JP2007119382A - タンパク質相互作用、及び、抗がん剤とそのスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】プロテアソームの形成機序を解明すること、その機序に基づいた全く新規な抗がん剤を提供すること。
【解決手段】本発明者らは、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３とが複合体を形成すること、プロテアソームとＤＳＣＲ、ＨＣＣＡ３、及び、ｈＵＭＰ１とがそれぞれ相互作用すること、などを新規に見出した。これらの新知見は、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３とが複合体を形成し、その複合体がプロテアソームのαサブユニットと結合してαリングを形成し、ｈＵＭＰ１がプロテアソームのβサブユニットと結合してハーフプロテアソームを二量体化し、２０Ｓプロテアソームを形成するという、一連のプロテアソーム形成機序を示唆する。これらの新知見は、新規な作用機序に基づく抗がん剤又はそのスクリーニング方法などに応用できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、タンパク質相互作用、及び、抗がん剤とそのスクリーニング方法に関する。より詳細には、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との相互作用、プロテアソームとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用、プロテアソームとｈＵｍｐ１との相互作用、それらの相互作用を阻害又は抑制する物質を含有する抗がん剤、ＤＳＣＲ２、ＨＣＣＡ３、若しくはｈＵＭＰ１の発現を抑制する物質を含有する抗がん剤、及び、抗がん剤のスクリーニング方法、などに関する。

細胞内における主要なタンパク質分解系として、ユビキチン−プロテアソームシステムが知られている。このシステムは、細胞内における選択的なタンパク質分解を担う。ユビキチンは、分解するタンパク質に結合し、ポリユビキチン鎖を形成する（ポリユビキチン化修飾）。プロテアソームは、ポリユビキチン化修飾されたタンパク質を特異的に分解する。

近年、細胞周期・アポトーシス・代謝調節・免疫応答・シグナル伝達・転写制御・ストレス応答・ＤＮＡ修復など、生命科学のあらゆる領域において、このシステムが中心的な役割を果たしていることが、明らかになりつつある。また、近年、プロテアソームの機能阻害ががん治療に有用である可能性があることが、各論文で示されている（例えば、非特許文献１〜７参照）。

以下、本発明に関わりのあるタンパク質として、プロテアソーム、ＤＳＣＲ２、ＨＣＣＡ３、並びにｈＵＭＰ１について、説明する。

プロテアソームは、分子量２５０万で、約１００個のサブユニットから構成される細胞内タンパク質分解装置である。活性型の２６Ｓプロテアソームは、２０Ｓプロテアソームの両端に、１９Ｓプロテアソームが会合した分子複合体である。２０Ｓプロテアソームは、タンパク質分解の活性部位であり、１９Ｓプロテアソームは、２０Ｓプロテアソームの制御を行う。２０Ｓプロテアソームは、αリングとβリングがαββαの順で会合した円筒型粒子のプロテアーゼ複合体である。αリングは、リング状に集まった７種類のサブユニット（α１〜α７）から構成される。同様に、βリングは、リング状に集まった７種類のサブユニット（β１〜β７）から構成される。なお、αリングとβリングが一つずつ会合した状態（２０Ｓプロテアソームの半分の状態）を、ハーフプロテアソームという。

ＤＳＣＲ２（Ｄｏｗｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｇｉｏｎ Ｇｅｎｅ ２）は、Ｃ２１ＬＲＰ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２１ Ｌｅｕｃｉｎｅ−Ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれるタンパク質である。その遺伝子は、ダウン症に関連する遺伝子として同定された（非特許文献７参照）。

ＨＣＣＡ３（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ３）は、その遺伝子が肝臓がん関連遺伝子として同定された（非特許文献８）。

ＵＭＰ１（Ｕｂｉｑｉｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）は、分子シャペロンとしてプロテアソーム形成にかかわる酵素であり、酵母では、ハーフプロテアソームを重合させ、２０Ｓプロテアソームの形成を促進することが知られている。また、ヒトなどにおけるＵＭＰ１のホモログ（ｈＵＭＰ１）は、２０Ｓプロテアソームと相互作用することが報告されている（非特許文献９）。
Hideshima T. et al, "Small-molecule inhibition of proteasome and aggresome function induces synergistic antitumor activity in multiple myeloma" PNAS vol.102 no.24 8567-8572(2005) Boccadoro M. et al, "Preclinical evalution of the proteasome inhibitor bortezomib in cancer therapy" Cancer Cell International 2005, 5:18 Pajonk F. et al, "The proteasome inhibitor MG-132 sensitizes PC-3 prostate cancer cells to ionizing radiation by a DNA-PK-independent mechanism" BMC Cancer 2005, 5:76 Fernandez Y. et al, "Differential Regulation of Noxa in Normal Melanocytes and Melanoma Cells by Proteasome Inhibition: Therapeutic Implications" Cancer Res 2005; 65 (14). July 15, 2005 Ogiso Y. et al, "Protesome Inhibition Circumvents Solid Tumor Resistance to Topoisomerase II-directed Drugs" CANCER RESEARCH 60, 2429-2434, May 1, 2000 HONG-DUCK KIM et al, "Glucose-Regulated Stresses Cause Degration of DNA Topoisomerase IIα by Inducing Nuclear Proteasome During G1 Cell Cycle Arrest in Cancer cells" JOURNAL OF PHYSIOLOGY 180:97-104 (1999) Vidal-Taboada JM. et al, "Identification and characterization of a new gene from human chromosome 21 between markers D21S343 and D21S268 encoding a leucine-rich protein" Biochem Biophys Res Commun. 250(3): 547-54 (1998) Wang ZX et al, "Expression of liver cancer associated gene HCCA3" World J Gastroenterol. 7 (6): 821-5 (2001) Burri L. et al, "Identification and characterization of a mammalian protein interacting with 20S proteasome precursors" 10348-10353 PNAS vol.97 no.19 (2000)

従来、ハーフプロテアソームが自立的に形成されると漠然と推測されているのみで、現在に至るまで、ハーフプロテアソーム形成がどのような機序で行われているか、全く知られていなかった。

一方、上述の通り、プロテアソームの機能阻害ががん治療に有用である可能性があることが示唆されており、ハーフプロテアソームの形成機序は、新たな抗がん剤の標的となる可能性がある。

