JP2007143524A

JP2007143524A - Cell separation method, cell assay method and reagent kit therefor

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Publication number: JP2007143524A
Application number: JP2005345542A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Kira; 敦史吉良; Akihiro Hattori; 明弘服部; Kenji Yasuda; 賢二安田
Original assignee: On-chip Cellomics Consortium; Ulvac Inc
Current assignee: On-chip Cellomics Consortium; Ulvac Inc
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2005-11-30
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2025-11-30
Also published as: JP4542502B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To prevent the damage of a cell function in a sorting step, when discrimination or separation of cells is required. <P>SOLUTION: A polynucleotide specifically binding to a specific antigen existing on the surface of a specific cell is used as a recognizing substance and the substance is bonded to a paramagnetic magnet. The specific cells are obtained by mixing a sample with the magnet, collecting the magnet by magnetic force, applying a nuclease to decompose the polynucleotide binding to a specific antigen of the specific cell, and removing the magnet with magnetic force. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は細胞の識別や分離を行う方法に関する。特に、再生医療や細胞のインプラントに用いる細胞分離のための細胞識別分離に関する。 The present invention relates to a method for identifying and separating cells. In particular, the present invention relates to cell identification separation for cell separation used in regenerative medicine and cell implants.

細胞を識別したり分離したりしようとすると、何らかの指標に従い区別する必要がある。細胞を区別する方法としては下記のような方法をあげることができる。 In order to identify or separate cells, it is necessary to distinguish them according to some sort of index. Examples of the method for distinguishing cells include the following methods.

１）細胞浸透性の染料による分類：
各細胞は細胞全体の形、細胞全体に占める核の比率、細胞質に存在する顆粒の種類や量に応じて、細胞浸透性の染料を利用して分類することができる。核や細胞内顆粒を分類のターゲットにする場合は、染料を用いて染色して検出する場合が多い。たとえば、核を見たい場合は酢酸オルセインや酢酸カーミン、パパニコロウ染色、ＤＡＰＩ染色があげられる。染料で染色して可視光で検出する他、蛍光染色で蛍光像として観察することもできる。 1) Classification by cell penetrating dye:
Each cell can be classified using a cell-permeable dye according to the shape of the whole cell, the ratio of nuclei in the whole cell, and the type and amount of granules present in the cytoplasm. When the nuclei and intracellular granules are targeted for classification, they are often detected by staining with a dye. For example, when it is desired to see the nucleus, examples include orcein acetate, carmine acetate, Papanicolaou staining, and DAPI staining. In addition to detection with visible light after staining with a dye, it can also be observed as a fluorescent image by fluorescent staining.

検出には顕微鏡下で目視観察して識別する方法とＣＣＤカメラなどで画像として識別する方法のいずれもが実用化されている。たとえば、尿中に出現する異型細胞検査による膀胱がんや尿道のがんなどの検査や血中の異型細胞分類、組織中における細胞診によるがん検査などをあげることができる。 For detection, both a method of visually observing under a microscope and a method of identifying as an image with a CCD camera or the like have been put into practical use. For example, examination of bladder cancer and urethral cancer by examination of atypical cells appearing in urine, classification of atypical cells in blood, and examination of cancer by cytology in tissues can be mentioned.

２）蛍光抗体法による細胞表面抗原（マーカー）染色による細胞分類：
一般にＣＤマーカーと呼ばれる細胞表面抗原を、それに特異的な蛍光標識抗体で染色するもので、セルソーターによる細胞分離やフローサイトメーターや組織染色によるがん検査などに用いられている。もちろんこれらは、医療面のみならず、細胞生理研究用や、工業的な細胞利用の上でも多用されている。 2) Cell classification by cell surface antigen (marker) staining by the fluorescent antibody method:
In general, a cell surface antigen called a CD marker is stained with a fluorescent labeling antibody specific to it, and is used for cell separation by a cell sorter, a cancer test by a flow cytometer or tissue staining, and the like. Of course, these are widely used not only for medical purposes but also for cell physiology research and industrial cell utilization.

これらの方法は、細胞を分類して、単に、その形態学的な違いを調べるだけであれば、きわめて有用である。特に上記２）の表面抗原の分類に基づく方法は微細な分類が可能で、組織学的な研究や検査、セルソーターによる細胞分離には欠かせない方法となっている。しかしながら、細胞を分離し、その後に分離した細胞を培養して利用しようとすると問題がある、すなわち、表面抗原の蛍光標識抗体による修飾は非可逆的であるので、分離後に残る細胞表面の蛍光標識抗体により、細胞機能が損なわれる可能性がある。 These methods are very useful if the cells are classified and simply examined for morphological differences. In particular, the method based on the classification of the surface antigen of 2) above can be classified finely and is an indispensable method for histological research and examination, and cell separation by a cell sorter. However, there is a problem when trying to use the cells after separating the cells and culturing the separated cells. That is, the modification of the surface antigen with the fluorescently labeled antibody is irreversible. Antibodies can impair cell function.

細胞を分離するためには、分離のキーとなる標識物質が必要であり、この標識物質は特異的な細胞表面抗原を認識して、これと強固に結合する必要がある。また、この標識物質には、標識物質が細胞に結合していることを検出するための蛍光体や微粒子からなる識別物質が結合している必要がある。 In order to separate cells, a labeling substance serving as a key for separation is required, and this labeling substance needs to recognize a specific cell surface antigen and bind tightly thereto. In addition, the labeling substance needs to be bound with a fluorescent substance or an identification substance made of fine particles for detecting that the labeling substance is bound to cells.

一般的には細胞表面抗原に結合する標識物質としては、目的細胞表面抗原に対する抗体が用いられる。抗体としてはモノクローナル抗体を用いることが多い。もちろんポリクローナル抗体を用いることもできる。これらの抗体は非特異的な結合を抑え、あるいは、補体系の不用意な活性化を防ぐために、抗体のＦｃ部位を切除したＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）_２、あるいは、Ｆ（ａｂ’）が用いられることが多い。これらの抗体やＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）_２、あるいは、Ｆ（ａｂ’）には、識別物質が共有結合で結合している。識別物質として用いる蛍光体は蛍光検出できるし、粒子も光学的に検出することができる。常磁性粒子を識別物質に用いることで特定細胞の検出と磁石による分離を同時に行う方法も開発されている。 In general, as a labeling substance that binds to a cell surface antigen, an antibody against the target cell surface antigen is used. A monoclonal antibody is often used as the antibody. Of course, polyclonal antibodies can also be used. These antibodies suppress non-specific binding or prevent F (ab), F (ab ′) ₂ or F (ab) from which the Fc region of the antibody has been excised in order to prevent inadvertent activation of the complement system. ') Is often used. An identification substance is covalently bound to these antibodies, F (ab), F (ab ′) ₂ , or F (ab ′). A phosphor used as an identification substance can be detected by fluorescence, and particles can also be detected optically. A method of detecting specific cells and separating them with a magnet at the same time by using paramagnetic particles as an identification substance has also been developed.

