JP2007135441A - New protein and gene encoding the same - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new protein relating to ontogeny. <P>SOLUTION: The invention relates to the proteins represented by following (a), (b), (c) or (d). Wherein (a) is a protein having a specific amino acid sequence originating from human lung, (b) is a protein comprising an amino acid sequence having one or a plurality of amino acids deleted, substituted or added to the specific amino acid sequence originating from human lung and indispensable in ontogeny, (c) a protein comprising an amino acid sequence having one or a plurality of amino acids deleted, substituted or added to the specific amino acid sequence originating from human lung and exhibiting affinity interaction with the protein disclosed in the (a), and (d) a protein comprising an amino acid sequence having one or a plurality of amino acids deleted, substituted or added to the specific amino acid sequence originating from human lung and exhibiting affinity interaction with the Bax inhibitor-1. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、新規タンパク質及びそれをコードする遺伝子に関する。   The present invention relates to a novel protein and a gene encoding the same.

本発明者が本発明を完成した後、本発明のタンパク質と公知のタンパク質との比較を行ったところ、本発明のタンパク質のＣ末端３２６アミノ酸部分は、仮想タンパク質として、ＮＣＢＩのデータベースに公開されていることが判明した（PID g16553765）。また、本発明のタンパク質に含まれるモチーフであるＳＡＭドメインに関しては、非特許文献１〜３に総説されている。
Ponting, C.P., SAM: A novel motif in yeast sterile and Drosophila polyhomeotic proteins, Protein Sci., , 1995, 4, 1928-1930 Schultz, J., SAM as a protein interaction domain involved in developmental regulation, Protein Sci., 1997, 6, 249-253 Kim, C.A. and Bowie, J.U., SAM domains: Uniform structure, diversity of function, Trends Biochem. Sci., 2003, 28, 625-628 After the present inventor completed the present invention, the protein of the present invention was compared with a known protein. The C-terminal 326 amino acid portion of the protein of the present invention was published as a virtual protein in the NCBI database. (PID g16553765). Non-patent documents 1 to 3 review SAM domains that are motifs contained in the protein of the present invention.
Ponting, CP, SAM: A novel motif in yeast sterile and Drosophila polyhomeotic proteins, Protein Sci.,, 1995, 4, 1928-1930 Schultz, J., SAM as a protein interaction domain involved in developmental regulation, Protein Sci., 1997, 6, 249-253 Kim, CA and Bowie, JU, SAM domains: Uniform structure, diversity of function, Trends Biochem.Sci., 2003, 28, 625-628

本発明は、第一に、個体発生に関連する新規タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び上記タンパク質に対する抗体又はその断片を提供することを目的とする。また、本発明は、第二に、個体発生に影響を与える物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。   The present invention firstly provides a novel protein related to ontogeny, a gene encoding the protein, a recombinant vector containing the gene, a transformant containing the recombinant vector, and an antibody against the protein or a fragment thereof. The purpose is to provide. Another object of the present invention is to provide a screening method for substances that affect ontogeny.

上記目的を達成するために、本発明は、以下のタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、抗体又はその断片、及びスクリーニング方法を提供する。
（１）下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、個体発生に必須のタンパク質
（２）下記（ａ）又は（ｃ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記（ａ）に示すタンパク質と親和性相互作用を示すタンパク質
（３）下記（ａ）又は（ｄ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示すタンパク質
（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（５）下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡを含む前記（４）記載の遺伝子。
（ｅ）配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号３記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）前記（ｅ）に示すＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（６）前記（４）又は（５）記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（７）前記（６）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（８）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片。
（９）試験物質が、前記（２）記載のタンパク質同士の親和性相互作用を抑制又は促進できる否かを判別し、前記親和性相互作用を抑制又は促進できる試験物質を個体発生に影響を与える物質としてスクリーニングする工程を含む、個体発生に影響を与える物質のスクリーニング方法。
（１０）試験物質が、前記（３）記載のタンパク質とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制又は促進できる否かを判別し、前記親和性相互作用を抑制又は促進できる試験物質を個体発生に影響を与える物質としてスクリーニングする工程を含む、個体発生に影響を与える物質のスクリーニング方法。 In order to achieve the above object, the present invention provides the following proteins, genes, recombinant vectors, transformants, antibodies or fragments thereof, and screening methods.
(1) Protein shown in the following (a) or (b).
(A) a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 (b) an amino acid sequence comprising one or more amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, and ontogeny (2) A protein shown in (a) or (c) below.
(A) a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 (c) consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, a protein having an affinity interaction with the protein shown in a) (3) a protein shown in (a) or (d) below.
(A) a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 (d) an amino acid sequence comprising one or more amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, and a Bax inhibitor -1, a protein that exhibits an affinity interaction with (-1) A gene encoding the protein according to any one of (1) to (3).
(5) The gene according to (4) above, which comprises the DNA shown in (e) or (f) below.
(E) DNA consisting of the 19th to 1452th base sequence in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or DNA consisting of the 46th to 1479th base sequence in the base sequence described in SEQ ID NO: 3
(F) DNA that hybridizes under stringent conditions to DNA complementary to the DNA shown in (e) above
(6) A recombinant vector comprising the gene according to (4) or (5).
(7) A transformant comprising the recombinant vector according to (6).
(8) An antibody or fragment thereof capable of reacting with the protein according to any one of (1) to (3).
(9) Determine whether or not the test substance can suppress or promote the affinity interaction between the proteins described in (2) above, and affect the ontogeny of the test substance that can suppress or promote the affinity interaction A method for screening a substance that affects ontogeny, comprising a step of screening as a substance.
(10) It is determined whether the test substance can suppress or promote the affinity interaction between the protein according to (3) and Bax inhibitor-1, and the test substance capable of suppressing or promoting the affinity interaction is an individual. A screening method for a substance that affects ontogeny, comprising a step of screening as a substance that affects development.

本発明によれば、個体発生に関連する新規タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び上記タンパク質に対する抗体又はその断片が提供される。また、本発明によれば、個体発生に影響を与える物質のスクリーニング方法が提供される。   According to the present invention, there are provided a novel protein related to ontogeny, a gene encoding the protein, a recombinant vector containing the gene, a transformant containing the recombinant vector, and an antibody against the protein or a fragment thereof. The The present invention also provides a method for screening for substances that affect ontogeny.

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のタンパク質は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質である。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（以下「タンパク質（ａ）」という場合がある。）
（ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、個体発生に必須のタンパク質（以下「タンパク質（ｂ）」という場合がある。）
（ｃ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記（ａ）に示すタンパク質と親和性相互作用を示すタンパク質（以下「タンパク質（ｃ）」という場合がある。）
（ｄ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示すタンパク質（以下「タンパク質（ｄ）」という場合がある。） The present invention will be described in detail below.
The protein of the present invention is a protein shown in the following (a), (b), (c) or (d).
(A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 (hereinafter sometimes referred to as “protein (a)”)
(B) It consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, and is essential for ontogeny (hereinafter referred to as “protein (b)”) is there.)
(C) a protein comprising an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, and exhibiting an affinity interaction with the protein shown in (a) above (It may be referred to as “protein (c)”.)
(D) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, and having affinity interaction with Bax inhibitor-1 (hereinafter referred to as “protein ( d) ".

タンパク質（ａ）のうち、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ヒト由来のタンパク質であり、配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、マウス由来のタンパク質である。   Among proteins (a), the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is a human-derived protein, and the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is a mouse-derived protein.

タンパク質（ａ）は、個体発生に必須のタンパク質である。タンパク質（ａ）は、特に胎生期における個体発生に必須であり、ヒトのゲノム中において、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がホモ欠損型になると、受精卵は正常な発生過程を経ることができず、ヒト胎児は致死に至る。また、マウスのゲノム中において、配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がホモ欠損型になると、受精卵は正常な発生過程を経ることができず、マウス胎児は致死に至る。なお、ヘテロ欠損型であれば、ヒト胎児及びマウス胎児は致死に至らない。   Protein (a) is a protein essential for ontogeny. The protein (a) is essential for ontogeny particularly in the embryonic period, and when the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 becomes homo-deficient in the human genome, the fertilized egg develops normally. Unable to go through the process, the human fetus is fatal. If the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 becomes homo-deficient in the mouse genome, the fertilized egg cannot go through a normal development process, and the mouse embryo is lethal. In addition, if it is a hetero deficiency type, a human fetus and a mouse fetus will not be lethal.

タンパク質（ａ）は、別のタンパク質（ａ）と親和性相互作用を示す。タンパク質（ａ）同士の親和性相互作用は、個体発生、特に胎生期における個体発生に関与しているものと考えられる。なお、「タンパク質（ａ）同士の親和性相互作用」は、タンパク質（ａ）同士の直接的な結合、及び他の物質を介したタンパク質（ａ）同士の間接的な結合のいずれをも意味するが、好ましくはタンパク質（ａ）同士の直接的な結合を意味する。   Protein (a) exhibits an affinity interaction with another protein (a). The affinity interaction between the proteins (a) is considered to be involved in ontogeny, particularly ontogeny in the embryonic period. “Affinity interaction between proteins (a)” means both direct binding between proteins (a) and indirect binding between proteins (a) via other substances. However, it preferably means a direct bond between the proteins (a).

タンパク質（ａ）は、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示す。タンパク質（ａ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用は、個体発生、特に胎生期における個体発生に関与しているものと考えられる。なお、「タンパク質（ａ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用」は、タンパク質（ａ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との直接的な結合、及び他の物質を介したタンパク質（ａ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との間接的な結合のいずれをも意味するが、好ましくはタンパク質（ａ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との直接的な結合を意味する。   Protein (a) shows an affinity interaction with Bax inhibitor-1. The affinity interaction between protein (a) and Bax inhibitor-1 is considered to be involved in ontogeny, particularly ontogeny in the embryonic period. “Affinity interaction between protein (a) and Bax inhibitor-1” refers to direct binding between protein (a) and Bax inhibitor-1, and protein (a) and Bax via other substances. It means any indirect binding to inhibitor-1 but preferably means direct binding between protein (a) and Bax inhibitor-1.

Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１は、アポトーシスを誘導する因子であるＢａｘの作用を阻害し、細胞死を抑制する。Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と相互作用するタンパク質としては、例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ等が知られている。ヒト由来のＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１のアミノ酸配列を配列番号６に示し、それをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号５に示す。   Bax inhibitor-1 inhibits the action of Bax, which is a factor inducing apoptosis, and suppresses cell death. Examples of proteins that interact with Bax inhibitor-1 include Bcl-2 and Bcl-XL. The amino acid sequence of human-derived Bax inhibitor-1 is shown in SEQ ID NO: 6, and the base sequence of the DNA encoding it is shown in SEQ ID NO: 5.

配列番号２又は４記載のアミノ酸配列のうち、第７３アミノ酸から第１４０アミノ酸部分は、ＳＡＭ（Sterile Alpha Motif）ドメインと称されるシグナル伝達因子に特徴的なペプチドモチーフを含む。第５２アミノ酸のＳｅｒ残基は、ＭＡＰキナーゼ基質に特徴的なモチーフに含まれ、第２４７から第２５０アミノ酸までの部位（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ）は、ＳＨ３結合領域モチーフである。   Of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, the 73rd to 140th amino acid portion contains a peptide motif characteristic of a signal transduction factor called SAM (Sterile Alpha Motif) domain. The Ser residue of the 52nd amino acid is included in the motif characteristic of the MAP kinase substrate, and the region from the 247th to the 250th amino acid (Pro-Pro-Leu-Pro) is the SH3 binding region motif.

ＳＡＭドメインは、約７０アミノ酸のペプチドドメイン構造であり、酵母からヒトに至る真核生物の遺伝子産物中に見出されており、タンパク質−タンパク質間の相互作用を仲介していると考えられている。また、一部のＳＡＭドメインでは、ＲＮＡ結合能、脂質結合能等も報告されている。ＭＡＰキナーゼは、真核生物に普遍的に存在するセリンスレオニンキナーゼであり、細胞増殖、分化、アポトーシス、形態形成等に重要な役割を果たしている。ＭＡＰキナーゼ基質は、ＭＡＰキナーゼによりリン酸化されて活性化又は不活性化するタンパク質であり、Ｅｌｋ−１、ｃ−Ｍｙｃ等の転写因子、ＲＳＫ、ＭＡＰＫＡＰＫ−２等のキナーゼ等が知られている。ＳＨ３（Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３）結合領域ドメインは、発がんチロシンキナーゼ遺伝子産物Ｓｒｃ中に存在する機能ドメインであるＳＨ３ドメインと結合するドメインで、共通アミノ酸配列として、Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｐｒｏ（Ｘａａ２は通常、疎水的アミノ酸）を有する。Ｓｒｃ遺伝子産物は、胎生期発生、細胞増殖に重要な役割を果たしていると考えられている。   The SAM domain is a peptide domain structure of about 70 amino acids, is found in eukaryotic gene products from yeast to human, and is thought to mediate protein-protein interactions. . Some SAM domains have also been reported to have RNA binding ability, lipid binding ability, and the like. MAP kinase is a serine threonine kinase that exists universally in eukaryotes and plays an important role in cell proliferation, differentiation, apoptosis, morphogenesis, and the like. The MAP kinase substrate is a protein that is activated or inactivated by phosphorylation by MAP kinase, and transcription factors such as Elk-1 and c-Myc, kinases such as RSK and MAPKAPK-2, and the like are known. The SH3 (Src homology 3) binding region domain is a domain that binds to the SH3 domain, which is a functional domain present in the carcinogenic tyrosine kinase gene product Src. As a common amino acid sequence, Pro-Xaa1-Xaa2-Pro (Xaa2 is usually Hydrophobic amino acids). The Src gene product is thought to play an important role in embryonic development and cell proliferation.

