JP2007175581A - Particulate recovering apparatus - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a particulate recovering apparatus having a chamber for recovering particulates which easily takes out target particulates outside. <P>SOLUTION: The chamber for recovering the particulates as a recovering part for recovering the particulates, a laser beam irradiation part and a passage for flowing a gas or a liquid between the recovering part and the laser beam irradiation part, and the recovering part is arranged to make an opening face to the side of the passage, wherein the laser beam irradiation part has at least one laser beam irradiation opening, from which a laser beam is made to intersect the passage. The particulate recovering apparatus operating in this way has a concave hollowed part at at least a part of the chamber for recovering the particulates and a hole possible to be opened and closed at the upper part of the chamber for recovering particulates corresponding to a position of the concave hollowed part. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は細胞などの微粒子の回収装置に関する。更に詳細には、本発明は光圧を利用して細胞などの微粒子を回収するための装置に関する。   The present invention relates to an apparatus for collecting fine particles such as cells. More particularly, the present invention relates to an apparatus for collecting fine particles such as cells using light pressure.

集光された光の光圧を用いて微粒子などを別々に捕捉して移送させたり、捕捉した微粒子を分離回収するための光学装置として光ピンセットが知られている。このような光ピンセットは半導体製造における汚染粒子の除去や、熱核融合における燃料ペレットの非接触遠隔操作などに利用できると言われている。   Optical tweezers are known as an optical device for separately capturing and transferring fine particles using the light pressure of the collected light, or for separating and collecting the captured fine particles. It is said that such optical tweezers can be used for removing contaminant particles in semiconductor manufacturing and non-contact remote control of fuel pellets in thermonuclear fusion.

最近は、光ピンセットの重要な用途として、免疫学的分野、血液学的分野、医学的分野、遺伝子工学的分野、応用生命科学的分野などにおいて、種々の細胞の採取や単離、特定細胞のクローニングや増殖、細胞表面に特定抗原を発現した細胞の分取、細胞膜分子の動体解析、細胞染色体の解析、尿中の有形成分類の解析などが特に注目されるようになってきた。細胞は大きさが数μｍ程度であり、光ピンセットで掴みやすい寸法であり、しかも、光ピンセットには、壊れやすい細胞を非接触で操作できるというメリットがある。このため、細胞動態の解析には不可欠の手段となりつつあり、現在最も強力に応用研究が進められている。   Recently, as an important use of optical tweezers, various cells are collected and isolated in the immunological field, hematology field, medical field, genetic engineering field, applied life science field, etc. Particular attention has been given to cloning and proliferation, fractionation of cells that express a specific antigen on the cell surface, analysis of moving body of cell membrane molecules, analysis of cell chromosomes, and analysis of urinary formation. The cell has a size of about several μm, is a size that can be easily grasped by optical tweezers, and optical tweezers have an advantage that a fragile cell can be manipulated without contact. For this reason, it is becoming an indispensable means for analysis of cell dynamics, and the most powerful applied research is currently underway.

最近、マイクロ・トータル・アナリシス・システムズ（μＴＡＳ）又はラブ・オン・チップ(Lab-on-Chip)などの総称で呼ばれるように、２枚の貼り合わせ基板内に所定の形状の流路を構成するマイクロチャネル及びポートなどの微細構造を設け、該微細構造内で物質の化学反応、合成、精製、抽出、生成及び／又は分析など各種の操作を行う装置が提案され、一部実用化されている。このような目的のために製作された、２枚の貼り合わせ基板内にマイクロチャネル及びポートなどの微細構造を有する装置は一般的に、「マイクロ流体デバイス」とか「マイクロチップ」と呼ばれることがある。   Recently, as commonly called micro total analysis systems (μTAS) or lab-on-chip (Lab-on-Chip), a channel having a predetermined shape is formed in two bonded substrates. Proposed and partially put into practical use are devices that have microstructures such as microchannels and ports, and perform various operations such as chemical reaction, synthesis, purification, extraction, generation and / or analysis of substances within the microstructures. . An apparatus having a microstructure such as a microchannel and a port in two bonded substrates manufactured for such a purpose is generally called a “microfluidic device” or “microchip”. .

光圧を用いた光ピンセットを前記のような「マイクロ流体デバイス」とか「マイクロチップ」に組み込んで微粒子を回収する装置の試作と研究開発が活発に行われている。   Trial manufacture and research and development of an apparatus for collecting fine particles by incorporating optical tweezers using light pressure into the above-mentioned “microfluidic device” or “microchip” are being actively conducted.

光圧を用いた光ピンセットで微粒子などを回収する装置は例えば、特許文献１に記載されている。図７は特許文献１に記載された微粒子回収装置の一例の部分概要平面図であり、図８は図７におけるＶＩＩＩ−ＶＩＩＩ線に沿った部分概要断面図である。特許文献１に記載された微粒子回収装置１００は細胞などの回収したい所望の微粒子（標的微粒子）１０２を所定の方向（例えば、図中の実矢線方向）に流すための流路（マイクロチャネル）１０４を有する。流路１０４の幅及び高さは数十μｍ〜数百μｍ程度である。この流路１０４の所定の箇所に微粒子回収用チャンバー１０６が配設されている。微粒子回収用チャンバー１０６の開口幅は被捕捉微粒子１０２のサイズを考慮して適宜決定される。例えば、数μｍ〜数十μｍ程度である。流路１０４と直交し、微粒子回収用チャンバー１０６に入射する収束光（例えば、レーザビーム）１０８を照射するための光源（例えば、レーザ光源）１１０が微粒子回収装置１００に隣接して配置されている。流路１０４内を通過する回収したい所望の微粒子（標的微粒子）１０２に対して選択的にレーザビーム１０８を照射すれば、光圧に応答する標的微粒子１０２だけがその運動方向をレーザビーム１０８の収束方向に偏向されて、微粒子回収用チャンバー１０６内に回収され、蓄積（濃縮）される。
図示されていないが、流路１０４の一端は入口ポートに接続され、他端は出口ポートに接続されている。流路１０４内には前記入口ポートから標的捉微粒子１０２を含有する気体又は液体が流される。
図８に示されるように、微粒子回収装置１００は、第１の基板１１２と第２の基板１１４の２枚の基板を貼り合わせて構成されており、流路１０４及び微粒子回収用チャンバー１０６を一方の基板（図８では第１の基板１１２）に配設し、他方の基板（図８では第２の基板１１４）で流路１０４及び微粒子回収用チャンバー１０６を封止する。第１の基板１１２及び第２の基板１１４はガラス又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などから形成されている。 An apparatus for collecting fine particles and the like with optical tweezers using light pressure is described in Patent Document 1, for example. FIG. 7 is a partial schematic plan view of an example of the particulate collection device described in Patent Document 1, and FIG. 8 is a partial schematic sectional view taken along line VIII-VIII in FIG. A microparticle collection apparatus 100 described in Patent Document 1 is a flow path (microchannel) for flowing desired microparticles (target microparticles) 102 to be collected, such as cells, in a predetermined direction (for example, a solid arrow direction in the figure). 104. The width and height of the channel 104 are about several tens of μm to several hundreds of μm. A particulate collection chamber 106 is disposed at a predetermined location of the flow path 104. The opening width of the particulate collection chamber 106 is appropriately determined in consideration of the size of the particulate matter to be captured 102. For example, it is about several μm to several tens of μm. A light source (for example, a laser light source) 110 for irradiating convergent light (for example, a laser beam) 108 that is orthogonal to the flow path 104 and enters the particle collection chamber 106 is disposed adjacent to the particle collection apparatus 100. . If the desired fine particles (target fine particles) 102 to be collected that pass through the flow path 104 are selectively irradiated with the laser beam 108, only the target fine particles 102 that respond to the light pressure change the direction of movement of the laser beam 108. It is deflected in the direction and collected in the particulate collection chamber 106 and accumulated (concentrated).
Although not shown, one end of the flow path 104 is connected to the inlet port, and the other end is connected to the outlet port. A gas or liquid containing the target trapping fine particles 102 flows from the inlet port into the flow path 104.
As shown in FIG. 8, the particulate collection device 100 is configured by bonding two substrates, a first substrate 112 and a second substrate 114, and the flow path 104 and the particulate collection chamber 106 are connected to one side. The substrate 104 (first substrate 112 in FIG. 8) is disposed, and the flow path 104 and the particle collection chamber 106 are sealed with the other substrate (second substrate 114 in FIG. 8). The first substrate 112 and the second substrate 114 are formed of glass, polydimethylsiloxane (PDMS), or the like.