しかし、標識物質である抗体やＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ'）_２、あるいは、Ｆ（ａｂ'）と表面抗原の結合は、結合定数が１０^８Ｍ^−１以上と強固なので、平衡論的な処理方法では、細胞の分離後に、標識物質を脱離させることは困難を有する。にもかかわらず、平衡論的な高濃度の表面抗原のエピトープを遊離抗原として加える方法が抗原抗体結合の解消法として一般的に利用される。遊離抗原と細胞表面抗原が交換反応を起こして細胞から標識物質である抗体を解離させることができる。 However, the binding between the labeling substance antibody, F (ab), F (ab ′) ₂ or F (ab ′) and the surface antigen is strong with an association constant of 10 ⁸ M ⁻¹ or more. In such a processing method, it is difficult to desorb the labeling substance after separating the cells. Nevertheless, a method of adding a high equilibrium equilibrium surface antigen epitope as a free antigen is generally used as a method for eliminating antigen-antibody binding. The free antigen and the cell surface antigen undergo an exchange reaction to dissociate the antibody as the labeling substance from the cell.

しかし、高濃度の表面抗原に曝露されることにより、細胞機能が著しく変動したり損傷を受けたりすることは容易に想像できる。あるいは、抗原と抗体の結合は、４Ｍのグアニジンの塩酸塩やイソチオシアン酸塩のようなカオトロピックイオンによる変性や塩酸酸性化による酸変性で解離するが、このような過酷な条件では細胞が生存することができない。 However, it can be easily imagined that cell functions are significantly fluctuated or damaged by exposure to high concentrations of surface antigens. Alternatively, antigen-antibody binding can be dissociated by denaturation with chaotropic ions such as 4M guanidine hydrochloride or isothiocyanate or acid denaturation with hydrochloric acid acidification, but cells must survive under such severe conditions. I can't.

本願の発明者らは、細胞を分類する過程で細胞機能が損なわれることを回避するための新しい分離方法として特定細胞に存在するトランスポーターを用いることを特願２００４−２２６３５９として提案した。すなわち、細胞表面に存在するトランスポーターを介して標識物質を細胞内に取り込ませ、この標識物質に識別物質として蛍光色素を結合させておき、トランスポーターを通過した標識物質に結合した蛍光色素で細胞分類を行うのである。この方法では、取り込まれた標識物質は、分離収集された後に、可逆的にトランスポーターから排出させることができるので、分離後の細胞に対する影響が少ない。 The inventors of the present application have proposed as Japanese Patent Application No. 2004-226359 that a transporter existing in a specific cell is used as a new separation method for avoiding the loss of cell function in the process of classifying cells. That is, a labeling substance is taken into a cell via a transporter present on the cell surface, and a fluorescent dye is bound to the labeling substance as a discriminating substance. Classification is performed. In this method, since the incorporated labeled substance can be reversibly discharged from the transporter after being separated and collected, there is little influence on the separated cells.

特願２００４−２２６３５９号明細書Japanese Patent Application No. 2004-226359 Specification

従来の細胞分離方法では、シースフローセルにレーザーを照射し、細胞がレーザー光を横切った時に散乱する光を検出する方法と、予め細胞を蛍光標識しておき、レーザーを横切ったときに発生する蛍光を検出する方法がある。そして、これらの一般的なフローサイトメーターやセルソーターは高価であること、装置が大型であること、試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接、試料を観察できないことなどの問題がある。 In the conventional cell separation method, the sheath flow cell is irradiated with a laser to detect the light scattered when the cell crosses the laser beam, and the fluorescence generated when the cell is fluorescently labeled in advance and crosses the laser. There is a way to detect. In addition, these general flow cytometers and cell sorters are expensive, the apparatus is large, a large amount of sample is required, and there is a possibility of damaging cells at the stage of creating droplets. There is a problem that the sample cannot be observed directly.

また、従来の形態学的な細胞分類による細胞識別分離や、蛍光抗体法による細胞表面抗原（マーカー）染色による不可逆的な細胞識別とは異なる新しい細胞識別法が求められている。この新しい細胞識別法は、標識物質が結合した細胞を、分離後に標識物質が結合する前の細胞状態に戻すことができる、あるいは少なくても、一旦標識物質で標識した細胞表面抗原を可逆的に脱標識することで細胞に与える影響を最小限にとどめることが実現できるものであることが必要である。 Further, there is a need for a new cell identification method different from conventional cell identification separation by morphological cell classification and irreversible cell identification by cell surface antigen (marker) staining by a fluorescent antibody method. This new cell identification method can return cells bound to the labeling substance to the cell state before the labeling substance binds after separation, or at least, the cell surface antigen once labeled with the labeling substance can be reversibly It is necessary to be able to realize that the effect on cells by delabeling is minimized.

本発明では、表面抗原の認識物質にマイルドな条件で分解可能な物質を用いるとともに、表面抗原の認識物質を生理的な条件の下で、細胞に影響の無いように分解して除去する。具体的には、認識物質に種々立体構造を形成することのできるポリヌクレオチドを利用する。このポリヌクレオチドは一般的にアプタマーと呼ばれる概念のものである。たとえば、全長を８０塩基とし、３'末端側と５'末端側の２０塩基は制御された既知の塩基配列とし、中央部の４０塩基はランダムな配列の多種類の合成ポリヌクレオチドを用意する。これらの合成ポリヌクレオチドを、内面に分離したい細胞の表面抗原を固定したカラムに通す。その結果、カラム内面には分離したい細胞の表面抗原にアフィニティーがある配列のポリヌクレオチドが捕捉される。このカラムをアルカリ処理して、捕捉されたポリヌクレオチドを分離回収し、ＰＣＲ増幅することにより、細胞表面抗原に特異的に結合するポリヌクレオチドを得ることができる。すなわち、マイルドな条件で分解可能な表面抗原の認識物質としてのアプタマーを得ることができる。 In the present invention, a substance capable of degrading under mild conditions is used as the surface antigen recognizing substance, and the surface antigen recognizing substance is decomposed and removed so as not to affect the cells under physiological conditions. Specifically, a polynucleotide capable of forming various three-dimensional structures on the recognition substance is used. This polynucleotide is a concept generally called an aptamer. For example, the total length is 80 bases, 20 bases on the 3 ′ end side and 5 ′ end side are controlled known base sequences, and 40 bases in the central part are prepared with various kinds of synthetic polynucleotides having random sequences. These synthetic polynucleotides are passed through a column on which surface antigens of cells to be separated are fixed. As a result, a polynucleotide having a sequence having affinity for the surface antigen of the cell to be separated is captured on the inner surface of the column. This column is treated with alkali to separate and collect the captured polynucleotide, and then PCR amplification, whereby a polynucleotide that specifically binds to a cell surface antigen can be obtained. That is, an aptamer as a surface antigen recognition substance that can be decomposed under mild conditions can be obtained.

