JP2007222110A5 - - Google Patents
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Description
本発明は、スクラレオールを基質としてドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を生成する新規微生物に関し、さらに当該新規微生物を用いたドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の製造方法に関する。 The present invention relates to a novel microorganism that produces dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate using sclareol as a substrate, and dodecahydro-3a, 6 using the novel microorganism. , 6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate.
ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン（アンブロキサン）は残香性の高い香料であり、主にクラリーセージ（Salvia sclarea）から抽出されたスクラレオール（Sclareol）から化学変換によって製造されている。スクラレオールからドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フランを生産する工程を図１に示す。図１に示すように、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体としては、デカヒドロ-2-ヒドロキシ-2,5,5,8a-テトラメチルナフタレンエタノール及びスクラレオリド（デカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン-2（1H）-オン；（Sclareolide））が知られている。また、図１には示さないが、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体としては、環状エーテル体（8α, 13-オキシド-12,13-デヒドロ-15,16-ジノルラブダン）が知られている。 Dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan (ambroxan) is a highly fragrant fragrance, mainly from Sclareol extracted from Salvia sclarea Manufactured by chemical transformation. A process for producing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan from sclareol is shown in FIG. As shown in FIG. 1, dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate includes decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethylnaphthalene. Ethanol and sclareolide (decahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan-2 (1H) -one; (Sclareolide)) are known. Although not shown in FIG. 1, as a dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate, a cyclic ether (8α, 13-oxide-12,13- Dehydro-15,16-dinorlabdane) is known.
微生物によるスクラレオールからドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の変換反応は、例えば特許文献１〜４に記載されている。特許文献１にはHyphozyma roseoniger ATCC20624によるデカヒドロ-2-ヒドロキシ-2,5,5,8a-テトラメチルナフタレンエタノールの生産が開示されている。また、特許文献２にはCryptococcus laurentii ATCC20920によるドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の生産が開示され、特許文献３にはBensingtonia cilliata ATCC20919によるドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の生産が開示され、特許文献４にはCryptococcus albidus ATCC20918及びCryptococcus albidus ATCC20921によるドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の生産が開示されている。 The conversion reaction of sclareol to dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate by microorganisms is described in, for example, Patent Documents 1 to 4. Patent Document 1 discloses the production of decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethylnaphthaleneethanol by Hyphozyma roseoniger ATCC20624. Patent Document 2 discloses the production of dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate by Cryptococcus laurentii ATCC20920, and Patent Document 3 discloses dodecahydro by Bensingtonia cilliata ATCC20919. -3a, 6,6,9a-Tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate production is disclosed in US Pat. No. 6,057,086, which is dodecahydro-3a, 6,6,9a -The production of tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediates is disclosed.
このように、スクラレオールを基質としてドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を生産する能力を有する微生物としては、特許文献１〜４に開示されたような微生物が知られているに過ぎなかった。 Thus, microorganisms having the ability to produce dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate using sclareol as a substrate are disclosed in Patent Documents 1 to 4. Only such microorganisms were known.
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、スクラレオールを基質としてドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を効率よく生成することができる新規な微生物を提供することを目的とし、更に、当該微生物を用いたドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の製造方法を提供することを目的とする。 Therefore, in view of the actual situation as described above, the present invention is a novel capable of efficiently producing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate using sclareol as a substrate. And to provide a method for producing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate using the microorganism. To do.
上述した目的を達成するため、本発明者等は、栃木県芳賀郡の土壌を分離源として目的の特性を有する微生物を単離、同定すべく鋭意検討した結果、従来公知の微生物には分類されない、目的の特性を有する複数の新規微生物を単離、同定することができた。本発明は、これら新規微生物が有するスクラレオールを基質としてドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の生成を行うことができるといった知見に基づいてなされたものである。 In order to achieve the above-mentioned object, the present inventors have conducted intensive studies to isolate and identify microorganisms having the desired characteristics using the soil of Haga-gun, Tochigi Prefecture as a separation source, and as a result, they are not classified as conventionally known microorganisms. It was possible to isolate and identify a plurality of novel microorganisms having the desired characteristics. The present invention has been made based on the knowledge that dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate can be produced using sclareol possessed by these novel microorganisms as a substrate. Is.
