JP2007119378A - ミトコンドリア膜タンパク質群およびそれらをコードする遺伝子群 - Google Patents
ミトコンドリア膜タンパク質群およびそれらをコードする遺伝子群 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007119378A JP2007119378A JP2005311816A JP2005311816A JP2007119378A JP 2007119378 A JP2007119378 A JP 2007119378A JP 2005311816 A JP2005311816 A JP 2005311816A JP 2005311816 A JP2005311816 A JP 2005311816A JP 2007119378 A JP2007119378 A JP 2007119378A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- amino acid
- mitochondrial
- seq
- proteins
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 413
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 title claims abstract description 66
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 title description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 title description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 377
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 133
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 74
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 64
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 claims description 98
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 claims description 94
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 39
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 19
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 55
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 41
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 55
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 27
- 101001129610 Homo sapiens Prohibitin 1 Proteins 0.000 description 17
- 102100031169 Prohibitin 1 Human genes 0.000 description 17
- 101000658110 Homo sapiens Synaptotagmin-like protein 2 Proteins 0.000 description 16
- 102100024172 Stomatin-like protein 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 14
- 101001121072 Homo sapiens MICOS complex subunit MIC19 Proteins 0.000 description 12
- 102100026626 MICOS complex subunit MIC19 Human genes 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 11
- 101001121964 Homo sapiens OCIA domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 10
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 10
- 102100027183 OCIA domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 10
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 10
- 102100039358 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 Human genes 0.000 description 9
- 101001035740 Homo sapiens 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 Proteins 0.000 description 9
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 9
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 7
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 7
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 7
- 102100034445 HCLS1-associated protein X-1 Human genes 0.000 description 7
- 101000873843 Homo sapiens Sorting and assembly machinery component 50 homolog Proteins 0.000 description 7
- 102100035853 Sorting and assembly machinery component 50 homolog Human genes 0.000 description 7
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 6
- 101710200673 HCLS1-associated protein X-1 Proteins 0.000 description 5
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 5
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 5
- 102100022564 Protein NipSnap homolog 2 Human genes 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 208000030212 nutrition disease Diseases 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 102100034663 Caseinolytic peptidase B protein homolog Human genes 0.000 description 4
- 102100033506 G-rich sequence factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 101000722054 Homo sapiens Dynamin-like 120 kDa protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 4
- 101000614988 Homo sapiens Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 12 Proteins 0.000 description 4
- 102100021070 Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 12 Human genes 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 102100028252 Brain acid soluble protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 101000935689 Homo sapiens Brain acid soluble protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000870806 Homo sapiens G-rich sequence factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000972822 Homo sapiens Protein NipSnap homolog 2 Proteins 0.000 description 3
- 101000594302 Homo sapiens Transcription termination factor 3, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 102100035551 Transcription termination factor 3, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 102100027831 14-3-3 protein theta Human genes 0.000 description 2
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 101710089232 Caseinolytic peptidase B protein homolog Proteins 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102100034680 Haloacid dehalogenase-like hydrolase domain-containing 5 Human genes 0.000 description 2
- 101710097166 Haloacid dehalogenase-like hydrolase domain-containing 5 Proteins 0.000 description 2
- 101000946436 Homo sapiens Caseinolytic peptidase B protein homolog Proteins 0.000 description 2
- 101001068173 Homo sapiens HCLS1-associated protein X-1 Proteins 0.000 description 2
- 101001083553 Homo sapiens Hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 101000591312 Homo sapiens Putative MORF4 family-associated protein 1-like protein UPP Proteins 0.000 description 2
- 101000841763 Homo sapiens Ubiquinol-cytochrome-c reductase complex assembly factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100030358 Hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101710092885 Protein NipSnap homolog 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100034096 Putative MORF4 family-associated protein 1-like protein UPP Human genes 0.000 description 2
