JP2007212248A - Detecting method of hybridization - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a detection method of hybridization capable of performing accurate detection by reducing a current flowing between each fixed electrode, since the current flows between each fixed electrode, when each fixed electrode has each different electric potential because of an influence of characteristic dispersion of amplifiers installed respectively on each electrode. <P>SOLUTION: In a micro-reaction chip wherein a plurality of fixed electrodes having respectively a fixing surface on which a probe for capturing an organism-related substance is fixed are provided, this method has a grouping process for numbering position numbers on a plurality of fixing surfaces in a two-dimensional array (m, n) from the end in due order, for example, a group comprising every three component (4m+1, 4n+1) (m, n=0, 1, 2, 3, ...)etc, and grouping by selecting each fixing surface at fixed intervals; a fixing process for synthesizing electrochemically the probes and fixing them on each fixing surface; and a detection process for measuring a current by applying a voltage simultaneously to each group. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、たとえばマイクロ反応チップを用いたＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの生体関連物質のハイブリダイゼーションの検出方法に関する。   The present invention relates to a method for detecting hybridization of a biological substance such as DNA (deoxyribonucleic acid) using, for example, a micro reaction chip.

近年、生物の多様な遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が進められており、
これらの遺伝子発現や塩基配列の解析のために、例えば、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなどのようなマイクロ反応チップに、固相基板上に高密度に異なるプローブ核酸を配列、固定したチップが用いられている。そして、このプローブ核酸に別途調製された一本鎖のターゲット核酸を供給し、配列の相補性による結合の有無を検出することで遺伝子発現や塩基配列の解析を行なっている。
ここで、ＤＮＡチップ上のプローブ核酸断片とターゲット核酸断片とのハイブリダイゼーションを検出する方法として、二本鎖核酸断片に特異的に結合し、かつ電気化学的に活性な二本鎖核酸断片標識体を用いて検出する方法や、酸化還元酵素を標識することで電気化学的測定によりターゲット核酸を検出する方法がある。 In recent years, technology development for efficiently analyzing various gene functions of living organisms has been promoted.
In order to analyze these gene expression and base sequences, for example, a chip in which different probe nucleic acids are arrayed and fixed on a solid phase substrate at a high density is used for a micro reaction chip such as a DNA chip or a DNA microarray. Yes. A single-stranded target nucleic acid prepared separately is supplied to the probe nucleic acid, and gene expression and base sequence analysis are performed by detecting the presence or absence of binding due to sequence complementarity.
Here, as a method for detecting the hybridization between the probe nucleic acid fragment on the DNA chip and the target nucleic acid fragment, a double-stranded nucleic acid fragment label that binds specifically to the double-stranded nucleic acid fragment and is electrochemically active And a method of detecting a target nucleic acid by electrochemical measurement by labeling an oxidoreductase.

このようなプローブ核酸を配列、固定する方法としては、あらかじめ調整されたプローブ核酸断片を電極の表面に結合固定する方法や、電極の表面で直接オリゴヌクレオチドを
合成する方法が知られている。電極の表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィ技術および固相合成技術を組み合わせ、所定の微小なマトリックス領域でのオリゴヌクレオチドの選択的な合成を行う方法が代表的であるが、電気化学反応によりオリゴヌクレオチドを電極の表面で選択的に合成する方法が提案されている（例えば、特許文献
１参照）。 As a method for arranging and fixing such probe nucleic acid, a method of binding and fixing a probe nucleic acid fragment prepared in advance on the surface of an electrode and a method of directly synthesizing an oligonucleotide on the surface of the electrode are known. As a method of directly synthesizing oligonucleotides on the surface of an electrode, a combination of the use of a protective group that is selectively removed by light irradiation, a photolithography technique and a solid-phase synthesis technique used in semiconductor manufacturing, A method of selectively synthesizing oligonucleotides in a matrix region is representative, but a method of selectively synthesizing oligonucleotides on the surface of an electrode by an electrochemical reaction has been proposed (for example, see Patent Document 1). ).

図４は、従来のマイクロ反応チップの概略平面図および概略断面図である。
ＤＮＡチップは、シリコンウエハ上に、図４に示すように、プローブ核酸断片が結合固定された電極であって絶縁性の基材５１表面の複数箇所に設けられた固定電極５２と
、各固定電極５２とプローブ核酸断片を介して対向配置された対向電極５３とを備えている。例えばＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：相補型金属酸化膜半導体）に接続されている。そして、固定電極５２と対向電極５３とを流れる信号電流や、固定電極５２と対向電極５３の間の電位差を測定する。
ここで上述した酸化還元酵素を標識としてハイブリダイゼーションの検出を行うために、固定電極５２と対向電極５３との間には、用いる基質によって異なるが、５０ｍＶ~５００ｍＶの酸化還元電位が印加される。なお、各固定電極５２の間隔は例えば、０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍ、また固定電極５２と対向電極５３との距離は例えば０．０５〜１．０ｍｍである。
特表２０００−５１４８０２号公報 FIG. 4 is a schematic plan view and a schematic cross-sectional view of a conventional micro reaction chip.
As shown in FIG. 4, the DNA chip is an electrode to which probe nucleic acid fragments are bound and fixed on a silicon wafer, and is provided at a plurality of locations on the surface of the insulating substrate 51. 52 and a counter electrode 53 arranged to face each other via a probe nucleic acid fragment. For example, it is connected to a CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor: complementary metal oxide semiconductor). Then, the signal current flowing through the fixed electrode 52 and the counter electrode 53 and the potential difference between the fixed electrode 52 and the counter electrode 53 are measured.
Here, in order to detect hybridization using the above-described oxidoreductase as a label, an oxidation-reduction potential of 50 mV to 500 mV is applied between the fixed electrode 52 and the counter electrode 53 depending on the substrate used. The interval between the fixed electrodes 52 is, for example, 0.05 mm to 0.5 mm, and the distance between the fixed electrode 52 and the counter electrode 53 is, for example, 0.05 to 1.0 mm.
Special Table 2000-514802