本発明に係る新規微生物は、クリプトコッカス（Cryptococcus）属に属し、スクラレオールを基質として、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を生成する能力を有する。当該能力を有するクリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する微生物は新規な知見であり、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン及びその中間体の製造に有用な微生物となりうる。本発明者らが単離、同定した新規微生物に関して28S rRNAをコードする遺伝子（以下、28S rDNAと称する）の塩基配列を決定したところ、配列番号１に示す塩基配列であった。さらに、当該新規微生物は表１に示す菌学的性質を示した。 The novel microorganism according to the present invention belongs to the genus Cryptococcus and has the ability to produce dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate using sclareol as a substrate. . A microorganism belonging to the genus Cryptococcus having this ability is a novel finding, and a microorganism useful for the production of dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan and its intermediates It can be. When the nucleotide sequence of a gene encoding 28S rRNA (hereinafter referred to as 28S rDNA) was determined for the novel microorganism isolated and identified by the present inventors, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained. Further, the novel microorganism exhibited the mycological properties shown in Table 1.
本発明者は、配列番号１に示す28S rDNAの塩基配列及び表１に示す菌学的性質に基づいて新規微生物の同定を行ったところ、当該新規微生物はクリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する以外は同定不能であった。すなわち、新規微生物は、クリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する既知種には分類されず、新種を構成すると結論付けられた。なお、菌学的性質を用いた分類は、Barnett, J. A., Payne, R. W., and Yarrow, D. (2000) Yeasts : Characteristics and identification, 3rd edition. Cambridge University Press, Cambridge, UK. Kurtzman, C. P. and Fell, J. W. (1998) The Yeasts, a taxonomic study, 4th edition. Elsevier, Amsterdam, Netherlands.に従った。 The present inventor has identified a novel microorganism based on the base sequence of 28S rDNA shown in SEQ ID NO: 1 and the mycological properties shown in Table 1, and identified that the novel microorganism belongs to the genus Cryptococcus. It was impossible. That is, it was concluded that the new microorganism was not classified into a known species belonging to the genus Cryptococcus, but constituted a new species. Classification using mycological properties is Barnett, JA, Payne, RW, and Yarrow, D. (2000) Yeasts: Characteristics and identification, 3 rd edition.Cambridge University Press, Cambridge, UK.Kurtzman, CP and Fell, JW (1998) the Yeasts , in accordance with a taxonomic study, 4 th edition. Elsevier, Amsterdam, the Netherlands..
なお、新規微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NITE特許微生物寄託センター：〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に2006年1月12日付けで受領番号FERM AP-20760として寄託した。 The new microorganisms are dated January 12, 2006 at the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (NITE Patent Microorganism Depositary Center: 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818) Deposited with receipt number FERM AP-20760.
すなわち、本発明に係る微生物は、クリプトコッカス（Cryptococcus）属に属し、スクラレオールを基質としてドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン合成過程における中間体を生成する能力を有する微生物である。また、本発明に係る微生物は、D-Xylose、L-Arabinose、D-Arabinose、Citrate及びD-Riboseを資化することができ、ビタミン不添加培地において生育可能であるといった技術的特徴を有している。 That is, the microorganism according to the present invention belongs to the genus Cryptococcus and produces an intermediate in the process of synthesizing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan using sclareol as a substrate. It is a microorganism with capacity. Further, the microorganism according to the present invention can assimilate D-Xylose, L-Arabinose, D-Arabinose, Citrate and D-Ribose, and has a technical feature that it can grow in a vitamin-free medium. ing.
また、本発明に係る微生物は、配列番号１に示す塩基配列に対して95%以上の相同性を有する塩基配列からなる28S rDNAを有することが望ましい。さらに、本発明に係る微生物は、表１に記載された菌学的性質を有することが望ましい。さらにまた、本発明に係る微生物は、受領番号FERM AP-20760で特定されるクリプトコッカス酵母の属する種に属する微生物であることが望ましい。 The microorganism according to the present invention preferably has 28S rDNA comprising a base sequence having a homology of 95% or more with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Furthermore, it is desirable that the microorganism according to the present invention has the bacteriological properties described in Table 1. Furthermore, the microorganism according to the present invention is preferably a microorganism belonging to the species to which the cryptococcus yeast specified by the receipt number FERM AP-20760 belongs.
本発明において上記中間体としては、デカヒドロ-2-ヒドロキシ-2,5,5,8a-テトラメチルナフタレンエタノール及び/又はスクラレオリド（デカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン-2（1H）-オン）を挙げることができる。 In the present invention, the intermediate includes decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethylnaphthalene ethanol and / or sclareolide (decahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1- b] Furan-2 (1H) -one).
一方、本発明は、本発明に係る新規微生物を使用したドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の製造方法を提供することができる。すなわち、本発明に係るドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の製造方法は、スクラレオールを含有する培地で上記新規微生物を培養し、スクラレオールを基質としてドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン合成過程における中間体を生成するものである。 On the other hand, the present invention can provide a method for producing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate using the novel microorganism according to the present invention. That is, the method for producing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate according to the present invention comprises culturing the above-mentioned novel microorganism in a medium containing sclareol, and using sclareol as a substrate As an intermediate in the process of dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan synthesis.
