JP2007222105A - Method for identifying strain of bacterium in processed food - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、加熱処理を施した加工食品中のＤＮＡを解析して、該加工食品中の菌種を同定する方法に関し、更に詳しくは、加工食品中のＤＮＡを抽出して得たＤＮＡ溶液にポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲ法という）を適用してＤＮＡを増幅させたＰＣＲ産物に変性勾配ゲル電気泳動法を適用することによって、塩基配列が相違するＤＮＡ毎に分離して解読することを特徴とする加工食品中の菌種の同定方法に関するものである。 The present invention relates to a method for analyzing DNA in processed food that has been subjected to heat treatment to identify bacterial species in the processed food, and more specifically, to a DNA solution obtained by extracting DNA in processed food. By applying denaturing gradient gel electrophoresis to PCR products obtained by amplifying DNA by applying the polymerase chain reaction method (hereinafter referred to as PCR method), it is possible to separate and decode each DNA having a different base sequence. The present invention relates to a method for identifying bacterial species in processed foods.
従来より、酵母や乳酸菌等の菌種の同定は、菌を培地で培養し、菌の栄養要求性及び形態等で同定する培養法が採用されてきた。しかしながら、該培養法による菌種の同定は、培養環境等の外的要因による影響を受ける上、時間がかかるという欠点があった。 Conventionally, for the identification of bacterial species such as yeast and lactic acid bacteria, a culture method in which the bacteria are cultured in a medium and identified by the nutritional requirement and form of the bacteria has been employed. However, the identification of the bacterial species by the culture method has a drawback that it takes time in addition to being influenced by external factors such as the culture environment.
また、菌種によっては、培養が困難であったり、死滅した菌では培養することができないという問題があった。 Moreover, there existed a problem that culture | cultivation was difficult depending on the microbial species, and it could not be culture | cultivated with the dead microbe.
一方で、近年の分子生物学の発展に伴い、ＤＮＡの塩基配列の違いから植物や細菌の種別を同定する方法が開発されてきている。 On the other hand, with the development of molecular biology in recent years, methods for identifying the types of plants and bacteria from the difference in DNA base sequences have been developed.
加工食品から植物遺伝子を検出する方法として、高温処理、高温磨砕処理、高圧処理または発酵処理のいずれかの処理を受けた植物性加工食品を、脱脂した後、ＤＮＡ粗画分を抽出し、次いでポリエチレングリコール沈殿法及び／又はポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるＤＮＡ分画処理を行って調製した鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲ法により植物遺伝子を検出する技術があった（特許文献１）。 As a method for detecting plant genes from processed foods, after degreasing plant processed foods that have been subjected to either high temperature treatment, high temperature grinding treatment, high pressure treatment or fermentation treatment, extract the crude DNA fraction, Next, there has been a technique for detecting a plant gene by PCR using a template DNA prepared by performing DNA fractionation treatment by polyethylene glycol precipitation and / or polyacrylamide gel electrophoresis (Patent Document 1).
しかし、該特許文献１に記載の技術は、ＰＣＲ法を適用する前に、煩雑なポリエチレングリコール沈澱法及び／又はポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるＤＮＡ分画処理を必要とするものであった。また、該特許文献１に記載の技術は、植物性加工食品の原料として遺伝子組み換え植物が使用されたか否かを判別するのに用いられるものであって、目的とする遺伝子の存否のみを判断するものであった。 However, the technique described in Patent Document 1 requires complicated DNA fractionation treatment by polyethylene glycol precipitation and / or polyacrylamide gel electrophoresis before applying the PCR method. The technique described in Patent Document 1 is used to determine whether or not a genetically modified plant is used as a raw material for processed vegetable foods, and only determines the presence or absence of a target gene. It was a thing.
さらには、食品から細菌を分離し、該分離した細菌のＤＮＡ断片にＰＣＲ法を適用して増幅させ、増幅させたＤＮＡ断片に電気泳動法を適用して電気泳動像を得て、該電気泳動像に基づいて細菌を検出する技術があった（特許文献２）。 Furthermore, the bacteria are separated from the food, the DNA fragments of the separated bacteria are amplified by applying a PCR method, the electrophoresis method is applied to the amplified DNA fragments to obtain an electrophoretic image, and the electrophoresis There has been a technique for detecting bacteria based on an image (Patent Document 2).
しかし、該前記特許文献２において試料とする食品は、非加熱又は加熱後に細菌を植菌した食品、即ち、細菌が加熱による損傷を受けていない食品であった。また、用いられるＰＣＲ法は、特殊なＳＳＣ−ＰＣＲ法で、多数のプライマーを合成するという非常に煩雑な作業を伴うものであった。
本発明は、加熱処理が施された加工食品中の、加熱工程において損傷を受けたり、死滅した菌の種類を同定する方法を提供するものである。 This invention provides the method of identifying the kind of microbe which was damaged in the heating process in the processed food which was heat-processed, or was killed.
本発明者は係る課題を解決するために鋭意研究したところ、加熱処理を施した加工食品からＤＮＡを抽出してＤＮＡ溶液を得て、該ＤＮＡ溶液中のＤＮＡを増幅させたＰＣＲ産物を得て、さらに変性勾配ゲル電気泳動法を用いて塩基配列の異なるＤＮＡを分離することができることを見いだし、本発明の加工食品中の菌種の同定方法を提案することができた。 The present inventor has intensively studied to solve the problem. As a result, DNA is extracted from the processed food that has been heat-treated to obtain a DNA solution, and a PCR product obtained by amplifying the DNA in the DNA solution is obtained. Furthermore, it was found that DNAs having different base sequences can be separated using denaturing gradient gel electrophoresis, and a method for identifying bacterial species in processed foods of the present invention could be proposed.
すなわち本発明の第一は、加熱処理を施した加工食品からＤＮＡを抽出してＤＮＡ溶液を得る工程、
該ＤＮＡ溶液にＰＣＲ法を適用してＤＮＡを増幅させたＰＣＲ産物を得る工程、
該ＰＣＲ産物に変性勾配ゲル電気泳動法を適用して、該ＰＣＲ産物中の塩基配列が相違するＤＮＡ毎にＤＮＡを分離する工程、
該分離したＤＮＡ毎に、塩基配列を解読する工程、
該解読した塩基配列毎に菌種を同定する工程、
を備えることを特徴とする加工食品中の菌種の同定方法である。
That is, the first of the present invention is a step of extracting DNA from a heat-processed processed food to obtain a DNA solution,
Applying a PCR method to the DNA solution to obtain a PCR product obtained by amplifying DNA;
Applying a denaturing gradient gel electrophoresis method to the PCR product, and separating the DNA for each DNA having a different base sequence in the PCR product;
A step of decoding a base sequence for each separated DNA,
Identifying a bacterial species for each decoded base sequence,
It is the identification method of the microbial species in processed food characterized by providing.
本発明の第二は、前記変性勾配ゲル電気泳動法を適用するＰＣＲ産物中のＤＮＡ量を１２５ｎｇ／μｌ以上とすることを特徴とする請求項１に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。 The method according to claim 1, wherein the amount of DNA in the PCR product to which the denaturing gradient gel electrophoresis method is applied is 125 ng / μl or more. It is.
本発明の第三は、前記ＤＮＡ溶液にＰＣＲ法を複数回適用してから変性勾配ゲル電気泳動法を適用することを特徴とする請求項１又は２に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。 The third aspect of the present invention is the identification of the bacterial species in the processed food according to claim 1 or 2, wherein a denaturing gradient gel electrophoresis method is applied after applying a PCR method to the DNA solution a plurality of times. Is the method.
本発明の第四は、前記ＰＣＲ法により増幅するＤＮＡの部位がリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡであることを特徴とする請求項１、２又は３に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。 The fourth aspect of the present invention is the method for identifying a bacterial species in a processed food according to claim 1, 2 or 3, wherein the DNA amplified by the PCR method is a DNA derived from ribosomal RNA. .