しかし、特許文献１に記載された微粒子回収装置１００は次のような欠点を有する。
(a)微粒子回収用チャンバー１０６内に回収された標的微粒子１０２がレーザビーム１０８に長時間曝露されるため、レーザビーム１０８の熱により標的微粒子１０２が変性したり、蒸発されたり、焼損する危険性がある。
(b)第１の基板１１２の上部から微粒子回収用チャンバー１０６内に回収用ピペット（図示されていない）を突き刺す際、ピペットの押圧力により標的微粒子１０２が微粒子回収用チャンバー１０６から流路１０４に押し戻されてしまう危険性がある。
(c)微粒子回収装置１００を用いて標的微粒子１０２を回収する場合、先ず、微粒子回収装置１００内の流路１０４及び微粒子回収用チャンバー１０６を緩衝液などで満たさなければならないが、微粒子回収用チャンバー１０６には空気の抜け道が無いので、微粒子回収用チャンバー１０６内に緩衝液を充填するのが困難である。 However, the particulate collection device 100 described in Patent Document 1 has the following drawbacks.
(a) Since the target fine particles 102 collected in the fine particle collecting chamber 106 are exposed to the laser beam 108 for a long time, there is a risk that the heat of the laser beam 108 causes the target fine particles 102 to be denatured, evaporated, or burned. There is.
(b) When a recovery pipette (not shown) is pierced from the upper part of the first substrate 112 into the particulate collection chamber 106, the target particulate 102 is moved from the particulate collection chamber 106 into the flow path 104 by the pressing force of the pipette. There is a risk of being pushed back.
(c) When recovering the target particulates 102 using the particulate collection apparatus 100, first, the flow path 104 and the particulate collection chamber 106 in the particulate collection apparatus 100 must be filled with a buffer solution or the like. Since there is no passage for air in 106, it is difficult to fill the particle collection chamber 106 with a buffer solution.

特開２００４−１６７４７９号公報JP 2004-167479 A

従って、本発明の目的は、標的微粒子がレーザビームに長時間曝露されることが無く、標的微粒子を外部に取り出す際に、流路に押し戻されることが無く、しかも、液体を充填しやすい微粒子回収用チャンバーを有する微粒子回収装置を提供することである。   Therefore, the object of the present invention is to prevent the target fine particles from being exposed to the laser beam for a long period of time, and when the target fine particles are taken out to the outside, the target fine particles are not pushed back into the flow path and are easy to fill the liquid. It is providing the fine particle collection | recovery apparatus which has a chamber for operation.

前記課題を解決するための手段として、請求項１における発明は、光圧に応答する微粒子を回収するための回収部と、レーザビーム照射部と、当該回収部とレーザビーム照射部との間に、光圧に応答する微粒子及び光圧に応答しない成分を含有する気体又は液体を流すための流路とを備え、
前記回収部が前記流路側に開口を向けて配置された少なくとも１つの微粒子回収用チャンバーを有し、
前記レーザビーム照射部が少なくとも１つのレーザビーム照射口を有し、当該レーザビーム照射口からレーザビームを、前記流路に交差させて、前記回収部の微粒子回収用チャンバーの開口に向けて当該開口より遠方に収束するように照射する微粒子回収装置において、
前記微粒子回収用チャンバーの少なくとも一部に凹陥部を有し、当該微粒子回収用チャンバーの上部に開閉可能な孔を有することを特徴とする微粒子回収装置を提供する。 As a means for solving the above-mentioned problems, the invention according to claim 1 is characterized in that a collection unit for collecting fine particles that respond to light pressure, a laser beam irradiation unit, and a portion between the collection unit and the laser beam irradiation unit. A flow path for flowing a gas or liquid containing fine particles that respond to light pressure and components that do not respond to light pressure,
The collection unit has at least one particulate collection chamber disposed with the opening facing the flow path;
The laser beam irradiation unit has at least one laser beam irradiation port, and the laser beam from the laser beam irradiation port intersects the flow path toward the opening of the particle collection chamber of the collection unit. In the fine particle collection device that irradiates to converge further,
There is provided a fine particle collecting apparatus having a concave portion in at least a part of the fine particle collecting chamber, and an openable / closable hole in an upper part of the fine particle collecting chamber.

前記請求項１に記載された微粒子回収装置によれば、捕捉された標的微粒子は、重力により、微粒子回収用チャンバーの凹陥部内に沈降し、レーザビームの照射から逃れることができる。しかも、チャンバー上部の開閉可能な孔を通して、緩衝液の注入の際の空気抜きが行われることにより緩衝液を流路の他、チャンバー内に極めて容易に充填することができ、しかも、この開閉可能な孔を通して、捕捉した標的微粒子をピペットなどで極めて容易に装置外に取り出すことができる。   According to the fine particle recovery apparatus of the first aspect, the trapped target fine particles can settle in the recessed portion of the fine particle recovery chamber due to gravity and escape from the laser beam irradiation. Moreover, air can be vented when the buffer solution is injected through the openable hole at the top of the chamber, so that the buffer solution can be filled into the chamber very easily in addition to the flow path. Through the hole, the captured target fine particles can be taken out of the apparatus very easily with a pipette or the like.

前記課題を解決するための手段として、請求項２における発明は、第１の基板と第２の基板を貼り合わせた構造を有し、前記流路、微粒子回収用チャンバー及び開閉可能孔が第１の基板内に形成され、前記凹陥部が第２の基板内に形成されていることを特徴とする請求項１記載の微粒子回収装置を提供する。   As means for solving the problems, the invention according to claim 2 has a structure in which the first substrate and the second substrate are bonded together, and the flow path, the particulate collection chamber and the openable / closable hole are the first. The fine particle recovery apparatus according to claim 1, wherein the concave portion is formed in a second substrate.

２枚の基板を貼り合わせることにより、流路、微粒子回収用チャンバー及び凹陥部を液漏れしない構造にすることができる。   By laminating the two substrates, the flow path, the particulate collection chamber, and the recessed portion can be structured to prevent liquid leakage.

前記課題を解決するための手段として、請求項３における発明は、第１の基板がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から形成されており、第２の基板がＰＤＭＳ又はガラスから形成されていることを特徴とする請求項２記載の微粒子回収装置を提供する。   As means for solving the above-mentioned problems, the invention according to claim 3 is characterized in that the first substrate is made of polydimethylsiloxane (PDMS) and the second substrate is made of PDMS or glass. A fine particle recovery apparatus according to claim 2 is provided.

ＰＤＭＳ同士又はＰＤＭＳとガラスは自己吸着性が非常に高く、接着剤などの特別な材料を使用しなくとも基板同士をしっかりと貼り合わせることができる。   PDMSs or PDMS and glass have a very high self-adsorption property, and substrates can be bonded firmly without using a special material such as an adhesive.

前記課題を解決するための手段として、請求項４における発明は、第１の基板がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から形成されており、第２の基板がＰＤＭＳから形成されている場合、第２の基板の下面に支持基板が更に貼り合わされていることを特徴とする請求項３記載の微粒子回収装置を提供する。   As means for solving the above-mentioned problems, the invention according to claim 4 is characterized in that when the first substrate is made of polydimethylsiloxane (PDMS) and the second substrate is made of PDMS, 4. The fine particle recovery apparatus according to claim 3, wherein a support substrate is further bonded to the lower surface of the substrate.

ＰＤＭＳ同士は自己吸着性が非常に高く、流路、微粒子回収用チャンバー及び凹陥部などを形成し易いので量産性に優れているが、柔軟過ぎて剛性に欠けることがあるが、支持基板を使用することによりその欠点を補うことができる。   PDMSs are extremely self-adsorbing and are easy to form flow paths, particulate collection chambers, and recesses, and are excellent in mass production, but they are too flexible and lack rigidity, but use a support substrate By doing so, the disadvantage can be compensated.

前記課題を解決するための手段として、請求項５における発明は、前記開閉可能な孔は、凹陥部の位置に対応する微粒子回収用チャンバーの上部に対応する第１の基板の上面から下面にまで貫通する亀裂を配設することにより構成されることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の微粒子回収装置を提供する。   As a means for solving the above-mentioned problems, the invention according to claim 5 is characterized in that the openable / closable hole extends from the upper surface to the lower surface of the first substrate corresponding to the upper part of the particle collecting chamber corresponding to the position of the recessed part. The fine particle recovery apparatus according to any one of claims 1 to 4, wherein the fine particle recovery apparatus is configured by disposing a penetrating crack.