本発明によれば、クリプトコッカス（Cryptococcus）属に属し、スクラレオールを基質としてドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン合成過程における中間体を生成する能力を有する新規微生物を提供することができる。この中間体からは、香料等の原料となるドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フランを製造することができる。したがって、本発明に係る新規微生物を使用することによって、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フランを低コストに製造することができる。 According to the present invention, it belongs to the genus Cryptococcus and has the ability to generate an intermediate in the process of synthesizing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan using sclareol as a substrate. New microorganisms can be provided. From this intermediate, dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan, which is a raw material such as a fragrance, can be produced. Therefore, dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan can be produced at low cost by using the novel microorganism according to the present invention.
また、本発明によれば、香料等の原料となるドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フランの原料となるドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の製造方法を提供することができる。本発明に係るドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の製造方法によれば、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フランを低コストで製造することが可能となる。 Further, according to the present invention, dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetra, which is a raw material for dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan, which is a raw material for fragrances, etc. A method for producing a methylnaphtho [2,1-b] furan intermediate can be provided. According to the process for producing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate according to the present invention, dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2, 1-b] Furan can be produced at low cost.
以下、本発明を詳細に説明する。
新規微生物
本発明に係る新規微生物は、クリプトコッカス（Cryptococcus）属に属し、スクラレオールを基質としてドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン合成過程における中間体（ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体）を生成する微生物である。ここで、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体とは、デカヒドロ-2-ヒドロキシ-2,5,5,8a-テトラメチルナフタレンエタノール及びスクラレオリド（デカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン-2（1H）-オン）を意味する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Novel microorganism The novel microorganism according to the present invention belongs to the genus Cryptococcus, and is an intermediate (dodecahydro) in the process of synthesizing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan using sclareol as a substrate. -3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate). Here, dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate means decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethylnaphthaleneethanol and sclareolide ( Decahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan-2 (1H) -one).
本発明に係る新規微生物は、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の生成能を指標として、土壌から単離することができる。ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の生成能は、供試微生物をスクラレオール含有培地にて培養し、培地中に含まれるドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を検出することで評価することができる。培地中に含まれるドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体は、供試微生物を除去した後の培地から有機溶媒を用いてドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を抽出した後、例えばガスクロマトグラフィー（GC）等によって検出することができる。 The novel microorganism according to the present invention can be isolated from soil using as an index the ability to produce dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate. The ability to produce dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate is obtained by culturing a test microorganism in a sclareol-containing medium, and then adding dodecahydro-3a, 6 , 6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate can be detected and detected. The dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate contained in the medium is obtained using an organic solvent from the medium after removing the test microorganisms. , 6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate can be extracted and then detected by, for example, gas chromatography (GC).
なお、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の検出には、GCに限らず、例えば、気液クロマトグラフィ(GLC)、薄層クロマトグラフィ(TLC)、高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)、赤外スペクトル(IR)及び核磁気共鳴(NMR)のような従来公知の分析方法を使用することができる。 In addition, detection of dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate is not limited to GC, for example, gas-liquid chromatography (GLC), thin layer chromatography (TLC) Conventionally known analytical methods such as high pressure liquid chromatography (HPLC), infrared spectrum (IR) and nuclear magnetic resonance (NMR) can be used.
本発明らは、このような手法によって栃木県芳賀郡の土壌からクリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する新規微生物を単離している。単離した新規微生物は、スクラレオールを含有する培地で培養することによって、培地中にドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を生成する能力を有している。本発明者は、この新規微生物をCryptococcus sp. KSM-JL3603と命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NITE特許微生物寄託センター：〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に2006年1月12日付けで受領番号FERM AP-20760として寄託している。 The present inventors have isolated a novel microorganism belonging to the genus Cryptococcus from soil in Haga-gun, Tochigi Prefecture by such a technique. The isolated novel microorganism has the ability to produce dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate in the medium by culturing in the medium containing sclareol. is doing. The present inventor named this new microorganism Cryptococcus sp. KSM-JL3603, and the National Institute of Technology and Evaluation Technology for Microorganisms (NITE Patent Microorganism Deposit Center: 2 Kazusa Kamashizu, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818, Japan) -5-8) was deposited as receipt number FERM AP-20760 on January 12, 2006.
本発明に係る新規微生物は、当該受領番号FERM AP-20760で特定されるクリプトコッカス（Cryptococcus）属酵母及び、当該酵母と同一の種に分類され、より好ましくは当該酵母と同一の株に分類され且つドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を生成する能力を有する微生物を含むこととなる。 The novel microorganism according to the present invention is classified into the Cryptococcus genus yeast specified by the receipt number FERM AP-20760, and the same species as the yeast, more preferably the same strain as the yeast and It will include microorganisms that have the ability to generate dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediates.
