JP2007104944A - Activation-regulating agent of cell having cell surface receptor capable of forming cluster, and method for screening the same - Google Patents

Activation-regulating agent of cell having cell surface receptor capable of forming cluster, and method for screening the same Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a medicine having a new action mechanism against diseases such as immunity disorders, etc., and a method necessary for the development of the same. <P>SOLUTION: This method for screening a substance capable of regulating the activation of cells comprises the evaluation whether a test substance can regulate the formation of micro clusters (MC)(e.g. TCR-containing MC) containing a cell surface receptor capable of forming the cluster, or not. The kit for screening the substance capable of regulating the activation of cells includes an expression vector of a constituting molecule of the MC containing the cell surface receptor capable of forming the cluster, or a T cell introduced with the expression vector. The cell activation-regulating agent contains the substance capable of regulating the formation of the MC containing the cell surface receptor capable of forming the cluster. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法、および細胞表面レセプター含有ＭＣの形成を調節し得る物質などを提供する。   The present invention provides a method for screening a substance capable of controlling cell activation, a substance capable of regulating the formation of cell surface receptor-containing MC, and the like.

免疫応答は、抗原（Ａｇ）処理Ａｇ提示細胞（ＡＰＣ）（例、樹状細胞（ＤＣ））とＡｇ特異的Ｔ細胞との間の相互作用により媒介される特定のＡｇの認識によるＴ細胞の活性化により誘発される。この相互作用は、細胞間境界面での特定構造−免疫シナプス（immunological synapse：ＩＳ）の形成を介して生じる。細胞接触後１０−１５分以内に、細胞表面分子と膜会合性細胞内分子の会合を伴う動的な再構成が生じる。ＩＳ形成は、細胞骨格およびレセプターの会合を誘導するＴＣＲ媒介シグナル伝達に依存し、エフェクター機能を誘導する。ＴＣＲ刺激は、表面分子の特異的な凝集を誘導する：ＴＣＲ−ＣＤ３複合体は、他の分子（例、ＣＤ４／ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ２８）とともにcentral (c-) supra molecular activation cluster（ＳＭＡＣ）として界面の中心に蓄積するものの、接着分子（例、ＬＦＡ−１）は、辺縁部（peripheral：p-）ＳＭＡＣとして周囲の領域に蓄積する。さらに、ＣＤ４３、ＣＤ４５のような大きな分子は、ＩＳから排除され、遠位（distal：d-）ＳＭＡＣへと位置付けられる。ＩＳのこれらの構造的特徴、特にｃ−ＳＭＡＣにおけるＴＣＲの蓄積から、ｃ−ＳＭＡＣは、Ｔ細胞のＡｇ認識および活性化を媒介し、ｐ−ＳＭＡＣは細胞接着を支持し、ＩＳを維持するために働くと従来考えられていた。   The immune response is determined by the recognition of specific Ags mediated by the interaction between antigen (Ag) -treated Ag-presenting cells (APCs) (eg, dendritic cells (DC)) and Ag-specific T cells. Induced by activation. This interaction occurs through the formation of a specific structure-immunological synapse (IS) at the intercellular interface. Within 10-15 minutes after cell contact, dynamic reconstitution with association of cell surface molecules and membrane associated intracellular molecules occurs. IS formation relies on TCR-mediated signaling to induce cytoskeleton and receptor association and induces effector function. TCR stimulation induces specific aggregation of surface molecules: TCR-CD3 complex as a central (c-) supra molecular activation cluster (SMAC) along with other molecules (eg, CD4 / CD8, CD2, CD28) Although it accumulates at the center of the interface, the adhesion molecule (eg, LFA-1) accumulates in the surrounding area as a peripheral (p-) SMAC. In addition, large molecules such as CD43, CD45 are excluded from IS and positioned in the distal (d-) SMAC. From these structural features of IS, particularly TCR accumulation in c-SMAC, c-SMAC mediates T cell Ag recognition and activation, and p-SMAC supports cell adhesion and maintains IS Previously thought to work.