そこで、本発明は、プロテアソームの形成機序を解明すること、その機序に基づいた全く新規な抗がん剤を提供すること、などを主な目的とする。

本発明者らは、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３とが複合体を形成すること、プロテアソームのα５サブユニット及び／又はα７サブユニットとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３とが相互作用することを新規に見出した。また、本発明者らは、ＵＭＰ１のヒトにおけるホモログ（ｈＵＭＰ１）は、プロテアソームのβサブユニットと相互作用することを新規に見出した。

そこで、本発明では、まず、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との相互作用、プロテアソームのα５サブユニット及び／又はα７サブユニットとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用、及び、プロテアソームのβサブユニットとプロテアソームのβサブユニットとの相互作用を提供する。

これらの相互作用は、以下のようなプロテアソーム形成機序を示唆する。まず、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３とが複合体を形成し、プロテアソームのα５サブユニットやα７サブユニットと結合し、αリングを形成する。次に、αリングとβリングが会合してハーフプロテアソームが形成され、また、ｈＵＭＰ１がプロテアソームのβサブユニットと結合する。そして、ｈＵＭＰ１がハーフプロテアソーム同士を会合させ、２０Ｓプロテアソームを形成する。

即ち、本発明により、ハーフプロテアソームは自立的に形成されるのではなく、タンパク質相互作用に基づき、順次、各サブユニットが組み立てられて、形成される可能性が高いことが分かった。このことは、プロテアソーム形成機序解明の一助となるだけでなく、プロテアソームに関わる生理的機構や様々な疾患の発症機序などの解明にも役立つと考える。

続いて、本発明では、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質、プロテアソームとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質、プロテアソームとｈＵｍｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質、ＤＳＣＲ２、ＨＣＣＡ３、又は、ｈＵＭＰ１のいずれかの発現を抑制する物質、のいずれか又は複数を少なくとも含有する抗がん剤を提供する。

上述の通り、プロテアソームの機能阻害ががん治療に有用である可能性があることが示唆されている。本発明に係る物質は、前記各相互作用又は前記各タンパク質の発現を阻害又は抑制することにより、プロテアソームの新規形成を抑制できるため、抗がん剤として有用な可能性が高い。

なお、本発明に係る抗がん剤は、プロテアソームの働き自体を阻害又は抑制するわけではなく、プロテアソーム形成に関わるタンパク質相互作用又はそのタンパク質の発現を阻害又は抑制することにより、プロテアソームの新規形成を抑制するのみであるため、副作用が少ない可能性が高いという利点がある。

以下、本発明に係るタンパク質について、説明する。

本発明に係るＤＳＣＲ２は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはＤＳＣＲ２のアミノ酸配列と相同性を有し、ＨＣＣＡ３、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットと相互作用する領域を保持するタンパク質である。即ち、例えば、前記タンパク質のスプライシング・バリアントや、前記アミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる場合も、本発明に係るＤＳＣＲ２に包含される。

本発明に係るＨＣＣＡ３は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはＨＣＣＡ３のアミノ酸配列と相同性を有し、ＤＳＣＲ２、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットと相互作用する領域を保持するタンパク質である。即ち、例えば、前記タンパク質のスプライシング・バリアントや、前記アミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる場合も、本発明に係るＨＣＣＡ３に包含される。

本発明に係るｈＵＭＰ１は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはｈＵＭＰ１のアミノ酸配列と相同性を有し、プロテアソームのβサブユニットと相互作用する領域を保持するタンパク質である。即ち、例えば、前記タンパク質のスプライシング・バリアントや、前記アミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる場合も、本発明に係るｈＵＭＰ１に包含される。

本発明は、プロテアソーム形成機序解明の一助となる。また、新規な作用機序に基づく抗がん剤又はそのスクリーニング方法などに応用できる。

＜プロテアソーム形成機序について＞
プロテアソーム形成機序について、図１を用いて、以下説明する。

図１は、２０Ｓプロテアソームの形成機序を示した模式図である。

ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３はシャペロン分子複合体になり、７種類のαサブユニットがαリングを形成する土台を形成する。そして、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との複合体は、プロテアソームのα５サブユニットやα７サブユニットと結合し、αリングを形成する。また、この複合体は、αリングが異常な凝集体を形成することを防ぐ働きもあると予想する。

次に、αリングとβリングが会合してハーフプロテアソームが形成され、また、ｈＵＭＰ１がプロテアソームのβサブユニットと結合する。そして、ｈＵＭＰ１がハーフプロテアソーム同士を会合（二量体化）させ、２０Ｓプロテアソームを形成する。なお、二量体化の際、ｈＵＭＰ１は解離し、分解される。また、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３の複合体も、２０Ｓプロテアソーム形成後、解離し、分解される。

＜ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤について＞
本発明に係る抗がん剤として、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質、プロテアソームとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質、プロテアソームとｈＵｍｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質、のいずれか又は複数を少なくとも含有する抗がん剤が想定できる。以下、図２から図４を用いて順に説明する。

図２は、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質を示す模式図である。

ＤＳＣＲ２（符号１）は、ＨＣＣＡ３との相互作用部位１１と、プロテアソームα５サブユニット又はα７サブユニット（符号３）との相互作用部位１２を有する。ＨＣＣＡ３（符号２）は、ＤＳＣＲ２との相互作用部位２１と、プロテアソームα５サブユニット又はα７サブユニット（符号３）との相互作用部位２２を有する。そして、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３は相互作用し（符号Ａ）、複合体を形成する。また、ＤＳＣＲ２及びＨＣＣＡ３は、プロテアソームα５サブユニット又はα７サブユニットと相互作用し（符号Ｂ）、プロテアソームのαリング形成を促進する。

ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質としては、例えば、（１）ＤＳＣＲ２の立体構造中の、ＨＣＣＡ３との結合部位に対して特異的に結合する物質、（２）ＤＳＣＲ２の立体構造中の、ＨＣＣＡ３との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質、（３）ＤＳＣＲ２と結合して、前記タンパク質の立体構造を変化させる物質、（４）ＨＣＣＡ３の立体構造中の、ＤＳＣＲ２との結合部位に対して特異的に結合する物質、（５）ＨＣＣＡ３の立体構造中の、ＤＳＣＲ２との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質、（６）ＨＣＣＡ３と結合して、前記タンパク質の立体構造を変化させる物質、（７）抗ＤＳＣＲ２抗体、抗ＤＳＣＲ２アプタマー、抗ＨＣＣＡ３抗体、抗ＨＣＣＡ３アプタマー、などが想定できる。