亀裂のままの状態では、微粒子回収用チャンバーに連通する孔は形成されないが、この亀裂を押し広げれば、微粒子回収用チャンバーに連通する孔を開くことができる。亀裂を押し広げるための応力を除けば、亀裂は再び閉じ、その結果、孔も閉じられる。   In the state of being cracked, a hole communicating with the particle collecting chamber is not formed, but if this crack is expanded, a hole communicating with the particle collecting chamber can be opened. With the exception of the stress that pushes the crack apart, the crack closes again, so that the hole is also closed.

前記課題を解決するための手段として、請求項６における発明は、前記開閉可能な孔は、凹陥部の位置に対応する微粒子回収用チャンバーの上部に予め貫通孔を開設し、該貫通孔を覆う着脱可能なＰＤＭＳ製シートを第１の基板上面に配置することにより構成され、前記ＰＤＭＳ製シートはその一部が第１の基板の上面に恒久接着され、残りの部分が第１の基板の上面に自己吸着していることを特徴とする請求項１又は２記載の微粒子回収装置を提供する。   As a means for solving the above-mentioned problem, the invention according to claim 6 is characterized in that the openable / closable hole previously opens a through-hole in the upper part of the particulate collection chamber corresponding to the position of the recessed portion and covers the through-hole. A detachable PDMS sheet is arranged on the upper surface of the first substrate, a part of the PDMS sheet is permanently bonded to the upper surface of the first substrate, and the remaining portion is the upper surface of the first substrate. The particulate collection device according to claim 1, wherein the particulate collection device is self-adsorbed on the surface.

微粒子回収用チャンバーの上部に予め貫通孔が開設されており、ＰＤＭＳ製シートの自己吸着部分を第１の基板上面から着脱することによりこの貫通孔を容易に開閉可能にすることができる。   A through hole is formed in the upper part of the fine particle collecting chamber in advance, and the through hole can be easily opened and closed by attaching / detaching the self-adsorption portion of the PDMS sheet from the upper surface of the first substrate.

前記課題を解決するための手段として、請求項７における発明は、請求項１〜６の何れかに記載の微粒子回収装置を具備したマイクロチップを提供する。   As means for solving the above-mentioned problems, the invention according to claim 7 provides a microchip having the particulate collection device according to any one of claims 1 to 6.

本発明の微粒子回収装置はマイクロチップ内で実現することが最も好ましい。   Most preferably, the microparticle recovery apparatus of the present invention is realized in a microchip.

本発明の微粒子回収装置によれば、微粒子回収用チャンバーの少なくとも一部に凹陥部が配設されており、捕捉された標的微粒子（例えば、細胞）は重力により凹陥部内に沈降し、レーザビームの照射から逃れることができる。その結果、レーザビームの熱により標的細胞が変性したり、蒸発されたり、焼損することは殆ど無くなる。また、チャンバー上部の開閉可能な開口を通して、緩衝液の注入の際の空気抜きが行われることにより緩衝液を流路の他、チャンバー内に極めて容易に充填することができ、作業性が飛躍的に向上する。更に、この開閉可能な開口を通して、捕捉した標的細胞を生きたままの状態でピペットなどの公知慣用の手段により極めて容易に装置外に取り出すことができ、分析能力が飛躍的に向上される。   According to the particulate collection device of the present invention, the concave portion is disposed in at least a part of the particulate collection chamber, and the captured target particulate (for example, cells) settles in the concave portion due to gravity, and the laser beam Can escape from irradiation. As a result, the target cell is hardly denatured, evaporated or burned out by the heat of the laser beam. In addition, the air can be vented when the buffer solution is injected through the openable opening at the top of the chamber, so that the buffer solution can be filled into the chamber very easily in addition to the flow path. improves. Further, through the openable and closable opening, the captured target cell can be taken out of the apparatus very easily by a known and common means such as a pipette while alive, and the analysis ability is dramatically improved.

以下、図面を参照しながら本発明の微粒子回収装置の好ましい実施態様について具体的に説明する。
図１Ａは本発明の微粒子回収装置の一例の部分概要断面図である。本発明の微粒子回収装置１、は図７に示されるような特許文献１の微粒子回収装置と同様に、第１の基板３と第２の基板５とからなる２枚の基板を貼り合わせた構造を有する。第１の基板３には細胞などの回収したい所望の微粒子（標的微粒子）１０２を所定の方向に流すための流路（マイクロチャネル）７を有する。流路７の幅及び高さは数十μｍ〜数百μｍ程度である。本発明の微粒子回収装置における回収部となる微粒子回収用チャンバー９はその開口１１が流路側に向くように配設されている。また、微粒子回収用チャンバー９は凹陥部１３を有する。流路７を流下してきた標的微粒子１０２は、レーザビーム照射部となるレーザ光源１１０から放射されるレーザビーム１０８による光圧に応答して、その運動方向をレーザビーム１０８の収束方向に偏向されて、微粒子回収用チャンバー９の凹陥部１３に向かって移動する。標的微粒子１０２は質量を有する有体物であるため、重力により凹陥部１３内に沈降する。その結果、レーザビーム１０８に曝露されることなく、標的微粒子１０２を凹陥部１３内に格納することができる。凹陥部１３の深さは標的微粒子１０２を格納するのに必要十分なものであればよい。微粒子回収用チャンバー９は、図示されたような１個だけの実施態様に限定されず、２個以上配設する実施態様も可能である。 Hereinafter, a preferred embodiment of the particulate collection device of the present invention will be specifically described with reference to the drawings.
FIG. 1A is a partial schematic cross-sectional view of an example of the particulate collection device of the present invention. The fine particle collection apparatus 1 of the present invention has a structure in which two substrates composed of a first substrate 3 and a second substrate 5 are bonded together as in the fine particle collection device of Patent Document 1 as shown in FIG. Have The first substrate 3 has a flow path (microchannel) 7 for flowing desired fine particles (target fine particles) 102 to be collected such as cells in a predetermined direction. The width and height of the flow path 7 are about several tens of μm to several hundreds of μm. The fine particle collecting chamber 9 serving as a collecting portion in the fine particle collecting apparatus of the present invention is disposed so that the opening 11 faces the flow path side. The particulate collection chamber 9 has a recessed portion 13. The target fine particles 102 that have flowed down the flow path 7 are deflected in the direction of convergence of the laser beam 108 in response to the light pressure generated by the laser beam 108 emitted from the laser light source 110 serving as the laser beam irradiation unit. Then, it moves toward the recessed portion 13 of the particulate collection chamber 9. Since the target fine particle 102 is a tangible substance having a mass, the target fine particle 102 settles in the recessed portion 13 by gravity. As a result, the target fine particles 102 can be stored in the recess 13 without being exposed to the laser beam 108. The depth of the recessed portion 13 may be any depth that is necessary and sufficient for storing the target fine particles 102. The particulate collection chamber 9 is not limited to a single embodiment as shown in the figure, and an embodiment in which two or more fine particle collection chambers 9 are arranged is also possible.

微粒子回収用チャンバー９の上部には、上面から下面にまで貫通する亀裂１５が配設されている。第１の基板３が例えば、ＰＤＭＳなどのような柔軟で弾性のあるプラスチック材料から形成されている場合、この亀裂１５を押し広げることにより、流路７からチャンバー９への液体の充填の際の空気抜き孔又は捕捉微粒子１０２をチャンバー９外へ取り出すための取出孔を形成することができる。応力を解除すれば、ＰＤＭＳの弾性により孔はもとの亀裂１５に戻り密閉される。一例として、図１Ｂに示されるように、亀裂１５の上端から先端が鋭利な中空状ピペット又はキャピラリ１６を微粒子回収用チャンバー９の凹陥部１３内に差し込むことにより、この中空状ピペット又はキャピラリ１６を介してチャンバー９内の空気を抜いたり、凹陥部１３内の捕捉された標的微粒子１０２を装置外へ取り出すことができる。ピペット又はキャピラリ１６を抜けば、ＰＤＭＳの弾性により亀裂１５は再び密閉される。   A crack 15 penetrating from the upper surface to the lower surface is disposed in the upper part of the particulate collection chamber 9. When the first substrate 3 is made of a flexible and elastic plastic material such as PDMS, for example, the crack 15 is expanded to fill the chamber 9 with liquid from the flow path 7. An air vent hole or an extraction hole for taking out the trapped fine particles 102 out of the chamber 9 can be formed. When the stress is released, the hole returns to the original crack 15 and is sealed by the elasticity of PDMS. As an example, as shown in FIG. 1B, by inserting a hollow pipette or capillary 16 having a sharp tip from the upper end of the crack 15 into the recessed portion 13 of the particulate collection chamber 9, the hollow pipette or capillary 16 is inserted. Thus, the air in the chamber 9 can be removed, or the captured target fine particles 102 in the recessed portion 13 can be taken out of the apparatus. If the pipette or capillary 16 is removed, the crack 15 is sealed again by the elasticity of PDMS.