しかし、Ｔ細胞の初期活性化（チロシンリン酸化、カルシウム動員およびホスホイノシチド代謝を含む）は、ＩＳ形成よりもはるかに早く誘導される。実際、Ｌｅｅらは、ＬｃｋおよびＺＡＰ−７０のリン酸化が成熟ＩＳ形成よりも早く生じることを報告している（非特許文献１）。ＣＤ２ＡＰ欠損マウスの解析も同様に、Ｔ細胞活性化が成熟ＩＳの非存在下で誘導されることを示した（非特許文献２）。さらに、部分アゴニストペプチドは、成熟ＩＳの非存在下でＴ細胞を誘発し得た（非特許文献３、４）。これらの結果から、ＩＳ形成は、初期Ｔ細胞活性化に必要ではないかもしれず、従って、Ｔ細胞活性化におけるＩＳの機能および活性化の部位は理解し難い。対照的に、ＴＣＲ刺激により誘導されるシグナル伝達経路が、生化学的および遺伝学的アプローチにより広範に解析されている。ＴＣＲによるＡｇ認識は、ＳｒｃキナーゼＬｃｋによる、ＣＤ３分子、特にＣＤ３ζ鎖のＩＴＡＭのリン酸化を誘導し、ＺＡＰ−７０をリン酸化ＩＴＡＭにリクルートする。次いで、ＺＡＰ−７０が活性化され、２つの重要なアダプターＬＡＴおよびＳＬＰ−７６を含む幾つかのアダプター分子をリン酸化する。膜アダプター分子ＬＡＴは、脂質ラフトに局在し、Ｇａｄｓとの会合を介してＳＬＰ−７６をリクルートする。リン酸化ＬＡＴおよびＳＬＰ−７６は、多くの下流シグナル伝達分子をリクルートし、それにより種々のエフェクター機能の活性化が生じる。   However, early activation of T cells (including tyrosine phosphorylation, calcium mobilization and phosphoinositide metabolism) is induced much earlier than IS formation. In fact, Lee et al. Report that phosphorylation of Lck and ZAP-70 occurs earlier than mature IS formation (Non-Patent Document 1). Similarly, analysis of CD2AP-deficient mice showed that T cell activation was induced in the absence of mature IS (Non-Patent Document 2). Furthermore, partial agonist peptides could induce T cells in the absence of mature IS (Non-Patent Documents 3 and 4). From these results, IS formation may not be necessary for early T cell activation, and therefore the function of IS in T cell activation and the site of activation are difficult to understand. In contrast, signaling pathways induced by TCR stimulation have been extensively analyzed by biochemical and genetic approaches. Ag recognition by TCR induces phosphorylation of ITAM of CD3 molecules, particularly CD3ζ chain, by Src kinase Lck, and recruits ZAP-70 to phosphorylated ITAM. ZAP-70 is then activated and phosphorylates several adapter molecules including two important adapters LAT and SLP-76. The membrane adapter molecule LAT localizes to lipid rafts and recruits SLP-76 via association with Gads. Phosphorylated LAT and SLP-76 recruit many downstream signaling molecules, resulting in activation of various effector functions.