- 101001023550 Rattus norvegicus NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex assembly factor 3 Proteins 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108050002989 Tom40 Proteins 0.000 description 2
- 102000012333 Tom40 Human genes 0.000 description 2
- 102100024950 Transcription termination factor 1, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102100029513 Ubiquinol-cytochrome-c reductase complex assembly factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000007625 mitochondrial abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000025608 mitochondrion localization Effects 0.000 description 2
- 230000008722 morphological abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 102000016670 prohibitin Human genes 0.000 description 2
- 108010028138 prohibitin Proteins 0.000 description 2
- 230000012481 regulation of membrane potential Effects 0.000 description 2
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038222 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 102000039504 BASP1 family Human genes 0.000 description 1
- 108091067189 BASP1 family Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 101150018198 COX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100205787 Caenorhabditis elegans timm-17B.1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 208000014392 Cat-eye syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 1
- 241000498886 Collimonas arenae Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101100275424 Danio rerio mt-co1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100275428 Dictyostelium discoideum cox1/2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000972160 Drosophila melanogaster Transcription termination factor, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 101710169327 G-rich sequence factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101000764239 Homo sapiens Mitochondrial import receptor subunit TOM5 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000648387 Homo sapiens Mitochondrial import receptor subunit TOM6 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000648421 Homo sapiens Mitochondrial import receptor subunit TOM7 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000693735 Homo sapiens Prefoldin subunit 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000945096 Homo sapiens Ribosomal protein S6 kinase alpha-5 Proteins 0.000 description 1
- 101001116554 Homo sapiens Transcription termination factor 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100022745 Laminin subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010052641 Mitochondrial DNA mutation Diseases 0.000 description 1
- 108700021610 Mitochondrial Precursor Protein Import Complex Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100026902 Mitochondrial import receptor subunit TOM5 homolog Human genes 0.000 description 1
- 102100028812 Mitochondrial import receptor subunit TOM6 homolog Human genes 0.000 description 1
- 102100028764 Mitochondrial import receptor subunit TOM7 homolog Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 101100329869 Nitrosomonas europaea (strain ATCC 19718 / CIP 103999 / KCTC 2705 / NBRC 14298) cyt gene Proteins 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 102100025542 Prefoldin subunit 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 101100337058 Rattus norvegicus Glp1r gene Proteins 0.000 description 1
- 102100033645 Ribosomal protein S6 kinase alpha-5 Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 101150118440 TIMM22 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150057558 Timm23 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150057670 Tomm22 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710184303 Transcription termination factor 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 201000006815 congenital muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010220 ion permeability Effects 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006676 mitochondrial damage Effects 0.000 description 1
- 208000012268 mitochondrial disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000001749 optic atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 108091023021 poly(A) binding Proteins 0.000 description 1
- 102000028499 poly(A) binding Human genes 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- -1 skeletons Proteins 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
【解決手段】特定のアミノ酸配列、又は少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有する蛋白質。また、別の特定のアミノ酸配列、又は少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有する蛋白質の群から選ばれる1種又は2種以上のタンパク質が欠損若しくは過剰発現した細胞、又はこれらのタンパク質が添加された細胞であって、ミトコンドリア形態に異常が生じている細胞に、試験物質を添加して、当該試験物質によるミトコンドリア形態の変化を測定し、ミトコンドリアの形態を正常化させる活性物質をスクリーニングする方法。
【選択図】なし
Description
ミトコンドリアは、哺乳動物では約1500種のタンパク質によって構成されているといわれている。そのうちの13種のタンパク質だけがmtDNAにより産生されていることになるから、残りの約99%のタンパク質は細胞核のDNAにコードされていることになる。細胞質で合成されたタンパク質は、N末端に存在するミトコンドリア指向配列(MTS)によりミトコンドリアに選別輸送される。このようなシグナル配列によりミトコンドリアのタンパク質を補足する方法も開発されている(特許文献1及び2参照)。
また、癌や栄養障害などにおいては、ミトコンドリア形態の異常も報告されている。本発明によって明らかにされたタンパク質群をコードする遺伝子断片や、タンパク質を認識する抗体などを用いることにより、将来的には疾患の診断マーカーなどへの応用も期待される。また、これらのタンパク質は治療標的としても考えることができ、これらのタンパク質派生体は治療薬などへの応用も考えられる。
しかしながら、ミトコンドリアには約1500種のタンパク質が存在すると言われているが、どのような種類のタンパク質が存在し、それらのタンパク質がどのような機能を有し、どのような関連性を有しているのかと言うことは未だに解明されていない。また、ミトコンドリア膜の形態を調節する詳しい分子メカニズムや、ミトコンドリアの膜形態と機能の連関性に関しては未だ明らかにされていない。
ミトコンドリアが有する各種の機能を解明するために、近年において多くの検討がなされてきている。例えば、ミトコンドリア膜のイオン透過性に関するもの(特許文献7参照)、カスパーゼの活性化に関するもの(特許文献8参照)、タンパク質のミトコンドリアへの細胞内移動に関するもの(特許文献9参照)、ミトコンドリアDNAを用いた遺伝子検出方法に関するもの(特許文献10参照)などが報告されてきている。
本発明は、ミトコンドリアの機能を担っているタンパク質を網羅的に同定・解析し、ミトコンドリア膜の形態を調節しかつミトコンドリアの機能を調節するタンパク質群の機能や相互の関連性を解明するための方法を提供し、また本発明の方法によって同定・解析された新規なタンパク質及びその用途を提供し、さらにミトコンドリアの機能を調整する方法を提供するものである。