タンパク質（ｂ）において、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列に対して欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数及び位置は、個体発生に必須であるというタンパク質（ａ）の機能が保持される限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個である。欠失に関する具体的な範囲は通常１〜４０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個であり、置換に関する具体的な範囲は通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個であり、付加に関する具体的な範囲は通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。タンパク質（ｂ）のアミノ酸配列は、タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と通常７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する。   In protein (b), the number and position of amino acids deleted, substituted or added to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 retains the function of protein (a), which is essential for ontogeny. The number is not particularly limited, and the number is one or more, preferably one or several. The specific range for deletion is usually 1-40, preferably 1-20, more preferably 1-10, and the specific range for substitution is usually 1-20, preferably 1-10. More preferably, the number is 1 to 5, and the specific range for addition is usually 1 to 10, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 2. The amino acid sequence of protein (b) has a homology of usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more with the amino acid sequence of protein (a).

タンパク質（ｂ）には、タンパク質（ａ）に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質の他、欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質や、それに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質も含まれる。欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質としては、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）由来のタンパク質（これらの哺乳動物において多型によって生じ得るタンパク質を含む。）が挙げられる。   In protein (b), in addition to proteins in which mutations such as deletions, substitutions and additions are artificially introduced into protein (a), mutations such as deletions, substitutions and additions are naturally introduced. It also includes existing proteins and proteins that have been artificially introduced with mutations such as deletion, substitution, and addition. Examples of proteins that exist in nature with mutations such as deletions, substitutions, and additions include, for example, mammals (eg, humans, monkeys, cows, sheep, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, Examples include proteins derived from mice, rats, etc. (including proteins that can be generated by polymorphism in these mammals).

タンパク質（ｃ）において、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列に対して欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数及び位置は、他のタンパク質（ａ）と親和性相互作用を示すというタンパク質（ａ）の機能が保持される限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個である。欠失に関する具体的な範囲は通常１〜４０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個であり、置換に関する具体的な範囲は通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個であり、付加に関する具体的な範囲は通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列は、タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と通常７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する。   In the protein (c), the number and position of amino acids deleted, substituted or added to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 indicates that the protein (a ) Is not particularly limited as long as the function is maintained, and the number thereof is one or more, preferably one or several. The specific range for deletion is usually 1-40, preferably 1-20, more preferably 1-10, and the specific range for substitution is usually 1-20, preferably 1-10. More preferably, the number is 1 to 5, and the specific range for addition is usually 1 to 10, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 2. The amino acid sequence of protein (c) has a homology of usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more with the amino acid sequence of protein (a).

配列番号２又は４記載のアミノ酸配列のうち、１〜６２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分、又は１５９〜４７８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されても、他のタンパク質（ａ）と親和性相互作用を示すというタンパク質（ａ）の機能が保持される。なお、１〜６２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分は、ＳＡＭドメインよりもＮ末側に存在し、ＭＡＰキナーゼ基質モチーフを含み、ヒトとマウス間で比較的相違の大きい部分であり、１５９〜４７８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分は、ＳＡＭドメインよりもＣ末側に存在し、ＳＨ３結合領域ドメインを含み、ヒトとマウス間で比較的相同性の高い部分である。   Among the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 2 or 4, in the amino acid sequence portion consisting of amino acids 1 to 62, or in the amino acid sequence portion consisting of amino acids 159 to 478, one or more amino acids are deleted, substituted or Even if it is added, the function of the protein (a) indicating affinity interaction with other proteins (a) is retained. The amino acid sequence portion consisting of amino acids 1 to 62 is located on the N-terminal side of the SAM domain, includes a MAP kinase substrate motif, and is a portion having a relatively large difference between humans and mice. The amino acid sequence portion consisting of the second amino acid is located on the C-terminal side of the SAM domain, includes the SH3 binding region domain, and is a portion having relatively high homology between human and mouse.

タンパク質（ｃ）には、タンパク質（ａ）に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質の他、欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質や、それに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質も含まれる。欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質としては、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）由来のタンパク質（これらの哺乳動物において多型によって生じ得るタンパク質を含む。）が挙げられる。   In protein (c), in addition to proteins in which mutations such as deletions, substitutions and additions have been artificially introduced into protein (a), mutations such as deletions, substitutions and additions are naturally introduced. It also includes existing proteins and proteins that have been artificially introduced with mutations such as deletion, substitution, and addition. Examples of proteins that exist in nature with mutations such as deletions, substitutions, and additions include, for example, mammals (eg, humans, monkeys, cows, sheep, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, Examples include proteins derived from mice, rats, etc. (including proteins that can be generated by polymorphism in these mammals).

タンパク質（ｄ）において、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列に対して欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数及び位置は、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示すというタンパク質（ａ）の機能が保持される限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個である。欠失に関する具体的な範囲は通常１〜４０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個であり、置換に関する具体的な範囲は通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個であり、付加に関する具体的な範囲は通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。タンパク質（ｄ）のアミノ酸配列は、タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と通常７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する。   In the protein (d), the number and position of amino acids to be deleted, substituted or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 are the same as those of the protein (a) indicating an affinity interaction with Bax inhibitor-1. The number is not particularly limited as long as the function is maintained, and the number thereof is one or more, preferably one or several. The specific range for deletion is usually 1-40, preferably 1-20, more preferably 1-10, and the specific range for substitution is usually 1-20, preferably 1-10. More preferably, the number is 1 to 5, and the specific range for addition is usually 1 to 10, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 2. The amino acid sequence of the protein (d) has a homology of usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more with the amino acid sequence of the protein (a).

配列番号２又は４記載のアミノ酸配列のうち、１〜２３２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分、又は２６４〜４７８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されても、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示すというタンパク質（ａ）の機能が保持される。１〜２３２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分は、ＳＡＭドメイン及びＭＡＰキナーゼ基質モチーフを含み、比較的親水性アミノ酸の多く含まれる部分であり、２６４〜４７８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分は、ＳＨ３結合領域ドメインを含み、疎水性アミノ酸の比較的多く含まれる部分である。   Among the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 2 or 4, in the amino acid sequence portion consisting of amino acids 1 to 232, or in the amino acid sequence portion consisting of amino acids 264 to 478, one or more amino acids are deleted, substituted or Even if added, the function of the protein (a) that shows an affinity interaction with Bax inhibitor-1 is retained. The amino acid sequence portion consisting of amino acids 1 to 232 includes a SAM domain and a MAP kinase substrate motif and is a portion containing a relatively large amount of hydrophilic amino acids. The amino acid sequence portion consisting of amino acids 264 to 478 is SH3. It is a part containing a binding domain and containing a relatively large amount of hydrophobic amino acids.

タンパク質（ｄ）には、タンパク質（ａ）に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質の他、欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質や、それに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質も含まれる。欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質としては、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）由来のタンパク質（これらの哺乳動物において多型によって生じ得るタンパク質を含む。）が挙げられる。   In protein (d), in addition to proteins in which mutations such as deletions, substitutions and additions have been artificially introduced into protein (a), naturally occurring mutations such as deletions, substitutions and additions are naturally introduced. It also includes existing proteins and proteins that have been artificially introduced with mutations such as deletion, substitution, and addition. Examples of proteins that exist in nature with mutations such as deletions, substitutions, and additions include, for example, mammals (eg, humans, monkeys, cows, sheep, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, Examples include proteins derived from mice, rats, etc. (including proteins that can be generated by polymorphism in these mammals).

タンパク質（ｄ）が親和性相互作用を示すＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１の由来動物は特に限定されるものではないが、タンパク質（ｄ）が天然に存在するタンパク質である場合、タンパク質（ｄ）の由来動物とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１の由来動物とが同種であると、タンパク質（ｄ）はＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と高い親和性相互作用を示すと考えられる。   The animal derived from Bax inhibitor-1 in which protein (d) exhibits an affinity interaction is not particularly limited, but when protein (d) is a naturally occurring protein, the animal derived from protein (d) If the animal derived from Bax inhibitor-1 is the same species, protein (d) is considered to exhibit a high affinity interaction with Bax inhibitor-1.

タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）には、糖鎖が付加されたタンパク質及び糖鎖が付加されていないタンパク質のいずれもが含まれる。タンパク質に付加される糖鎖の種類、位置等は、タンパク質の製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、糖鎖が付加されたタンパク質には、いずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含まれる。また、タンパク質（ａ）、（ｂ）又は（ｄ）には、その医薬的に許容される塩も含まれる。   Proteins (a), (b), (c) or (d) include both proteins with added sugar chains and proteins without added sugar chains. The type, position, etc. of the sugar chain added to the protein vary depending on the type of host cell used in the production of the protein, but any host cell can be used for the protein with the added sugar chain. Protein is also included. Protein (a), (b) or (d) also includes pharmaceutically acceptable salts thereof.

タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、例えば、哺乳動物の脳、腎臓、肺、筋肉、胎盤、小腸、精巣、副腎、唾液腺、脾臓、胃等の組織から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、それぞれ配列番号１又は３記載の塩基配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得られる。以下、ｃＤＮＡライブラリーの作製、及び目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニングの各工程について説明する。   The gene encoding protein (a), (b), (c) or (d) is, for example, mammalian brain, kidney, lung, muscle, placenta, small intestine, testis, adrenal gland, salivary gland, spleen, stomach, etc. By preparing a cDNA library using mRNA extracted from the tissue and screening a clone containing the target DNA from the cDNA library using probes synthesized based on the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 or 3, respectively. can get. Hereinafter, each step of preparing a cDNA library and screening a clone containing the target DNA will be described.

〔ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
ｃＤＮＡライブラリーを作製する際には、例えば、哺乳動物の脳、腎臓、肺、筋肉、胎盤、小腸、精巣、副腎、唾液腺、脾臓、胃等の組織から全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、バッチ法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。この際、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、該組換えベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーが得られる。ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターは、宿主細胞中で自立複製できるものであればよく、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター等を使用できる。宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等を使用できる。 [Preparation of cDNA library]
When preparing a cDNA library, for example, after obtaining total RNA from tissues such as mammalian brain, kidney, lung, muscle, placenta, small intestine, testis, adrenal gland, salivary gland, spleen, stomach, etc., oligo dT- Poly (A +) RNA (mRNA) is obtained by affinity column method, batch method or the like using cellulose, poly U-sepharose or the like. At this time, poly (A +) RNA (mRNA) may be fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like. Next, using the obtained mRNA as a template, single-stranded cDNA is synthesized using oligo dT primer and reverse transcriptase, and then double-stranded cDNA is synthesized from the single-stranded cDNA. The double-stranded cDNA thus obtained is incorporated into an appropriate cloning vector to prepare a recombinant vector, and a host cell such as Escherichia coli is transformed using the recombinant vector to indicate tetracycline resistance and ampicillin resistance. A library of cDNA is obtained by selecting transformants as The cloning vector for preparing the cDNA library may be any cloning vector as long as it can autonomously replicate in the host cell. For example, a phage vector, a plasmid vector, or the like can be used. Examples of host cells that can be used include Escherichia coli.

大腸菌等の宿主細胞の形質転換は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞に、組換えベクターを加える方法等により行うことができる。ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有させておくことが好ましい。   Transformation of host cells such as E. coli can be performed by a method of adding a recombinant vector to competent cells prepared in the presence of calcium chloride, magnesium chloride or rubidium chloride. When using a plasmid as a vector, it is preferable to contain a drug resistance gene such as tetracycline or ampicillin.

ｃＤＮＡライブラリーの作製にあたっては、市販のキット、例えば、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（Gibco BRL社製）、ZAP-cDNA Synthesis Kit（ストラタジーン社製）等を使用できる。   In preparing a cDNA library, commercially available kits such as SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Gibco BRL), ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene), etc. can be used.

〔目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニング〕
ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングする際には、配列番号１又は３記載の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＰＣＲ増幅断片を得る。ＰＣＲ増幅断片は、適当なプラスミドベクターを用いてサブクローニングしてもよい。ＰＣＲに使用するプライマーセットは特に限定されるものではなく、配列番号１又は３記載の塩基配列に基づいて設計できる。 [Screening of clones containing the target DNA]
When screening a clone containing a target DNA from a cDNA library, a primer is synthesized based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, and a polymerase chain reaction (PCR) is performed using the primer, and a PCR amplified fragment Get. The PCR amplified fragment may be subcloned using an appropriate plasmid vector. The primer set used for PCR is not particularly limited, and can be designed based on the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3.

ｃＤＮＡライブラリーに対して、ＰＣＲ増幅断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、目的のＤＮＡが得られる。プローブとしては、ＰＣＲ増幅断片をアイソトープ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ等で標識したものを使用できる。目的のＤＮＡを含むクローンは、抗体を用いたイムノスクリーニング等の発現スクリーニングによっても得ることができる。 By subjecting the cDNA library to colony hybridization or plaque hybridization using a PCR amplified fragment as a probe, the target DNA can be obtained. As the probe, a PCR-amplified fragment labeled with an isotope (eg, 32 P, 35 S), biotin, digoxigenin, alkaline phosphatase, or the like can be used. A clone containing the target DNA can also be obtained by expression screening such as immunoscreening using an antibody.

取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのまま、又は適当な制限酵素等で切断した後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いて決定できる。塩基配列解析の際には、通常、３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（Perkin Elmer社製）等の塩基配列分析装置が用いられる。   The base sequence of the obtained DNA is the DNA fragment as it is or after being cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, and then incorporated into a vector by a conventional method, and a commonly used base sequence analysis method, for example, Maxam-Gilbert chemical modification method Can be determined using the dideoxynucleotide chain termination method. For base sequence analysis, a base sequence analyzer such as a 373A DNA sequencer (manufactured by Perkin Elmer) is usually used.

タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、オープンリーディングフレームとその３'末端に位置する終止コドンとを含む。また、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、オープンリーディングフレームの５'末端及び／又は３'末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。   The gene encoding protein (a), (b), (c) or (d) comprises an open reading frame and a stop codon located at its 3 ′ end. In addition, the gene encoding protein (a), (b), (c) or (d) can contain an untranslated region (UTR) at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the open reading frame.