Ｔ細胞の初期活性化におけるシグナル伝達分子の動的なリクルートが、固定化抗ＣＤ３Ａｂでの刺激により種々のＥＧＦＰ融合タンパク質を発現するJurkat細胞を用いて、Bunnellらにより解析された（非特許文献５）。それらの研究は、ＴＣＲ、キナーゼおよびアダプター分子を含む特殊なクラスターがＴ細胞の刺激後速やかに誘導されることを明らかに示している。しかし、固定化抗ＣＤ３Ａｂによる刺激を利用するこのシステムは、活性化の初期の解析が限定的なものとなり、そのため、生理学的条件下におけるＩＳ形成までの全プロセスは依然として不明である。一方、ＩＳ構造は、Ｔ細胞活性化に必要とされる持続シグナルの維持に必要とされることが示されている（非特許文献６）。ＭＡＰＫ活性化、カルシウム動員およびＡｋｔ活性化を含む持続シグナル伝達が、サイトカイン分泌およびエフェクター機能を誘導するＴ細胞活性化に必要とされることは周知である。ＩＳはシグナルの持続の維持に必要とであると考えられているが、このような持続シグナルの誘導のための真の部位は依然として不明である。
Lee et al., Science 295, 1539-42 (2002) Lee et al., Science 302, 1218-22 (2003) Irvine et al., Nature 419, 845-9 (2002) Purtic et al., Proc Natl Acad Sci USA 102, 2904-9 (2005) Bunnell et al., J Cell Biol 158, 1263-75 (2002) Huppa et al., Nat Immunol 4, 749-55 (2003) Dynamic recruitment of signaling molecules in the initial activation of T cells was analyzed by Bunnell et al. Using Jurkat cells that express various EGFP fusion proteins upon stimulation with immobilized anti-CD3 Ab (5). ). Those studies clearly show that a specialized cluster containing TCR, kinase and adapter molecules is rapidly induced after T cell stimulation. However, this system, which utilizes stimulation with immobilized anti-CD3 Ab, has limited initial analysis of activation, so the entire process up to IS formation under physiological conditions remains unclear. On the other hand, it has been shown that the IS structure is required for maintaining a sustained signal required for T cell activation (Non-patent Document 6). It is well known that sustained signaling including MAPK activation, calcium mobilization and Akt activation is required for T cell activation to induce cytokine secretion and effector functions. Although IS is thought to be necessary for maintaining signal persistence, the true site for induction of such persistence signals remains unclear.
Lee et al., Science 295, 1539-42 (2002) Lee et al., Science 302, 1218-22 (2003) Irvine et al., Nature 419, 845-9 (2002) Purtic et al., Proc Natl Acad Sci USA 102, 2904-9 (2005) Bunnell et al., J Cell Biol 158, 1263-75 (2002) Huppa et al., Nat Immunol 4, 749-55 (2003)

Ｔ細胞等の細胞の活性化の機序の解明は、免疫疾患等の疾患に対する新たな作用機序を有する医薬品の開発につながる。本発明は、このような疾患に対する治療薬のスクリーニング方法などを提供することを目的とする。   The elucidation of the activation mechanism of cells such as T cells leads to the development of a pharmaceutical having a new action mechanism for diseases such as immune diseases. It is an object of the present invention to provide a screening method for therapeutic agents for such diseases.