より特異性が高く、結合力の強いアプタマー（ポリヌクレオチド）を得るために、ＰＣＲ増幅時にわざとフィデリティーを落として配列が変化するようにしてアフィニティー精製を繰り返す進化工学的な手法を併用しても良い。表面抗原に結合する塩基部分を修飾して電荷を持たせて結合力を高める工夫がなされるケースもある。あるいは塩基の糖鎖部分を修飾したヌクレオチドを用いて結合力を高める工夫がなされるケースもある。 In order to obtain aptamers (polynucleotides) with higher specificity and stronger binding force, it is possible to use evolutionary engineering techniques that repeat affinity purification in such a way that the fidelity is intentionally dropped and the sequence is changed during PCR amplification. good. In some cases, the base portion that binds to the surface antigen is modified to give a charge to increase the binding power. Alternatively, there is a case where a device for increasing the binding force is made using a nucleotide in which the sugar chain portion of the base is modified.

得られる構造認識型ポリヌクレオチドのバックボーン構造はリボヌクレオチド型でもよいし、デオキシリボヌクレオチド型でもよい。一般的にリボヌクレオチド型のほうが多様な構造をとりやすいことから有利であるが、周辺に存在するＲＮａｓｅによる不用意な分解があるので使用が困難なケースもある。ＤＮａｓｅは細胞外には多く存在せず、不活性化も容易であるからであるこのことから、デオキシリボヌクレオチド型のほうが使い勝手の面では有利である。 The backbone structure of the resulting structure-recognizing polynucleotide may be ribonucleotide type or deoxyribonucleotide type. In general, the ribonucleotide type is more advantageous because it has a variety of structures, but it may be difficult to use due to inadvertent degradation due to RNases present in the vicinity. This is because DNase does not exist in large amounts outside the cell and is easily inactivated. Therefore, the deoxyribonucleotide type is advantageous in terms of usability.

上記で得られた構造認識型ポリヌクレオチド（アプタマー）を認識物質とし、常磁性粒子に修飾して認識素子を構成する。常磁性粒子は、標的細胞のサイズに比べ小さすぎるものでは、結合した際に細胞へ取り込まれてしまい、細胞の常態に影響を与えてしまうだけでなく、磁場による回収が困難となる。しかし、常磁性粒子のサイズが大きくなると、溶液中での細胞への衝突確立が減り、細胞の回収効率が悪くなる。 Using the structure-recognized polynucleotide (aptamer) obtained above as a recognition substance, it is modified with paramagnetic particles to constitute a recognition element. If the paramagnetic particles are too small compared to the size of the target cells, they will be taken up by the cells when bound, which will affect the normal state of the cells, and will be difficult to recover by a magnetic field. However, when the size of the paramagnetic particles increases, the probability of collision with cells in the solution decreases, and the cell recovery efficiency deteriorates.

そこで、標的とする細胞の特長および回収目的によって認識素子担体として用いる常磁性粒子のサイズを決定する。標的細胞の回収量のみを目的とする場合、常磁性粒子のサイズを標的細胞の（予想される）平均直径の半分以下のサイズのものを用いる。標的細胞の（予想される）平均直径の半分以上で４μｍの直径の常磁性粒子では、細胞へ取り込まれる可能性は無く、回収量も遜色ない。４μｍより大きい直径の常磁性粒子では、磁場での回収時間が短時間ですむので、試料中に標的細胞が十分にある場合に用いる。 Therefore, the size of paramagnetic particles used as a recognition element carrier is determined according to the characteristics of the target cells and the purpose of collection. If the objective is to collect only target cells, use a paramagnetic particle whose size is not more than half the (predicted) average diameter of the target cells. Paramagnetic particles that are more than half of the (predicted) average diameter of the target cell and have a diameter of 4 μm are unlikely to be taken up by the cell and the recovery amount is comparable. Paramagnetic particles with a diameter larger than 4 μm can be used when the target cells are sufficiently present in the sample because the collection time in the magnetic field is short.

標的細胞に認識素子を結合させた後、磁場中に置くことで認識素子と結合した標的細胞を回収する。 After the recognition element is bound to the target cell, the target cell bound to the recognition element is recovered by placing it in a magnetic field.

回収された認識素子に結合した標的細胞は、ヌクレアーゼで処理することで表面抗原に結合している認識物質であるアプタマーを分解除去する。認識ポリヌクレオチドがリボヌクレオチド型の場合はＲＮａｓｅで分解する。デオキシリボヌクレオチド型の場合はＤＮａｓｅで分解する。ここで安定性を高めるために修飾ヌクレオチドを利用する場合はこれらヌクレアーゼでの分解が完全に阻害されないように注意することが重要である。ヌクレアーゼの効果を阻害する恐れのあるヌクレオチド構造はアプタマー分子の一部分への導入にとどめるべきである。このようにすることで、たとえ、ヌクレアーゼの働かない部分があるにしてもアプタマー分子全体で見れば十分低分子に分解されるようになる。続いて、標的細胞から解離した常磁性粒子を磁場を用いて回収することで純粋な標的細胞を分離できる。 The target cells bound to the collected recognition elements are treated with nuclease to decompose and remove aptamers that are recognition substances bound to surface antigens. When the recognition polynucleotide is a ribonucleotide type, it is degraded with RNase. In the case of deoxyribonucleotide type, it is decomposed with DNase. Here, when using modified nucleotides to enhance the stability, it is important to take care not to completely inhibit the degradation with these nucleases. Nucleotide structures that can inhibit the effect of nucleases should be introduced into a portion of the aptamer molecule. By doing so, even if there is a part where nuclease does not work, the aptamer molecule as a whole will be decomposed into sufficiently small molecules. Subsequently, pure target cells can be separated by collecting paramagnetic particles dissociated from the target cells using a magnetic field.

したがって、アプタマーを認識物質とし常磁性粒子と組み合わせて認識素子を構成した細胞分離方法では細胞に対して可逆的な標識で、さらには磁場中にサンプルを供するという非常に簡便なシステムによって細胞分離が可能となる。 Therefore, in the cell separation method in which an aptamer is used as a recognition substance and a recognition element is configured in combination with paramagnetic particles, cell separation can be achieved by a very simple system that uses reversible labeling for cells and further provides a sample in a magnetic field. It becomes possible.

細胞表面抗原の標識物質である構造認識型ポリヌクレオチド（アプタマー）はヌクレアーゼで容易に除去することができる。そして、ＲＮａｓｅやＤＮａｓｅは細胞膜を通過できないので細胞内のＲＮＡやＤＮＡが損傷を受けることはない。また、細胞表面にＲＮＡやＤＮＡが露出していることも考えにくいので、細胞表面抗原に結合した構造認識型ポリヌクレオチド（アプタマー）によって細胞そのものが影響を受けることは無いと考えられる。さらに、認識素子担体として用いる常磁性粒子を用いた分離方法によって、簡便な分離方法が可能となる。したがって、大掛かりな装置を必要とせず、細胞の分離のための処理により細胞が変質することを防止できる。 A structure-recognizing polynucleotide (aptamer) that is a labeling substance for a cell surface antigen can be easily removed with a nuclease. And since RNase and DNase cannot pass through a cell membrane, RNA and DNA in a cell will not be damaged. In addition, it is unlikely that RNA or DNA is exposed on the cell surface, so it is considered that the cell itself is not affected by the structure recognition type polynucleotide (aptamer) bound to the cell surface antigen. Furthermore, a simple separation method is possible by a separation method using paramagnetic particles used as a recognition element carrier. Therefore, it is possible to prevent the cells from being altered by the treatment for separating the cells without requiring a large-scale device.

