preferred. These compounds are converted into enzyme reaction products having a structure preferable for electrochemical measurement upon reaction with an enzyme.
本発明の上記検出方法においては、もう一つの本発明である、酵素免疫測定法を実行するための手段と、酵素免疫測定法において形成された酵素反応産物の応答を電気化学的に測定する手段とからなる抗原検出装置が用いられる。酵素免疫測定法を実行するための手段としては、特に限定されるものではなく、例えば、ELISA法を実行するための器具やキットの組み合わせが挙げられる。酵素反応産物の応答を電気化学的に測定する手段も、特に限定されるものではないが、好ましいのは、ディファレンシャルパルスボルタンメトリー等のパルスボルタンメトリー又はアンペロメトリーである。例えば、市販のボルタンメトリー装置やアンペロメトリーの装置を用いることができる。 In the above detection method of the present invention, another means of carrying out the enzyme immunoassay method of the present invention and a means of electrochemically measuring the response of the enzyme reaction product formed in the enzyme immunoassay method An antigen detection apparatus consisting of The means for performing the enzyme immunoassay is not particularly limited, and examples thereof include a combination of instruments and kits for performing the ELISA method. The means for electrochemically measuring the response of the enzyme reaction product is not particularly limited, but is preferably pulse voltammetry or amperometry such as differential pulse voltammetry. For example, a commercially available voltammetry apparatus or amperometry apparatus can be used.
前記本発明の検出方法又は検出装置において、酵素免疫測定と酵素反応産物の応答の測定のために使用する器具として、本発明のもう一つの発明である検出チップ、即ち、試料注入部、試薬注入部、洗浄液注入部、反応部、検出部及び廃液部と、これらを連結するマイクロ流路から構成された検出チップを用いるのが好ましい。 In the detection method or detection apparatus of the present invention, as a device used for enzyme immunoassay and enzyme reaction product response measurement, a detection chip according to another invention of the present invention, that is, a sample injection part, a reagent injection It is preferable to use a detection chip composed of a part, a cleaning liquid injection part, a reaction part, a detection part, a waste liquid part, and a microchannel connecting them.
本発明の検出チップは、一つの、例えば、名刺大のプラスチックの板に、それぞれが小さな溝あるいは凹部からなる試料注入部、試薬注入部、洗浄液注入部、反応部、検出部及び廃液部と、これらを連結するマイクロ流路を形成したものである。凹部の底は、抗体の固定化や電気化学的測定を考慮して、例えば、金の薄膜を付与するのが好ましい。試料注入部はサンプルを注入する部分であり、試薬注入部は抗体や化合物溶液を注入する部分であり、洗浄液注入部は洗浄バッファー等を注入する部分である。反応部はサンプル中の抗原を捕捉し、抗原-抗体反応、酵素反応を行う部分である。次いで反応液は検出部へ運ばれ、ここで電気化学シグナルが検出される。最終的に、反応液等は廃液部に流入し貯められる。以下、実施例により本発明を具体的に説明する。 The detection chip of the present invention is a single, for example, a business card-sized plastic plate, a sample injection part, a reagent injection part, a cleaning liquid injection part, a reaction part, a detection part, and a waste liquid part each consisting of a small groove or recess, A micro flow path connecting these is formed. The bottom of the recess is preferably provided with, for example, a gold thin film in consideration of antibody immobilization and electrochemical measurement. The sample injection part is a part for injecting a sample, the reagent injection part is a part for injecting an antibody or a compound solution, and the cleaning liquid injection part is a part for injecting a cleaning buffer or the like. The reaction part is a part that captures an antigen in a sample and performs an antigen-antibody reaction and an enzyme reaction. Next, the reaction solution is conveyed to a detection unit, where an electrochemical signal is detected. Finally, the reaction liquid and the like flow into the waste liquid part and are stored. Hereinafter, the present invention will be described specifically by way of examples.