図２は本発明の微粒子回収装置の別の例の部分概要断面図である。図２の装置１Ａでは、微粒子回収用チャンバー９の開口１１と反対側に凹陥部１３が形成されている。レーザ光源１１０から照射されるレーザビーム１０８を、流路７に交差させて、微粒子回収用チャンバー９の開口１１に向けて当該開口より遠方に収束するように照射する場合、開口１１よりも奥側に凹陥部１３が存在することが好ましい。図１の装置１の場合、微粒子回収用チャンバー９の開口１１と凹陥部１３が同位置にあるため、標的微粒子以外の微粒子も凹陥部１３に落ち込んでくる可能性がある。   FIG. 2 is a partial schematic cross-sectional view of another example of the particulate collection device of the present invention. In the apparatus 1A of FIG. 2, a recessed portion 13 is formed on the side opposite to the opening 11 of the particulate collection chamber 9. When the laser beam 108 emitted from the laser light source 110 intersects the flow path 7 and is irradiated toward the opening 11 of the particle collection chamber 9 so as to converge farther from the opening, the rear side of the opening 11 It is preferable that the recessed portion 13 exists in the surface. In the case of the apparatus 1 of FIG. 1, since the opening 11 and the recessed portion 13 of the particle collection chamber 9 are in the same position, there is a possibility that particles other than the target particles fall into the recessed portion 13.

図３は本発明の微粒子回収装置の更に別の例の部分概要断面図である。図１及び図２に示されるような亀裂１５の代わりに、所定のサイズの孔１７を予め微粒子回収用チャンバー９の上部に開設しておく。この孔１７の上部にＰＤＭＳ製のシート１９を配置することにより、孔１７を開閉可能に構成することができる。例えば、ＰＤＭＳ製シート１９の下面の一方の端部の所定面積部分２１だけをＰＤＭＳ製の第１の基板３の上面に恒久接着させ、他の下面を自己吸着させる。ＰＤＭＳ同士が恒久接着すると、その部分は剥離させることはできないが、自己吸着部分は剥離させ、その後再度自己吸着させることが何度でも可能である。従って、ＰＤＭＳ製シート１９の自己吸着部分を「蓋」又は「カバー」として使用することにより、微粒子回収用チャンバー９の上部の孔１７を開閉可能に構成することができる。   FIG. 3 is a partial schematic cross-sectional view of still another example of the fine particle recovery apparatus of the present invention. Instead of the crack 15 as shown in FIGS. 1 and 2, a hole 17 having a predetermined size is opened in the upper part of the particle collection chamber 9 in advance. By arranging a sheet 19 made of PDMS above the hole 17, the hole 17 can be configured to be openable and closable. For example, only the predetermined area portion 21 at one end of the lower surface of the PDMS sheet 19 is permanently bonded to the upper surface of the first substrate 3 made of PDMS, and the other lower surface is self-adsorbed. When PDMSs are permanently bonded to each other, the part cannot be peeled off, but the self-adsorbing part can be peeled off and then self-adsorbed again and again. Therefore, by using the self-adsorption portion of the PDMS sheet 19 as a “lid” or “cover”, the upper hole 17 of the particulate collection chamber 9 can be configured to be openable and closable.

図４はＰＤＭＳ製シート１９の自己吸着部分を剥離して、孔１７を露出させた状態の部分概要断面図である。この露出された孔１７から捕捉された細胞などの標的微粒子１０２をピペッター（図示されていない）などの公知慣用の手段で吸い出して装置外へ取り出すことができる。また、この露出された孔１７は、流路７、微粒子回収用チャンバー９及び凹陥部１３に、微粒子流下用の液体を満たす際の空気抜き孔としても使用することができる。   FIG. 4 is a partial schematic cross-sectional view showing a state in which the self-adsorption portion of the PDMS sheet 19 is peeled and the holes 17 are exposed. The target fine particles 102 such as cells captured from the exposed holes 17 can be sucked out by a known and usual means such as a pipetter (not shown) and taken out of the apparatus. The exposed hole 17 can also be used as an air vent hole when filling the flow path 7, the particulate collection chamber 9 and the recessed portion 13 with a liquid for flowing particulates.

微粒子回収用チャンバー９の凹陥部１３が形成されている第２の基板５の素材はガラス又はプラスチックなどであることができる。第２の基板５がガラス製の場合、凹陥部１３の形成コストがやや高くなるので、第２の基板５は、凹陥部１３を安価に量産可能なプラスチック製であることが好ましい。この場合、第２の基板５の形成材料としては、第１の基板３が例えば、ＰＤＭＳ製であれば、このＰＤＭＳ基板と恒久接着及び／又は自己吸着可能なプラスチック材料を選択することが好ましい。従って、第２の基板５の形成材料としては、第１の基板３と同様に、ＰＤＭＳを使用することが好ましい。   The material of the second substrate 5 on which the recessed portion 13 of the particle collecting chamber 9 is formed can be glass or plastic. When the second substrate 5 is made of glass, the formation cost of the recessed portion 13 is slightly increased. Therefore, the second substrate 5 is preferably made of a plastic capable of mass-producing the recessed portion 13 at a low cost. In this case, as the material for forming the second substrate 5, if the first substrate 3 is made of PDMS, for example, it is preferable to select a plastic material that can be permanently bonded and / or self-adsorbed to the PDMS substrate. Therefore, it is preferable to use PDMS as a material for forming the second substrate 5 as in the case of the first substrate 3.

図５は本発明の微粒子回収装置の更に他の例の部分概要断面図である。前記のように、第１の基板３及び第２の基板５が両方ともＰＤＭＳ製である場合、装置全体の機械的剛性が弱くなるので、図５に示されるように、第２の基板５の下面に支持基板２３を接着させることが好ましい。支持基板２３としては、ＰＤＭＳとの間で優れた接着性を発揮するガラスを使用することが好ましい。言うまでもなく、ガラスの他に、光透過性で必要十分な機械的剛性を有するプラスチック材料も支持基板として使用することができる。支持基板２３を使用する利点は、第２の基板５の厚さを薄くすることができることである。従って、支持基板２３の上面をそのまま凹陥部１３の底面として使用できる。   FIG. 5 is a partial schematic cross-sectional view of still another example of the particulate collection apparatus of the present invention. As described above, when both the first substrate 3 and the second substrate 5 are made of PDMS, the mechanical rigidity of the entire apparatus is weakened. Therefore, as shown in FIG. It is preferable to adhere the support substrate 23 to the lower surface. As the support substrate 23, it is preferable to use glass that exhibits excellent adhesiveness with PDMS. Needless to say, in addition to glass, a plastic material having optical transparency and sufficient mechanical rigidity can be used as the supporting substrate. An advantage of using the support substrate 23 is that the thickness of the second substrate 5 can be reduced. Therefore, the upper surface of the support substrate 23 can be used as the bottom surface of the recessed portion 13 as it is.

第１の基板３に流路７及び微粒子回収用チャンバー９を形成する方法及び第２の基板５に凹陥部１３を形成する方法自体は当業者に周知である。例えば、これらはレジスト鋳型を用いた光リソグラフィー法により容易に形成することができる。また、第１の基板３に亀裂１５を入れたり、孔１７を開設する方法自体も当業者に周知である。例えば、これらは機械的方法により容易に形成することができる。更に、ＰＤＭＳ製シート１９の一部を第１の基板３の上面に恒久接着させ、残余の部分を自己吸着させる方法自体も当業者に周知である。例えば、ＰＤＭＳ製シート１９の一部を第１の基板３の上面に恒久接着させる場合、マスクを用いてその部分だけを選択的に酸素プラズマ又はエキシマＵＶ光に曝露させ、酸素プラズマやエキシマＵＶ光によって発生したオゾンや励起酸素原子で表面改質を行うことにより実施できる。表面改質処理が行われなかった部分は自己吸着性となり、剥離可能となる。   A method of forming the flow path 7 and the particle collecting chamber 9 on the first substrate 3 and a method of forming the recessed portion 13 on the second substrate 5 are well known to those skilled in the art. For example, they can be easily formed by photolithography using a resist mold. In addition, a method of making a crack 15 in the first substrate 3 or opening a hole 17 itself is well known to those skilled in the art. For example, they can be easily formed by a mechanical method. Further, a method for permanently adhering a part of the PDMS sheet 19 to the upper surface of the first substrate 3 and self-adsorbing the remaining part is well known to those skilled in the art. For example, when a part of the sheet 19 made of PDMS is permanently adhered to the upper surface of the first substrate 3, only the part is selectively exposed to oxygen plasma or excimer UV light using a mask, and oxygen plasma or excimer UV light is exposed. It can be carried out by surface modification with ozone or excited oxygen atoms generated by. The portion where the surface modification treatment has not been performed becomes self-adsorbing and can be peeled off.

