JP2007163350A - Observation device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、培養細胞などの被観察物を観察するための観察装置に関する。 The present invention relates to an observation apparatus for observing an observation object such as a cultured cell.
従来、培養細胞の培地の中にはフェノールレッドなどのｐＨ指示薬が添加されているものがある。これを利用すれば、培地の色から培養細胞の状態を簡単に把握することができる（特許文献１等参照）。
例えば、フェノールレッドは、培地がアルカリ性（ｐＨ値大）になると赤色から赤紫色を示し、培地が酸性（ｐＨ値小）になると黄色からオレンジ色を示す。よって、培地内にカビ等が侵入して細胞の数が減少すると、培地へ排出される乳酸の量が少なくなるので、培地が赤紫色になる。一方、培地内の細胞の数が増加すると、乳酸の量が多くなるので、培地が黄色になる。培地内の細胞のの数が適量であるときには、乳酸の量も適度になるので、培地がピンク色になる。したがって、管理者は適切なタイミングで培地の色を判定し、例えばそれがピンク色になるよう必要に応じて培地交換や継代を行えば、培養細胞を良好な状態に保つことができる。
For example, phenol red exhibits red to magenta when the medium becomes alkaline (high pH value) and yellow to orange when the medium becomes acidic (low pH value). Therefore, when mold or the like enters the medium and the number of cells decreases, the amount of lactic acid discharged into the medium decreases, and the medium becomes reddish purple. On the other hand, when the number of cells in the medium increases, the amount of lactic acid increases, so the medium turns yellow. When the number of cells in the medium is appropriate, the amount of lactic acid is also moderate, so the medium becomes pink. Therefore, the administrator can keep the cultured cells in a good state by determining the color of the medium at an appropriate timing and, for example, replacing or subculture the medium as necessary so that it becomes pink.
しかし、培地の色を判定するには培養容器を持ち上げて室内灯などの光にかざす必要があるため、培養液を溢す虞があり、手間もかかる。また、色の見え方は培地の量、室内灯の種類によって異なり、さらには判定者の経験量も影響するので、判定は正確性に欠ける。
そこで本発明は、被観察物のｐＨ値を非接触で正確に測定することのできる観察装置を提供することを目的とする。
However, in order to determine the color of the culture medium, it is necessary to lift the culture container and hold it over light such as room light. In addition, the color appearance varies depending on the amount of the medium and the type of room light, and further, the judgment person's experience level also affects, so the judgment is not accurate.
Therefore, an object of the present invention is to provide an observation apparatus that can accurately measure the pH value of an object to be observed without contact.
本発明の観察装置は、ｐＨ指示薬で染色された被観察物のカラー画像を取得する撮像装置と、前記カラー画像の色に基づき前記被観察物のｐＨ値を算出する演算手段とを備えたことを特徴とする。
なお、前記撮像装置は、前記カラー画像の少なくとも緑色成分と青色成分とを取得することが可能であり、前記演算手段は、前記緑色成分と前記青色成分との強度比に基づき前記被観察物のｐＨ値を算出してもよい。
The observation apparatus of the present invention includes an imaging device that acquires a color image of an object to be observed that is stained with a pH indicator, and an arithmetic unit that calculates the pH value of the object to be observed based on the color of the color image. It is characterized by.
The imaging device is capable of acquiring at least a green component and a blue component of the color image, and the calculation means is configured to determine the object to be observed based on an intensity ratio between the green component and the blue component. The pH value may be calculated.
また、前記演算手段は、前記ｐＨ値の情報と前記カラー画像とを重畳して表示するための信号を生成してもよい。
また、前記演算手段及び前記撮像装置は、前記カラー画像の取得と前記ｐＨ値の算出とからなる測定を複数回行い、前記演算手段はその測定の履歴を作成してもよい。
Further, the calculation means may generate a signal for displaying the pH value information and the color image in a superimposed manner.
Further, the calculation unit and the imaging device may perform measurement including acquisition of the color image and calculation of the pH value a plurality of times, and the calculation unit may create a history of the measurement.
本発明によれば、被観察物のｐＨ値を非接触で正確に測定することのできる観察装置が実現する。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the observation apparatus which can measure the pH value of a to-be-observed object correctly without contact is implement | achieved.
［第１実施形態］
以下、第１実施形態を説明する。本実施形態は、観察システムの実施形態である。
先ず、本システムの全体構成を説明する。
図１は、システムの全体構成を示す図である。図１に示すとおり、本システムには、載置台７、カラー撮像装置９、照明部６、撮像制御部１１、照明制御部８、コンピュータ２０、イメージ表示部（液晶表示装置やＣＲＴなど）２１、入力器（マウスやキーボードなど）２２などが配置される。
[First Embodiment]
Hereinafter, the first embodiment will be described. This embodiment is an embodiment of an observation system.
First, the overall configuration of this system will be described.