本発明者らは、ＩＳ形成の動的プロセス、特に、活性化シグナルを誘導するＴＣＲシグナル伝達複合体の形成とのその関連性をリアルタイムで精密に解析するため、正常なＡｇ特異的Ｔ細胞のための平面二重層および全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の組合せシステムを利用した。このアプローチは、Ｔ細胞活性化におけるシグナル分子のナノスケールの移動の解析を可能とする。本発明者らは、本システムを利用することで、ＴＣＲ、キナーゼおよびアダプター分子を含むマイクロクラスター（ＭＣ）を同定し、二重層に対する細胞の接触直後からＩＳ形成の終了までに及ぶ全プロセスのモニターに成功した。本発明者らはまた、ＩＳではなくＭＣが初期および持続活性化シグナルの発生のための部位であることを見出した。ＭＣにおけるＴＣＲシグナル伝達複合体の形成は、活性化の誘導に必要である。ＩＳ形成後、このようなシグナル誘導性ＭＣはＩＳの辺縁部でのみ生じる。このことは、持続活性化シグナルがＩＳの辺縁部で生じ、ｃ−ＳＭＡＣからは生じないことを示唆する。本発明者らはまた、Ｔ細胞に限らず、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを有する細胞、特に免疫シナプスを形成し得る細胞でも同様にＭＣが形成され、細胞活性化が誘導され得ることを想起し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである。
〔１〕被験物質が、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節するか否かを評価することを含む、細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法。
〔２〕免疫シナプスを形成し得る細胞の活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法である、上記〔１〕の方法。
〔３〕ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節するか否かを評価することを含む、Ｔ細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法。
〔４〕ＴＣＲ含有ＭＣが免疫シナプス辺縁部におけるＴＣＲ含有ＭＣである、上記〔３〕の方法。
〔５〕被験物質がＴＣＲ含有ＭＣの形成を抑制するか否かを評価することを含むＴ細胞活性化を阻害し得る物質のスクリーニング方法である、上記〔３〕または〔４〕の方法。
〔６〕ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節するか否かの評価が、ＴＣＲ含有ＭＣへのキナーゼ分子および／またはアダプター分子のリクルートの評価である、上記〔３〕または〔４〕の方法。
〔７〕キナーゼ分子およびアダプター分子がそれぞれ、ＺＡＰ−７０およびＳＬＰ−７６である、上記〔４〕の方法。
〔８〕以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、上記〔３〕のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、Ｔ細胞、およびＴ細胞活性化抗原をロードした脂質二重層含有媒体を接触させる工程：
（ｂ）被験物質の存在下において、二重層含有媒体を接触させたＴ細胞におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成能を測定し、該形成能を、該被験物質の不在下における形成能と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、該形成を調節する被験物質を選択する工程。
〔９〕脂質二重層含有媒体が、抗原提示能を有する平面二重層または抗原提示細胞である、上記〔８〕の方法。
〔１０〕細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング用キットであって、
クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの構成分子の発現ベクターまたは該発現ベクターが導入されたＴ細胞を含み、
該構成分子が検出可能に標識されている、キット。
〔１１〕クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節し得る物質を含む、細胞活性化制御剤。
〔１２〕免疫シナプスを形成する細胞の活性化制御剤である、上記〔１１〕の剤。
〔１３〕ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質を含む、Ｔ細胞活性化制御剤。
〔１４〕ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質が、免疫シナプス辺縁部におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質である、上記〔１３〕の剤。
〔１５〕ＴＣＲ含有ＭＣの形成を抑制し得る物質を含むＴ細胞活性化阻害剤である、上記〔１３〕の剤。
〔１６〕ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質が、ＴＣＲ含有ＭＣへのキナーゼ分子および／またはアダプター分子のリクルートを調節し得る物質、または細胞骨格の形成を調節し得る物質である、上記〔１３〕または〔１４〕の剤。 In order to precisely analyze in real time the dynamic process of IS formation, in particular its association with the formation of a TCR signaling complex that induces an activation signal, normal Ag-specific T cells A combined system of planar bilayer and total reflection illumination fluorescence microscope (TIRFM) was utilized. This approach allows analysis of nanoscale movement of signal molecules in T cell activation. By using this system, the inventors have identified microclusters (MCs) containing TCR, kinases and adapter molecules, and monitored the entire process from immediately after cell contact to the bilayer to the end of IS formation. succeeded in. We have also found that MC, not IS, is a site for the generation of early and sustained activation signals. Formation of the TCR signaling complex in MC is necessary for induction of activation. After IS formation, such signal-induced MC occurs only at the edge of the IS. This suggests that a sustained activation signal occurs at the IS margin and not from c-SMAC. The present inventors also show that not only T cells but also cells having cell surface receptors that can form clusters, particularly cells that can form immune synapses, can similarly form MC and induce cell activation. Recalling that the present invention has been completed.
That is, the present invention is as follows.
[1] A screening method for a substance capable of controlling cell activation, comprising evaluating whether a test substance regulates the formation of MC containing a cell surface receptor capable of forming a cluster.
[2] The method of [1] above, which is a screening method for a substance capable of controlling the activation of cells capable of forming immune synapses.
[3] A screening method for a substance capable of controlling T cell activation, comprising evaluating whether or not the formation of TCR-containing MC is regulated.
[4] The method of [3] above, wherein the TCR-containing MC is a TCR-containing MC at the immune synaptic margin.
[5] The method according to [3] or [4] above, which is a screening method for a substance capable of inhibiting T cell activation, comprising evaluating whether a test substance suppresses the formation of TCR-containing MC.
[6] The method according to [3] or [4] above, wherein the evaluation as to whether or not the formation of TCR-containing MC is regulated is the evaluation of recruitment of kinase molecules and / or adapter molecules to TCR-containing MC.
[7] The method of [4] above, wherein the kinase molecule and the adapter molecule are ZAP-70 and SLP-76, respectively.
[8] The screening method of the above [3], comprising the following steps (a) to (c):
(A) A step of contacting a test substance, a T cell, and a lipid bilayer-containing medium loaded with a T cell activating antigen:
(B) measuring the ability of TCR-containing MC to be formed in T cells contacted with the bilayer-containing medium in the presence of the test substance, and comparing the ability to form in the absence of the test substance;
(C) A step of selecting a test substance that regulates the formation based on the comparison result of (b).
[9] The method according to [8] above, wherein the lipid bilayer-containing medium is a planar bilayer or antigen-presenting cell having antigen-presenting ability.
[10] A screening kit for a substance capable of controlling cell activation,
An expression vector of a component molecule of MC containing a cell surface receptor capable of forming a cluster, or a T cell into which the expression vector has been introduced,
A kit wherein the constituent molecules are detectably labeled.
[11] A cell activation control agent comprising a substance capable of regulating the formation of MC containing a cell surface receptor capable of forming a cluster.
[12] The agent according to [11] above, which is an agent for controlling activation of cells that form immune synapses.
[13] A T cell activation regulator comprising a substance capable of regulating the formation of a TCR-containing MC.
[14] The agent according to [13] above, wherein the substance capable of regulating the formation of a TCR-containing MC is a substance capable of regulating the formation of a TCR-containing MC at the immunosynaptic margin.
[15] The agent according to [13] above, which is a T cell activation inhibitor containing a substance capable of suppressing the formation of TCR-containing MC.
[16] The substance capable of regulating the formation of a TCR-containing MC is a substance capable of regulating recruitment of a kinase molecule and / or an adapter molecule to the TCR-containing MC, or a substance capable of regulating the formation of a cytoskeleton. [13] or [14].