本発明の実施例について説明する前に、本発明の認識物質として有用なアプタマーの例として、細胞表面抗原ＣＤ４に対するアプタマーの調製方法と常磁性粒子への修飾方法について説明する。認識物質としてのアプタマーとしてNucleic Acids Research 26,3915-3924 (1998)記載の論文「Staining of cell surface human CD4 with 3’−F-pyrimidine−containing RNA aptamers for flow cytometry」記載の細胞表面抗原ＣＤ４に対するアプタマーを用いる。このアプタマーはリボヌクレオチド型すなわちＲＮＡアプタマーである。 Before describing the examples of the present invention, as an example of aptamers useful as a recognition substance of the present invention, a method for preparing aptamers for cell surface antigen CD4 and a method for modifying paramagnetic particles will be described. Aptamer for cell surface antigen CD4 described in the article “Staining of cell surface human CD4 with 3′-F-pyrimidine-containing RNA aptamers for flow cytometry” described in Nucleic Acids Research 26, 3915-3924 (1998) as an aptamer as a recognition substance Is used. This aptamer is a ribonucleotide type or RNA aptamer.

上記論文ではアプタマーを蛍光で識別できるようにするために、ＲＮＡアプタマーの５’末端にインビトロトランスクリプションでＧＤＰ−β−Ｓを導入する。すなわちこの時点でアプタマーの５’末端にはチオリン酸基が挿入される。このチオリン酸基にヨードアセチル基を導入したビオチンを反応させ、５’ビオチン化ＲＮＡアプタマーを得る。 In the above paper, GDP-β-S is introduced into the 5 ′ end of RNA aptamer by in vitro transcription so that the aptamer can be distinguished by fluorescence. That is, at this point, a thiophosphate group is inserted into the 5 'end of the aptamer. By reacting this thiophosphate group with biotin having an iodoacetyl group introduced, a 5 'biotinylated RNA aptamer is obtained.

ストレプトアビジンがコートされた常磁性子に５’ビオチン化ＲＮＡアプタマーを加える。ストレプトアビジンがコートの常磁性粒子はすでに市販されており、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２８Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎという商品名で常磁性粒子の直径が２．８μｍのものをＤＹＮＡＬＢＩＯＴＥＣＨ社から入手できる。アビジン−ビオチン相互作用によって５’ビオチン化ＲＮＡアプタマーが常磁性粒子に修飾される。この際、５’ビオチン化ＲＮＡアプタマーを加える量と混合溶液の塩強度をコントロールすることでアプタマーの修飾量が制御できる。 A 5 'biotinylated RNA aptamer is added to a paramagnetic element coated with streptavidin. Streptavidin-coated paramagnetic particles are already commercially available, for example, Dynabeads M-28 Streptavidin with a paramagnetic particle diameter of 2.8 μm is available from DYNAL BIOTECH. The 5 'biotinylated RNA aptamer is modified to paramagnetic particles by avidin-biotin interaction. At this time, the amount of aptamer modification can be controlled by controlling the amount of 5 'biotinylated RNA aptamer added and the salt strength of the mixed solution.

次に、認識物質を化学結合によって常磁性粒子に修飾する方法例を述べる。ＲＮＡアプタマーは上記論文記載の方法を用いてもよいが、ここでは化学合成によって作成したものを用いる。以下の方法においても常磁性粒子にＲＮＡアプタマーを修飾する際の混合比と混合溶液の塩強度をコントロールする。 Next, an example of a method for modifying a recognition substance to paramagnetic particles by chemical bonding will be described. As the RNA aptamer, the method described in the above paper may be used, but here, the RNA aptamer prepared by chemical synthesis is used. Also in the following method, the mixing ratio and the salt strength of the mixed solution when the RNA aptamer is modified to paramagnetic particles are controlled.

（ｉ）アミド結合：ＲＮＡアプタマーの化学合成時にアミノ基を導入する。カルボキシル基が表面に導入されている常磁性粒子を用意し、カルボキシル基をカルボジイミドで活性エステルの形にして、５’アミノ化ＲＮＡアプタマーを反応させる。 (I) Amide bond: An amino group is introduced during chemical synthesis of an RNA aptamer. Paramagnetic particles having a carboxyl group introduced on the surface are prepared, the carboxyl group is converted into an active ester form with carbodiimide, and a 5 'aminated RNA aptamer is reacted.

（ｉｉ）アルデヒド結合：ＲＮＡアプタマーの５’末端にアルデヒド基を導入したものを用意する。カルボキシル基表面の常磁性粒子を用意し、カルボキシル基をカルボジイミドで活性エステルの形にした後、ヒドラジンを反応させた常磁性粒子と５’アルデヒド基ＲＮＡアプタマーを反応させる。 (Ii) Aldehyde bond: An RNA aptamer having an aldehyde group introduced at the 5 'end is prepared. Paramagnetic particles on the surface of the carboxyl group are prepared, the carboxyl group is converted into an active ester form with carbodiimide, and then the paramagnetic particles reacted with hydrazine are reacted with the 5 'aldehyde group RNA aptamer.

（ｉｉｉ）ジスルフィド結合：５’末端にアミノ基を導入した合成ＲＮＡアプタマーにN-(8-Maleimidocapryloxy)sulfosuccinimideのような２価性試薬を反応させてＳＨ基と反応するマレイイミド基をＲＮＡアプタマーの５’末端に導入する。常磁性粒子の表面にＳＨ基の導入したものを調整する。ＳＨ基の導入は、ＮＨ_２表面の常磁性粒子に２−イミノチオランを用いて常磁性粒子のアミノ基を修飾しＳＨ基を導入する。マレイイミド基を導入したＲＮＡアプタマーをＳＨ基表面の常磁性粒子をｐＨ７で混合することで反応させる。 (Iii) Disulfide bond: A maleimide group that reacts with a SH group by reacting a divalent reagent such as N- (8-Maleimidocapryloxy) sulfosuccinimide with a synthetic RNA aptamer having an amino group introduced at the 5 ′ end, is converted into 5 of the RNA aptamer. 'Introduce to the end. A material in which SH groups are introduced on the surface of the paramagnetic particles is prepared. The introduction of the SH group is performed by modifying the amino group of the paramagnetic particle to the paramagnetic particle on the NH ₂ surface using 2-iminothiolane and introducing the SH group. The RNA aptamer introduced with a maleimide group is reacted by mixing paramagnetic particles on the surface of the SH group at pH 7.

（ｉｖ）その他：この他に、DYNAL BIOTECH社から販売されているトシル基やエポキシ基表面の常時性粒子を用いて共有結合によってＲＮＡアプタマーを修飾することができる。また、イソチオシアナート基表面の常磁性粒子を用いて、５’アミノ化ＲＮＡアプタマーを修飾する方法も有効な手段である。 (Iv) Others: Besides this, RNA aptamers can be modified by covalent bonding using permanent particles on the surface of tosyl groups and epoxy groups sold by DYNAL BIOTECH. In addition, a method of modifying a 5 'aminated RNA aptamer using paramagnetic particles on the surface of an isothiocyanate group is also an effective means.