FIG. 1 is a diagram showing the overall configuration of the system. As shown in FIG. 1, the system includes a mounting table 7, a
被観察物である培養容器は、載置台７上に載置される。培養容器には様々な種類があるが、ここでは外径が円形であるディッシュ１を説明する。ディッシュ１の本体２の内部は培地３で満たされており、その培地３の中で細胞が培養されている。この培地３にはｐＨ指示薬の１種であるフェノールレッドが予め添加されており、培地３の色は培地３のｐＨ値を示している。ディッシュ１の本体２は、開閉可能な光透過性の蓋４でカバーされており、蓋４と本体２との僅かな隙間が培地３と外気との通気性を保っている。因みに、ディッシュ１をはじめとする各種の培養容器の材料には、一般に、光透過性（透明性）、耐薬品性、及び清浄性の高い材料、例えばポリスチレンなどのプラスチックが用いられる。
The culture container as the object to be observed is placed on the placing table 7. There are various types of culture vessels. Here, the dish 1 having a circular outer diameter will be described. The inside of the
ディッシュ１は、載置台７を介して照明部６により照明される。載置台７の材質及び構造は、照明部６から発せられた照明光を遮ることなく培養容器１の側へ透過させるようなものとされる。照明部６は、略均一な強度で面発光する白色照明である。照明部６には、例えば、モリテックス社製のＭＤＢＬ-ＣＷ１００が適用可能である。或いは、照明部６には、ハロゲンランプなどの光源と、その光源からの光を拡散する拡散板との組み合わせを適用することもできる。なお、照明部６の発光タイミングは、照明制御部８によって制御される。
The dish 1 is illuminated by the
カラー撮像装置９は、載置台７の略全域を一括して撮像することができる。つまり、カラー撮像装置９の受光レンズ９ａは、その視野が載置台７の略全域をカバーするよう設定されており、載置台７に載置された物体（ここではディッシュ１）の像を、カラー撮像装置９の撮像素子９ｂ上に形成する。撮像素子９ｂは、その物体（ここではディッシュ１）の像を撮像してカラー画像信号を生成する。ここでは、このカラー画像信号を、像の赤色成分の画像信号（Ｒ信号）と、像の緑色成分の画像信号（Ｇ信号）と、像の青色成分の画像信号（Ｂ信号）とからなるＲＧＢ信号とする。なお、このようなカラー画像信号、又はそれに相当するカラー画素信号を生成できるのであれば、カラー撮像装置９は単板式の撮像装置であっても多板式の撮像装置であっても構わない。
The
撮像素子９がカラー画像信号を生成するタイミング（撮像タイミング）は、撮像制御部１１によって制御される。撮像制御部１１は、撮像素子９が生成したカラー画像信号を取り込み、コンピュータ２０へ送出する。コンピュータ２０は、撮像制御部１１から送出されたカラー画像信号により、載置台７上の物体（ここではディッシュ１）のカラー画像を認識する。
The timing at which the
また、撮像制御部１１は、照明制御部８と共にコンピュータ２０によって制御される。コンピュータ２０は、撮像制御部１１及び照明制御部８を適切に制御し、載置台７に載置された物体（ここではディッシュ１）を照明しながらそのカラー画像を取得する。このようにして取得されたディッシュ１のカラー画像には、ディッシュ１内の培地３の色が明確に反映される。
Further, the
コンピュータ２０は、取得したカラー画像に基づきそれを表示するための信号を生成し、それをイメージ表示部２１へ送出することによって物体（ここではディッシュ１）のカラー画像を表示する。なお、コンピュータ２０は、その他に、本システムのユーザ（ディッシュ１の管理者）に対し条件設定をさせる設定処理や、取得したディッシュ１のカラー画像に基づき培地３のｐＨ値を測定する測定処理なども行う（詳細は後述）。その際、コンピュータ２０と管理者との間の情報伝達は、コンピュータ２０に接続された入力器２２
やイメージ表示部２１を介して行われる。
The
And the
次に、コンピュータ２０の動作の全体の流れを説明する。以下に説明する動作に必要なプログラムは、コンピュータ２０に対し予めインストールされている。
図２は、コンピュータ２０の動作フローチャートである。図２に示すとおり、先ず、コンピュータ２０は、管理者に対し条件設定を行わせる（ステップＳ１）。このとき、少なくともコンピュータ２０は、ｐＨ値測定の測定間隔（１２時間，２４時間など）と、ｐＨ値測定の測定ポイントとを管理者に対し指定させる。測定ポイントを指定させる際、コンピュータ２０は、例えば図３（Ａ）に示すとおり現在の載置台７のカラー画像を表示するとよい。このカラー画像上で管理者は、例えば、ディッシュ１の中央付近など、所望の測定ポイントをコンピュータ２０に対し指定する。
Next, the overall flow of the operation of the
FIG. 2 is an operation flowchart of the
その後、管理者から開始の指示が入力されると（ステップＳ２ＹＥＳ）、コンピュータ２０は、測定処理を実行してｐＨ値を算出する（ステップＳ３）。この測定処理の内容を簡単に説明すると、ディッシュ１のカラー画像を取得し、そのカラー画像上で管理者が指定した測定ポイントに相当する箇所の色を参照し、その色に基づきｐＨ値を算出するものである。この測定処理の詳細は後述する。
Thereafter, when a start instruction is input from the administrator (step S2 YES), the
この測定処理（ステップＳ３）の実行後、コンピュータ２０は、例えば図３（Ｂ）に示すような画像を表示する。この画像は、取得したディッシュ１のカラー画像上に、算出したｐＨ値を示すイメージを重畳させたものである。表示を行うに当たり、コンピュータ２０は、ｐＨ値を示す文字イメージを生成し、それをディッシュ１のカラー画像と合成する。
After execution of this measurement process (step S3), the