配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。ここで、配列番号１記載の塩基配列のうち、オープンリーディングフレームは１９〜１４５２番目の塩基配列に位置し、翻訳開始コドンは１９〜２１番目の塩基配列に位置し、終止コドンは１４５３〜１４５５番目の塩基配列に位置する。配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、当該タンパク質をコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列に限定されるものではない。   Examples of the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 include a gene containing DNA consisting of the 19th to 1452th base sequences in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Here, in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, the open reading frame is located at the 19th to 1452th base sequence, the translation initiation codon is located at the 19th to 21st base sequence, and the stop codon is from 1453 to 1455th. It is located in the base sequence. The base sequence of the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is not particularly limited as long as it encodes the protein, and the base sequence of the open reading frame is the base sequence described in SEQ ID NO: 1 It is not limited to the 19th to 1452th base sequence.

配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号３記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。ここで、配列番号４記載の塩基配列のうち、オープンリーディングフレームは４６〜１４７９番目の塩基配列に位置し、翻訳開始コドンは４６〜４８番目の塩基配列に位置し、終止コドンは１４８０〜１４８２番目の塩基配列に位置する。配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、当該タンパク質をコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号４記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列に限定されるものではない。   Examples of the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 include a gene containing DNA consisting of the 46th to 1479th base sequences in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. Here, in the base sequence described in SEQ ID NO: 4, the open reading frame is located at the 46th to 1479th base sequence, the translation initiation codon is located at the 46th to 48th base sequence, and the stop codon is from 1480 to 1482th. It is located in the base sequence. The base sequence of the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is not particularly limited as long as it encodes the protein, and the base sequence of the open reading frame is the base sequence described in SEQ ID NO: 4 It is not limited to the 46-1479th base sequence.

タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、その塩基配列に従って化学合成により得ることもできる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。   A gene encoding the protein (a), (b), (c) or (d) can also be obtained by chemical synthesis according to the base sequence. For the chemical synthesis of DNA, a commercially available DNA synthesizer, for example, a DNA synthesizer using a thiophosphite method (manufactured by Shimadzu Corporation) or a DNA synthesizer using a phosphoramidite method (manufactured by Perkin Elmer) is used. Can be done.

タンパク質（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子、又は配列番号３記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。   Examples of the gene encoding the protein (b), (c) or (d) include stringent conditions for DNA complementary to the DNA comprising the 19th to 1452th base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 1. A gene comprising DNA that hybridizes under stringent conditions, or a DNA that hybridizes under stringent conditions to DNA complementary to the DNA comprising the 46th to 1479th nucleotide sequences of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 Can be mentioned.

「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。   Examples of “stringent conditions” include conditions of 42 ° C., 2 × SSC and 0.1% SDS, preferably 65 ° C., 0.1 × SSC and 0.1% SDS.

配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、配列番号３記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号３記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。   Examples of DNA that hybridizes under stringent conditions to DNA complementary to the DNA consisting of the 19th to 1452th base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 include 19-1452 of the base sequence described in SEQ ID NO: 1. And DNA having the homology of at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more with the DNA comprising the second base sequence, and the 46th to 1479th bases of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 The DNA that hybridizes under stringent conditions to DNA complementary to the DNA comprising the sequence is at least 70% or more, preferably at least 70% or more of the DNA comprising the 46 to 1479th nucleotide sequence of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Examples thereof include DNA having a homology of 80% or more, more preferably 90% or more.

タンパク質（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、タンパク質（ａ）をコードする遺伝子に、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより得ることもできる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Mutant-K（TAKARA社製）、Mutant-G（TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。また、塩基配列が既に決定されている遺伝子については、その塩基配列に従って化学合成することにより得ることができる。   The gene encoding protein (b), (c) or (d) is artificially introduced into the gene encoding protein (a) using a known method such as site-directed mutagenesis. Can also be obtained. Mutation can be introduced, for example, using a mutation introduction kit such as Mutant-K (TAKARA), Mutant-G (TAKARA), or TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis series kit. A gene whose base sequence has already been determined can be obtained by chemical synthesis according to the base sequence.

タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）は、例えば、以下の工程に従って、それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることにより製造できる。
〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列を、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。 The protein (a), (b), (c) or (d) can be produced, for example, by expressing a gene encoding each protein in a host cell according to the following steps.
[Production of recombinant vector and transformant]
When producing a recombinant vector, a DNA fragment of an appropriate length containing the coding region of the target protein is prepared. In addition, a DNA is prepared by substituting the base sequence of the coding region of the target protein so that the codon is optimal for expression in the host cell.

このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより組換えベクターを作製し、該組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより、目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体が得られる。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有できる。   A transformant capable of producing a target protein by producing a recombinant vector by inserting this DNA fragment downstream of a promoter of an appropriate expression vector and introducing the recombinant vector into an appropriate host cell Is obtained. The DNA fragment needs to be incorporated into a vector so that its function is exhibited. The vector is not only a promoter but also a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker (for example, dihydro Folate reductase gene, ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene), ribosome binding sequence (SD sequence) and the like.

発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用できる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50）が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）が挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。   The expression vector is not particularly limited as long as it can replicate autonomously in a host cell, and for example, a plasmid vector, a phage vector, a virus vector, and the like can be used. Examples of plasmid vectors include plasmids derived from E. coli (eg, pRSET, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5), and plasmids derived from yeast (eg, YEp13 YEp24, YCp50), and phage vectors include, for example, λ phage (for example, Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP), and viral vectors include, for example, retrovirus, vaccinia Examples include animal viruses such as viruses and insect viruses such as baculoviruses.

宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。   As the host cell, any of prokaryotic cells, yeast, animal cells, insect cells, plant cells and the like may be used as long as the target gene can be expressed. Moreover, you may use an animal individual, a plant individual, a silkworm body, etc.

細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用できる。具体的には、Escherichia coli BL21、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli K12、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101等の大腸菌や、Bacillus subtilis MI 114、Bacillus subtilis 207-21等の枯草菌を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを使用できる。また、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも使用できる。 When a bacterium is used as a host cell, for example, Escherichia such as Escherichia coli, Bacillus subtilis such as Bacillus subtilis, Pseudomonas putida such as Pseudomonas putida, Rhizobium meriroti ( Rhizobium meliloti) and other bacteria belonging to the genus Rhizobium can be used as host cells. Specifically, Escherichia coli BL21, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli K12, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, etc., Bacillus subtilis MI 114, Bacillus subtilis 207- Bacillus subtilis such as 21 can be used as a host cell. The promoter of the case is not particularly limited as long as it can be expressed in bacteria such as Escherichia coli, for example, using a promoter derived from the trp promoter, lac promoter, P L promoter, P R promoter of Escherichia coli or phage, etc. it can. In addition, artificially designed and modified promoters such as tac promoter, lacT7 promoter, and let I promoter can also be used.

細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用できる。   The method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method capable of introducing DNA into bacteria. For example, a method using calcium ions, an electroporation method, or the like can be used.

酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を使用できる。   When yeast is used as a host cell, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, and the like can be used as host cells. The promoter in this case is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast. For example, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter Etc. can be used.

酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用できる。   The method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method capable of introducing DNA into yeast. For example, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, or the like can be used.

動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTR(Long Terminal Repeat)プロモーター、CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用できる。   When animal cells are used as host cells, monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), mouse L cells, rat GH3, human FL cells and the like can be used as host cells. The promoter in this case is not particularly limited as long as it can be expressed in animal cells. For example, SRα promoter, SV40 promoter, LTR (Long Terminal Repeat) promoter, CMV promoter, human cytomegalovirus early gene promoter, etc. Can be used.

動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用できる。   The method for introducing the recombinant vector into the animal cell is not particularly limited as long as it can introduce DNA into the animal cell. For example, an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method and the like can be used.

昆虫細胞を宿主とする場合には、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用できる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等が挙げられる。   When insect cells are used as hosts, Spodoptera frugiperda ovary cells, Trichoplusia ni ovary cells, silkworm ovary-derived cultured cells, and the like can be used as host cells. Spodoptera frugiperda ovarian cells include Sf9, Sf21, Trichoplusia ni ovarian cells High 5, BTI-TN-5B1-4 (manufactured by Invitrogen), and silkworm ovary-derived cultured cells include Bombyx mori N4 It is done.

昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用できる。   The method for introducing a recombinant vector into insect cells is not particularly limited as long as DNA can be introduced into insect cells. For example, the calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method and the like can be used.

〔形質転換体の培養〕
目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を通常の培養方法に従って培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。 [Culture of transformants]
A transformant into which a recombinant vector incorporating a DNA encoding the target protein has been introduced is cultured according to a normal culture method. The transformant can be cultured according to a usual method used for culturing host cells.

大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを使用してもよい。   As a medium for cultivating transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as host cells, the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms, so that the transformants can be cultured efficiently. As long as it is a medium that can be used in a simple manner, either a natural medium or a synthetic medium may be used.

炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用できる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用できる。   As the carbon source, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used. As the nitrogen source, ammonia, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, and the like can be used. As the inorganic salt, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.

大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体の培養は、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は通常２５〜３７℃、培養時間は通常１６〜２４時間であり、培養期間中はｐＨを６．０〜８．０に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。また、培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。   The transformant obtained by using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as host cells is cultured under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture. The culture temperature is usually 25 to 37 ° C., the culture time is usually 16 to 24 hours, and the pH is maintained at 6.0 to 8.0 during the culture period. The pH can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like. Moreover, you may add antibiotics, such as an ampicillin and a tetracycline, to a culture medium at the time of culture | cultivation as needed.

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。   When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside is used when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter, and indole acrylic is used when a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter is cultured. An acid or the like may be added to the medium.

動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培地、DMEM培地、Ham F12培地、Ham F12K培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用できる。形質転換体の培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３日間行う。また、培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 As a medium for culturing a transformant obtained by using animal cells as host cells, generally used RPMI1640 medium, Eagle's MEM medium, DMEM medium, Ham F12 medium, Ham F12K medium, fetal bovine serum, etc. Can be used. The transformant is usually cultured at 37 ° C. for 1 to 3 days in the presence of 5% CO 2 . Moreover, you may add antibiotics, such as kanamycin, penicillin, streptomycin, to a culture medium at the time of culture | cultivation as needed.

昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（ファーミンジェン社製）、Sf-900 II SFM培地（Gibco BRL社製）、ExCell400、ExCell405（JRHバイオサイエンシーズ社製）等を使用できる。形質転換体の培養は、通常２０〜２８℃で２〜４日間行う。また、培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。   As a medium for culturing a transformant obtained by using insect cells as host cells, commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Gibco BRL), ExCell400 ExCell405 (manufactured by JRH Biosciences) or the like can be used. The transformant is usually cultured at 20 to 28 ° C. for 2 to 4 days. Moreover, you may add antibiotics, such as a gentamicin, to a culture medium at the time of culture | cultivation as needed.

目的とするタンパク質は、分泌タンパク質又は融合タンパク質として発現させることもできる。融合させるタンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（His-tag）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）等が挙げられる。   The target protein can also be expressed as a secreted protein or a fusion protein. Examples of proteins to be fused include β-galactosidase, protein A, IgG binding region of protein A, chloramphenicol acetyltransferase, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose binding protein, glutathione S- Examples include transferase, polyhistidine chain (His-tag), S peptide, DNA-binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, and green fluorescent protein (GFP).

〔タンパク質の単離・精製〕
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。 [Isolation and purification of protein]
The target protein is obtained by collecting the target protein from the culture of the transformant. Here, the “culture” includes any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, cells or disrupted cells.
If the target protein accumulates in the cells of the transformant, the culture is centrifuged to collect the cells in the culture, wash the cells, disrupt the cells, Extract the protein to be used. When the target protein is secreted outside the transformant, the culture supernatant is used as it is, or cells or cells are removed from the culture supernatant by centrifugation or the like.

こうして得られるタンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製できる。   The protein (a), (b), (c) or (d) thus obtained is a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylaminoethyl (DEAE) -sepharose, ions It can be purified by exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, affinity chromatography, or the like.

タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）は、そのアミノ酸配列に基づいて、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造できる。この際、市販のペプチド合成機を使用できる。   Protein (a), (b), (c) or (d) is based on its amino acid sequence, such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), etc. It can also be produced by a synthesis method. At this time, a commercially available peptide synthesizer can be used.

本発明の抗体又はその断片は、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に反応し得る抗体又はその断片である。ここで、「抗体」には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体」には全てのクラスのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。また、「抗体」には、ウサギ、マウス等の免疫動物にタンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）を免疫して得られる抗血清、ヒト抗体、遺伝子組換えによって得られるヒト型化抗体も含まれる。また、「抗体の断片」には、Fab断片、F(ab)'2断片、単鎖抗体(scFv)等が含まれる。 The antibody or fragment thereof of the present invention is an antibody or fragment thereof that can react with the protein (a), (b), (c) or (d). Here, “antibodies” include both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, and “monoclonal antibodies and polyclonal antibodies” include all classes of monoclonal antibodies and polyclonal antibodies. “Antibodies” are obtained by immunizing animals such as rabbits and mice with antisera obtained by immunizing proteins (a), (b), (c) or (d), human antibodies, and gene recombination. Humanized antibodies are also included. “Antibody fragments” include Fab fragments, F (ab) ′ 2 fragments, single-chain antibodies (scFv) and the like.

本発明の抗体又はその断片は、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）を免疫用抗原として利用することより作製できる。免疫用抗原としては、例えば、(i) タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）を発現している細胞又は組織の破砕物又はその精製物、(ii) 遺伝子組換え技術を用いて、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子を大腸菌、昆虫細胞又は動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、(iii) 化学合成したペプチド等を使用できる。   The antibody or fragment thereof of the present invention can be prepared by using the protein (a), (b), (c) or (d) as an immunizing antigen. Examples of the antigen for immunization include (i) crushed cell or tissue expressing protein (a), (b), (c) or (d) or purified product thereof, (ii) gene recombination technology A recombinant protein expressed by introducing a gene encoding the protein (a), (b), (c) or (d) into a host such as Escherichia coli, insect cells or animal cells, and (iii) A synthesized peptide or the like can be used.