そして、本発明者は、このミトコンドリアの膜に強固に結合するタンパク質群を可溶化し、二次元電気泳動法により、これらのタンパク質を網羅的に解析することができることを見出した。さらに、得られたタンパク質のスポットを分離し、これらのスポットを切り抜き、ゲル内消化後ペプチドを抽出し、質量分析法およびデータベース検索にてこれらのタンパク質を同定することに成功した。
また、本発明は、配列表の配列番号1〜22のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質の群から選ばれる1種又は2種以上のタンパク質が欠損若しくは過剰発現した細胞、又はこれらのタンパク質が添加された細胞であって、ミトコンドリアの形態に異常が生じている細胞に、試験物質を添加して、当該試験物質によるミトコンドリアの形態の変化を測定することからなる、ミトコンドリアの形態を正常化させるために活性な物質をスクリーニングする方法に関する。
さらに、本発明は、配列表の配列番号1〜22のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質からなるミトコンドリア膜組織形成剤に関する。また、本発明は、配列表の配列番号1〜22のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質からなるミトコンドリア膜の形態調節剤に関する。さらに、本発明は、配列表の配列番号1〜12のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物に関する。
また、本発明は、配列表の配列番号23〜44のいずれかに記載の塩基配列、又はこれらの塩基配列のうちの連続した少なくとも20塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて、ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質をコードする遺伝子を検出・同定する方法に関する。
さらに、本発明は、配列表の配列番号1〜15のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質に対する抗体に関する。
また、本発明は、ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料を、可溶化し、二次元電気泳動法により、これらのタンパク質群を網羅的に解析する方法に関する。
さらに、本発明は、ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料を、可溶化し、二次元電気泳動法により、これらのタンパク質群の二次元電気泳動による泳動パターンを得、得られた泳動パターンを標準泳動パターンと比較することからなるミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群の異常を検出、同定する方法に関する。
(1)配列表の配列番号1〜15のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質。
(2)配列表の配列番号1〜12のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質。
(3)タンパク質が、ミトコンドリアに局在するタンパク質である前記(1)又は(2)に記載のタンパク質。
(4)タンパク質が、ミトコンドリアの形態を制御又は調節する機能を有するものである前記(1)又は(2)に記載のタンパク質。
(5)タンパク質が、培養細胞を細胞破砕した後、遠心分離法にて粗なミトコンドリア画分を分離し、この画分を比重密度勾配遠心法にて精製し単離されたものである前記(1)又は(2)に記載のタンパク質。
(6)配列表の配列番号1〜22のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質の群から選ばれる1種又は2種以上のタンパク質が欠損若しくは過剰発現した細胞、又はこれらのタンパク質が添加された細胞であって、ミトコンドリアの形態に異常が生じている細胞に、試験物質を添加して、当該試験物質によるミトコンドリアの形態の変化を測定することからなる、ミトコンドリアの形態を正常化させるために活性な物質をスクリーニングする方法。
(7)タンパク質の群が、配列表の配列番号1〜15のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質の群である前記(6)に記載の方法。
(8)タンパク質の群が、配列表の配列番号19〜22のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質の群である前記(6)に記載の方法。
(9)ミトコンドリアの形態の正常化が、ミトコンドリアの凝集の抑制である前記(6)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)配列表の配列番号1〜22のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質からなるミトコンドリア膜組織形成剤。
(11)配列表の配列番号1〜22のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質からなるミトコンドリア膜の形態調節剤。
(12)配列表の配列番号1〜15、好ましくは配列番号1〜12のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物。
(13)配列表の配列番号23〜44のいずれかに記載の塩基配列、又はこれらの塩基配列のうちの連続した少なくとも20塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて、ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質をコードする遺伝子を検出・同定する方法。
(14)配列表の配列番号1〜15、好ましくは配列番号1〜12のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質に対する抗体。
(15)抗体が、モノクローナル抗体である前記(14)に記載の抗体。
(17)培養細胞が、ヒト細胞である前記(16)に記載の方法。
(18)ヒト細胞が、ヒトHeLa細胞である前記(17)に記載の方法。
(19)精製されたミトコンドリア画分を超音波破砕し、次いで遠心法にて膜画分とマトリックス画分に分離し、得られた膜画分をアルカリ液にて洗浄することにより、膜に緩く結合するタンパク質群の二つのタンパク質群を分離し、残された膜画分から、膜貫通ドメインを持つなどの膜に強固に結合する性質を持つタンパク質群を得ることからなるミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を製造する方法。
(20)ミトコンドリア画分が、ヒト細胞由来のミトコンドリア画分である前記(19)に記載の方法。
(21)培養細胞から、細胞破砕後、遠心分離法にて粗なミトコンドリア画分を分離し、この画分を比重密度勾配遠心法にて精製することにより、高純度のミトコンドリア画分を得、次いで得られた精製されたミトコンドリア画分を超音波破砕し、次いで遠心法にて膜画分とマトリックス画分に分離し、得られた膜画分をアルカリ液にて洗浄することにより、膜に緩く結合するタンパク質群の二つのタンパク質群を分離し、残された膜画分から、膜貫通ドメインを持つなどの膜に強固に結合する性質を持つタンパク質群を得ることからなるミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を製造する方法。
(22)培養細胞が、ヒト細胞である前記(21)に記載の方法。
(23)ヒト細胞が、ヒトHeLa細胞である前記(22)に記載の方法。
(24)ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料を、可溶化し、二次元電気泳動法により、これらのタンパク質群を網羅的に解析する方法。
(25)ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料が、請求項4〜9のいずれかに記載の方法により得られたものである前記(24)に記載の方法。
(26)ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料を、可溶化し、二次元電気泳動法により、これらのタンパク質群の二次元電気泳動による泳動パターンを得、得られた泳動パターンを標準泳動パターンと比較することからなるミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群の異常を検出、同定する方法。
(27)ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料が、請求項4〜9のいずれかに記載の方法により得られたものである前記(26)に記載の方法。
(28)正常なミトコンドリアの機能を有する細胞から得られたミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質群を含有する試料を、可溶化し、二次元電気泳動法により、これらのタンパク質群の二次元電気泳動による泳動パターン。
本発明における「ミトコンドリア」としては、ミトコンドリアを有している生物種からのものであればよく、動物であっても植物であってもよい。好ましいミトコンドリアとしては、ヒトミトコンドリアが挙げられる。ヒトミトコンドリアを対象にすることにより、ヒトの疾患や健康、老化などの予防や治療又は診断に応用することができる。
本発明における「ミトコンドリア膜組織」とは、ミトコンドリアの外膜及び/又は内膜に強固に結合する物質群、好ましくはタンパク質群をいう。典型的な「ミトコンドリア膜組織」を形成するタンパク質としては、少なくとも1個の膜貫通ドメインを持つタンパク質が挙げられる。例えば、外膜におけるミトコンドリア局在化シグナルを認識しているTOM40複合体を形成するTom40,Tom5、Tom6、Tom7、Tom22、また、内膜における膜透過装置を形成するTIM複合体を形成するTim17、Tim22、Tim23などの膜タンパク質が挙げられる。
本発明における「ミトコンドリア膜組織形成剤」とは、前記した本発明の「ミトコンドリア膜組織」を形成するための物質、好ましくはタンパク質である。ミトコンドリア膜組織には既知及び未知の物質を含めて非常に多くの物質が存在しており、それらが単独で若しくは複合して、又は相互に関連して、ミトコンドリアのATP産生やアポトーシスなどの多種多様な機能を発現させている。したがって、「ミトコンドリア膜組織」を正常に維持してゆくことは、個体の恒常性を維持して上で極めて重要なことである。本発明の「ミトコンドリア膜組織形成剤」は、正常なミトコンドリア膜組織において機能している物質、好ましくはタンパク質だけでなく、何等かの原因で欠損したり、又は機能不全となった異常なミトコンドリア膜組織を正常な状態に戻すために適用されるものを包含している。
本発明における「泳動パターン」とは、可溶化されたタンパク質群を二次元電気泳動にかけたときにできるこれらのタンパク質群によるスポットにより形成される二次元のスポットによる位置情報である。このような位置情報としては、写真や映像のような画像情報であってもよいし、X軸とY軸における数値情報であってもよい。したがって、本発明における「泳動パターン」は、目視可能な画像に限定されるものではなく、二次元電気泳動によって得られる位置情報であるということができる。
また、本発明の二次元電気泳動における展開方法としては、一次元が等電点電気泳動法で、二次元がSDS−PAGE法による分子量の違いによる展開法が好ましいがこれに限定されるものではない。一次元目及び二次元目の展開方法としては各種の方法を採用することができる。例えば、複合体解析などによく用いられる未変性アクリルアミドゲルを用いた展開法なども採用することもできるが、等電点電気泳動法とSDS−PAGE法による方法の組み合わせが再現性もよく好ましい。
本発明におけるその他の用語の意味は、当業者が通常使用している意味で用いられている。
まず、大量培養したヒト培養細胞HeLa細胞を破砕後、遠心分離法にて粗なミトコンドリア画分を分離した。この画分を比重密度勾配遠心法にて、高純度のミトコンドリア画分を精製した。このミトコンドリア画分を超音波破砕した後、遠心法にて膜画分とマトリックス画分に分離した。この膜画分には、膜貫通ドメインを持つなどの膜に強固に結合する性質を持つタンパク質群と、膜に緩く結合するタンパク質群の二つのタンパク質群が存在し、アルカリ液にて洗浄することにより、これらを分離した。このミトコンドリアの膜に強固に結合するタンパク質群を網羅的に解析するために、まずこれらのタンパク質を可溶化し、二次元電気泳動法にて200以上のタンパク質のスポットを分離した。これらのスポットを切り抜き、ゲル内消化後ペプチドを抽出し、質量分析法にてこれらのタンパク質を同定した。同定されたタンパク質をペプチド配列ターゲッティング(Peptide sequence tagging)法を用いてデータベース検索を行ない、スポットのタンパク質をすべて同定した。247スポットを解析し、171種類のタンパク質を同定した。