本発明の微粒子回収装置はマイクロチップの形態にすることができる。このようなマイクロチップは、本発明の微粒子回収装置だけを有することもできるが、その他の目的に使用されるポート、マイクロバルブ、マイクロポンプ、電極、マイクロチャネルなどのような他の構成要素類を混在させ、これらの構成要素類と微粒子回収装置を有機的に関連させて使用することもできる。何れにしろ、本発明の微粒子回収装置を利用すれば、従来提案されているマイクロチップを用いて流体制御を行う技術では困難であった複数種類の微粒子を、一度の操作で非常に迅速に、精度良く効率的に弁別することができる。特に、本発明の微粒子回収装置を利用すれば、従来のマイクロチップを用いて流体制御を行う技術に比べて、微量のサンプルを利用して簡便に複数種類の微粒子を弁別することができる。   The microparticle recovery apparatus of the present invention can be in the form of a microchip. Such a microchip may have only the particulate collection device of the present invention, but other components such as ports, microvalves, micropumps, electrodes, microchannels etc. used for other purposes. It is also possible to mix these components and use the particulate collection device in an organic manner. In any case, if the microparticle recovery apparatus of the present invention is used, a plurality of types of microparticles, which has been difficult with the technology of performing fluid control using a conventionally proposed microchip, can be obtained very quickly in one operation. It is possible to discriminate accurately and efficiently. In particular, if the microparticle recovery apparatus of the present invention is used, a plurality of types of microparticles can be easily discriminated using a very small amount of sample as compared with a technique of controlling fluid using a conventional microchip.

本発明の微粒子回収装置による目的微粒子の回収は、光圧に応答する微粒子を含む液体又は気体を入口ポートから流路（マイクロチャネル）に流し込み、該液体又は気体の流れ方向と直交するようにレーザビームを照射し、該流路内を流れる標的微粒子の運動方向をレーザビームの収束方向に偏向させ、光圧に応答しない成分と分別することにより実施できる。照射されたレーザビームの照射領域に光圧に応答する微粒子が流れてくると、該照射領域内には光の場に不均一が生じているため、その中で微粒子は、これを取り囲む物質との間の屈折率、誘電率などの違いによって、これに作用する光の力（例えば、光の放射圧、誘電泳動力などであり、これらを総称して「光圧」という）に差を生じる。この力の差によって、光圧に応答する微粒子は流体力学的流れ方向に逆らってビームの光軸方向に沿って、光の場の密な位置に向かって移動する。この光圧は、微粒子とそれを取り囲む物質との屈折率（又は誘電率）の差の値が大きいほど大きく、また、微粒子の体積が大きいほど大きい。   The recovery of target particles by the particle recovery apparatus of the present invention is performed by flowing a liquid or gas containing particles that responds to light pressure from an inlet port into a flow path (microchannel) and orthogonal to the flow direction of the liquid or gas. This can be carried out by irradiating the beam, deflecting the direction of movement of the target fine particles flowing in the flow path in the direction of convergence of the laser beam, and separating it from components that do not respond to light pressure. When fine particles that respond to light pressure flow in the irradiated region of the irradiated laser beam, the light field is uneven in the irradiated region, so that the fine particles are separated from the surrounding material. Due to differences in refractive index, dielectric constant, etc., there is a difference in the light force acting on this (for example, light radiation pressure, dielectrophoretic force, etc., collectively referred to as “light pressure”) . Due to this difference in force, the microparticles responding to the light pressure move toward the dense position of the light field along the optical axis direction of the beam against the hydrodynamic flow direction. This light pressure increases as the difference in refractive index (or dielectric constant) between the fine particles and the surrounding material increases, and increases as the volume of the fine particles increases.

本発明の微粒子回収装置において、流路に流す気体又は液体は例えば、空気、不活性ガス（例えば、炭酸ガス又は窒素など）、純水、燐酸塩緩衝生理食塩水、蒸留水、精製水などである。使用する気体又は液体は、光圧に応答する微粒子との関連において、その屈折率などが当該微粒子の屈折率よりも小さいものであることが好ましい。この要件を満たすことにより、該気体又は液体自体は「光圧に応答しない成分」と言い得る。   In the fine particle recovery apparatus of the present invention, the gas or liquid flowing through the flow path is, for example, air, inert gas (for example, carbon dioxide or nitrogen), pure water, phosphate buffered saline, distilled water, purified water, or the like. is there. The gas or liquid to be used is preferably one having a refractive index smaller than that of the fine particles in relation to the fine particles that respond to light pressure. By satisfying this requirement, the gas or liquid itself can be said to be “a component that does not respond to light pressure”.

前記気体又は液体中に含有させ得る「光圧に応答する微粒子」は例えば、細胞（例えば、動物細胞（赤血球など）又は植物細胞など）、微生物（例えば、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類など）、生体高分子物質（例えば、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）など）、有機高分子材料（例えば、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなど）、無機材料（例えば、ガラス、シリカ、磁性体材料など）、金属（例えば、金コロイド、アルミニウムなど）などであるが、これらに限定されない。微粒子のサイズも特に限定されることはないが、一般的に、約数ｎｍ〜数十μｍの範囲内であることが好ましい。同様に、微粒子の形状及び質量なども特に限定されない。形状は定形又は不定形、整形又は不整形、立体形又は平面形、球形又は非球形のいずれであることもできる。微粒子の質量は、レーザビームが照射された際に、レーザビームの収束方向に偏向させることができる範囲内の質量であればよい。   Examples of the “microparticles that respond to light pressure” that can be contained in the gas or liquid include cells (for example, animal cells (such as erythrocytes) or plant cells), microorganisms (for example, bacteria such as E. coli, tobacco mosaic virus, etc. Viruses, fungi such as yeast, etc.), biopolymers (eg, chromosomes, liposomes, mitochondria, organelles (cell organelles) etc. that make up various cells), organic polymer materials (eg, polystyrene, styrene divinyl) Benzene, polymethyl methacrylate, etc.), inorganic materials (eg, glass, silica, magnetic material, etc.), metals (eg, gold colloid, aluminum, etc.), but not limited thereto. The size of the fine particles is not particularly limited, but generally it is preferably in the range of about several nm to several tens of μm. Similarly, the shape and mass of the fine particles are not particularly limited. The shape can be either regular or irregular, shaped or irregular, solid or planar, spherical or non-spherical. The mass of the fine particles may be within a range that can be deflected in the laser beam convergence direction when the laser beam is irradiated.

微粒子は気体又は液体などの媒体中に混合、配合又は懸濁させて、流路に流される。従って、微粒子自体はその元の形状を維持し続けるものであり、媒体中に溶解してはならない。媒体中に含まれる微粒子の個数は特に限定されないが、一般的に、１ｘ１０５〜１ｘ１０７個／ｍｌの範囲内であることが好ましい。微粒子を含む気体又は液体の流速は、レーザビームの照射によってその流れ方向をレーザビームの収束方向に偏向させ得ることを前提として、微粒子の種類、質量、個数、形状、及び該微粒子に照射されるレーザビームの種類、出力などを考慮して適宜決定することができる。 The fine particles are mixed, blended or suspended in a medium such as a gas or a liquid, and then flowed through the flow path. Therefore, the microparticles themselves maintain their original shape and must not dissolve in the medium. The number of fine particles contained in the medium is not particularly limited, but generally it is preferably in the range of 1 × 10 5 to 1 × 10 7 particles / ml. The flow velocity of the gas or liquid containing the fine particles is irradiated on the fine particles, the type, mass, number, shape, and the fine particles on the premise that the flow direction can be deflected in the laser beam convergence direction by laser beam irradiation. It can be determined appropriately in consideration of the type and output of the laser beam.