ポリクローナル抗体の作製にあたっては、免疫用抗原を用いて、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫動物は、抗体を容易に作製できることからウサギを利用することが好ましい。免疫の際には、抗体産生誘導する為に、フロイント完全アジュバント等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回の免疫することが好ましい。免疫助剤としては、フロイント完全アジュバント(FCA)の他、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムゲル等を利用できる。哺乳動物１匹当たりの抗原の投与量は、哺乳動物の種類に応じて適宜設定できるが、ウサギの場合には通常１０〜１０００μｇである。投与部位は、例えば、静脈内、皮内、皮下、腹腔内等である。免疫の間隔は、通常、数日から数週間間隔、好ましくは５日〜３週間間隔で、合計３〜８回、好ましくは４〜６回免疫を行う。そして、最終免疫日から１０〜１４日後に、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。抗体力価の測定は、酵素免疫測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等により行うことができる。   In the production of a polyclonal antibody, mammals such as rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, cows and the like are immunized using an immunizing antigen. Rabbits are preferably used as immunized animals because antibodies can be easily produced. In immunization, in order to induce antibody production, it is preferable to immunize several times after emulsification using an immune assistant such as Freund's complete adjuvant. As the immunity assistant, Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), aluminum hydroxide gel, and the like can be used. The dose of the antigen per mammal can be appropriately set according to the type of mammal, but is usually 10 to 1000 μg in the case of rabbits. The administration site is, for example, intravenous, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal or the like. Immunization is usually performed every few days to several weeks, preferably 5 days to 3 weeks, for a total of 3 to 8 times, preferably 4 to 6 times. Then, 10 to 14 days after the final immunization day, the antibody titer against the protein (a), (b), (c) or (d) is measured, and blood is collected after the antibody titer is increased to obtain antiserum. . The antibody titer can be measured by enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) or the like.

抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。   When purification of the antibody from the antiserum is required, a known method such as salting out with ammonium sulfate, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography or the like can be appropriately selected or used in combination.

モノクローナル抗体の作製にあたっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫し、最終免疫日から３〜４日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。   In the production of a monoclonal antibody, a mammal is immunized with an immunizing antigen as in the case of a polyclonal antibody, and antibody-producing cells are collected 3 to 4 days after the final immunization day. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, thymocytes, and peripheral blood cells, and spleen cells are generally used.

次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、ヒト、マウス等の哺乳動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を利用できる。利用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地(例えばHAT培地)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、P3X63-Ag.8.U1（P3U1）、P3/NSI/1-Ag4-1、Sp2/0-Ag14等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。   Next, in order to obtain a hybridoma, cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed. As myeloma cells to be fused with antibody-producing cells, cell lines derived from mammals such as humans and mice and generally available can be used. The cell line to be used is preferably a cell line that has drug selectivity and cannot survive in a selective medium (for example, HAT medium) in an unfused state but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Specific examples of myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as P3X63-Ag.8.U1 (P3U1), P3 / NSI / 1-Ag4-1, and Sp2 / 0-Ag14.

細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地等の動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合（例えば３：１〜１．５：１）で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で、又は電気パルス処理(例えばエレクトロポレーション)により融合反応を行う。   In cell fusion, antibody-producing cells and myeloma cells are mixed in a predetermined ratio (for example, 3: 1 to 1.5: 1) in animal cell culture media such as serum-free DMEM and RPMI-1640 media. The fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter such as polyethylene glycol or by electric pulse treatment (for example, electroporation).

細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法 (ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等によってスクリーニングできる。   After cell fusion treatment, the cells are cultured using a selective medium, and the target hybridoma is selected. Subsequently, it is screened whether the target antibody exists in the culture supernatant of the grown hybridoma. Hybridoma screening is not particularly limited, and may be performed according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected and screened by enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) or the like.

ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。   Hybridoma cloning can be performed, for example, by limiting dilution, soft agar, fibrin gel, fluorescence excitation cell sorter, or the like, and finally a hybridoma producing a monoclonal antibody is obtained.

取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用することができる。細胞培養法においては、例えばハイブリドーマを１０〜２０％牛胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件(例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度)で３〜１４日間培養することにより、その培養上清からモノクローナル抗体を取得することができる。また、ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に移植し、１０〜２０日後に腹水を採取し、当該腹水からモノクローナル抗体を取得することもできる。 As a method for collecting a monoclonal antibody from the obtained hybridoma, a normal cell culture method or the like can be used. In the cell culture method, for example, the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10 to 20% fetal calf serum and MEM medium under normal culture conditions (for example, 37 ° C., 5% CO 2 concentration). By culturing for 14 days, a monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant. Alternatively, the hybridoma can be transplanted into the abdominal cavity of a mouse or the like, and ascites can be collected 10 to 20 days later to obtain a monoclonal antibody from the ascites.

モノクローナル抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。   When purification of the monoclonal antibody is required, a known method such as salting out with ammonium sulfate, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography or the like can be appropriately selected or used in combination.

モノクローナル抗体をヒトに投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体又はヒト型化抗体を使用することが好ましい。ヒト抗体又はヒト型化抗体は、例えば、免疫動物としてヒト抗体遺伝子を導入したマウス等を用いてハイブリドーマを作製することにより、また、ファージ上に抗体を提示したライブラリーを用いることにより取得できる。具体的には、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に、抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いて目的のタンパク質に対するヒト抗体を取得できる（国際公開番号WO92-03918、WO93-2227、WO94-02602、WO96-33735及びWO96-34096参照）。また、複数の異なるヒトscFvをファージ上に提示させた抗体ライブラリーから、抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物に結合する抗体を提示しているファージを選り分けることで、目的のタンパク質に結合するscFvを選択できる（Griffiths.等, EMBO J. 12, 725-734, 1993）。   When the monoclonal antibody is used for the purpose of administering it to humans (antibody therapy), it is preferable to use a human antibody or a humanized antibody in order to reduce immunogenicity. A human antibody or a humanized antibody can be obtained, for example, by preparing a hybridoma using a mouse or the like into which a human antibody gene has been introduced as an immunized animal, or by using a library displaying an antibody on a phage. Specifically, a hybridoma having a human antibody gene repertoire is immunized with an antigen protein, a protein-expressing cell or a lysate thereof to obtain an antibody-producing cell, and a hybridoma obtained by fusing this with a myeloma cell is obtained. Can be used to obtain human antibodies against the protein of interest (see International Publication Nos. WO92-03918, WO93-2227, WO94-02602, WO96-33735 and WO96-34096). In addition, the target protein can be selected by selecting an antigen library, a phage displaying an antibody that binds to a protein-expressing cell or a lysate thereof from an antibody library in which a plurality of different human scFvs are displayed on the phage. ScFvs that bind to can be selected (Griffiths. Et al., EMBO J. 12, 725-734, 1993).

本発明の第１のスクリーニング方法は、試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の親和性相互作用を抑制又は促進できる否かを判別し、当該親和性相互作用を抑制又は促進できる試験物質を個体発生に影響を与える物質としてスクリーニングする工程を含む。   The first screening method of the present invention determines whether or not the test substance can suppress or promote the affinity interaction between the proteins (a) or (c) and can test or suppress the affinity interaction. Screening a substance as a substance that affects ontogeny.

タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の親和性相互作用は、個体発生、特に胎生期における個体発生に関与していると考えられるので、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の親和性相互作用を抑制又は促進できる物質を選択することにより、個体発生、特に胎生期における個体発生に影響を与える可能性がある物質をスクリーニングできる。   Since the affinity interaction between the proteins (a) or (c) is considered to be involved in ontogeny, particularly ontogeny in the embryonic period, the affinity interaction between the proteins (a) or (c) By selecting substances that can be suppressed or promoted, it is possible to screen for substances that may affect ontogeny, particularly ontogeny during the embryonic period.

試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の親和性相互作用を抑制又は促進できる否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。   Whether or not the test substance can suppress or promote the affinity interaction between the proteins (a) or (c) can be determined as follows, for example, but the determination method is not limited thereto.

タンパク質（ａ）又は（ｃ）と別のタンパク質（ａ）又は（ｃ）とを試験物質の存在下又は不存在下で接触させた後、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合量を測定し、試験物質の存在下における結合量と試験物質の不存在下における結合量とを比較する。その結果、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも少なければ、試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合を抑制できると判別できる。一方、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも多ければ、試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合を促進できると判別できる。   After contacting protein (a) or (c) with another protein (a) or (c) in the presence or absence of the test substance, the amount of binding between proteins (a) or (c) is measured. Then, the amount of binding in the presence of the test substance is compared with the amount of binding in the absence of the test substance. As a result, if the amount of binding in the presence of the test substance is less than the amount of binding in the absence of the test substance, it can be determined that the test substance can suppress the binding between the proteins (a) or (c). On the other hand, if the amount of binding in the presence of the test substance is greater than the amount of binding in the absence of the test substance, it can be determined that the test substance can promote the binding between the proteins (a) or (c).

タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合を抑制又は促進できる物質は、一方のタンパク質（ａ）又は（ｃ）に作用する物質であってもよいし、両方のタンパク質（ａ）又は（ｃ）に作用する物質であってもよい。また、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合を抑制できる物質は、解離状態にあるタンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合を抑制できる物質であってもよいし、結合状態にあるタンパク質（ａ）又は（ｃ）同士を解離させることができる物質であってもよい。   The substance capable of suppressing or promoting the binding between the proteins (a) or (c) may be a substance acting on one protein (a) or (c), or both proteins (a) or (c). It may be a substance that acts on Moreover, the substance which can suppress the coupling | bonding of protein (a) or (c) may be a substance which can suppress the coupling | bonding of protein (a) or (c) in a dissociation state, and the protein in a binding state A substance capable of dissociating (a) or (c) may be used.

タンパク質（ａ）又は（ｃ）と別のタンパク質（ａ）又は（ｃ）とは、in vitroで接触させてもよいし、in vivoで接触させてもよい。   The protein (a) or (c) and another protein (a) or (c) may be contacted in vitro or in vivo.

in vitroで接触させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｃ）として、（i）目的とするタンパク質を発現している細胞又は組織から抽出した内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体の培養物から抽出した組換えタンパク質、（iii）化学合成したペプチド等を使用できる。   When contacting in vitro, as protein (a) or (c), (i) an endogenous protein extracted from a cell or tissue expressing the target protein, (ii) a set capable of expressing the target protein A recombinant vector is introduced into a host cell to produce a transformant, and a recombinant protein extracted from the transformant culture, (iii) a chemically synthesized peptide, or the like can be used.

in vivoで接触させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｃ）として、（i）細胞内に存在する内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体内に存在する組換えタンパク質等を使用できる。   When contacting in vivo, as a protein (a) or (c), (i) an endogenous protein present in the cell, (ii) a recombinant vector capable of expressing the target protein is introduced into the host cell. A recombinant protein or the like present in the produced transformant can be used.

タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士を接触させる際、タンパク質（ａ）又は（ｃ）として、野生型、変異型、野生型又は変異型の誘導体、野生型又は変異型と他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等を使用できる。   When proteins (a) or (c) are brought into contact with each other, as protein (a) or (c), wild type, mutant type, wild type or mutant type derivative, wild type or mutant type and other protein or peptide Fusion proteins of can be used.

タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士を接触させる際、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合に影響を与える条件を調節し、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合が試験物質の有無に依存するようにする。   When the proteins (a) or (c) are brought into contact with each other, the conditions affecting the binding between the proteins (a) or (c) are adjusted, and the binding between the proteins (a) or (c) is the presence or absence of the test substance. To depend on.

タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合に影響を与える条件としては、例えば、温度、溶媒の種類、タンパク質（ａ）又は（ｃ）の濃度、攪拌強度、共存時間、重力、磁場等が挙げられる。   Examples of conditions that affect the binding between proteins (a) or (c) include temperature, solvent type, protein (a) or (c) concentration, stirring intensity, coexistence time, gravity, and magnetic field. It is done.

タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士を接触させる際の温度は、例えば、２〜６５℃に設定できる。タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士を接触させる際の溶媒としては、例えば、ＰＢＳ、ＴＢＳ、Ｈｅｐｅｓバッファー等を使用できる。タンパク質（ａ）又は（ｃ）の濃度は、例えば１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌに設定できる。   The temperature at which the proteins (a) or (c) are brought into contact with each other can be set to, for example, 2 to 65 ° C. As a solvent for bringing the proteins (a) or (c) into contact with each other, for example, PBS, TBS, Hepes buffer or the like can be used. The concentration of protein (a) or (c) can be set, for example, to 1 ng / ml to 100 mg / ml.

タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合量は、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合体量、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合によって生じるシグナル量等を指標として測定できる。   The amount of binding between proteins (a) or (c) is measured using, for example, the amount of conjugate between proteins (a) or (c), the amount of signal generated by binding between proteins (a) or (c), etc. it can.

タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合体量は、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｃ）に標識物質を付加しておき、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士を接触させた後、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合体を分離し、当該結合体が有する標識物質量を指標として測定できる。具体的には、ＧＳＴ ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ法等の公知の方法を利用して測定できる。   The amount of the conjugate between the proteins (a) or (c) is, for example, after adding a labeling substance to the protein (a) or (c) and bringing the proteins (a) or (c) into contact with each other. A conjugate of (a) or (c) can be separated, and the amount of labeling substance possessed by the conjugate can be measured as an index. Specifically, it can be measured using a known method such as the GST pull down method.