（１）ＤＳＣＲ２の立体構造中の、ＨＣＣＡ３との結合部位に対して特異的に結合する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ１）が、ＤＳＣＲ２の立体構造中の、ＨＣＣＡ３との結合部位１１に対して特異的に結合した場合、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との複合体形成が阻害又は抑制されるため、プロテアソームのαリング形成、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（２）ＤＳＣＲ２の立体構造中の、ＨＣＣＡ３との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ２）が、ＤＳＣＲ２の立体構造中の、ＨＣＣＡ３との結合部位の近傍に結合した場合、前記と同様、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との複合体形成が阻害又は抑制されるため、プロテアソームのαリング形成、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（３）ＤＳＣＲ２と結合して、前記タンパク質の立体構造を変化させる物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ３）がＤＳＣＲ２と結合して、ＤＳＣＲ２の立体構造を変化させた場合、前記と同様、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との複合体形成が阻害又は抑制されるため、プロテアソームのαリング形成、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（４）ＨＣＣＡ３の立体構造中の、ＤＳＣＲ２との結合部位に対して特異的に結合する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ４）がＨＣＣＡ３の立体構造中の、ＤＳＣＲ２との結合部位に対して特異的に結合した場合、前記と同様、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との複合体形成が阻害又は抑制されるため、プロテアソームのαリング形成、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（５）ＨＣＣＡ３の立体構造中の、ＤＳＣＲ２との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ５）がＨＣＣＡ３の立体構造中の、ＤＳＣＲ２との結合部位の近傍に結合した場合、前記と同様、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との複合体形成が阻害又は抑制されるため、プロテアソームのαリング形成、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（６）ＨＣＣＡ３と結合して、ＨＣＣＡ３の立体構造を変化させる物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ６）がＨＣＣＡ３と結合して、ＨＣＣＡ３の立体構造を変化させた場合、前記と同様、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との複合体形成が阻害又は抑制されるため、プロテアソームのαリング形成、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（７）抗ＤＳＣＲ２抗体、抗ＤＳＣＲ２アプタマー、抗ＨＣＣＡ３抗体、抗ＨＣＣＡ３アプタマーについて：
抗ＤＳＣＲ２抗体又は抗ＤＳＣＲ２アプタマー（符号Ｍ７）、及び、抗ＨＣＣＡ３抗体又は抗ＨＣＣＡ３アプタマー（符号Ｍ８）は、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３と特異的に結合し、その機能を抑制する。そのため、前記と同様、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との複合体形成が阻害又は抑制することができ、プロテアソームのαリング形成、新規のプロテアソーム形成を阻害又は抑制できる。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。ここで、アプタマーは、抗体代替分子であり、標的分子を特異的に認識するオリゴヌクレオチドである（以下同じ）。抗体又はアプタマーは、公知の方法により作製できる（以下同じ）。

＜プロテアソームとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤について＞
プロテアソームとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤について、図３を用いて、以下説明する。

図３は、プロテアソームとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質を示す模式図である。

ＤＳＣＲ２（符号１）及びＨＣＣＡ３（符号２）は、それぞれ、プロテアソームαサブユニット（α５又はα７、符号３）との相互作用部位１２、２２を有する。プロテアソームαサブユニット（α５又はα７、符号３）は、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用部位３１を有する。そして、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３と、プロテアソームαサブユニット（α５又はα７）とは、相互作用し（符号Ｂ）、αリングが形成される。

プロテアソームとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質としては、例えば、（１）プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットの立体構造中の、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との結合部位に対して特異的に結合する物質、（２）プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットの立体構造中の、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質、（３）ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３の立体構造中の、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットとの結合部位に対して特異的に結合する物質、（４）ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３の立体構造中の、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットとの結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質、（５）ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３と結合して、前記いずれかのタンパク質の立体構造を変化させる物質、（６）抗ＤＳＣＲ２抗体、抗ＤＳＣＲ２アプタマー、抗ＨＣＣＡ３抗体、抗ＨＣＣＡ３アプタマー、抗プロテアソームα５サブユニット抗体、抗プロテアソームα５サブユニットアプタマー、抗プロテアソームα７サブユニット抗体、抗プロテアソームα７サブユニットアプタマー、などが想定できる。

（１）プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットの立体構造中の、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との結合部位に対して特異的に結合する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ１）が、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットの立体構造中の、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との結合部位３１に対して特異的に結合した場合、プロテアソームのαリング形成が阻害又は抑制されるため、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（２）プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットの立体構造中の、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ２）がプロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットの立体構造中の、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との結合部位３１の近傍に結合した場合、前記と同様、プロテアソームのαリング形成が阻害又は抑制されるため、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（３）ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３の立体構造中の、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットとの結合部位に対して特異的に結合する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ４）が、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３の立体構造中の、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットとの結合部位２２に対して特異的に結合した場合、前記と同様、プロテアソームのαリング形成が阻害又は抑制されるため、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（４）ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３の立体構造中の、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットとの結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ５）が、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３の立体構造中の、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットとの結合部位の近傍に結合した場合、前記と同様、プロテアソームのαリング形成が阻害又は抑制されるため、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（５）ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３と結合して、前記いずれかのタンパク質の立体構造を変化させる物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ６）が、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３と結合して、いずれかのタンパク質の立体構造を変化させた場合、前記と同様、プロテアソームのαリング形成が阻害又は抑制されるため、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（６）抗ＤＳＣＲ２抗体、抗ＤＳＣＲ２アプタマー、抗ＨＣＣＡ３抗体、抗ＨＣＣＡ３アプタマー、抗プロテアソームα５サブユニット抗体、、抗プロテアソームα５サブユニットアプタマー、抗プロテアソームα７サブユニット抗体、抗プロテアソームα７サブユニットアプタマーについて：
抗ＤＳＣＲ２抗体又は抗ＤＳＣＲ２アプタマー、抗ＨＣＣＡ３抗体又は抗ＨＣＣＡ３アプタマー、抗プロテアソームα５サブユニット抗体又は抗プロテアソームα５サブユニットアプタマー、若しくは抗プロテアソームα７サブユニット又は抗プロテアソームα７サブユニットアプタマーは、ＤＳＣＲ２、ＨＣＣＡ３、プロテアソームのα５又はα７サブユニットのいずれかと特異的に結合し、それらの機能を抑制する。そのため、前記と同様、プロテアソームのαリング形成、新規のプロテアソーム形成を阻害又は抑制できる。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

＜プロテアソームとｈＵｍｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤について＞
プロテアソームとｈＵｍｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤について、図４を用いて、以下説明する。

図４は、プロテアソームとｈＵｍｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質を示す模式図である。

プロテアソームαサブユニット（符号３）は、７種類（α１〜α７）が凝集し、αリングを形成する。また、プロテアソームβサブユニット（符号４）も、７種類（β１〜β７）が凝集し、βリングを形成する。そして、αリングとβリングが会合し、ハーフプロテアソームが形成される。ハーフプロテアソーム形成過程において、ｈＵＭＰ１（符号５）は、プロテアソームのβサブユニットと相互作用する（符号Ｃ）。プロテアソームのβサブユニットは、ｈＵＭＰ１との相互作用部位４１を有し、ｈＵＭＰ１は、プロテアソームβサブユニットとの相互作用部位５１を有する。

プロテアソームとｈＵｍｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質としては、例えば、（１）プロテアソームのβサブユニットの立体構造中の、ｈＵｍｐ１との結合部位に対して特異的に結合する物質、（２）プロテアソームのβサブユニットの立体構造中の、ｈＵｍｐ１との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質、（３）ｈＵｍｐ１の立体構造中の、プロテアソームのβサブユニットとの結合部位に対して特異的に結合する物質、（４）ｈＵｍｐ１の立体構造中の、プロテアソームのβサブユニットとの結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質、（５）ｈＵｍｐ１と結合して、ｈＵｍｐ１の立体構造を変化させる物質、（６）抗ｈＵｍｐ１抗体、抗ｈＵｍｐ１アプタマー、抗プロテアソームβサブユニット抗体、抗プロテアソームβサブユニットアプタマー、などが想定できる。

（１）プロテアソームのβサブユニットの立体構造中の、ｈＵｍｐ１との結合部位に対して特異的に結合する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ１）が、プロテアソームのβサブユニットの立体構造中の、ｈＵｍｐ１との結合部位４１に対して特異的に結合した場合、プロテアソームのβサブユニットとｈＵＭＰ１との相互作用が阻害又は抑制されるため、ハーフプロテアソームの形成が阻害又は抑制され、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（２）プロテアソームのβサブユニットの立体構造中の、ｈＵｍｐ１との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ２）が、プロテアソームのβサブユニットの立体構造中の、ｈＵｍｐ１との結合部位４１の近傍に結合した場合、前記と同様、プロテアソームのβサブユニットとｈＵＭＰ１との相互作用が阻害又は抑制されるため、ハーフプロテアソームの形成が阻害又は抑制され、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（３）ｈＵｍｐ１の立体構造中の、プロテアソームのβサブユニットとの結合部位に対して特異的に結合する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ４）が、ｈＵｍｐ１の立体構造中の、プロテアソームのβサブユニットとの結合部位５１に対して特異的に結合した場合、前記と同様、プロテアソームのβサブユニットとｈＵＭＰ１との相互作用が阻害又は抑制されるため、ハーフプロテアソームの形成が阻害又は抑制され、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（４）ｈＵｍｐ１の立体構造中の、プロテアソームのβサブユニットとの結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ５）が、ｈＵｍｐ１の立体構造中の、プロテアソームのβサブユニットとの結合部位５１の近傍に結合した場合、前記と同様、プロテアソームのβサブユニットとｈＵＭＰ１との相互作用が阻害又は抑制されるため、ハーフプロテアソームの形成が阻害又は抑制され、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（５）ｈＵｍｐ１と結合して、ｈＵｍｐ１の立体構造を変化させる物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ６）が、ｈＵｍｐ１と結合して、ｈＵｍｐ１の立体構造を変化させた場合、前記と同様、プロテアソームのβサブユニットとｈＵＭＰ１との相互作用が阻害又は抑制されるため、ハーフプロテアソームの形成が阻害又は抑制され、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

（６）抗ｈＵｍｐ１抗体、抗ｈＵｍｐ１アプタマー、抗プロテアソームβサブユニット抗体、抗プロテアソームβサブユニットアプタマーについて：
抗ｈＵｍｐ１抗体又は抗ｈＵｍｐ１アプタマー（符号Ｍ７）、若しくは抗プロテアソームβサブユニット抗体又は抗プロテアソームβサブユニットアプタマー（符号Ｍ８）は、ｈＵＭＰ１又はプロテアソームβサブユニットと特異的に結合し、それらの機能を抑制する。そのため、前記と同様、ＵＭＰ１との相互作用を阻害又は抑制するため、ハーフプロテアソームの形成を阻害又は抑制し、新規のプロテアソーム形成を阻害又は抑制する。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

＜ＤＳＣＲ２、ＨＣＣＡ３、ｈＵＭＰ１のいずれかのタンパク質の発現を抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤について＞
上述の通り、ＤＳＣＲ２、ＨＣＣＡ３、及び、ｈＵＭＰ１は、いずれも、プロテアソーム形成（組立て）に深く関与する。従って、それらのタンパク質の発現を抑制することにより、新規プロテアソームの形成を抑制できる可能性がある。

（１）ＤＳＣＲ２の発現を抑制する物質について：
例えば、この物質（図示せず）によりＤＳＣＲ２の発現が抑制された場合、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との複合体形成やプロテアソームのαリング形成が阻害又は抑制されるため、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

このような物質として、例えば、ＤＳＣＲ２をコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、そのタンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡ、及び、ＤＳＣＲ２のプロモーター領域に作用する物質、が挙げられる。なお、ＲＮＡ干渉に基づく二本鎖ＲＮＡは、公知方法により設計・作製できる（以下同じ）。

（２）ＨＣＣＡ３の発現を抑制する物質について：
例えば、この物質（図示せず）によりＨＣＣＡ３の発現が抑制された場合、前記と同様、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との複合体形成やプロテアソームのαリング形成が阻害又は抑制されるため、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

このような物質として、例えば、ＨＣＣＡ３をコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、そのタンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡ、及び、ＨＣＣＡ３のプロモーター領域に作用する物質、が挙げられる。

（３）ｈＵｍｐ１のの発現を抑制する物質について：
例えば、この物質（図示せず）によりｈＵＭＰ１の発現が抑制された場合、プロテアソームのβサブユニットとｈＵＭＰ１との相互作用が阻害又は抑制されるため、ハーフプロテアソームの形成が阻害又は抑制され、新規のプロテアソーム形成が阻害又は抑制される。従って、この物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

このような物質として、例えば、ｈＵｍｐ１をコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、そのタンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡ、及び、ｈＵｍｐ１のプロモーター領域に作用する物質、が挙げられる。