以上、ＲＮＡアプタマーを常磁性粒子に修飾する調製法を述べたが、デオキシリボヌクレオチドでできたＤＮＡアプタマーの場合も、合成機でＤＮＡアプタマーを合成する時に５'末端に上記ＲＮＡアプタマーと同様にＳＨ基やアミノ基を導入することができるので、認識素子として同様に調製することができる。ＲＮＡアプタマーは上記合成法以外にも定法に従い５'末端側にＴ７プロモータを持つ１本鎖ＤＮＡとして合成し、その後ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡに転写してもよい。 The preparation method for modifying RNA aptamers to paramagnetic particles has been described above, but in the case of DNA aptamers made of deoxyribonucleotides, an SH group at the 5 ′ end is synthesized at the 5 ′ end in the same manner as the above RNA aptamers. Or an amino group can be introduced, so that it can be similarly prepared as a recognition element. The RNA aptamer may be synthesized as a single-stranded DNA having a T7 promoter on the 5 ′ end side according to a conventional method other than the above synthesis method, and then transcribed into RNA using RNA polymerase.

（実施例１）
細胞表面抗原ＣＤ４を認識するための物質としてＲＮＡアプタマーを採用し、ＲＮＡアプタマーが結合した細胞の分離回収のために粒径が３μｍ常磁性粒子を用いた装置例について説明する。すなわち、細胞表面抗原ＣＤ４提示細胞を上述したＲＮＡアプタマーと常磁性粒子で構成される認識素子を用いて磁場を利用し分離、回収する。 Example 1
An apparatus example in which an RNA aptamer is employed as a substance for recognizing the cell surface antigen CD4 and paramagnetic particles having a particle diameter of 3 μm for separation and recovery of cells bound with the RNA aptamer will be described. That is, cell surface antigen CD4-presenting cells are separated and recovered using a magnetic field using the above-described recognition element composed of RNA aptamer and paramagnetic particles.

図１は分離システムおよびその流れを説明する図である。１０１は第一混合槽であり、サンプルである試料細胞群、認識素子および洗浄および希釈用の緩衝液が導入され、混合される。第一混合槽１０１では、右側の吹き出しに示すように、▲で示される細胞表面抗原ＣＤ４１１３を持つ標的細胞１１１の細胞群と、●で示されるＣＤ４以外の表面抗原１１４を持つ細胞１１２の細胞群と、細胞表面抗原ＣＤ４認識ＲＮＡアプタマー１１６が常磁性粒子１１５に修飾してある認識素子１１７とが混合される。この際、認識素子１１７の濃度が１００ｎＭとなるようにする。十分な時間を置くと、ＣＤ４抗原１１３とＲＮＡアプタマー１１６が結合する、その結果、標的細胞１１１と認識素子１１７とが結合体となる。第一混合槽１０１の後流部からバルブ１０２で制御されて無用なドレインが排出される。 FIG. 1 is a diagram for explaining a separation system and its flow. Reference numeral 101 denotes a first mixing tank, into which a sample cell group as a sample, a recognition element, and a buffer solution for washing and dilution are introduced and mixed. In the first mixing tank 101, as shown in the right-hand balloon, a cell group of target cells 111 having a cell surface antigen CD4 113 indicated by ▲ and a cell 112 having a surface antigen 114 other than CD4 indicated by ● The group and the recognition element 117 in which the cell surface antigen CD4 recognition RNA aptamer 116 is modified to the paramagnetic particle 115 are mixed. At this time, the concentration of the recognition element 117 is set to 100 nM. When sufficient time is allowed, the CD4 antigen 113 and the RNA aptamer 116 bind to each other, and as a result, the target cell 111 and the recognition element 117 become a conjugate. Unnecessary drains are discharged from the downstream portion of the first mixing tank 101 under the control of the valve 102.

次に、第一磁場分離槽１０４にサンプルと認識素子混合溶液を移す。第一磁場分離槽１０４に磁場を発生させるために用いる磁石１０５が備えられる。この磁石１０５は希土類のネオジウムを用いるのがよい。また、この磁石は可動式とし、第一磁場分離槽１０４の磁場の強度を調節できる。磁場中では、右側の吹き出しに示すように、常磁性粒子１１５を担体とする認識素子１１７と結合している標的細胞１１１は、磁場によってトラップされ、結合しない細胞はバルブ１０２で制御されてドレインに流れる。結果、標的細胞１１１のみが試料細胞群から回収される。 Next, the sample and the recognition element mixed solution are transferred to the first magnetic field separation tank 104. A magnet 105 used for generating a magnetic field in the first magnetic field separation tank 104 is provided. The magnet 105 is preferably made of rare earth neodymium. Further, this magnet is movable, and the strength of the magnetic field in the first magnetic field separation tank 104 can be adjusted. In the magnetic field, as shown in the right-hand balloon, the target cell 111 bound to the recognition element 117 having the paramagnetic particle 115 as a carrier is trapped by the magnetic field, and the unbound cell is controlled by the valve 102 and is discharged to the drain. Flowing. As a result, only the target cell 111 is recovered from the sample cell group.

第一磁場分離槽１０４から磁石１０５を離して、磁場を開放し、上流部から緩衝液を導入する。ここで用いる緩衝液は、後にヌクレアーゼで処理することを考慮し、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で、０．１５ＭＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡの組成のものとする。 The magnet 105 is separated from the first magnetic field separation tank 104 to release the magnetic field, and a buffer solution is introduced from the upstream portion. The buffer solution used here is 10 mM HEPES (pH 7.4) and has a composition of 0.15 M NaCl, 2 mM MgCl ₂ , 1 mg / ml BSA in consideration of later treatment with nuclease.