さらに、コンピュータ２０は、測定処理（ステップＳ３）で取得したディッシュ１のカラー画像に算出したｐＨ値を対応づけたもの（又は合成後のカラー画像）を保存すると共に、測定処理（ステップＳ３）を実行した日時と算出したｐＨ値とを対応付けてなる測定履歴を作成する（ステップＳ４）。
その後、管理者が予め指定した測定間隔（１２時間，２４時間など）が経過すると（ステップＳ９ＹＥＳ）、コンピュータ２０は、ステップＳ３に戻る。したがって、ステップＳ３，Ｓ４は、管理者が予め指定した測定間隔（１２時間，２４時間など）が経過する毎に繰り返される。
Furthermore, the
Thereafter, when a measurement interval (12 hours, 24 hours, etc.) designated in advance by the administrator has elapsed (YES in step S9), the
また、コンピュータ２０は、管理者から測定履歴の呼び出しがあると（ステップＳ５）、その時点までに作成された測定履歴を、例えば、図３（Ｃ）に示すように表示する（ステップＳ６）。図３（Ｃ）は、測定履歴を折れ線グラフの形式で表示したときの様子を示している。グラフの横軸が日時であり、グラフの縦軸がｐＨ値である。測定履歴の表示形式は、折れ線グラフの他に、表形式などの他の形式にすることもできる。
Further, when the administrator calls the measurement history (step S5), the
また、コンピュータ２０は、管理者から保存済みのカラー画像の呼び出しがあると（ステップＳ７）、それを表示する。その際の画像も、図３（Ｂ）に示したように、ディッシュ１のカラー画像上にｐＨ値の文字イメージを重畳させたものであることが好ましい。なお、保存済みのカラー画像が複数あるときには、コンピュータ２０は、図３（Ｄ）に示すように複数のカラー画像をオーバーラップ表示してもよい。
Further, when there is a call for a stored color image from the administrator (step S7), the
次に、測定処理（ステップＳ３）の詳細を説明する。
図４は、測定処理におけるコンピュータ２０の動作フローチャートである。図４に示すように、先ず、コンピュータ２０は、ディッシュ１のカラー画像Ｉを取得し（ステップＳ３１）、取得したカラー画像Ｉのうち、管理者が予め指定した測定ポイントの画素のＧ信号及びＢ信号を参照し、それらＧ信号とＢ信号との比Ｂ／Ｇ（以下「Ｂ／Ｇ比」という。
）を算出する（ステップＳ３２）。なお、その際、信号に含まれるノイズの影響を低減するため、コンピュータ２０は、測定ポイント近傍の複数画素のＧ信号及びＢ信号を参照し、複数画素のＧ信号の平均値及びＢ信号の平均値を、それぞれ測定ポイントのＧ信号及びＢ信号とみなすことが望ましい。
Next, details of the measurement process (step S3) will be described.
FIG. 4 is an operation flowchart of the
) Is calculated (step S32). At that time, in order to reduce the influence of noise included in the signal, the
さらに、コンピュータ２０は、算出したＢ／Ｇ比を所定式に当てはめることによりｐＨ値を算出する（ステップＳ３３）。この所定式は、以下の式（１）で表される。
Ｂ／Ｇ＝ａ×（ｐＨ）＾２＋ｂ×（ｐＨ）＋ｃ …（１）
但し、「Ｂ／Ｇ」はＢ／Ｇ比、「ｐＨ」はｐＨ値、「（ｐＨ）＾２」はｐＨ値の二乗を表す。つまり、式（１）は、Ｂ／Ｇ比をｐＨ値の２次関数で表したものである。なお、実際にｐＨ値を算出するときには、式（１）をｐＨについて解いたものが用いられる。
Furthermore, the
B / G = a * (pH) ^ 2 + b * (pH) + c (1)
However, “B / G” represents the B / G ratio, “pH” represents the pH value, and “(pH) ^ 2” represents the square of the pH value. That is, Formula (1) expresses B / G ratio with the quadratic function of pH value. When the pH value is actually calculated, a value obtained by solving the equation (1) for the pH is used.
ここで、式（１）中のａ，ｂ，ｃは何れも定数であり、例えば、ａ＝０．５６，ｂ＝−７．４８，ｃ＝２．５４などに設定される。
但し、ａ，ｂ，ｃの値は、フェノールレッドの特性、本システムの照明部６の白色性、撮像素子９ｂの分光特性などによって決まるので、本システムとフェノールレッドのサンプルとを用いた測定により適宜校正されることが望ましい（校正の詳細は後述）。
Here, a, b, and c in Equation (1) are all constants, and are set to, for example, a = 0.56, b = −7.48, c = 2.54, and the like.
However, the values of a, b, and c are determined by the characteristics of phenol red, the whiteness of the
次に、本実施形態の測定原理を詳細に説明する。
図５は、フェノールレッドの９つのサンプル（ｐＨ値が０．２ずつ異なる９つのサンプル）を本システムの載置台７に載置して取得した９つのカラー画像信号（ＲＧＢ信号）を示す図である。横軸は、サンプルのｐＨ値であり、左端のサンプル（ｐＨ値＝６．８、つまり酸性側）は、一般にオレンジ色に見えるものであり、右端のサンプル（ｐＨ値＝８．４、つまりアルカリ性側）のサンプルは、一般に赤紫色に見えるものである。また、縦軸はカラー画像信号の信号値であり、値が大きいほど明るいことを示す。
Next, the measurement principle of this embodiment will be described in detail.