上記の方法により網羅的に同定・解析されたタンパク質群には、ミトコンドリア膜の形態を調節しかつミトコンドリアの機能を調節するタンパク質が存在すると考えられる。
これらの二次元電気泳動により展開されたパターン中にはリン酸化されたタンパク質や、各種のアイソフォームを含まれていた。
この方法により、ミトコンドリア膜組織を形成するタンパク質の247スポットを解析し、重複を除いた171種のタンパク質を同定した。これらの171種のタンパク質をミトコンドリアの機能に基づいて分類した結果を次の表1に示す。
得られたタンパク質のアミノ酸配列に基づいてデータベースを検索したところ、次のA〜Cの3群に分けることができた。
A群:ゲノム研究においてその配列が推定されていたが、今までに単離され確認された
ことが無いタンパク質であって、その機能についても明らかにされていない
タンパク質。
配列番号1に記載のタンパク質:NP−060336(LOC54968)
hypothetical protein LOC54968
配列番号2に記載のタンパク質:NP−077027(LOC79135)
hypothetical protein LOC79135
配列番号3に記載のタンパク質:NP−001001692(FLJ45139)
FLJ45139 protein
配列番号4に記載のタンパク質:NP−775932(LOC285492)
hypothetical protein LOC285492
配列番号5に記載のタンパク質:NP−078937(LOC79714)
hypothetical protein LOC79714
配列番号6に記載のタンパク質:AAQ89151(AAQ89151)
HSAL5836
配列番号7に記載のタンパク質:NP−115716(c6orf125)
chromosome 6 open reading frame 125
配列番号8に記載のタンパク質:BAC04486(BAC04486)
unnamed protein product
配列番号9に記載のタンパク質:NP−951032(E3−3a)
nuclear protein E3-3 isoform a
配列番号10に記載のタンパク質:NP−060282(CHCHD3)
coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain
containing 3; CHCHD3
配列番号11に記載のタンパク質:NP−057026(CGI−12)
hypothetical protein LOC51001; CGI-12
配列番号12に記載のタンパク質:Q9H078(Q9H078SKD3)
suppressor of potassium transport defect 3; SKD3
配列番号13に記載のタンパク質:NP−060300(OCIA)
ovarian carcinoma immunoreactive antigen; OCIA
配列番号14に記載のタンパク質:AAH01837(GBAS)
glioblastoma amplified sequence; GBAS
配列番号15に記載のタンパク質:NP−149061(cat eye c5-2)
cat eye syndrome chromosome region,
candidate 5 isoform 2 precursor
タンパク質。
配列番号16に記載のタンパク質:NP−006308(BASP1)
brain abundant, membrane attached signal protein 1
配列番号17に記載のタンパク質:NP−002083(GRSF1)
G-rich RNA sequence binding factor 1
C群:ミトコンドリアへの局在が明らかであり、機能の一部に関する知見はあるが、
ミトコンドリアの形態への影響に関する知見がないタンパク質。
配列番号18に記載のタンパク質:NP−002625(PHB)
prohibitin; PHB
配列番号19に記載のタンパク質:NP−038470(SLP2)
stomatin-like protein 2; SLP2
配列番号20に記載のタンパク質:NP−056195(CGI−51)
CGI-51 protein
配列番号21に記載のタンパク質:NP−006109(HAX−1)
HS1 binding protein; HAX1
配列番号22に記載のタンパク質:NP−004484(HADH2)
hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase, type II; HADH2
また、A群の中の配列番号13〜15に記載のタンパク質は、ゲノム研究などにおいてその配列が推定されていたが、今までに単離され確認されたことが無いタンパク質ではあるが、ある種の疾患との関連性が推定されていたタンパク質である。しかし、これらのタンパク質自体も未だ人間が入手したことの無いものであり、本発明により初めて単離され、同定されたものである。したがって、これらのタンパク質は人類が初めて取得し、その作用を確認することができた新規なタンパク質である。例えば、配列番号13のNP−060300と命名されているタンパク質は、卵巣癌のcDNAライブラリーから免疫スクリーニング法により染色体4p11に配座する遺伝子であるとされたものである(Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (1), 401-406 (2001))。また、配列番号14のAAH01837と命名されたタンパク質は、ヒト及びマウスにおける全長が15000以上のcDNAの解析から推定されたものである(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002))。さらに、配列番号15のNP−149061と命名されたタンパク質は、ヒトのネコ眼症候群(cat eye syndrome)のクリティカル領域及びマウスの保存されたシンテニー(synteny)の解析及び第22染色体のセントロメア周辺における候補遺伝子の探索から推定されたものである(Genome Res. 11 (6), 1053-1070 (2001))。
このようにC群に分類されているタンパク質は、ある程度の機能は既に報告されているが、しかし、これらの機能がミトコンドリア機能と関連していることは未だ報告されていない。
C群のタンパク質は、既にミトコンドリアへの局在が明らかにされてきており、機能の一部に関する知見は報告されていきているが、ミトコンドリアの形態に影響を与えるタンパク質であることは報告されていないタンパク質である。
このためにA群に属するタンパク質であるc6orf125(配列番号7)、E3−3a(配列番号9)、及びLOC79135(配列番号2)をコードする遺伝子を、それぞれFLAGタグを付してHeLa細胞へ導入して発現させ、これをチトクロームCに対する抗体(α−cyt.c)、及びタグ標識タンパク質(α−FLAG)を用いて二重染色による免疫染色を検討した。その結果を図7及び図8に示す。図7の左側の写真はそれぞれの細胞におけるミトコンドリアの顕微鏡写真である。左から2番目の写真は、チトクロームCに対する抗体(α−cyt.c)により染色(赤色)したものを示し、左から3番目の写真は、タグ標識タンパク質(α−FLAG)で染色(緑色)したものを示し、右側の写真はこれらをマージしたものである。図8の写真は図7の拡大像を示している。
この結果、c6orf125(配列番号7)、E3−3a(配列番号9)、及びLOC79135(配列番号2)のタンパク質はいずれもミトコンドリアに局在しており、c6orf125及びE3−3aでは、ミトコンドリアは管状の形態となり、当該を管状の形態のトコンドリアの先端部に局在しており、これらのタンパク質はミトコンドリアの融合や***に関与するものであると考えられ、また、LOC79135ではミトコンドリアが車軸状の形態となり、このタンパク質はミトコンドリアを車軸状の形態に誘導する活性があることが示された。
この結果、LOC79714(配列番号5)、CHCHD3(配列番号10)、及びOCIA(配列番号13)のいずれのタンパク質もミトコンドリアに局在化しており、LOC79714及びCHCHD3では、ミトコンドリアが細胞核の近辺に凝集しており、これらのタンパク質はミトコンドリアを細胞内で凝集させる活性を有することが示された。
これらの結果、SLP2の過剰発現細胞ではミトコンドリアの膜電位の低下が認められなかったものの、PHBの過剰発現細胞ではミトコンドリアの膜電位の低下が認められた(図11の上段の左側の写真中の矢印参照)。このことは、PHBタンパク質がミトコンドリアにおいて膜電位の調節に関わっている可能性を示しており、本発明におけるタンパク質の中には、ミトコンドリアの形態の制御だけでなく、ミトコンドリアの膜電位の制御に関連しているタンパク質が包含されていることが示された。
したがって、本発明は、前記したA群に属する新規なタンパク質を提供するものである。本発明のこれらの15種のタンパク質は、それぞれ配列表の配列番号1〜15に記載されるアミノ酸配列を有するものであるが、当該アミノ酸配列は、ミトコンドリアの形態を制御又は調節することができる活性を有している範囲において、配列表に各々記載されている全アミノ酸配列における50%以下の数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、同じく100%以下の数のアミノ酸が付加され、及び/又は、同じく50%以下の数のアミノ酸が欠失してなるアミノ酸配列を有するものであってもよい。本発明のタンパク質としては、配列表の配列番号1〜15に記載されているタンパク質、及び当該タンパク質と50%以上、好ましくは70%以上、又は80%以上、より好ましくは90%以上のアミノ酸配列における相同性を有するものであって、ミトコンドリアの形態を制御又は調節することができる活性を有しているタンパク質が包含される。
また、本発明は、前記したA〜C群に属するタンパク質の群から選ばれる1種又は2種以上のタンパク質からなるミトコンドリア膜組織形成剤、及びミトコンドリア膜の形態調節剤を提供するものである。
さらに、本発明は、前記したA〜C群に属する22種のタンパク質の群から選ばれる1種又は2種以上のタンパク質が欠損若しくは過剰発現した細胞、又はこれらのタンパク質が添加された細胞であって、ミトコンドリアの形態に異常が生じている細胞に、試験物質を添加して、当該試験物質によるミトコンドリアの形態の変化を測定することからなる、ミトコンドリアの形態を正常化させるために活性な物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
したがって、本発明のミトコンドリア膜組織形成剤、及びミトコンドリア膜の形態調節剤は、ミトコンドリアの形態異常に起因する各種の疾患や、栄養障害や加齢などによるミトコンドリアの形態の異常を修復するための有効成分として、ミトコンドリアの形態異常に起因する各種の疾患を治療・予防するための医薬組成物の成分として有用なだけでなく、栄養障害や加齢などによる体力の減退を予防・回復するための有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、前記した本発明のA〜C群に属するタンパク質の群から選ばれる1種又は2種以上のタンパク質、及び製薬上許容される担体を含有してなるものである。本発明の医薬組成物における有効成分としてのタンパク質は、タンパク質自体であってもよいが、必要により当該タンパク質に対する抗体、当該タンパク質をコードする遺伝子、頭蓋タンパク質の発現を抑制するためのアンチセンスなどであってもよい。
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される有効成分(前記したタンパクや、その抗体など)の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、有効成分の量として一回につき1μgから100mgの範囲で投与される。
(1)前記したA〜C群に属する22種のタンパク質の群から選ばれる1種又は2種以上のタンパク質が欠損若しくは過剰発現した細胞、又はこれらのタンパク質が添加された細胞を培養し、
(2)当該培養された細胞におけるミトコンドリアの形態に異常を生じさせ、
(3)ミトコンドリアの形態に異常が生じている細胞に、試験物質を添加して、
(4)当該試験物質による、当該細胞におけるミトコンドリアの形態の変化を観察・測定する、
ことからなるものである。
この方法における細胞としては、ヒトの細胞、サルの細胞、マウスの細胞、ラットの細胞などの動物細胞、大腸菌、酵母などの微生物細胞などを使用することができる。また、これらの細胞に目的タンパク質を過剰発現させる方法としては、1又は2以上のコピー数を有する遺伝子を用いて形質転換する方法が挙げられる。形質転換方法としては当業者によく知られている通常の手法を採用することができる。また、抗体を用いて目的のタンパク質の機能を障害させたり、遺伝子を欠損させて目的のタンパク質の発現を抑制することもできる。欠損させる方法としては、突然変異法やターゲッティング法などを採用することができる。さらに、細胞種によっては、培養系に目的のタンパク質を添加することにより、目的のタンパク質の過剰発現系と同種の状況を形成してもよい。