また、受領番号FERM AP-20760で特定される子嚢菌酵母は、配列番号１に示す塩基配列を含む28S rDNAを有している。したがって、本発明に係る新規微生物は、配列番号１に示す塩基配列に対して95%以上、好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列を含む28S rDNAを有するクリプトコッカス（Cryptococcus）属酵母であって、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の生成能を有する微生物を含むこととなる。 Further, the ascomycetous yeast identified by the receipt number FERM AP-20760 has 28S rDNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Therefore, the novel microorganism according to the present invention is a cryptococcus having 28S rDNA containing a base sequence having a homology of 95% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is a yeast of the genus (Cryptococcus) and includes a microorganism having an ability to produce a dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate.
新規微生物によるドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の製造
上述した本発明に係る新規微生物を使用して、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を製造することができる。製造されたドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体は、付加価値の高い、残香性の高い香料であるドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン（ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン）を製造する際の原料として使用することができる。
Production of dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate by a novel microorganism Using the novel microorganism according to the present invention described above, dodecahydro-3a, 6,6,9a -A tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate can be produced. The produced dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate is dodecahydro-3a, 6,6,9a- It can be used as a raw material for producing tetramethylnaphtho [2,1-b] furan (dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan).
本発明に係る新規微生物を使用してドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を製造する際には、先ず、本発明に係る新規微生物を、スクラレオールを含有する培地で培養する。培地としては、子嚢菌網に属する微生物が生育可能である培地であれば如何なる組成の培地をも使用することができる。使用可能な培地は、炭素源、窒素源、金属ミネラル類及びビタミン類等を含有する固体培地及び液体培地等を挙げることができる。なお、本発明に係る新規微生物を培養するための培地には、培養条件等に応じて界面活性剤や消泡剤を添加してもよい。 When producing the dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate using the novel microorganism according to the present invention, first, the novel microorganism according to the present invention, Incubate in medium containing sclareol. As the medium, a medium having any composition can be used as long as microorganisms belonging to the Ascomycetes net can grow. Usable media include solid media and liquid media containing carbon sources, nitrogen sources, metal minerals, vitamins, and the like. In addition, you may add surfactant and an antifoamer to the culture medium for culture | cultivating the novel microorganisms based on this invention according to culture conditions.
培地に添加される炭素源としては、単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖が挙げられ、これら2種以上を混合して用いても良い。ここで糖質以外の炭素源としては、例えば酢酸塩等の有機酸塩が挙げられる。ここで、炭素源としては、これら各成分を単独で使用しても良いし、必要に応じ複数成分を混合して使用しても良い。 Examples of the carbon source added to the medium include monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, and polysaccharides, and two or more of these may be used in combination. Examples of carbon sources other than carbohydrates include organic acid salts such as acetate. Here, as the carbon source, each of these components may be used alone, or a plurality of components may be mixed and used as necessary.
また、窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム及び酢酸アンモニウム等の無機並びに有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス及びカゼイン加水分解物等の窒素含有有機物、グリシン、グルタミン酸、アラニン及びメチオニン等のアミノ酸等が挙げられる。ここで、窒素源としては、これら各成分を単独で使用しても良いし、必要に応じ複数成分を混合して使用しても良い。 Examples of the nitrogen source include inorganic and organic ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium carbonate, ammonium phosphate and ammonium acetate, urea, peptone, meat extract, yeast extract and casein hydrolyzate. Examples thereof include nitrogen-containing organic substances, amino acids such as glycine, glutamic acid, alanine, and methionine. Here, as the nitrogen source, each of these components may be used alone, or a plurality of components may be mixed and used as necessary.
さらに、金属ミネラル類としては、例えば塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛及び炭酸カルシウム等が挙げられる。ここで、金属ミネラル類としては、これら各成分を単独で使用しても良いし、必要に応じ複数成分を混合して使用しても良い。 Furthermore, examples of metal minerals include sodium chloride, ferrous sulfate, magnesium sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, and calcium carbonate. Here, as metal minerals, each of these components may be used alone, or a plurality of components may be mixed and used as necessary.
本発明に係る新規微生物を培養する際の培養条件としては、特に限定されず、至適範囲のpH及び温度に調整して行われる。具体的にpHの至適範囲は、３〜８、好ましくは４〜８、より好ましくは５〜７である。また、温度の至適範囲は、１０〜３５℃、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜３０℃である。培養は、振とう培養、嫌気培養、静置培養、醗酵槽による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応も用いることができる。 The culture conditions for culturing the novel microorganism according to the present invention are not particularly limited, and are adjusted to the optimum pH and temperature. Specifically, the optimum range of pH is 3 to 8, preferably 4 to 8, and more preferably 5 to 7. Moreover, the optimal range of temperature is 10-35 degreeC, Preferably it is 15-30 degreeC, More preferably, it is 20-30 degreeC. In addition to shaking culture, anaerobic culture, stationary culture, and culture using a fermenter, culture can be carried out by resting cell reaction and immobilized cell reaction.