FIG. 5 is a diagram showing nine color image signals (RGB signals) obtained by placing nine phenol red samples (9 samples having different pH values by 0.2) on the placing table 7 of the present system. is there. The horizontal axis is the pH value of the sample, and the leftmost sample (pH value = 6.8, that is, the acidic side) generally looks orange, and the rightmost sample (pH value = 8.4, that is, alkaline). The side) sample generally looks reddish purple. The vertical axis represents the signal value of the color image signal, and the larger the value, the brighter the signal.
カラー画像信号（ＲＧＢ信号）に含まれるＲ信号，Ｇ信号，Ｂ信号の最大値は何れも２５５なので、ＲＧＢ信号（Ｒ信号及びＧ信号及びＢ信号の加算値）の最大値は、７６５（＝２５５×３色）である。この図５からわかるのは、ｐＨ値が変化したときに、Ｒ信号よりもＧ信号とＢ信号とが大きく変化することである。したがって、人間の眼から見たフェノールレッドのオレンジ色、赤色、赤紫色などの色の相違は、青色成分と緑色成分との比率の相違に過ぎないことがわかる。 Since the maximum values of the R signal, G signal, and B signal included in the color image signal (RGB signal) are all 255, the maximum value of the RGB signal (added value of the R signal, G signal, and B signal) is 765 (= 255 × 3 colors). As can be seen from FIG. 5, when the pH value changes, the G signal and the B signal change more greatly than the R signal. Therefore, it can be seen that the differences in the colors of phenol red such as orange, red, and magenta as seen from the human eye are only differences in the ratio between the blue component and the green component.
図６は、図５においてＲＧＢ信号（Ｒ信号及びＧ信号及びＢ信号の加算値）を１００％としたときのＲ信号，Ｇ信号，Ｂ信号の比率を示す図である。ｐＨ値が高くなるにつれて、Ｂ信号の比率が高まり、その反対にＧ信号の比率が低くなることがわかる。これに対し、Ｒ信号の比率には、Ｇ信号やＢ信号の比率ほど大きな変化は無い。
そこで、よりわかりやすくするために、Ｂ信号とＧ信号のみに着眼して、Ｂ信号とＧ信号の加算値を１００％としたときのＢ信号とＧ信号の比率を図７に示す。図７からは、ｐＨ値が高いなるほど、Ｂ信号の比率が高まり、Ｇ信号の比率が低くなる傾向がはっきりと見て取れる。
FIG. 6 is a diagram illustrating the ratio of the R signal, the G signal, and the B signal when the RGB signal (added value of the R signal, the G signal, and the B signal) is 100% in FIG. It can be seen that as the pH value increases, the ratio of the B signal increases, and conversely, the ratio of the G signal decreases. On the other hand, the ratio of the R signal does not change as much as the ratio of the G signal and the B signal.
Therefore, for easier understanding, FIG. 7 shows the ratio of the B signal and the G signal when only the B signal and the G signal are focused on and the added value of the B signal and the G signal is 100%. From FIG. 7, it can be clearly seen that the higher the pH value, the higher the B signal ratio and the lower the G signal ratio.
さらに、ｐＨ値毎にＢ信号とＧ信号の比率（Ｂ／Ｇ比）を計算し、横軸にｐＨ値をとってグラフ化したのが図８である。図８の各点を２次関数にフィッティングすると、下式（１’）が得られる。
Ｂ／Ｇ＝０・５６×（ｐＨ）＾２−７．４８×（ｐＨ）＋２．５４ …（１’）
なお、Ｂ／ＧはＢ／Ｇ比であり、ｐＨはｐＨ値であり、（ｐＨ）＾２はｐＨ値の二乗である。したがって、フェノールレッドのＢ／Ｇ比は、ｐＨ値に応じて一義的に変化する。なお、この式（１’）は、本システムの測定処理で用いた式（１）に相当する。
Further, FIG. 8 is a graph in which the ratio of the B signal to the G signal (B / G ratio) is calculated for each pH value, and the pH value is plotted on the horizontal axis. When each point in FIG. 8 is fitted to a quadratic function, the following expression (1 ′) is obtained.
B / G = 0.56 × (pH) ^ 2-7.48 × (pH) +2.54 (1 ′)
B / G is a B / G ratio, pH is a pH value, and (pH) 2 is a square of the pH value. Therefore, the B / G ratio of phenol red changes uniquely depending on the pH value. This equation (1 ′) corresponds to the equation (1) used in the measurement process of this system.
図９は、９つのサンプルのＢ−Ｇ座標を示す散布図である。横座標がＧ信号の値、縦座標がＢ信号の値である。点３０は、ｐＨ値＝６．８のサンプルのＢ−Ｇ座標であり、点３１は、ｐＨ値＝８．４のサンプルのＢ−Ｇ座標である。この図９において、或るサンプルのＢ−Ｇ座標から原点へ延ばした直線の傾きが、そのサンプルのＢ／Ｇ比に相当する。図９に示すように、異なるサンプルの間では、この直線の傾きが異なるので、Ｂ／Ｇ比も異なる。このことからも、フェノールレッドのＢ／Ｇ比がｐＨ値に応じて一義的に変化することがわかる。
FIG. 9 is a scatter diagram showing the BG coordinates of nine samples. The abscissa is the value of the G signal, and the ordinate is the value of the B signal.
