JP2007110996A - 細胞培養容器および細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞のロスや細胞に与えるストレスを抑制し、簡単な方法により培養容器の継代操作を行うことができる手段を提供する。
【解決手段】
細胞培養容器は、培養面が比較的小さい初代培養器と培養面が比較的大きい二代培養器とを有し、細胞培養容器を傾斜させることにより、初代培養器中の溶液は二代培養器に移動する。本発明の細胞培養容器は、更に培養面が大きい三代培養器を有し、細胞培養容器を傾斜させることにより、二代培養器中の溶液は三代培養器に移動する。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞を培養するための細胞培養容器及び装置に関し、特に、接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器及び装置に関する。

接着依存性細胞は、培養容器の底面に接着して増殖する。そのため、接着依存性細胞を培養する場合には、細胞密度が常に一定の範囲になるよう配慮する必要がある。細胞密度が低過ぎ、隣接する細胞間の距離が大きくなると、接着依存性細胞は、増殖速度が低下し死滅することがある。細胞密度が高すぎ、隣接する細胞間の距離が小さくなると、接着依存性細胞は、細胞の増殖を停止し、そのまま死滅することがある。したがって、接着依存性細胞を培養する場合には、接着依存性細胞を順次培養容器へ植え継ぐ継代操作を行う必要がある。

継代操作では、培養の初期に、培養面積の小さい培養容器で培養を行い、接着依存性細胞の細胞密度が低くなりすぎないようにする。そこで、接着依存性細胞がある程度まで増殖したら、より培養面積の大きい培養容器、または同培養面積を有する複数の培養容器へ植え継ぐ。これを繰り返し、目的の細胞数まで接着依存性細胞を増殖させる。

非特許文献１に記載されているように、従来、このような継代操作を含む細胞培養操作は、熟練オペレーターの手作業により行われていた。特許文献１には、細胞培養プログラムにより培地交換操作、継代培養操作をタイミング良く自動的に行う細胞培養装置が提案されている。
株式会社秀潤社発行「バイオ実験イラストレイテッド（６）すくすく育て細胞培養」Ｐ９２ 特開2001-275659号公報

特許文献１に記載されている細胞培養装置では、第１培養ユニットと第２培養ユニットは配管で接続されている。細胞を継代するとき、移動ポンプを用いて、細胞懸濁液を第１培養ユニットから第２培養ユニットへ移動させる。このように培養容器間を配管でつなぎ、移動ポンプを用いて継代を行う培養装置では、培養容器間の移動に伴う細胞のロスや、細胞に与えるストレス、また装置の構造が複雑になる等の課題があった。

本発明の目的は、細胞のロスや細胞に与えるストレスを抑制し、簡単な方法により培養容器の継代操作を行うことができる手段を提供することにある。

本発明の細胞培養容器は、培養面が比較的小さい初代培養器と培養面が比較的大きい二代培養器とを有し、細胞培養容器を傾斜させることにより、初代培養器中の溶液は二代培養器に移動する。本発明の細胞培養容器は、更に培養面が大きい三代培養器を有し、細胞培養容器を傾斜させることにより、二代培養器中の溶液は三代培養器に移動する。

本発明によると、細胞のロスや細胞に与えるストレスを抑制し、簡単な方法により培養容器の継代操作を行うことができる。

本発明の第一の実施形態を図面に基づいて説明する。
図１を参照して本発明の細胞培養容器の第１の例を説明する。図１（ａ）は本例の細胞培養容器100の上面構成を示し、図１（ｂ）はその断面構成を示す。本例の細胞培養容器100は、円形平底のシャーレ20とその中に配置されたＵ字状の仕切り板30を有する。仕切り板30によってシャーレ20は初代培養器110と二代培養器120の２つの部分に分割されている。即ち、初代培養器110は、仕切り板30の内側とシャーレ20の内壁によって囲まれ、二代培養器120は、仕切り板30の外側とシャーレ20の内壁によって囲まれている。初代培養器110及び二代培養器120の培養面はシャーレ20の底面によって構成されている。

図１（ａ）に示すように、仕切り板30は、円弧状部分30aとその両側に延びる端部30b、30cからなる。図１（ｂ）に示すように、仕切り板30の高さはシャーレ20の高さより低い。仕切り板30の２つの端部30b、30cは、シャーレ20の底面に対して垂直に配置されているが、円弧状部分30aは、シャーレ20の底面に対して所定の角度にて傾斜して配置されている。図示のように、仕切り板30の円弧状部分30aと初代培養器110の底面110aが成す角をθとする。90°＜θ＜180°であるが、以下では、θ＝135°として説明する。円弧状部分30aは、細胞培養容器100を傾斜させたとき、初代培養器110から二代培養器120へ溶液が移動するために通路部として機能する。尚、円弧状部分30aを底面に対して傾斜させる代わりに、嘴状の注ぎ口を設けてもよい。