このような組成の培地に添加するスクラレオール濃度は、特に限定されないが、0.1%〜50％とすることが好ましい。スクラレオールは、培養に先立って培地に添加しても良いし、培養途中で添加（流加培養）してもよい。また、スクラレオール以外の組成、例えば炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、界面活性剤、消泡剤も同時に流加することが可能である。 The concentration of sclareol added to the medium having such a composition is not particularly limited, but is preferably 0.1% to 50%. Sclareol may be added to the medium prior to culturing or may be added during the culturing (fed-batch culture). In addition, compositions other than sclareol, such as carbon sources, nitrogen sources, vitamins, minerals, surfactants and antifoaming agents, can be fed simultaneously.
ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体は、上述したように新規微生物を培養した後、培地から回収することができる。ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を培地から回収する方法は、公知の方法に従って行えば良く、特に限定されない。例えば、培地から菌体を分離除去した後、遠心分離、限外ろ過、イオン交換、逆浸透膜、電気透析、塩析、晶析等を組み合わせることによりドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を単離・精製することができる。 The dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate can be recovered from the medium after culturing the new microorganism as described above. The method for recovering the dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate from the medium may be carried out according to a known method, and is not particularly limited. For example, dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetra can be obtained by separating and removing cells from the medium and then combining centrifugation, ultrafiltration, ion exchange, reverse osmosis membrane, electrodialysis, salting out, crystallization, etc. Methylnaphtho [2,1-b] furan intermediate can be isolated and purified.
製造されたドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体を用いてドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フランを製造する方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を適宜使用することができる。具体的には、スクラレオリドは、例えば水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、又は水素化ホウ素カリウム／塩化リチウム混合物で還元することによって、デカヒドロ-2-ヒドロキシ-2,5,5,8a-テトラメチルナフタレンエタノールに変換する。デカヒドロ-2-ヒドロキシ-2,5,5,8a-テトラメチルナフタレンエタノールは、酸性触媒、例えば、p-トルエンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸クロリド、触媒量の硫酸及び酸性イオン交換体を用いて、種々の溶媒中で脱水環化によりドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フランに変換される。 Using the prepared dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate, dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan The method for producing is not particularly limited, and a conventionally known method can be appropriately used. Specifically, sclareolide is decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl, for example by reduction with lithium aluminum hydride, sodium borohydride, or potassium borohydride / lithium chloride mixture. Convert to naphthalene ethanol. Decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethylnaphthalene ethanol is used with acidic catalysts such as p-toluenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid chloride, catalytic amounts of sulfuric acid and acidic ion exchangers. It is converted to dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan by dehydration cyclization in various solvents.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to a following example.
〔実施例１〕新規微生物の単離
以下のようにして、栃木県芳賀郡の土壌より新規微生物の単離を行った。
先ず、0.2%酵母エキス、0.2%硝酸アンモニウム、0.1%リン酸１カリウム、0.05%硫酸マグネシウム・7水和物、2.0% 寒天、1.0% スクラレオール（別滅菌）及び0.5% ツイーン80（別滅菌）からなる寒天培地上に土壌懸濁液を100μl塗布した。25℃にて7〜14日間培養し、生育したコロニーを0.2% 酵母エキス、0.2% 硝酸アンモニウム、0.1% リン酸１カリウム及び0.05% 硫酸マグネシウム・7水和物を含有する液体培地に接種し、25℃で1日間培養し種菌とした。次に、0.2% 酵母エキス、0.2% 硝酸アンモニウム、0.1% リン酸１カリウム、0.05% 硫酸マグネシウム・7水和物、1.0% スクラレオール（別滅菌）及び0.5% ツイーン80（別滅菌）を含有する培地に種菌を1％植菌し、25℃にて1週間培養した。
[Example 1] Isolation of new microorganisms New microorganisms were isolated from soil in Haga-gun, Tochigi Prefecture as follows.