ミトコンドリアの形態の変化を観察・測定する方法としては、顕微鏡により観察する方法、目的のタンパク質の抗体による免疫染色法、タグタンパク質による方法、GFPなどの蛍光法などの各種の方法を採用することができる。
本発明のミトコンドリアの形態を正常化させるために活性な物質をスクリーニングする方法により、活性を有すると判定された物質は、ミトコンドリアの各種の機能障害に対する有効成分として有用な物質である。これらの有効性が確認された物質は、医薬の有効成分として、また化粧品や機能性食品における成分として有用である。
本発明のこれらの抗体は、公知の一般的な製造方法によって製造することができる。例えば、本発明のタンパク質又はその一部のアミノ酸配列からなるタンパク質を免疫原(抗原)として、必要に応じてフロイントアジュバント(Freund's Adjuvant)とともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギに免疫することにより製造できる。ポリクローナル抗体は、当該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、当該免疫感作動物から得た抗体産生細胞(脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓のB細胞)と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞(ミエローマ細胞)からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを免疫学的測定法(ELISAなど)により選択することによって製造することができる。
DMEMに10%FBSを添加した培養液を用いて培養した5x108から1x109個のHeLa細胞をトリプシン処理した後に回収し、PCV(packed cell volume)を測定した。細胞塊を10xPCV量の低張液で懸濁したのち、ポッター型ホモゲナイザーでホモゲナイズした後、ショ糖液にて等張とした。これを高速冷却遠心機にて600gで、10分間、4℃にて遠心分離し、上清を細胞質画分とした。得られた細胞質画分を、さらに高速冷却遠心機にて10000gで、10分間、4℃にて遠心分離し、沈殿をミトコンドリア粗画分とした。この沈殿を、等張ショ糖液で懸濁後、密度勾配遠心法に用いた。密度勾配遠心は、OptiPrepTM(Invitrogen社製)を用いて、その35%及び13%、並びに6%Percol(Difco社製)の段階的傾斜濃度(step gradient)を用いて、20000rpmで、16時間、4℃の遠心分離を施行した後、ミトコンドリアのバンドを得た。これを等張ショ糖液で洗浄し、純ミトコンドリア画分とした。
得られた純ミトコンドリア画分を超音波で破砕した後、冷却ミクロ遠心機にて15000rpmで、10分遠心分離して非破砕ミトコンドリアを沈殿として取り除いた後、上清を卓上超遠心機にて100000rpmで、20分、4℃にて遠心分離し、沈殿を粗なミトコンドリア膜画分(A)とし、その上清をマトリックス画分(B)とした。粗な膜画分をアルカリ液にて処理したのち、この条件で超遠心分離を行い、沈殿をミトコンドリア膜に強固に結合するタンパク質群(C)とし、その上清をミトコンドリア膜に弱く結合するタンパク質群(D)とした。
これらの各ミトコンドリア画分の分画の可否を検討するために、それぞれの精製段階で二次元電気泳動にて検討した。二次元電気泳動は以下の方法で実施した。まず各々の画分約200mgのタンパク質をTCA沈殿法で精製し、7M尿素及び2Mチオ尿素を含むサンプル用緩衝液で可溶化した。これをpH3−10のレンジの非線形の等電点電気用ゲル(ImmobilineTM DryStrip pH3-10 NL: Amersham Biosciences)を用いて一次元電気泳動法を施行後、ヨードアセトアミドにてアルキル化処理して、二次元目の電気泳動に供した。二次元目の電気泳動は10%または12%のSDS−PAGEを施行し、銀染色またはCBB染色にてタンパク質のスポットを検出した。
図3は、同様の方法でミトコンドリア膜に強固に結合するタンパク質群(C)について検討した結果であり、図4は同様にミトコンドリア膜に弱く結合するタンパク質群(D)について検討した結果である。なお、ゲルの染色はCBB染色法を用いた。その結果、膜タンパク質(例えばATP合成酵素dサブユニット:図3及び図4中の矢印参照)は膜に強固に結合するタンパク質群(C)に多く見られることなどから、アルカリ洗浄法による精製はよく行なわれたことがわかった。
前記した実施例1で得られたミトコンドリア膜に強固に結合するタンパク質群(C)を網羅的に解析するために、この画分を改めて12%SDS−PAGEを用いて二次元電気泳動法を行い、CBB染色の染色性を高めてタンパク質を検出したところ、合計247スポットを検出した(図3参照)。
これらのスポットをすべて切り出し、トリプシンにてゲル中での消化(in gel digestion)を行った後、ペプチドを精製し、これをLC−MS/MS(ナノLCとしてParadigm MS−4と、MS/MSとしてFinigan LTQとを組み合わせて用いた。)にて分析し、ペプチド配列タギング(Peptide sequence tagging)法を用いてデータベース検索を行ない、各スポットのタンパク質をすべて同定した。247個のスポットを解析し、重複を排除して171種類のタンパク質を同定した。その結果を分類したものを表1に示した。以上の結果から、同定されたタンパク質がミトコンドリアタンパク質であり、実施例1に記載したミトコンドリアの精製標品の純度が高いことが示された。
表1で同定されたタンパク質の中で、新たにミトコンドリアの形態や機能の調節に関与する可能性のあるタンパク質に着目し、各々のタンパク質の生物学的情報の程度により以下の(A)〜(C)の3群に分類した。
A.機能が明らかにされていないタンパク質群。
B.機能の一部に関する知見はあるが、ミトコンドリアでの機能が明らかでないタンパ ク質群。
C.ミトコンドリアへの局在が明らかであり、機能の一部に関する知見はあるが、ミト コンドリアの形態への影響に関する知見がないタンパク質群。
(1)タンパク質A−1(配列番号1に記載のタンパク質):
検索結果:NP_060336 hypothetical protein LOC54968
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):10.00%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mlflalgspw avelplcgrr talcaaaalr
1
gprasvsras sssgpsgpva gwstgpsgaa
31
rllrrpgraq ipvywegyvr flntpsdkse
61
dgrliytgnm aravfgvkcf systsliglt
91
flpyiftqnn aisesvplpi qiifygimgs
121
ftvitpvllh fitkgyvirl yheattdtyk
151
aitynamlae tstvfhqndv kipdakhvft
181
tfyaktksll vnpvlfpnre dyihlmgydk
211
eefilymeet seekrhkddk
241 260
(下線部分は、配列合致部分を示す。以下同じ。)
検索結果:NP_077027 hypothetical protein LOC79135
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):13.13%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mfkviqrsvg paslslltfk vyaapkkdsp
1
pknsvkvdel slysvpegqs kyveearsql
31
eesisqlrhy cepyttwcqe tysqtkpkmq
61
slvqwgldsy dylqnappgf fprlgvigfa
91
gliglllarg skikklvypp gfmglaasly
121
ypqqaivfaq vsgerlydwg lrgyiviedl
151
wkenfqkpgn vknspgtk
181 198
検索結果:NP_001001692 FLJ45139 protein
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's): 4.41%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mkkrfynakt vsillvkqqn nwaissqlhh
1
qlmpnlesiw lrmekeslpr slnfdhhgiy
31
mnwqtkfmll lktvsiprsq aiftqpglgs
61
gtpqgykqsh salgwaatls cwgkdgsrql
91
swvtagssfh ksdlis
121 136
検索結果:NP_775932 hypothetical protein LOC285492
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):10.86%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mrlpgapalp dadflvhlhf lvqtswficn
1
flvripwasa lpdapallvi lektfpehat
31
crgcwvsgyl cwtapgncic sanvgflkie
61
ntyrqihhth mhrhththtd ksithtctdt
91
htqsqrhrlt sralrlfiln aitdtskfga
121
avffyvyclf adsvykffpf lppfr
151 175
検索結果:NP_078937 hypothetical protein LOC79714
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):13.16%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mtrtlcspgp sqpgekrpee valglhhrlp
1
algralghsi qqratstakt wwdryeefvg
31
lnevreaqgk vteaekvfmv arglvreare
61
dlevhqaklk evrdrldrvs redsqylela
91
tlehrmlqee krlrtaylra edserekfsl
121
fsaavreshe kertraertk nwsligsvlg
151
aligvagsty vnrvrlqelk allleaqkgp
181
vslqeaireq assysrqqrd lhnlmvdlrg
211
lvhaagpgqd sgsqagsppt rdrdvdvlsa
241
alkeqlshsr qvhscleglr eqldglektc
271
sqmagvvqlv ksaahpglve padgampsfl
301
leqgsmilal sdteqrleaq vnrntiystl
331
vtcvtfvatl pvlymlfkas
361 380
検索結果:AAQ89151 HSAL5836
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):31.46%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mhsalatall llipllllrr ffdgsalreg
1
gsrekpgpsr rrwaghspep wrsptlrsgp
31
gfpsyplgvp afvfispgps psqwalpcl
61 89
検索結果:NP_115716 chromosome 6 open reading frame 125
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):53.13%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
maasryrrfl klceewpvde tkrgrdlgay
1
lrqrvaqafr egentqvaep eacdqmyesl
31
arlhsnyykh kyprprdtsf sglsleeykl
61
ilstdtleel keidkgmwkk lqekfapkgp
91
eedhka
121 126
検索結果:BAC04486 unnamed protein product
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):18.60%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mksklpppsg rlcshswrtg sgaapggsag