続いて、第二混合槽１０６にて標的細胞１１１と認識素子１１７の結合体に５０ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを混合する。ＲＮＡアプタマーは立体構造を形成しているので、１本鎖ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼＡのようなタイプのヌクレアーゼだけでは十分な分解ができないケースがある。１本鎖と２本鎖ＲＮＡの両方を分解する酵素を用いるのが効果的である。ここではThe Journal of Biological Chemistry 244、 5219-5225 (1969)記載のSerratia marcescens由来のヌクレアーゼを遺伝子工学的に量産した（EP特許No. 0229866、米国特許No. 5,173,418）商品名Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を使用する。この酵素は、３７℃で働き、使用ｐＨレンジが６から９と中性領域であるので細胞に対して利用しやすい。高濃度のリン酸や一価の金属イオンで酵素化成が落ちるので、ここでは緩衝液として比リン酸系の緩衝液を用いる。リン酸系を使用せざるを得ない場合は、リン酸カリウム／ナトリウム濃度を５ｍＭに押さえ、０．１５ＭＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む条件で用いる。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼの量は１０〜１００ｕ／ｍｌで使用する。あるいは、リボヌクレアーゼＡとリボヌクレアーゼＴ１の混合物を用いることもできるがSerratia marcescens由来のヌクレアーゼのほうが汎用性に富む。 Subsequently, 50 u / ml Benzonase (registered trademark) nuclease is mixed with the conjugate of the target cell 111 and the recognition element 117 in the second mixing tank 106. Since RNA aptamers form a three-dimensional structure, there are cases where sufficient degradation cannot be achieved with a type of nuclease such as ribonuclease A that degrades single-stranded RNA. It is effective to use an enzyme that degrades both single-stranded and double-stranded RNA. Here, Serratia marcescens-derived nuclease described in The Journal of Biological Chemistry 244, 5219-5225 (1969) was mass-produced by genetic engineering (EP Patent No. 0229866, US Patent No. 5,173,418). The trade name Benzonase (registered trademark) use. This enzyme works at 37 ° C. and is easy to use for cells because the pH range used is 6 to 9 in the neutral range. Since enzyme formation falls with high concentration phosphoric acid and monovalent metal ions, a specific phosphate buffer solution is used here as a buffer solution. When a phosphoric acid system must be used, the potassium phosphate / sodium concentration is kept at 5 mM and used under the conditions containing 0.15 M NaCl, 2 mM MgCl ₂ , 1 mg / ml BSA. Benzonase® nuclease is used in an amount of 10 to 100 u / ml. Alternatively, a mixture of ribonuclease A and ribonuclease T1 can be used, but a nuclease derived from Serratia marcescens is more versatile.

必要に応じて、緩衝液の代わりに血清を用いることも考えられるが、この場合は、血清中のヌクレアーゼインヒビターの影響があるケースがあるので、血清ロット毎にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ添加量を加減する必要がある可能性がある。一般的には血清を用いる場合は１００〜４００ｕ／ｍｌで利用することでよい結果を得られる。 If necessary, serum may be used instead of buffer, but in this case, there may be effects of nuclease inhibitors in the serum, so the amount of Benzonase (registered trademark) nuclease added for each serum lot It may be necessary to adjust. In general, when serum is used, good results can be obtained by using 100 to 400 u / ml.

ヌクレアーゼを標的細胞１１１と認識素子１１７の結合体に混合すると、右側の吹き出しに示すように、ＲＮＡアプタマーが分解され（ここでは、参照符号１１９(スキャナで読めない可能性があるので、黒い線にしてください)を付した破線で示す）、標的細胞１１１が認識素子１１７から解離する。 When the nuclease is mixed with the conjugate of the target cell 111 and the recognition element 117, the RNA aptamer is decomposed as shown in the balloon on the right (here, reference numeral 119 (because it may not be readable by a scanner, The target cell 111 is dissociated from the recognition element 117.

ヌクレアーゼ処理後、第二磁場分離槽１０７へ、標的細胞１１１が認識素子１１７から解離したまま混合されているサンプルを流す。第二磁場分離槽１０７も、第一磁場分離槽１０４と同様、第二磁場分離槽１０７に磁場を発生させるために用いる磁石１０５が備えられる。第二磁場分離槽１０７では、、右側の吹き出しに示すように、磁場によって常磁性粒子１１５がトラップされ、分離された標的細胞１１１のみが流れていく。 After the nuclease treatment, the sample mixed with the target cells 111 dissociated from the recognition element 117 is passed through the second magnetic field separation tank 107. Similarly to the first magnetic field separation tank 104, the second magnetic field separation tank 107 is also provided with a magnet 105 that is used to generate a magnetic field in the second magnetic field separation tank 107. In the second magnetic field separation tank 107, the paramagnetic particles 115 are trapped by the magnetic field, and only the separated target cells 111 flow, as shown in the right side blowing.

第二磁場分離槽１１７の下流に細胞をカウントできるように、細胞の流路を挟んで、光源１０８とフォトンカウンター１０９を配置し、分離された標識細胞１１１の数をリアルタイムで計測する。細胞数を計測する方法として、散乱光にて検出する方法でもよい。 A light source 108 and a photon counter 109 are arranged so that the cells can be counted downstream of the second magnetic field separation tank 117, and the number of separated labeled cells 111 is measured in real time. As a method of measuring the number of cells, a method of detecting with scattered light may be used.

回収された標的細胞を含む溶液は回収して、溶液を交換して認識物質ＲＮＡアプタマーの分解物１１９を除去することにより、細胞表面抗原ＣＤ４提示細胞１１１を純粋に回収することができる。細胞上清の交換には遠心を用いる。３０００ｒｐｍで１５分間遠心して細胞を沈殿させ、上清を捨てる操作を行う。 The cell surface antigen CD4-presenting cell 111 can be recovered pure by recovering the solution containing the recovered target cells and exchanging the solution to remove the degradation product 119 of the recognition substance RNA aptamer. Centrifugation is used to replace the cell supernatant. Centrifuge at 3000 rpm for 15 minutes to precipitate the cells, and discard the supernatant.

このようにＲＮＡアプタマーで修飾された常磁性粒子から構成する認識素子を用いることで、磁場による非常に簡便な細胞分離が可能である。また、ＲＮＡアプタマーを表面抗原と結合させて、細胞回収後にリボヌクレアーゼでアプタマーを分解除去すれば、細胞標識前の***（？？？）できる程度の自然な状態に戻すことができる。この技術は、上述したように、細胞の分離、回収に革命的な効果をもたらす。 By using a recognition element composed of paramagnetic particles modified with an RNA aptamer in this way, very simple cell separation by a magnetic field is possible. In addition, if an RNA aptamer is bound to a surface antigen and the aptamer is decomposed and removed by ribonuclease after cell recovery, it can be returned to a natural state that can be divided (??) before cell labeling. As described above, this technology has a revolutionary effect on cell separation and recovery.

（実施例２）
図２（Ａ），（Ｂ）は、実施例１と同様に、細胞表面抗原ＣＤ４を認識するＲＮＡアプタマーで修飾された３μｍ常磁性粒子からなる認識素子を用いて、細胞表面抗原ＣＤ４提示細胞を磁場を利用し分離、回収する装置例とその方法を示す図である。 (Example 2)
2 (A) and 2 (B) show, as in Example 1, cell surface antigen CD4 presenting cells using a recognition element consisting of 3 μm paramagnetic particles modified with an RNA aptamer that recognizes cell surface antigen CD4. It is a figure which shows the example of an apparatus and its method which isolate | separate and collect | recover using a magnetic field.