First, it consists of 0.2% yeast extract, 0.2% ammonium nitrate, 0.1% monopotassium phosphate, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate, 2.0% agar, 1.0% sclareol (separate sterilization), and 0.5% Tween 80 (separate sterilization) 100 μl of the soil suspension was applied on the agar medium. After culturing at 25 ° C. for 7 to 14 days, the grown colonies are inoculated into a liquid medium containing 0.2% yeast extract, 0.2% ammonium nitrate, 0.1% monopotassium phosphate and 0.05% magnesium sulfate heptahydrate. It was cultured for 1 day at 0 ° C. and used as an inoculum. Next, in a medium containing 0.2% yeast extract, 0.2% ammonium nitrate, 0.1% monopotassium phosphate, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate, 1.0% sclareol (separate sterilization) and 0.5% Tween 80 (separate sterilization) 1% of the inoculum was inoculated and cultured at 25 ° C for 1 week.
培養終了後、培養液0.1mlを使用し、酢酸エチル0.6mlにて目的物質を抽出し、適宜希釈してガスクロマトグラフィー（GC）分析を行った。GC分析装置はAgilent technologies 6890Nで行い、分析条件は以下のとおりである。検出器としてはFID（Flame Ionization Detector）を使用し、注入口温度を250℃とし、注入法をスプリットモード（スプリット比100：1）とし、トータルフローを200ml/分とし、カラム流速を0.4ml/分とし、カラムとしてはJ&W社製のDB-WAX（φ0.1mm×10m）を使用し、オーブン温度を250℃とした。本条件により、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体である環状エーテル体は0.8分付近にピークが現れ、スクラレオリドは2.4分付近にピークが現れ、スクラレオールは2.7分付近にピークが表れ、デカヒドロ-2-ヒドロキシ-2,5,5,8a-テトラメチルナフタレンエタノールは3分付近にピークが現れた。 After completion of the culture, 0.1 ml of the culture solution was used, the target substance was extracted with 0.6 ml of ethyl acetate, diluted as appropriate, and subjected to gas chromatography (GC) analysis. The GC analyzer is Agilent Technologies 6890N, and the analysis conditions are as follows. FID (Flame Ionization Detector) is used as the detector, the inlet temperature is 250 ° C, the injection method is split mode (split ratio 100: 1), the total flow is 200 ml / min, and the column flow rate is 0.4 ml / The column was DB-WAX (φ0.1 mm × 10 m) manufactured by J & W, and the oven temperature was 250 ° C. Under these conditions, the cyclic ether compound, which is an intermediate of dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan, has a peak around 0.8 minutes, and sclareolide has a peak around 2.4 minutes. Sclareol peaked around 2.7 minutes, and decahydro-2-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethylnaphthaleneethanol peaked around 3 minutes.
本条件で6950個の種菌についてドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の生成能を評価したところ、主としてスクラレオリドを生成することができる新規微生物を単離することができた。単離した新規微生物をKSM-JL3603と命名した。 Under these conditions, 6950 inoculums were evaluated for the ability to produce dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediates. New microorganisms capable of mainly producing sclareolide were identified. Could be isolated. The isolated new microorganism was named KSM-JL3603.
〔実施例２〕新規微生物の分類
実施例１で単離したKSM-JL3603の菌学的性質を特定するとともにrDNAを解析することで、KSM-JL3603の分類を試みた。
[Example 2] Classification of new microorganisms KSM-JL3603 was identified by identifying the bacteriological properties of KSM-JL3603 isolated in Example 1 and analyzing rDNA.
先ず、KSM-JL3603の菌学的性質を以下のように特定した。YM寒天（Becton Dickinson）平板培地上において湿性で白色から白クリーム色のコロニーが観察され、コロニーの周辺部は平滑状を示した。微視的特徴を観察した結果、球形〜亜球形の栄養細胞の形成が認められ、栄養細胞は出芽によって増殖する様子が観察された。生化学的性状試験を行った結果、表２に示す結果が得られた。なお、表２において、+は反応が陽性、−は反応が陰性、ｗは弱い陽性反応が認められたことを示す。また、本KSM-JL3603は25℃で生育し、30℃で弱い生育が認められた。しかしながら、本KSM-JL3603は35℃以上では生育しなかった。 First, the mycological properties of KSM-JL3603 were identified as follows. Wet white to white cream colonies were observed on a YM agar (Becton Dickinson) plate medium, and the periphery of the colonies showed a smooth shape. As a result of observing microscopic features, formation of spherical to subspherical vegetative cells was observed, and it was observed that vegetative cells proliferated by budding. As a result of the biochemical property test, the results shown in Table 2 were obtained. In Table 2, + indicates positive reaction,-indicates negative reaction, and w indicates weak positive reaction. This KSM-JL3603 grew at 25 ° C and weak growth was observed at 30 ° C. However, this KSM-JL3603 did not grow above 35 ° C.