＜本発明に係るスクリーニング方法について＞
上述の通り、プロテアソームの機能阻害ががん治療に有用である可能性があることが知られている。従って、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との相互作用、プロテアソームとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用、プロテアソームとｈＵｍｐ１との相互作用のいずれかを阻害又は抑制する物質を探索することにより、新規抗がん剤を見つけ出すことができる可能性がある。

相互作用の検出は、例えば、タンパク質間の結合を検出することによって行うことができる。タンパク質間の結合は、既知の方法、例えば、共免疫沈降法、ウエスタンブロット法、カラムを用いたプルダウン法、質量分析計を用いた方法、蛍光標識を用いたイメージング、又はそれらの組み合わせなどにより行うことができる。

本発明に係るスクリーニング方法は、キット化が可能である。その場合、例えば、ＤＳＣＲ２、ＨＣＣＡ３、プロテアソームα５サブユニット、同じくα７サブユニット、同じくβサブユニット、抗ＤＳＣＲ２抗体、抗ＨＣＣＡ３抗体、抗プロテアソームα５サブユニット抗体、抗プロテアソームα７サブユニット抗体、抗プロテアソームβサブユニット抗体、相互作用検出（共免疫沈降法、ウエスタンブロットなど）に用いる試薬などを、検出方法に応じて適宜組み合わせ、キット化する。

実施例１は、ＤＳＣＲ２及びＨＣＣＡ３とプロテアソームとが相互作用することを示す実験である。

まず、ＤＳＣＲ２及びＨＣＣＡ３をＦｌａｇタグで標識した融合タンパク質をコードするＤＮＡを調製した後、「ＦｕＧＥＮＥ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）」を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にそのＤＮＡをトランスフェクトし、細胞内にＦｌａｇで標識されたＤＳＣＲ２（又はＦｌａｇで標識されたＨＣＣＡ３）を発現させた。

次に、それらの細胞を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解し、細胞抽出液を得た後、Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて免疫沈降を行った。「Ｍ２」は抗Ｆｌａｇ−Ｍ２モノクローナル抗体のことであり、Ｆｌａｇタグに特異的に結合する。従って、Ｍ２アガロースを用いて免疫沈降を行うことにより、Ｆｌａｇタグで標識されたタンパク質とその相互作用複合体を特異的に回収できる。

次に、Ｍ２アガロースから相互作用複合体を溶出し、その相互作用複合体についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、以下同じ）を行った後、抗プロテアソーム抗体又は抗Ｆｌａｇ−Ｍ２モノクローナル抗体を用いて免疫ブロットを行った。

結果を図５に示す。図５は、抗Ｆｌａｇ−Ｍ２モノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った場合における免疫ブロット写真である。

図中、「Ｆｌａｇ−ＰＡＣ１」はＦｌａｇタグで標識されたＤＳＣＲ２をトランスフェクトし、免疫沈降を行った場合における免疫ブロット写真であることを、「Ｆｌａｇ−ＰＡＣ２」はＦｌａｇタグで標識されたＨＣＣＡ３をトランスフェクトし、免疫沈降を行った場合における免疫ブロット写真であることを、「Ｆｌａｇ」は、Ｆｌａｇタグのみをトランスフェクトし、免疫沈降を行った場合における免疫ブロット写真（コントロール）であることを、それぞれ表す。

図中、「ＩＰ（ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）」は免疫沈降を行った場合における免疫ブロット写真であることを、「Ｉｎｐｕｔ」は免疫沈降を行う前の細胞抽出液について行った免疫ブロット写真（コントロール）であることを、それぞれ表す。

図中、「ＭＧ１３２」の欄は、ＩＧ１３２添加の有無を示し、「＋」は、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養液中に、ＩＧ１３２を添加したことを、「−」は添加していないことを、それぞれ表す。なお、「ＩＧ１３２」は、プロテアソーム活性阻害剤である。

図中、「Ｆｌａｇ」、「α６」、「β５」、「β６」の各段は、それぞれ、抗Ｆｌａｇ抗体（抗Ｆｌａｇ−Ｍ２モノクローナル抗体）、抗プロテアソームα６サブユニット抗体、抗プロテアソームβ５サブユニット抗体、抗プロテアソームβ６サブユニット抗体を用いて免疫ブロットを行ったことを表す。

図５中、一番左側の免疫ブロット写真（コントロール）と真ん中の免疫ブロット写真とを比較した場合、一番左側の免疫ブロット写真では、右側の二つのレーンにおいて、「α６」、「β５」、「β６」の各段でバンドは検出されなかったのに対し、真ん中の免疫ブロット写真では、右側の二つのレーンにおいて、「α６」、「β５」、「β６」の各段でバンドが検出された。この結果は、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降を行い、Ｆｌａｇで標識されたＤＳＣＲ２（Ｆｌａｇ−ＰＡＣ１）の相互作用複合体を回収するとその免疫沈降物中に、プロテアソームの各サブユニットが存在することを示す。

同様に、図５中、一番左側の免疫ブロット写真（コントロール）と一番右側の免疫ブロット写真とを比較した場合、一番左側の免疫ブロット写真では、右側の二つのレーンにおいて、「α６」、「β５」、「β６」の各段でバンドは検出されなかったのに対し、一番右側の免疫ブロット写真では、右側の二つのレーンにおいて、「α６」、「β５」、「β６」の各段でバンドが検出された。この結果は、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降を行い、Ｆｌａｇで標識されたＨＣＣＡ３（Ｆｌａｇ−ＨＣＣＡ３）の相互作用複合体を回収するとその免疫沈降物中に、プロテアソームの各サブユニットが存在することを示す。

なお、発明者らによるその後の解析により、ＤＳＣＲ２及びＨＣＣＡ３は、ともに、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットと、直接、相互作用することが分かった。従って、本実験結果は、ＤＳＣＲ２及びＨＣＣＡ３が、α５サブユニット又はα７サブユニットを介して、α６、β５、β６の各サブユニットとも相互作用していたと推測する。即ち、本実験結果は、ＤＳＣＲ２及びＨＣＣＡ３が、α５サブユニット又はα７サブユニットと、直接、相互作用するとともに、プロテアソーム全体と相互作用することを示唆する。