図２（Ａ）は検査装置の概念図を示す。サンプルチューブ２０２、分注機構２０１および磁場発生機構２０３が最小構成単位である。この他に、認識素子溶液２０４（細胞表面抗原ＣＤ４を認識するＲＮＡアプタマーで修飾された３μｍ常磁性粒子２０８が混入されている）を保持しているチューブ、ヌクレアーゼ溶液を保持しているチューブ２０５を用意する。分注機構２０１はｘ方向、ｙ方向（紙面に垂直方向）およびｚ方向に移動が制御されるとともに、自動分注が可能である。また、磁場発生機構２０３は可動式で、サンプルチューブ２０２中の磁場の強度をコントロールできる。ここで、磁場を発生させる磁石としては、希土類の磁石を用いる。また磁場発生機構の位置はサンプルチューブに対して側面の位置でも構わない。 FIG. 2A shows a conceptual diagram of the inspection apparatus. The sample tube 202, the dispensing mechanism 201, and the magnetic field generating mechanism 203 are the minimum constituent units. In addition, a tube holding a recognition element solution 204 (mixed with 3 μm paramagnetic particles 208 modified with an RNA aptamer that recognizes the cell surface antigen CD4), a tube 205 holding a nuclease solution prepare. The movement of the dispensing mechanism 201 is controlled in the x direction, the y direction (perpendicular to the paper surface), and the z direction, and automatic dispensing is possible. The magnetic field generation mechanism 203 is movable and can control the strength of the magnetic field in the sample tube 202. Here, a rare earth magnet is used as a magnet for generating a magnetic field. Further, the position of the magnetic field generation mechanism may be the position of the side surface with respect to the sample tube.

図２（Ｂ）は、この装置を用いて細胞表面抗原ＣＤ４提示細胞を分離、回収する方法を示す。試料細胞群をサンプルチューブ２０２に入れる。試料細胞群には、細胞表面抗原ＣＤ４提示細胞２０６とそれ以外の表面抗原を持つ細胞２０７とが混在している。分注機構２０１を用いて、認識素子溶液２０４を分注し、撹拌する。分注機構にて撹拌しながら十分な時間反応させた後、磁場発生機構２０３でサンプルチューブ２０２中に磁場を発生させる。認識素子２０８と結合した細胞は、磁場によってサンプルチューブ壁面に固定される。 FIG. 2B shows a method for separating and recovering cell surface antigen CD4-presenting cells using this apparatus. A sample cell group is put into the sample tube 202. In the sample cell group, cell surface antigen CD4 presenting cells 206 and cells 207 having other surface antigens are mixed. Using the dispensing mechanism 201, the recognition element solution 204 is dispensed and stirred. After reacting for a sufficient time while stirring by the dispensing mechanism, the magnetic field generating mechanism 203 generates a magnetic field in the sample tube 202. The cells coupled to the recognition element 208 are fixed to the sample tube wall surface by a magnetic field.

磁場をかけた状態で、分注機構２０１にて上清を回収し、さらに、緩衝液もしくは培養液にてサンプルチューブ２０２を２回洗浄する。続いて、ヌクレアーゼ溶液２０５を分注機構２０１でサンプルチューブ２０２に添加する。ヌクレアーゼを添加することで認識素子２０８のアプタマーが分解される（ここでは、参照符号２１０(スキャナで読めない可能性があるので、黒い線にしてください)で示す）。その結果、アプタマーと結合し、アプタマーで修飾された常磁性粒子とともに、サンプルチューブ２０２の壁面にトラップされていた細胞２０６が解離する。細胞２０６が解離した溶液を回収することで、細胞表面抗原ＣＤ４提示細胞が分離される。 In a state where a magnetic field is applied, the supernatant is collected by the dispensing mechanism 201, and the sample tube 202 is washed twice with a buffer solution or a culture solution. Subsequently, the nuclease solution 205 is added to the sample tube 202 by the dispensing mechanism 201. By adding nuclease, the aptamer of the recognition element 208 is decomposed (in this case, indicated by reference numeral 210 (because it may not be readable by a scanner, make it a black line)). As a result, the cells 206 bound to the aptamer and trapped on the wall surface of the sample tube 202 are dissociated together with the paramagnetic particles modified with the aptamer. By collecting the solution from which the cells 206 are dissociated, the cell surface antigen CD4-presenting cells are separated.

（実施例３）
本発明を応用することにより、検査キットを実現することができる。ここでは、細胞表面抗原ＣＤ４４に結合するＲＮＡアプタマーを認識物質とし、認識素子担体に常磁性粒子（粒径１μｍ）を用いるケースについて説明する。糞便中に含まれる剥奪した癌由来細胞でＣＤ４４を細胞表面抗原として表現している細胞の分離検出およびその検査を目的とする検査キットについて説明する。 (Example 3)
By applying the present invention, a test kit can be realized. Here, a case will be described in which an RNA aptamer that binds to the cell surface antigen CD44 is used as a recognition substance, and paramagnetic particles (particle size: 1 μm) are used as a recognition element carrier. A test kit for the purpose of separating and detecting cells in which CD44 is expressed as a cell surface antigen in the deprived cancer-derived cells contained in the stool and the test thereof will be described.

被検体である糞便０．１ｇを１ｍＬの１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．５）、０．１５ＭＮａＣｌ、１％ＢＳＡ緩衝液に懸濁したものをサンプルとして用いる。ＲＮＡアプタマー修飾常磁性粒子（認識素子）をサンプル溶液に添加し、３０分間緩やかに攪拌する。懸濁液を内径２ｍｍのチューブに通し、チューブに１ｃｍおきで配したネオジウム系磁石のアレーでチューブ内を移動する磁性粒子をトラップする。回収した常磁性粒子を培養液で洗浄し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを添加する。 A sample obtained by suspending 0.1 g of stool, which is a subject, in 1 mL of 10 mM PBS (pH 7.5), 0.15 M NaCl, and 1% BSA buffer is used. RNA aptamer-modified paramagnetic particles (recognition elements) are added to the sample solution and gently stirred for 30 minutes. The suspension is passed through a tube having an inner diameter of 2 mm, and magnetic particles moving in the tube are trapped by an array of neodymium magnets arranged at intervals of 1 cm in the tube. The collected paramagnetic particles are washed with a culture solution, and Benzonase (registered trademark) nuclease is added.

３０分間緩やかに撹拌した懸濁液とヌクレアーゼの混合溶液を、ネオジウム系磁石のアレーを通し、通過した溶液を回収、遠心にて細胞表面抗原ＣＤ４４提示細胞を得る。分離した生細胞を細胞培養用マイクロチャンバー、例えば、本願の発明者らが提案する特願２００４−３０５２５８号明細書に記載される細胞培養用マイクロチャンバー、で培養する。がん細胞であれば長期培養に耐えることができ、程なく***を開始する細胞も現れる。 The mixed solution of the suspension and nuclease gently stirred for 30 minutes is passed through an array of neodymium magnets, and the passed solution is collected and centrifuged to obtain cell surface antigen CD44-presenting cells. The separated living cells are cultured in a cell culture microchamber, for example, a cell culture microchamber described in Japanese Patent Application No. 2004-305258 proposed by the inventors of the present application. Cancer cells can withstand long-term culture, and some cells will begin to divide soon.

このように糞便中の細胞からがん由来細胞を分離し、一定期間培養することができればがんの部位を特定することはできないが、体のどこかに病巣があることを知ることができる。また、抗がん剤の効能検査等も同時に行うことも可能である。 Thus, if cancer-derived cells can be separated from cells in feces and cultured for a certain period of time, the site of cancer cannot be specified, but it can be known that there is a lesion somewhere in the body. It is also possible to test the efficacy of anticancer agents at the same time.