次に、KSM-JL3603のrDNAを以下のように解析した。すなわち、O’Donnell等の方法（O’Donnell, K. 1993. Fusarium and its near relatives. In Reynolds, D. R. and Taylor, J. W. (Eds) The Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics, CAB International, Wallingford ）により、28S rDNA D1/D2領域及び18S rDNAの解析を行い、帰属分類群を推定した。28S rDNA D1/D2領域の塩基配列を決定した結果を配列番号１に示す。なお相同検索はBLASTを用いた。 Next, the rDNA of KSM-JL3603 was analyzed as follows. That is, O'Donnell et al. (O'Donnell, K. 1993. Fusarium and its near relatives. In Reynolds, DR and Taylor, JW (Eds) The Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics, CAB International , Wallingford), 28S rDNA D1 / D2 region and 18S rDNA were analyzed, and the attribution taxon was estimated. The result of determining the base sequence of the 28S rDNA D1 / D2 region is shown in SEQ ID NO: 1. For homology search, BLAST was used.
KSM-JL3603から得られた28S rDNA D1/D2領域塩基配列は、担子菌酵母の一種であるCryptococcus magnus、Filobacidium floriforme及びFilobasidium elegansと高い相同性を示した。その中に含まれるCryptococcus magnusの基準株であるCBS140（AF181851）の塩基配列と99.8％、Filobacidium floriformeの基準株であるCBS6241（AY075498）の塩基配列と99.8%の相同性を示した。なお、Filobacidium属はCryptococcus属の有性時代の属である。このことから、本菌株は28S rDNA D1/D2領域の解析においては、Cryptococcus magnus、Filobacidium floriformeまたはFilobasidium elegansに帰属する菌種である可能性が高いものと考えられた。また、形態観察において、栄養細胞の出芽形式や形状はCryptococcus属およびFilobacidium属に類似していた。しかし、培養菌体において、テレオモルフであるFilobacidium属の有性生殖器官の形成は認められないことから、本菌株はCryptococcus属と推定された。 The 28S rDNA D1 / D2 region nucleotide sequence obtained from KSM-JL3603 showed high homology with Cryptococcus magnus, Filobacidium floriforme, and Filobasidium elegans, which are a kind of basidiomycetous yeast. It showed 99.8% homology with the base sequence of CBS140 (AF181851), which is the reference strain of Cryptococcus magnus, and 99.8% with the base sequence of CBS6241 (AY075498), which is the reference strain of Filobacidium floriforme. The genus Filobacidium is a genus of the sexual age of the genus Cryptococcus. From this, it was considered that this strain is highly likely to be a species belonging to Cryptococcus magnus, Filobacidium floriforme or Filobasidium elegans in the analysis of 28S rDNA D1 / D2 region. In morphological observation, the budding form and shape of vegetative cells were similar to those of the genus Cryptococcus and Filobacidium. However, the formation of sexual reproductive organs of the genus Filobacidium, a teleomorph, was not observed in the cultured cells, so this strain was presumed to be a genus Cryptococcus.
特許第2820588号には、スクラレオールを変換するCryptococcus属が3株記載されている。しかしながら、特許第2820588号に記載のCryptococcus albidus ATCC20918は、D-Xylose、L-Arabinose、D-Arabinoseを資化しないことが記載され、さらに、ビタミン無しの培地にて生育が不可であることが記載されている。これに対して、本KSM-JL3603は、D-Xylose、L-Arabinose、D-Arabinoseを資化し、ビタミン無しの培地で生育する。このように生化学的性質が異なるため、本KSM-JL3603は、Cryptococcus albidus ATCC20918とは異なる種、異なる株であると結論づけられた。 Japanese Patent No. 2820588 describes three strains of Cryptococcus that convert sclareol. However, Cryptococcus albidus ATCC20918 described in Patent No. 2820588 is described as not assimilating D-Xylose, L-Arabinose, D-Arabinose, and further described as being unable to grow in a vitamin-free medium. Has been. In contrast, the present KSM-JL3603 assimilates D-Xylose, L-Arabinose, and D-Arabinose and grows in a vitamin-free medium. Thus, it was concluded that this KSM-JL3603 is a different species and different strain from Cryptococcus albidus ATCC20918 because of its different biochemical properties.
また、特許第2820588号に記載のCryptococcus laurentii ATCC20920は、Melibiose及びDL-Lactateを資化することが記載されている。これに対して、本KSM-JL3603は、これらを資化できない。このように生化学的性質が異なるため、本KSM-JL3603は、Cryptococcus laurentii ATCC20920とは異なる種、異なる株であると結論づけられた。 In addition, Cryptococcus laurentii ATCC 20920 described in Japanese Patent No. 2820588 is described to assimilate Melibiose and DL-Lactate. In contrast, the KSM-JL3603 cannot assimilate them. Thus, it was concluded that this KSM-JL3603 is a different species and different strain from Cryptococcus laurentii ATCC20920 because of its different biochemical properties.