実施例２では、ＤＳＣＲ２及びＨＣＣＡ３が、プロテアソーム形成のどの過程でプロテアソームと相互作用するか、密度勾配超遠心法を用いて検証した。

まず、Ｆｌａｇタグで標識したＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３を安定的に発現するＨｅＬａ細胞を樹立した。次に、その細胞をＩＦＮ−γ存在下で培養し、プロテアソームを成熟化させた後、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解し、細胞抽出液を得た。次に、３２〜８％グリセロールを順に重層し、その上にさらに細胞抽出液を重層した後、１０万Ｇで２２時間超遠心を行った。そして、密度勾配により、２２のフラクションに分画した。

次に、各フラクションからサンプル（タンパク質複合体）を回収した後、各フラクションについて、実施例１と同様に、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降を行い、Ｆｌａｇタグで標識されたタンパク質又はその相互作用複合体を回収した。そして、回収した相互作用複合体についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、抗プロテアソーム抗体を用いて免疫ブロットを行った。

結果を図６に示す。図６は、密度勾配超遠心法により回収した１０番目と１６番目のフラクションについて、抗Ｆｌａｇ−Ｍ２モノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った場合における免疫ブロット写真である。

図中、「ＩＰ：ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ」は、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降を行い、Ｆｌａｇタグで標識されたタンパク質とその相互作用複合体を回収したことを表す。

図中、「Ｆｌａｇ−ＰＡＣ１」は、免疫沈降により、Ｆｌａｇタグで標識されたＤＳＣＲ２とその相互作用複合体を回収した結果であることを、「Ｆｌａｇ−ＰＡＣ２」は、免疫沈降により、Ｆｌａｇタグで標識されたＨＣＣＡ３とその相互作用複合体を回収した結果であることを、「Ｍｏｃｋ」は、Ｆｌａｇで標識されたタンパク質を発現させていない細胞を用いて同様の実験を行った場合の結果（コントロール）であることを、それぞれ表す。

図中、「Ｆｒ＃」は、フラクション番号を表す。なお、フラクション１０は、２０Ｓプロテアソーム形成過程の未成熟な２０Ｓプロテアソームが回収される分画であり、フラクション１６は、成熟した２０Ｓプロテアソームが回収される分画である。

図中、「Ｆｌａｇ」、「α３」「α６」、「β１ｉ」、「ｈＵＭＰ１」の各段は、それぞれ、抗Ｆｌａｇ抗体、抗プロテアソームα３サブユニット抗体、抗プロテアソームα６サブユニット抗体、抗プロテアソームβ１ｉサブユニット抗体、抗ｈＵＭＰ１抗体を用いて免疫ブロットを行ったことを表す。なお、プロテアソームβ１ｉサブユニットは、β１サブユニットの活性化状態（成熟した状態）である。

図中の右側に記載された矢印は、検出されるバンドの位置を表す。即ち、「ＰＡＣ１」の矢印はＤＳＣＲ２のバンドの位置を、「ＰＡＣ２」の矢印はＨＣＣＡ３のバンドの位置を、それぞれ表す。また、「Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ」の矢印は、プロテアソームβ１サブユニットの未成熟型のバンドの位置を、「Ｍａｔｕｒｅ」の矢印は成熟型のバンドの位置を、それぞれ表す。

図６の真ん中の免疫ブロット写真において、フラクション１０のレーンでは、「α３」「α６」、「β１ｉ」、「ｈＵＭＰ１」の各位置のバンドが濃く検出されたのに対し、フラクション１６のレーンでは、「α３」「α６」、「β１ｉ」、「ｈＵＭＰ１」の各位置のバンドが薄くなった。

同様に、図６の右側の免疫ブロット写真においても、フラクション１０のレーンでは、「α３」「α６」、「β１ｉ」、「ｈＵＭＰ１」の各位置のバンドが濃く検出されたのに対し、フラクション１６のレーンでは、「α３」「α６」、「β１ｉ」、「ｈＵＭＰ１」の各位置のバンドが薄くなった。

この結果は、ＤＳＣＲ２及びＨＣＣＡ３が、プロテアソーム形成の初期段階で、プロテアソームと相互作用すること、即ち、両タンパク質が、プロテアソームの組立ての初期段階に深く関わっていることを強く示唆する。

実施例３は、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３が直接相互作用し、複合体を形成することを示す実験である。

まず、ｐＧＥＸ６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて、ＧＳＴタグ及びＨＡタグを融合したＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３のｃＤＮＡをサブクローン化した。次に、「ＴＮＴ Ｔ７ ＱＵＩＣＫ ｆｏｒ ＰＣＲ ＤＮＡ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）」を用いて、無細胞タンパク質合成系でそれらの融合タンパク質を合成し、かつ、^３５Ｓメチオニンで放射性ラベル化した。

次に、ＧＳＴタグを融合したＤＳＣＲ２とＨＡタグを融合したＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３、並びにＧＳＴタグを融合したＨＣＣＡ３とＨＡタグを融合したＨＣＣＡ３又はＤＳＣＲ２、をそれぞれ同一試験管内に入れ、１時間インキュベートした後、Ｇｌｕｔａｔｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）にＧＳＴ融合タンパク質（ＤＳＣＲ２）を吸着させた。次に、ビーズに吸着したＧＳＴ融合タンパク質を溶出バッファーで溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、オートラジオグラフィーにより、各タンパク質のバンドを検出した。

結果を図７に示す。図７中、左側の写真は、ＧＳＴタグを融合したＤＳＣＲ２とＨＡタグを融合したＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３を混合した場合におけるオートラジオグラフィー写真、右側の写真は、ＧＳＴタグを融合したＨＣＣＡ３とＨＡタグを融合したＨＣＣＡ３又はＤＳＣＲ２を混合した場合におけるオートラジオグラフィー写真である。

図中、「ｐｕｌｌｄｏｗｎ」は、Ｇｌｕｔａｔｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズを用いてＧＳＴ融合タンパク質を回収した場合におけるオートラジオグラフィー写真であることを、「Ｉｎｐｕｔ」は、無細胞タンパク質合成系で合成した全タンパク質についてのオートラジオグラフィー写真（コントロール）であることを、それぞれ表す。

左側の写真中、「ＧＳＴ−ＰＡＣ１」はＧＳＴタグを融合したＤＳＣＲ２を、「ＨＡ−ＰＡＣ１」はＨＡタグを融合したＤＳＣＲ２を、「ＨＡ−ＰＡＣ２」はＨＡタグを融合したＨＣＣＡ３を、それぞれ表す。また、右側の写真中、「ＧＳＴ−ＰＡＣ２」はＧＳＴタグを融合したＨＣＣＡ３を、「ＨＡ−ＰＡＣ２」はＨＡタグを融合したＨＣＣＡ３を、「ＨＡ−ＰＡＣ１」はＨＡタグを融合したＤＳＣＲ２を、それぞれ表す。そして、「＋」はその融合タンパク質を添加したことを、「−」は添加しなかったことを、それぞれ表す。なお、各写真の右側に記載された矢印は、各タンパク質のバンドの位置を表す。