本発明に係る分離システムおよびその流れを説明する図である。It is a figure explaining the separation system concerning the present invention, and its flow. （Ａ），（Ｂ）は、細胞表面抗原ＣＤ４を認識するＲＮＡアプタマーで修飾された常磁性粒子からなる認識素子を用いて、細胞表面抗原ＣＤ４提示細胞を磁場を利用し分離、回収する装置例とその方法を示す図である。(A), (B) is an example of an apparatus for separating and recovering cell surface antigen CD4-presenting cells using a magnetic field using a recognition element composed of paramagnetic particles modified with an RNA aptamer that recognizes cell surface antigen CD4. FIG.

符号の説明Explanation of symbols

１０１…第一混合槽、１０２…バルブ、１０４…第一磁場分離槽、１０５…磁石、１０６…第二混合槽、１０８…光源、１０９…フォトンカウンター、１１１…標的細胞、１１２…ＣＤ４以外の表面抗原を持つ細胞、１１３…細胞表面抗原ＣＤ４、１１４…ＣＤ４以外の表面抗原、１１５…常磁性粒子、１１６…細胞表面抗原ＣＤ４認識ＲＮＡアプタマー、１１７…認識素子サンプルである試料細胞群、２０１…分注機構、２０２…サンプルチューブ、２０３…磁場発生機構、２０４…認識素子溶液、２０５…チューブ、２０８…常磁性粒子、２０６…細胞表面抗原ＣＤ４提示細胞、２０７…細胞表面抗原ＣＤ４以外の表面抗原を持つ細胞、２０８…認識素子、２１０…分解されたアプタマー。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 101 ... 1st mixing tank, 102 ... Valve | bulb, 104 ... 1st magnetic field separation tank, 105 ... Magnet, 106 ... 2nd mixing tank, 108 ... Light source, 109 ... Photon counter, 111 ... Target cell, 112 ... Surface other than CD4 Cells with antigen, 113 ... Cell surface antigen CD4, 114 ... Surface antigen other than CD4, 115 ... Paramagnetic particles, 116 ... Cell surface antigen CD4 recognition RNA aptamer, 117 ... Sample cell group as recognition element sample, 201 ... minute Injection mechanism, 202 ... sample tube, 203 ... magnetic field generation mechanism, 204 ... recognition element solution, 205 ... tube, 208 ... paramagnetic particle, 206 ... cell surface antigen CD4 presenting cell, 207 ... surface antigen other than cell surface antigen CD4 Cells with 208 ... recognition elements, 210 ... resolved aptamers.

Claims

特定細胞の表面に存在する特定の抗原に特異的に結合するポリヌクレオチドを認識物質とし、該認識物質が常磁性の機能を持つ担体に結合した構造を持つ認識素子を準備し、試料細胞群と前記認識素子を混合した溶液中で前記試料細胞群中の前記特定細胞の特定抗原に前記ポリヌクレオチドを結合させるとともに、前記特定抗原を有する特定細胞と前記認識素子の複合体に磁力を適用して、前記複合体を前記溶液から単離し、前記複合体にヌクレアーゼを作用させて前記特定細胞の特定抗原に結合している前記ポリヌクレオチドを分解し、さらに磁力にて前記常磁性の機能を持つ担体を除去して前記特定細胞を得る細胞分離方法。 A recognition element having a structure in which a polynucleotide that specifically binds to a specific antigen existing on the surface of a specific cell is used as a recognition substance, and the recognition substance is bound to a carrier having a paramagnetic function, In the solution in which the recognition element is mixed, the polynucleotide is bound to a specific antigen of the specific cell in the sample cell group, and magnetic force is applied to a complex of the specific cell having the specific antigen and the recognition element. A carrier having the paramagnetic function by magnetic force, isolating the complex from the solution, decomposing the polynucleotide bound to the specific antigen of the specific cell by allowing a nuclease to act on the complex A cell separation method for obtaining the specific cells by removing the cells.

がん由来細胞に発現する表面抗原に特異的に結合するポリヌクレオチドで、前記ポリヌクレオチドが共有結合で常磁性機能を持つ微粒子担体と結合している構造の認識素子を、試料細胞群中の前記がん由来細胞で発現する表面抗原と前記ポリヌクレオチドを結合させて、前記がん由来細胞と前期認識素子の複合体を磁場を用いて単離し、前記複合体にヌクレアーゼを作用させて前記がん由来細胞で発現する表面抗原に結合している前記ポリヌクレオチドを分解し、さらに磁場によって前記常磁性機能を持つ微粒子担体を回収することで前記がん由来細胞を得てがんの存在を判定する細胞検査方法。 A polynucleotide that specifically binds to a surface antigen expressed in a cancer-derived cell, wherein the polynucleotide is bound to a microparticle carrier having a covalent bond and a paramagnetic function. A surface antigen expressed in a cancer-derived cell is bound to the polynucleotide, and a complex of the cancer-derived cell and the early recognition element is isolated using a magnetic field, and a nuclease is allowed to act on the complex to cause the cancer. Decomposing the polynucleotide bound to the surface antigen expressed in the cell derived from the cell, and further collecting the particulate carrier having the paramagnetic function by a magnetic field to obtain the cancer-derived cell to determine the presence of cancer Cell inspection method.

標的とする特定細胞に発現する表面抗原に特異的に結合するポリヌクレオチドが結合している常磁性機能を持つ物質よりなる認識素子、該認識素子と細胞群試料とを混合して前記特定細胞と前記ポリヌクレオチドの複合体を生成する混合手段、該混合手段に磁場を作用させる磁場装置、該磁場装置の発生する磁場に捕捉された認識素子に前記複合体の前記ポリヌクレオチドを分解するためのヌクレアーゼを添加する手段、前記ポリヌクレオチドの分解により分離された前記特定細胞を回収する手段、とよりなることを特徴とする細胞分離装置。 A recognition element made of a substance having a paramagnetic function, to which a polynucleotide that specifically binds to a surface antigen expressed in a target specific cell is bound, and the recognition element and a cell group sample are mixed to form the specific cell Mixing means for generating a complex of the polynucleotide, a magnetic field device for applying a magnetic field to the mixing means, and a nuclease for decomposing the polynucleotide of the complex into a recognition element captured by the magnetic field generated by the magnetic field device And means for collecting the specific cells separated by the degradation of the polynucleotide.

標的とする特定細胞に発現する表面抗原に特異的に結合する前記ポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドが常磁性機能を持つ物質に結合している認識素子と、該認識素子と被検体を混合したサンプル懸濁液を通すネオジウム系磁石のアレーを設けたチューブと、
前記認識素子と前記特定細胞の複合体を解離させるためのヌクレアーゼが試薬としてセットされた試薬および検査キット。 The polynucleotide that specifically binds to a surface antigen expressed in a specific target cell, a recognition element in which the polynucleotide is bound to a substance having a paramagnetic function, and a sample obtained by mixing the recognition element and an analyte A tube provided with an array of neodymium magnets for passing the suspension;
A reagent and a test kit in which a nuclease for dissociating the complex of the recognition element and the specific cell is set as a reagent.