また、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合体量は、公知のタンパク質解析技術、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合体に反応できる抗体又はその断片を使用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、組織免疫染色法等によって測定できる。なお、「抗体」には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「モノクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体」には全てのクラスのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。また、「抗体の断片」には、Fab断片、F(ab)'2断片、単鎖抗体(scFv)等が含まれる。 The amount of conjugate between proteins (a) or (c) is a known protein analysis technique, for example, Western blotting using an antibody or fragment thereof that can react with a conjugate between proteins (a) or (c). , Immunoprecipitation, ELISA, tissue immunostaining, and the like. “Antibodies” include both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, and “monoclonal antibodies” and “polyclonal antibodies” include all classes of monoclonal antibodies and polyclonal antibodies. “Antibody fragments” include Fab fragments, F (ab) ′ 2 fragments, single-chain antibodies (scFv) and the like.

タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合によって生じるシグナルの種類は特に限定されるものではないが、例えば、レポーター遺伝子の発現、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は水晶振動子の振動数移動による局所密度変化の検出等が挙げられる。   The type of signal generated by the binding between the proteins (a) or (c) is not particularly limited. For example, reporter gene expression, fluorescence energy transfer (FRET), surface plasmon resonance (SPR), or a crystal oscillator For example, detection of local density change due to frequency shift of.

レポーター遺伝子としては、例えば、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等が挙げられ、レポーター活性としては、例えば、βガラクトシダーゼ活性、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性、ルシフェラーゼ活性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性等が挙げられる。   Examples of reporter genes include β-galactosidase gene, chloramphenicol acetyltransferase gene, luciferase gene, ampicillin resistance gene, tetracycline resistance gene, kanamycin resistance gene and the like. Reporter activities include, for example, β-galactosidase activity, Examples include lamphenicol acetyltransferase activity, luciferase activity, ampicillin resistance, tetracycline resistance, kanamycin resistance, and the like.

本発明の第２のスクリーニング方法は、試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制又は促進できる否かを判別し、当該親和性相互作用を抑制又は促進できる試験物質を個体発生に影響を与える物質としてスクリーニングする工程を含む。   In the second screening method of the present invention, the test substance determines whether or not the affinity interaction between the protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1 can be suppressed or promoted, and the affinity interaction is determined. Screening a test substance that can be suppressed or promoted as a substance that affects ontogeny.

タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用は、個体発生、特に胎生期における個体発生に関与していると考えられるので、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制又は促進できる物質を選択することにより、個体発生、特に胎生期における個体発生に影響を与える可能性がある物質をスクリーニングできる。   Since the affinity interaction between protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1 is considered to be involved in ontogeny, particularly ontogeny during embryonic period, protein (a) or (d) and Bax By selecting a substance capable of suppressing or promoting the affinity interaction with inhibitor-1, substances that may affect ontogeny, particularly ontogeny during the embryonic period, can be screened.

試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制又は促進できる否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。   Whether or not the test substance can suppress or promote the affinity interaction between protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1 can be determined, for example, as follows, but the determination method is limited to this. It is not something.

タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１とを試験物質の存在下又は不存在下で接触させた後、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との結合量を測定し、試験物質の存在下における結合量と試験物質の不存在下における結合量とを比較する。その結果、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも少なければ、試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制できると判別できる。一方、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも多ければ、試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を促進できると判別できる。   After contacting protein (a) or (d) with Bax inhibitor-1 in the presence or absence of the test substance, the amount of binding between protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1 is measured. The amount of binding in the presence of the test substance is compared with the amount of binding in the absence of the test substance. As a result, if the amount of binding in the presence of the test substance is less than the amount of binding in the absence of the test substance, the test substance exhibits an affinity interaction between the protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1. It can be determined that it can be suppressed. On the other hand, if the amount of binding in the presence of the test substance is greater than the amount of binding in the absence of the test substance, the test substance promotes the affinity interaction between the protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1. It can be determined that it can.

タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制又は促進できる物質は、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１のうちの一方に作用する物質であってもよいし、両方に作用する物質であってもよい。また、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制できる物質は、解離状態にあるタンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との結合を抑制できる物質であってもよいし、結合状態にあるタンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１とを解離させることができる物質であってもよい。   The substance capable of suppressing or promoting the affinity interaction between protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1 is a substance that acts on one of protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1. It may be a substance that acts on both. Moreover, the substance which can suppress the affinity interaction of protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1 can suppress the coupling | bonding of protein (a) or (d) in a dissociated state, and Bax inhibitor-1. It may be a substance, or a substance capable of dissociating the protein (a) or (d) in a bound state with Bax inhibitor-1.

タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１とは、in vitroで接触させてもよいし、in vivoで接触させてもよい。   Protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1 may be contacted in vitro or in vivo.

in vitroで接触させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｄ）として、（i）目的とするタンパク質を発現している細胞又は組織から抽出した内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体の培養物から抽出した組換えタンパク質、（iii）化学合成したペプチド等を使用できる。Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１についても同様である。   When contacting in vitro, as protein (a) or (d), (i) an endogenous protein extracted from a cell or tissue expressing the target protein, (ii) a set capable of expressing the target protein A recombinant vector is introduced into a host cell to produce a transformant, and a recombinant protein extracted from the transformant culture, (iii) a chemically synthesized peptide, or the like can be used. The same applies to Bax inhibitor-1.

in vivoで接触させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｄ）として、（i）細胞内に存在する内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体内に存在する組換えタンパク質等を使用できる。Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１についても同様である。   When contacting in vivo, as a protein (a) or (d), (i) an endogenous protein present in the cell, (ii) a recombinant vector capable of expressing the target protein is introduced into the host cell. A recombinant protein or the like present in the produced transformant can be used. The same applies to Bax inhibitor-1.

タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１とを接触させる際、タンパク質（ａ）又は（ｄ）として、野生型、変異型、野生型又は変異型の誘導体、野生型又は変異型と他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等を使用できる。Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１についても同様である。   When contacting protein (a) or (d) with Bax inhibitor-1, as protein (a) or (d), wild type, mutant, wild type or mutant derivative, wild type or mutant and others A fusion protein with a protein or peptide can be used. The same applies to Bax inhibitor-1.

タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１とを接触させる際、両者の結合に影響を与える条件を調節し、両者の結合が試験物質の有無に依存するようにする。両者の結合に影響を与える条件としては、例えば、温度、溶媒の種類、タンパク質（ａ）又は（ｄ）の濃度、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１の濃度、攪拌強度、共存時間、重力、磁場等が挙げられる。   When the protein (a) or (d) is contacted with the Bax inhibitor-1, conditions that affect the binding between the two are adjusted so that the binding between the two depends on the presence or absence of the test substance. Examples of conditions that affect the binding between the two include temperature, solvent type, protein (a) or (d) concentration, Bax inhibitor-1 concentration, stirring intensity, coexistence time, gravity, and magnetic field. .

温度は、例えば、２〜６５℃に設定できる。溶媒としては、例えば、ＰＢＳ、ＴＢＳ、Ｈｅｐｅｓバッファー等を使用できる。タンパク質（ａ）又は（ｄ）の濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌに設定できる。Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１の濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌに設定できる。   The temperature can be set to 2 to 65 ° C., for example. As the solvent, for example, PBS, TBS, Hepes buffer and the like can be used. The concentration of the protein (a) or (d) can be set, for example, to 1 ng / ml to 100 mg / ml. The concentration of Bax inhibitor-1 can be set to 1 ng / ml to 100 mg / ml, for example.

タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との結合量は、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合量と同様に、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との結合体量、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との結合によって生じるシグナル量等を指標として測定できる。   The amount of binding between protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1 is, for example, the amount of binding between protein (a) or (c) and protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1 And the amount of signal produced by the binding of protein (a) or (d) and Bax inhibitor-1 can be measured as indicators.

〔実施例１〕ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１の単離及び同定
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりヒト肺由来ｃＤＮＡの中からヒト遺伝子１を単離した。ＰＣＲは、変性工程、プライマーのアニーリング工程及びＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程からなるＤＮＡ増幅サイクルを繰り返して行う反応であり、例えば、Saiki等，Science，第230巻，第1350頁（1985年）、Williams等，Nucleic Acid Research，第18巻，第22号，第6531頁〜第6535頁（1991年）等に記載されている常法に従って行った。 [Example 1] Isolation and identification of human gene 1 and mouse gene 1 Human gene 1 was isolated from cDNA derived from human lung by polymerase chain reaction (PCR). PCR is a reaction performed by repeating a DNA amplification cycle comprising a denaturation step, a primer annealing step and a DNA polymerase extension step. For example, Saiki et al., Science, 230, 1350 (1985), Williams et al. , Nucleic Acid Research, Vol. 18, No. 22, pages 6531 to 6535 (1991) and the like.

具体的には、5'-aagcagttccggttcggctccgagcagctgccg-3'を５'プライマーとして用い、5'-ggcatctaagacacctagggggaacgc-3'を３'プライマーとして用い、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Expand Long Template PCR System, Roche社製）５ユニット、２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）、ヒト肺組織由来ｃＤＮＡ ０．５ｎｇ、及び１．７５ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する増幅用バッファー中で、９４℃で１０分間処理の後、９４℃で３０秒、６２℃で４５秒、６８℃で５分の処理を３５サイクル繰り返し、さらに６８℃１０分の処理を行った。   Specifically, 5'-aagcagttccggttcggctccgagcagctgccg-3 'is used as a 5' primer, 5'-ggcatctaagacacctagggggaacgc-3 'is used as a 3' primer, and heat resistant DNA polymerase (Expand Long Template PCR System, manufactured by Roche) 5 units , 200 μM dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0.5 ng of cDNA derived from human lung tissue, and 1.75 mM magnesium chloride, treated at 94 ° C. for 10 minutes, and then treated at 94 ° C. for 30 minutes. The process was repeated for 35 cycles at a second of 62 ° C. for 45 seconds and 68 ° C. for 5 minutes, and further at 68 ° C. for 10 minutes.

プライマーは次のように設計した。ショウジョウバエにおいて、発生分化に関わるレセプター（エクダイソンレセプター）と相互作用するタンパク質（ＧＨ２４６２７ｐ）をコードするＤＮＡ配列に基づいて、その相同ｃＤＮＡをヒトＥＳＴから検索し、このｃＤＮＡ配列に基づいて、ヒト精巣由来ｃＤＮＡを鋳型として５'−ＲＡＣＥを行い、得られた配列に基づいて５'プライマーを設計した。３'プライマーは、ヒトゲノム配列から想定して設計した。   Primers were designed as follows. In Drosophila, a homologous cDNA is searched from human EST based on a DNA sequence encoding a protein (GH24627p) that interacts with a receptor involved in developmental differentiation (ecdysone receptor). Based on this cDNA sequence, a human testis-derived cDNA 5′-RACE was performed using as a template, and a 5 ′ primer was designed based on the obtained sequence. The 3 ′ primer was designed assuming the human genome sequence.

反応終了後、反応液を、１％アガロースゲル（ＴＢＥバッファー）を用いた電気泳動に供した後、ゲルをエチジウムブロマイド染色し、トランスイルミネーターにより観察することにより、増幅されたＤＮＡ断片を検出した。さらにこのＤＮＡ断片を、QUIAquick Gel Extraction Kit（QUIAGEN社製）を用いてアガロースゲルから回収し、ｐＧＥＭＴＥ等のクローニング用ベクタープラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した後、大腸菌を宿主として増幅し、配列を決定した。クローニング用ベクターのクローニングサイトへの挿入は、ＴＡクローニングにより行った。すなわち、ＥｃｏＲＶ消化により平滑末端化したベクターの３’末端にＴ（チミジン）を付加し、３’末端にＡ（アデニン）が付加されたＰＣＲ産物をライゲートした。これを電気穿孔法により、大腸菌内に遺伝子導入し、ポジティブクローンを選抜した後、ＬＢ液体培地中、３７℃で１６〜２０時間攪拌培養した。培養後の大腸菌を、遠心により回収し、ＱＩＡＧＥＮミニプレップキット（キアゲン社製）を用いてプラスミドの精製を行った。挿入配列の決定は、Dye Terminator法により、蛍光シークエンサーを用いて行った。   After completion of the reaction, the reaction solution was subjected to electrophoresis using 1% agarose gel (TBE buffer), and then the gel was stained with ethidium bromide and observed with a transilluminator to detect the amplified DNA fragment. . Furthermore, this DNA fragment was recovered from an agarose gel using QUIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QUIAGEN), inserted into a multicloning site of a cloning vector plasmid such as pGEMTE, and then amplified using Escherichia coli as a host to determine the sequence. did. The cloning vector was inserted into the cloning site by TA cloning. That is, a PCR product in which T (thymidine) was added to the 3 'end of the vector blunt-ended by EcoRV digestion and A (adenine) was added to the 3' end was ligated. This was introduced into Escherichia coli by electroporation, and positive clones were selected, followed by stirring and culture in an LB liquid medium at 37 ° C. for 16 to 20 hours. The cultured Escherichia coli was collected by centrifugation, and the plasmid was purified using a QIAGEN miniprep kit (manufactured by Qiagen). The insertion sequence was determined by the dye terminator method using a fluorescent sequencer.