さらに、特許第2820588号に記載のCryptococcus albidus ATCC20921はCitrate及びD-Riboseを資化することはできないと記載されている。これに対して、本KSM-JL3603は、これらを利用し、弱い生育が認められた。比較的性質の似ているC. albidus ATCC20921については、菌株を取り寄せ、特許第2820588号に記載の実施例に従い培養を行ったところ、主な生成物は環状エーテルであった。これに対して、本KSM-JL3603を同様に培養したところ、主な生成物はスクラレオリドであった。このように、スクラレオールを基質として生成するドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体が異なる物質であることから、本KSM-JL3603は、Cryptococcus albidus ATCC20921とは異なる種、異なる株であると結論づけられた。 Further, it is described that Cryptococcus albidus ATCC20921 described in Japanese Patent No. 2820588 cannot assimilate Citrate and D-Ribose. On the other hand, this KSM-JL3603 utilized these, and weak growth was recognized. As for C. albidus ATCC20921 having relatively similar properties, strains were ordered and cultured according to the examples described in Japanese Patent No. 2820588. As a result, the main product was a cyclic ether. In contrast, when this KSM-JL3603 was cultured in the same manner, the main product was sclareolide. Thus, since the dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate produced using sclareol as a substrate is a different substance, this KSM-JL3603 is a Cryptococcus albidus ATCC20921 It was concluded that they were different species and different strains.
以上の検討結果から、本KSM-JL3603は、特許第2820588号に記載されている3つのCryptococcus属の微生物には分類されない新種の微生物として同定することができた。 From the above examination results, the present KSM-JL3603 could be identified as a new species of microorganism not classified into the three Cryptococcus microorganisms described in Japanese Patent No. 2820588.
なお、Cryptococcus sp. KSM-JL3603は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NITE特許微生物寄託センター：〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に2006年１月１２日付けで受領番号FERM AP-20760として寄託した。 In addition, Cryptococcus sp. KSM-JL3603 was established by the National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center (NITE Patent Microorganism Depositary Center: 2-5-8 Kazusa Kamashitsu, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818). Deposited as receipt number FERM AP-20760 on 12th of March.
〔実施例３〕ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の生産性検討
本実施例では、Cryptococcus sp. KSM-JL3603のドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の生産性を検討した。先ず、Cryptococcus sp. KSM-JL3603を2.1％YM broth（Becton Dickinson）に１白金耳植菌し、25℃にて2日間振とう培養したものを種菌とした。次に、2.1%YM broth、0.1%硫酸マグネシウム・7水和物、1%ツイーン80及び2%スクラレオールからなる培地へ種菌を2%植菌し、25℃にて振とう培養を行った。培養液は実施例１の手法にて抽出及びGC分析を行い、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の生産量を求めた。結果を表３に示す。なお、表３に示した数値の単位は“g/L”である
[Example 3] Productivity study of dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate In this example, Cryptococcus sp. KSM-JL3603 dodecahydro-3a, 6, The productivity of 6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate was investigated. First, Cryptococcus sp. KSM-JL3603 was inoculated with 1 platinum ear in 2.1% YM broth (Becton Dickinson), and cultured with shaking at 25 ° C. for 2 days. Next, 2% of the inoculum was inoculated into a medium consisting of 2.1% YM broth, 0.1% magnesium sulfate heptahydrate, 1% Tween 80 and 2% sclareol, and cultured with shaking at 25 ° C. The culture solution was extracted and subjected to GC analysis by the method of Example 1 to determine the production amount of dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate. The results are shown in Table 3. The unit of numerical values shown in Table 3 is “g / L”.
表３に示した結果より、Cryptococcus sp. KSM-JL3603は、ドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体のうちスクラレオリド、デカヒドロ-2-ヒドロキシ-2,5,5,8a-テトラメチルナフタレンエタノール及び環状エーテルの生成能を有しており、特に主としてスクラレオリドを生成できることが明らかとなった。 From the results shown in Table 3, Cryptococcus sp. KSM-JL3603 was found to be sclareolide, decahydro-2-hydroxy-2 among dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediates. , 5,5,8a-tetramethylnaphthalene ethanol and cyclic ethers, and it was found that sclareolide can be produced mainly.
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| JP5317488B2 (en) * | 2008-02-01 | 2013-10-16 | 花王株式会社 | Novel microorganism and method for producing dodecahydro-3a, 6,6,9a-tetramethylnaphtho [2,1-b] furan intermediate using the novel microorganism |
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| JP2802588B2 (en) * | 1994-08-05 | 1998-09-24 | インターナショナル フレーバーズ アンド フレー グランシィズ インコーポレーテッド | Biologically pure culture of microorganism, and method for producing diol and cyclic ether using the same |
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2006
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