初代培養器110には第一供給チューブ111と第一排出チューブ112が配置されている。これらの２つのチューブ111、112は、仕切り板30の円弧状部分30aに近接して配置されている。第一供給チューブ111の下端は、初代培養器110の底面110aより上方に配置されている。第一排出チューブ112の下端は、仕切り板30の円弧状部分30aの下端の近傍であって、初代培養器110の底面110aより僅か上方に配置されている。

第一供給チューブ111を介して、初代培養器110内に、培地、洗浄液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、細胞剥離剤（例えばトリプシン）、剥離停止剤（例えばトリプシンインヒビター）等が供給される。第一排出チューブ112を介して、初代培養器110から、溶液が排出される。

二代培養器120には、第二供給チューブ121と第二排出チューブ122が配置されている。これらの２つのチューブ121、122は、仕切り板30と反対側に且つシャーレ20の内壁120dに近接して配置されている。第二供給チューブ121の下端は、第一供給チューブ111の下端と略同一の高さである。第二排出チューブ122の下端は、第一排出チューブ112の下端と略同一の高さであり、二代培養器120の底面120aより僅か上方に配置されている。

第二供給チューブ121を介して、二代培養器120内に、培地、洗浄液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、細胞剥離剤（例えばトリプシン）、剥離停止剤（例えばトリプシンインヒビター）等が供給される。第二排出チューブ122を介して、二代培養器120から溶液が排出される。

細胞培養容器100、即ち、シャーレ20と仕切り板30は、培地及び接着依存性細胞の状態を肉眼で容易に観察することができるように、透明な材料により形成される。このような材料として、ポリスチレン、メタクリル樹脂、ガラス等がある。初代培養器の底面110a及び二代培養器の底面120aの表面は、接着依存性細胞が接着し増殖し易いように、例えば、コラーゲンでコーティングしたり、プラズマ照射によってラジカルを発生させたりしてもよい。

図２を参照して本例の細胞培養容器を傾斜させるための傾斜装置の一例を説明する。この傾斜装置は、細胞培養容器100を保持するための保持リング51、保持リング51に接続されたアーム52、アーム52を回転させるための支点54、アーム52を水平に保持するためのストッパー53、及び、上下方向に移動可能なシャフト55、を有する。細胞培養容器100の下方には、顕微鏡60が配置されている。

図２（ａ）に示すように、細胞培養容器100を顕微鏡60によって観察する場合には、シャフト55は初期位置に配置され、アーム52はストッパー53によって保持され、細胞培養容器100は水平に配置されている。顕微鏡60による観察が終り、細胞培養容器100を傾斜させる場合には、図２（ｂ）に示すように、シャフト55を上方に移動させる。それによって、細胞培養容器100、保持リング51及びアーム52は支点54周りに回転し、細胞培養容器100が傾斜する。細胞培養容器100の傾斜角度をαとする。

次に、図３〜図６を参照して、本発明の細胞培養容器の第１の例を用いて、接着依存性細胞を培養する方法を説明する。

図３は、本例の接着依存性細胞の培養方法の手順を示す流れ図である。先ず、ステップＳ１０１にて、細胞の播種を行う。図示しない細胞供給ユニットにより第一供給チューブ111を介して接着依存性細胞を初代培養器110へ注入する。初代培養器110に播種された接着依存性細胞は、培地の栄養分を吸収して増殖する。従って、時間が経過すると、培地の栄養分が減少し、接着依存性細胞から排出される老廃物が蓄積する。そこで、ステップＳ１０２にて、初代培養器における培地交換を行う。

図4を参照して、ステップＳ１０２の初代培養器における培地交換の操作を説明する。まず図4(a)のように細胞培養容器100を傾斜させる。細胞培養容器100の底面が水平面となす角を傾斜角αとすると、傾斜角αは45°未満である。初代培養器110中の培地500が仕切り板30を乗り越えて二代培養器120へ流れ出さないように、細胞培養容器100を傾斜させる。初代培養器中の培地500は初代培養器の底面110aと仕切り板30との境界付近に集まるため、第一排出チューブ112を介して全ての培地500を効率的に吸い取ることができる。

図4(b)に示すように、初代培養器中の培地500を全て吸い取ったら、細胞培養容器100が水平（α=0°）になるように元に位置に戻す。次に、第一供給チューブ111を介して新しい培地501を初代培養器110へ注入する。こうして、初代培養器における培地交換が完了する。