1
aaegffagtv qqaardktar qrpmargsse
31
pespaarrfs ipgsvqghld avgksrsgdi
61
gsslrveagd krtqasperq phcgahdaqg
91
ehheaqeig
121 129
検索結果:NP_951032 nuclear protein E3-3 isoform a
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):35.33%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
matalalrsl yrarpslrcp pvelpwaprr
1
ghrlspadde lyqrtrisll qreaaqamyi
31
dsynsrgfmi ngnrvlgpca llphsvvqwn
61
vgshqdited sfslfwllep rieivvvgtg
91
drterlqsqv lqamrqrgia vevqdtpnac
121
atfnflcheg rvtgaalipp pggtsltslg
151
qaaq
181 184
検索結果:NP_060282 coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain
containing 3; CHCHD3
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):39.21%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mggttstrrv tfeadeneni tvvkgirlse
1
nvidrmkess psgsksqrys gaygasvsde
31
elkrrvaeel aleqakkese dqkrlkqake
61
ldreraaane qltrailrer icseeeraka
91
khlarqleek drvlkkqdaf ykeqlarlee
121
rssefyrvtt eqyqkaaeev eakfkryesh
151
pvcadlqaki lqcyrenthq tlkcsalatq
181
ymhcvnhakq smlekgg
211 227
検索結果:NP_057026 hypothetical protein LOC51001 ; CGI-12
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):41.25%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
malsaqqipr wfnsvklrsl inaaqltkrf
1
trpartllhg fsaqpqissd ncflqwgfkt
31
yrtsslwnss qstssssqen nsaqssllps
61
mneqsqktqn issfdselfl eeldelppls
91
pmqpiseeea iqiiadpplp pasftlrdyv
121
dhsetlqklv llgvdlskie khpeaanlll
151
rldfekdikq mllflkdvgi ednqlgaflt
181
knhaifsedl enlktrvayl hsknfskadv
211
aqmvrkapfl lnfsverldn rlgffqkele
241
lsvkktrdlv vrlprlltgs lepvkenmkv
271
yrlelgfkhn eiqhmitrip kmltankmkl
301
tetfdfvhnv msiphhiivk fpqvfntrlf
331
kvkerhlflt ylgraqydpa kpnyisldkl
361
vsipdeifce eiakasvqdf ekflktl
391 417
検索結果:Q9H078 suppressor of potassium transport defect 3; SKD3
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):30.41%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
MLGSLVLRRK ALAPRLLLRL LRSPTLRGHG
1
GASGRNVTTG SLGEPQWLRV ATGGRPGTSP
31
ALFSGRGAAT GGRQGGRFDT KCLAAATWGR
61
LPGPEETLPG QDSWNGVPSR AGLGMCALAA
91
ALVVHCYSKS PSNKDAALLE AARANNMQEV
121
SRLLSEGADV NAKHRLGWTA LMVAAINRNN
151
SVVQVLLAAG ADPNLGDDFS SVYKTAKEQG
181
IHSLEDGGQD GASRHITNQW TSALEFRRWL
211
GLPAGVLITR EDDFNNRLNN RASFKGCTAL
241
HYAVLADDYR TVKELLDGGA NPLQRNEMGH
271
TPLDYAREGE VMKLLRTSEA KYQEKQRKRE
301
AEERRRFPLE QRLKEHIIGQ ESAIATVGAA
331
IRRKENGWYD EEHPLVFLFL GSSGIGKTEL
361
AKQTAKYMHK DAKKGFIRLD MSEFQERHEV
391
AKFIGSPPGY VGHEEGGQLT KKLKQCPNAV
421
VLFDEVDKAH PDVLTIMLQL FDEGRLTDGK
451
GKTIDCKDAI FIMTSNVASD EIAQHALQLR
481
QEALEMSRNR IAENLGDVQI SDKITISKNF
511
KENVIRPILK AHFRRDEFLG RINEIVYFLP
541
FCHSELIQLV NKELNFWAKR AKQRHNITLL
571
WDREVADVLV DGYNVHYGAR SIKHEVERRV
601
VNQLAAAYEQ DLLPGGCTLR ITVEDSDKQL
631
LKSPELPSPQ AEKRLPKLRL EIIDKDSKTR
661
RLDIRAPLHP EKVCNTI
691 707
検索結果:NP_060300 ovarian carcinoma immunoreactive antigen; OCIA
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):13.47%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mngradfrep naevprpiph igpdyiptee
1
errvfaecnd esfwfrsvpl aatsmlitqg
31
liskgilssh pkygsipkli lacimgyfag
61
klsyvktcqe kfkklenspl gealrsgqar
91
rssppghyyq kskydssvsg qssfvtspaa
121
dniemlphye pipfsssmne saptgitdhi
151
vqgpdpnlee spkrknitye elrnknresy
181
evsltqktdp svrpmhervp kkevkvnkyg
211
dtwde
241 245
検索結果:AAH01837 glioblastoma amplified sequence; GBAS
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's): 9.44%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
maarvlrarg aawaggllqr aapcsllprl
1
rtwtsssnrs redswlkslf vrkvdprkda
31
hsnllakket snlyklqfhn vkpecleayn
61
kicqevlpki hedkhypctl vgtwntwyge
91
qdqavhlwry eggypaltev mnklrenkef
121
lefrkarsdm llsrknqlll efsfwnepvp
151
rsgpniyelr syqlrpgtmi ewgnywarai
181
rfrqdgneav ggffsqigql ymvhhlwayr
211
dlqtredirn aawhkhgwee lvyytvpliq
241
emesrimipl ktsplq
271 286
検索結果:NP_149061 cat eye syndrome chromosome region,
candidate 5 isoform 2 precursor
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's): 3.87%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
maawgcvaal gaarglcwra araaaglqgr
1
parrcyavgp aqspptfgfl ldidgvlvrg
31
hrvipaalka frrlvnsqgq lrvpvvfvtn
61
agnilqhska qelsallgce vdadqvilsh
91
spmklfseyh ekrmlvsgqg pvmenaqglg
121
frnvvtvdel rmafplldmv dlerrlkttp
151
lprndfprie gvlllgepvr wetslqlimd
181
vllsngspga glatppyphl pvlasnmdll
211
wmaeakmprf ghgtfllcle tiyqkvtgke
241
lryeglmgkp siltyqyaed lirrqaerrg
271
waapirklya vgdnpmsdvy ganlfhqylq
301
kathdgapel gaggtrqqqp sasqscisil
331
vctgvynprn pqstepvlgg geppfhghrd
361
lcfspglmea shvvndvnea vqlvfrkegw
391
ale
421 423
検索結果:NP_006308 brain abundant, membrane attached
signal protein 1
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):76.21%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mggklskkkk gynvndekak ekdkkaegaa
1
teeegtpkes epqaaaepae akegkekpdq
31
daegkaeeke gekdaaaake eapkaepekt
61
egaaeakaep pkapeqeqaa pgpaaggeap
91
kaaeaaaapa esaapaagee pskeegepkk
121
teapaapaaq etksdgapas dskpgsseaa
151
pssketpaat eapsstpkaq gpaasaeepk
181
pveapaansd qtvtvke
211 227
検索結果:NP_002083 G-rich RNA sequence binding factor 1
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):13.92%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
magtrwvlga llrgcgcncs scrrtgaacl
1
pfysaasypa lrasllpqsl aaaaavptrs
31
ysqeskttyl edlppppeye lapskleeev
61
ddvfliraqg lpwsctmedv lnffsdcrir
91
ngengihfll nrdgkrrgda liemeseqdv
121
qkalekhrmy mgqryvevye innedvdalm
151
kslqvksspv vndgvvrlrg lpyscnekdi
181
vdffaglniv ditfvmdyrg rrktgeayvq
211
feepemanqa llkhreeign ryieifpsrr
241
nevrthvgsy kgkkiasfpt akyitepemv
271
feehevnedi qpmtafesek eielpkevpe
301
klpeaadfgt tsslhfvhmr glpfqanaqd
331
iinffaplkp vritmeysss gkatgeadvh
361
fethedavaa mlkdrshvhh ryielflnsc
391
pkgk
421 424
検索結果:NP_002625 prohibitin; PHB
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):29.04%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