［プリオンモデルタンパク質を用いた検討とその検出感度］
プリオンモデルタンパク質として、マウスプリオンの121番目から231番目までのアミノ酸が連結したポリペプチドを、大腸菌から組み換えタンパク質として調製し、これをモデルタンパク質とした(以下PrP121-231と略記する、M. R. Scott, et. al.,
Protein Science, 1, 986-997 (1992)参照)。このPrP121-231を、10μg/ml
炭酸バッファー(pH
9.0)溶液として調製し、この溶液を96穴プレートの各ウェルに100μlずつ添加して、37℃で終夜インキュベートした。
[Examination using prion model protein and its detection sensitivity]
As a prion model protein, a polypeptide in which amino acids 121 to 231 of mouse prion are linked was prepared as a recombinant protein from E. coli and used as a model protein (hereinafter abbreviated as PrP121-231, MR Scott, et al. al.,
Protein Science, 1, 986-997 (1992)). This PrP121-231, 10μg / ml
Carbonate buffer (pH
9.0) Prepared as a solution, 100 μl of this solution was added to each well of a 96-well plate and incubated at 37 ° C. overnight.
その後、50mM Trisバッファー(pH7.4)300μlで三回洗浄した。プリオン抗体(マウスIgG1)を20mM Trisバッファー(pH 7.4)溶液で0.2 ng/ml、1 ng/ml、20 ng/ml、100 ng/ml、200ng/ml、1μg/mlの濃度にそれぞれ調製し、この溶液を、洗浄後の各ウェルに100μlずつ添加して37 ℃で30分間インキュベートした。その後、50 mM Trisバッファー (0.05% Tween-20を含む, pH 7.4)300μlで三回洗浄した。抗マウスIgG (アルカリホスファターゼ標識)を0.2μg/mlの20 mM Trisバッファー (pH 7.4)溶液として調製し、この溶液を洗浄後の各ウェルに100μlずつ添加して37℃で30分間インキュベートした。
Thereafter, the plate was washed three times with 300 μl of 50 mM Tris buffer (pH 7.4). Prepare prion antibody (mouse IgG1) in a concentration of 0.2 ng / ml, 1 ng / ml, 20 ng / ml, 100 ng / ml, 200 ng / ml, 1 μg / ml with 20 mM Tris buffer (pH 7.4) solution, 100 μl of this solution was added to each well after washing and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Then, it was washed three times with 300 μl of 50 mM Tris buffer (containing 0.05% Tween-20, pH 7.4). Anti-mouse IgG (alkaline phosphatase labeled) was prepared as a 0.2 μg /
その後、50 mM Trisバッファー (0.05% Tween-20を含む, pH 7.4)300μlで三回洗浄した。p-アミノフェニルリン酸を、50 mM Trisバッファー pH 9.0、10 mM 塩化ナトリウム、 10 mM 塩化マグネシウムの混合溶液により0.5 mMの溶液として調製した。この溶液を、洗浄後の各ウェルに100μlずつ添加して37℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェル中の溶液中に生成・遊離したp-アミノフェノールを、ディファレンシャルパルスボルタンメトリー (DPV)で測定した。添加したプリオン抗体の濃度に対して、DPV測定で得られた電流応答値をプロットしたものが図２である。濃度に依存して電流値が変化していることがわかる。この図２から、本手法による検出限界は数ng/mlであり、通常のELISA法と同程度の感度を有していることが明らかとなった。 Then, it was washed three times with 300 μl of 50 mM Tris buffer (containing 0.05% Tween-20, pH 7.4). p-Aminophenyl phosphate was prepared as a 0.5 mM solution using a mixed solution of 50 mM Tris buffer pH 9.0, 10 mM sodium chloride, and 10 mM magnesium chloride. 100 μl of this solution was added to each well after washing and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After the incubation, p-aminophenol produced and released in the solution in each well was measured by differential pulse voltammetry (DPV). FIG. 2 is a plot of current response values obtained by DPV measurement versus the concentration of the added prion antibody. It can be seen that the current value changes depending on the concentration. FIG. 2 shows that the detection limit by this method is several ng / ml, and the sensitivity is comparable to that of a normal ELISA method.