本発明の微粒子回収装置において回収される標的微粒子の好ましい具体例としては、一般的なフローサイトメトリーのセルソーティング方法（ＦＡＣＳ）に従って蛍光標識などで標識された抗体を結合（コーティング）させた細胞、同様に蛍光色素などで標識した生体高分子などを挙げることができる。また、蛍光標識によらない場合、蛍光物質に代えて、抗体の種類に応じて異なる大きさのビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、シリカビーズ、金コロイドビーズなど）を用いることもできる。この場合、当該ビーズに抗体をコーティングした後、該抗体を血液などの献体サンプルと混合して免疫反応させ、得られた反応物（微粒子）を含む液体を流路７に流すサンプルとして使用すると、微粒子の大きさの相違に基づいて、同時に異なる複数種の抗原抗体反応物（すなわち、異なる細胞、タンパク質など）を分別回収して解析することができる。   Preferred specific examples of target microparticles recovered in the microparticle recovery apparatus of the present invention include cells bound (coated) with an antibody labeled with a fluorescent label according to a general flow cytometry cell sorting method (FACS), Similarly, biopolymers labeled with fluorescent dyes can be used. Further, when not using a fluorescent label, beads having different sizes (for example, polystyrene beads, silica beads, colloidal gold beads, etc.) can be used instead of the fluorescent substance depending on the type of antibody. In this case, after the antibody is coated on the beads, the antibody is mixed with a dedicated sample such as blood to cause an immunoreaction, and the resulting reaction product (fine particles) is used as a sample that flows into the flow path 7. Based on the difference in the size of the microparticles, different types of antigen-antibody reaction products (that is, different cells, proteins, etc.) can be separately collected and analyzed at the same time.

本発明の微粒子回収装置で使用されるレーザ光源１１０自体は公知慣用のレーザ光源と同じものである。例えば、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ（波長：１０６４ｎｍ）又はＮｄ：ＶＡＮレーザ（波長：１０６４ｎｍ）などを使用できる。これらの光源から照射されるレーザビームは生物に対する影響が少ないので好ましい。レーザビーム照射条件も公知慣用の条件を使用できる。例えば、レーザビームは１００ｍＷ〜２Ｗの範囲内の連続波（ＣＷ）を連続的に又は間欠的に照射することができる。   The laser light source 110 itself used in the particulate collection apparatus of the present invention is the same as a known and commonly used laser light source. For example, an Nd: YAG laser (wavelength: 1064 nm) or an Nd: VAN laser (wavelength: 1064 nm) can be used. Laser beams emitted from these light sources are preferable because they have little influence on living organisms. Known and commonly used conditions can be used for the laser beam irradiation conditions. For example, the laser beam can be continuously or intermittently irradiated with a continuous wave (CW) within a range of 100 mW to 2 W.

レーザビームの照射は、一般的に、気体又は液体の流れ方向に直交するように行うことが好ましいが、気体又は液体の流れ方向と交差する限り、すなわち、微粒子の流れる方向が偏向される限り、特にその照射角度は重要ではない。また、レーザビームの形状は円形に限らず、楕円形であることもできる。   In general, the laser beam irradiation is preferably performed so as to be orthogonal to the flow direction of the gas or liquid, but as long as it intersects the flow direction of the gas or liquid, that is, as long as the flow direction of the fine particles is deflected. In particular, the irradiation angle is not important. In addition, the shape of the laser beam is not limited to a circle, but may be an ellipse.

光圧に応答する異なる特性を有する複数の微粒子を標的とする場合、例えば、微粒子回収用チャンバー９を並列させて複数個配置し、各チャンバーの開口１１に向けて複数のレーザビーム１０８を照射すれば、これによって目的とする各標的微粒子をそれぞれ別々のチャンバーの凹陥部１３内に分別回収することができる。凹陥部１３内に回収された標的微粒子（例えば、細胞、微生物又はタンパク質など）は、各凹陥部内で免疫反応の検出を行うか、又は各凹陥部１３に蓄積された標的微粒子を、亀裂１５を介するか又はＰＤＭＳ製シート１９の自己吸着部分を剥離して、孔１７を露出させることにより、ピペット又はマイクロシリンジなどで装置外に取り出し、別個に常法通りに生化学的分析に供して免疫測定などを行うこともできる。   When targeting a plurality of microparticles having different characteristics in response to light pressure, for example, a plurality of microparticle recovery chambers 9 are arranged in parallel, and a plurality of laser beams 108 are irradiated toward the opening 11 of each chamber. For example, the target fine particles can be collected separately in the recessed portions 13 of the separate chambers. Target microparticles (for example, cells, microorganisms, proteins, etc.) collected in the recesses 13 detect an immune reaction in each recess, or target microparticles accumulated in each recess 13 are cracked 15. Or by releasing the self-adsorbing part of the PDMS sheet 19 and exposing the holes 17, and taking it out of the apparatus with a pipette or a microsyringe, and separately subjecting it to biochemical analysis in a conventional manner for immunoassay Etc. can also be performed.

図示されていないが、本発明の微粒子回収装置を実際に使用する場合、流路７を流れる気体又は液体中の光圧に応答する微粒子１０２を検出し、解析するための、検出及び解析装置を併用することが好ましい。このような検出及び解析装置は、特許文献１に記載されるような検出及び解析装置を使用することもできるし、あるいは当業者に公知慣用の他の装置を使用することもできる。例えば、検出装置は、流路７内を流れる微粒子含有液体試料又は気体試料にレーザ光を照射するための検出用レーザ光源と、検出用レーザ光源から照射されたレーザ光を当てて、該流路を通過した微粒子１０２から得られる散乱光を受光するか、若しくは、標的微粒子を予め蛍光標識で標識した場合、当該蛍光標識された微粒子の各種蛍光を受光し、測定するための受光検出器を有することができる。また、解析装置は、前記受光検出器によって検出されたデータをデジタル変換してサイトグラム及び／又はヒストグラムとして表示するための解析表示装置を有することができる。これら検出装置及び解析装置は、レーザ光源１１０と連動させることができ、検出装置で得られ、解析装置で解析されたデータに基づいて、流路７の予定照射領域に、選択された標的微粒子１０２が流れてきたときのみ、当該標的微粒子１０２に選択的にレーザビーム１０８が照射されるように装置設計することができる。   Although not shown, when the particulate collection device of the present invention is actually used, a detection and analysis device for detecting and analyzing the particulate 102 that responds to the light pressure in the gas or liquid flowing through the flow path 7 is provided. It is preferable to use together. As such a detection and analysis device, a detection and analysis device as described in Patent Document 1 can be used, or other devices commonly used by those skilled in the art can be used. For example, the detection device applies a detection laser light source for irradiating the fine particle-containing liquid sample or gas sample flowing in the flow path 7 with laser light, and the laser light emitted from the detection laser light source, and the flow path A light receiving detector for receiving and measuring various fluorescence of the fluorescently labeled fine particles when the target fine particles are previously labeled with a fluorescent label be able to. Further, the analysis device may include an analysis display device for digitally converting the data detected by the light receiving detector and displaying the data as a cytogram and / or a histogram. These detection device and analysis device can be interlocked with the laser light source 110, and based on the data obtained by the detection device and analyzed by the analysis device, the target fine particles 102 selected in the planned irradiation region of the flow path 7 are selected. It is possible to design the apparatus so that the target fine particle 102 is selectively irradiated with the laser beam 108 only when the gas flows.