ステップＳ１０２の初代培養器110における培地交換を繰り返しながら、図2に示した顕微鏡60より初代培養器中の細胞を観察する。細胞密度が目的とする値に達したら、ステップＳ１０３にて、継代を行う。

図５を参照して継代の操作を説明する。まず、ステップＳ１０２の初代培養器における培地交換と同様の方法で初代培養器中の培地を抜き取る。次に、初代培養器の底面110aに接着している細胞を洗浄するため、第一供給チューブ111を介してリン酸緩衝生理食塩水を初代培養器へ所定の量注入する。こうして、細胞は、初代培養器の底面110aに接着した状態で洗浄される。洗浄後、ステップＳ１０２の初代培養器における培地交換と同様の方法で、洗浄廃液であるリン酸緩衝生理食塩水を抜き取る。次に、初代培養器の底面110aに接着している細胞を剥がすために、第一供給チューブ111を介してトリプシンなどの細胞剥離剤を初代培養器110に所定の量注入する。注入後、5分程度静置して細胞が初代培養器の底面から十分剥がれたら、第一供給チューブ111を介してトリプシンインヒビターなどの剥離停止剤を注入し細胞剥離剤の効果を失活させる。

細胞剥離剤が失活したら、図5(a)に示すように、細胞培養容器を傾斜角αが45°以上になるよう傾ける。細胞を含んだ細胞剥離剤と剥離停止剤の混合液502は仕切り板30を乗り越えて、初代培養器110から二代培養器120へ移動する。細胞の混合液502が全て移動し終わったら、細胞培養容器100が水平（α＝0°）になるように元の位置に戻す。図5(b)に示すように、第二供給チューブ121を介して新しい培地を所定の量注入し、培養を続ける。尚、このとき二代培養器120内の培地503は、細胞を含んだ細胞剥離剤と剥離停止剤の混合液502と新しく注入された培地の混合液である。

初代培養器110から二代培養器120への継代が完了してから所定の時間が経過した後、ステップＳ１０４にて、二代培養器における培地交換を行う。

図6を参照して二代培養器における培地交換の操作を説明する。先ず、図6(a)に示すように、細胞培養容器100を傾斜角αが45°程度になるように傾ける。二代培養器中の培地503は二代培養器の底面120aと二代培養器の側面120dとの境界付近に集まるため、第二排出チューブ122を介して二代培養器中の全ての培地503を効率よく抜き取ることができる。

図6(b)に示すように二代培養器中の全ての培地を抜き取ったら、細胞培養容器100が水平（α=0°）になるように元の位置に戻す。次に、第二供給チューブ121を介して新しい培地504を所定の量、二代培養器120に注入する。こうして、二代培養器における培地交換を完了する。

ステップＳ１０４の二代培養器における培地交換を繰り返しながら、図2に示した顕微鏡60より二代培養器中の細胞を観察する。細胞密度が目的とする値に達したら、ステップＳ１０５にて、細胞の回収を行う。

まず、ステップＳ１０４の二代培養器における培地交換と同様の方法で二代培養器中の培地を抜き取る。二代培養器の底面120aに接着している細胞を洗浄するために、第二供給チューブ121を介してリン酸緩衝生理食塩水を所定の量注入する。洗浄後、ステップＳ１０４の二代培養器における培地交換と同様の方法でリン酸緩衝生理食塩水を抜き取る。続いて、二代培養器の底面120aに接着している細胞を剥がすために、第二供給チューブ121を介してトリプシンインヒビターなどの細胞剥離剤を二代培養器120に所定の量注入する。注入後、5分程度静置し、細胞が二代培養器の底面120aから十分剥がれたら、第二供給チューブ121を介してトリプシンインヒビターなどの剥離停止剤を注入し細胞剥離剤の効果を失活させる。

細胞剥離剤が失活したら、細胞培養容器を傾斜角αが45°程度になるように傾ける。細胞を含んだ混合液は二代培養器の底面120aと二代培養器の側面120dとの境界付近に集まるため、第二排出チューブ122を介して二代培養器中の細胞を含む混合液を効率よく全て抜き取ることができる。抜き取った細胞を細胞回収容器（図示しない）へ注入し細胞を回収する。

以上説明した本実施形態によれば、複数の細胞培養容器を使用せずに、一つの細胞培養容器内で継代を行うことができる。更に、細胞培養容器を一方向に傾斜させ、その傾斜角度を調節するだけで培地交換、継代を効率よく実行することができるため装置を簡略化することができる。仕切り板の角度を調節することで細胞培養容器を大きく傾けることなく培地交換、継代を実行することができる。こうして、装置を小さくすることができ、また、細胞培養容器を大きく動かすことがないため、チューブが外れたり切れたりする危険性を抑えることができる。また、継代に複雑な操作を伴わないため継代に伴う細胞のロスや細胞に与えるストレスを抑えることができる。更に、細胞の成長に合わせ順次培養面積を拡大し、常に新しい培養面を使用して培養することができるため、細胞培養に適切な環境を維持し、効率的に細胞を増殖させることができる。また、初代培養中、二代培養中の細胞の様子を一つの観察ユニットにより観察することができる。

以上の説明では、特に円形の培養容器について説明したが、もちろん円形以外の形状でもよい。また、細胞を培養容器底面から細胞を剥がす際に細胞剥離剤を用いる代わりに、初代培養器の底面110aおよび二代培養器の底面120aの表面に、所定の温度を境界として疎水性と親水性とが切り替わる温度応答性処理を施してもよい。

図7に示す例では、二代培養器の上部に、細胞は通さず溶液のみを通すことのできるフィルター124が取り付けられた細胞分離チューブ123が付加的に設けられている。上述のステップＳ１０３の継代の処理では、細胞を含んだ細胞剥離剤と剥離停止剤の混合液150が初代培養器110から二代培養器120へ移動する。従って、細胞は、二代培養器120において、細胞剥離剤と剥離停止剤の存在下にて増殖を行う。

本例では、ステップＳ１０３の継代の処理が完了したら、混合液を抜き取り、細胞剥離剤と剥離停止剤を除去する。

図7(a)に示すように、細胞培養容器100を傾斜角αが45°程度になるように傾ける。細胞を含んだ細胞剥離剤と剥離停止剤の混合液501は二代培養器の底面120aと二代培養器の側面120dとの境界付近に集まるため、細胞分離チューブ123を介して二代培養器中の全ての混合液501を効率よく抜き取ることができる。細胞分離チューブ123の先端のフィルター124は、混合液501のみを吸い取り、細胞を残す。こうして、全ての混合液501を抜き取ったら、図7(b)に示すように、細胞分離チューブ123を介して二代培養器へ新しい培地502を注入する。それにより、フィルター124に集積した細胞は二代培養器120内に分散する。

この方法により、初代培養器110から二代培養器120へ細胞を移した直後に、細胞剥離剤や剥離停止剤を除去することができるため、細胞剥離剤や剥離停止剤が細胞に与える影響を低減することができる。

図８を参照して本発明の細胞培養容器の第２の例を説明する。図８（ａ）は本例の細胞培養容器200の上面構成を示し、図８（ｂ）はその断面構成を示す。本例の細胞培養容器200は、初代培養器210と、初代培養器210の下方に配置され且つ初代培養器210より大きな培養面積を有する二代培養器220と、二代培養器220の下方に配置され且つ二代培養器220より大きな培養面積を有する三代培養器230と、を有する。

３つの培養器は、円形平底の皿状の形状を有し、この円形平底によって培養面が形成されている。３つの培養器は、各端縁が重なるように、且つ、各中心が一直線上に乗るように、配置されている。初代培養器210の高さより二代培養器220の高さのほうが僅かに大きい。三代培養器230の高さは、初代培養器210及び二代培養器220の高さより十分大きい。従って、初代培養器210及び二代培養器220は、完全に三代培養器230内に収容されている。

初代培養器210の一方の側面は底面210aに垂直であるがそれと反対側の側面210dは底面210aより傾斜している。この傾斜側面210dが底面210aとなす角をθ1とする。二代培養器220の一方の側面は底面220aに垂直であるがそれと反対側の側面220dは底面220aより傾斜している。この傾斜側面220dが底面220aとなす角をθ２とする。90°≦θ1＜180°、90°≦θ2＜180°、θ2≦θ1であるが、以下では、θ1＝140°、θ2＝120°として説明する。

初代培養器210の傾斜側面210dは、細胞培養容器200を傾斜させたとき、初代培養器210から二代培養器220へ溶液が移動するための通路部として機能する。二代培養器220の傾斜側面220dは、細胞培養容器200を傾斜させたとき、二代培養器220から三代培養器230へ溶液が移動するための通路部として機能する。尚、傾斜側面210d、傾斜側面220dを設ける代わりに、嘴状の注ぎ口を設けてもよい。

初代培養器210には第一供給チューブ211と第一排出チューブ212が配置されている。これらの２つのチューブ211、212は、初代培養器210の傾斜側面210dに近接して配置されている。第一供給チューブ211の下端は、初代培養器210の上端の位置又はそれより僅か下方に配置されている。第一排出チューブ212の下端は、初代培養器210の傾斜側面210dの下端の近傍であって、初代培養器210の底面210aより僅か上方に配置されている。

第一供給チューブ211を介して、初代培養器210内に、培地、洗浄液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、細胞剥離剤（例えばトリプシン）、剥離停止剤（例えばトリプシンインヒビター）等が供給される。第一排出チューブ212を介して、初代培養器210から、溶液が排出される。

二代培養器220には第二供給チューブ221と第二排出チューブ222が配置されている。これらの２つのチューブ221、222は、二代培養器220の傾斜側面220dに近接して配置されている。第二供給チューブ221の下端は、二代培養器220の上端の位置又はそれより僅か下方に配置されている。第二排出チューブ222の下端は、二代培養器220の傾斜側面220dの下端の近傍であって、二代培養器220の底面220aより僅か上方に配置されている。

第二供給チューブ221を介して、二代培養器220内に、培地、洗浄液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、細胞剥離剤（例えばトリプシン）、剥離停止剤（例えばトリプシンインヒビター）等が供給される。第二排出チューブ222を介して、二代培養器220から溶液が排出される。

三代培養器230には第三供給チューブ231と第三排出チューブ232が配置されている。これらの２つのチューブ231、232は、三代培養器230の側面230dに近接して配置されている。第三供給チューブ231の下端は、第二供給チューブ221の下端と略同一の位置に配置されている。第三排出チューブ232の下端は、三代培養器230の側面230dの下端の近傍であって、三代培養器230の底面230aより僅か上方に配置されている。

第三供給チューブ231を介して、三代培養器230内に、培地、洗浄液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、細胞剥離剤（例えばトリプシン）、剥離停止剤（例えばトリプシンインヒビター）等が供給される。第三排出チューブ232を介して、三代培養器230から溶液が排出される。

初代培養器210、二代培養器220、及び、三代培養器230は、培地及び接着依存性細胞の状態を肉眼で容易に観察することができるように、透明な材料により形成される。このような材料として、ポリスチレン、メタクリル樹脂、ガラス等がある。初代培養器210、二代培養器220、及び、三代培養器230の底面の表面は、接着依存性細胞が接着し増殖し易いように、例えば、コラーゲンでコーティングしたり、プラズマ照射によってラジカルを発生させたりしてもよい。

次に、図９〜図１０を参照して、本発明の細胞培養容器の第２の例を用いて、接着依存性細胞を培養する方法を説明する。

図９は、本例の接着依存性細胞の培養方法の手順を示す流れ図である。先ず、ステップＳ２０１にて、細胞の播種を行う。図示しない細胞供給ユニットにより第一供給チューブ211を介して接着依存性細胞を初代培養器210へ注入する。初代培養器210に播種された接着依存性細胞は、培地の栄養分を吸収して増殖する。従って、時間が経過すると、培地の栄養分が減少し、接着依存性細胞から排出される老廃物が蓄積する。そこで、ステップＳ２０２にて、初代培養器における培地交換を行う。

図１０を参照して、ステップＳ２０２の初代培養器における培地交換の操作を説明する。まず図１０（ａ）に示すように細胞培養容器を傾斜させる。細胞培養容器の底面が水平面となす角を傾斜角αとすると、傾斜角αは45°未満である。初代培養器210中の培地600が傾斜側面210dを乗り越えて二代培養器220へ流れ出さないように、細胞培養容器を傾斜させる。初代培養器中の培地600は初代培養器の底面210aと傾斜側面210dの境界付近に集まるため、第一排出チューブ212を介して全ての培地600を効率的に吸い取ることができる。

ステップＳ２０２の初代培養器における培地交換を繰り返しながら、図2に示した顕微鏡60より初代培養器中の細胞を観察する。細胞密度が目的とする値に達したら、ステップＳ２０３にて、初代培養器210から二代培養器220へ継代を行う。

初代培養器210から二代培養器220へ継代を説明する。まず、ステップＳ２０２の初代培養器における培地交換と同様の方法で初代培養器中の培地を抜き取る。次に、初代培養器の底面210aに接着している細胞を洗浄するため、第一供給チューブ211を介してリン酸緩衝生理食塩水を初代培養器へ所定の量注入する。こうして、細胞は、初代培養器の底面210aに接着した状態で洗浄される。洗浄後、ステップＳ２０２の初代培養器における培地交換と同様の方法で、洗浄廃液であるリン酸緩衝生理食塩水を抜き取る。次に、初代培養器の底面210aに接着している細胞を剥がすために、第一供給チューブ211を介してトリプシンなどの細胞剥離剤を初代培養器210に所定の量注入する。注入後、5分程度静置して細胞が初代培養器の底面から十分剥がれたら、第一供給チューブ211を介してトリプシンインヒビターなどの剥離停止剤を注入し細胞剥離剤の効果を失活させる。

細胞剥離剤が失活したら、図１０（ｂ）に示すように、細胞培養容器を傾斜角αが、40°＜α＜60°となるように傾ける。細胞を含んだ細胞剥離剤と剥離停止剤の混合液601は傾斜側面210dを乗り越えて、初代培養器210から二代培養器220へ移動する。細胞の混合液601が全て移動し終わったら、細胞培養容器が水平（α＝0°）になるように元の位置に戻す。第二供給チューブ221を介して二代培養器220へ新しい培地を所定の量注入し、培養を続ける。

初代培養器210から二代培養器220への継代が完了してから所定の時間が経過した後、ステップＳ２０４にて、二代培養器220における培地交換を行う。二代培養器220における培地交換は、初代培養器210における培地交換と同様である。先ず、細胞培養容器を傾斜角αが45°程度になるように傾ける。二代培養器中の培地は二代培養器の底面220aと二代培養器の側面220dとの境界付近に集まるため、第二排出チューブ222を介して二代培養器中の全ての培地を効率よく抜き取ることができる。

二代培養器中の全ての培地を抜き取ったら、細胞培養容器が水平（α=0°）になるように元の位置に戻す。次に、第二供給チューブ221を介して新しい培地を所定の量、二代培養器220に注入する。こうして、二代培養器における培地交換を完了する。

ステップＳ２０４の二代培養器における培地交換を繰り返しながら、図2に示した顕微鏡60より二代培養器中の細胞を観察する。細胞密度が目的とする値に達したら、ステップＳ２０５にて、二代培養器220から三代培養器230へ継代を行う。

二代培養器220から三代培養器230への継代は、初代培養器210から二代培養器220への継代と同様である。まず、ステップＳ２０４の二代培養器における培地交換と同様の方法で二代培養器中の培地を抜き取る。次に、二代培養器の底面220aに接着している細胞を洗浄するため、第二供給チューブ221を介してリン酸緩衝生理食塩水を二代培養器へ所定の量注入する。こうして、細胞は、二代培養器の底面220aに接着した状態で洗浄される。洗浄後、ステップＳ２０４の二代培養器における培地交換と同様の方法で、洗浄廃液であるリン酸緩衝生理食塩水を抜き取る。次に、二代培養器の底面220aに接着している細胞を剥がすために、第二供給チューブ221を介してトリプシンなどの細胞剥離剤を二代培養器220に所定の量注入する。注入後、5分程度静置して細胞が二代培養器の底面から十分剥がれたら、第二供給チューブ221を介してトリプシンインヒビターなどの剥離停止剤を注入し細胞剥離剤の効果を失活させる。

細胞剥離剤が失活したら、図１０（ｂ）に示すように、細胞培養容器を傾斜角αが、40°＜α＜60°となるように傾ける。細胞を含んだ細胞剥離剤と剥離停止剤の混合液は傾斜側面220dを乗り越えて、二代培養器220から三代培養器230へ移動する。細胞の混合液が全て移動し終わったら、細胞培養容器が水平（α＝0°）になるように元の位置に戻す。第三供給チューブ231を介して三代培養器230へ新しい培地を所定の量注入し、培養を続ける。

二代培養器220から三代培養器230への継代が完了してから所定の時間が経過した後、ステップＳ２０６にて、三代培養器230における培地交換を行う。三代培養器230における培地交換は、初代培養器210及び二代培養器220における培地交換と同様である。先ず、細胞培養容器を傾斜角αが45°程度になるように傾ける。三代培養器中の培地は三代培養器の底面230aと三代培養器の側面230dとの境界付近に集まるため、第三排出チューブ232を介して三代培養器中の全ての培地を効率よく抜き取ることができる。

三代培養器中の全ての培地を抜き取ったら、細胞培養容器が水平（α=0°）になるように元の位置に戻す。次に、第三供給チューブ231を介して新しい培地を所定の量、三代培養器230に注入する。こうして、三代培養器における培地交換を完了する。

ステップＳ２０６の三代培養器における培地交換を繰り返しながら、図2に示した顕微鏡60より三代培養器中の細胞を観察する。細胞密度が目的とする値に達したら、ステップＳ２０７にて、細胞の回収を行う。