さらにヒト遺伝子１を基にマウスｃＤＮＡからマウス遺伝子１を単離した。ヒト遺伝子１の部分ｃＤＮＡと相同性を示すマウスｃＤＮＡを公開データベースから探索し、この配列を基に５'-ＲＡＣＥプライマー(5'-cttcggtcatggagaaggcccacgggatcct-3')を設計し、マウス***由来ｃＤＮＡを鋳型として５'-ＲＡＣＥを行い、得られた配列より５'プライマー(5'-ccaaaggggccggagcgatgcccgctggtagccg-3')を設計した。５'プライマー及び３'プライマー(5'-ctcattacagagagagagtcttcatcc-3')各１５ｐｍｏｌｅ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Expand Long Template PCR System, Roche社製）５ユニット、２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）、マウス***由来ｃＤＮＡ ０．５ｎｇ及び１．７５ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する増幅用バッファー中、９４℃で１０分間処理の後、９４℃で３０秒、６２℃で４５秒、６８℃で５分の処理を３５サイクル繰り返し、さらに６８℃１０分の処理を行った。反応終了後、反応液を、１％アガロースゲル（ＴＢＥバッファー）を用いた電気泳動に供した後、ゲルをエチジウムブロマイド染色し、トランスイルミネーターにより観察することにより、増幅されたＤＮＡ断片を検出した。さらにこのＤＮＡ断片を、QUIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いてアガロースゲルから回収し、ｐＧＥＭＴＥ等のクローニング用ベクタープラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した後、大腸菌を宿主として増幅し、配列を決定した。クローニング用ベクターのクローニングサイトへの挿入は、ＴＡクローニングにより行った。すなわち、ＥｃｏＲＶ消化により、平滑末端化したベクターの３’末端にＴ（チミジン）を付加し、３’末端にＡ（アデニン）が付加されたＰＣＲ産物をライゲートした。これを電気穿孔法により、大腸菌内に遺伝子導入し、ＬＢ液体培地中で、３７℃下で１６〜２０時間攪拌培養した。培養後の大腸菌を、遠心により回収し、ＱＩＡＧＥＮミニプレップキット（キアゲン社製）を用いてプラスミドの精製を行った。挿入配列の決定は、Dye Terminator法により、蛍光シークエンサーを用いて行った。   Furthermore, mouse gene 1 was isolated from mouse cDNA based on human gene 1. A mouse cDNA showing homology with the partial cDNA of human gene 1 is searched from a public database, and a 5'-RACE primer (5'-cttcggtcatggagaaggcccacgggatcct-3 ') is designed based on this sequence, using mouse sperm-derived cDNA as a template. 5′-RACE was performed, and a 5 ′ primer (5′-ccaaaggggccggagcgatgcccgctggtagccg-3 ′) was designed from the obtained sequence. 5 ′ primer and 3 ′ primer (5′-ctcattacagagagagagtcttcatcc-3 ′) 15 pmole each, heat-resistant DNA polymerase (Expand Long Template PCR System, manufactured by Roche) 5 units, 200 μM dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), mouse 35 minutes of treatment at 94 ° C. for 30 seconds, 62 ° C. for 45 seconds, and 68 ° C. for 5 minutes in an amplification buffer containing 0.5 ng of sperm-derived cDNA and 1.75 mM magnesium chloride The cycle was repeated, and further treatment at 68 ° C. for 10 minutes was performed. After completion of the reaction, the reaction solution was subjected to electrophoresis using 1% agarose gel (TBE buffer), and then the gel was stained with ethidium bromide and observed with a transilluminator to detect the amplified DNA fragment. . Furthermore, this DNA fragment was recovered from an agarose gel using QUIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), inserted into a multicloning site of a cloning vector plasmid such as pGEMTE, and then amplified using Escherichia coli as a host to determine the sequence. did. The cloning vector was inserted into the cloning site by TA cloning. That is, a PCR product in which T (thymidine) was added to the 3 'end of the blunt-ended vector and A (adenine) was added to the 3' end by digestion with EcoRV was ligated. The gene was introduced into Escherichia coli by electroporation, and cultured with stirring in LB liquid medium at 37 ° C. for 16 to 20 hours. The cultured Escherichia coli was collected by centrifugation, and the plasmid was purified using a QIAGEN miniprep kit (manufactured by Qiagen). The insertion sequence was determined by the dye terminator method using a fluorescent sequencer.

ヒト遺伝子１の塩基配列を配列番号１に示す。ヒト遺伝子１は、４７８アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含む。ヒト遺伝子１にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２のうち、第７３アミノ酸から第１４０アミノ酸部分は、ＳＡＭ（Sterile Alpha Motif）ドメインと称されるシグナル伝達因子に特徴的なペプチドモチーフを含む。第５２アミノ酸のＳｅｒ残基は、ＭＡＰキナーゼ基質に特徴的なモチーフに含まれ、第２４７から第２５０アミノ酸までの部位（ＰＰＬＰ：Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ）は、ＳＨ３結合領域モチーフである。   The nucleotide sequence of human gene 1 is shown in SEQ ID NO: 1. Human gene 1 contains an open reading frame encoding 478 amino acids. The amino acid sequence of the protein encoded by human gene 1 is shown in SEQ ID NO: 2. In SEQ ID NO: 2, the amino acid portion from amino acid 73 to amino acid 140 contains a peptide motif characteristic of a signal transduction factor called SAM (Sterile Alpha Motif) domain. The Ser residue of the 52nd amino acid is included in the motif characteristic of the MAP kinase substrate, and the region from the 247th to the 250th amino acid (PPLP: Pro-Pro-Leu-Pro) is an SH3 binding region motif.

マウス遺伝子１の塩基配列を配列番号３に示す。マウス遺伝子１は、４７８アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含む。マウス遺伝子１にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。配列番号４のうち、第７３アミノ酸から第１４０アミノ酸部分は、ＳＡＭ（Sterile Alpha Motif）ドメインと称されるシグナル伝達因子に特徴的なペプチドモチーフを含む。第５２アミノ酸のＳｅｒ残基は、ＭＡＰキナーゼ基質に特徴的なモチーフに含まれ、第２４７から第２５０アミノ酸までの部位（ＰＰＬＰ：Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ）は、ＳＨ３結合領域モチーフである。   The nucleotide sequence of mouse gene 1 is shown in SEQ ID NO: 3. Mouse gene 1 contains an open reading frame encoding 478 amino acids. The amino acid sequence of the protein encoded by mouse gene 1 is shown in SEQ ID NO: 4. In SEQ ID NO: 4, the amino acid portion from amino acid 73 to amino acid 140 contains a peptide motif characteristic of a signaling factor called SAM (Sterile Alpha Motif) domain. The Ser residue of the 52nd amino acid is included in the motif characteristic of the MAP kinase substrate, and the region from the 247th to the 250th amino acid (PPLP: Pro-Pro-Leu-Pro) is an SH3 binding region motif.

オープンリーディングフレーム領域について、ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１は、ＤＮＡレベルで８９．５％、タンパク質レベルで９０．２％の相同性を示した。   Regarding the open reading frame region, human gene 1 and mouse gene 1 showed 89.5% homology at the DNA level and 90.2% at the protein level.

〔実施例２〕ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１のゲノム構造
ヒト遺伝子１のｃＤＮＡ配列を公開済ヒトゲノム配列に対して相同検索することにより、ヒト遺伝子１のゲノム構造を決定した。マウス遺伝子１のｃＤＮＡ配列を公開済マウスゲノム配列に対して相同検索することにより、マウス遺伝子１のゲノム構造を決定した。 [Example 2] Genomic structure of human gene 1 and mouse gene 1 The genomic structure of human gene 1 was determined by homologous search of the cDNA sequence of human gene 1 against the published human genomic sequence. The genomic structure of mouse gene 1 was determined by homologous search of the mouse gene 1 cDNA sequence against the published mouse genome sequence.

ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１のゲノム構造を図１に示す。図１に示すように、ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１のゲノム構造は極めて類似していた。特に相同なエクソン領域は全て同一の塩基数であった。イントロンの長さは、ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１間で相違が認められた。   The genomic structures of human gene 1 and mouse gene 1 are shown in FIG. As shown in FIG. 1, the genomic structures of human gene 1 and mouse gene 1 were very similar. In particular, all homologous exon regions had the same number of bases. Intron length was found to differ between human gene 1 and mouse gene 1.

〔実施例３〕ヒト遺伝子１の発現組織
ヒト各組織から調製したｐｏｌｙＡ ＲＮＡをブロットしたナイロンメンブレンに対し、32Ｐ標識ヒト遺伝子１をプローブとして用い、ハイブリダイゼーションバッファー（ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer, Ambion社製）中で、４２℃、２２時間ハイブリダイズさせた後、ＬＳバッファー（組成：２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）又はＨＳバッファー（組成：０．１％ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）を用いて洗浄した。ハイブリダイズ像の検出は、イメージアナライザー（Fuji社製）を用いて行った。 [Example 3] Expression tissue of human gene 1 A nylon buffer blotted with polyA RNA prepared from human tissues was subjected to hybridization buffer (ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer, manufactured by Ambion) using 32 P-labeled human gene 1 as a probe. ), And then washed with LS buffer (composition: 2XSSC, 0.1% SDS) or HS buffer (composition: 0.1% SSC, 0.1% SDS). did. Hybridized images were detected using an image analyzer (Fuji).

その結果、図２に示すように、脳、腎臓、肺、筋肉、胎盤、小腸、精巣、副腎、唾液腺、脾臓、胃等の組織でヒト遺伝子１の発現が確認された。   As a result, as shown in FIG. 2, the expression of human gene 1 was confirmed in tissues such as brain, kidney, lung, muscle, placenta, small intestine, testis, adrenal gland, salivary gland, spleen, and stomach.

〔実施例４〕ＧＦＰ融合ヒト遺伝子１産物の細胞内での存在状態の観察
哺乳動物細胞内でＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）のＣ末端にヒト遺伝子１産物が融合したタンパク質が産生されるように設計した遺伝子発現ベクター１を構築した（図８）。すなわち、ＧＦＰコード領域ｃＤＮＡの３’末端部位にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位を付加し、ＣＭＶプロモーターにより哺乳動物細胞内でＧＦＰ融合タンパク質の発現が誘導されるように設計した基本ＧＦＰベクターを、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで制限消化した。ヒト遺伝子１ｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＮｏｔＩ部位を導入し、両酵素で切断した遺伝子断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した前述の基本ＧＦＰベクターにライゲートし、大腸菌に遺伝子導入し、遺伝子発現ベクター１をクローニングした。 [Example 4] Observation of intracellular presence of GFP-fused human gene 1 product Designed to produce a protein in which the human gene 1 product is fused to the C-terminus of GFP (Green Fluorescent Protein) in mammalian cells. The constructed gene expression vector 1 was constructed (FIG. 8). That is, a basic GFP vector designed by adding an EcoRI-NotI site to the 3 ′ end site of the GFP coding region cDNA and inducing the expression of a GFP fusion protein in a mammalian cell by a CMV promoter is expressed by EcoRI and NotI. Limited digestion. An EcoRI site was introduced into the 5 ′ end of human cDNA 1 cDNA, a NotI site was introduced into the 3 ′ end, and the gene fragment cleaved with both enzymes was ligated to the basic GFP vector digested with EcoRI and NotI, and introduced into E. coli. Gene expression vector 1 was cloned.

Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、遺伝子ベクター１をＣＯＳ−７細胞内に遺伝子導入した。すなわち、１μｇの遺伝子ベクター１と３μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を含む無血清培地１００μｌを混和し、室温下で１５分間静置した後、ＣＯＳ−７を２４時間前にハーベストした細胞培養シャーレに滴下、混和することにより遺伝子導入した。遺伝子導入されたＣＯＳ−７細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で、２４時間培養した。細胞核を染色するため、培地中に１．５μｇ／ｍｌ濃度となるようにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を加え、１０分間３７℃でインキュベートした後、ＰＢＳで４回洗浄した。蛍光顕微鏡によりＣＯＳ−７細胞内でのＧＦＰ融合ヒト遺伝子１産物の局在を観察した。その結果、図３に示すように、ＧＦＰ融合ヒト遺伝子１産物は、ＣＯＳ−７細胞内で繊維状又は小胞状の構造を呈することが判明した。 Gene vector 1 was introduced into COS-7 cells using Fugene 6 (Roche). That is, 100 μl of serum-free medium containing 1 μg of gene vector 1 and 3 μl of Fugene 6 (Roche) was mixed, allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then dropped into a cell culture dish harvested 24 hours ago with COS-7. The gene was introduced by mixing. The transfected COS-7 cells were cultured for 24 hours in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C. In order to stain cell nuclei, Hoechst 33342 was added to the medium to a concentration of 1.5 μg / ml, incubated at 37 ° C. for 10 minutes, and then washed 4 times with PBS. The localization of the GFP-fused human gene 1 product in COS-7 cells was observed with a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 3, it was found that the GFP-fused human gene 1 product exhibits a fibrous or vesicular structure in COS-7 cells.

〔実施例５〕免疫共沈法によるヒト遺伝子１産物同士の相互作用の検出
ヒト遺伝子１産物のＮ末端にＦＬＡＧタグ又はＨＡタグが融合したタンパク質を哺乳動物細胞内で発現できる遺伝子発現ベクターを構築した（図９，図１０）。すなわち、ＦＬＡＧタグｃＤＮＡの３’末端部位にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位を付加し、ＣＭＶプロモーターにより哺乳動物細胞内でＧＦＰ融合タンパク質の発現が誘導されるように設計した基本ＦＬＡＧタグベクターを、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで制限消化した。ヒト遺伝子１ｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＮｏｔＩ部位を導入した遺伝子断片をＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ消化した基本ＧＦＰベクターにライゲートし、大腸菌に遺伝子導入し、ＦＬＡＧ−ヒト遺伝子１ベクターをクローニングした。ＨＡタグベクターも同様に作製した。 [Example 5] Detection of interaction between human gene 1 products by co-immunoprecipitation method Construction of a gene expression vector capable of expressing a protein in which a FLAG tag or HA tag is fused to the N-terminus of a human gene 1 product in mammalian cells (FIGS. 9 and 10). That is, a basic FLAG tag vector designed to add an EcoRI-NotI site to the 3 ′ end site of the FLAG tag cDNA and induce expression of a GFP fusion protein in a mammalian cell by a CMV promoter is called EcoRI and NotI. Limited digestion. A gene fragment in which an EcoRI site was introduced at the 5 ′ end of the human gene 1 cDNA and a NotI site at the 3 ′ end was ligated to an EcoRI-NotI digested basic GFP vector, introduced into Escherichia coli, and the FLAG-human gene 1 vector was cloned. . An HA tag vector was prepared in the same manner.