本発明のスクリーニング方法は、細胞、例えば免疫シナプスを形成し得る細胞、特にＴ細胞の活性化を制御し得る物質の取得を可能とする。本発明のキットは、本発明のスクリーニング方法を簡便に行うことを可能とする。本発明の剤は、細胞の活性化の制御を可能とする。   The screening method of the present invention makes it possible to obtain a substance that can control the activation of cells, for example, cells capable of forming immune synapses, particularly T cells. The kit of the present invention makes it possible to easily perform the screening method of the present invention. The agent of the present invention enables control of cell activation.

本発明は、細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、被験物質が、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節（例、促進または抑制）するか否かを評価することを含み得る。   The present invention provides a screening method for a substance capable of controlling cell activation. The screening method of the present invention may comprise evaluating whether the test substance modulates (eg, promotes or suppresses) the formation of MC containing cell surface receptors capable of forming clusters.

クラスターを形成し得る細胞表面レセプター（以下、必要に応じて細胞表面レセプターと省略する）とは、細胞表面レセプターに対する刺激（例、リガンド刺激）の受容後に集積し、細胞内へとシグナルを伝達する細胞表面レセプターをいう。従って、本発明によれば、このような細胞表面レセプターを有する任意の細胞の活性化を制御し得る物質のスクリーニングが可能となる。このような細胞表面レセプターを有する細胞は特に限定されるものではないが、例えば、血液細胞（例、リンパ球（例、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）、樹状細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、好塩基球）、肝細胞、脾細胞、骨髄細胞、ランゲルハンス細胞、内皮細胞、肥満細胞、破骨細胞、骨芽細胞、またはこれらの幹細胞が挙げられる。これらの細胞のなかでも、血液細胞が好ましいが、免疫シナプスを形成し得る細胞であるＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、マクロファージがより好ましく、Ｔ細胞が最も好ましい。   A cell surface receptor capable of forming a cluster (hereinafter abbreviated as cell surface receptor, if necessary) accumulates after receiving a stimulus (eg, ligand stimulus) to the cell surface receptor and transmits a signal into the cell. Refers to cell surface receptor. Therefore, according to the present invention, it is possible to screen for a substance that can control the activation of any cell having such a cell surface receptor. The cell having such a cell surface receptor is not particularly limited. For example, blood cells (eg, lymphocytes (eg, T cells, B cells, NK cells, NKT cells), dendritic cells, macrophages, Monocytes, eosinophils, neutrophils, basophils), hepatocytes, spleen cells, bone marrow cells, Langerhans cells, endothelial cells, mast cells, osteoclasts, osteoblasts, or stem cells thereof. Among these cells, blood cells are preferable, but T cells, B cells, NK cells, NKT cells, dendritic cells, and macrophages that are cells capable of forming immune synapses are more preferable, and T cells are most preferable.