この理論を利用し、本システムの測定処理では、カラー画像信号のＢ／Ｇ比と式（１）とから一義的にｐＨ値を算出している。したがって、本システムは、非接触で取得したカラー画像から間接的にｐＨ値を測定しているにも拘わらず、その測定の正確性は高い。
ところで、本システムのカラー画像信号は、図１の照明部６から発せられ、しかも培地３を透過した光が基となっているので、同じｐＨ値であっても、培地３が浅ければ、培地３の色は薄く写り、培地３が深ければ、培地３の色は濃く写る。しかし、ｐＨ値の測定は、培地３の深さに左右されない必要がある。
Using this theory, in the measurement process of this system, the pH value is uniquely calculated from the B / G ratio of the color image signal and the equation (1). Therefore, although the present system measures the pH value indirectly from a color image acquired in a non-contact manner, the accuracy of the measurement is high.
By the way, the color image signal of this system is based on the light emitted from the
次に、上記理論が培地３の深さに左右されないことを検証する。
実験では、或る培地を収めた培養容器（フラスコ）を用意し、それをわざと傾けて、同一の培地に深い部分と浅い部分とが生じるようにした。これにより、ｐＨ値が同じで深さのみ異なる複数のサンプルを用意することができた。
図１０は、ｐＨ値が同じで深さのみ異なる複数のサンプルのＢ−Ｇ平面上のＢ−Ｇ座標を示す散布図である。図１０には、比較のため、図９に示した９つのサンプル、すなわち深さが同じでｐＨ値のみ異なるサンプルのＢ−Ｇ座標を三角印で示した（符号３３）。ｐＨ値が同じで深さのみ異なる複数のサンプルのＢ−Ｇ座標は、四角印で示した（符号３４）。
Next, it is verified that the above theory does not depend on the depth of the culture medium 3.
In the experiment, a culture vessel (flask) containing a certain medium was prepared, and it was intentionally tilted so that a deep portion and a shallow portion were formed in the same medium. Thereby, a plurality of samples having the same pH value but different depths could be prepared.
FIG. 10 is a scatter diagram showing BG coordinates on a BG plane of a plurality of samples having the same pH value but different depths. In FIG. 10, for comparison, the BG coordinates of the nine samples shown in FIG. 9, that is, samples having the same depth but different pH values are indicated by triangles (reference numeral 33). The BG coordinates of a plurality of samples having the same pH value but different depths are indicated by square marks (reference numeral 34).
このうち、点３５は、浅いサンプルのＢ−Ｇ座標であり、点３６は、深いサンプルのＢ−Ｇ座標である。このように、同じｐＨ値であっても深さのあるサンプルほど色は濃くなり（Ｂ信号及びＧ信号の値が大きくなり）、浅いサンプルほど色が薄くなる（Ｂ信号及びＧ信号の値が大きくなる）。しかし、これらサンプルのＢ−Ｇ座標は、何れも原点３７を通る同一直線３８上に存在する。これは、これらサンプルのＢ／Ｇ比が等しいことを意味する。
Among these, the
このことから、ｐＨ値の等しい複数のサンプルはその深さに依らずＢ／Ｇが等しいことがわかる。つまり、上記理論は、培地３の深さに左右されない。したがって、上記理論を利用した本システムは、培地３の深さに依らず確実に測定を行うことができる。
（第１実施形態の補足１）
なお、本システムのコンピュータ２０は、誤測定（測定エラー）を防ぐため、図４のフローチャートに代えて図１１のフローチャートを実行してもよい。
From this, it can be seen that a plurality of samples having the same pH value have the same B / G regardless of the depth. That is, the above theory does not depend on the depth of the culture medium 3. Therefore, this system using the above theory can reliably perform the measurement regardless of the depth of the culture medium 3.
(Supplement 1 of the first embodiment)
Note that the
図１１のフローチャートによると、コンピュータ２０は、カラー画像を取得すると（ステップＳ３１）、測定ポイントのＢ信号及びＧ信号を参照し（ステップＳ３２’）、それらＢ信号及びＧ信号の双方の値が所定範囲内に収まっているか否かを判定する（ステップＳ３２”）。そして、コンピュータ２０は、双方の値が所定範囲内に収まっていたとき（ステップＳ３２”ＹＥＳ）にはそれら信号の信頼性は高いとみなし、Ｂ／Ｇ比を算出してｐＨ値の算出ステップ（ステップＳ３３）へ進む。一方、Ｂ信号及びＧ信号の少なくとも一方の値が所定範囲から外れていたとき（ステップＳ３２”ＮＯ）にはそれら信号の信頼性は低いとみなし、Ｂ／Ｇ比の算出及びｐＨ値の算出（ステップＳ３３）を省略して測定処理を終了する。
According to the flowchart of FIG. 11, when the
また、ステップＳ３２”でＮＯと判定され、ｐＨ値の算出ができなかったカラー画像については、コンピュータ２０は、ｐＨ値の情報の代わりに、測定が不可能であった旨の情をが対応づけて扱う。例えば、図３（Ｂ），（Ｄ）のような表示画面上には、「ｐＨ＝００」，「ｐＨ＝−−」などの文字イメージを表示すればよい。
以上の判定（ステップＳ３２”）が有効となる理由は、次のとおりである。
In addition, for a color image that has been determined as NO in step S32 ″ and the pH value could not be calculated, the
The reason why the above determination (step S32 ″) is effective is as follows.