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、遺伝子導入した。２日間培養後、細胞溶解液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，２２５ｍＭ ＮａＣｌ，０．２％ＮＰ−４０，ｐＨ７．４）を培養プレートに加え、細胞抽出液を調製した。抗ＦＬＡＧ抗体を加え、４℃で６０分間反転混和し、さらにプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを細胞抽出液に加え、４℃で６０分間反転混和し、遠心分離後、細胞溶解液でペレットを３回洗浄し、２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）で１回洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質を分離した。泳動終了後、ニトロセルロースメンブレンにタンパク質を転写し、マウス抗ＨＡ（ヘマグルチニン）抗体（Ｒｏｃｈｅ社）を一次抗体、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（アマーシャム―ファルマシア社）を２次抗体として用いて、ＨＡタグタンパク質の存在を検出した。   Genes were introduced into HEK293T cells using Fugene 6 (Roche). After culturing for 2 days, a cell lysate (25 mM Tris-Cl, 225 mM NaCl, 0.2% NP-40, pH 7.4) was added to the culture plate to prepare a cell extract. Add anti-FLAG antibody, mix by inversion at 4 ° C for 60 minutes, add protein G-Sepharose to the cell extract, mix by inversion at 4 ° C for 60 minutes, centrifuge and wash the pellet 3 times with cell lysate. After washing once with 20 mM Tris-Cl (pH 7.4), the protein was separated by SDS-PAGE. After completion of the electrophoresis, the protein is transferred to a nitrocellulose membrane, and a mouse anti-HA (hemagglutinin) antibody (Roche) is used as the primary antibody and a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (Amersham-Pharmacia) is used as the secondary antibody. The presence of the tag protein was detected.

その結果、図４に示すように、ＦＬＡＧタグ−ヒト遺伝子１産物（レーン１）又はＨＡタグ−ヒト遺伝子１産物（レーン３）を単独で発現させた場合、ＨＡ−ヒト遺伝子１産物は検出されなかった。しかし、ＦＬＡＧタグ−ヒト遺伝子１産物及びＨＡタグ−ヒト遺伝子１産物（レーン２）を同時に発現させた場合、ＨＡタグ−ヒト遺伝子１産物が検出された。このことは、ＦＬＡＧタグ−ヒト遺伝子１産物及びＨＡタグ−ヒト遺伝子１産物が親和性を持ち、ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降複合体にＨＡタグ−ヒト遺伝子１産物が含まれることを示している。   As a result, as shown in FIG. 4, when the FLAG tag-human gene 1 product (lane 1) or the HA tag-human gene 1 product (lane 3) is expressed alone, the HA-human gene 1 product is detected. There wasn't. However, when the FLAG tag-human gene 1 product and the HA tag-human gene 1 product (lane 2) were expressed simultaneously, the HA tag-human gene 1 product was detected. This indicates that the FLAG tag-human gene 1 product and the HA tag-human gene 1 product have affinity, and the HA tag-human gene 1 product is contained in the immunoprecipitation complex by the FLAG antibody.

〔実施例６〕哺乳動物細胞ツーハイブリッド法によるヒト遺伝子１産物同士の相互作用の検出
ヒト遺伝子１産物が酵母由来ＧＡＬ４ＤＮＡ結合タンパク質のＣ末領域に融合して発現できるように設計した哺乳動物細胞用遺伝子発現ベクター（ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１ベクター，図１１）、及びヒト遺伝子１産物がＨｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ由来ＶＰ１６遺伝子発現活性化タンパク質のＣ末領域に融合して発現できるように設計した哺乳動物細胞用遺伝子発現ベクター（ｐＶＰ１６−ヒト遺伝子１ベクター，図１２）を構築した。すなわち、ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１ベクターは、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合結合領域ｃＤＮＡの３’末端部位にＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位を付加し、Ｅａｒｌｙ ＳＶ４０プロモーターにより哺乳動物細胞内でＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域融合タンパク質の発現が誘導されるように設計した基本ＧＡＬ４ベクターを、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで制限消化した。ヒト遺伝子１ｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＸｈｏＩ部位を導入し両酵素で切断した遺伝子断片をＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ消化した基本ＧＡＬ４ベクターにライゲートし、大腸菌に遺伝子導入し、ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１ベクターをクローニングした。ｐＶＰ１６−ヒト遺伝子１ベクターは、ＶＰ１６転写活性化領域ｃＤＮＡの３’末端部位にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位を付加し、ＣＭＶプロモーターにより哺乳動物細胞内でＶＰ１６転写活性化領域融合タンパク質の発現が誘導されるように設計した基本ＶＰ１６ベクターを、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで制限消化した。ヒト遺伝子１ｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＮｏｔＩ部位を導入し両酵素で切断した遺伝子断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した基本ＶＰ１６ベクターにライゲートし、大腸菌に遺伝子導入し、ｐＶＰ１６−ヒト遺伝子１ベクターをクローニングした。これらのベクターをＣＯＳ−７細胞に遺伝子導入した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で、２４時間培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ルシフェラーゼ活性測定用細胞溶解液（２５ｍＭ ＴＡＥ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭ ＤＴＴ）を加え、ルシフェリン、ＡＴＰ存在下でルミノメーターにより、細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定した。 [Example 6] Detection of interaction between human gene 1 products by the mammalian cell two-hybrid method For mammalian cells designed so that the human gene 1 product can be expressed fused to the C-terminal region of the yeast-derived GAL4 DNA binding protein Gene expression vector (pGAL4-human gene 1 vector, FIG. 11), and gene for mammalian cells designed so that the human gene 1 product can be fused and expressed in the C-terminal region of VP16 gene expression activation protein derived from Herpes Simplex Virus An expression vector (pVP16-human gene 1 vector, FIG. 12) was constructed. That is, in the pGAL4-human gene 1 vector, an EcoRI-SalI site is added to the 3 ′ end site of the GAL4 DNA binding region cDNA so that expression of the GAL4 DNA binding region fusion protein is induced in mammalian cells by the Early SV40 promoter. The basic GAL4 vector designed in the above was digested with EcoRI and SalI. A gene fragment obtained by introducing an EcoRI site at the 5 ′ end of human cDNA 1 cDNA and an XhoI site at the 3 ′ end and cleaved with both enzymes was ligated to a basic GAL4 vector digested with EcoRI-SalI, introduced into Escherichia coli, and pGAL4-human gene One vector was cloned. In the pVP16-human gene 1 vector, an EcoRI-NotI site is added to the 3 ′ terminal site of the VP16 transcriptional activation region cDNA so that expression of the VP16 transcriptional activation region fusion protein is induced in mammalian cells by the CMV promoter. The basic VP16 vector designed in the above was digested with EcoRI and NotI. A gene fragment obtained by introducing an EcoRI site at the 5 ′ end of human cDNA 1 cDNA and a NotI site at the 3 ′ end and cleaved with both enzymes was ligated to a basic VP16 vector digested with EcoRI and NotI, introduced into E. coli, and pVP16-human The gene 1 vector was cloned. These vectors were transfected into COS-7 cells. After culturing at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours, the cells were washed with PBS, and a cell lysate for measuring luciferase activity (25 mM TAE, 1 mM EDTA, 10% Glycerol, 1% Triton X-100, 2 mM DTT) The luciferase activity in the cell extract was measured with a luminometer in the presence of luciferin and ATP.

その結果、図５に示すように、ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１及びｐＶＰ１６−ヒト遺伝子１を同時に遺伝子導入した場合には、ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１及び遺伝子１領域をもたないｐＶＰ１６を同時に遺伝子導入させた場合に比べて、９．３倍のルシフェラーゼ活性が検出された。この結果から、ヒト遺伝子１産物同士の親和性相互作用が示唆された。   As a result, as shown in FIG. 5, when pGAL4-human gene 1 and pVP16-human gene 1 were introduced simultaneously, pGAL4-human gene 1 and pVP16 having no gene 1 region were simultaneously introduced. Compared to the case, 9.3-fold luciferase activity was detected. This result suggested an affinity interaction between human gene 1 products.

〔実施例７〕哺乳動物細胞ツーハイブリッド法によるヒト遺伝子１産物及びヒトＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子産物間の相互作用の検出
ヒト遺伝子１産物が酵母由来ＧＡＬ４ＤＮＡ結合タンパク質のＣ末領域に融合して発現できるように設計した哺乳動物細胞用遺伝子発現ベクター（ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１，図１１）、及びヒトＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子産物がＨｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ由来ＶＰ１６遺伝子発現活性化タンパク質のＣ末領域に融合して発現できるように設計した哺乳動物細胞用遺伝子発現ベクター（ｐＶＰ１６−Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１，１３）を構築した。すなわち、ｐＶＰ１６−Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１ベクターは、ＶＰ１６転写活性化領域ｃＤＮＡの３’末端部位にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位を付加し、ＣＭＶプロモーターにより哺乳動物細胞内でＶＰ１６転写活性化領域融合タンパク質の発現が誘導されるように設計した基本ＶＰ１６ベクターを、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで制限消化した。ヒトＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１ｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＮｏｔＩ部位を導入し両酵素で切断した遺伝子断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した基本ＶＰ１６ベクターにライゲートし、大腸菌に遺伝子導入し、ｐＶＰ１６−ヒトＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１ベクターをクローニングした。なお、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子の塩基配列を配列番号５に、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子産物のアミノ酸配列を配列番号６に示す。これらのベクターを、ＣＯＳ−７細胞に遺伝子導入した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で、２４時間培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ルシフェラーゼ活性測定用細胞溶解液（２５ｍＭ ＴＡＥ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭ ＤＴＴ）を加え、ルシフェリン、ＡＴＰ存在下でルミノメーターにより、細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定した。 [Example 7] Detection of interaction between human gene 1 product and human Bax inhibitor-1 gene product by mammalian cell two-hybrid method Human gene 1 product can be expressed fused to the C-terminal region of GAL4 DNA binding protein derived from yeast The gene expression vector for mammalian cells (pGAL4-human gene 1, FIG. 11) designed as described above, and the human Bax inhibitor-1 gene product are fused and expressed in the C-terminal region of the VP16 gene expression activation protein derived from Herpes Simplex Virus A gene expression vector for mammalian cells (pVP16-Bax inhibitor-1, 13) designed to be able to be constructed was constructed. That is, in the pVP16-Bax inhibitor-1 vector, an EcoRI-NotI site is added to the 3 ′ end site of the VP16 transcriptional activation region cDNA, and expression of the VP16 transcriptional activation region fusion protein is induced in mammalian cells by the CMV promoter. The basic VP16 vector designed as described above was restriction digested with EcoRI and NotI. A gene fragment obtained by introducing an EcoRI site at the 5 ′ end of human Bax inhibitor-1 cDNA and a NotI site at the 3 ′ end and cleaved with both enzymes was ligated to a basic VP16 vector digested with EcoRI and NotI, introduced into Escherichia coli, and introduced into pVP16. -The human Bax inhibitor-1 vector was cloned. The base sequence of the Bax inhibitor-1 gene is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the Bax inhibitor-1 gene product is shown in SEQ ID NO: 6. These vectors were transfected into COS-7 cells. After culturing at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours, the cells were washed with PBS, and a cell lysate for measuring luciferase activity (25 mM TAE, 1 mM EDTA, 10% Glycerol, 1% Triton X-100, 2 mM DTT) The luciferase activity in the cell extract was measured with a luminometer in the presence of luciferin and ATP.

その結果、図６に示すように、ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１及びｐＶＰ１６−Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１を同時に遺伝子導入した場合、ｐＧＡＬ４及びｐＶＰ１６を同時に遺伝子導入させた場合に比べて、１１．３倍のルシフェラーゼ活性が検出された。この結果から、ヒト遺伝子１産物及びＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子産物の親和性相互作用が示唆される。   As a result, as shown in FIG. 6, when pGAL4-human gene 1 and pVP16-Bax inhibitor-1 were introduced simultaneously, 11.3 times the luciferase activity compared to the case where pGAL4 and pVP16 were introduced simultaneously. Was detected. This result suggests an affinity interaction between the human gene 1 product and the Bax inhibitor-1 gene product.

〔実施例８〕抗遺伝子１抗体を用いたウェスタンブロッティングによるヒト遺伝子１産物の検出
ヒト遺伝子１産物のうち第３０から４９アミノ酸部分（ＮＨ２−ＧＥＡＧＲＡＰＤＳＤＧＧＳＤＡＤＳＥＶＧ−ＣＯＯＨ）をペプチド合成し、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）をキャリアーとし、アジュバンドとともにウサギ（２羽）に筋肉及び皮下注射した。さらに２週後、５週後、１１週後、１７週後にもペプチド、アジュバンド混合液を注射し、抗血清を最初の抗原注射から２５週後に調製した。ＦＬＡＧタグ−ヒト遺伝子１産物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過的に発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動でタンパク質を分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンをブロッキングバッファー（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０及び５％脱脂粉乳含有ＰＢＳ）で室温下１時間ブロックし、１０００倍希釈した抗血清を含む新たなブロッキングバッファー中で、４℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回メンブレンを洗浄した後、ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を含む、ブロッキングバッファー中で室温下１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回メンブレンを洗浄した後、ケミルミネッセンス法（例えば、ＷｅｓｔＰｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて、抗体特異的バンドを検出した。 [Example 8] Detection of human gene 1 product by Western blotting using anti-gene 1 antibody The 30th to 49th amino acid portion (NH 2 -GEAGRAPSDDGSDADSEVG-COOH) of the human gene 1 product was peptide-synthesized, and KLH (Keyhole Limitet) was synthesized. Hemocyanin) was used as a carrier, and rabbits (2) were injected intramuscularly and subcutaneously together with adjuvant. Further, after 2 weeks, 5 weeks, 11 weeks, and 17 weeks, the peptide and adjuvant mixture were injected, and antiserum was prepared 25 weeks after the first antigen injection. The FLAG tag-human gene 1 product was transiently expressed in HEK293T cells, treated with SDS-PAGE sample buffer, proteins were separated by SDS-PAGE electrophoresis, and transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane was blocked with blocking buffer (PBS containing 0.1% Tween 20 and 5% nonfat dry milk) for 1 hour at room temperature, and incubated at 4 ° C. for 2 hours in a new blocking buffer containing antiserum diluted 1000 times. The membrane was washed three times with PBST (PBS containing 0.1% Tween 20), and then incubated at room temperature for 1 hour in a blocking buffer containing a horseradish peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody. After washing the membrane three times with PBST (PBS containing 0.1% Tween 20), an antibody-specific band was detected using a chemiluminescence method (for example, WestPico Chemiluminescent Substrate, PIERCE).