［プリオン感染細胞抽出液をサンプルとして用いた実験結果］
実サンプルは入手困難であるため、プリオン病に感染したマウス神経芽細胞腫細胞 (Neuro 2a)の細胞抽出液を、サンプルとして用いて実験を行った。プリオン病非感染のNeuro 2aの細胞抽出液を、対照サンプルとして用いた。感染、非感染細胞由来の抽出物をそれぞれ96穴プレートに100μlずつ添加し、室温で終夜静置した。その後、50 mM Trisバッファー (pH 7.4)300μlで三回洗浄した。
[Experimental results using prion-infected cell extract]
Since actual samples are difficult to obtain, experiments were performed using a cell extract of mouse neuroblastoma cells (Neuro 2a) infected with prion disease as a sample. A cell extract of Neuro 2a uninfected with prion disease was used as a control sample. 100 μl each of extracts from infected and non-infected cells was added to a 96-well plate and allowed to stand overnight at room temperature. Then, it was washed three times with 300 μl of 50 mM Tris buffer (pH 7.4).
プリオン抗体 (マウスIgG1)を20 mM Trisバッファー (pH 7.4)溶液で0.2μg/mlの濃度に調製し、この溶液を洗浄後の各ウェルに100μlずつ添加して37 ℃で30分間インキュベートした。その後、50 mM Trisバッファー (0.05% Tween-20を含む、 pH 7.4)300μlで三回洗浄した。抗マウスIgG (アルカリホスファターゼ標識)を0.2μg/mlの20 mM Trisバッファー (pH 7.4)溶液として調製し、この溶液を洗浄後の各ウェルに100μlずつ添加して37℃で30分間インキュベートした。
A prion antibody (mouse IgG1) was adjusted to a concentration of 0.2 μg / ml with a 20 mM Tris buffer (pH 7.4) solution, 100 μl of this solution was added to each well after washing, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Then, it was washed three times with 300 μl of 50 mM Tris buffer (containing 0.05% Tween-20, pH 7.4). Anti-mouse IgG (alkaline phosphatase labeled) was prepared as a 0.2 μg /
その後、50 mM Trisバッファー (0.05% Tween-20を含む、pH 7.4)300μlで三回洗浄した。p-アミノフェニルリン酸を、50 mM Trisバッファー pH 9.0、10 mM 塩化ナトリウム、10 mM 塩化マグネシウムの混合溶液により0.5 mMの溶液として調製した。この溶液を、洗浄後の各ウェルに100μlずつ添加して、37 ℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルの溶液中に生成・遊離したp-アミノフェノールを、ディファレンシャルパルスボルタンメトリー (DPV)測定した。 Then, it was washed three times with 300 μl of 50 mM Tris buffer (containing 0.05% Tween-20, pH 7.4). p-Aminophenyl phosphate was prepared as a 0.5 mM solution using a mixed solution of 50 mM Tris buffer pH 9.0, 10 mM sodium chloride, and 10 mM magnesium chloride. 100 μl of this solution was added to each well after washing and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After incubation, differential pulse voltammetry (DPV) was measured for p-aminophenol produced and released in the solution of each well.
得られた測定結果 (電流値)を図3に示した。感染細胞サンプルで得られた電流値が、非感染細胞サンプルで得られた電流値よりも大きかった。この非感染細胞サンプルで得られた電流値を閾値として、この値を超えたかどうかによってプリオン病感染の診断が可能となる。 The obtained measurement results (current values) are shown in FIG. The current value obtained with the infected cell sample was greater than the current value obtained with the uninfected cell sample. With the current value obtained from this non-infected cell sample as a threshold, it is possible to diagnose prion disease infection depending on whether this value is exceeded.