（１）本発明の微粒子回収装置を具備したマイクロチップの作製
図３及び図４に示されるような微粒子回収装置を具備したマイクロチップを作製した。第１の基板３として、６０ｍｍｘ２４ｍｍで厚さ５ｍｍのＰＤＭＳ基板を使用した。第２の基板５として、６０ｍｍｘ２４ｍｍで厚さ５ｍｍのＰＤＭＳ基板を使用した。第１のＰＤＭＳ基板３には５０μｍ幅、２５μｍ深さの流路７が形成されており、この流路７に直交するように、３５μｍ幅、３５μｍ奥行、２５μｍ深さの微粒子回収用チャンバー９が形成されており、該チャンバー９の開口部と反対側の他端上部には大気に向かって開口する直径０．５ｍｍの孔１７が形成されていた。第２のＰＤＭＳ基板５には、前記微粒子回収用チャンバー９及び孔１７に連通する凹陥部１３（５００μｍ幅、５００μｍ奥行、２００μｍ深さ）が形成されていた。図示されていないが、流路７の両端には大気に連通するポートが配設されていた。このポートは液体又は気体の入口及び出口となるものである。前記第１のＰＤＭＳ基板の流路及び微粒子回収用チャンバー形成面と、第２のＰＤＭＳ基板の凹陥部形成面とを位置合わせして接着させた。その後、第１のＰＤＭＳ基板の孔１７を遮蔽するためのＰＤＭＳ製シート１９（１０ｍｍｘ３ｍｍ、厚さ０．３ｍｍ）を第１のＰＤＭＳ基板上に部分的に恒久接着させた。第１のＰＤＭＳ基板３の端面から流路７までの間隔は３００μｍであった。
（２）流下試験
前記（１）で作製された本発明の微粒子回収装置を具備したマイクロチップにおいて、出口側のポートを塞ぎ、ＰＤＭＳ製シート１９の自己吸着部分を剥離して孔１７を露出させた状態で、入口側のポートから流路７に超純水を流したところ、流路全体及び微粒子回収用チャンバー（凹陥部を含む）全体が極めて短時間のうちに超純水で満たされ、孔１７の上面にまで達した時点で超純水の流下を止め、ＰＤＭＳ製シート１９を再び第１のＰＤＭＳ基板３の上面に自己吸着させて孔１７を遮蔽した。
（３）捕捉試験
前記（２）で、流路及び微粒子回収用チャンバーが超純水で満たされた本発明の微粒子回収装置を具備したマイクロチップを水平な状態に維持しながら、微粒子回収用チャンバーの開口部と正対する位置にレーザ光源１１０（Ｎｄ：ＶＡＮレーザ，波長１０６４ｎｍ）を配置した。言うまでもなく、レーザ光源１１０には、ビームを収束させ、焦点距離を調整するための対物レンズやビーム径を調整するためのビームエキスパンダーなどの公知慣用の光学素子類が組み込まれていた。また、この試験では、流路を流れてくる微粒子を検出・解析するために、蛍光顕微鏡(Axiovert135TV, Carl Zeiss社製)をレーザ操作システムと結合・連動させて用いた。
この試験では、直径２μｍの蛍光ラテックスビーズ(Polysciences, Inc.社製)を光圧に応答する微粒子として用いた。該微粒子を超純水に１ｘ１０５個／ｍｌとなる濃度で懸濁させた液をサンプル液として利用した。該サンプル液は、シリンジポンプ（シリンジフィーダー）を利用して入口側ポートから流路７内に導入した。流路７内を流れるサンプル液の流速は１９２μｍ／秒とした。流路７を通過したサンプル液は出口側ポートから回収した。
蛍光顕微鏡で流路を流れてくる微粒子を観察し、微粒子回収用チャンバーの開口部手前付近に達した時点でレーザ光源からレーザビームを照射した。レーザビームは微粒子回収用チャンバーの奥方向に合焦するように照射した。
（４）試験結果
微粒子が微粒子回収用チャンバーの開口部から凹陥部にまで異動され、凹陥部内に集積されたかを確認するため、蛍光ラテックスビーズが経時的に凹陥部内に回収集積できるか否かを調べた。すなわち、レーザビームの照射を連続的に行って、凹陥部内の蛍光強度を経時的に測定した。蛍光強度はビデオテープに記録した画像をコンピュータに取り込んだ後、画像解析ソフト(NIH image: http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)を用いて、凹陥部内領域のビデオフレーム毎（３０フレーム／秒）の蛍光強度を解析することにより求めた。蛍光強度の測定結果は相対値として示される。得られた結果を図６示す。図６に示される結果から明らかなように、凹陥部内の蛍光強度は６０秒間にわたって、時間に比例して増加している。このことから、レーザビームを連続的に照射することによって、流路を通過する標的微粒子の流れを光圧によってチャンバー方向に偏向させ、更に、凹陥部内に標的微粒子を回収蓄積できることが確認された。
（５）凹陥部からの標的微粒子の取出試験
レーザビームの照射を止めた後、ＰＤＭＳ製シート１９を剥離し、凹陥部内の液体をマイクロピペットで取り出した。この液体を別の蛍光検出器で分析したところ、取り出した液体中に蛍光ラテックスビーズが含まれていることが確認できた。従って、本発明の微粒子回収装置によれば、凹陥部内に回収蓄積させた標的微粒子を装置外へ簡単に取り出すことが出来ることが確認された。 (1) Production of microchip equipped with fine particle collection apparatus of the present invention A microchip equipped with a fine particle collection apparatus as shown in FIGS. 3 and 4 was produced. As the first substrate 3, a PDMS substrate having a thickness of 60 mm × 24 mm and a thickness of 5 mm was used. As the second substrate 5, a PDMS substrate having a size of 60 mm × 24 mm and a thickness of 5 mm was used. A flow path 7 having a width of 50 μm and a depth of 25 μm is formed in the first PDMS substrate 3, and a particle collection chamber 9 having a width of 35 μm, a depth of 35 μm, and a depth of 25 μm is formed so as to be orthogonal to the flow path 7. A hole 17 having a diameter of 0.5 mm that opens toward the atmosphere was formed in the upper part of the other end opposite to the opening of the chamber 9. The second PDMS substrate 5 was formed with a recess 13 (500 μm width, 500 μm depth, 200 μm depth) communicating with the particle collection chamber 9 and the hole 17. Although not shown, ports communicating with the atmosphere are disposed at both ends of the flow path 7. This port is the inlet and outlet for liquid or gas. The flow path of the first PDMS substrate and the particle collecting chamber forming surface and the recessed portion forming surface of the second PDMS substrate were aligned and adhered. Thereafter, a PDMS sheet 19 (10 mm × 3 mm, thickness 0.3 mm) for shielding the holes 17 of the first PDMS substrate was partially and permanently bonded onto the first PDMS substrate. The distance from the end surface of the first PDMS substrate 3 to the flow path 7 was 300 μm.
(2) Flow-down test In the microchip equipped with the microparticle recovery apparatus of the present invention prepared in (1) above, the port on the outlet side is closed, and the self-adsorption portion of the PDMS sheet 19 is peeled to expose the holes 17. In this state, when ultrapure water was flowed from the port on the inlet side to the flow path 7, the entire flow path and the entire particle collection chamber (including the recessed portion) were filled with ultrapure water in a very short time, When reaching the upper surface of the hole 17, the flow of ultrapure water was stopped, and the PDMS sheet 19 was again adsorbed on the upper surface of the first PDMS substrate 3 to shield the hole 17.
(3) Capture test In the above (2), while maintaining the microchip equipped with the particulate collection device of the present invention in which the flow path and the particulate collection chamber are filled with ultrapure water, the particulate collection chamber A laser light source 110 (Nd: VAN laser, wavelength 1064 nm) was disposed at a position directly opposite to the opening. Needless to say, the laser light source 110 incorporates known and common optical elements such as an objective lens for converging the beam and adjusting the focal length and a beam expander for adjusting the beam diameter. In this test, a fluorescence microscope (Axiovert135TV, manufactured by Carl Zeiss) was used in conjunction with a laser operation system in order to detect and analyze fine particles flowing in the flow path.
In this test, fluorescent latex beads having a diameter of 2 μm (manufactured by Polysciences, Inc.) were used as fine particles that responded to light pressure. A liquid in which the fine particles were suspended in ultrapure water at a concentration of 1 × 10 5 particles / ml was used as a sample liquid. The sample solution was introduced into the flow path 7 from the inlet port using a syringe pump (syringe feeder). The flow rate of the sample liquid flowing in the flow path 7 was set to 192 μm / second. The sample liquid that passed through the flow path 7 was collected from the outlet side port.
The fine particles flowing through the flow path were observed with a fluorescence microscope, and the laser beam was irradiated from the laser light source when reaching the vicinity of the opening portion of the fine particle collecting chamber. The laser beam was irradiated so as to be focused in the depth direction of the particle collection chamber.
(4) Test results Whether or not the fluorescent latex beads can be collected and accumulated in the recessed portion over time in order to confirm whether the fine particles were transferred from the opening of the particle collecting chamber to the recessed portion and accumulated in the recessed portion. Examined. That is, the laser beam was continuously irradiated, and the fluorescence intensity in the recess was measured over time. Fluorescence intensity is measured using video analysis software (NIH image: http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) after capturing the image recorded on the videotape into a computer. It was determined by analyzing the fluorescence intensity at every (30 frames / second). The measurement result of fluorescence intensity is shown as a relative value. The obtained result is shown in FIG. As is clear from the results shown in FIG. 6, the fluorescence intensity in the recessed portion increases in proportion to time over 60 seconds. From this, it was confirmed that by continuously irradiating the laser beam, the flow of the target fine particles passing through the flow path can be deflected toward the chamber by the light pressure, and further, the target fine particles can be collected and accumulated in the recessed portion.
(5) Extraction test of target fine particles from recessed portion After stopping the laser beam irradiation, the PDMS sheet 19 was peeled off, and the liquid in the recessed portion was taken out with a micropipette. When this liquid was analyzed with another fluorescence detector, it was confirmed that the extracted liquid contained fluorescent latex beads. Therefore, according to the fine particle collection apparatus of the present invention, it was confirmed that the target fine particles collected and accumulated in the recessed portion can be easily taken out of the apparatus.

本発明の装置は、２枚の基板を貼り合わせたマイクロ流体デバイス又はマイクロチップと呼ばれる超小型装置として実現することができる。   The apparatus of the present invention can be realized as a microminiature device called a microfluidic device or a microchip in which two substrates are bonded together.