maakvfesig kfglalavag gvvnsalynv
1
daghravifd rfrgvqdivv gegthflipw
31
vqkpiifdcr srprnvpvit gskdlqnvni
61
tlrilfrpva sqlpriftsi gedydervlp
91
sitteilksv varfdageli tqrelvsrqv
121
sddlteraat fglilddvsl thltfgkeft
151
eaveakqvaq qeaerarfvv ekaeqqkkaa
181
iisaegdska aelianslat agdglielrk
211
leaaediayq lsrsrnityl pagqsvllql
241
pq
271272
検索結果:NP_038470 stomatin-like protein 2; SLP2
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):41.01%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mlaraargtg alllrgslla sgraprrass
1
glprntvvlf vpqqeawvve rmgrfhrile
31
pglnilipvl driryvqslk eivinvpeqs
61
avtldnvtlq idgvlylrim dpykasygve
91
dpeyavtqla qttmrselgk lsldkvfrer
121
eslnasivda inqaadcwgi rclryeikdi
151
hvpprvkesm qmqveaerrk ratvlesegt
181
resainvaeg kkqaqilase aekaeqinqa
211
ageasavlak akakaeairi laaaltqhng
241
daaasltvae qyvsafskla kdsntillps
271
npgdvtsmva qamgvygalt kapvpgtpds
301
lssgssrdvq gtdasldeel drvkms
331 356
検索結果:NP_056195 CGI-51 protein
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's): 9.38%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mgtvharsle plpssgpdfg glgeeaefve
1
vepeakqeil enkdvvvqhv hfdglgrtkd
31
diiiceigdv fkaknlievm rkshearekl
61
lrlgifrqvd vlidtcqgdd alpngldvtf
91
evtelrrltg syntmvgnne gsmvlglklp
121
nllgraekvt fqfsygtket syglsffkpr
151
pgnfernfsv nlykvtgqfp wsslretdrg
181
msaeysfpiw ktshtvkweg vwrelgclsr
211
tasfavrkes ghslksslsh amvidsrnss
241
ilprrgallk vnqelagytg gdvsfikedf
271
elqlnkqlif dsvfsasfwg gmlvpigdkp
301
ssiadrfylg gptsvrgfsm hsigpqsegd
331
ylggeaywag glhlytplpf rpgqggfgel
361
frthfflnag nlcnlnygeg pkahirklae
391
cirwsygagi vlrlgniarl elnycvpmgv
421
qtgdricdgv qfgagirfl
451 469
検索結果:NP_006109 HS1 binding protein; HAX1
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):18.64%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
mslfdlfrgf fgfpgprshr dpffggmtrd
1
edddeeeeee ggswgrgnpr fhspqhppee
31
fgfgfsfspg ggirfhdnfg fddlvrdfns
61
ifsdmgawtl pshppelpgp esetpgerlr
91
egqtlrdsml kypdshqpri fggvlesdar
121
sespqpapdw gsqrpfhrfd dvwpmdphpr
151
tredndldsq vsqeglgpvl qpqpksyfks
181
isvtkitkpd giveerrtvv dsegrtettv
211
trheadsspr gdpesprppa lddafsildl
241
flgrwfrsr
271 279
検索結果:NP_004484 hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase,
type II; HADH2
AA’によるアミノ酸配列の一致率(protein coverage by AA's):46.36%
検索されたアミノ酸配列とその一致部分
maaacrsvkg lvavitggas glglataerl
1
vgqgasavll dlpnsggeaq akklgnncvf
31
apadvtsekd vqtalalakg kfgrvdvavn
61
cagiavaskt ynlkkgqtht ledfqrvldv
91
nlmgtfnvir lvagemgqne pdqggqrgvi
121
intasvaafe gqvgqaaysa skggivgmtl
151
piardlapig irvmtiapgl fgtplltslp
181
ekvcnflasq vpfpsrlgdp aeyahlvqai
211
ienpflngev irldgairmq p
241 261
これらのタンパク質のドメイン構成を、それぞれのタンパク質についてSIB(Swiss Institute of Bioinformatics)のプロテオミクスサーバーであるExPASy(Expert Protein Analysis System)にアクセスして、各種の予測ツールでドメイン構成を予測した。この結果を図5及び図6に示す。これらの結果から、同定された多くのタンパク質が予測上のミトコンドリア標的シグナル(MTS)や膜貫通ドメインなどを持つタンパク質であることが明らかとなった。
実施例1及び2において単離され同定されたタンパク質群のそれぞれのcDNAをPCR法により単離し、当該タンパク質のカルボキシル末端にFLAGタグなどのタグタンパク質を融合させるような融合タンパク質をコードする遺伝子を構築し、これを動物細胞用発現ベクターに挿入したプラスミドを作製した。これらの遺伝子をHeLa細胞に導入し、発現させた。これらの発現細胞を免疫細胞染色法にて、タグ標識タンパク質とミトコンドリアのタンパク質としてチトクロームC(cyt. C)に対する抗体を用いて、二重染色を行なった。これを共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
結果を図7に示す。この結果の拡大図を図8に示す。この結果、c6orf125およびE3−3aは、管状の形態をもつミトコンドリアの先端部に位置し、ミトコンドリアの融合や***に関与する可能性がある。また、LOC79135はミトコンドリアが車軸状の形態をとるように誘導する活性があることが示された。
また、タンパク質としてLOC79714、OCIA、及びCHCHD3を同様に行った結果を図9に示す。この結果、OCIAおよびCHCHD3のタンパク質はミトコンドリアに局在すること、LOC79714およびCHCHD3は、ミトコンドリアを凝集させる活性が存在することが示された。
この結果を図10に示す。この結果、いずれのタンパク質も、ミトコンドリアの形態を凝集させる活性があることが示された。
C群に属するタンパク質であるPHB及びSLP2のカルボキシル末端にFLAGタグを融合させた融合タンパク質をコードする遺伝子をHeLa細胞に強制発現させ、ミトコンドリア膜電位に依存したミトコンドリア染色マーカーRh123でミトコンドリアの膜電位を検出した。
結果を図11に示す。その結果、SLP2の過剰発現細胞ではミトコンドリアの膜電位の低下が認められなかったものの、PHBの過剰発現細胞ではミトコンドリアの膜電位の低下が認められた(図11の矢印)。このことは、PHBタンパク質がミトコンドリアにおいて膜電位の調節に関わっている可能性を示している。
配列番号2:NP−077027のアミノ酸配列。
配列番号3:NP−001001692のアミノ酸配列。
配列番号4:NP−775932のアミノ酸配列。
配列番号5:NP−078937のアミノ酸配列。
配列番号6:AAQ89151のアミノ酸配列。
配列番号7:NP−115716のアミノ酸配列。
配列番号8:BAC04486のアミノ酸配列。
配列番号9:NP−951032のアミノ酸配列。
配列番号10:NP−060282のアミノ酸配列。
配列番号11:NP−057026のアミノ酸配列。
配列番号12:Q9H078のアミノ酸配列。
配列番号13:NP−060300のアミノ酸配列。
配列番号14:AAH01837のアミノ酸配列。
配列番号15:NP−149061のアミノ酸配列。
配列番号16:NP−006308のアミノ酸配列。
配列番号17:NP−002083のアミノ酸配列。
配列番号18:NP−002625のアミノ酸配列。
配列番号19:NP−038470のアミノ酸配列。
配列番号20:NP−056195のアミノ酸配列。
配列番号21:NP−006109のアミノ酸配列。
配列番号22:NP−004484のアミノ酸配列。
配列番号23:NP−060336の塩基配列。
配列番号24:NP−077027の塩基配列。
配列番号25:NP−001001692の塩基配列。
配列番号26:NP−775932の塩基配列。
配列番号27:NP−078937の塩基配列。
配列番号28:AAQ89151の塩基配列。
配列番号29:NP−115716の塩基配列。
配列番号30:BAC04486の塩基配列。
配列番号31:NP−951032の塩基配列。
配列番号32:NP−060282の塩基配列。
配列番号33:NP−057026の塩基配列。
配列番号34:Q9H078の塩基配列。
配列番号35:NP−060300の塩基配列。
配列番号36:AAH01837の塩基配列
配列番号37:NP−149061の塩基配列。
配列番号38:NP−006308の塩基配列。
配列番号39:NP−002083の塩基配列。
配列番号40:NP−002625の塩基配列。
配列番号41:NP−038470の塩基配列。
配列番号42:NP−056195の塩基配列。
配列番号43:NP−006109の塩基配列。
配列番号44:NP−004484の塩基配列。
Claims (9)
- 配列表の配列番号1〜15のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質。
- 配列表の配列番号1〜12のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質。
- タンパク質が、ミトコンドリアに局在するタンパク質である請求項1又は2に記載のタンパク質。
- タンパク質が、ミトコンドリアの形態を制御又は調節する機能を有するものである請求項1又は2に記載のタンパク質。
- タンパク質が、培養細胞を細胞破砕した後、遠心分離法にて粗なミトコンドリア画分を分離し、この画分を比重密度勾配遠心法にて精製し単離されたものである請求項1又は2に記載のタンパク質。
- 配列表の配列番号1〜22のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質の群から選ばれる1種又は2種以上のタンパク質が欠損若しくは過剰発現した細胞、又はこれらのタンパク質が添加された細胞であって、ミトコンドリアの形態に異常が生じている細胞に、試験物質を添加して、当該試験物質によるミトコンドリアの形態の変化を測定することからなる、ミトコンドリアの形態を正常化させるために活性な物質をスクリーニングする方法。
- タンパク質の群が、配列表の配列番号1〜15のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質の群である請求項6に記載の方法。
- タンパク質の群が、配列表の配列番号19〜22のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア膜組織の形成能を有するタンパク質の群である請求項6に記載の方法。