本実施例は、本発明の検出チップの具体例を示すものである。図３に示したように、名刺大の大きさのプラスチック板に、それぞれが小さな凹部からなる試料注入部Ａ、試薬注入部Ｂ、洗浄液注入部Ｃ、反応部Ｄ、検出部Ｅ及び廃液部Ｆを設け、これらを連結するマイクロ流路（図３において各部をつなぐ連結線として示されている）を形成した。試料注入部Aは、サンプル注入部である。試薬注入部Bは、抗体や化合物溶液注入部である。洗浄液注入部Cは、洗浄バッファー等の注入部である。反応部Dは、サンプル中の抗原を捕捉し、抗原-抗体反応、酵素反応を行う反応部である。ここでの反応液は検出部Eへ運ばれ、電気化学シグナルとして検出される。廃液部Fは最終的に反応等の廃液を貯めるところである。 This example shows a specific example of the detection chip of the present invention. As shown in FIG. 3, a sample injection part A, a reagent injection part B, a cleaning liquid injection part C, a reaction part D, a detection part E, and a waste liquid part F each formed of a small concave part on a plastic plate having a size of a business card And a micro flow channel (shown as a connecting line connecting the respective parts in FIG. 3) is formed. The sample injection part A is a sample injection part. The reagent injection part B is an antibody or compound solution injection part. The cleaning liquid injection part C is an injection part for a cleaning buffer or the like. The reaction part D is a reaction part that captures an antigen in a sample and performs an antigen-antibody reaction and an enzyme reaction. The reaction solution here is carried to the detection unit E and detected as an electrochemical signal. The waste liquid part F is where the waste liquid such as reaction is finally stored.
例えば、本発明によるBSE検査は、各畜産場におけるその場診断を目的としているので、その検出チップや測定装置は非常に小型であることを特徴であり、かかるチップはそのような場合に便利に用いられる。本発明のチップ自体はプラスチックなどの安価な材料で構わない。凹部の底は、抗体の固定化や電気化学測定を考慮して、例えば、金薄膜が望ましい。 For example, since the BSE inspection according to the present invention is intended for in-situ diagnosis at each livestock farm, the detection chip and the measuring device are very small, and such a chip is convenient in such a case. Used. The chip itself of the present invention may be an inexpensive material such as plastic. For example, a gold thin film is desirable for the bottom of the recess in consideration of antibody immobilization and electrochemical measurement.
抗原抗体反応を利用して抗原、例えば、異常プリオンを電気化学的に検出する方法であり、狂牛病等のプリオン病診断における生前(と畜前)診断役立ち、小型化及び低価格化の測定装置を提供できる可能性がある。 It is a method of electrochemically detecting antigens such as abnormal prions using antigen-antibody reaction, which is useful for prenatal (prenatal) diagnosis in the diagnosis of prion diseases such as mad cow disease, and measures for miniaturization and cost reduction There is a possibility that a device can be provided.
Claims (6)
A detection chip used for electrochemically detecting an antigen, comprising a sample injection part, a reagent injection part, a washing liquid injection part, a reaction part, a detection part and a waste liquid part, and a microchannel connecting them. Detection chip.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006065744A JP2007240425A (en) | 2006-03-10 | 2006-03-10 | Electrochemical antigen detection method and device for same and detection chip |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006065744A JP2007240425A (en) | 2006-03-10 | 2006-03-10 | Electrochemical antigen detection method and device for same and detection chip |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007240425A true JP2007240425A (en) | 2007-09-20 |
Family
ID=38586102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006065744A Pending JP2007240425A (en) | 2006-03-10 | 2006-03-10 | Electrochemical antigen detection method and device for same and detection chip |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007240425A (en) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0572173A (en) * | 1991-09-14 | 1993-03-23 | Kanebo Ltd | Immunity measuring device |
| JP2003047500A (en) * | 2001-08-01 | 2003-02-18 | Fuji Photo Film Co Ltd | Method for detecting target nucleic acid fragment and detecting kit for target nucleic acid fragment |
| WO2004061418A2 (en) * | 2002-12-26 | 2004-07-22 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay cartridges and methods of using the same |
| JP2005024483A (en) * | 2003-07-01 | 2005-01-27 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Biosensor |