本発明の装置は、免疫学的分野、血液学的分野、医学的分野、遺伝子工学的分野、応用生命科学的分野などにおいて、種々の細胞の採取や単離、特定細胞のクローニングや増殖、細胞表面に特定抗原を発現した細胞の分取、細胞膜分子の動体解析、細胞染色体の解析、尿中の有形成分類の解析などの目的に有効に利用することができる。   The device of the present invention is used in various fields such as immunology, hematology, medicine, genetic engineering, applied life science, etc. It can be effectively used for purposes such as sorting of cells that express a specific antigen on the surface, moving body analysis of cell membrane molecules, analysis of cell chromosomes, and analysis of formation classification in urine.

（Ａ）は本発明の微粒子回収装置の一例の部分概要断面図であり、（Ｂ）は亀裂１５にピペット又はキャピラリ１６を挿脱する状態を示す部分概要断面図である。(A) is a partial outline sectional view of an example of the particulate collection device of the present invention, and (B) is a partial outline sectional view showing a state where a pipette or capillary 16 is inserted into and removed from a crack 15. 本発明の微粒子回収装置の別の例の部分概要断面図である。It is a partial outline sectional view of another example of the particulate collection device of the present invention. 本発明の微粒子回収装置の更に別の例の部分概要断面図である。It is a partial outline sectional view of another example of the particulate collection device of the present invention. 図３に示された装置におけるＰＤＭＳ製シート１９の自己吸着部分を剥離して、孔１７を露出させた状態の部分概要断面図である。FIG. 4 is a partial schematic cross-sectional view showing a state in which a self-adsorption portion of a PDMS sheet 19 in the apparatus shown in FIG. 本発明の微粒子回収装置の更に他の例の部分概要断面図である。It is a partial outline sectional view of other examples of the particulate collection device of the present invention. 実施例１で行った試験において、微粒子回収用チャンバーの凹陥部内に標的微粒子が経時的に回収、蓄積されることを示す、該凹陥部内の蛍光強度推移を示す特性図である。In the test conducted in Example 1, it is a characteristic figure which shows fluorescence intensity transition in this recessed part which shows that target microparticles | fine-particles are collect | recovered and accumulate | stored in a recessed part of a particulate collection chamber with time. 特開２００４−１６７４７９号公報（特許文献１）に記載された微粒子回収装置の部分概要平面図である。It is a partial outline top view of the particulate collection device indicated in JP, 2004-167479, A (patent documents 1). 図７におけるＶＩＩＩ−ＶＩＩＩ線に沿った部分概要断面図である。FIG. 8 is a partial schematic cross-sectional view taken along line VIII-VIII in FIG. 7.

符号の説明Explanation of symbols

１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ 本発明の微粒子回収装置
３ 第１の基板
５ 第２の基板
７ 流路
９ 微粒子回収用チャンバー
１１ 微粒子回収用チャンバーの開口
１３ 微粒子回収用チャンバーの凹陥部
１５ 亀裂
１６ ピペット又はキャピラリ
１７ 微粒子回収用チャンバーの上部孔
１９ ＰＤＭＳ製シート
２１ ＰＤＭＳ製シートの恒久接着部
２３ 支持基板
１００ 特開２００４−１６７４７９号公報（特許文献１）に記載された微粒子回収装置
の部分概要平面図
１０２ 標的微粒子
１０４ 流路
１０６ 微粒子回収用チャンバー
１０８ レーザビーム
１１０ レーザ光源
１１２ 第１の基板
１１４ 第２の基板
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1, 1A, 1B, 1C Fine particle collection apparatus of this invention 3 1st board | substrate 5 2nd board | substrate 7 Flow path 9 Fine particle collection chamber 11 Opening of fine particle collection chamber 13 Recessed part 15 of fine particle collection chamber Crack 16 Pipette Or capillary 17 Upper hole 19 of fine particle collection chamber 19 PDMS sheet 21 PDMS sheet permanent bonding portion 23 Support substrate
100 Partial outline plan view of a particulate collection device described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-167479 (Patent Document 1) 102 Target particulate 104 Channel 106 Particle collection chamber 108 Laser beam 110 Laser light source 112 First substrate 114 Second Board

Claims (7)

光圧に応答する微粒子を回収するための回収部と、レーザビーム照射部と、当該回収部とレーザビーム照射部との間に、光圧に応答する微粒子及び光圧に応答しない成分を含有する気体又は液体を流すための流路とを備え、
前記回収部が前記流路側に開口を向けて配置された少なくとも１つの微粒子回収用チャンバーを有し、
前記レーザビーム照射部が少なくとも１つのレーザビーム照射口を有し、当該レーザビーム照射口からレーザビームを、前記流路に交差させて、前記回収部の微粒子回収用チャンバーの開口に向けて当該開口より遠方に収束するように照射する微粒子回収装置において、
前記微粒子回収用チャンバーの少なくとも一部に凹陥部を有し、当該凹陥部の位置に対応する微粒子回収用チャンバーの上部に開閉可能な孔を有することを特徴とする微粒子回収装置。 Contains a collection unit for collecting fine particles that respond to light pressure, a laser beam irradiation unit, and fine particles that respond to light pressure and components that do not respond to light pressure between the collection unit and the laser beam irradiation unit. A flow path for flowing gas or liquid,
The collection unit has at least one particulate collection chamber disposed with the opening facing the flow path;
The laser beam irradiation unit has at least one laser beam irradiation port, and the laser beam from the laser beam irradiation port intersects the flow path toward the opening of the particle collection chamber of the collection unit. In the fine particle collection device that irradiates to converge further,
A fine particle collecting apparatus having a concave portion in at least a part of the fine particle collecting chamber, and an openable / closable hole in an upper portion of the fine particle collecting chamber corresponding to the position of the concave portion. 第１の基板と第２の基板を貼り合わせた構造を有し、前記流路、微粒子回収用チャンバー及び開閉可能孔が第１の基板内に形成され、前記凹陥部が第２の基板内に形成されていることを特徴とする請求項１記載の微粒子回収装置。 It has a structure in which a first substrate and a second substrate are bonded together, the flow path, the particulate collection chamber and the openable / closable hole are formed in the first substrate, and the recessed portion is formed in the second substrate. The fine particle recovery device according to claim 1, wherein the fine particle recovery device is formed. 前記第１の基板がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から形成されており、前記第２の基板がＰＤＭＳ又はガラスから形成されていることを特徴とする請求項２記載の微粒子回収装置。 The fine particle recovery apparatus according to claim 2, wherein the first substrate is made of polydimethylsiloxane (PDMS), and the second substrate is made of PDMS or glass. 前記第１の基板がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から形成されており、前記第２の基板がＰＤＭＳから形成されている場合、前記第２の基板の下面に支持基板が更に貼り合わされていることを特徴とする請求項３記載の微粒子回収装置。 When the first substrate is made of polydimethylsiloxane (PDMS) and the second substrate is made of PDMS, a support substrate is further bonded to the lower surface of the second substrate. The fine particle recovery apparatus according to claim 3, wherein 前記開閉可能な孔は、凹陥部の位置に対応する微粒子回収用チャンバーの上部に対応する第１の基板の上面から下面にまで貫通する亀裂を配設することにより構成されることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の微粒子回収装置。 The openable / closable hole is configured by disposing a crack penetrating from the upper surface to the lower surface of the first substrate corresponding to the upper portion of the particle collecting chamber corresponding to the position of the recessed portion. The particulate collection device according to any one of claims 1 to 4. 前記開閉可能な孔は、凹陥部の位置に対応する微粒子回収用チャンバーの上部に予め貫通孔を開設し、該貫通孔を覆う着脱可能なＰＤＭＳ製シートを第１の基板上面に配置することにより構成され、前記ＰＤＭＳ製シートはその一部が第１の基板の上面に恒久接着され、残りの部分が第１の基板の上面に自己吸着していることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の微粒子回収装置。 The openable / closable hole is formed by previously opening a through hole in the upper part of the fine particle collecting chamber corresponding to the position of the recessed portion, and placing a removable PDMS sheet covering the through hole on the upper surface of the first substrate. 5. The PDMS sheet according to claim 1, wherein a part of the PDMS sheet is permanently bonded to the upper surface of the first substrate and the remaining part is self-adsorbed to the upper surface of the first substrate. The particulate collection apparatus according to any one of the above. 請求項１〜６の何れかに記載の微粒子回収装置を具備したマイクロチップ。 A microchip comprising the fine particle recovery apparatus according to claim 1.
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