ステップＳ２０７の細胞の回収を説明する。まず、ステップＳ２０６の三代培養器における培地交換と同様の方法で三代培養器中の培地を抜き取る。三代培養器の底面230aに接着している細胞を洗浄するために、第三供給チューブ231を介してリン酸緩衝生理食塩水を三代培養器230に所定の量注入する。洗浄後、ステップＳ２０６の三代培養器における培地交換と同様の方法でリン酸緩衝生理食塩水を抜き取る。続いて、三代培養器の底面230aに接着している細胞を剥がすために、第三供給チューブ231を介してトリプシンインヒビターなどの細胞剥離剤を二代培養器230に所定の量注入する。注入後、5分程度静置し、細胞が三代培養器の底面から十分剥がれたら、第三供給チューブ231を介してトリプシンインヒビターなどの剥離停止剤を注入し細胞剥離剤の効果を失活させる。

細胞剥離剤が失活したら、細胞培養容器を傾斜角αが45°程度になるように傾ける。細胞を含んだ混合液は三代培養器の底面230aと側面230dとの境界付近に集まるため、第三排出チューブ232を介して三代培養器中の細胞を含む混合液を効率よく全て抜き取ることができる。抜き取った細胞を細胞回収容器（図示しない）へ注入し細胞を回収する。

本実施形態によれば、三次元的に複数の培養面を設置することができるため、小スペースで多量の細胞を培養することができ、細胞培養装置を小型化することができる。

上述の説明では、初代培養器210へ細胞を播種し、二代培養器220、三代培養器230へ順番に細胞を継代して培養する場合を説明した。しかしながら、初めから二代培養器220もしくは三代培養器230へ播種して培養してもよい。更に、初め初代培養器210で培養を行った後、二代培養器で培養を行うことなく、三代培養器230へ継代して培養してもよい。

また、初代培養器210へ細胞を播種し数日間培養を行った後、二代培養器220へ継代すると同時に初代培養器210へ新たな細胞を播種し、初代培養器210と二代培養器220を使用して同時に培養を行ってもよい。その後数日間培養を行った後、初代培養器210から二代培養器220へ、二代培養器220から三代培養器230へ継代すると同時に再び初代培養器210へ新たな細胞を播種し、初代培養器210、二代培養器220、三代培養器230を同時に使用して培養を行ってもよい。

また、初代培養器210、二代培養器220、三代培養器230に対し、それぞれ供給チューブと排出チューブを一本づつ設けた。しかしながら、供給チューブ及び排出チューブの使用方法として、この例に限定されない。

例えば、図１０に示す細胞培養容器200において、第一供給チューブ211のみを設け、第二及び第三供給チューブ221、231を省略してもよい。この形態の場合、二代培養器220や三代培養器230へ培地などの溶液を供給するには、まず供給チューブ211を介して初代培養器210へ溶液を注入した後、細胞培養容器200を傾けて二代培養器220あるいは三代培養器230へ移す。

図１１を参照して細胞培養容器の他の例を説明する。本例では、初代培養器210と二代培養器220の底面の一部241、242をシリコンなどの柔らかい素材で形成し、その上部に排出チューブ212を設ける。排出チューブ212は上下に移動可能である。初代培養器210に供給チューブ211を設ける。図１１（ａ）に示すように、初代培養器210の溶液を排出する場合には、排出チューブ212を、その下端が初代培養器210の底面の上になるように配置する。図１１（ｂ）に示すように、二代培養器220の溶液を排出する場合には、排出チューブ212を下方へ移動し、初代培養器210の底面の一部241を突き破り、排出チューブ212を、その下端が二代培養器220の底面の上になるように配置する。図１１（ｃ）に示すように、三代培養器230の溶液を排出する場合には、排出チューブ212を下方へ移動し、二代培養器220の底面の一部242を突き破り、排出チューブ212を、その下端が三代培養器230の底面の上になるように配置する。

尚、本例の細胞培養容器において、継代を行う場合には、細胞培養容器を傾斜させて溶液を移動させるが、この操作は上述の例と同様である。

こうして本例によると、排出チューブの数を減らすことができるから、チューブが途中で切れたり、外れたりする可能性を低減することができる。

図１２を参照して細胞培養容器の更に他の例を説明する。本例では、初代培養器210と二代培養器220が交互に、即ち、細胞培養容器200の両側に対向するように配置されている。初代培養器210から二代培養器220へ継代する場合と二代培養器220から三代培養器230へ継代する場合とでは、細胞培養容器200の傾斜方向が反対となる。従って、初代培養器210から二代培養器220へ継代する際に、溶液の一部が誤って三代培養器230へ移ってしまう可能性を低減することができる。

本発明によれば、複数の細胞培養容器を使用せずに、一つの細胞培養容器内で継代を行うことができ、かつ、細胞培養容器を傾斜させる角度を調節するだけで培地交換、継代を効率よく実行することができるため装置を簡略化することができる。また、継代に複雑な操作を伴わないため継代に伴う細胞のロスや細胞に与えるストレスを抑えることができる。また、細胞の成長に合わせ順次培養面積を拡大し、常に新しい培養面を使用して培養することができるため、細胞培養に適切な環境を維持し、効率的に細胞を増殖させることができる。また人手によらず細胞培養操作を自動で行うことができるため、作業者への負担をなくし、細胞培養を効率的に行うことができる。

以上本発明に関し、実施例を用いて具体的に説明したが、本発明はこれら実施例に限定したものではなく、各実施例の組み合わせやその効果を逸脱しない範囲で種々変更可能である。

本発明による細胞培養装置の第１の例の構造を示す図である。 本発明による細胞培養容器を傾斜させるための傾斜装置の構成を示す図である。 本発明による細胞培養容器の第１の例を用いて細胞を培養する手順を示す図である。 本発明による細胞培養容器の第１の例を用いて、初代培養器において培地交換を行う状態を示す図である。 本発明による細胞培養容器の第１の例を用いて、初代培養器から二代培養器へ継代を行う状態を示す図である。 本発明による細胞培養容器の第１の例を用いて、二代培養器において培地交換を行う状態を示す図である。 本発明による細胞培養容器の第１の例において、細胞分離チューブを設けた場合を示す図である。 本発明による細胞培養装置の第２の例の構成を示す図である。 本発明による細胞培養容器の第２の例を用いて細胞を培養する手順を示す図である。 本発明による細胞培養容器の第２の例を用いて、培地交換及び継代を行う状態を示す図である。 本発明による細胞培養装置の第３の例の構造を示す図である。 本発明による細胞培養装置の第４の例の構造を示す図である。

符号の説明

20…シャーレ、 30…仕切り板、 100…細胞培養容器、 110…初代培養器、 111…第一供給チューブ、 112…第一排出チューブ、 120…二代培養器、 121…第二供給チューブ、 122…第二排出チューブ、 123…細胞分離チューブ、 124…フィルター、 200…細胞培養容器、 210…初代培養器、 211…第一供給チューブ、 212…第一排出チューブ、 220…二代培養器、 221…第二供給チューブ、 222…第二排出チューブ、 230…三代培養器、 231…第三供給チューブ、 232…第三排出チューブ

Claims (6)

1. 底面に培養面を有する容器と該容器内に配置された仕切り板とを有し、該仕切り板によって上記容器は初代培養器を形成する小さな部分と二代培養器を形成する大きな部分の２つの部分に分割され、上記仕切り板は、上記初代培養器から上記二代培養器へ溶液を移動させるための通路部を有し、上記容器を傾斜させたとき、上記初代培養器内の溶液は上記仕切り板の通路部を介して上記二代培養器内へ流れることを特徴とする細胞培養容器。
2. 請求項１記載の細胞培養容器において、上記仕切り板は上記通路部を形成する円弧状部分と該円弧状部分の両側に延びる２つの端部とからなるＵ字状の形状を有し、上記２つの端部は上記容器の底面に垂直に配置され、上記円弧状部分は上記容器の底面に対して傾斜して配置されていることを特徴とする細胞培養容器。
3. 底面に培養面を有する初代培養器と、底面に上記初代培養器の培養面より大きな培養面を有し且つ上記初代培養器の下方に配置された二代培養器と、を有する細胞培養容器において、上記初代培養器は通路部を有し、該細胞培養容器を傾斜させたとき、上記初代培養器の溶液は、上記通路部を介して上記二代培養器へ移動することを特徴とする細胞培養容器。
4. 請求項３記載の細胞培養容器において、更に、底面に上記二代培養器の培養面より大きな培養面を有し且つ上記二代培養器の下方に配置された三代培養器を有し、上記二代培養器は通路部を有し、該細胞培養容器を傾斜させたとき、上記二代培養器の溶液は、上記通路部を介して上記三代培養器へ移動することを特徴とする細胞培養容器。
5. 請求項３又は４に記載の細胞培養容器において、上記通路部は傾斜された側面であることを特徴とする細胞培養容器。
6. 請求項１から５のいずれかに記載の細胞培養容器と、前記細胞培養容器を傾斜させる手段と、上記培養器に溶液を供給する手段と、上記培養器から溶液を排出する手段と、を有する細胞培養装置。

Images