| WO2005026689A2 (en) * | 2003-09-10 | 2005-03-24 | I-Stat Corporation | Immunoassay device with immuno-reference electrode |
| JP2005221252A (en) * | 2004-02-03 | 2005-08-18 | Canon Inc | Sensor and detection method |
| JP2005227096A (en) * | 2004-02-12 | 2005-08-25 | Suenaga Tomokazu | Immunoassay analyzer, chip electrode, and test chip |
-
2006
- 2006-03-10 JP JP2006065744A patent/JP2007240425A/en active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0572173A (en) * | 1991-09-14 | 1993-03-23 | Kanebo Ltd | Immunity measuring device |
| JP2003047500A (en) * | 2001-08-01 | 2003-02-18 | Fuji Photo Film Co Ltd | Method for detecting target nucleic acid fragment and detecting kit for target nucleic acid fragment |
| WO2004061418A2 (en) * | 2002-12-26 | 2004-07-22 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay cartridges and methods of using the same |
| JP2005024483A (en) * | 2003-07-01 | 2005-01-27 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Biosensor |
| WO2005026689A2 (en) * | 2003-09-10 | 2005-03-24 | I-Stat Corporation | Immunoassay device with immuno-reference electrode |
| JP2005221252A (en) * | 2004-02-03 | 2005-08-18 | Canon Inc | Sensor and detection method |
| JP2005227096A (en) * | 2004-02-12 | 2005-08-25 | Suenaga Tomokazu | Immunoassay analyzer, chip electrode, and test chip |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lee et al. | Method validation of protein biomarkers in support of drug development or clinical diagnosis/prognosis | |
| JP4184356B2 (en) | Sensor, measuring apparatus and measuring method | |
| RU2397178C1 (en) | Diagnostic test system in immunochip format and differential serum diagnostics of syphilis | |
| US20180120328A1 (en) | Biomarker for psychiatric and neurological disorders | |
| JP2022169555A (en) | Nanopore protein conjugate for detection and analysis of analyte | |
| JP2007010418A (en) | Measuring method of endocrine substance in specimen | |
| CN106324251A (en) | Preparation method of small-fragment BMG antibody and beta2-microglobulin detection kit | |
| JP4197393B2 (en) | Test method for IgA nephropathy | |
| RU2748540C1 (en) | Method for detecting sars-cov-2 virus by mass spectrometry | |
| US11782052B2 (en) | Biosensor for male infertility | |
| Ruocco et al. | A new collection method for the evaluation of nasal mucus proteins | |
| Tel et al. | Development of lateral flow test for serological diagnosis of tularemia | |
| JP2007240425A (en) | Electrochemical antigen detection method and device for same and detection chip | |
| JP2005304376A (en) | Method and apparatus for detecting organism | |
| RU2757078C1 (en) | Method for potentiometric diagnosis of bovine leukemia | |
| Minamijima et al. | A comprehensive and comparative proteomic analysis of horse serum proteins in colitis | |
| US20030044868A1 (en) | Method for detecting prion proteins in tissue samples | |
| CN101158686A (en) | Electrochemical sensor used for detecting blood fluke, preparation method and applications | |
| KR101187674B1 (en) | Enzyme Activity Assay Using Two Stage Immunochromatography | |
| CN106546755B (en) | A kind of occult blood speed is surveyed with capillary array preparation method and application | |
| JPH03505920A (en) | Detection method | |
| JP6716241B2 (en) | Method for detecting IgG antibody against periodontal pathogen | |
| Lellman et al. | LAP-MALDI MS profiling and identification of potential biomarkers for the detection of bovine tuberculosis | |
| RU1832198C (en) | Method of determination of antibodies in blood serum | |
| KR20200077779A (en) | A composition for predicting a risk of neurodegenerative diseases and a method for predicting neurodegenerative diseases using the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090202 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20101215 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110201 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110809 |