図７の左側の写真が示す通り、ＧＳＴタグを融合したＤＳＣＲ２とＨＡタグを融合したＨＣＣＡ３とを混合した場合は、ＨＡタグを融合したＨＣＣＡ３のバンドが検出されたのに対し（一番右側のレーン参照）、ＧＳＴタグを融合したＤＳＣＲ２とＨＡタグを融合したＤＳＣＲ２とを混合した場合は、ＨＡタグを融合したＤＳＣＲ２のバンドは検出されなかった。

同様に、図７の右側の写真が示す通り、ＧＳＴタグを融合したＨＣＣＡ３とＨＡタグを融合したＤＳＣＲ２とを混合した場合は、ＨＡタグを融合したＤＳＣＲ２のバンドが検出されたのに対し（右から二番目のレーン参照）、ＧＳＴタグを融合したＨＣＣＡ３とＨＡタグを融合したＨＣＣＡ３とを混合した場合は、ＨＡタグを融合したＨＣＣＡ３のバンドは検出されなかった。

これらの結果は、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３は、ヘテロダイマー（複合体）を形成すること、及び、それぞれのタンパク質同士のホモダイマーは形成しないことを示す。

実施例４では、ＲＮＡ干渉により、ＤＳＣＲ２、ＨＣＣＡ３、ｈＵＭＰ１の各タンパク質の発現をそれぞれ抑制した場合における、プロテアソームαサブユニットの動態を調べた。

まず、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を作製した。ＤＳＣＲ２を標的としたｓｉＲＮＡの塩基配列を配列番号４に、ＨＣＣＡ３を標的としたｓｉＲＮＡの塩基配列を配列番号５に、ｈＵＭＰ１を標的としたｓｉＲＮＡの塩基配列を配列番号６及び配列番号７に、それぞれ示す。なお、ｈＵＭＰ１を標的とするｓｉＲＮＡは、両者を混合して用いた。

次に、「ＦｕＧＥＮＥ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）」を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に各ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、標的とするタンパク質の発現を抑制した。

次に、トランスフェクションから７２時間培養を行った後、それらの細胞を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解し、細胞抽出液を得た。

次に、その細胞抽出液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。これにより、細胞中において、単独で存在した各サブユニット及び２０Ｓプロテアソームを分離した。

次に、抗プロテアソームαサブユニット抗体を用いて免疫ブロットを行った。そして、単独で存在する各αサブユニットと、２０Ｓプロテアソームとして存在する各αサブユニットの両者を染色した。抗プロテアソームαサブユニット抗体には、それぞれ、抗α３抗体、抗α４抗体、抗α５抗体、抗α６抗体、抗α７抗体、の各抗体を用いた。

次に、免疫ブロットの結果をコンピューターに取り込み、バンドの濃淡を数値化した。そして、細胞中において単独で遊離して存在しているサブユニット（ｆｒｅｅ ｆｏｒｍ）を示すバンドと、２０Ｓプロテアソームを示すバンド（２０Ｓプロテアソームの構成サブユニットとして存在しているサブユニットを示すバンド）の両者について、その濃淡を表す数値を取得し、前者を後者で除して、各αサブユニットの動態に関する相対値を取得した。

結果を図８に示す。図８は、ＲＮＡ干渉により各遺伝子の発現を抑制した場合における、プロテアソームの各αサブユニットの動態を示すグラフである。

図８のグラフの縦軸「Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｒａｔｉｏ（Ｆｒｅｅ／２０Ｓ）」は、各αサブユニットの動態に関する相対値を表す。特定の抗プロテアソームαサブユニット抗体を用いて免疫ブロットを行った場合における、細胞中において単独で遊離して存在しているサブユニット（ｆｒｅｅ ｆｏｒｍ）のバンドの濃淡を表す数値を、２０Ｓプロテアソームを示すバンドの濃淡を表す数値で除した値である。

図８のグラフの横軸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）により発現抑制を行ったタンパク質を表す。「ＰＡＣ１」の欄はＤＳＣＲ２の発現を抑制したことを、「ＰＡＣ２」の欄はＨＣＣＡ３の発現を抑制したことを、「ｈＵＭＰ１」の欄はｈＵＭＰ１の発現を抑制したことを、それぞれ表す。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＲＮＡ干渉による遺伝子の発現抑制を行わなかった場合における結果（コントロール）であることを表す。

図中、「α３」〜「α７」は、それぞれ、その抗プロテアソームαサブユニット抗体を用いて免疫ブロットを行った場合の結果であることを表す。

図８では、いずれの抗プロテアソームαサブユニット抗体を用いた場合においても、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３の発現を抑制すると、２０Ｓプロテアソームの構成サブユニットとして存在するサブユニットに比べ、単独で遊離して存在するサブユニットの割合が増大した。このことは、ＤＳＣＲ２及びＨＣＣＡ３が、２０Ｓプロテアソームの形成に関与することを示唆し、また、それらの遺伝子の発現を抑制することにより、プロテアソーム形成を抑制できることを示唆する。

加えて、図８では、いずれの抗プロテアソームαサブユニット抗体を用いた場合においても、ｈＵＭＰ１の発現を抑制すると、２０Ｓプロテアソームの構成サブユニットとして存在するサブユニットに比べ、単独で遊離して存在するサブユニットの割合が大幅に増大した。このことは、ｈＵＭＰ１が、ヒトにおいても、２０Ｓプロテアソーム形成に関与していることを示唆し、また、ｈＵＭＰ１の発現を抑制することにより、プロテアソーム形成を抑制できることを示唆する。

なお、発明者らの別途解析では、ｈＵＭＰ１の発現を抑制した場合、プロテアソームのαリング形成量は正常であるが、２０Ｓプロテアソーム形成量は減少することが示唆された。従って、それらの各知見を総合すると、ｈＵＭＰ１は、ヒトにおいても、２０Ｓプロテアソーム形成、特に、ハーフプロテアソームの二量体化に関与していると考える。