本発明の第五は、前記分離したＤＮＡ毎に、ＤＮＡ量をＰＣＲ法により増幅させてから、塩基配列を解読することを特徴とする請求項１、２、３又は４に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。 In the fifth aspect of the present invention, in the processed food according to claim 1, 2, 3, or 4, the base sequence is decoded after the amount of DNA is amplified by the PCR method for each separated DNA. This is a method for identifying the bacterial species.
本発明の第六は、前記変性勾配ゲル電気泳動法が変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。 Sixth of the present invention, the denaturing gradient gel electrophoresis method is a denaturing agent concentration gradient gel electrophoresis method, wherein the bacterial species in the processed food according to claim 1, 2, 3, 4 or 5 This is an identification method.
本発明の第七は、前記菌が酵母及び／又は乳酸菌であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。 A seventh aspect of the present invention is the method for identifying a bacterial species in processed food according to claim 1, 2, 3, 4, 5 or 6, wherein the bacterium is yeast and / or lactic acid bacterium.
本発明の第八は、前記加工食品を粉砕してからＤＮＡを抽出することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６又は７に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。 The eighth aspect of the present invention is the identification of the bacterial species in the processed food according to claim 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7, wherein the processed food is crushed and then DNA is extracted. Is the method.
本発明の第九は、前記加工食品がベーカリー製品であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。 A ninth aspect of the present invention is the method for identifying a bacterial species in a processed food according to claim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8, wherein the processed food is a bakery product. is there.
本発明の第十は、前記ベーカリー製品が食パン、フランスパン、ライ麦パン、サワーブレッド又は中華まんじゅうであることを特徴とする請求項９に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。 The tenth aspect of the present invention is the method for identifying a bacterial species in a processed food according to claim 9, wherein the bakery product is bread, French bread, rye bread, sour bread or Chinese bun.
本発明の第十一は、前記ベーカリー製品のクラム（内相）部分からＤＮＡを抽出することを特徴とする請求項９又は１０に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。 The eleventh aspect of the present invention is the method for identifying a bacterial species in a processed food according to claim 9 or 10, wherein DNA is extracted from a crumb (inner phase) portion of the bakery product.
本発明の加工食品中の菌種の同定方法によって、加熱処理が施された加工食品中の加熱工程において損傷したり、死滅した菌の種類を同定することが可能となっている。 According to the method for identifying a bacterial species in a processed food of the present invention, it is possible to identify the type of bacteria that are damaged or killed in a heating process in a processed food that has been subjected to heat treatment.
このため加熱処理を施した加工食品として、パン、ドーナツ、パイ、中華まんじゅう等のベーカリー製品の中で、特に、乳酸菌等の醗酵種を用いて製品の特徴付けがされることのある食パン、フランスパン、ライ麦パン、サワーブレッド及び中華まんじゅうで用いられた菌種を同定することによって、菌の種類による加工食品に与える影響を解析することが可能となる。 For this reason, as a processed food that has been heat-treated, among bread products such as bread, donuts, pies, and Chinese buns, especially bread that may be characterized using fermented species such as lactic acid bacteria, France By identifying the bacterial species used in bread, rye bread, sour bread and Chinese manju, it becomes possible to analyze the effect of the type of fungus on the processed food.
本発明における加熱処理を施した加工食品とは、焼成、蒸成、油揚その他の加熱工程を経て製造された加工食品である。本発明では、特に限定されるものではないが、例えば、パン、ドーナツ、パイ、中華まんじゅう等のベーカリー製品が望ましい。特に、乳酸菌等の醗酵種を用いて製品の特徴付けがされることのある食パン、フランスパン、ライ麦パン、サワーブレッド及び中華まんじゅうであることがより望ましい。 The processed food subjected to the heat treatment in the present invention is a processed food produced through baking, steaming, frying, and other heating processes. Although it does not specifically limit in this invention, For example, bakery products, such as bread, donut, pie, and Chinese bun, are desirable. In particular, it is more desirable to use white bread, French bread, rye bread, sour bread and Chinese bun, which may be characterized using fermented species such as lactic acid bacteria.
また、本発明において、加熱処理を施した加工食品として、ベーカリー製品を採用する場合には、該ベーカリー製品のクラム（内相）部分を試料として用いることが望ましい。これは、ベーカリー製品のクラム部分は、クラスト（外相）部分と比較して加熱によるＤＮＡの損傷が少ないため、クラム部分からＤＮＡを抽出した方が、より純度の高いＤＮＡ溶液が得られ、より有効に菌種の同定を行うことができるようになるからである。 In the present invention, when a bakery product is employed as the processed food subjected to heat treatment, it is desirable to use the crumb (inner phase) portion of the bakery product as a sample. This is because the crumb portion of the bakery product has less DNA damage due to heating compared to the crust (outer phase) portion, so extracting the DNA from the crumb portion yields a more pure DNA solution and is more effective This is because the bacterial species can be identified.
また、前記加工食品は、粉砕してから試料として用いることが望ましく、本発明における菌は、酵母及び／又は乳酸菌であることが望ましい。 The processed food is desirably used after pulverization as a sample, and the bacteria in the present invention are preferably yeast and / or lactic acid bacteria.
本発明では、まず、加熱処理を施した加工食品から、該加工食品中の菌のＤＮＡを抽出してＤＮＡ溶液を得る。 In the present invention, first, a DNA solution is obtained by extracting bacterial DNA in the processed food from the heat-treated processed food.
本発明において、ＤＮＡの抽出は、ＤＮＡ抽出の基本的な手法とされているＣＴＡＢ法、ＳＤＳ−フェノール法、プロテアーゼＫ法、その他を用いることができるし、また、市販化されているＤＮＡ抽出用キットを用いることもできる。 In the present invention, the CTAB method, the SDS-phenol method, the protease K method, etc., which are the basic methods for DNA extraction, can be used for DNA extraction. Kits can also be used.
ＣＴＡＢ法を採用する場合には、例えば、以下の通り行うことができる。 When the CTAB method is adopted, for example, it can be performed as follows.
まず、試料とする加工食品にＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）抽出液を加え、攪拌して、保温した後、遠心分離してその上清を得る。次に、該上清にＰＣＩ（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール）溶液を加え、振とうして、遠心分離してその上層を得る。 First, a CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) extract is added to a processed food sample, stirred and kept warm, and then centrifuged to obtain a supernatant. Next, a PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) solution is added to the supernatant, shaken, and centrifuged to obtain an upper layer.
次に、該上層にイソプロピルアルコールを加え、混和した後、遠心分離してその沈澱物を乾燥する。該乾燥させた沈澱物にＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）とリボヌクレアーゼAを加え、保温した後、ＣＴＡＢ抽出液を加え、さらにＣＩＡ（クロロホルム：イソアミルアルコール）を加えて、混和した後、遠心分離してその上層を得る。該上層にイソプロピルアルコールを加えて混和し、遠心分離してその沈澱物を乾燥する。該乾燥させた沈澱物に滅菌水を加え、ＤＮＡを溶解してＤＮＡ溶液を得ることにより行うことができる。 Next, isopropyl alcohol is added to the upper layer, mixed, and centrifuged to dry the precipitate. TE (Tris-EDTA) and ribonuclease A are added to the dried precipitate, and after keeping warm, CTAB extract is added, CIA (chloroform: isoamyl alcohol) is further added and mixed, and then centrifuged. Get the upper layer. Isopropyl alcohol is added to the upper layer, mixed, and centrifuged to dry the precipitate. Sterile water is added to the dried precipitate to dissolve the DNA to obtain a DNA solution.
次に、前記ＤＮＡ溶液中のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅させてＰＣＲ産物を得る。 Next, the DNA in the DNA solution is amplified by a PCR method to obtain a PCR product.
ここで、ＰＣＲ法を適用する前に、ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ量を測定してからＰＣＲ法を適用することが望ましい。該ＤＮＡ量の測定は、例えば、分光光度計を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度からＤＮＡ量を測定したり、ゲル電気泳動装置を用いて、電気泳動を行い、電気泳動後のゲルを染色して紫外線照射等によりゲルが分布する部分を可視化して該可視化した部分（バンド）と、同時に電気泳動させた予めＤＮＡ量が明らかであるＤＮＡ分子量マーカー（ラダーマーカー）のバンドとの濃淡の比較に基づいて前記可視化したバンド中のＤＮＡ量を算出することにより行なうこともできる。 Here, before applying the PCR method, it is desirable to apply the PCR method after measuring the amount of DNA in the DNA solution. The amount of DNA can be measured, for example, by measuring the amount of DNA from the absorbance at 260 nm using a spectrophotometer, or performing electrophoresis using a gel electrophoresis apparatus, and staining the gel after electrophoresis to obtain ultraviolet light. Based on the comparison of the density of the visualized part (band) by irradiation etc. and the visualized part (band) and the band of the DNA molecular weight marker (ladder marker) that has been preliminarily electrophoresed and whose DNA amount is clear in advance. It can also be carried out by calculating the amount of DNA in the visualized band.
なお、ここでの「ゲル電気泳動」は、例えば、ＤＮＡを電気泳動させてＤＮＡの長さの相違によりＤＮＡを分離するアガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動を採用することができる。 The “gel electrophoresis” used herein may be, for example, agarose gel electrophoresis or polyacrylamide gel electrophoresis in which DNA is electrophoresed and DNA is separated according to the difference in DNA length.
ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ量は、好ましくは１０〜１００ｎｇ／μｌの範囲内となるように調製することが望ましい。ＤＮＡ量が少な過ぎる場合には、その後のＰＣＲによるＤＮＡの増幅に悪影響を及ぼすおそれがある。従って、このような場合には、改めて、加工食品からＤＮＡを抽出し直して前記好ましい範囲のＤＮＡ量とすることが望ましく、さらには、試料の量を最初のＤＮＡ抽出に用いた量よりも多くして、改めて、ＤＮＡ抽出をし直して前記好ましい範囲のＤＮＡ量とすることがより望ましい。 The amount of DNA in the DNA solution is preferably adjusted to be in the range of 10 to 100 ng / μl. If the amount of DNA is too small, it may adversely affect subsequent DNA amplification by PCR. Therefore, in such a case, it is desirable to extract the DNA from the processed food again to obtain the preferable amount of DNA, and moreover, the amount of the sample is larger than the amount used for the initial DNA extraction. Thus, it is more desirable that the DNA extraction is performed again to obtain the DNA amount within the above preferable range.
また、ＤＮＡ量が前記好ましい範囲よりも多い場合には、ＤＮＡ溶液を適宜蒸留水で希釈して、前記好ましい範囲内のＤＮＡ量とすることが望ましい。 When the amount of DNA is larger than the above preferred range, it is desirable to dilute the DNA solution with distilled water as appropriate to obtain the amount of DNA within the above preferred range.
本発明において、ＰＣＲは常法により行うことができる。具体的には、例えば、前記ＤＮＡ溶液、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド）、緩衝液、プライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ及び水の混合液をチューブに入れて、該チューブをＰＣＲ反応装置に設置して、熱変性、アニーリング及び伸張（重合）反応を繰り返し行う。 In the present invention, PCR can be performed by a conventional method. Specifically, for example, the DNA solution, dNTP (deoxynucleotide), buffer solution, primer pair, DNA polymerase and water mixed solution are put in a tube, the tube is placed in a PCR reaction apparatus, and heat denaturation, Repeat annealing and stretching (polymerization) reactions.
ここで、ＰＣＲにより増幅させるＤＮＡの部位は、リボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡであることが望ましい。例えば、菌が乳酸菌である場合には、１６ｓリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ、また、酵母である場合には、１８ｓリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡであることが望ましい。 Here, the DNA site amplified by PCR is desirably DNA derived from ribosomal RNA. For example, when the bacterium is a lactic acid bacterium, DNA derived from 16s ribosomal RNA is desirable, and when the bacterium is yeast, it is desirably DNA derived from 18s ribosomal RNA.
リボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡの塩基配列は、菌種毎の変異に富んだ領域（菌種毎に特徴的な配列）を備えているため、菌種に特異なリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡの塩基配列をＰＣＲにより増幅させることにより、菌種の同定がより有効に行うことができるようになる。 Since the base sequence of DNA derived from ribosomal RNA has a region rich in mutation for each bacterial species (characteristic sequence for each bacterial species), the base sequence of DNA derived from ribosomal RNA specific to the bacterial species is PCR Thus, the bacterial species can be identified more effectively.
また、一方で、リボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡは、保存性の高い領域（菌種にかかわらず共通の配列）をも備えているため、ＰＣＲで用いるプライマーの設定をより有効に行うことができるようになる。 On the other hand, ribosomal RNA-derived DNA also has a highly conserved region (a common sequence regardless of the bacterial species), so that the primers used in PCR can be set more effectively. Become.
ＰＣＲに用いるプライマーは、ＰＣＲによる増幅の標的とするＤＮＡに応じて適宜該ＤＮＡに特異なプライマーを選択して使用する。具体的には、例えば、乳酸菌１６ｓリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡを標的とする場合には、以下に示すプライマー対を用いることが望ましい。 As a primer used for PCR, a primer specific to the DNA is appropriately selected and used according to the DNA to be amplified by PCR. Specifically, for example, when targeting DNA derived from lactic acid bacteria 16s ribosomal RNA, it is desirable to use the following primer pairs.
５´―ＡＧＣ ＡＧＴ ＡＧＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＴＣＣ Ａ−３´
５´―ＧＣクランプ―ＡＴＴ ＴＣＡ ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＡＣ ＡＴＧ−３´
5'-AGC AGT AGG GAA TCT TCC A-3 '
5'-GC clamp-ATT TCA CCG CTA CAC ATG-3 '
この場合、ＧＣクランプとは、ＧＣに富んだ配列のことであり、例えば、以下に示す配列が使用可能である。 In this case, the GC clamp is a GC-rich sequence. For example, the following sequences can be used.
CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG
また、温度プログラムは、用いるプライマー対に応じて適宜設定することができる。具体的には、例えば、上記プライマー対を用いる場合には、９４℃で３分間保持した後、９４℃で１分間（熱変性）、６１℃で１分間（アニーリング）及び７２℃で３分間（伸張（重合）反応）を１サイクルとして、これを３５サイクル行った後、７２℃で７分間保持する温度プログラムを採用することが望ましい。得られたＰＣＲ産物を保管する場合には、４℃で保管することが望ましい。 The temperature program can be set as appropriate according to the primer pair used. Specifically, for example, in the case of using the above primer pair, after holding at 94 ° C. for 3 minutes, 94 ° C. for 1 minute (thermal denaturation), 61 ° C. for 1 minute (annealing), and 72 ° C. for 3 minutes ( It is desirable to employ a temperature program in which an extension (polymerization) reaction) is performed as one cycle and 35 cycles are performed, and then held at 72 ° C. for 7 minutes. When storing the obtained PCR product, it is desirable to store at 4 ° C.
ＰＣＲ産物は精製することが望ましい。後述するように、複数回のＰＣＲを適用する場合には、ＰＣＲを適用した毎にＰＣＲ産物を精製するのが望ましい。こうすることにより、より有効に菌種の同定を行うことができるようになる。ここでのＰＣＲ産物の精製方法は、特に限定されるものではなく、例えば、エタノール沈澱法等により行なうこともできるし、市販されているＰＣＲ産物精製用キットを用いて精製することも可能であり、望ましい。 It is desirable to purify the PCR product. As will be described later, when a plurality of PCRs are applied, it is desirable to purify the PCR product every time PCR is applied. By doing so, it becomes possible to identify bacterial species more effectively. The PCR product purification method here is not particularly limited, and can be performed, for example, by ethanol precipitation, or can be purified using a commercially available PCR product purification kit. ,desirable.
次に、前記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物中のＤＮＡ量を測定することが望ましい。ここでのＤＮＡ量測定は、前記ＤＮＡ抽出後のＤＮＡ溶液のＤＮＡ量測定と同様にして行うことができる。 Next, it is desirable to measure the amount of DNA in the PCR product obtained by the PCR. The DNA amount measurement here can be performed in the same manner as the DNA amount measurement of the DNA solution after the DNA extraction.
本発明では、ＤＮＡが加熱工程により損傷を受けて、ＰＣＲにより増幅させても十分なＤＮＡ量が得られないおそれがあり、その後の変性勾配ゲル電気泳動により、ＤＮＡを検出できなくなるおそれがあるため、前記ＰＣＲ産物中のＤＮＡ量が１２５ｎｇ／μｌ以上となるようにすることが望ましい。ＰＣＲ産物中のＤＮＡ量が１２５ｎｇ／μｌよりも少ない場合には、さらに１回又は複数回ＰＣＲを行って、ＤＮＡ量を１２５ｎｇ／μｌ以上としてから変性勾配ゲル電気泳動することが望ましい。２回目以降のＰＣＲ条件は、最初のそれと同様の条件を採用できるし、条件を変えて行うこともできる。 In the present invention, the DNA is damaged by the heating step, and there is a possibility that a sufficient amount of DNA cannot be obtained even if amplified by PCR, and there is a possibility that the DNA cannot be detected by subsequent denaturing gradient gel electrophoresis. It is desirable that the amount of DNA in the PCR product is 125 ng / μl or more. When the amount of DNA in the PCR product is smaller than 125 ng / μl, it is desirable to perform PCR one or more times to increase the DNA amount to 125 ng / μl or more before performing denaturing gradient gel electrophoresis. The PCR conditions for the second and subsequent times can be the same as the first PCR conditions, or can be performed by changing the conditions.
次に、前記ＰＣＲ産物を変性勾配ゲル電気泳動法に供して、前記ＰＣＲ産物中の塩基配列が相違するＤＮＡ毎にＤＮＡを分離する。変性勾配電気泳動法は、変性剤の濃度勾配や温度勾配を利用して、ＤＮＡの塩基配列の相違によりＤＮＡを分離する手法である。変性勾配ゲル電気泳動法は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動法（ＴＧＧＥ）等の方法により行うことができる。以下では、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法を用いる場合について説明する。 Next, the PCR product is subjected to denaturing gradient gel electrophoresis to separate the DNA for each DNA having a different base sequence in the PCR product. Denaturing gradient electrophoresis is a technique for separating DNA based on the difference in DNA base sequence using a denaturing agent concentration gradient or temperature gradient. Denaturing gradient gel electrophoresis can be performed by methods such as denaturing agent concentration gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE). Below, the case where denaturing agent concentration gradient gel electrophoresis is used is explained.
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動は、例えば、変性剤として尿素とホルムアミドの混合物を用い、該変性剤の濃度勾配を３５％から５０％としたポリアクリルアミドゲル上で、前記ＰＣＲ産物を一定温度（例えば、６０℃）で、６０Ｖで１３時間定電圧で電気泳動を行うことが望ましい。これにより、該ゲル上の前記ＰＣＲ産物に含まれる２本鎖ＤＮＡは、該ゲルの変性濃度に応じて部分解離しながら、該ゲル上を泳動する。該解離度は、塩基配列に依存しており、そして、該解離度により該ゲル上での部分解離したＤＮＡの移動度が異なるため、該移動度の相違を検出することにより、塩基配列の異なるＤＮＡ毎にＤＮＡを分離することができる。 Denaturant concentration gradient gel electrophoresis is performed by, for example, using a mixture of urea and formamide as a denaturing agent, and the PCR product on a polyacrylamide gel in which the concentration gradient of the denaturing agent is 35% to 50% (for example, , 60 ° C.), and it is desirable to perform electrophoresis at 60 V and a constant voltage for 13 hours. Thereby, the double-stranded DNA contained in the PCR product on the gel migrates on the gel while being partially dissociated according to the denaturation concentration of the gel. The degree of dissociation depends on the base sequence, and the mobility of partially dissociated DNA on the gel differs depending on the degree of dissociation. Therefore, the base sequence differs by detecting the difference in mobility. DNA can be separated for each DNA.
具体的には、例えば、前記変性勾配ゲル電気泳動後のゲルを染色して、ＵＶトランスイルミネーター等による紫外線照射等により、泳動したＤＮＡがゲル中に分布する部分（バンド）を可視化した電気泳動像を得る。該染色は、特に限定されるものではないが、電気泳動後のゲルの染色に一般的に用いられる、エチジウムブロマイド、その他により行うことができる。そして、前記電気泳動像は、必要に応じ、ＣＣＤカメラ等で撮影して電気泳動像の写真を得て、さらには、該写真をスキャナでコンピュータに取り込んでもよい。 Specifically, for example, the gel after the denaturing gradient gel electrophoresis is stained, and an electrophoresis in which a portion (band) in which the migrated DNA is distributed in the gel is visualized by ultraviolet irradiation with a UV transilluminator or the like Get a statue. Although this dyeing | staining is not specifically limited, Ethidium bromide etc. which are generally used for dyeing | staining of the gel after electrophoresis can be performed. Then, if necessary, the electrophoretic image may be taken with a CCD camera or the like to obtain a photo of the electrophoretic image, and the photo may be taken into a computer with a scanner.
本発明では、ＤＮＡの塩基配列の解読・決定の前に、好ましくは、前記ゲル中のＤＮＡをＰＣＲにより増幅させることが望ましい。この場合、前記バンドに対応する部分毎にゲルを、例えば、ピペット、ガラス棒、爪楊枝等で採取して、前記採取したゲル毎に、該ゲルをＰＣＲ法に供してもよいし、または、該ゲル毎にＤＮＡを抽出、例えば、該ゲルに蒸留水を加えて攪拌後、遠心分離することにより得られた上清をＤＮＡ溶液として、該ＤＮＡ溶液にＰＣＲ法を適用してもよい。 In the present invention, it is preferable to amplify the DNA in the gel by PCR before decoding and determining the base sequence of the DNA. In this case, a gel may be collected for each portion corresponding to the band, for example, with a pipette, a glass rod, a toothpick, etc., and the gel may be subjected to a PCR method for each collected gel, or DNA may be extracted for each gel, for example, distilled water may be added to the gel and stirred, and then the supernatant obtained by centrifugation may be used as the DNA solution, and the PCR method may be applied to the DNA solution.
この場合のＰＣＲの条件は、例えば、上述したＰＣＲの条件と同じ条件を採用することが望ましいが、別の条件を採用することもできる。そして、ここで得られたＰＣＲ産物をそれぞれ精製することが望ましい。ここでの精製は、上述したＰＣＲ産物の精製と同様に行うことができる。即ち、ＰＣＲ産物の精製の常法を用いることができ、市販されているＤＮＡ精製キットを用いてＤＮＡを精製することができる。 In this case, for example, it is desirable to adopt the same conditions as the PCR conditions described above, but other conditions may be employed. And it is desirable to refine | purify each PCR product obtained here. The purification here can be performed in the same manner as the purification of the PCR product described above. That is, a conventional method for purifying PCR products can be used, and DNA can be purified using a commercially available DNA purification kit.
次に、前記分離した、好ましくは分離してＰＣＲにより増幅した、より好ましくは分離・抽出してＰＣＲにより増幅した、さらにより好ましくは分離・抽出してＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を精製したＤＮＡ毎に塩基配列を解読して決定する。 Next, the separated, preferably separated and amplified by PCR, more preferably separated and extracted and amplified by PCR, and even more preferably the separated and extracted PCR product obtained by PCR. Decide the base sequence every time.
該ＤＮＡの塩基配列の解読及び決定は、常法であるサンガー法やマクサム−ギルバート法等を採用することができ、特に限定されるものではない。 The decoding and determination of the base sequence of the DNA can employ a conventional Sanger method, Maxam-Gilbert method, or the like, and is not particularly limited.
本発明では、簡便性及び感度の良好性からサンガー法を採用することが望ましい。サンガー法のうち、ｄｄＮＴＰ（ジデオキシヌクレオチド）を蛍光標識して行なうダイターミネータ法を採用した場合の一例を示すと、例えば、まず、前記分離した、好ましくは分離してＰＣＲにより増幅した、より好ましくは分離・抽出してＰＣＲにより増幅した、さらにより好ましくは分離・抽出してＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を精製したＤＮＡと、緩衝液、プライマー（５´―ＡＧＣ ＡＧＴ ＡＧＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＴＣＣ Ａ−３´）、ＤＮＡポリメラーゼ及び水の混合液（マスターミックス）を作成して、４つのチューブに分注する。 In the present invention, it is desirable to adopt the Sanger method because of its simplicity and good sensitivity. An example of adopting a dye terminator method in which ddNTP (dideoxynucleotide) is fluorescently labeled among the Sanger methods is shown. For example, first, the separated, preferably separated and amplified by PCR, more preferably DNA isolated and extracted and amplified by PCR, and even more preferably, purified and PCR product obtained by PCR after separation and extraction, buffer, primer (5'-AGC AGT AGG GAA TCT TCC A-3 ' ), Prepare a mixture of DNA polymerase and water (master mix) and dispense into 4 tubes.
次に、蛍光基質を含有するｄｄＮＴＰ（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ）を、前記４つのチューブに、１つのチューブにつき１種類ずつ加え、それぞれのチューブをＰＣＲ反応装置に設置して、例えば、９５℃で２分間保持した後、９５℃で３０秒間（熱変性）、５０℃で３０秒間（アニーリング）及び７２℃で４５秒間伸張（重合）反応を１サイクルとして、これを３０サイクル行った後、７２℃で５分間保持する温度プラグラムによりＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ産物中の未反応ｄｄＮＴＰを除去してから、ＰＣＲ産物を９５℃で３分間熱変性させ、氷上に載置する。 Next, ddNTP containing a fluorescent substrate (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) is added to each of the four tubes, one for each tube, and each tube is placed in a PCR reaction apparatus. After holding for 2 minutes at 95 ° C., 30 cycles at 95 ° C. (thermal denaturation), 30 seconds at 50 ° C. (annealing), and 45 seconds at 72 ° C. (polymerization) were performed for 30 cycles. PCR is performed with a temperature program held at 72 ° C. for 5 minutes. After removing unreacted ddNTP in the obtained PCR product, the PCR product is heat denatured at 95 ° C. for 3 minutes and placed on ice.
ここで得られたＰＣＲ産物は、それぞれｄｄＡＴＰで終結するポリヌクレオチド鎖ＤＮＡ、ｄｄＣＴＰで終結するポリヌクレオチド鎖ＤＮＡ、ｄｄＧＴＰで終結するポリヌクレオチド鎖ＤＮＡ及びｄｄＴＴＰで終結するポリヌクレオチド鎖ＤＮＡのみを含有し、さらに、それぞれのＰＣＲ産物中のポリヌクレオチド鎖は、様々な長さのものが混在する。 The PCR products obtained here contain only the polynucleotide chain DNA terminating with ddATP, the polynucleotide chain DNA terminating with ddCTP, the polynucleotide strand DNA terminating with ddGTP, and the polynucleotide strand DNA terminating with ddTTP, respectively. Furthermore, the polynucleotide chain in each PCR product is mixed in various lengths.
次に、シーケンサーにより、それぞれのＰＣＲ産物を電気泳動する。前述したように、前記ＰＣＲ産物中には、様々長さの異なるポリヌクレオチド鎖を有するＤＮＡが存在することから、これらを電気泳動した場合には、ポリヌクレオチド鎖の短いＤＮＡ程遠くまで移動することとなる。そして、電気泳動後のゲルを染色して紫外線等で照射すると、蛍光基質により、ＤＮＡが分布する部分が発色してバンドを形成するので、該バンドを遠くまで移動した順（ポリヌクレオチド鎖の短い順）に塩基を読んでいくことで塩基配列を解読する。 Next, each PCR product is electrophoresed by a sequencer. As described above, since there are DNAs having different lengths of polynucleotide strands in the PCR product, when they are electrophoresed, they move farther as the DNA with shorter polynucleotide strands. Become. When the gel after electrophoresis is stained and irradiated with ultraviolet rays or the like, a portion where DNA is distributed is colored by the fluorescent substrate to form a band. The base sequence is decoded by reading the bases in order).
上述のように解読した塩基配列を、例えば、インターネットによる塩基配列のデータベースに基づく相同性検索やコンピュータによる相同性解析等の手法により、菌種を同定する。 The bacterial sequence is identified from the base sequence decoded as described above by, for example, a homology search based on a base sequence database on the Internet or a homology analysis using a computer.
加熱処理が施された加工食品として、市販されているパン・ド・カンパーニュ（フランスパンの一種）４種類を試料（試料１〜４）として用いて、以下に示すように本発明により各試料中の乳酸菌種を同定した。
〔試料〕
As processed foods subjected to heat treatment, four kinds of commercially available breads de campagne (a kind of French bread) were used as samples (samples 1 to 4), and each sample according to the present invention was used as follows. Of lactic acid bacteria were identified.
〔sample〕
パン・ド・カンパーニュのクラム部分を家庭用ミキサーで粉砕して試料とした。
〔ＤＮＡ抽出〕
A crumb portion of bread de campagne was crushed with a home mixer to prepare a sample.
[DNA extraction]
前記試料から、ＤＮＡ抽出用キット「ＩＳＯＰＬＡＮＴ２」（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）を用いて、以下に示す通り、ＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ溶液を得た。 DNA was extracted from the sample using a DNA extraction kit “ISOPLANT2” (manufactured by NIPPON GENE) as shown below to obtain a DNA solution.
２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを終濃度０．５％となるように緩衝液に加えた溶液１ｍｌに、前記試料２００ｍｇを加えて混合し、１４ｋ×ｇ、４℃の条件で１０分間遠心分離して、沈殿物を得る。 200 ml of the sample is added to 1 ml of a solution obtained by adding 2-mercaptoethanol to the buffer so as to have a final concentration of 0.5%, and the mixture is centrifuged at 14 k × g and 4 ° C. for 10 minutes to obtain a precipitate. Get.
２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを終濃度１％となるように「ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ」に加えた溶液３００μｌと前記沈殿物とを１〜２秒間混合・攪拌する。 300 μl of 2-mercaptoethanol added to “Solution I” to a final concentration of 1% and the precipitate are mixed and stirred for 1 to 2 seconds.
前記混合・攪拌物に１％ＮａＢＨ?溶液を３０μｌ加えて混合し、さらに、「ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ」を１５０μｌ加えて、１０秒間攪拌した後、５０℃で１０分間静置した。 30 μl of a 1% NaBH solution was added to the mixed and stirred product, and then 150 μl of “Solution II” was added and stirred for 10 seconds, and then allowed to stand at 50 ° C. for 10 minutes.
静置した後の溶液に、「ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ−Ａ」を１００μｌ及び「ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ−Ｂ」を１２０μｌを加えて、１〜２秒間攪拌した後、氷上に１０分間静置し、さらにその後、１４ｋ×ｇ、４℃の条件で１０分間遠心分離して、遠心分離後の水相を得る。 To the solution after standing, 100 μl of “Solution III-A” and 120 μl of “Solution III-B” were added, stirred for 1 to 2 seconds, then left on ice for 10 minutes, and then 14 k × g, Centrifugation is performed at 4 ° C. for 10 minutes to obtain an aqueous phase after centrifugation.
該水相に２倍量エタノールを混合し、６ｋ×ｇ、室温の条件で５分間遠心分離して、沈殿物を得る。該沈殿物に７０％エタノールを混合し、６ｋ×ｇ、室温の条件で１分間遠心分離し、得られた沈殿物を乾燥させた後、ｐＨ８．０のＴＥを加えて、ＤＮＡ溶液を得た。
分光光度計（Beckman社製）を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度から該ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ量を測定した。いずれのＤＮＡ溶液も、ＤＮＡ量は１０〜１００ｎｇ／μｌの範囲内であった。
〔ＰＣＲ〕
The aqueous phase is mixed with 2 volumes of ethanol and centrifuged at 6 k × g and room temperature for 5 minutes to obtain a precipitate. The precipitate was mixed with 70% ethanol, centrifuged at 6 k × g and room temperature for 1 minute, and the resulting precipitate was dried, and then pH 8.0 TE was added to obtain a DNA solution. .
The amount of DNA in the DNA solution was measured from the absorbance at 260 nm using a spectrophotometer (Beckman). In all the DNA solutions, the amount of DNA was in the range of 10 to 100 ng / μl.
[PCR]
前記ＤＮＡ溶液中の１６ｓリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡを増幅の標的として、ＰＣＲ反応装置「サーマルサイクラー」（ＢＩＯ―ＲＡＤ社製）を用いて以下の条件にてＰＣＲ法を適用した。
〔反応液〕
The PCR method was applied under the following conditions using a PCR reactor “thermal cycler” (manufactured by BIO-RAD) with the DNA derived from 16s ribosomal RNA in the DNA solution as a target for amplification.
(Reaction solution)
反応液は総量２５μｌとし、５０ｎｇ DNA、DNAポリメラーゼとして「ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ」(ＴａＫａＲａ社製)０．１μＬを使用し、また、緩衝液及びｄＮＴＰは「ＥｘＴａｑ」に付属の「ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ」と「ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ」を使用した。また、各プライマー溶液は最終濃度が２．５μＭとなるように反応液に加えた。
〔プライマー対〕
The total amount of the reaction solution is 25 μl, 50 ng DNA, 0.1 μL of “TaKaRa ExTaq” (manufactured by TaKaRa) is used as the DNA polymerase, and the buffer solution and dNTP are “PCRBuffer” and “dNTP Mixture” attached to “ExTaq”. It was used. Each primer solution was added to the reaction solution so that the final concentration was 2.5 μM.
[Primer pair]
５´―ＡＧＣ ＡＧＴ ＡＧＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＴＣＣ Ａ−３´
５´―ＧＣクランプ―ＡＴＴ ＴＣＡ ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＡＣ ＡＴＧ−３´
5'-AGC AGT AGG GAA TCT TCC A-3 '
5'-GC clamp-ATT TCA CCG CTA CAC ATG-3 '
〔ＧＣクランプ〕 [GC clamp]
CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG
〔温度プログラム〕
CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG
[Temperature program]
〔精製〕 [Purification]
前記ＰＣＲにより得たＰＣＲ産物をＤＮＡ精製キット（「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」ＱＩＡＧＥＮ社製）により以下のように精製した。 The PCR product obtained by the PCR was purified as follows using a DNA purification kit (“QIAquick PCR Purification Kit” manufactured by QIAGEN).
前記ＰＣＲ産物２０μｌに５倍量の「バッファーＰＢ」を加え十分混合した後、１３，０００ｒｐｍで６０秒間遠心分離して、上清を除去する。次いで、「バッファーＰＥ」を７５０μｌ加えて、１３，０００ｒｐｍで６０秒間遠心分離して、上清を除去する。次いで、３０μｌの蒸留水を加えて、６０秒間そのまま保持した後、１３，０００ｒｐｍで６０秒間遠心分離して、精製したＰＣＲ産物を得た。
〔ＰＣＲ〕
After adding 5 times the amount of “Buffer PB” to 20 μl of the PCR product and mixing well, the supernatant is removed by centrifugation at 13,000 rpm for 60 seconds. Next, 750 μl of “buffer PE” is added and centrifuged at 13,000 rpm for 60 seconds to remove the supernatant. Next, 30 μl of distilled water was added and held for 60 seconds, and then centrifuged at 13,000 rpm for 60 seconds to obtain a purified PCR product.
[PCR]
前記精製したＰＣＲ産物を前記ＰＣＲと同様の条件にてＰＣＲ（２回目）を適用した。該２回目のＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物の精製と同様に精製した。該精製した２回目のＰＣＲ産物中のＤＮＡ量を、分光光度計（Beckman社製)を用いて２６０ｎｍにおける吸光度から測定したところ、いずれも１２５ｎｇ／μｌ以上であった。
〔変性勾配ゲル電気泳動〕
PCR (second time) was applied to the purified PCR product under the same conditions as in the PCR. The second PCR product was purified in the same manner as the PCR product. The amount of DNA in the purified second PCR product was measured from the absorbance at 260 nm using a spectrophotometer (manufactured by Beckman), and all were 125 ng / μl or more.
[Denaturing gradient gel electrophoresis]
前記２回目のＰＣＲ産物を「Ｄコードシステム」（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により、以下の条件にて、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供して、ＤＮＡを塩基配列の相違するＤＮＡ毎に分離した。 The second PCR product was subjected to denaturant concentration gradient gel electrophoresis using the “D code system” (manufactured by BIO-RAD) under the following conditions to separate the DNA for each DNA having a different base sequence. .
８％ポリアクリルアミドゲル
変性剤：７Ｍ尿素、４０％ホルムアミド
変性剤濃度勾配：３５％〜５０％
６０Ｖ、１３時間定電圧
8% polyacrylamide gel denaturing agent: 7M urea, 40% formamide denaturing agent concentration gradient: 35% to 50%
60V, 13 hours constant voltage
前記変性剤濃度勾配ゲル電気泳動後のゲルを発色用試薬（「ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎn Ｉ」ＴａＫａＲａ社製）で染色した後、トランスイルミネーターで紫外線照射して分離したＤＮＡが分布する部分を発色させて可視化したバンドを有する電気泳動像を得た。
〔ＤＮＡ抽出〕
The gel after the denaturant concentration gradient gel electrophoresis is stained with a coloring reagent (“SYBR Green I” manufactured by TaKaRa), and then irradiated with ultraviolet rays using a transilluminator to develop a color and visualize the portion where the separated DNA is distributed. An electrophoretic image having the obtained band was obtained.
[DNA extraction]
前記バンド毎に、バンドに対応する部分のゲルをガラス棒により採取して、チューブに入れ、これに、蒸留水を加えて、攪拌・遠心分離して得られた上清をＤＮＡ溶液とした。
〔ＰＣＲ〕
For each band, a portion of the gel corresponding to the band was collected with a glass rod and placed in a tube. Distilled water was added thereto, and the supernatant obtained by stirring and centrifuging was used as the DNA solution.
[PCR]
前記ゲルから抽出したＤＮＡ溶液毎に前記ＰＣＲと同様の条件にてＰＣＲ（３回目）を適用した。
〔ＤＮＡ精製〕
For each DNA solution extracted from the gel, PCR (third time) was applied under the same conditions as in the PCR.
[DNA purification]
前記３回目のＰＣＲ産物をＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）により、上記精製と同様の条件にて精製した。
〔ダイターミネータ法〕
The third PCR product was purified with a DNA purification kit (manufactured by QIAGEN) under the same conditions as described above.
[Die terminator method]
前記精製した３回目のＰＣＲ産物から、ダイターミネータ法により、塩基配列を決定した。
〔マスターミックス組成（２７μｌ）〕
From the purified third PCR product, the base sequence was determined by the dye terminator method.
[Master mix composition (27 μl)]
精製した３回目のＰＣＲ産物 １μｌ
プライマー（５´―ＡＧＣ ＡＧＴ ＡＧＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＴＣＣ Ａ−３´）３μｌ
バッファー ２μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ（「ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ」Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製） ２μｌ
蒸留水 １９μｌ
1 μl of purified third PCR product
Primer (5′-AGC AGT AGG GAA TCT TCC A-3 ′) 3 μl
2 μl of buffer
DNA polymerase (“ThermoSequenase” Pharmacia Biotech) 2 μl
19 μl of distilled water
４つのチューブを用意し、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの４種のｄｄＮＴＰ（「ＩＲＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｘ」Ａｌｏｋａ社製）を１つのチューブにつき、１種類を２μｌ入れる。該４つチューブに、前記組成のマスターミックスをそれぞれ６．５μｌずつ入れた。
〔ＰＣＲ〕
Four tubes are prepared, and 2 kinds of ddNTPs of A, C, G, and T (“IRDyeTermination mix” manufactured by Aloka) are put in 2 μl per tube. In each of the four tubes, 6.5 μl of the master mix having the above composition was placed.
[PCR]
前記４つのチューブをＰＣＲ反応装置にセットして、以下の温度プログラムにより、ＰＣＲ法を適用した。
〔温度プログラム〕
The four tubes were set in a PCR reactor, and the PCR method was applied according to the following temperature program.
[Temperature program]
〔未反応ｄｄＮＴＰの除去〕 [Removal of unreacted ddNTP]
ここで得られた４種類のＰＣＲ産物をそれぞれ以下の方法にて精製して、未反応のｄｄＮＴＰを除去した。 The four types of PCR products obtained here were purified by the following method to remove unreacted ddNTPs.
ＰＣＲ産物（８．５μｌ）に３ＭＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を１μｌ、リニアポリアクリルアミド（「ビビッドバイオレット」ＣＨＩＭＥＲｘ社製）を１μｌ加え、さらに、１００％エタノールを２０μｌを加え混合して、室温で５分間放置した。 1 μl of 3M NaOAc (pH 5.2) and 1 μl of linear polyacrylamide (“Vivid Violet” manufactured by CHIMERx) are added to the PCR product (8.5 μl), and 20 μl of 100% ethanol is further added and mixed for 5 minutes at room temperature. I left it alone.
次に、これを１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。 Next, this was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed.
さらに、７０％エタノールを２００μｌ加え、混合した後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、沈澱物を乾燥させた。 Furthermore, after adding 200 μl of 70% ethanol and mixing, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and the precipitate was dried.
乾燥させた沈殿物に蒸留水３μｌを加えて攪拌した後、反応停止液（Ａｌｏｋａ社製）を１．５μｌ添加して、９５℃で３分間熱変性させ、氷上に置いた。
〔電気泳動〕
After 3 μl of distilled water was added to the dried precipitate and stirred, 1.5 μl of a reaction stop solution (Aloka) was added, heat-denatured at 95 ° C. for 3 minutes, and placed on ice.
[Electrophoresis]
前記未反応ｄｄＮＴＰ液を除去したＰＣＲ産物をそれぞれ１μｌずつシーケンサー（「ＤＮＡシーケンシングシステム」Ａｌｏｋａ社製）により電気泳動させて、得られた電気泳動像からシーケンサーにより、それぞれ塩基配列を解読して決定した。
〔電気泳動条件〕
1 μl each of the PCR products from which the unreacted ddNTP solution has been removed are electrophoresed by a sequencer (“DNA sequencing system” manufactured by Aloka), and the determined base sequence is decoded from the obtained electrophoretic image by the sequencer. did.
[Electrophoretic conditions]
電圧 ２０００Ｖ
電流 ２５ｍＡ
電力 ５０ｗ
温度 ４５℃
時間 ９時間
〔相同性検索〕
Voltage 2000V
Current 25mA
Electric power 50w
Temperature 45 ° C
Time 9 hours [homology search]
前記決定した塩基配列に基づき、それぞれＢＬＡＳＴ（「Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ」）により、相同性検索を行い、それぞれの塩基配列から菌種を同定した。
〔結果〕
Based on the determined base sequence, homology search was performed by BLAST (“Basic local alignment search tool”), and the bacterial species was identified from each base sequence.
〔result〕
各試料から検出された乳酸菌１６ｓリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡの塩基配列と９９％以上の相同性を有する乳酸菌種を以下の表３に示す。
パン・ド・カンパーニュは、田舎風のフランスパンとも言われ、一般的に、全粒粉やライ麦等を原料の一部として含み、これらに特有の穀物臭をマスキングするために、乳酸菌等の醗酵種を用いた製パン法が採用されることが多い。前記結果により、同定された菌種は、いずれも乳酸菌で、パン用乳酸菌醗酵種に利用される菌種であることから、試料１乃至４は、いずれも乳酸菌醗酵種を用いて製造されたものと推測された。また、それぞれ試料は異なる風味を有するものであったが、これは上記結果のように乳酸菌種の相違、乳酸菌の組合せの相違による影響が大きいものと推測された。 Bread de campagne is also said to be a rustic French bread, and generally contains whole grains, rye, etc. as part of the raw material, and in order to mask the peculiar grain odor of these, fermented species such as lactic acid bacteria are used. The bread making method used is often adopted. Based on the above results, the bacterial species identified are all lactic acid bacteria and are the bacterial species used for the lactic acid bacteria fermentation species for bread, so samples 1 to 4 were all manufactured using the lactic acid bacteria fermentation species. It was speculated. Moreover, although each sample had a different flavor, it was speculated that this was largely influenced by the difference in lactic acid bacteria species and the combination of lactic acid bacteria as in the above results.
加熱処理が施された加工食品として、市販されているバゲット（フランスパンの一種）６種類を試料（試料５〜１０）として用いて、実施例１と同様にして、各試料中の乳酸菌種を同定した。 Using 6 kinds of commercially available baguettes (a kind of French bread) as samples (samples 5 to 10) as processed foods subjected to heat treatment, the lactic acid bacteria species in each sample were obtained in the same manner as in Example 1. Identified.
なお、試料８及び試料９については、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法適用前の２回目のＰＣＲ産物中のＤＮＡ量は、１２５ｎｇ／μｌを大きく下回っていた。いずれも２回のＰＣＲによってもＤＮＡ量の増幅が認められなかったことから、さらにＰＣＲ法を適用することなく、他の試料と同様に、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法を適用した。
〔結果〕
For Sample 8 and Sample 9, the amount of DNA in the second PCR product before application of the denaturant gradient gel electrophoresis method was significantly lower than 125 ng / μl. In both cases, amplification of the amount of DNA was not recognized by two PCRs, and thus the denaturant concentration gradient gel electrophoresis method was applied in the same manner as other samples without applying the PCR method.
〔result〕
試料８及び９からは乳酸菌が検出されなかった。バゲットに関しては、製造者が製品を特徴付けるために、乳酸菌醗酵種を使用する場合と、敢えて使用しない場合とがあると考えられ、試料５、６、７及び１０に関しては前者、試料８及び９に関しては後者の場合であると推測された。 Lactic acid bacteria were not detected from Samples 8 and 9. With regard to baguettes, it is considered that the manufacturer may or may not use lactic acid fermenting species to characterize the product, with respect to samples 5, 6, 7 and 10, the former, and samples 8 and 9. Was assumed to be the latter case.
〔初種の調製〕 (Preparation of the first species)
以下の表５に示す配合からなる原料を混合し、該混合物を２７℃で２７時間醗酵させて初種の種起こしをする。 The raw material which consists of a mixing | blending shown in the following Table 5 is mixed, and this mixture is fermented at 27 degreeC for 27 hours, and seeding | inducing of a first kind is carried out.
〔継ぎ種の調製〕 (Preparation of joint seed)
該初種の一部を元種として、以下の表６に示す配合からなる原料を混合し、該混合物を２７℃で２４時間醗酵させて継ぎ種を調製する。 A raw material having the composition shown in Table 6 below is mixed using a part of the initial species as the original species, and the mixture is fermented at 27 ° C. for 24 hours to prepare a joint seed.
該継ぎ種の一部を元種として、以下の表７に示す配合からなる原料を混合し、該混合物を２７℃で２４時間、定期的に攪拌しながら、醗酵させて継ぎ種２を調製する。 Using a part of the joint seed as the original seed, a raw material having the composition shown in Table 7 below is mixed, and the mixture is fermented at 27 ° C. for 24 hours with regular stirring to prepare joint seed 2. .
該継ぎ種２の一部を元種として、以下の表８に示す配合からなる原料を混合し、該混合物を２７℃で１２時間、定期的に攪拌しながら、醗酵させて継ぎ種３を調製して、１０℃で１２時間保存する。 Using a part of the joint seed 2 as an original seed, a raw material having the composition shown in Table 8 below is mixed, and the mixture is fermented at 27 ° C. for 12 hours with regular stirring to prepare a joint seed 3 And store at 10 ° C. for 12 hours.
〔醗酵種の調製〕
該保存後の継ぎ種３の一部を元種として、以下の表９に示す配合からなる原料を混合し、該混合物を２７℃で８時間醗酵させて継ぎ種４を調整して、１０℃で保存する。これを何回も繰り返して醗酵種とする。
[Preparation of fermented species]
The raw material consisting of the composition shown in Table 9 below is mixed using a part of the seed 3 after storage as the original seed, and the mixture is fermented at 27 ° C. for 8 hours to adjust the seed 4 to 10 ° C. Save with. This is repeated many times to make a fermented seed.
〔パンの作成〕
前記醗酵種を使用して、以下の表１０に示す配合と表１１に示す工程によりパリジャン（フランスパンの一種）を製造する。
[Creating bread]
Using the fermented seeds, Parisien (a kind of French bread) is produced by the formulation shown in Table 10 below and the steps shown in Table 11.
前記醗酵種並びに実施例３−１及び実施例３−２のパリジャンを試料として用いて、前記実施例１と同様にして、各試料中の乳酸菌種を同定した。（但し、醗酵種については、粉砕せずに、そのまま試料としてＤＮＡを抽出した。）
〔結果〕
Using the fermentation species and the Parisians of Examples 3-1 and 3-2 as samples, the lactic acid bacteria species in each sample were identified in the same manner as in Example 1. (However, with respect to the fermented species, DNA was extracted as a sample without being crushed.)
〔result〕
前記醗酵種、実施例３−１及び実施例３−２から同定された乳酸菌種は、いずれもL.sanfranciscensisであった。 The lactic acid bacteria species identified from the fermentation species, Example 3-1 and Example 3-2 were all L. sanfranciscensis.
加熱工程を経る前の前記醗酵種には、優勢種としてL.sanfranciscensisが存在し、該醗酵種を用いて加熱処理を施して作成されたパンからもL.sanfranciscensisが同定されたことから、本発明により、加熱処理を施した加工食品から加熱処理前に存在した菌種を同定することができることが確認できた。 In the fermented species before passing through the heating step, L. sanfranciscensis exists as a dominant species, and L. sanfranciscensis was also identified from bread made by heat treatment using the fermented species. According to the invention, it was confirmed that the bacterial species existing before the heat treatment can be identified from the processed food subjected to the heat treatment.
Claims (11)
該ＤＮＡ溶液にＰＣＲ法を適用してＤＮＡを増幅させたＰＣＲ産物を得る工程、
該ＰＣＲ産物に変性勾配ゲル電気泳動法を適用して、該ＰＣＲ産物中の塩基配列が相違するＤＮＡ毎にＤＮＡを分離する工程、
該分離したＤＮＡ毎に、塩基配列を解読する工程、
該解読した塩基配列毎に菌種を同定する工程、
を備えることを特徴とする加工食品中の菌種の同定方法。 Extracting DNA from processed food that has been heat-treated to obtain a DNA solution;
Applying a PCR method to the DNA solution to obtain a PCR product obtained by amplifying DNA;
Applying a denaturing gradient gel electrophoresis method to the PCR product, and separating the DNA for each DNA having a different base sequence in the PCR product;
A step of decoding a base sequence for each separated DNA,
Identifying a bacterial species for each decoded base sequence,
A method for identifying bacterial species in processed foods, comprising:
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015111443A1 (en) * | 2014-01-27 | 2015-07-30 | 株式会社 日立ハイテクノロジーズ | Nucleic acid analyzing device |
| JP2016513975A (en) * | 2013-03-14 | 2016-05-19 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | Diagnostic system and method |
-
2006
- 2006-02-24 JP JP2006048666A patent/JP2007222105A/en active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JPN6010037125, Ｅｕｒ． Ｆｏｏｄ． Ｒｅｓ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ｖｏｌ． ２０９， ｐａｇｅｓ １８５−１９１ （１９９９） * |
| JPN6010037126, Ｉｎｔ． Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． １０１， ｐａｇｅｓ ３３３−３３９ （２００５） * |
| JPN6010037128, Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ｖｏｌ． ９９， ｐａｇｅｓ ２１６−２２１ （２００５） * |
| JPN6010037129, Ｆｏｏｄ． Ｐｒｅｓｅｒｖ． Ｓｃｉ．， ｖｏｌ． ３０， ｐａｇｅｓ １９５−１９８ （２００４） * |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10975416B2 (en) | 2013-03-14 | 2021-04-13 | Gen-Probe Incorporated | Method for processing the contents of a processing vial within an instrument |
| US11434521B2 (en) | 2013-03-14 | 2022-09-06 | Gen-Probe Incorporated | Method for conducting an assay |
| US9732374B2 (en) | 2013-03-14 | 2017-08-15 | Gen-Probe Incorporated | Method for analyzing a plurality of samples |
| JP2018015006A (en) * | 2013-03-14 | 2018-02-01 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | Diagnostic systems and methods |
| JP2020039365A (en) * | 2013-03-14 | 2020-03-19 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | Diagnostic systems and methods |
| US10711297B2 (en) | 2013-03-14 | 2020-07-14 | Gen-Probe Incorporated | Automated method for analyzing samples |
| JP2016513975A (en) * | 2013-03-14 | 2016-05-19 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | Diagnostic system and method |
| US11279967B2 (en) | 2013-03-14 | 2022-03-22 | Gen-Probe Incorporated | System and method for conducting an assay |
| US11840722B2 (en) | 2013-03-14 | 2023-12-12 | Gen-Probe Incorporated | Diagnostic systems and methods |
| US11732288B2 (en) | 2013-03-14 | 2023-08-22 | Gen-Probe Incorporated | Assembly having reagent pack loading station |
| US11732289B2 (en) | 2013-03-14 | 2023-08-22 | Gen-Probe Incorporated | Receptacle distribution system |
| US11761027B2 (en) | 2013-03-14 | 2023-09-19 | Gen-Probe Incorporated | System and method for receiving and storing reagent packs in an instrument |
| US11761026B2 (en) | 2013-03-14 | 2023-09-19 | Gen-Probe Incorporated | Diagnostic system and method |
| US11834701B2 (en) | 2013-03-14 | 2023-12-05 | Gen-Probe Incorporated | Reagent pack changer |
| WO2015111443A1 (en) * | 2014-01-27 | 2015-07-30 | 株式会社 日立ハイテクノロジーズ | Nucleic acid analyzing device |
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