- ミトコンドリアの形態の正常化が、ミトコンドリアの凝集の抑制である請求項6〜8のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005311816A JP4920239B2 (ja) | 2005-10-26 | 2005-10-26 | ミトコンドリア膜タンパク質群およびそれらをコードする遺伝子群 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005311816A JP4920239B2 (ja) | 2005-10-26 | 2005-10-26 | ミトコンドリア膜タンパク質群およびそれらをコードする遺伝子群 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011125684A Division JP5891561B2 (ja) | 2011-06-03 | 2011-06-03 | ミトコンドリア膜タンパク質群およびそれらをコードする遺伝子群 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007119378A true JP2007119378A (ja) | 2007-05-17 |
JP4920239B2 JP4920239B2 (ja) | 2012-04-18 |
Family
ID=38143600
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005311816A Active JP4920239B2 (ja) | 2005-10-26 | 2005-10-26 | ミトコンドリア膜タンパク質群およびそれらをコードする遺伝子群 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4920239B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015500481A (ja) * | 2011-12-19 | 2015-01-05 | エンパイア テクノロジー ディベロップメント エルエルシー | ミトコンドリア粒子を含む大気質センサ |
US9863955B2 (en) | 2012-05-17 | 2018-01-09 | Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd. | AMPK activator screening method, and AMPK activator |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001090304A2 (en) * | 2000-05-19 | 2001-11-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
JP2002223768A (ja) * | 2001-01-31 | 2002-08-13 | Japan Science & Technology Corp | ヒトミトコンドリア蛋白質とこの蛋白質をコードするポリヌクレオチド |
WO2003025148A2 (en) * | 2001-09-19 | 2003-03-27 | Nuvelo, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
-
2005
- 2005-10-26 JP JP2005311816A patent/JP4920239B2/ja active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001090304A2 (en) * | 2000-05-19 | 2001-11-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
JP2002223768A (ja) * | 2001-01-31 | 2002-08-13 | Japan Science & Technology Corp | ヒトミトコンドリア蛋白質とこの蛋白質をコードするポリヌクレオチド |
WO2003025148A2 (en) * | 2001-09-19 | 2003-03-27 | Nuvelo, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015500481A (ja) * | 2011-12-19 | 2015-01-05 | エンパイア テクノロジー ディベロップメント エルエルシー | ミトコンドリア粒子を含む大気質センサ |
US9863955B2 (en) | 2012-05-17 | 2018-01-09 | Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd. | AMPK activator screening method, and AMPK activator |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4920239B2 (ja) | 2012-04-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Chu et al. | Regulation of the ER stress response by a mitochondrial microprotein | |
Lin et al. | Toxic PR poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion target LC domain polymers | |
Braun et al. | Mutations in KEOPS-complex genes cause nephrotic syndrome with primary microcephaly | |
Boke et al. | Amyloid-like self-assembly of a cellular compartment | |
Bang et al. | Myopalladin, a novel 145-kilodalton sarcomeric protein with multiple roles in Z-disc and I-band protein assemblies | |
Gertler et al. | Mena, a relative of VASP and Drosophila Enabled, is implicated in the control of microfilament dynamics | |
Zha et al. | ASIC2 subunits target acid-sensing ion channels to the synapse via an association with PSD-95 | |
Ruff et al. | Sequence grammar underlying the unfolding and phase separation of globular proteins | |
Sato et al. | Profilin is an effector for Daam1 in non-canonical Wnt signaling and is required for vertebrate gastrulation | |
Wang et al. | Structural basis of diverse membrane target recognitions by ankyrins | |
Chang et al. | Interaction between Poly (ADP-ribose) and NuMA contributes to mitotic spindle pole assembly | |
Scifo et al. | Proteomic analysis of the palmitoyl protein thioesterase 1 interactome in SH-SY5Y human neuroblastoma cells | |
Yin et al. | The 1D4 antibody labels outer segments of long double cone but not rod photoreceptors in zebrafish | |
Dráberová et al. | Differential expression of human γ‐tubulin isotypes during neuronal development and oxidative stress points to a γ‐tubulin‐2 prosurvival function | |
Machado et al. | Heat shock cognate protein 70 regulates gephyrin clustering | |
Ali et al. | Endoplasmic reticulum quality control is involved in the mechanism of endoglin-mediated hereditary haemorrhagic telangiectasia | |
Yang et al. | A plasma membrane localized protein phosphatase in Toxoplasma gondii, PPM5C, regulates attachment to host cells | |
Pinello et al. | MAR1 links membrane adhesion to membrane merger during cell-cell fusion in Chlamydomonas | |
JP2003284574A (ja) | 核酸分子、ポリペプチド、ならびにアルツハイマー病の診断および処置を含むそれらの使用 | |
JP2013165715A (ja) | タンパク質重合体の重合核となりうるタンパク質又はその重合体が導入された細胞及びその製造法 | |
Wiktor et al. | Identification of novel potential interaction partners of UDP-galactose (SLC35A2), UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) and an orphan (SLC35A4) nucleotide sugar transporters | |
Travina et al. | The long linker region of telomere-binding protein TRF2 is responsible for interactions with lamins | |
Koch et al. | Systematic functional analysis of Bicaudal-D serine phosphorylation and intragenic suppression of a female sterile allele of BicD | |
Chambraud et al. | FKBP52 in neuronal signaling and neurodegenerative diseases: a microtubule story | |
JP4920239B2 (ja) | ミトコンドリア膜タンパク質群およびそれらをコードする遺伝子群 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080725 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110405 |
|
RD13 | Notification of appointment of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7433 Effective date: 20110527 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110603 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20110527 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110711 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20110711 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120117 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120201 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4920239 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150210 Year of fee payment: 3 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |