JP2007117003A - Method for rapidly removing and purifying hollow virus particle - Google Patents
Method for rapidly removing and purifying hollow virus particle Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007117003A JP2007117003A JP2005314476A JP2005314476A JP2007117003A JP 2007117003 A JP2007117003 A JP 2007117003A JP 2005314476 A JP2005314476 A JP 2005314476A JP 2005314476 A JP2005314476 A JP 2005314476A JP 2007117003 A JP2007117003 A JP 2007117003A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- exchange membrane
- virus
- vector
- hollow particles
- viral vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、ウイルスベクターの調製過程において、イオン交換膜を用いてウイルスベクター粗溶解物を精製する方法に関する。本発明は特に、イオン交換膜を用いて中空粒子を除去する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法に用いるイオン交換膜を含む、ウイルスベクター精製用のキットに関する。 The present invention relates to a method for purifying a crude viral vector lysate using an ion exchange membrane in the process of preparing a viral vector. In particular, the present invention relates to a method for removing hollow particles using an ion exchange membrane. The present invention also relates to a kit for purifying a viral vector comprising an ion exchange membrane used in the method of the present invention.
さらに本発明は、イオン交換膜を用いてウイルスベクター粗溶解物から中空粒子を精製して回収する方法に関する。また、本発明は、本発明の方法に用いるイオン交換膜を含む、ウイルス中空粒子精製用のキットに関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for purifying and recovering hollow particles from a virus vector crude lysate using an ion exchange membrane. The present invention also relates to a kit for purifying virus hollow particles, which includes an ion exchange membrane used in the method of the present invention.
近年、培養細胞のみならず組織や個体において目的の遺伝子を発現させるために、様々な遺伝子導入技術が開発されている。ウイルスベクターについてもアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス等に由来するものが開発されており、タンパク質の機能解析や遺伝子治療実験などで目的に応じて使い分けられている。 In recent years, various gene transfer techniques have been developed in order to express a target gene not only in cultured cells but also in tissues and individuals. Virus vectors derived from adenoviruses, retroviruses, adeno-associated viruses, and the like have been developed, and are used properly according to the purpose in protein functional analysis and gene therapy experiments.
例えば、アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus、以下ＡＡＶ）に由来するベクターは、１）病原性がないこと、２）免疫反応性が低いこと、３）非***細胞への遺伝子導入が可能であること、４）導入遺伝子が長期間発現すること、といった特徴を備えており、安全面で優れている。また近年、血清型１〜９型のＡＡＶに由来するベクターも開発されており、各血清型の感染性の違いを応用して、神経細胞・筋細胞・肝細胞など様々な組織での遺伝子発現が可能となっている。これらの特徴によりＡＡＶベクターは遺伝子治療において有望視されている。例えば、神経変性疾患の中でも頻度が高いパーキンソン病や血友病を対象に、遺伝子治療への臨床試験が始まっている。さらに、筋肉で分泌型タンパク質を発現することにより、全身的な効果が得られるタンパク質補充療法が可能であり、高血圧、高脂血症や動脈硬化性疾患などの生活習慣病の治療への応用も強く期待される。 For example, a vector derived from an adeno-associated virus (hereinafter referred to as AAV) is 1) non-pathogenic, 2) low in immunoreactivity, 3) gene transfer into non-dividing cells is possible. 4) It has the characteristics that the transgene is expressed for a long time, and is excellent in safety. In recent years, vectors derived from AAV of serotypes 1 to 9 have been developed, and gene expression in various tissues such as nerve cells, muscle cells, and hepatocytes is applied by applying the difference in infectivity of each serotype. Is possible. These characteristics make AAV vectors look promising in gene therapy. For example, clinical trials for gene therapy have started for Parkinson's disease and hemophilia, which are common in neurodegenerative diseases. Furthermore, protein replacement therapy with systemic effects can be achieved by expressing secreted proteins in muscle, and it can be applied to the treatment of lifestyle-related diseases such as hypertension, hyperlipidemia and arteriosclerotic diseases. Highly expected.
生体内において、ウイルスベクターを用いて高い遺伝子導入効率を得るためには、不純物の混入が少ない精製度の高いウイルスベクターを迅速に調製する必要がある。ところが、従来の塩化セシウムを用いた密度勾配遠心と透析処理を用いた精製方法は非常に煩雑でコストがかかるため、効率の高い精製方法の開発が待たれている。 In order to obtain high gene transfer efficiency using a viral vector in vivo, it is necessary to rapidly prepare a highly purified viral vector with few impurities. However, since the conventional purification method using density gradient centrifugation using cesium chloride and dialysis treatment is very complicated and expensive, development of an efficient purification method is awaited.
また、ウイルスベクターを含む細胞破砕溶液中には、ウイルスの構造タンパク質からなるが内部にベクターゲノムを含まない中空粒子が含まれている。中空粒子は、ウイルスの構造タンパク質を有するため、ウイルスベクターによる感染を競合的に阻害し、遺伝子導入効率の低下およびそれに伴う導入遺伝子発現効率の低下を引き起こす原因となる。したがって、最小限のウイルスベクターの量で高い遺伝子発現を得るためには、生成過程において中空粒子が粗溶解物から除かれる必要がある。ところが、ウイルスベクターの精製度の判断に従来用いられていた電気泳動では、細胞由来の不純物の混入率を判定することは可能であるが、ウイルスの構造タンパク質からなる中空粒子をウイルス粒子と区別することは困難であり、精製されたベクターサンプル中の中空粒子の混入率については検討されていない。 Moreover, the cell disruption solution containing the viral vector contains hollow particles that are composed of viral structural proteins but do not contain the vector genome. Since the hollow particles have a viral structural protein, infection by the viral vector is competitively inhibited, causing a decrease in gene transfer efficiency and a decrease in transgene expression efficiency associated therewith. Therefore, in order to obtain high gene expression with a minimum amount of viral vector, the hollow particles need to be removed from the crude lysate during the production process. However, electrophoresis that has been used in the past to determine the degree of purification of a viral vector can determine the contamination rate of cell-derived impurities, but distinguishes hollow particles made of viral structural proteins from viral particles. This is difficult, and the contamination rate of the hollow particles in the purified vector sample has not been studied.
セシウム密度勾配超遠心を用いる従来のウイルス粒子の精製技術では、中空粒子をウイルスベクター粗溶解物から除去する条件や効果が検討されていない。原理的には、セシウム密度勾配超遠心を用いる方法では、中空粒子とウイルス粒子の比重が近接しているため、中空粒子をウイルスベクター粗溶解物から完全に除去することは困難である。 In conventional virus particle purification techniques using cesium density gradient ultracentrifugation, conditions and effects for removing hollow particles from a virus vector crude lysate have not been studied. In principle, in the method using cesium density gradient ultracentrifugation, since the specific gravity of the hollow particles and the virus particles are close to each other, it is difficult to completely remove the hollow particles from the virus vector crude lysate.
また、イオン交換クロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーを用いる、ウイルスベクターの精製方法についても報告されているが、ウイルスベクターを含む粗溶解物から中空粒子を除去する条件や効果については検討されていない（例えば、特許第３３１３１１７号、特表２０００−５１０６８２号、特表平１１−５１１３２６号、特表２００１−５１３６４４号、特表２００１−５１４８４５号、または米国特許第６，５９３，１２３号等を参照）。また、上記文献に記載の方法は、ビーズ充填カラムを用いることを主に意図しているが、ビーズ充填カラムはサンプルの拡散が不十分であり、吸着効率が低く、そしてカラムの容積が大きいため吸着・溶出に時間がかかる等、必ずしも効率がよい方法とはいえず、効率の良いウイルスベクターの精製方法の開発が期待されていた。 Moreover, although the purification method of the viral vector using various chromatography including ion exchange chromatography has been reported, the conditions and effects for removing the hollow particles from the crude lysate containing the viral vector have not been studied ( (For example, refer to Japanese Patent No. 3313117, Japanese Patent Publication No. 2000-510682, Japanese Patent Publication No. 11-511326, Japanese Patent Publication No. 2001-513644, Japanese Patent Publication No. 2001-514845, or US Pat. . In addition, the method described in the above document is mainly intended to use a bead packed column, but the bead packed column has insufficient sample diffusion, low adsorption efficiency, and a large column volume. Development of an efficient method for purifying a viral vector has been expected because it is not necessarily an efficient method because it takes time for adsorption and elution.
米国特許第６，８６１，００１号は、陰イオン交換膜を用いたウイルスの除去方法を記載している。しかしながら、この文献に記載された技術は、サンプルからウイルス粒子を除去することを目的としており、ウイルスベクターと中空粒子とを分離することについては検討されていない。 US Pat. No. 6,861,001 describes a method for removing viruses using an anion exchange membrane. However, the technique described in this document is intended to remove virus particles from a sample, and separation of virus vectors and hollow particles has not been studied.
また、ウイルスを吸着させる陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、同一ｐＨ条件下にて中空粒子とウイルス粒子を異なるピークとして分離することは困難であると一般的には考えられている。 Further, in anion exchange chromatography for adsorbing viruses, it is generally considered that it is difficult to separate hollow particles and virus particles as different peaks under the same pH condition.
したがって、中空粒子をウイルスベクター粗溶解物から迅速かつ効率的に除去し、中空粒子を実質的に含まないベクターを効率よく大量に精製する手法の開発が、ウイルスベクターの臨床応用を成功させるための重要な技術として期待されている。
本発明の目的は、ウイルスベクターの調製過程において、イオン交換膜を用いてウイルスベクター粗溶解物中の中空粒子を除去してウイルスベクターを精製する方法を提供することにある。本発明はまた、本発明の方法に用いるイオン交換膜を含む、ウイルスベクター精製用のキットを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for purifying a virus vector by removing hollow particles in a virus vector crude lysate using an ion exchange membrane in the preparation process of the virus vector. Another object of the present invention is to provide a kit for purifying a viral vector comprising an ion exchange membrane used in the method of the present invention.
本発明はさらに、イオン交換膜を用いてウイルスベクター粗溶解物から中空粒子を回収する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、本発明の方法に用いるイオン交換膜を含む、ウイルス中空粒子回収用のキットを提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide a method for recovering hollow particles from a viral vector crude lysate using an ion exchange membrane. Another object of the present invention is to provide a kit for recovering virus hollow particles, which includes an ion exchange membrane used in the method of the present invention.
本発明者らは上記課題の解決のために、鋭意研究に努めた結果、ウイルスベクターの精製にイオン交換膜を用いることで、簡便かつ効率的にウイルスベクター粗溶解物中に含まれる中空粒子の除去および回収が行えることを見いだし、本発明を完成した。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventors have used an ion exchange membrane for purification of a viral vector, so that the hollow particles contained in the viral vector crude lysate can be easily and efficiently obtained. It has been found that removal and recovery can be performed, and the present invention has been completed.
当初、本発明者らは、ウイルスの構造タンパク質の中にベクターゲノムを含むウイルスベクター粒子と、ウイルスの構造タンパク質のみからなりベクターゲノムを含まない中空粒子を分離するためには、ベクターゲノムを構成するＤＮＡが負電荷を帯びていることを利用し、低いｐＨ条件で陰イオン交換体にウイルスベクター粒子を吸着させることで、中空粒子を除去できることを期待していた。より低いｐＨ条件が好ましいとしたのは、ＤＮＡのリン酸アニオンがより解離した状態にあるため、ウイルスベクター粒子と中空粒子との性質の差をより引き出すことが可能となるためである。そこでまず、ウイルスが特に安定なｐＨ６．５ないし８．０の範囲で、ウイルスベクター粗精製物を陰イオン交換膜を用いた膜クロマトグラフィーにかけ、ウイルスベクター粒子の回収率を検討した。検討の結果、低いｐＨではウイルスが陰イオン交換体に吸着されず、回収率が低くなることが判明した（実施例２を参照）。このことは、陰イオン交換体のみでは中空粒子の除去とウイルスの回収の双方を効率よく行うことは困難であることを示すものである。 Initially, the present inventors constructed a vector genome in order to separate a viral vector particle containing a vector genome in a viral structural protein and a hollow particle consisting only of the viral structural protein and not containing the vector genome. It was expected that hollow particles could be removed by adsorbing viral vector particles to an anion exchanger under low pH conditions utilizing the negative charge of DNA. The reason why the lower pH condition is preferred is that the phosphate anion of DNA is in a more dissociated state, so that the difference in properties between the virus vector particles and the hollow particles can be further extracted. Therefore, first, the virus vector crude product was subjected to membrane chromatography using an anion exchange membrane in the pH 6.5 to 8.0 range where the virus was particularly stable, and the recovery rate of virus vector particles was examined. As a result of the examination, it was found that the virus was not adsorbed to the anion exchanger at a low pH, and the recovery rate was low (see Example 2). This indicates that it is difficult to efficiently perform both the removal of the hollow particles and the recovery of the virus with only the anion exchanger.
そこで、本発明者らは、ウイルスベクター粗精製物を陽イオン交換膜に通し、次いで陰イオン交換膜を用いて膜クロマトグラフィーを行った。すると驚くべきことに陽イオン交換体に中空粒子が吸着してウイルスベクター粗精製物から中空粒子が除かれ、その後の陰イオン交換膜クロマトグラフィーによりウイルスベクター粒子が効率よく回収できることを見いだした。本発明は上記の知見に基づいて完成したものである。 Therefore, the present inventors passed the crude purified viral vector through a cation exchange membrane, and then performed membrane chromatography using an anion exchange membrane. Surprisingly, it was found that the hollow particles were adsorbed on the cation exchanger to remove the hollow particles from the crude virus vector purified product, and the virus vector particles could be efficiently recovered by subsequent anion exchange membrane chromatography. The present invention has been completed based on the above findings.
以下、本発明を詳細に説明する。
中空粒子の除去方法
本発明は、イオン交換膜を用いて、ウイルスベクター粗溶解物中の中空粒子を除去する工程を含む、ウイルスベクターの精製方法を提供する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Method for Removing Hollow Particles The present invention provides a method for purifying a virus vector, which comprises a step of removing hollow particles in a virus vector crude lysate using an ion exchange membrane.
好ましい態様において、本発明の方法は、ウイルスベクターの精製方法であって、前記中空粒子を除去する工程が、ウイルスベクター粗溶解物を陽イオン交換膜を用いる膜クロマトグラフィーにかける工程を含む、前記方法である。 In a preferred embodiment, the method of the present invention is a method for purifying a viral vector, wherein the step of removing the hollow particles includes the step of subjecting the crude viral vector lysate to membrane chromatography using a cation exchange membrane. Is the method.
さらに好ましい態様において、本発明の方法は、ウイルスベクターの精製方法であって、前記中空粒子を除去する工程が、ウイルスベクター粗溶解物を陽イオン交換膜および陰イオン交換膜を用いる膜クロマトグラフィーにかける工程を含む、前記方法である。 In a further preferred embodiment, the method of the present invention is a method for purifying a virus vector, wherein the step of removing the hollow particles is performed by subjecting the virus vector crude lysate to membrane chromatography using a cation exchange membrane and an anion exchange membrane. It is the said method including the process to pour.
本明細書において、イオン交換膜とは、膜状のイオン交換体である。従来のイオン交換クロマトグラフィー担体（ビーズカラム）は、拡散孔が小さいため、流速の早い部分と遅い部分が生じ、マクロ分子（例えばＤＮＡ、プラスミド、ウイルス、分子量の大きなタンパク質など）の拡散に制限が生じる。しかし、イオン交換膜は、均一な孔径を有し、団塊状の表面が均一に分布するので、マクロ分子が拡散孔の全ての吸着部位に出入りするのに充分なスペースがあり、イオン交換の修飾基が広く均等に分布していることからマクロ分子に対しても迅速に吸着・溶出ができるというメリットがある（図１）。したがって、イオン交換膜をウイルスベクターの精製に用いることで、イオン交換樹脂ビーズを用いる場合とは対照的に高い流速、高い吸着容量が得られるので、迅速かつ効率よく精製を行うことができる。 In this specification, an ion exchange membrane is a membrane-like ion exchanger. Conventional ion-exchange chromatography carriers (bead columns) have small diffusion holes, so there are parts with high and low flow rates, limiting the diffusion of macromolecules (eg, DNA, plasmids, viruses, large molecular weight proteins, etc.). Arise. However, the ion exchange membrane has a uniform pore size and a uniform surface distribution, so there is enough space for macromolecules to enter and exit all the adsorption sites of the diffusion pores, and the ion exchange modification Since the groups are widely distributed evenly, there is an advantage that macromolecules can be adsorbed and eluted quickly (FIG. 1). Therefore, by using an ion exchange membrane for purification of a virus vector, a high flow rate and a high adsorption capacity can be obtained as opposed to the case of using ion exchange resin beads, so that purification can be performed quickly and efficiently.
本発明の方法に用いるイオン交換膜の基材は、特に限定はないが、多孔質の基材であって、団塊状の表面が均一に分布している膜が好ましい。イオン交換膜の基材として利用可能なポリマーの例は、ポリ芳香族、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリイミド、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリカーボネート、ポリエステルおよびフッ素ポリマーからなる群より選択されるポリマー、またはそれらの組み合わせであるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の方法に用いるイオン交換膜は、架橋重合されたポリエーテルスルホンで構成される基材で構成される。基材は親水性であることが好ましい。また、膜の孔径は、０．２μｍ〜３．０μｍの範囲であればよく、好ましくは０．５μｍ〜１．２μｍの範囲、最も好ましくは、約０．８μｍである。 The base material of the ion exchange membrane used in the method of the present invention is not particularly limited, but a porous base material with a nodular surface uniformly distributed is preferable. Examples of polymers that can be used as substrates for ion exchange membranes are selected from the group consisting of polyaromatic, polysulfone, polyethersulfone, polyolefin, polystyrene, polyamide, polyimide, cellulose acetate, cellulose nitrate, polycarbonate, polyester, and fluoropolymer. Polymer, or a combination thereof, but is not limited thereto. Preferably, the ion exchange membrane used in the method of the present invention is composed of a substrate composed of cross-linked polymerized polyethersulfone. The substrate is preferably hydrophilic. The pore diameter of the membrane may be in the range of 0.2 μm to 3.0 μm, preferably in the range of 0.5 μm to 1.2 μm, and most preferably about 0.8 μm.
イオン交換膜には、陽イオン交換膜および陰イオン交換膜が含まれる。陽イオン交換膜である場合は基材表面にスルホン酸基、カルボン酸基などを保持し、陰イオン交換膜である場合は基材表面に第四級アンモニウム、第三級アミノ基などを保持するが、これらに限定されない。好ましくは、陽イオン交換膜は基材表面にスルホン酸基を保持し、陰イオン交換膜は基材表面に第四級アンモニウム基を保持する。また、基材表面に提示された官能基は、基材に直接結合したものでもよく、または基材の表面修飾により導入されたものであってもよい。 The ion exchange membrane includes a cation exchange membrane and an anion exchange membrane. In the case of a cation exchange membrane, sulfonic acid groups, carboxylic acid groups, etc. are retained on the substrate surface, and in the case of an anion exchange membrane, quaternary ammonium groups, tertiary amino groups, etc. are retained on the substrate surface. However, it is not limited to these. Preferably, the cation exchange membrane retains sulfonic acid groups on the substrate surface, and the anion exchange membrane retains quaternary ammonium groups on the substrate surface. The functional group presented on the surface of the substrate may be directly bonded to the substrate, or may be introduced by surface modification of the substrate.
本発明の方法に使用可能なイオン交換膜は、高い生体高分子吸着能を有する物が好ましい。高い生体高分子吸着能を有するイオン交換膜は、迅速な吸着・溶出が可能であり、サンプルの流速による影響を受けにくいため、迅速かつ簡便なウイルスベクターの精製が可能になる。生体高分子吸着能は、便宜的には例えば、タンパク質結合容量を指標とすることができる。タンパク質結合容量は、陽イオン交換膜の場合はウシ血清アルブミンまたはイムノグロブリンなど、陰イオン交換膜の場合はリゾチームなどのタンパク質に基づいて決定される。本発明の方法に使用可能なイオン交換膜のタンパク質結合容量は、１５ｍｇ／ｍｌ以上、２０ｍｇ／ｍｌ以上、２５ｍｇ／ｍｌ以上、または３０ｍｇ／ｍｌ以上である。 The ion exchange membrane that can be used in the method of the present invention is preferably one having a high biopolymer adsorption capacity. An ion exchange membrane having a high biopolymer adsorption capacity can be rapidly adsorbed and eluted, and is not easily affected by the flow rate of the sample, so that a virus vector can be purified quickly and easily. For convenience, the biopolymer adsorption capacity can be, for example, the protein binding capacity as an index. The protein binding capacity is determined based on a protein such as bovine serum albumin or immunoglobulin in the case of a cation exchange membrane or lysozyme in the case of an anion exchange membrane. The protein binding capacity of the ion exchange membrane that can be used in the method of the present invention is 15 mg / ml or more, 20 mg / ml or more, 25 mg / ml or more, or 30 mg / ml or more.
上記に記載した性質を有するイオン交換膜は、例えば、米国特許第６，７８０，３２７号、米国特許第６，７８３，９３７号、米国特許第６，８５１，５６１号、および米国特許第６，８６０，３９３号に記載されるようなイオン交換膜であり、これらは引用により本明細書に完全に援用する。また、本願発明の方法に使用可能な市販のイオン交換膜には、以下：陽イオン交換膜として、Mustang（米国登録商標） S（以下、ムスタングＳ）（ポール コーポレーション）、ICE450メンブレン（ポール コーポレーション）、またはSarto-bind S（ザルトリウス）など；陰イオン交換膜として、Mustang（米国登録商標） Q（以下、ムスタングＱ）（ポール コーポレーション）、SB-6407（ポール コーポレーション）、またはSarto-bind Q（ザルトリウス）など；が含まれるが、これらに限定されない。 Ion exchange membranes having the properties described above include, for example, US Pat. No. 6,780,327, US Pat. No. 6,783,937, US Pat. No. 6,851,561, and US Pat. 860,393, which are fully incorporated herein by reference. Commercially available ion exchange membranes that can be used in the method of the present invention include the following: As a cation exchange membrane, Mustang (US registered trademark) S (hereinafter Mustang S) (Pole Corporation), ICE450 membrane (Pole Corporation) Or Sarto-bind S (Sartorius); As anion exchange membrane, Mustang (US registered trademark) Q (hereinafter Mustang Q) (Paul Corporation), SB-6407 (Paul Corporation), or Sarto-bind Q (Sartorius) ) Etc., but is not limited to these.
本発明の方法に使用するイオン交換膜のサイズは、当業者であれば適正なサイズを決定することができる。例えば、初期の実験には、まず最小のシリンジフィルタータイプで、標的とした物質が膜に効率的に吸着されるか、あるいは効率的に除去できる最適条件の設定を行うことができる。スケールアップする際には、シリンジフィルタータイプでの実験データに基づいて、実際の製造スケールに合った適正なサイズを決定し、スケールアップしていくことができる。また、例えば精製するウイルスベクターが遺伝子治療に用いる場合は、実際の製造に用いるイオン交換膜は滅菌されていることが好ましい。 A person skilled in the art can determine an appropriate size for the size of the ion exchange membrane used in the method of the present invention. For example, in an initial experiment, an optimum condition can be set so that the target substance can be efficiently adsorbed on the membrane or efficiently removed with the smallest syringe filter type. When scaling up, it is possible to determine an appropriate size that matches the actual production scale based on the experimental data of the syringe filter type, and to scale up. For example, when the virus vector to be purified is used for gene therapy, the ion exchange membrane used for actual production is preferably sterilized.
本明細書において、ウイルスベクターとは、細胞への外来遺伝子の導入法としてウイルスが本来細胞へ感染・維持される仕組みを応用しているベクターをいう。よって、本明細書においてウイルスベクターは、遺伝子組換え技術を利用して調製される、導入遺伝子を有するベクターゲノムを含むウイルスである。ウイルスベクターを組換えにより調製する際には、ウイルスの構造タンパク質にベクターゲノムがパッケージングされるが、中にはベクターゲノムがパッケージングされずにウイルスの構造タンパク質のみで存在する粒子が生じる。中空粒子とは、このようなウイルスの構造タンパク質からなるが、その内部にベクターゲノムを含んでいない粒子である。ウイルスベクター粒子と中空粒子は、その内部にベクターゲノムを含むか否かの点でのみ違いがある。本発明の方法はウイルスベクター粒子が負の電荷を帯びているＤＮＡで構成されるベクターゲノムを有する点に着目して、その差異に基づいてウイルスベクター粒子と中空粒子を分離する方法であるので、原理的には、遺伝子組換え技術を利用して調製されるウイルスベクター全般について適用可能である。 In the present specification, a viral vector refers to a vector that applies a mechanism in which a virus originally infects and maintains a cell as a method for introducing a foreign gene into the cell. Therefore, in this specification, a viral vector is a virus containing a vector genome having a transgene, which is prepared using a gene recombination technique. When a viral vector is prepared by recombination, the vector genome is packaged in the structural protein of the virus, but there are particles that are present only in the structural protein of the virus without packaging the vector genome. A hollow particle is a particle that is composed of such a structural protein of a virus but does not contain a vector genome. Viral vector particles and hollow particles differ only in whether they contain a vector genome. Since the method of the present invention is a method for separating viral vector particles and hollow particles based on the difference, focusing on the fact that the viral vector particles have a vector genome composed of negatively charged DNA, In principle, the present invention can be applied to all viral vectors prepared using gene recombination techniques.
本発明の方法により精製されるウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、インフルエンザウイルス、センダイウイルス、単純ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、パピローマウイルス、バキュロウイルス、狂犬病ウイルス、および泡沫状ウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の方法により精製されるウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。 Viral vectors purified by the method of the present invention include adeno-associated virus (AAV), adenovirus, retrovirus, lentivirus, influenza virus, Sendai virus, herpes simplex virus, hepatitis virus, papilloma virus, baculovirus, rabies virus. And vectors derived from viruses selected from the group consisting of foamy viruses. Preferably, the viral vector purified by the method of the present invention is an AAV vector.
また、本発明の方法により精製されるウイルスベクターは、好ましくは、ヒトを含む動物またはそれらの細胞に対する遺伝子導入または遺伝子治療に使用するためのベクターである。 Moreover, the viral vector purified by the method of the present invention is preferably a vector for use in gene transfer or gene therapy for animals including humans or their cells.
本明細書においてウイルスベクター粗溶解物とは、中空粒子が充分に除去さていないウイルスベクターを含む溶液または懸濁液を意味し、ウイルスベクターを内包する組換え細胞の細胞破砕液、または前記細胞破砕液から細胞由来の夾雑物を除去したウイルスベクター粗精製物がこれに含まれる。 In the present specification, the virus vector crude lysate means a solution or suspension containing a virus vector from which hollow particles have not been sufficiently removed, and a cell disruption solution of a recombinant cell containing the virus vector, or the cell disruption. This includes a virus vector crude product obtained by removing cell-derived contaminants from the solution.
本明細書において、中空粒子が充分に除去されていないとは、中空粒子がウイルスベクター粒子に対して６％以上、好ましくは５％以上、４％以上、３％以上または２％以上、より好ましくは１％以上、含まれていることを意味する。一方、中空粒子を除去するとは、ウイルスベクター粗溶解物中に含まれる中空粒子を、ウイルスベクター粒子に対して６％未満、好ましくは５％未満、４％未満、３％未満または２％未満、より好ましくは１％未満、にまで減少させることを意味する。本明細書において、中空粒子を含まないウイルスベクターとは、中空粒子を除去したウイルスベクターを意味し、そのようなウイルスベクター中の中空粒子の割合は、ウイルスベクター粒子に対して６％未満、好ましくは５％未満、４％未満、３％未満または２％未満、より好ましくは１％未満である。中空粒子の割合は、例えば、電子顕微鏡により中空粒子とウイルスベクター粒子を検出し、それぞれを計数することにより算出することができる。 In the present specification, if the hollow particles are not sufficiently removed, the hollow particles are 6% or more, preferably 5% or more, 4% or more, 3% or more, or 2% or more, more preferably with respect to the virus vector particles. Means 1% or more. On the other hand, removing the hollow particles means that the hollow particles contained in the viral vector crude lysate are less than 6%, preferably less than 5%, less than 4%, less than 3% or less than 2% with respect to the virus vector particles. More preferably, it means a reduction to less than 1%. In the present specification, a viral vector that does not contain hollow particles means a viral vector from which hollow particles have been removed, and the proportion of hollow particles in such viral vectors is preferably less than 6% with respect to the viral vector particles. Is less than 5%, less than 4%, less than 3% or less than 2%, more preferably less than 1%. The ratio of the hollow particles can be calculated, for example, by detecting the hollow particles and virus vector particles with an electron microscope and counting each of them.
中空粒子の除去にイオン交換膜を用いた膜クロマトグラフィーを採用することによるメリットとしては、以下のことが挙げられる。すなわち、（１）流速が早く短時間の処理が可能であること、（２）処理後の再生洗浄が不要であること、および（３）処理後にバッファー系を置換する必要がないことである。 Advantages of employing membrane chromatography using an ion exchange membrane for the removal of the hollow particles include the following. That is, (1) the flow rate is fast and processing can be performed for a short time, (2) regeneration washing after processing is unnecessary, and (3) it is not necessary to replace the buffer system after processing.
本明細書において、イオン交換膜を用いた膜クロマトグラフィーとは、サンプル中の物質のイオン交換膜への吸着の度合いの差を利用して、サンプル中の物質を分離する手法である。イオン交換膜クロマトグラフィーにおいては、塩強度の低い開始バッファーでイオン交換膜を平衡化した後、サンプルをロードして開始バッファーを流す。イオン交換膜に吸着しない物質は、素通り画分として得られる。その後、イオン交換膜を流すバッファー中の塩強度を高めていくことによって、イオン交換膜に吸着した物質を溶出する。その際、イオン交換膜を流すバッファー中の塩強度を徐々に高めていくと、イオン交換膜への吸着が弱いものから強いものへの順番で溶出することができる。イオン交換膜からの溶出液を分画して回収することによって、サンプル中の各物質を単離することができる。 In the present specification, membrane chromatography using an ion exchange membrane is a technique for separating a substance in a sample by utilizing a difference in the degree of adsorption of the substance in the sample to the ion exchange membrane. In ion exchange membrane chromatography, after equilibrating the ion exchange membrane with a low salt strength start buffer, the sample is loaded and the start buffer is run. A substance that is not adsorbed on the ion exchange membrane is obtained as a flow-through fraction. Thereafter, the substance adsorbed on the ion exchange membrane is eluted by increasing the salt strength in the buffer through which the ion exchange membrane flows. At that time, if the salt strength in the buffer in which the ion exchange membrane is passed is gradually increased, the salt can be eluted in the order from weak to strong adsorption on the ion exchange membrane. By fractionating and collecting the eluate from the ion exchange membrane, each substance in the sample can be isolated.
イオン交換膜を用いた膜クロマトグラフィーは、ＦＰＬＣ（Fast Protein Liquid Chromatography：中圧液体クロマトグラフィー）システムを用いて行ってもよい。膜クロマトグラフィーを行う条件を決定した後は、イオン交換膜をシリンジポンプ等につなぐなど、簡便な装置で本発明の方法を行ってもよい。 Membrane chromatography using an ion exchange membrane may be performed using a FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) system. After determining the conditions for membrane chromatography, the method of the present invention may be performed with a simple apparatus such as connecting an ion exchange membrane to a syringe pump or the like.
本発明の方法において、中空粒子とウイルスベクターを分離するためには、陽イオン交換膜クロマトグラフィーを必ず用いる。これは、ウイルスベクター粗溶解物を陽イオン交換膜クロマトグラフィーに通すと、中空粒子が陽イオン交換膜に吸着し、ウイルスベクターは素通り画分として得られるためである。さらに、陽イオン交換膜クロマトグラフィーにかける前または後で陰イオン交換膜クロマトグラフィーにかけることで、精製度の高いウイルスベクターを回収することができる。 In the method of the present invention, cation exchange membrane chromatography is always used to separate the hollow particles from the viral vectors. This is because, when the virus vector crude lysate is passed through cation exchange membrane chromatography, the hollow particles are adsorbed on the cation exchange membrane and the virus vector is obtained as a flow-through fraction. Furthermore, by carrying out anion exchange membrane chromatography before or after being subjected to cation exchange membrane chromatography, a highly purified virus vector can be recovered.
したがって、本発明の方法は、ウイルスベクターの精製方法であって以下の工程：
（１）ウイルスベクター粗溶解物を陽イオン交換膜に通し；そして、
（２）陽イオン交換膜を通したサンプルを陰イオン交換膜クロマトグラフィーによりウイルスベクターを含む画分を回収する；
を含む、前記方法である。
Therefore, the method of the present invention is a method for purifying a viral vector, which comprises the following steps:
(1) passing the viral vector crude lysate through a cation exchange membrane; and
(2) collecting the fraction containing the viral vector from the sample that has passed through the cation exchange membrane by anion exchange membrane chromatography;
Is the method.
また別の態様において、本発明の方法は、ウイルスベクターの精製方法であって以下の工程：
（１）ウイルスベクター粗溶解物を陰イオン交換膜クロマトグラフィーによりウイルスベクターを含む画分を回収し；そして、
（２）回収した画分を陽イオン交換膜に通して素通り画分を回収する；
を含む、前記方法である。
In another embodiment, the method of the present invention is a method for purifying a viral vector, comprising the following steps:
(1) collecting the fraction containing the viral vector by anion exchange membrane chromatography of the crude viral vector lysate; and
(2) Pass the collected fraction through a cation exchange membrane and collect the passing fraction;
Is the method.
また、ウイルスベクター粗溶解物は、例えば塩化セシウム溶液を用いる超遠心分離法により粗精製したものであってもよい。従って、さらに別の態様において本発明の方法は、イオン交換膜を用いて、ウイルスベクター粗溶解物中の中空粒子を除去する工程を含むウイルスベクターの精製方法であって、当該中空粒子を除去する工程が以下の工程：
（１）ウイルスベクター粗溶解物を塩化セシウム溶液を用いる超遠心分離により粗精製し；そして、
（２）陽イオン交換膜および陰イオン交換膜を用いる膜クロマトグラフィーにかけて、ウイルスベクターを回収する；
ことを含む、前記方法である。
Moreover, the viral vector crude lysate may be roughly purified by ultracentrifugation using a cesium chloride solution, for example. Therefore, in yet another embodiment, the method of the present invention is a method for purifying a viral vector comprising a step of removing hollow particles in a crude viral vector lysate using an ion exchange membrane, wherein the hollow particles are removed. The process is as follows:
(1) The crude viral vector lysate is roughly purified by ultracentrifugation using a cesium chloride solution; and
(2) recovering the viral vector by membrane chromatography using a cation exchange membrane and an anion exchange membrane;
The method.
本発明の方法における膜クロマトグラフィーに使用可能なバッファーには、限定されるわけではないが、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、およびＴｒｉｓ−ＨＣｌからなる群より選択されるバッファー、または、それらの組み合わせ、が含まれる。好ましくは、本発明の方法に使用可能なバッファーは、ＭＨＮバッファー（３．３３ｍＭ ＭＥＳ、３．３３ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３．３３ｍＭ ＮａＯＡｃ）である。 Buffers that can be used for membrane chromatography in the methods of the present invention include, but are not limited to, a buffer selected from the group consisting of MES, HEPES, and Tris-HCl, or combinations thereof. . Preferably, the buffer that can be used in the method of the present invention is MHN buffer (3.33 mM MES, 3.33 mM HEPES, 3.33 mM NaOAc).
本発明の方法は、ウイルスが不活化されないｐＨの範囲で行われる限り、ｐＨに特に制限はない。好ましくは、ウイルスが特に安定なｐＨ６．５ないし８．０の範囲である。
ウイルスベクター粒子に含まれるベクターゲノムはより低いｐＨでより強く負電荷を帯びる。よって、ウイルスベクターと中空粒子を分離するために陽イオン交換膜に通す工程は、ウイルスが特に安定なｐＨ６．５ないし８．０の範囲で行ってもよいが、より低いｐＨ条件で行うことが好ましい。より具体的には、ウイルスベクター粗溶解物を陽イオン交換膜に通す工程はｐＨ６．５〜７．０の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ６．５で行うことがさらに好ましい。
The pH of the method of the present invention is not particularly limited as long as the method is performed in a pH range where the virus is not inactivated. Preferably, the pH is in the range of 6.5 to 8.0 where the virus is particularly stable.
The vector genome contained in the viral vector particle is more strongly negatively charged at lower pH. Therefore, the step of passing through a cation exchange membrane to separate the virus vector and the hollow particles may be performed in a pH range of 6.5 to 8.0 where the virus is particularly stable, but may be performed under a lower pH condition. preferable. More specifically, the step of passing the virus vector crude lysate through a cation exchange membrane is preferably performed in the range of pH 6.5 to 7.0, and more preferably at pH 6.5.
また、ウイルスベクター粒子は実施例２に示されるように、より高いｐＨにおいて陰イオン交換膜によく吸着され、高い回収率が得られる。よって、陰イオン交換膜で膜クロマトグラフィーを行う工程は、ウイルスが特に安定なｐＨ６．５ないし８．０の範囲で行ってもよいが、より高いｐＨ条件で行うことが好ましい。より具体的には、陰イオン交換膜で膜クロマトグラフィーを行う工程は、ｐＨ７．０〜８．０の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ７．５〜８．０の範囲で行うことがさらに好ましい。 Further, as shown in Example 2, the virus vector particles are well adsorbed on the anion exchange membrane at a higher pH, and a high recovery rate is obtained. Therefore, the step of performing membrane chromatography with an anion exchange membrane may be performed in the range of pH 6.5 to 8.0 where virus is particularly stable, but it is preferably performed under higher pH conditions. More specifically, the step of performing membrane chromatography with an anion exchange membrane is preferably performed in the range of pH 7.0 to 8.0, and more preferably in the range of pH 7.5 to 8.0.
本発明の方法により、ウイルスベクター粗溶解物中に含まれる中空粒子を除去することが可能である。塩化セシウムを用いた超遠心分離法による従来の精製を行ったウイルスベクターと、本発明の方法で精製を行ったウイルスベクターを用いてラットに対して遺伝子導入実験を行ったところ、本発明の方法で精製を行ったウイルスベクターを用いた場合、従来法で精製を行ったベクターを用いた場合と比較して、導入遺伝子産物の発現の向上が見られた。このことは、本発明の方法によりウイルスベクター粗溶解物中の中空粒子が除去された結果、遺伝子導入効率の高いウイルスベクターを得ることができることを示している。本発明の方法は、遺伝子導入効率の高いウイルスベクターを得ることを目的に使用される。 By the method of the present invention, it is possible to remove the hollow particles contained in the viral vector crude lysate. A gene transfer experiment was conducted on rats using a virus vector that had been purified by ultracentrifugation using cesium chloride and a virus vector that had been purified by the method of the present invention. When using the virus vector purified in step 1, the expression of the transgene product was improved as compared with the case where the vector purified by the conventional method was used. This indicates that a virus vector having high gene transfer efficiency can be obtained as a result of removing hollow particles in the virus vector crude lysate by the method of the present invention. The method of the present invention is used for the purpose of obtaining a viral vector with high gene transfer efficiency.
本明細書において、遺伝子導入効率の高いウイルスベクターとは、塩化セシウムを用いた超遠心分離法による精製を行ったウイルスベクターを用いた場合の導入遺伝子産物の発現量と比較して、それより多くの導入遺伝子産物の発現を達成するウイルスベクターをいう。好ましくは、遺伝子導入効率の高いウイルスベクターは、塩化セシウムを用いた超遠心分離法による精製のみを行ったウイルスベクターを用いた場合と比較して、１倍より多い、より好ましくは、２倍以上、３倍以上、４倍以上または５倍以上の遺伝子導入率または導入遺伝子産物の発現量が得られるウイルスベクターである。 In this specification, a viral vector with high gene transfer efficiency is more than the expression level of the transgene product when using a virus vector purified by ultracentrifugation using cesium chloride. A viral vector that achieves the expression of the transgene product. Preferably, the virus vector with high gene transfer efficiency is more than 1 time, more preferably 2 times or more, compared with the case where a virus vector purified only by ultracentrifugation using cesium chloride is used. It is a viral vector that can obtain a gene transfer rate or transgene product expression level of 3 times or more, 4 times or more or 5 times or more.
中空粒子の精製方法
中空粒子は、ウイルスベクターによる遺伝子導入の際にウイルスベクターに混入していると、遺伝子導入効率の低下を引き起こす原因となり得る。しかしながら、中空粒子自体は、ウイルスの遺伝子を含まないことを利用して、中空粒子内に薬剤や核酸等の物質を封入することにより、細胞内にそれら物質を送達するために用いることができるので、高い利用価値がある。本発明は、イオン交換膜を用いて、ウイルスベクター粗溶解物中の中空粒子を回収する工程を含む、ウイルス中空粒子の精製方法を提供する。
Method for purifying hollow particles If hollow particles are mixed in a virus vector during gene transfer using a virus vector, it may cause a decrease in gene transfer efficiency. However, since the hollow particles themselves do not contain viral genes, they can be used to deliver such substances into cells by encapsulating substances such as drugs and nucleic acids in the hollow particles. , High utility value. The present invention provides a method for purifying virus hollow particles, which comprises a step of recovering hollow particles in a virus vector crude lysate using an ion exchange membrane.
好ましい態様において、本発明の方法は、ウイルス中空粒子の精製方法であって、前記中空粒子を回収する工程が、以下の工程：
（１）ウイルスベクター粗溶解物を陽イオン交換膜に通し；そして
（２）陽イオン交換膜に吸着した中空粒子を溶出して回収する；
を含む、前記方法である。すなわち、本発明の中空粒子の精製方法においては、陽イオン交換膜クロマトグラフィーを用いる。
In a preferred embodiment, the method of the present invention is a method for purifying virus hollow particles, and the step of recovering the hollow particles comprises the following steps:
(1) The virus vector crude lysate is passed through a cation exchange membrane; and (2) the hollow particles adsorbed on the cation exchange membrane are eluted and collected;
Is the method. That is, cation exchange membrane chromatography is used in the method for purifying hollow particles of the present invention.
また、本発明のウイルス中空粒子の回収方法において、ウイルスベクター粗溶解物は、塩化セシウム溶液を用いる超遠心分離法、または陰イオン交換クロマトグラフィー等により、あらかじめ粗精製されていてもよい。 In the virus hollow particle recovery method of the present invention, the virus vector crude lysate may be roughly purified in advance by ultracentrifugation using a cesium chloride solution, anion exchange chromatography, or the like.
したがって、別の態様において本発明のウイルス中空粒子の精製方法は、以下の工程：
（１）ウイルスベクター粗溶解物を塩化セシウム溶液を用いる超遠心分離法によりウイルスの構造タンパク質を含む画分を回収し；
（２）回収した画分を陽イオン交換膜に通し；そして、
（３）陽イオン交換膜に吸着した中空粒子を溶出して回収する；
を含む、前記方法である。
Therefore, in another embodiment, the method for purifying virus hollow particles of the present invention comprises the following steps:
(1) recovering a fraction containing a viral structural protein by ultracentrifugation using a cesium chloride solution from a crude viral vector lysate;
(2) passing the collected fraction through a cation exchange membrane; and
(3) The hollow particles adsorbed on the cation exchange membrane are eluted and collected;
Is the method.
また別の態様において本発明のウイルス中空粒子の精製方法は、以下の工程：
（１）ウイルスベクター粗溶解物を陰イオン交換クロマトグラフィーによりウイルスの構造タンパク質を含む画分を回収し；
（２）回収した画分を陽イオン交換膜に通し；そして、
（３）陽イオン交換膜に吸着した中空粒子を溶出して回収する；
を含む、前記方法である。
In another embodiment, the method for purifying virus hollow particles of the present invention comprises the following steps:
(1) recovering a fraction containing the structural protein of the virus vector crude lysate by anion exchange chromatography;
(2) passing the collected fraction through a cation exchange membrane; and
(3) The hollow particles adsorbed on the cation exchange membrane are eluted and collected;
Is the method.
さらに別の態様において本発明のウイルス中空粒子の精製方法は、以下の工程：
（１）ウイルスベクター粗溶解物を塩化セシウム溶液を用いる超遠心分離法によりウイルスの構造タンパク質を含む画分を回収し；
（２）（１）で回収した画分を、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけることによりウイルスの構造タンパク質を含む画分を回収し；
（３）（２）で回収した画分を陽イオン交換膜に通し；そして、
（４）陽イオン交換膜に吸着した中空粒子を溶出して回収する；
を含む、前記方法である。
In still another embodiment, the method for purifying virus hollow particles of the present invention comprises the following steps:
(1) recovering a fraction containing a viral structural protein by ultracentrifugation using a cesium chloride solution from a crude viral vector lysate;
(2) The fraction collected in (1) is subjected to anion exchange chromatography to collect a fraction containing viral structural proteins;
(3) passing the fraction collected in (2) through a cation exchange membrane; and
(4) The hollow particles adsorbed on the cation exchange membrane are eluted and collected;
Is the method.
本発明のウイルス中空粒子の精製方法について、イオン交換膜、ウイルスベクター粗溶解物、および膜クロマトグラフィーという文言が意味するところは、上記中空粒子の除去方法の項目に記載したとおりである。 With regard to the method for purifying virus hollow particles of the present invention, the terms “ion exchange membrane”, “virus vector crude lysate”, and “membrane chromatography” mean the same as described in the item of the method for removing hollow particles.
本発明の方法により精製されるウイルス中空粒子には、アデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、インフルエンザウイルス、センダイウイルス、単純ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、パピローマウイルス、バキュロウイルス、狂犬病ウイルス、および泡沫状ウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来する中空粒子が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の方法により精製されるウイルス中空粒子は、ＡＡＶに由来する中空粒子である。 Virus hollow particles purified by the method of the present invention include adeno-associated (AAV) virus, adenovirus, retrovirus, lentivirus, influenza virus, Sendai virus, herpes simplex virus, hepatitis virus, papilloma virus, baculovirus, rabies. Hollow particles derived from viruses and viruses selected from the group consisting of foamy viruses are included, but are not limited to these. Preferably, the virus hollow particles purified by the method of the present invention are hollow particles derived from AAV.
ウイルス中空粒子の精製方法について用いてよいバッファーは、上述の中空粒子の除去方法と同様のバッファーである。
本発明の方法は、ウイルスが不活化されないｐＨの範囲で行われる限り、ｐＨに特に制限はない。好ましくは、ウイルスが特に安定なｐＨ６．５ないし８．０の範囲である。また、ウイルスベクター粒子と中空粒子を分離するにあたっては、ウイルスベクター粒子に含まれるベクターゲノムがより低いｐＨでより強く負電荷を帯びることを利用して、それらの性質の差を引き出すことが有利である。よって、より低いｐＨで本発明の方法を行うことがさらに好ましい。例えば、ウイルスベクター溶解物について陽イオン交換膜クロマトグラフィーを行う条件は、ｐＨ６．５〜７．０の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ６．５で行うことがさらに好ましい。
The buffer that may be used for the method for purifying virus hollow particles is the same buffer as the method for removing hollow particles described above.
The pH of the method of the present invention is not particularly limited as long as the method is performed in a pH range where the virus is not inactivated. Preferably, the pH is in the range of 6.5 to 8.0 where the virus is particularly stable. In separating virus vector particles and hollow particles, it is advantageous to draw out the difference in their properties by utilizing the fact that the vector genome contained in the virus vector particles is more strongly negatively charged at a lower pH. is there. Therefore, it is more preferable to perform the method of the present invention at a lower pH. For example, the conditions for performing cation exchange membrane chromatography on the virus vector lysate are preferably in the range of pH 6.5 to 7.0, and more preferably pH 6.5.
ウイルスベクター精製用キット
本発明は、ウイルスベクター精製用キットであって、
イオン交換膜；および、
本発明の方法による遺伝子導入用または遺伝子治療用ウイルスベクターの精製に、当該イオン交換膜を使用するための使用説明書；
を含む、前記キットを提供する。
Virus vector purification kit The present invention is a virus vector purification kit,
An ion exchange membrane; and
Instructions for using the ion exchange membrane for purification of a viral vector for gene transfer or gene therapy by the method of the present invention;
The kit is provided.
本発明のウイルスベクター精製用キットに含まれるイオン交換膜は、上述した性質を有する本発明の方法に利用可能なイオン交換膜である。使用説明書には、キットに付属するイオン交換膜を本発明の中空粒子を除去する方法に使用するためのバッファー条件やｐＨ条件などの実験条件、操作手順等が記載されている。本発明のキットはさらに、本発明の方法の実施に適切な条件のバッファー、パッケージなどを適宜含んでいてもよい。 The ion exchange membrane contained in the kit for purifying virus vectors of the present invention is an ion exchange membrane that can be used in the method of the present invention having the properties described above. The instruction manual describes experimental conditions such as buffer conditions and pH conditions, operating procedures, etc. for using the ion exchange membrane attached to the kit in the method for removing hollow particles of the present invention. The kit of the present invention may further appropriately include a buffer, a package, and the like under conditions suitable for carrying out the method of the present invention.
中空粒子回収用キット
本発明は、ウイルス中空粒子回収用キットであって、
イオン交換膜；および、
本発明の方法による中空粒子の精製に、当該イオン交換膜を使用するための使用説明書を含む、前記キットを提供する。
Hollow particle collection kit The present invention is a virus hollow particle collection kit,
An ion exchange membrane; and
The kit is provided comprising instructions for using the ion exchange membrane for the purification of hollow particles by the method of the present invention.
本発明の中空粒子回収用キットに含まれるイオン交換膜は、上述した性質を有する本発明の方法に利用可能なイオン交換膜である。使用説明書には、キットに付属するイオン交換膜を本発明の中空粒子の精製方法に使用するためのバッファー条件やｐＨ条件などの実験条件、操作手順等が記載されている。本発明のキットはさらに、本発明の方法の実施に適切な条件のバッファー、パッケージなどを適宜含んでいてもよい。 The ion exchange membrane contained in the hollow particle recovery kit of the present invention is an ion exchange membrane that can be used in the method of the present invention having the above-described properties. The instruction manual describes experimental conditions such as buffer conditions and pH conditions, operating procedures, etc. for using the ion exchange membrane attached to the kit in the method for purifying hollow particles of the present invention. The kit of the present invention may further appropriately include a buffer, a package, and the like under conditions suitable for carrying out the method of the present invention.
本発明の方法は、従来は有効な対策法が開発されていなかった中空粒子の除去方法を提供する。また、従来の方法では密度勾配遠心だけで１８時間以上かかっていたものが、本発明の方法では２〜３時間と大幅に時間短縮ができ、本発明の方法は非常に効率がよい方法である。 The method of the present invention provides a method for removing hollow particles, for which no effective countermeasure has been developed. In addition, the conventional method, which only takes 18 hours or more by density gradient centrifugation, can be greatly shortened to 2-3 hours in the method of the present invention, and the method of the present invention is a very efficient method. .
本発明の方法より、中空粒子を含まない高い純度のウイルスベクターを迅速かつ効率的に精製することが可能となった。また、本発明の方法により精製された中空粒子を含まないウイルスベクターは、従来の精製法で精製したウイルスベクターと比較して、遺伝子を導入した際の遺伝子発現の効率が高く、本発明の方法により高い活性を有するウイルスベクターを得ることができる。
以下、本発明を実施例にて具体的かつ詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
From the method of the present invention, it has become possible to rapidly and efficiently purify a high-purity virus vector that does not contain hollow particles. In addition, the virus vector containing no hollow particles purified by the method of the present invention has higher gene expression efficiency when the gene is introduced than the virus vector purified by the conventional purification method. A viral vector having higher activity can be obtained.
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described specifically and in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実験材料
特に断りのない限り、本実施例で使用する実験材料は以下の通りである。
（１）イオン交換膜
イオン交換膜としてムスタングＱ（陰イオン交換）およびムスタングＳ（陽イオン交換）（いずれもポール コーポレーション）を用いた。ムスタングの膜基材は架橋重合されたポリエーテルスルホンで構成されている。その基材の表面に、独自の表面修飾技術により用途に応じた官能基が保持されており、ムスタングＱは第四級アンモニウム基を、ムスタングＳはスルホン酸基を保持している。この膜の孔径は０．８μｍであり、均一に団塊状の表面が分布している（図１）。図１の模式図に示すように、左図の拡散孔が小さい従来のクロマトグラフィー担体（ビーズカラム）の場合は、流速の早い部分と遅い部分が生じ、生体高分子を含むマクロ分子の拡散に制限が出てくる。一方、右図のムスタングメンブレンの場合には、マクロ分子が拡散孔の全ての吸着部位に出入りするのに十分なスペースがあり、強イオン交換の修飾基が広く均等に分布していることからＤＮＡやプラスミドのような生体高分子（マクロ分子）やウイルスのような大きさの粒子に対しても、迅速に吸着・溶出が可能である。ビーズとは対照的に高い流速、高い吸着容量が得られる。また、ムスタングは非常に高い生体高分子吸着能を有しており、流速に依らず安定した吸着量が確保できる。特にムスタングＱは流速に依存されず高吸着能を有し、ムスタングＳのクロマトグラフィーにおける分離能も流速に影響を受けにくい（例えば、米国特許第６，７８０，３２７号、米国特許第６，７８３，９３７号を参照。これら文献は引用により本願明細書に完全に援用される）。
（２）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
野生型ＡＡＶの生物学的特徴及び人に対する影響
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科デペンドウイルス属に分類され、１型から９型の血清型のＡＡＶが知られている。中でも２型ＡＡＶは研究が進んでおり、その性質が解析されている。２型ＡＡＶは直径約２６ｎｍのエンベロープを持たない球形ウイルスである。ＶＰ１（８２ｋＤａ）、ＶＰ２（６５ｋＤａ）、ＶＰ３（６０ｋＤａ）が１：１：１０の比率で合計６０分子が集まって約３６００ｋＤａのキャプシドを構成している。ゲノムは４６７９ヌクレオチドからなる１本鎖ＤＮＡ（約１５００ｋＤａ）であり、プラスとマイナス鎖がほぼ同じ比率で混在する。ゲノム両末端１４５ヌクレオチオドはＴ字型ヘアピン構造を形成しておりinverted terminal repeat（ＩＴＲ）と呼ばれる。ＡＡＶゲノムにはｒｅｐとｃａｐ遺伝子がありそれぞれ非構造タンパク質とキャプシドタンパク質をコードしている。ＡＡＶはアデノウイルス、ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下でのみ増殖でき、単独では増殖できない。単独で細胞に感染した場合、第１９番染色体のＡＡＶＳ１領域（１９ｑ１３．４２）に特異的にそのゲノムを組み込み、潜伏感染の状態となる。ヘルパーウイルスと同時に感染したり、潜伏感染状態でヘルパーウイルスが感染した時にＡＡＶの増殖が起こる。２型ＡＡＶのヒトへの感染は不顕性感染であり、ＡＡＶの感染に伴う特有の疾患は報告されておらず非病原性と考えられている。米国での調査によると出生直後はＡＡＶに対する抗体は検出できないが、学童期で人口の５０％以上で抗体が陽性となる。ｒｅｐ遺伝子より合成されるＲｅｐタンパク質は過剰発現すると細胞増殖を抑制したり、ヘルパーウイルスを含めた他のウイルスの複製も抑制する。ウイルス粒子は物理化学的にきわめて安定で、ｐＨ３から９の間で不活化されず、また５６℃、１時間の処理でも不活化されない。
Experimental Materials Unless otherwise specified, the experimental materials used in this example are as follows.
(1) Ion Exchange Membrane Mustang Q (anion exchange) and Mustang S (cation exchange) (both from Pall Corporation) were used as ion exchange membranes. Mustang membrane substrate is composed of cross-linked polymerized polyethersulfone. A functional group corresponding to the application is held on the surface of the base material by a unique surface modification technique, Mustang Q holds a quaternary ammonium group, and Mustang S holds a sulfonic acid group. The pore diameter of this membrane is 0.8 μm, and the nodular surface is uniformly distributed (FIG. 1). As shown in the schematic diagram of FIG. 1, in the case of the conventional chromatography carrier (bead column) having a small diffusion hole in the left figure, a part having a high flow rate and a part having a low flow rate are generated, and diffusion of macromolecules including biopolymers is caused. Limit comes out. On the other hand, in the case of the Mustang membrane shown on the right, there is sufficient space for macromolecules to enter and exit all the adsorption sites of the diffusion holes, and the strong ion exchange modifying groups are widely distributed evenly. It can also be adsorbed and eluted quickly even on biopolymers (macromolecules) such as plasmids and particles as large as viruses. In contrast to beads, high flow rates and high adsorption capacities are obtained. In addition, Mustang has a very high biopolymer adsorption capacity, and a stable adsorption amount can be ensured regardless of the flow rate. In particular, Mustang Q does not depend on the flow rate and has a high adsorption capacity, and the resolution of Mustang S in chromatography is not easily affected by the flow rate (for example, US Pat. No. 6,780,327, US Pat. No. 6,783). 937, which are hereby fully incorporated by reference).
(2) Adeno-associated virus (AAV) vector
Biological characteristics of wild type AAV and effects on humans Adeno-associated virus (AAV) is classified into the genus Dependovirus of the Parvoviridae family, and serotypes AAV of type 1 to 9 are known. Among them, type 2 AAV has been studied and its properties have been analyzed. Type 2 AAV is a spherical virus with no envelope of about 26 nm in diameter. A total of 60 molecules of VP1 (82 kDa), VP2 (65 kDa), and VP3 (60 kDa) are gathered at a ratio of 1: 1: 10 to constitute a capsid of about 3600 kDa. The genome is single-stranded DNA (about 1500 kDa) composed of 4679 nucleotides, and plus and minus strands are mixed at almost the same ratio. 145 nucleotides at both ends of the genome form a T-shaped hairpin structure and are called inverted terminal repeat (ITR). There are rep and cap genes in the AAV genome, encoding nonstructural proteins and capsid proteins, respectively. AAV can grow only in the presence of helper viruses such as adenovirus and herpes virus, and cannot grow alone. When a cell is infected alone, its genome is specifically integrated into the AAVS1 region (19q13.42) of chromosome 19 and becomes a latent infection state. AAV growth occurs when the virus is infected simultaneously with the helper virus or when the helper virus is infected in a latent infection state. Infection of humans with type 2 AAV is a subclinical infection and no specific disease associated with AAV infection has been reported and is considered non-pathogenic. According to a survey in the United States, antibodies against AAV cannot be detected immediately after birth, but antibodies become positive in more than 50% of the population at school age. When the Rep protein synthesized from the rep gene is overexpressed, it suppresses cell growth or replication of other viruses including helper virus. Virus particles are extremely physicochemically stable, are not inactivated between pH 3 and 9, and are not inactivated by treatment at 56 ° C. for 1 hour.
ウイルスベクターの構造と生物学的特徴
ウイルスキャプシドは野生型ウイルスと異ならない。キャプシド内に組み込まれているベクターゲノムは３４６６ヌクレオチドから成り、両末端のＩＴＲは野生型と同じであるが、その間はプロモーター、目的遺伝子、ヒト成長ホルモン遺伝子ポリＡシグナルに置き換えられている。
Viral vector structure and biological characteristics The viral capsid is not different from the wild type virus. The vector genome integrated into the capsid consists of 3466 nucleotides, and the ITRs at both ends are the same as the wild type, but in the meantime, the promoter, target gene, and human growth hormone gene poly A signal are replaced.
ＡＡＶベクターは人以外の動物でも感染が成立すると考えられている。ＡＡＶベクターは神経細胞、肝臓、骨格筋、心筋などで効率の良い遺伝子発現が起こる。一本鎖ベクターゲノムは核内でその相補鎖とアニールし、宿主のＤＮＡ合成酵素の働きで二本鎖となり導入遺伝子を発現できるようになる。また、二本鎖となったベクターＤＮＡは複数が連なり環状ＤＮＡを形成するかコンカタマ―を形成して、その一部が染色体に組み込まれると考えられる。ＡＡＶベクターにより***細胞、静止期の細胞双方に遺伝子導入が可能であるが、発現様式に違いがある。***細胞では宿主ＤＮＡ合成酵素の働きで発現型二本鎖に変換され感染直後より良好な導入遺伝子の発現が認められる。染色体に組み込まれていない導入遺伝子は細胞***に伴い希釈され失われてゆき、染色体に組み込まれた導入遺伝子を持つ細胞が最終的に長期発現を維持する。一方、静止期細胞では相補鎖同士のアニーリングが二本鎖ゲノムの主たる合成経路と考えられ、約１ヶ月程かかって徐々に導入遺伝子の発現が上昇してゆき、染色体外でコンカタマーの形態で長期間にわたって安定に保持される。動物実験では年余に渡る導入遺伝子の発現も報告されている。ＡＡＶベクターゲノムの染色体での組込み部位は、ｒｅｐ遺伝子を欠いているためＡＡＶＳ１領域へは組み込まれず、ランダムに組み込まれるが、その組込み効率は極めて低いと考えられている。マウスの肝臓での組込み部位の解析では組込みは遺伝子存在領域に組み込まれていることが多く、組込み部位近傍のゲノムが約２ｋｂ程まで欠失していることもある。ＩＴＲは弱いながらプロモーター活性を持つが、内向きにプロモーター活性を持ち、また染色体への組込みに伴い欠失することが多く、組込み部位近傍の遺伝子の発現を誘導する可能性は少ない。
実施例１：ウイルスベクターの調製および粗精製
（１）細胞溶解液の調製
まず、１．４×１０８個のＡＡＶ−２９３細胞を、２２５ｃｍ２フラスコ２８本（または６，３２０ｃｍ２ １０段フラスコ１個）を用いて１０％ＦＢＳ＋ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。４８時間後に燐酸カルシウム法にて、（ｉ）ＡＡＶベクタープラスミド、（ｉｉ）ＡＡＶゲノムのＩＴＲを除きｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子をクローニングしたＡＡＶヘルパープラスミド、（ｉｉｉ）２型アデノウイルスのＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡＲＮＡ遺伝子をクローニングしたアデノウイルスヘルパープラスミド（各々６５０μｇ）を導入した。７２時間後に細胞を回収し、細胞ペレットを３０ｍｌのＴＢＳにて懸濁した。このサンプルの凍結融解を４−６回繰り返し、毎回ボルテックス操作にてよく混和した。１５０μｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２と２０μｌの２５０Ｕ／μｌ Benzonaseを添加し、３７℃で３０分間反応させた後、３００μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加し反応を停止させ、９００μｌ の５Ｍ ＮａＣｌを加えてよく混和し、４℃で１０，０００×ｇ、１０分間遠心し上清を回収した。この宿主細胞の培養とトランスフェクションについては、より詳細には例えば以下の文献：Okada, T., et al., Methods Enzymol., Vol 346: Gene Therapy Methods (ed. by M. Ian Phillips), pp378-393, 2002; Okada, T., et al., Methods., 28: pp237-247, 2002；またはOkada, T., et al., Hum. Gene Ther., 16: pp1212-1218, 2005; （これらの文献は引用により本明細書に完全に援用される）に基づいて行うことができる。
（２）超遠心によるウイルスの粗精製
塩化セシウム溶液（１．５０ｇ／ｍｌ）の上に塩化セシウム溶液（１．２５ｇ／ｍｌ）を重層し、さらにこの上に回収したウイルス溶液（上記（１）で回収した細胞溶解液）を重層した。１６℃で２５，０００×ｇ、３時間遠心後、チューブの下に２２Ｇ針にて穴を開けて塩化セシウムの層を０．５ｍｌずつ回収した。各分画の屈折率（refractive index：ＲＩ）を測定し、ＲＩが１．３７１−１．３８０の画分を回収した後、サンプルの約１００倍量のＭＨＮバッファー（３．３３ｍＭ ＭＥＳ、３．３３ｍＭ ＨＥＰＥＳ ［ｐＨ６．５］、３．３３ｍＭ ＮａＯＡｃ）に対し、３０分間透析した。さらに１６℃で３，０００×ｇ、２分間遠心して上清を回収し、サンプルの約５倍量の開始バッファーでサンプルを希釈した後、０．２２μｍ、５００ｍｌフィルターシステムを用いてサンプルをろ過した。
実施例２：陰イオン交換膜クロマトグラフィーにおけるウイルスベクター回収率の検討
ウイルスが特に安定なｐＨ６．５ないし８．０の範囲で、ウイルスベクター粗精製物を陰イオン交換膜を用いた膜クロマトグラフィーにかけ、ウイルスベクター粒子の回収率を検討した。陰イオン交換膜としてムスタングＱ（ポール コーポレーション）を使用した。
AAV vectors are thought to be infected even in animals other than humans. AAV vectors allow efficient gene expression in nerve cells, liver, skeletal muscle, cardiac muscle and the like. The single-stranded vector genome anneals with its complementary strand in the nucleus and becomes double-stranded by the action of the host DNA synthase to express the transgene. Further, it is considered that a plurality of double-stranded vector DNAs are linked to form a circular DNA or a concatamer, and a part thereof is integrated into the chromosome. Although AAV vectors can introduce genes into both dividing cells and quiescent cells, there are differences in expression patterns. In dividing cells, the host DNA synthetase is converted into an expression double strand, and better transgene expression is observed immediately after infection. Transgenes that are not integrated into the chromosome are diluted and lost with cell division, and cells with the transgene integrated into the chromosome eventually maintain long-term expression. On the other hand, in stationary cells, annealing of complementary strands is considered to be the main synthetic pathway of double-stranded genome, and it takes about one month to gradually increase the expression of the transgene. Holds stable over time. Animal experiments have also reported transgene expression over the years. The integration site in the chromosome of the AAV vector genome is not integrated into the AAVS1 region because it lacks the rep gene, but is integrated randomly, but its integration efficiency is considered to be extremely low. In the analysis of the integration site in the mouse liver, the integration is often integrated in the gene existence region, and the genome near the integration site may be deleted to about 2 kb. Although ITR is weak, it has promoter activity, but has inward promoter activity and is often deleted upon integration into the chromosome, and it is unlikely to induce gene expression near the integration site.
Example 1: Preparation of virus vector and rough purification (1) Preparation of cell lysate First, 1.4 × 10 8 AAV-293 cells were mixed with 28 225 cm 2 flasks (or 6,320 cm 2 10-stage flask 1). And cultured in 10% FBS + DMEM / F12 medium. 48 hours later, by calcium phosphate method, (i) AAV vector plasmid, (ii) AAV helper plasmid obtained by cloning rep and cap genes except for ITR of AAV genome, (iii) E2A, E4 and VARNA genes of type 2 adenovirus The adenovirus helper plasmids (650 μg each) were cloned. After 72 hours, the cells were collected, and the cell pellet was suspended in 30 ml of TBS. This sample was freeze-thawed 4-6 times and mixed well by vortexing each time. 150 μl of 1M MgCl 2 and 20 μl of 250 U / μl Benzonase are added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes, then 300 μl of 0.5 M EDTA is added to stop the reaction, and 900 μl of 5 M NaCl is added and mixed well. The supernatant was collected by centrifugation at 10,000 × g for 10 minutes at 4 ° C. For more details on the culture and transfection of this host cell, see, for example, the following literature: Okada, T., et al., Methods Enzymol., Vol 346: Gene Therapy Methods (ed. By M. Ian Phillips), pp378. Okada, T., et al., Methods., 28: pp237-247, 2002; or Okada, T., et al., Hum. Gene Ther., 16: pp1212-1218, 2005; Which are fully incorporated herein by reference).
(2) Rough purification of virus by ultracentrifugation The cesium chloride solution (1.25 g / ml) was layered on the cesium chloride solution (1.50 g / ml), and the virus solution (1) above was further collected thereon. The cell lysate collected in (1) was overlaid. After centrifugation at 25,000 × g for 3 hours at 16 ° C., a hole was made with a 22 G needle below the tube, and 0.5 ml of a cesium chloride layer was collected. After measuring the refractive index (refractive index: RI) of each fraction and collecting the fraction having an RI of 1.371-1.380, the MHN buffer (3.33 mM MES, 3. Dialyzed against 33 mM HEPES [pH 6.5], 3.33 mM NaOAc) for 30 minutes. Further, the supernatant was recovered by centrifugation at 3,000 × g for 2 minutes at 16 ° C., and the sample was diluted with about 5 times the starting buffer of the sample, and then the sample was filtered using a 0.22 μm, 500 ml filter system. .
Example 2: Examination of virus vector recovery rate in anion exchange membrane chromatography In the range of pH 6.5 to 8.0 where virus is particularly stable, a crude virus vector was subjected to membrane chromatography using an anion exchange membrane. The recovery rate of virus vector particles was examined. Mustang Q (Pole Corporation) was used as an anion exchange membrane.
ムスタングＱアクロディスクを、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５またはｐＨ８．０に調整した開始バッファー（３．３３ｍＭ ＭＥＳ、３．３３ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３．３３ｍＭ ＮａＯＡｃ）で平衡化した後、実施例１で得られたウイルスベクター粗精製物を吸着させた。その後、開始バッファーと同一のｐＨに調整した溶出バッファー（３．３３ｍＭ ＭＥＳ、３．３３ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３．３３ｍＭ ＮａＯＡｃ、２Ｍ ＮａＣｌ）でウイルスを溶出して回収した。結果を表１に示す。 Mustang Q acrodiscs after equilibration with starting buffer (3.33 mM MES, 3.33 mM HEPES, 3.33 mM NaOAc) adjusted to pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5 or pH 8.0 The virus vector crude product obtained in 1 was adsorbed. Thereafter, the virus was eluted and recovered with an elution buffer (3.33 mM MES, 3.33 mM HEPES, 3.33 mM NaOAc, 2 M NaCl) adjusted to the same pH as the starting buffer. The results are shown in Table 1.
低いｐＨではウイルスが陰イオン交換体に吸着されず、回収率が低くなった。一方、ｐＨ７．５ないし８．０の条件では約９０％のウイルス粒子を回収できることが明らかとなった。
実施例３：陽イオン交換膜および陰イオン交換膜によるウイルスベクターの精製
イオン交換膜としてムスタングＳおよびムスタングＱ（ポール コーポレーション）を使用した。ムスタングの膜基材は架橋重合されたポリエーテルスルホンで構成されており、その基材の表面に、用途に応じた官能基で表面が修飾されている。ムスタングＳは、基材表面にスルホン酸基を保持する陽イオン交換膜である。ムスタングＱは、基材表面に第四級アンモニウム基を保持する陰イオン交換膜である。この膜の孔径は０．８μｍであり、均一に団塊状の表面が分布している（図１）。
At low pH, the virus was not adsorbed on the anion exchanger and the recovery rate was low. On the other hand, it was revealed that about 90% of virus particles can be recovered under the condition of pH 7.5 to 8.0.
Example 3: Purification of virus vector by cation exchange membrane and anion exchange membrane Mustang S and Mustang Q (Pole Corporation) were used as ion exchange membranes. The Mustang membrane base material is composed of cross-linked polymerized polyethersulfone, and the surface of the base material is modified with functional groups depending on the application. Mustang S is a cation exchange membrane that retains sulfonic acid groups on the surface of the substrate. Mustang Q is an anion exchange membrane that retains a quaternary ammonium group on the surface of a substrate. The pore diameter of this membrane is 0.8 μm, and the nodular surface is uniformly distributed (FIG. 1).
ＦＰＬＣシステムとして、 AKTA explorer 10S（アマシャムバイオサイエンス）を用い、精製操作を行った。サンプルを、開始バッファー（３．３３ｍＭ ＭＥＳ、３．３３ｍＭ ＨＥＰＥＳ ［ｐＨ６．５］、３．３３ｍＭ ＮａＯＡｃ）で平衡化したムスタングＳアクロディスク（ポール コーポレーション）に通し、スーパーループに充填した。開始バッファーでムスタングＱアクロディスク（ポール コーポレーション）を平衡化した後、流速３ｍｌ／分にてサンプルをムスタングＱアクロディスクに吸着させ、開始バッファーにて洗浄し、０−１００％Ｂ（２Ｍ ＮａＣｌ）／５０ＣＶの濃度勾配条件下にてウイルスを溶出し画分量１ｍｌにて回収した。Ｂ液は、２Ｍ ＮａＣｌを含む他は開始バッファーと同一の組成のバッファーである。結果を図２に示す。 A purification operation was performed using AKTA explorer 10S (Amersham Bioscience) as the FPLC system. Samples were passed through Mustang S Acrodisc (Pole Corporation) equilibrated with starting buffer (3.33 mM MES, 3.33 mM HEPES [pH 6.5], 3.33 mM NaOAc) and loaded into the superloop. After equilibrating Mustang Q Acrodisc (Pole Corporation) with the starting buffer, the sample was adsorbed onto Mustang Q Acrodisc at a flow rate of 3 ml / min, washed with the starting buffer, and 0-100% B (2M NaCl) / The virus was eluted under a concentration gradient of 50 CV and collected in a fraction volume of 1 ml. Solution B is a buffer with the same composition as the starting buffer except that it contains 2M NaCl. The results are shown in FIG.
ピークの画分を電気泳動したものを、精製前のサンプル（ＣＶＬ）と比較した。結果を図３に示す。ムスタングＳおよびＱによる精製後（ＣｓＣｌ＋ＭｔｇＳ／Ｑ）のサンプルを用いた電気泳動解析では、ＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の３本のバンドが鮮明に認められ、NIH imageを用いてこの画像を解析したところ、その精製度は９割以上であった。 The electrophoresis of the peak fraction was compared with the sample (CVL) before purification. The results are shown in FIG. In the electrophoretic analysis using the sample after purification by Mustang S and Q (CsCl + MtgS / Q), three bands of VP1, VP2, and VP3 of AAV are clearly recognized, and this image is analyzed using NIH image As a result, the degree of purification was 90% or more.
電子顕微鏡により、塩化セシウムを用いた超遠心分離法による精製を行った１型ＡＡＶベクター、ムスタングＳに吸着されたサンプル、および、ムスタングＳおよびＱを用いて中空粒子を除去した１型ＡＡＶベクターと比較した。結果を図４に示す。超遠心分離法による精製のみを行ったもの（図４Ａ）では、中心に黒い部分がありウイルスゲノムが入っていない中空粒子（矢頭で示した粒子）が１割弱（６．７％、９１／１３５０粒子）認められた。ムスタングＳに吸着されたサンプルを解析すると、意外にも中空粒子がほぼすべて（９７．３％、６９４／７１３粒子）を占めた（図４Ｂ）。よって、ムスタングＳを通した段階で中空粒子がサンプルからほぼ除去されることが示された。ムスタングＳおよびＱを用いて精製したものでは、中空粒子の混入は１％未満（０．８％、２６／３３６５粒子）であった（図４Ｃ）。
実施例４：ウイルスベクターの回収率
アクロディスク形状のムスタングＱを２個用いた場合のＡＡＶウイルスベクターの回収率を検討した。１型および５型のＡＡＶベクターを含む細胞溶解液を、実施例３の方法と同様に精製した結果を表２に示す。
A type 1 AAV vector purified by ultracentrifugation using cesium chloride by an electron microscope, a sample adsorbed on Mustang S, and a type 1 AAV vector from which hollow particles were removed using Mustang S and Q Compared. The results are shown in FIG. In the case where only purification by ultracentrifugation (FIG. 4A) was performed, hollow particles (particles indicated by arrowheads) that had a black portion at the center and did not contain the viral genome were less than 10% (6.7%, 91 / 1350 particles). When the sample adsorbed on Mustang S was analyzed, almost all hollow particles (97.3%, 694/713 particles) accounted for unexpectedly (FIG. 4B). Therefore, it was shown that the hollow particles are almost removed from the sample at the stage of passing through Mustang S. In the product purified using Mustang S and Q, the contamination of hollow particles was less than 1% (0.8%, 26/3365 particles) (FIG. 4C).
Example 4: Virus vector recovery rate The recovery rate of AAV viral vectors when two Acrodisc-shaped Mustang Qs were used was examined. Table 2 shows the results of purifying cell lysates containing type 1 and type 5 AAV vectors in the same manner as in Example 3.
アクロディスク形状のムスタングＱを２個用いると、最大２.０×１０１４ウイルス粒子が吸着した。細胞溶解液と最終精製物を比較した場合、その回収率はいずれのＡＡＶウイルスベクターについても約２０％であり、本発明の方法によりウイルスベクターが高い効率で回収できることが示された。ただし、実施例２に示すとおり、ｐＨを７．５ないし８．０に上げることによって、ムスタングＱによるウイルスの回収率はさらに改善される。ｐＨの調整は、透析操作によるバッファー交換や希釈によって可能である。
実施例５：中空粒子を除去したＡＡＶウイルスベクターの活性
ラットＩＬ−１０発現１型ＡＡＶベクター(６ｘ１０１０ ゲノムコピー)を３週令のWistarラット前脛骨筋に注入し、８週間後にＩＬ−１０の血中濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。本発明の方法により中空粒子の除去を行ったウイルスベクターを用いた場合、セシウム密度勾配超遠心による精製のみを行ったベクターと比較して、遺伝子産物の血中濃度が約３倍増加した。結果を図５に示す。このことは、中空粒子の除去により、従来の塩化セシウムを用いた超遠心分離法と比べ顕著に遺伝子導入効率の高いＡＡＶベクターの作製が可能となったことを示している。また、ウイルスを注入した前脛骨筋における病理所見を解析したが、炎症反応は認められず、安全性が高いことが確認された。
When two Acrodisc-shaped Mustang Qs were used, a maximum of 2.0 × 10 14 virus particles were adsorbed. When the cell lysate and the final purified product were compared, the recovery rate was about 20% for any AAV viral vector, indicating that the viral vector can be recovered with high efficiency by the method of the present invention. However, as shown in Example 2, the virus recovery rate by Mustang Q is further improved by raising the pH to 7.5 to 8.0. The pH can be adjusted by buffer exchange or dilution by dialysis.
Example 5: Activity of AAV viral vector with hollow particles removed Rat IL-10 expression type 1 AAV vector (6 × 10 10 genomic copy) was injected into 3 weeks old Wistar rat anterior tibial muscle, and 8 weeks later IL-10 The blood concentration was measured by ELISA. When the viral vector from which the hollow particles were removed by the method of the present invention was used, the blood concentration of the gene product increased by about 3 times compared to the vector only purified by cesium density gradient ultracentrifugation. The results are shown in FIG. This indicates that the removal of the hollow particles made it possible to produce an AAV vector with significantly higher gene transfer efficiency than the conventional ultracentrifugation method using cesium chloride. In addition, pathological findings in the anterior tibial muscle injected with the virus were analyzed, but no inflammatory reaction was observed, confirming that the safety was high.
本発明の方法により精製された中空粒子の混入が低いウイルスベクターは、従来の精製条件によって精製されたウイルスベクターに対して、優れた遺伝子導入効率を有している。したがって、本発明の方法により精製されたウイルスベクターは、臨床での使用、特に遺伝子治療に好適に使用し得る。 The virus vector purified by the method of the present invention with low contamination of hollow particles has superior gene transfer efficiency compared to a virus vector purified by conventional purification conditions. Therefore, the viral vector purified by the method of the present invention can be suitably used for clinical use, particularly gene therapy.
Claims (15)
（１）ウイルスベクター粗溶解物を塩化セシウム溶液を用いる超遠心分離法により粗精製し；そして
（２）陽イオン交換膜および陰イオン交換膜を用いる膜クロマトグラフィーにかけて、ウイルスベクターを回収する；
ことを含む、請求項１に記載の方法。 The step of removing the hollow particles includes the following steps:
(1) The crude viral vector lysate is roughly purified by ultracentrifugation using a cesium chloride solution; and (2) The viral vector is recovered by subjecting it to membrane chromatography using a cation exchange membrane and an anion exchange membrane;
The method of claim 1, comprising:
イオン交換膜；および、
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法による遺伝子導入用または遺伝子治療用ベクターの精製に、当該イオン交換膜を使用するための使用説明書；
を含む、前記キット。 A virus vector purification kit comprising:
An ion exchange membrane; and
Instructions for using the ion exchange membrane for purification of a vector for gene transfer or gene therapy by the method according to any one of claims 1 to 8;
The kit.
（１）ウイルスベクター粗溶解物を陽イオン交換膜に通し；そして
（２）陽イオン交換膜に吸着した中空粒子を溶出して回収する；
を含む、請求項１３に記載の方法。 The step of recovering the hollow particles includes the following steps:
(1) The virus vector crude lysate is passed through a cation exchange membrane; and (2) The hollow particles adsorbed on the cation exchange membrane are eluted and collected;
14. The method of claim 13, comprising:
イオン交換膜；および、
請求項１３または１４に記載の方法による中空粒子の精製に、当該イオン交換膜を使用するための使用説明書；
を含む、前記キット。
A virus hollow particle purification kit comprising:
An ion exchange membrane; and
Instructions for using the ion exchange membrane for the purification of hollow particles by the method according to claim 13 or 14;
The kit.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005314476A JP2007117003A (en) | 2005-10-28 | 2005-10-28 | Method for rapidly removing and purifying hollow virus particle |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005314476A JP2007117003A (en) | 2005-10-28 | 2005-10-28 | Method for rapidly removing and purifying hollow virus particle |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007117003A true JP2007117003A (en) | 2007-05-17 |
Family
ID=38141526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005314476A Pending JP2007117003A (en) | 2005-10-28 | 2005-10-28 | Method for rapidly removing and purifying hollow virus particle |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007117003A (en) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012144446A1 (en) | 2011-04-18 | 2012-10-26 | 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター | Drug delivery particles and method for producing same |
| JP2019527058A (en) * | 2016-07-14 | 2019-09-26 | ピュリディファイ リミテッド | Process for recovering viral products using functionalized chromatographic media |
| WO2020162752A1 (en) * | 2019-02-08 | 2020-08-13 | Vicinivax Holding B.V. | Methods for providing purified viral particles of semliki forest virus (sfv), preparations obtainable thereby, and uses thereof. |
| US11015173B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-05-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV1 |
| US11015174B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-05-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV8 |
| US11028372B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-06-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAVRH10 |
| US11098286B2 (en) * | 2015-12-11 | 2021-08-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV9 |
| WO2022045055A1 (en) * | 2020-08-24 | 2022-03-03 | タカラバイオ株式会社 | METHOD FOR FORMULATING NON-ENVELOPED VIRAL VECTOR PARTICLES BY CHANGE IN pH |
-
2005
- 2005-10-28 JP JP2005314476A patent/JP2007117003A/en active Pending
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3219313A2 (en) | 2011-04-18 | 2017-09-20 | National Center of Neurology and Psychiatry | Drug delivery particle and method for producing the same |
| EP3777843A1 (en) | 2011-04-18 | 2021-02-17 | National Center of Neurology and Psychiatry | Drug delivery particle and method for producing the same |
| WO2012144446A1 (en) | 2011-04-18 | 2012-10-26 | 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター | Drug delivery particles and method for producing same |
| US11713449B2 (en) | 2015-12-11 | 2023-08-01 | Ths Trustees of the University of Pennsylvania | Scalable purification method for AAVRH10 |
| US11718835B2 (en) | 2015-12-11 | 2023-08-08 | Ths Trustees of the University of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV8 |
| US11713450B2 (en) | 2015-12-11 | 2023-08-01 | Ths Trustees of the University of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV1 |
| US11015173B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-05-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV1 |
| US11015174B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-05-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV8 |
| US11028372B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-06-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAVRH10 |
| US11098286B2 (en) * | 2015-12-11 | 2021-08-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV9 |
| US11103853B2 (en) | 2016-07-14 | 2021-08-31 | Puridify Ltd. | Process for recovering viral products using functionalised chromatography media |
| JP7139004B2 (en) | 2016-07-14 | 2022-09-20 | ピュリディファイ リミテッド | Process for Harvesting Viral Products Using Functionalized Chromatographic Media |
| JP2019527058A (en) * | 2016-07-14 | 2019-09-26 | ピュリディファイ リミテッド | Process for recovering viral products using functionalized chromatographic media |
| WO2020162752A1 (en) * | 2019-02-08 | 2020-08-13 | Vicinivax Holding B.V. | Methods for providing purified viral particles of semliki forest virus (sfv), preparations obtainable thereby, and uses thereof. |
| WO2022045055A1 (en) * | 2020-08-24 | 2022-03-03 | タカラバイオ株式会社 | METHOD FOR FORMULATING NON-ENVELOPED VIRAL VECTOR PARTICLES BY CHANGE IN pH |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6991095B2 (en) | High-purity viral vector for use in gene therapy and an expandable manufacturing platform in viral vector purification | |
| JP6868572B2 (en) | Purification of recombinant adeno-associated virus particles including affinity purification steps | |
| JP6521965B2 (en) | Method for producing non-enveloped virus particle | |
| EP3387117B1 (en) | Scalable purification method for aav8 | |
| Strobel et al. | Comparative analysis of cesium chloride-and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications | |
| Okada et al. | Scalable purification of adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) and AAV8 vectors, using dual ion-exchange adsorptive membranes | |
| JP2007117003A (en) | Method for rapidly removing and purifying hollow virus particle | |
| JP2021526829A (en) | Anion exchange chromatography for recombinant AAV production | |
| JP2023093461A (en) | Compositions and methods of treating huntington's disease | |
| AU2017391164B2 (en) | Adeno-associated virus purification methods | |
| JP2019068846A (en) | Virus like particle purification | |
| JP2018518164A (en) | Purification of recombinant adeno-associated virus particles by multi-step anion exchange chromatography | |
| JP2010155868A (en) | Method for producing preparation of recombinant aav virion substantially free of empty capsid | |
| CN113227362A (en) | Compositions and methods for making gene therapy vectors | |
| JP5861001B2 (en) | Method for producing non-enveloped virus | |
| AU2017240721A1 (en) | Column-based fully scalable rAAV manufacturing process | |
| Turnbull et al. | Adenovirus 5 recovery using nanofiber ion‐exchange adsorbents | |
| JP2002524070A (en) | Methods for producing high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors | |
| CN117677703A (en) | Method for isolating adeno-associated viral capsids, compositions obtained by the method and uses thereof | |
| JP2001513644A (en) | Filtration methods for virus isolation | |
| Belova et al. | Approaches to purification and concentration of rAAV vectors for gene therapy | |
| CN114317464B (en) | Separation and purification method of adeno-associated virus rAAV9 | |
| CN112226418B (en) | Recombinant adeno-associated virus purification method | |
| WO2022191168A1 (en) | Method for producing recombinant aav9 virion | |
| JP6616329B2 (en) | Method for producing non-enveloped virus particles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081028 |
|
| A072 | Dismissal of procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A073 Effective date: 20090526 |