２０Ｓプロテアソームの形成機序を示した模式図。 ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質を示す模式図。 プロテアソームとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質を示す模式図。 プロテアソームとｈＵｍｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質を示す模式図。 実施例１において、抗Ｆｌａｇ−Ｍ２モノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った場合における免疫ブロット写真。 実施例２において、密度勾配超遠心法により回収した１０番目と１６番目のフラクションについて、抗Ｆｌａｇ−Ｍ２モノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った場合における免疫ブロット写真。 実施例３において、ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３がヘテロダイマーを形成することを示すオートラジオグラフィー写真。 実施例４において、ＲＮＡ干渉により各遺伝子の発現を抑制した場合における、プロテアソームの各αサブユニットの動態を示すグラフ。

Claims (42)

1. プロテアソームと相互作用するＤＳＣＲ２。
2. ＨＣＣＡ３と複合体を形成することを特徴とする請求項１記載のＤＳＣＲ２。
3. プロテアソームのα５サブユニット及び／又はα７サブユニットと相互作用することを特徴とする請求項１記載のＤＳＣＲ２。
4. プロテアソームと相互作用するＨＣＣＡ３。
5. ＤＳＣＲ２と複合体を形成することを特徴とする請求項４記載のＨＣＣＡ３。
6. プロテアソームのα５サブユニット及び／又はα７サブユニットと相互作用することを特徴とする請求項４記載のＨＣＣＡ３。
7. プロテアソームと相互作用するｈＵｍｐ１。
8. プロテアソームのβサブユニットと相互作用することを特徴とする請求項７記載のｈＵｍｐ１。
9. ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３の相互作用を阻害又は抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
10. 前記物質は、ＤＳＣＲ２の立体構造中の、ＨＣＣＡ３との結合部位に対して特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項９記載の抗がん剤。
11. 前記物質は、ＤＳＣＲ２の立体構造中の、ＨＣＣＡ３との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質であることを特徴とする請求項９記載の抗がん剤。
12. 前記物質は、ＤＳＣＲ２と結合して、前記タンパク質の立体構造を変化させる物質であることを特徴とする請求項９記載の抗がん剤。
13. 前記物質は、ＨＣＣＡ３の立体構造中の、ＤＳＣＲ２との結合部位に対して特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項９記載の抗がん剤。
14. 前記物質は、ＨＣＣＡ３の立体構造中の、ＤＳＣＲ２との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質であることを特徴とする請求項９記載の抗がん剤。
15. 前記物質は、ＨＣＣＡ３と結合して、前記タンパク質の立体構造を変化させる物質であることを特徴とする請求項９記載の抗がん剤。
16. 前記物質は、抗ＤＳＣＲ２抗体、抗ＤＳＣＲ２アプタマー、抗ＨＣＣＡ３抗体、抗ＨＣＣＡ３アプタマー、のいずれかであることを特徴とする請求項９記載の抗がん剤。
17. プロテアソームとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
18. 前記物質は、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットの立体構造中の、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との結合部位に対して特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項１７記載の抗がん剤。
19. 前記物質は、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットの立体構造中の、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質であることを特徴とする請求項１７記載の抗がん剤。
20. 前記物質は、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３の立体構造中の、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットとの結合部位に対して特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項１７記載の抗がん剤。
21. 前記物質は、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３の立体構造中の、プロテアソームのα５サブユニット又はα７サブユニットとの結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質であることを特徴とする請求項１７記載の抗がん剤。
22. 前記物質は、ＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３と結合して、前記いずれかのタンパク質の立体構造を変化させる物質であることを特徴とする請求項１７記載の抗がん剤。
23. 前記物質は、抗ＤＳＣＲ２抗体、抗ＤＳＣＲ２アプタマー、抗ＨＣＣＡ３抗体、抗ＨＣＣＡ３アプタマー、抗プロテアソームα５サブユニット抗体、抗プロテアソームα５サブユニットアプタマー、抗プロテアソームα７サブユニット抗体、抗プロテアソームα７サブユニットアプタマーのいずれかであることを特徴とする請求項１７記載の抗がん剤。
24. プロテアソームとｈＵｍｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
25. 前記物質は、プロテアソームのβサブユニットの立体構造中の、ｈＵｍｐ１との結合部位に対して特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項２４記載の抗がん剤。
26. 前記物質は、プロテアソームのβサブユニットの立体構造中の、ｈＵｍｐ１との結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質であることを特徴とする請求項２４記載の抗がん剤。
27. 前記物質は、ｈＵｍｐ１の立体構造中の、プロテアソームのβサブユニットとの結合部位に対して特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項２４記載の抗がん剤。
28. 前記物質は、ｈＵｍｐ１の立体構造中の、プロテアソームのβサブユニットとの結合部位の近傍に結合することにより、前記相互作用を阻害又は抑制する物質であることを特徴とする請求項２４記載の抗がん剤。
29. 前記物質は、ｈＵｍｐ１と結合して、前記タンパク質の立体構造を変化させる物質であることを特徴とする請求項２４記載の抗がん剤。
30. 前記物質は、抗ｈＵｍｐ１抗体、抗ｈＵｍｐ１アプタマー、抗プロテアソームβサブユニット抗体、抗プロテアソームβサブユニットアプタマーのいずれかであることを特徴とする請求項２４記載の抗がん剤。
31. 請求項１記載のＤＳＣＲ２の発現を抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
32. 前記物質は、ＤＳＣＲ２をコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、前記タンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項３１記載の抗がん剤。
33. 前記物質は、ＤＳＣＲ２のプロモーター領域に作用する物質であることを特徴とする請求項３１記載の抗がん剤。
34. 請求項４記載のＨＣＣＡ３の発現を抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
35. 前記物質は、ＨＣＣＡ３をコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、前記タンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項３４記載の抗がん剤。
36. 前記物質は、ＨＣＣＡ３のプロモーター領域に作用する物質であることを特徴とする請求項３４記載の抗がん剤。
37. 請求項７記載のｈＵｍｐ１のの発現を抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
38. 前記物質は、ｈＵｍｐ１をコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、前記タンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項３７記載の抗がん剤。
39. 前記物質は、ｈＵｍｐ１のプロモーター領域に作用する物質であることを特徴とする請求項３７記載の抗がん剤。
40. ＤＳＣＲ２とＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質を探索する抗がん剤のスクリーニング方法。
41. プロテアソームとＤＳＣＲ２又はＨＣＣＡ３との相互作用を阻害又は抑制する物質を探索する抗がん剤のスクリーニング方法。
42. プロテアソームとｈＵｍｐ１との相互作用を阻害又は抑制する物質を探索する抗がん剤のスクリーニング方法。