しかしながら、上記従来のハイブリダイゼーションの検出方法には、以下の課題が残されている。すなわち、検出速度を向上させるために、マイクロ反応チップのすべての固定電極に同時に電圧を印加して同時に結合による電気信号を検出するが、各電極にそれぞれ設置された増幅器の特性のばらつきの影響で、各固定電極でそれぞれ異なる電位を有していることがあり、各固定電極間で電流が流れることがある。この電流値の大きさが配列の相補性による結合の有無の電気信号に比較して十分小さくないので、結合の有無の電気信号が各固定電極間で流れる電流に埋もれる場合がある。ここで、各固定電極間の電位差は平均で１０ｍＶ〜３０ｍＶ、最大で５０ｍＶの場合もある。一方、固定電極と対向電極との電位差は５０ｍＶ〜５００ｍＶであって、各固定電極のばらつきは無視できない大きさとなっている。また、各固定電極間の距離が固定電極と対向電極の距離に対して数分の１と短いので、各固定電極間で流れる電流は、比較的大きいことになる。すなわち、実際に固定電極間を流れる電流が、対向電極と固定電極との間を流れる電流の大きさの半分程度になる場合もある。   However, the following problems remain in the conventional method for detecting hybridization. In other words, in order to improve the detection speed, a voltage is simultaneously applied to all the fixed electrodes of the micro reaction chip and the electrical signal due to the coupling is detected at the same time. The fixed electrodes may have different potentials, and current may flow between the fixed electrodes. Since the magnitude of the current value is not sufficiently small as compared with the electric signal indicating the presence or absence of coupling due to the array complementarity, the electric signal indicating the presence or absence of coupling may be buried in the current flowing between the fixed electrodes. Here, the potential difference between the fixed electrodes may be 10 mV to 30 mV on average and 50 mV at the maximum. On the other hand, the potential difference between the fixed electrode and the counter electrode is 50 mV to 500 mV, and the variation between the fixed electrodes is not negligible. Further, since the distance between the fixed electrodes is as short as a fraction of the distance between the fixed electrode and the counter electrode, the current flowing between the fixed electrodes is relatively large. That is, the current that actually flows between the fixed electrodes may be about half the magnitude of the current that flows between the counter electrode and the fixed electrode.

本発明は、前記課題に鑑みてなされたもので、各固定電極間を流れる電流を減少させ、精度よい検出を行うことができるハイブリダイゼーションの検出方法を提供することを目的とする。   The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a hybridization detection method that can reduce the current flowing between the fixed electrodes and perform accurate detection.

本発明のハイブリダイゼーションの検出方法は、生体関連物質を捕捉するプローブが固定されている固定面を有する固定電極が複数設けられていたマイクロ反応チップに前記プローブを固定し、該プローブを介して前記固定電極と対向配置される対向電極に電圧を印加するハイブリダイゼーションの検出方法において、前記複数の固定面の位置番号を端から順番に２次元配列（ｍ，ｎ）で番号付け、１つおきのグループ（２ｍ＋１、２ｎ＋１）（ｍ，ｎ＝０，１，２，３，・・・・）、２つおきのグループ（３ｍ＋１、３ｎ＋１）（ｍ，ｎ＝０，１，２，３，４，・・・）または３つおきのグループ（４ｍ＋１、４ｎ＋１）（ｍ，ｎ＝０，１，２，３，・・・）の場合を含む、ある一定の間隔を隔てた固定面を選んでグループ化する組分工程と、前記各固定面にプローブを電気化学的に合成して固定する固定工程と、そのグループ毎に同時に電圧を印加し、電流を測定する検出工程とを備えたことを特徴とする。   In the method for detecting hybridization according to the present invention, the probe is fixed to a microreaction chip provided with a plurality of fixed electrodes having a fixed surface to which a probe for capturing a biological substance is fixed, and the probe is inserted through the probe. In the detection method of hybridization in which a voltage is applied to a counter electrode arranged opposite to a fixed electrode, the position numbers of the plurality of fixed surfaces are numbered sequentially from the end in a two-dimensional array (m, n), and every other number Group (2m + 1, 2n + 1) (m, n = 0, 1, 2, 3,...) Every other group (3m + 1, 3n + 1) (m, n = 0, 1, 2, 3, 4, ..) Or every third group (4m + 1, 4n + 1) (m, n = 0, 1, 2, 3,...) Grouping process A fixing step of fixing by electrochemically synthesized probes to each fixing surface, applying simultaneously a voltage for respective groups, characterized by comprising a detection step of measuring the current.

本発明のハイブリダイゼーションの検出方法は、すべての固定面の電位の測定なしに、例えば、２つおきまたは５つおきに固定面をグループ分けし、このグループごとに電圧を印加して電気信号を検出している。すなわち、互いに隣接、または近距離の２つの固定面の電位が大きく異なっていても、組分工程で同時に印加する電極は十分離れているので、同時に電位を印加した固定面間の電流の流れはほとんど無視できる。また、印加していない固定面と印加した固定面間の電流の流れもない。これにより、電気信号の検出を行う一方の固定面に向けて検出を行わない他方の固定面から電流が流れ込まないので、一方の固定面で検出した電気信号に対するノイズを低減できる。したがって、精度よい検出・解析を行うことができる。   In the method for detecting hybridization of the present invention, without fixing the potentials of all the fixed surfaces, for example, every two or five fixed surfaces are grouped, and an electric signal is applied by applying a voltage to each group. Detected. That is, even if the potentials of two fixed surfaces adjacent to each other or close to each other are greatly different, the electrodes applied at the same time in the assembling process are sufficiently separated, so the current flow between the fixed surfaces to which the potential is applied simultaneously is Almost negligible. Further, there is no current flow between the fixed surface not applied and the fixed surface applied. As a result, current does not flow from the other fixed surface that is not detected toward the one fixed surface where the electric signal is detected, so that noise with respect to the electric signal detected on the one fixed surface can be reduced. Therefore, accurate detection / analysis can be performed.

また、本発明のハイブリダイゼーションの検出方法は、固定工程で、前記各グループを構成する前記固定面の少なくとも１つに、前記複数のグループで共通する参照用プローブを固定することが好ましい。
この発明では、各グループで参照用プローブがハイブリダイゼーションを行った際の電気信号を取得して比較することで、各グループで検出した参照用プローブ以外の他のプローブの電気信号を補正することができる。したがって、各グループ間における電気信号の検出結果のバラツキを抑制し、他のプローブにおける検出結果をより正確に解析することができる。 In the hybridization detection method of the present invention, it is preferable that, in the fixing step, a reference probe common to the plurality of groups is fixed to at least one of the fixing surfaces constituting the groups.
In this invention, the electrical signals of the probes other than the reference probe detected in each group can be corrected by acquiring and comparing the electrical signals when the reference probes are hybridized in each group. it can. Therefore, it is possible to suppress variation in the detection result of the electric signal between the groups, and to analyze the detection result of the other probe more accurately.

また、本発明のハイブリダイゼーションの検出方法は、前記マイクロ反応チップが、前記固定面から離間して該固定面の外周を囲む包括電極を備えることが好ましい。
この発明では、互いに近接する２つの固定面において電位差が生じていても、一方の固定面から他方の固定面に向けて流れる電流が一方の固定面と包括電極の間で流れる。これにより、近接する２つの固定面の間で電流が流れることを防止する。したがって、電気信号に対するノイズの低減が図れて電気信号の検出をより精度よく行うことができる。 In the hybridization detection method of the present invention, it is preferable that the micro reaction chip includes a comprehensive electrode that is spaced apart from the fixed surface and surrounds an outer periphery of the fixed surface.
In the present invention, even if a potential difference occurs between two fixed surfaces that are close to each other, a current that flows from one fixed surface toward the other fixed surface flows between the one fixed surface and the global electrode. This prevents current from flowing between two adjacent fixed surfaces. Therefore, the noise with respect to the electric signal can be reduced, and the electric signal can be detected with higher accuracy.

本発明のハイブリダイゼーションの検出方法によれば、互いに近接する２つの固定面における電位が大きく異なっても、組分工程で隣接固定面は異なるグループに分別されるので、検出工程で、接近したこの２つの固定面に同時に電圧が印加されない。したがって電気信号の検出を行う一方の固定面に他方の固定面から電流が流れ込まない。そのため、一方の固定面における電気信号に対するノイズの低減が図れ、より精度よい検出を行うことができる。   According to the method for detecting hybridization of the present invention, even if the potentials at two fixed surfaces adjacent to each other are greatly different, the adjacent fixed surfaces are separated into different groups in the grouping step. No voltage is applied to the two fixed surfaces simultaneously. Therefore, current does not flow from one fixed surface to the other fixed surface where electric signals are detected. Therefore, noise with respect to the electric signal on one fixed surface can be reduced, and more accurate detection can be performed.

（実施例１）
以下、本発明にかかるハイブリダイゼーションの検出方法の一実施例を、図面を参照しながら説明する。
図１は、本発明の実施例１におけるハイブリダイゼーションの検出方法が適用される検出装置の構成を示すブロック図である。
本実施例によるハイブリダイゼーションの検出方法は、図１に示すように、ＤＮＡチップ（マイクロ反応チップ）１と、ＤＮＡチップ１の電気的な制御を行う制御装置２とを用いて行う。
図２は、本実施例１のハイブリダイゼーションの検出方法におけるＤＮＡチップの部分平面図、Ｘ−Ｙ断面図である。
ＤＮＡチップ１は、図２に示すように、ＣＭＯＳ部１１と、ＣＭＯＳ部１１の上面に形成されているプローブ核酸（プローブ、図省略）が固定されている合成電極部１２とを備えている。 Example 1
Hereinafter, an embodiment of a method for detecting hybridization according to the present invention will be described with reference to the drawings.
FIG. 1 is a block diagram illustrating a configuration of a detection apparatus to which the hybridization detection method according to the first embodiment of the present invention is applied.
The hybridization detection method according to this embodiment is performed using a DNA chip (microreaction chip) 1 and a control device 2 that performs electrical control of the DNA chip 1 as shown in FIG.
FIG. 2 is a partial plan view and XY cross-sectional view of the DNA chip in the hybridization detection method of the first embodiment.
As shown in FIG. 2, the DNA chip 1 includes a CMOS unit 11 and a synthetic electrode unit 12 to which a probe nucleic acid (probe, not shown) formed on the upper surface of the CMOS unit 11 is fixed.

ＣＭＯＳ部１１は、合成電極部１２に対して印加する電圧を制御するＣＭＯＳ能動素子部１５と、ＣＭＯＳ能動素子部１５と外部とを接続する入出力電極１６と、ＣＭＯＳ能動素子部１５および入出力電極１６の外表面に形成されてＣＭＯＳ能動素子部１５を保護するＣＭＯＳ保護層１７とを備えている。   The CMOS unit 11 includes a CMOS active element unit 15 that controls a voltage applied to the composite electrode unit 12, an input / output electrode 16 that connects the CMOS active element unit 15 and the outside, a CMOS active element unit 15, and an input / output unit. A CMOS protective layer 17 formed on the outer surface of the electrode 16 and protecting the CMOS active element portion 15 is provided.

ＣＭＯＳ能動素子部１５は、後述する固定電極部（固定電極）２３および包囲電極部（包囲電極）２４に対してそれぞれ独立して電圧を印加すると共に、後述する各固定面２３ａで検出した電圧を増幅して後述する電位測定部３１に出力するよう構成されている。
入出力電極１６は、例えばＡｌ（アルミニウム）のような導電体によって構成されており、ＣＭＯＳ保護層１７に形成された貫通孔であるコンタクトホール１７ａから外部に向けて露出している。
また、ＣＭＯＳ保護層１７は、その膜厚が例えば２ｕｍであって、例えばＳｉＮ（窒化珪素）／ＳｉＯ２（二酸化珪素）のような絶縁体によって形成されている。 The CMOS active element portion 15 applies a voltage independently to the fixed electrode portion (fixed electrode) 23 and the surrounding electrode portion (surrounding electrode) 24 described later, and detects the voltage detected on each fixed surface 23a described later. It is configured to amplify and output to the potential measuring unit 31 described later.
The input / output electrode 16 is made of a conductor such as Al (aluminum), for example, and is exposed to the outside from a contact hole 17a which is a through hole formed in the CMOS protective layer 17.
The CMOS protective layer 17 has a thickness of, for example, 2 μm and is formed of an insulator such as SiN (silicon nitride) / SiO 2 (silicon dioxide).

合成電極部１２は、入出力電極１６と接続する接続電極部２１と、接続電極部２１を封止する第１絶縁層２２と、第１絶縁層２２上に形成されて接続電極部２１と接続する固定電極部２３および包囲電極部２４と、固定電極部２３、包囲電極２４および第１絶縁層２２を覆う第２絶縁層２５とを備えている。
接続電極部２１は、例えばＡｌによって形成されており、コンタクトホール１７ａを充填すると共に、一部がコンタクトホール１７ａ近傍におけるＣＭＯＳ保護層１７の上面に積層されている。この接続電極部２１は、コンタクトホール１７ａを充填するように、例えば３ｕｍ形成した後、ＣＭＯＳ保護層１７の上面からの突出量が０．５ｕｍ以下となるように平坦化されている。 The synthetic electrode unit 12 is formed on the connection electrode unit 21 connected to the input / output electrode 16, the first insulating layer 22 sealing the connection electrode unit 21, and the connection electrode unit 21 formed on the first insulating layer 22. The fixed electrode part 23 and the surrounding electrode part 24 which perform, and the 2nd insulating layer 25 which covers the fixed electrode part 23, the surrounding electrode 24, and the 1st insulating layer 22 are provided.
The connection electrode portion 21 is made of, for example, Al and fills the contact hole 17a, and a part thereof is laminated on the upper surface of the CMOS protective layer 17 in the vicinity of the contact hole 17a. The connection electrode portion 21 is flattened so that the amount of protrusion from the upper surface of the CMOS protective layer 17 is 0.5 μm or less after, for example, 3 μm is formed so as to fill the contact hole 17a.

第１絶縁層２２は、例えばＳｉＮやＳｉＯ２のような絶縁体によって構成されており、
接続電極部２１を充填するように形成されている。この第１絶縁層２２は、プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：化学的気相成長）法などを用いてＣＭＯＳ保護層１７または接続電極部２１の上面に、例えば厚さが０．５ｕｍとなるように平坦化して形成されている。
また、第１絶縁層２２には、平面視でＣＭＯＳ保護層１７に形成されたコンタクトホール１７ａと一致しない位置に、接続電極部２１に至る貫通孔であるコンタクトホール２２ａが設けられている。このコンタクトホール２２ａは、所定の開口形状を有するマスクパターンを用いたドライエッチングなどによって形成されている。 The first insulating layer 22 is made of, for example, insulator such as SiN or SiO 2,
It is formed so as to fill the connection electrode portion 21. The first insulating layer 22 is formed on the upper surface of the CMOS protective layer 17 or the connection electrode portion 21 by using a plasma CVD (Chemical Vapor Deposition) method or the like, for example, to have a thickness of 0.5 μm. It is formed by flattening.
The first insulating layer 22 is provided with a contact hole 22a that is a through hole reaching the connection electrode portion 21 at a position that does not coincide with the contact hole 17a formed in the CMOS protective layer 17 in plan view. The contact hole 22a is formed by dry etching using a mask pattern having a predetermined opening shape.

固定電極部２３は、例えばＰｔ（白金）によって構成されており、平面視でほぼ円形状を有している。そして、固定電極部２３の一部が、コンタクトホール２２ａ内に形成され
ることで、接続電極部２１に接続されている。この固定電極部２３は、所定の開口形状を有するマスクパターンを用いたスパッタリング法によって、第１絶縁層２２上に厚さが例えば０．２〜０．３ｕｍとなるように形成されている。
また、固定電極部２３には、第２絶縁層２５に形成された貫通孔２５ａによって外部に露出されていてプローブ核酸が固定化される固定面２３ａが形成されている。この固定面２３ａは、平面視においてほぼ円形となっており、その直径が例えば１０ｕｍ〜１００ｕｍとなっている。なお、固定電極部２３ａは第１絶縁層２２上の２方向で等間隔となるように複数設けられており、固定面２３ａが複数形成されることでマイクロアレイ化されている。 The fixed electrode portion 23 is made of, for example, Pt (platinum) and has a substantially circular shape in plan view. A part of the fixed electrode portion 23 is connected to the connection electrode portion 21 by being formed in the contact hole 22a. The fixed electrode portion 23 is formed on the first insulating layer 22 to have a thickness of 0.2 to 0.3 μm, for example, by sputtering using a mask pattern having a predetermined opening shape.
In addition, the fixed electrode portion 23 is formed with a fixing surface 23a that is exposed to the outside through a through hole 25a formed in the second insulating layer 25 and on which the probe nucleic acid is immobilized. This fixed surface 23a is substantially circular in plan view, and its diameter is, for example, 10 μm to 100 μm. A plurality of fixed electrode portions 23a are provided at equal intervals in two directions on the first insulating layer 22, and a plurality of fixed surfaces 23a are formed to form a microarray.

第２絶縁層２５は、例えばＳｉＮで形成されており、平面視において固定電極部２３と重なると共にコンタクトホール２２ａと一致しない位置に、円状の貫通孔２５ａが形成されている。また、第２絶縁層２５は、平面視において包囲電極２４と重なると共にコンタクトホール２２ａと一致しない位置に、環状の貫通孔２５ｂが形成されている。この貫通孔２５ｂによって、露出面２４ａが固定面２３ａの周囲を囲むように形成されている。   The second insulating layer 25 is made of, for example, SiN, and a circular through hole 25a is formed at a position that overlaps the fixed electrode portion 23 and does not coincide with the contact hole 22a in plan view. The second insulating layer 25 is formed with an annular through hole 25b at a position that overlaps with the surrounding electrode 24 in a plan view and does not coincide with the contact hole 22a. By this through hole 25b, the exposed surface 24a is formed so as to surround the periphery of the fixed surface 23a.

また、第２絶縁層２５は、プラズマＣＶＤ法を用いて固定電極部２３または第１絶縁層２２上に厚さが例えば０．７ｕｍ〜０．９ｕｍとなるように形成されている。そして、貫通孔２５ａ、２５ｂは、所定の開口形状を有するマスクパターンを用いたドライエッチングなどによって形成されている。   Further, the second insulating layer 25 is formed on the fixed electrode portion 23 or the first insulating layer 22 so as to have a thickness of, for example, 0.7 μm to 0.9 μm by using a plasma CVD method. The through holes 25a and 25b are formed by dry etching using a mask pattern having a predetermined opening shape.

制御装置２は、複数の固定面２３ａをグループに分けて組分判断部３２と、固定面２３ａと対向配置される対向電極３３と、対向電極３３と固定面２３ａとの間に電圧を印加する電圧印加部３４と、固定面２３ａに接続されたＣＭＯＳ能動素子部１５から出力された電気信号を検出する信号検出部３５と、記録部３６と、出力部３７を備えている。   The control device 2 divides the plurality of fixed surfaces 23a into groups and applies a voltage between the group determination unit 32, the counter electrode 33 arranged to face the fixed surface 23a, and the counter electrode 33 and the fixed surface 23a. The voltage application part 34, the signal detection part 35 which detects the electrical signal output from the CMOS active element part 15 connected to the fixed surface 23a, the recording part 36, and the output part 37 are provided.

組分判断部３２は、各固定面２３ａの電位の測定結果から、例えば隣接する５固定面ごとの固定面２３ａのグループ分けを行い、その結果を記録部３６に出力するように構成されている。
対向電極３３は、複数の固定面２３ａとそれぞれプローブを介して対向配列されている。
ハイブリダイゼーションの検出時には、プローブ核酸のハイブリダイゼーションにおける酵素反応で電流を取り出すために、対向電極３３と固定面２３ａとの間に酸化還元電位を与えている。なお、用いる基質によって、酸化還元電位が５０ｍＶ〜５００ｍＶとなっている。
電圧印加部３４は、グループ分けした固定面２３ａのグループごとにグループを構成する固定面２３ａと対向電極３３との間に電圧を印加するように構成されている。
信号検出部３５は、固定面２３ａと対向電極３３との間に電圧を印加されたときに固定面で検出される電気信号を検出し、その結果を記録部３６に出力するように構成されている。
記録部３６は、メモリなどによって構成されており、モニタやハードディスクなどで構成された出力部３７に信号検出部３５で検出した電気信号の強度を表示または出力させる
。 The group determination unit 32 is configured to perform grouping of the fixed surfaces 23a for every five adjacent fixed surfaces, for example, from the measurement result of the potential of each fixed surface 23a, and output the result to the recording unit 36. .
The counter electrode 33 is arranged to face the plurality of fixed surfaces 23a via probes.
At the time of detection of hybridization, an oxidation-reduction potential is applied between the counter electrode 33 and the fixed surface 23a in order to extract an electric current by an enzyme reaction in hybridization of the probe nucleic acid. Depending on the substrate used, the oxidation-reduction potential is 50 mV to 500 mV.
The voltage application unit 34 is configured to apply a voltage between the fixed surface 23a constituting the group and the counter electrode 33 for each group of the fixed surfaces 23a divided into groups.
The signal detection unit 35 is configured to detect an electrical signal detected on the fixed surface when a voltage is applied between the fixed surface 23 a and the counter electrode 33, and output the result to the recording unit 36. Yes.
The recording unit 36 is configured by a memory or the like, and causes the output unit 37 configured by a monitor, a hard disk, or the like to display or output the intensity of the electrical signal detected by the signal detection unit 35.

プローブ核酸は、表面で生態関連物質であるターゲット核酸を捕捉する核酸であって、固定面２３ａに電気化学的な合成によって結合固定されている。ここで、１つの固定面２３ａには同一種のプローブ核酸が結合固定されており、複数の固定面２３ａのそれぞれで各種プローブ核酸が結合固定されている。なお、本明細書において、「核酸」とは、一般的な塩基配列により表されるＤＮＡ、ＲＮＡ（リボ核酸）および核酸類似物質などを総括して示しており、このような核酸は天然に存在するものであっても、人工的に合成または修飾されたものであってもよい。   The probe nucleic acid is a nucleic acid that captures a target nucleic acid that is an ecologically related substance on the surface, and is bound and fixed to the fixing surface 23a by electrochemical synthesis. Here, the same type of probe nucleic acid is bonded and fixed to one fixed surface 23a, and various probe nucleic acids are bonded and fixed to each of the plurality of fixed surfaces 23a. In this specification, “nucleic acid” refers to DNA, RNA (ribonucleic acid), nucleic acid analogues, and the like that are represented by general base sequences, and such nucleic acids exist in nature. Or may be artificially synthesized or modified.

以上のような構成のＤＮＡチップ１を用いたハイブリダイゼーションの検出方法について説明する。なお、本実施例において、ＤＮＡチップ１は、１１行×３０列の固定面２３ａを有している。
本実施例におけるハイブリダイゼーションの検出方法は、組分工程と固定工程と、検査工程とで構成されている。
最初に、組分工程を行う。これは、電位測定部３１がＤＮＡチップ１の一点を基準として複数の固定面２３ａの電位を測定し、測定結果を記録部３６に出力する。この結果、例えば、各固定面２３ａに電位が得られる。
図３は、この組分工程の各固定面の電位分布およびグループの分布を示す説明図である。そして、組分判断部３２が記録部３６に記録された各固定面２３ａの電位測定結果から固定面２３ａのグループ分けを行う。たとえば、３固定面おきに測定するとか、５固定面おきに測定するとか、必要な測定精度に応じて同時に印加する各固定面間の距離を決める。精度が必要なときには、必要な距離だけ離れた電極で同時に電圧を印加することを決める。 A method for detecting hybridization using the DNA chip 1 configured as described above will be described. In the present embodiment, the DNA chip 1 has a fixing surface 23a of 11 rows × 30 columns.
The method for detecting hybridization in the present embodiment is composed of a grouping step, a fixing step, and an inspection step.
First, a grouping process is performed. This is because the potential measuring unit 31 measures the potentials of the plurality of fixing surfaces 23 a with respect to one point of the DNA chip 1 and outputs the measurement results to the recording unit 36. As a result, for example, a potential is obtained at each fixed surface 23a.
FIG. 3 is an explanatory diagram showing the potential distribution and group distribution of each fixed surface in this grouping process. Then, the group determination unit 32 performs grouping of the fixed surfaces 23 a from the potential measurement result of each fixed surface 23 a recorded in the recording unit 36. For example, the measurement is performed every 3 fixed surfaces, or every 5 fixed surfaces, or the distance between the fixed surfaces applied simultaneously is determined according to the required measurement accuracy. When accuracy is required, it is decided to apply a voltage simultaneously with electrodes separated by a necessary distance.

次に、固定工程を行う。これは、各固定面２３ａにプローブ核酸を電気化学的に合成して固定する。ここで、各グループを構成する固定面２３ａの少なくとも１つずつに共通のプローブ核酸を参照用プローブ核酸として固定する。このとき、グループに共通する参照用プローブを固定する個数は、所望する検出精度によって適宜設定するが、各グループで３箇所以上の固定面２３ａに参照用プローブを固定することが望ましい。   Next, a fixing process is performed. In this method, probe nucleic acids are electrochemically synthesized and fixed to each fixing surface 23a. Here, a common probe nucleic acid is fixed as a reference probe nucleic acid to at least one of the fixing surfaces 23a constituting each group. At this time, the number of reference probes common to the group is appropriately set according to the desired detection accuracy, but it is desirable to fix the reference probes to three or more fixing surfaces 23a in each group.

そして、検出工程を行う。これは、電気化学的検出法を用いて固定電極部２３と対向電極３３との間の電流値や電圧値などの電気信号の検出を行う。まず、ＤＮＡチップ１に別途調製したターゲット核酸を供給しグループＡを構成する固定面２３ａと対向電極３３との間に酸化還元電位として、例えば、１００ｍＶの電圧を印加する。このとき、固定したプローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションが起こると、固定面２３ａに電気信号が流れる。そして、信号検出部３５は、この電気信号を検出し、記録部３６に出力する。ここで、包囲電極部２４の電位が、固定電極部２３の電位とほぼ同じ電位となるように制御されている。
続いて、距離の離れたグループＢを構成する固定面２３ａと対向電極３３との間に電圧を印加して、ハイブリダイゼーションが発生した際の電気信号を信号検出部３５で検出する。 And a detection process is performed. This detects an electrical signal such as a current value or a voltage value between the fixed electrode portion 23 and the counter electrode 33 using an electrochemical detection method. First, a separately prepared target nucleic acid is supplied to the DNA chip 1, and a voltage of, for example, 100 mV is applied as an oxidation-reduction potential between the fixed surface 23a constituting the group A and the counter electrode 33. At this time, when hybridization between the immobilized probe nucleic acid and the target nucleic acid occurs, an electrical signal flows through the immobilization surface 23a. Then, the signal detection unit 35 detects this electric signal and outputs it to the recording unit 36. Here, the potential of the surrounding electrode portion 24 is controlled to be substantially the same as the potential of the fixed electrode portion 23.
Subsequently, a voltage is applied between the fixed surface 23a constituting the group B at a distance and the counter electrode 33, and an electric signal when hybridization occurs is detected by the signal detection unit 35.

その後、グループＢと同様に、グループＣ、Ｄのそれぞれを構成する固定面２３ａにおける電気信号を検出する。
そして、供給したターゲット核酸と、取得した電気信号から、固定面２３ａに固定されているプローブ核酸の遺伝子発現や塩基配列を解析する。この際、各グループＡ〜Ｄを構成する固定面２３ａに固定された参照用プローブのハイブリダイゼーションによる電気信号の検出結果を基に、各個底面２３ａで検出された電気信号を補正する。これは、基準グループであるプローブＡにおける参照用プローブの電気信号の検出結果と他のグループにおける参照用プローブの電気信号の検出結果とを比較し、その差を補正値とする。そして、各グループで検出された電気信号を補正値に基づいて補正する。 Thereafter, similarly to the group B, an electrical signal in the fixed surface 23a constituting each of the groups C and D is detected.
Then, gene expression and base sequence of the probe nucleic acid fixed to the fixing surface 23a are analyzed from the supplied target nucleic acid and the acquired electric signal. At this time, the electric signals detected on the individual bottom surfaces 23a are corrected based on the detection results of the electric signals by the hybridization of the reference probes fixed to the fixing surfaces 23a constituting the groups A to D. This compares the detection result of the electrical signal of the reference probe in the probe A, which is the reference group, with the detection result of the electrical signal of the reference probe in another group, and uses the difference as a correction value. Then, the electrical signal detected in each group is corrected based on the correction value.

以上のように、本実施例によれば、互いに隣接する２つの固定面２３ａの電位差が大きい場合でも、組分工程でこの２つの固定面２３ａが異なるグループに区分されるので、検出工程でのこの２つの固定面２３ａに対して同時に電圧が印加されることを回避することができる。これにより、電気信号の検出を行う一方の固定面２３ａに他方の固定面２３ａから電流が流れ込まない。したがって、検出を行う一方の固定面２３ａにおける電気信号に対するノイズの低減が図れ、精度よい検出を行うことができる。   As described above, according to the present embodiment, even when the potential difference between the two fixed surfaces 23a adjacent to each other is large, the two fixed surfaces 23a are divided into different groups in the assembling process. It can be avoided that a voltage is simultaneously applied to the two fixed surfaces 23a. Thereby, an electric current does not flow into one fixed surface 23a which detects an electric signal from the other fixed surface 23a. Therefore, it is possible to reduce noise with respect to the electrical signal on the one fixed surface 23a to be detected, and to perform detection with high accuracy.

ここで各グループＡ〜Ｄに共通の参照用プローブを固定しており、この参照用プローブがハイブリダイゼーションを行った際に取得した電気信号を各グループで比較することで、比較した値を基に各グループで検出した他のプローブ核酸の電気信号を補正することができる。さらに、包囲電極２４を設けることで、一方の固定面２３ａから他方の固定面２３ａに向けて流れる電流が一方の包囲電極２４と他方の包囲電極２４との間で流れ、隣接する２つの固定面２３ａ間で電流が流れることを防止する。以上により、各グループＡ〜Ｄにおける電気信号の検出結果のバラツキを抑制し、各グループＡ〜Ｄを構成する固定面２３ａにそれぞれ固定化された他のプローブ核酸における検出結果をより正確に解析することができる。   Here, a reference probe common to each of the groups A to D is fixed, and an electric signal acquired when the reference probe performs hybridization is compared in each group, so that the reference value is based on the comparison value. The electric signals of other probe nucleic acids detected in each group can be corrected. Furthermore, by providing the surrounding electrode 24, a current flowing from one fixed surface 23a toward the other fixed surface 23a flows between the one surrounding electrode 24 and the other surrounding electrode 24, and two adjacent fixed surfaces The current is prevented from flowing between 23a. As described above, variation in the detection result of the electric signal in each group A to D is suppressed, and the detection result in the other probe nucleic acid respectively immobilized on the fixing surface 23a constituting each group A to D is analyzed more accurately. be able to.

なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。
例えば、上記実施例では、組分工程において、固定面２３ａを３つおきや５つおきに取っているが、６つおきと適宜変更してもよい。
ここで、同一グループ内で同時に印加する固定面間の距離は十分離れているため、同時に印加する固定面間で流れる電流を十分小さくできる。
また、固定工程において、各グループＡ〜Ｄに共通する参照用プローブを固定しているが、参照用プローブを固定しなくてもよい。 In addition, this invention is not limited to the said Example, A various change can be added in the range which does not deviate from the meaning of this invention.
For example, in the above-described embodiment, every three or five fixing surfaces 23a are taken in the grouping step, but may be appropriately changed to every six.
Here, since the distance between the fixed surfaces applied simultaneously in the same group is sufficiently large, the current flowing between the fixed surfaces applied simultaneously can be made sufficiently small.
In the fixing step, the reference probes common to the groups A to D are fixed, but the reference probes need not be fixed.

また、プローブ核酸の一端が直接固定面２３ａ上に固定化されているが、リンカーを介して固定されてもよく、ポリマー網を介して固定されていてもよい。ここで、リンカーと
しては、例えばアリールアセチレンや２〜１０モノマー単位を有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、ジアッシド、アミノ酸またはこれらの組み合わせたものが挙げられる。 また、プローブ核酸が捕捉する生体関連物質としてターゲット核酸を適用しているが、タンパクなど、他の生体関連物質を捕捉するようにしてもよい。さらに、プローブとしてタンパクなどの他の生体関連物質を適用してもよい。 Further, one end of the probe nucleic acid is directly immobilized on the immobilization surface 23a, but it may be immobilized via a linker or via a polymer network. Here, examples of the linker include aryl acetylene, ethylene glycol oligomer having 2 to 10 monomer units, diamine, diacid, amino acid, or a combination thereof. Moreover, although the target nucleic acid is applied as a biological substance to be captured by the probe nucleic acid, other biological substances such as proteins may be captured. Furthermore, other biological materials such as proteins may be applied as probes.

また、固定面２３ａが平面視で円形を有しているが、矩形など他の形状であってもよい。
また、露出面２４ａが固定面２３ａの周縁から等間隔で離間した位置に形成されているが、設計に応じて適宜変更してもよい。
また、各包囲電極部２４が電気的に接続され、同電位となるように構成してもよい。
また、１つの固定電極部２３や包囲電極部２４がコンタクトホール２２ａにおいて接続電極部２１と接続されているが、固定電極部２３や包囲電極部２４を接続電極部２１上に直接スパッタリング法などによって形成した構造としてもよい。
また、包囲電極部２４を設けない構成としてもよい。
また、ＣＭＯＳ部１１によって各固定電極部２３に対して印加する電圧の制御などうを行っているが、ＣＭＯＳに限らず、他の半導体装置によって各固定電極部２３の電圧制御や電位測定部３１への出力などを行ってもよい。 Moreover, although the fixed surface 23a has a circular shape in plan view, it may have another shape such as a rectangle.
Moreover, although the exposed surface 24a is formed in the position spaced apart from the periphery of the fixed surface 23a at equal intervals, you may change suitably according to design.
Alternatively, the surrounding electrode portions 24 may be electrically connected to have the same potential.
In addition, one fixed electrode portion 23 and the surrounding electrode portion 24 are connected to the connection electrode portion 21 in the contact hole 22a, but the fixed electrode portion 23 and the surrounding electrode portion 24 are directly formed on the connection electrode portion 21 by a sputtering method or the like. A formed structure may be adopted.
Moreover, it is good also as a structure which does not provide the surrounding electrode part 24. FIG.
Further, although the voltage applied to each fixed electrode unit 23 is controlled by the CMOS unit 11, the voltage control of each fixed electrode unit 23 and the potential measuring unit 31 are not limited to the CMOS, but other semiconductor devices. You may output to.

この実施例によれば、ハイブリダイゼーションの検出方法に関して、各固定電極間を流れる電流によるノイズを低減し、精度よい検出を行うことができ、産業上の利用可能性が認められる。   According to this embodiment, with respect to the method for detecting hybridization, noise due to the current flowing between the fixed electrodes can be reduced and detection can be performed with high accuracy, and industrial applicability is recognized.

本発明の実施例１のハイブリダイゼーションの検出方法が適用される検出装置の構成を示すブロック図である。It is a block diagram which shows the structure of the detection apparatus with which the detection method of hybridization of Example 1 of this invention is applied. 本発明の実施例１のハイブリダイゼーションの検出方法におけるＤＮＡチップの部分平面図、Ｘ−Ｙ断面図である。It is the fragmentary top view of a DNA chip in the detection method of hybridization of Example 1 of this invention, and XY sectional drawing. 本発明の実施例１のハイブリダイゼーションの検出方法における組分工程の各固定面の電位分布およびグループの分布を示す説明図である。It is explanatory drawing which shows the electric potential distribution and distribution of a group of each fixed surface of the grouping process in the detection method of the hybridization of Example 1 of this invention. 従来のマイクロ反応チップの概略平面図および概略断面図である。It is the schematic plan view and schematic sectional drawing of the conventional micro reaction chip.

符号の説明Explanation of symbols

１……ＤＮＡチップ（マイクロ反応チップ）、２３……固定電極部（固定電極）、２３ａ……固定面、２４……包囲電極部（包囲電極）、３３……対向電極。
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... DNA chip (micro reaction chip), 23 ... Fixed electrode part (fixed electrode), 23a ... Fixed surface, 24 ... Surrounding electrode part (surrounding electrode), 33 ... Counter electrode.

Claims (3)

生体関連物質を捕捉するプローブが固定されている固定面を有する固定電極が複数設けられたマイクロ反応チップに前記プローブを固定し、該プローブを介して前記固定電極と対向配置される対向電極に電圧を印加するハイブリダイゼーションの検出方法において、
前記複数の固定面の位置番号を端から順番に２次元配列（ｍ，ｎ）で番号付け、１つおきのグループ（２ｍ＋１、２ｎ＋１）（ｍ，ｎ＝０，１，２，３，・・・・）、２つおきのグループ（３ｍ＋１、３ｎ＋１）（ｍ，ｎ＝０，１，２，３，４，・・・）または３つおきのグループ（４ｍ＋１、４ｎ＋１）（ｍ，ｎ＝０，１，２，３，・・・）の場合を含む、ある一定の間隔を隔てた固定面を選んでグループ化する組分工程と、
前記各固定面にプローブを電気化学的に合成して固定する固定工程と、
そのグループ毎に同時に電圧を印加し、電流を測定する検出工程と、
を備えたことを特徴とするハイブリダイゼーションの検出方法。 The probe is fixed to a micro reaction chip provided with a plurality of fixed electrodes each having a fixed surface to which a probe for capturing a biological substance is fixed, and a voltage is applied to the counter electrode arranged to face the fixed electrode through the probe. In the method for detecting hybridization, wherein
The position numbers of the plurality of fixed surfaces are numbered sequentially from the end in a two-dimensional array (m, n), and every other group (2m + 1, 2n + 1) (m, n = 0, 1, 2, 3,. ..) Every other group (3m + 1, 3n + 1) (m, n = 0, 1, 2, 3, 4,...) Or every third group (4m + 1, 4n + 1) (m, n = 0) , 1, 2, 3,...), And a grouping step for selecting and grouping fixed surfaces with a certain interval therebetween,
An immobilization step of electrochemically synthesizing and immobilizing a probe on each immobilization surface;
A detection process in which a voltage is simultaneously applied to each group and current is measured;
A method for detecting hybridization, comprising: 前記固定工程では、前記各グループを構成する前記固定面の少なくとも１つずつに、前記複数のグループで共通する参照プローブを固定することを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーションの検出方法。   The method for detecting hybridization according to claim 1, wherein, in the fixing step, a reference probe common to the plurality of groups is fixed to at least one of the fixing surfaces constituting each group. 前記マイクロ反応チップが、前記固定面から離間して該固定面の外周を囲む包囲電極を有することを特徴とする請求項１または２記載のマイクロ反応チップの測定方法。
The method for measuring a microreaction chip according to claim 1, wherein the microreaction chip has an surrounding electrode that is spaced apart from the fixed surface and surrounds the outer periphery of the fixed surface.
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