例えば、培地３が浅すぎるときには、撮像素子９ｂに対する入射光量が極端に多くなるので、撮像素子９ｂが飽和し、Ｂ信号やＧ信号が正確な値を示さなくなる。反対に、培地３が深すぎるときには、撮像素子９ｂに対する入射光量が極端に少なくなるので、撮像素子９ｂのＳＮが悪くなり、Ｂ信号やＧ信号が正確な値を示さなくなる。これらの場合にＢ／Ｇ比を求めると、誤ったｐＨ値が算出されてしまう。これが、測定エラーである。
For example, when the culture medium 3 is too shallow, the amount of light incident on the
極端な例として、培地３が無いときには、照明部６から射出した光が殆どそのまま撮像素子９ｂへ入射するので、Ｂ信号とＧ信号とは共に２５５となる。このとき、Ｂ／Ｇ比は１となる。Ｂ／Ｇ＝１を例えば式（１’）に当てはめると、ｐＨ＝７．７と算出されるが、これは明らかに測定エラーである。
一方、培地３が多すぎるときには、照明部６から射出した光が殆ど撮像素子９ｂへ入射しなくなるので、Ｂ信号とＧ信号とが共に０に近くなる。このとき、Ｂ／Ｇ比を算出しても、小さい値同士の割り算、しかもＳＮの悪い値同士の割り算なので、測定エラーとなる可能性が極めて高い。
As an extreme example, when the medium 3 is not present, the light emitted from the
On the other hand, when the medium 3 is too much, light emitted from the
そこで、このステップＳ３２”における判定基準は、例えば、２５〜２４０の範囲に設定される。このとき、コンピュータ２０は、Ｂ信号の値とＧ信号の値との何れか一方が２５〜２４０の範囲から外れていたときに、それら信号の信頼性を低いとみなし、双方が２５〜２４０の範囲に収まっていたときに、それら信号の信頼性を高いとみなす。因みに、信頼性が高いと判定されるようなＢ信号とＧ信号との組み合わせをＢ−Ｇ座標で表すと、図１２の斜線部内の各点となる。
Therefore, the determination criterion in step S32 ″ is set, for example, in the range of 25 to 240. At this time, the
（第１実施形態の補足２）
本システムの校正方法（式（１）の値ａ，ｂ，ｃの決定方法）を説明する。校正が行われるタイミングは、本システムの出荷前、出荷後に照明部６の白色性が低下したとき、出荷後に照明部６が故障して新しいものに交換されたときなどである。
図１３は、本システムの校正方法を説明する図である。図１３に示すように、先ず、本システムの管理者は、フェノールレッドのサンプル１ａ，１ｂ，…１ｈを本システムの載置台７に載置する（図１３（ａ））。サンプル１ａ，１ｂ，…１ｈは、例えば、ｐＨ値が０．２ずつ異なる９つのサンプルである。この状態で、サンプル１ａ，１ｂ，…１ｈのカラー画像を、本システムのカラー撮像装置９で取得する（図１３（ｂ））。このカラー画像上でサンプル１ａ，１ｂ，…，１ｈに対応する各部分を、画像Ｉａ，Ｉｂ，…，Ｉｈとおく。次に、画像Ｉａ，Ｉｂ，…，Ｉｈの各々のＢ／Ｇ比を算出する。この算出は、本システムのコンピュータ２０で行っても、他のコンピュータで行っても構わないが、本システムのコンピュータ２０に行わせるのが最も簡単である。算出したＢ／Ｇ比を、ｐＨ値−Ｂ／Ｇ比のグラフ上にプロットすると、例えば、図１３（ｃ）のとおりになる。
(
The calibration method of this system (method for determining the values a, b, and c in equation (1)) will be described. The timing at which calibration is performed is when the whiteness of the illuminating
FIG. 13 is a diagram for explaining a calibration method of the present system. As shown in FIG. 13, the administrator of the system first places the phenol
次に、図１３（ｃ）に示す離散的なデータを、二次関数である式（１）にフィッティングし、式（１）中のａ，ｂ，ｃを算出する。この算出は、本システムのコンピュータ２０で行っても、他のコンピュータで行っても構わないが、本システムのコンピュータ２０に行わせるのが最も簡単である。
こうして求めたａ，ｂ，ｃの値を、本システムのコンピュータ２０に対し記憶させる。これによって、校正が完了する。ａ，ｂ，ｃの値は、その後、新たな校正が行われる度に更新される。
Next, the discrete data shown in FIG. 13C is fitted to a quadratic function equation (1) to calculate a, b, and c in the equation (1). This calculation may be performed by the
The values of a, b, and c thus obtained are stored in the
なお、本システムのコンピュータ２０には、以上の校正を本システムの管理者に対し行わせるためのプログラム（校正用プログラム）が予めインストールされていることが望ましい。
（第１実施形態の補足３）
上述した説明では、培養容器としてディッシュ１を説明したが、培養容器は、用途に合わせて、各種形状・大きさのものが市販されており、形状を大別すると、ディッシュ（丸形）、ウェルプレート（複数のウェルが設けられる）、フラスコ（通気性のあるキャップ付き）などがある。本システムにおいては、何れの培養容器を使用することも可能である。
Note that it is desirable that a program (calibration program) for causing the administrator of the system to perform the above calibration is installed in advance in the
(Supplement 3 of the first embodiment)
In the above description, the dish 1 has been described as a culture container. However, culture containers having various shapes and sizes are commercially available according to the application. There are plates (provided with a plurality of wells), flasks (with a breathable cap), and the like. In this system, any culture vessel can be used.
また、上述した説明では、載置台７に１つの培養容器（ディッシュ１）しか載置されなかったが、載置台７のサイズを十分に大きくし、２以上の培養容器を載置台７上に並べて載置してもよい。
但し、ウェルプレートを用いるときや、２以上の培養容器を並べて載置するときには、培地の数が複数になるので、ｐＨ値の測定は培地の各々について行われる必要がある。その場合、管理者は、図１４（Ａ）に示すようにカラー画像上で複数の培地の位置を確認し、それら培地の位置をそれぞれ測定ポイントとして指定すればよい。このとき、コンピュータ２０は、指定された複数の測定ポイントのｐＨ値をそれぞれ測定し、１つのカラー画像につき複数のｐＨ値を対応づけて扱うことになる。例えば、カラー画像と共にｐＨ値を表示するときには、図１４（Ｂ）に示すように、ｐＨ値の文字イメージを測定ポイント毎に表示するとよい。
In the above description, only one culture vessel (dish 1) was placed on the mounting table 7. However, the size of the mounting table 7 is sufficiently large, and two or more culture containers are arranged on the mounting table 7. It may be placed.
However, when a well plate is used or when two or more culture vessels are placed side by side, since the number of culture media becomes plural, the pH value needs to be measured for each culture media. In that case, the administrator may confirm the positions of a plurality of culture media on the color image as shown in FIG. 14A and designate the positions of the culture media as measurement points. At this time, the
（第１実施形態の補足４）
本システムの照明系（照明部６など）は、被観察物（ディッシュ１）を透過照明するタイプ（透過型）の照明系であったが、図１５に示すように、被観察物（ディッシュ１）を反射照明するタイプ（反射型）の照明系を使用してもよい。その場合、載置台４０の材質又は構造は、光を透過しないものとされる。例えば、載置台４０は、光を反射する白色の板（例えば白色のプラスチック板）からなる。また、照明部４１は、例えば、ハロゲンランプなどの光源と、その光源からの射出光の径を拡大するビームエキスパンダとの組み合わせからなる。因みに、このような照明部４１は、比較的安価である。
(Supplement 4 of the first embodiment)
The illumination system (such as the illumination unit 6) of this system is a type (transmission type) illumination system that illuminates the object to be observed (dish 1), but as shown in FIG. ) Reflection type illumination system (reflection type) may be used. In that case, the material or the structure of the mounting table 40 does not transmit light. For example, the mounting table 40 is made of a white plate (for example, a white plastic plate) that reflects light. Moreover, the
照明部４１から発せられた白色光からなる照明光は、ハーフミラー４２で反射してから被観察物（ディッシュ１）を上方から照明する。そして、その照明光は、被観察物（ディッシュ１）を透過し、載置台４０で反射してから再び被観察物（ディッシュ１）を透過し、ハーフミラー４２を透過してカラー撮像装置９へ入射する。
なお、このような反射型の照明系を使用した場合、上述した式（１）のａ，ｂ，ｃは、フェノールレッドの特性、照明部４１の白色性、撮像素子９ｂの分光特性だけでなく、載置台４０の白色性にも依存するが、上述した校正方法のとおりサンプルを載置台４０へ載置して校正を行えば、ａ，ｂ，ｃの値を正しく設定することができる。
The illumination light composed of white light emitted from the
When such a reflective illumination system is used, a, b, and c in the above formula (1) are not only the characteristics of phenol red, the whiteness of the
また、このような反射型の照明系を使用した場合、被観察物（ディッシュ１）の表面で照明光が反射するので、カラー画像上に照明部４１の外形が写ってしまう可能性もあるが、ｐＨ値の測定には然したる障害とはならない。
（その他）
なお、本システムでは、カラー撮像装置９の受光レンズ９ａの代わりに顕微鏡光学系を用いてもよい。顕微鏡光学系を用いた場合にもｐＨ値の測定は同様に行うことができる。因みに、顕微鏡光学系を用いた場合、培養容器（ディッシュ１）の全体の様子を観察することはできなくなるが、培養細胞の顕微鏡観察をすることが可能になる。
In addition, when such a reflective illumination system is used, the illumination light is reflected on the surface of the object to be observed (dish 1), so that the outline of the
(Other)
In this system, a microscope optical system may be used instead of the
また、本システムにおいて、コンピュータ２０の動作の一部又は全部を回路に行わせてもよい。また、撮像制御部１１及び照明制御部８の動作の一部又は全部をコンピュータ２０に行わせてもよい。
また、本システムにおいて、測定ポイントを指定させるタイミングや、ｐＨ値を算出するタイミングは、上述したものに限定されることはない。例えば、ｐＨ値の算出は、培養期間中の全てのカラー画像の取得後に行われてもよい。
In this system, a part or all of the operation of the
Further, in this system, the timing for designating the measurement point and the timing for calculating the pH value are not limited to those described above. For example, the calculation of the pH value may be performed after acquisition of all color images during the culture period.