その結果、図７に示すように、ヒト遺伝子１を強制発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出タンパク質レーンに抗原特異的バンドが検出された。   As a result, as shown in FIG. 7, an antigen-specific band was detected in the HEK293T cell extract protein lane in which human gene 1 was forcibly expressed.

〔実施例９〕
（１）マウス遺伝子１ジーンターゲッティングベクターの構築
マウス遺伝子１の第１エクソン及び第２エクソンの一部を含む５'側のゲノムＤＮＡと、第２エクソンの一部、第３及び第４エクソンを含む３'側のゲノムＤＮＡとを、末端に制限酵素部位を付加した形で、ＰＣＲ増幅した。すなわち、第１エクソン及び第２エクソンの一部を含む５'側のゲノムＤＮＡは、５’プライマー（5'-gactcgtcctcttcagtgctggatgtaggcgtg-3’）と、SalI部位を付加して設計した３'プライマー（5'-tcgtcgacacagccacatgcttggtagtccagcggc-3'）各１５ｐｍｏｌｅ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Expand Long Template PCR System, Roche社製）５ユニット、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）、マウス***由来ｃＤＮＡ０．５ｎｇ及び１．７５ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する増幅用バッファー中で、９４℃で１０分間処理の後、９４℃で３０秒、６５℃で４５秒、６８℃で１５分の処理を２６サイクル繰り返し、さらに６８℃１５分の処理を子なった。第２エクソンの一部、第３及び第４エクソンを含む３'側のゲノムＤＮＡは、ClaI部位を付加して設計した５'プライマー（5'-catcgatttaggttattgttcatgagcgagtgcctg-3'）と、３'プライマー（5'-caggtgctgtcctggcacggagagggaggtc-3’）各１５ｐｍｏｌｅ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Expand Long Template PCR System, Roche社製）５ユニット、２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）、マウス***由来ｃＤＮＡ ０．５ｎｇ及び１．７５ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する増幅用バッファー中で、９４℃で１０分間処理の後、９４℃で３０秒、６２℃で４５秒、６８℃で２０分の処理を２６サイクル繰り返し、さらに６８℃２０分の処理を行った。ＧＦＰ−Ｎｅｏ遺伝子をＧＦＰｃＤＮＡとマウス遺伝子１の第２エクソンのタンパク質コード領域とインフレームになるよう接続し、Ｎｅｏ遺伝子の３’側には、ストップコドンを導入したマウス遺伝子１ジーンターゲッティングベクターを構築した（図１４）。 Example 9
(1) Construction of mouse gene 1 gene targeting vector 5 'genomic DNA containing part of the first and second exons of mouse gene 1, part of the second exon, part 3 and part 4 PCR amplification was performed on the 3 ′ genomic DNA with a restriction enzyme site added to the end. That is, the 5 ′ genomic DNA containing part of the first exon and the second exon is composed of a 5 ′ primer (5′-gactcgtcctcttcagtgctggatgtaggcgtg-3 ′) and a 3 ′ primer (5 ′ designed by adding a SalI site). -tcgtcgacacagccacatgcttggtagtccagcggc-3 ') 15 pmole each, 5 units of heat-resistant DNA polymerase (Expand Long Template PCR System, manufactured by Roche), dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), mouse sperm-derived cDNA 0.5 ng and 1.75 mM magnesium chloride Treatment at 94 ° C. for 10 minutes, followed by 26 cycles of treatment at 94 ° C. for 30 seconds, 65 ° C. for 45 seconds and 68 ° C. for 15 minutes, and further at 68 ° C. for 15 minutes. I became a child. The 3 ′ genomic DNA containing a part of the second exon, the third and fourth exons, was designed by adding a ClaI site (5′-catcgatttaggttattgttcatgagcgagtgcctg-3 ′) and 3 ′ primer (5 '-caggtgctgtcctggcacggagagggaggtc-3') 15 pmole each, 5 units of heat-resistant DNA polymerase (Expand Long Template PCR System, manufactured by Roche), 200 μM dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), mouse sperm-derived cDNA 0.5 ng and 1. In an amplification buffer containing 75 mM magnesium chloride, after treatment at 94 ° C. for 10 minutes, treatment at 94 ° C. for 30 seconds, 62 ° C. for 45 seconds, and 68 ° C. for 20 minutes is repeated 26 cycles, and further at 68 ° C. for 20 minutes. Was processed. The GFP-Neo gene was connected in-frame with the GFP cDNA and the protein coding region of the second exon of mouse gene 1, and a mouse gene 1 gene targeting vector into which a stop codon was introduced was constructed 3 ′ of the Neo gene. (FIG. 14).

（２）遺伝子１ノックアウトマウスの作製
マウス遺伝子１ジーンターゲッティングベクターを制限酵素ＮｏｔＩ消化により、２本鎖状にし、電気穿孔法によりマウスＥＳ細胞に導入した。同細胞を３７℃、５％ＣＯ２で選択薬剤であるＧ４１８及びガンシクロビル存在下で培養した。耐性細胞コロニーからゲノミックＤＮＡを調製し、ＰＣＲ及びサザンハイブリダイゼーションにより相同組み換え陽性ＥＳ細胞を選抜した。陽性ＥＳ細胞を胚盤胞にマイクロインジェクション法により導入後、偽妊娠雌マウスに移植した。産生したキメラマウスを野生型マウスと交配し、アグーチ毛色をマーカーとして、得られた産児のゲノタイピングを行い、ヘテロに遺伝子１を欠損したマウスを作出した。 (2) Preparation of gene 1 knockout mouse Mouse gene 1 gene targeting vector was made into double strands by digestion with restriction enzyme NotI and introduced into mouse ES cells by electroporation. The cells were cultured at 37 ° C. in 5% CO 2 in the presence of selective drugs G418 and ganciclovir. Genomic DNA was prepared from resistant cell colonies, and homologous recombination positive ES cells were selected by PCR and Southern hybridization. Positive ES cells were introduced into blastocysts by microinjection and then transplanted into pseudopregnant female mice. The produced chimeric mouse was bred with a wild-type mouse, and the resulting baby was genotyped using Agouti hair color as a marker to produce a heterozygous mouse deficient in gene 1.

（３）遺伝子１ヘテロ欠損マウス間交配より得られた産児及び胎児のゲノタイプ解析
遺伝子１のヘテロ欠損雌マウスと遺伝子１のヘテロ欠損雄マウスを交配し、得られた産児のゲノタイピングを行った。また、遺伝子１のヘテロ欠損雌マウスと遺伝子１のヘテロ欠損雄マウスを交配し、一定時期経過後、妊娠雌マウスを解剖し、胎児又は羊膜よりゲノムＤＮＡを調製し、ゲノタイピングを行った。
その結果、表１に示すように、遺伝子１ヘテロ欠損マウス間交配により産生した産児のゲノタイプは、野生型又はヘテロ欠損型で、ホモ欠損型は得られなかった。また、表２に示すように、遺伝子１ヘテロ欠損マウス間交配により得られた受精１２．５日後、９．５日後、８．５日後の各胎児のゲノタイプは、野生型又はヘテロ欠損型で、ホモ欠損型は得られなかった。これらの結果から、遺伝子１ホモ欠損型の胎児は受精８．５日後以前の発生段階で致死していると考えられる。 (3) Genotype analysis of infants and fetuses obtained by mating between gene 1 hetero-deficient mice Gene 1 hetero-deficient female mice and gene 1 hetero-deficient male mice were mated, and the resulting infants were genotyped. In addition, heterozygous female mice with gene 1 and male mice with heterozygous genes for gene 1 were mated, and after a certain period of time, pregnant female mice were dissected, genomic DNA was prepared from fetuses or amnion, and genotyping was performed.
As a result, as shown in Table 1, the neonatal genotype produced by crossing between gene 1 hetero-deficient mice was wild type or hetero-deficient, and no homo-deficient type was obtained. Moreover, as shown in Table 2, the genotype of each fetus after 12.5 days, 9.5 days, and 8.5 days after fertilization obtained by crossing between gene 1 heterodeficient mice is wild type or heterodeficient type, A homo-deficient type was not obtained. From these results, it is considered that the fetus having a homozygous gene 1 is dead at the developmental stage before 8.5 days after fertilization.

ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１のゲノム構造を示す図である。It is a figure which shows the genomic structure of the human gene 1 and the mouse gene 1. 脳、腎臓、肺、筋肉、胎盤、小腸、精巣、副腎、唾液腺、脾臓、胃等の組織でヒト遺伝子１の発現を示す図である。It is a figure which shows expression of the human gene 1 in tissues, such as a brain, a kidney, a lung, a muscle, a placenta, a small intestine, a testis, an adrenal gland, a salivary gland, a spleen, a stomach. 蛍光顕微鏡によってＣＯＳ−７細胞内でのＧＦＰ融合ヒト遺伝子１産物の局在を観察した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having observed the localization of the GFP fusion human gene 1 product in a COS-7 cell with a fluorescence microscope. 免疫共沈法によるヒト遺伝子１産物同士の相互作用の検出結果を示す図である。It is a figure which shows the detection result of the interaction between human gene 1 products by the co-immunoprecipitation method. 哺乳動物細胞ツーハイブリッド法によるヒト遺伝子１産物同士の相互作用の検出結果を示す図である。It is a figure which shows the detection result of the interaction between human gene 1 products by the mammalian cell two-hybrid method. 哺乳動物細胞ツーハイブリッド法によるヒト遺伝子１産物及びヒトＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子産物間の相互作用の検出結果を示す図である。It is a figure which shows the detection result of the interaction between the human gene 1 product and human Bax inhibitor-1 gene product by the mammalian cell two-hybrid method. 抗遺伝子１抗体を用いたウェスタンブロッティングによるヒト遺伝子１産物の検出結果を示す図である。It is a figure which shows the detection result of the human gene 1 product by the western blotting using an anti-gene 1 antibody. ＧＦＰ−ヒト遺伝子１ベクターの構成図である。It is a block diagram of a GFP-human gene 1 vector. ＦＬＡＧ−ヒト遺伝子１ベクターの構成図である。It is a block diagram of a FLAG-human gene 1 vector. ＨＡ−ヒト遺伝子１ベクターの構成図である。It is a block diagram of HA-human gene 1 vector. ＧＡＬ４−ヒト遺伝子１ベクターの構成図である。It is a block diagram of GAL4-human gene 1 vector. ＶＰ１６−ヒト遺伝子１ベクターの構成図である。It is a block diagram of VP16-human gene 1 vector. ＶＰ１６−ヒトＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子ベクターの構成図である。It is a block diagram of VP16-human Bax inhibitor-1 gene vector. マウス遺伝子１ジーンターゲッティングベクターの構成図である。It is a block diagram of a mouse gene 1 gene targeting vector.

Claims (10)

下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、個体発生に必須のタンパク質 The protein shown in the following (a) or (b).
(A) a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 (b) an amino acid sequence comprising one or more amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, and ontogeny Essential proteins 下記（ａ）又は（ｃ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記（ａ）に示すタンパク質と親和性相互作用を示すタンパク質 The protein shown in the following (a) or (c).
(A) a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 (c) consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, Protein showing affinity interaction with the protein shown in a) 下記（ａ）又は（ｄ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示すタンパク質 The protein shown in the following (a) or (d).
(A) a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 (d) an amino acid sequence comprising one or more amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4, and a Bax inhibitor -1 and protein showing affinity interaction 請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。   The gene which codes the protein in any one of Claims 1-3. 下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡを含む請求項４記載の遺伝子。
（ｅ）配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号３記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）前記（ｅ）に示すＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ The gene according to claim 4, comprising the DNA shown in (e) or (f) below.
(E) DNA consisting of the 19th to 1452th base sequence in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or DNA consisting of the 46th to 1479th base sequence in the base sequence described in SEQ ID NO: 3
(F) DNA that hybridizes under stringent conditions to DNA complementary to the DNA shown in (e) above 請求項４又は５記載の遺伝子を含む組換えベクター。   A recombinant vector comprising the gene according to claim 4 or 5. 請求項６記載の組換えベクターを含む形質転換体。   A transformant comprising the recombinant vector according to claim 6. 請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片。   An antibody or fragment thereof capable of reacting with the protein according to any one of claims 1 to 3. 試験物質が、請求項２記載のタンパク質同士の親和性相互作用を抑制又は促進できる否かを判別し、前記親和性相互作用を抑制又は促進できる試験物質を個体発生に影響を与える物質としてスクリーニングする工程を含む、個体発生に影響を与える物質のスクリーニング方法。   It is determined whether or not the test substance can suppress or promote the affinity interaction between the proteins according to claim 2, and the test substance capable of suppressing or promoting the affinity interaction is screened as a substance that affects ontogeny. A method for screening a substance that affects ontogeny, comprising a step. 試験物質が、請求項３記載のタンパク質とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制又は促進できる否かを判別し、前記親和性相互作用を抑制又は促進できる試験物質を個体発生に影響を与える物質としてスクリーニングする工程を含む、個体発生に影響を与える物質のスクリーニング方法。
It is determined whether or not the test substance can suppress or promote the affinity interaction between the protein according to claim 3 and Bax inhibitor-1, and the test substance capable of suppressing or promoting the affinity interaction affects the ontogeny. A method for screening a substance that affects ontogeny, comprising a step of screening as a substance to be given.
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