また、本システムでは、ｐＨ指示薬としてフェノールレッドを用いたが、クロルフェノールレッド、ブロムクレゾール パープルなどの他のｐＨ指示薬が用いられてもよい。何れの場合も、ｐＨ値の異なる複数のサンプルを用いた実験でｐＨ指示薬の色とｐＨ値との関係式を予め求めておけば、カラー画像からｐＨ値を算出することができる。
［第２実施形態］
以下、第２実施形態を説明する。本実施形態は、インキュベータの実施形態である。
In this system, phenol red is used as a pH indicator, but other pH indicators such as chlorophenol red and bromcresol purple may be used. In any case, the pH value can be calculated from the color image by previously obtaining a relational expression between the color of the pH indicator and the pH value in an experiment using a plurality of samples having different pH values.
[Second Embodiment]
The second embodiment will be described below. This embodiment is an embodiment of an incubator.
図１６は、インキュベータの全体構成を示す図である。インキュベータ１００の内部には、ストッカー１０１、搬送装置１０２、及び観察装置１０が配置されている。
ストッカー１０１には、複数のホルダ１1，１2，１3，…が収容されている。個々のホルダ１1，１2，１3，…は、個別に培養容器を保持している。個々の培養容器内は培地で満たされており、その培地の中で細胞が培養される。その培地にはｐＨ指示薬が予め添加されている。なお、１つのホルダ１iが保持するのは、例えば、複数のディッシュ、ウェルプレート、フラスコなどである。
FIG. 16 is a diagram showing the overall configuration of the incubator. Inside the
A plurality of holders 1 1 , 1 2 , 1 3 ,... Are accommodated in the
観察装置１０は、第１実施形態の観察システムの光学系部分であり、少なくとも載置台とカラー撮像装置と照明部とを有する。観察システムの他の部分（回路やコンピュータなど）は、インキュベータ１００の外部に配置され、観察システム１０とはケーブルで接続されている。
搬送装置１０２は、ベースプレート１０２ｂ及びホルダーアーム１０２ｂを動かして、ストッカー１０１と観察装置１０との間でホルダ１iを搬送する。符号１０２ｃは、搬送装置１０２の駆動用モータである。
The
The
インキュベータ１００の内部は、培養が開始されると、例えば、炭酸ガス５％、摂氏３７度の雰囲気に保たれる。培養期間中、所定の測定間隔（１２時間，２４時間など）で、インキュベータ１００内の全ての培養容器の全ての培地のｐＨ値が測定される。
本インキュベータ１００を用いた場合、ｐＨ値の測定は、次のとおり行われる。
先ず、搬送装置１０２は、ストッカー１０１から観察装置１０へとホルダ１iを搬送する。観察装置１はホルダ１iのカラー画像（培養容器のカラー画像）を取得し、外部のコンピュータへ送出する。カラー画像が取得されると、搬送装置１０２は、ホルダ１iをストッカー１０１へ戻す。以上の処理が、ストッカー１０１に収容された全てのホルダ１1，１2，１3，…について行われる。その結果、コンピュータは、全てのホルダ１1，１2，１3，…のカラー画像を得ることができる。コンピュータは、それらカラー画像に写っている各培地のｐＨ値を算出し、そのｐＨ値の情報を、それらカラー画像の情報と共に管理する。また、コンピュータは、ホルダ毎の測定履歴を作成する。
When the culture is started, the inside of the
When the
First, the
このコンピュータを介して、管理者は、インキュベータ１００内の多数の培養容器の各々の状態を、その培養環境を保ちながら監視することができる。
Through this computer, the administrator can monitor the state of each of a large number of culture vessels in the
１…培養容器（ディッシュ），７…載置台，６…照明部，９…カラー撮像装置，２０…コンピュータ，２１…イメージ表示部，２２…入力器
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Culture container (dish), 7 ... Mounting stand, 6 ... Illumination part, 9 ... Color imaging device, 20 ... Computer, 21 ... Image display part, 22 ... Input device
Claims (3)
前記カラー画像の色に基づき前記被観察物のｐＨ値を算出する演算手段とを備え、
前記撮像装置は、前記カラー画像の少なくとも緑色成分と青色成分とを取得することが可能であり、
前記演算手段は、前記緑色成分と前記青色成分との強度比に基づき前記被観察物のｐＨ値を算出する
ことを特徴とする観察装置。 an imaging device for obtaining a color image of an observation object stained with a pH indicator;
Calculating means for calculating the pH value of the object to be observed based on the color of the color image;
The imaging device can obtain at least a green component and a blue component of the color image,
The said calculating means calculates the pH value of the said to-be-observed object based on the intensity ratio of the said green component and the said blue component. The observation apparatus characterized by the above-mentioned.
前記演算手段は、前記ｐＨ値の情報と前記カラー画像とを重畳して表示するための信号を生成する
ことを特徴とする観察装置。 The observation apparatus according to claim 1,
The said calculating means produces | generates the signal for superimposing and displaying the information of the said pH value, and the said color image. The observation apparatus characterized by the above-mentioned.
前記演算手段及び前記撮像装置は、前記カラー画像の取得と前記ｐＨ値の算出とからなる測定を複数回行い、前記演算手段は前記測定の履歴を作成する
ことを特徴とする観察装置。
In the observation device according to claim 1 or 2,
The said calculating means and the said imaging device perform the measurement which consists of acquisition of the said color image and calculation of the said pH value in multiple times, and the said calculating means produces the log | history of the said measurement. The observation apparatus characterized by the above-mentioned.
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