好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、被験物質が、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターとして抗原レセプターを含有するマイクロクラスター（ＭＣ）の形成を調節（例、促進または抑制）するか否かを評価することを含み得る。抗原レセプターとしては、抗原刺激を細胞内に伝達するレセプターをいい、例えば、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）、ＮＫ細胞レセプターが挙げられる。   In a preferred embodiment, the screening method of the present invention determines whether the test substance modulates (eg, promotes or suppresses) the formation of a microcluster (MC) containing an antigen receptor as a cell surface receptor capable of forming a cluster. Can be evaluated. The antigen receptor refers to a receptor that transmits antigen stimulation into a cell, and examples thereof include a T cell receptor (TCR), a B cell receptor (BCR), and an NK cell receptor.

抗原レセプター含有ＭＣは、抗原レセプターおよびその細胞内効果器、キナーゼ分子およびアダプター分子を含む、細胞活性化に必要なシグナル伝達を担うクラスターである。本発明者らは、かかる抗原レセプター含有ＭＣが細胞の活性化シグナルを発生する部位であり得ることを見出した。抗原レセプター含有ＭＣとしては、ＴＣＲ含有ＭＣが好ましい。   The antigen receptor-containing MC is a cluster responsible for signal transduction necessary for cell activation, including the antigen receptor and its intracellular effector, kinase molecule and adapter molecule. The present inventors have found that such antigen receptor-containing MC may be a site that generates a cell activation signal. As the antigen receptor-containing MC, a TCR-containing MC is preferable.

ＴＣＲ含有ＭＣは、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体、キナーゼ分子およびアダプター分子を含む、Ｔ細胞活性化に必要なＴＣＲシグナル伝達（ＭＡＰＫ活性化、カルシウム動員およびＡｋｔ活性化を含む）を担うクラスターである。本発明者らは、かかるＴＣＲ含有ＭＣがＴ細胞の活性化シグナル（初期および持続活性化シグナルを含む）を発生する部位であり得ることを見出した。ＴＣＲ含有ＭＣに含まれるキナーゼ分子としては、活性化シグナルを下流に伝達し得るものである限り特に限定されないが、例えば、ＺＡＰ−７０、Ｌｃｋが挙げられる。ＴＣＲ含有ＭＣに含まれるアダプター分子としては、活性化シグナルを下流に伝達し得るものである限り特に限定されないが、例えば、ＳＬＰ−７６、ＬＡＴ、Ｎｃｋが挙げられる。本明細書中、ＴＣＲ含有ＭＣに含まれる任意の分子を意図する場合、ＴＣＲ含有ＭＣ構成分子と呼ぶ場合がある。   TCR-containing MCs are clusters responsible for TCR signaling (including MAPK activation, calcium mobilization and Akt activation) required for T cell activation, including TCR-CD3 complex, kinase molecule and adapter molecule. The inventors have found that such TCR-containing MCs can be sites that generate T cell activation signals (including early and sustained activation signals). The kinase molecule contained in the TCR-containing MC is not particularly limited as long as it can transmit an activation signal downstream, and examples thereof include ZAP-70 and Lck. The adapter molecule contained in the TCR-containing MC is not particularly limited as long as it can transmit an activation signal downstream, and examples thereof include SLP-76, LAT, and Nck. In the present specification, when an arbitrary molecule contained in a TCR-containing MC is intended, it may be referred to as a TCR-containing MC constituent molecule.

ＴＣＲ含有ＭＣは、Ｔ細胞と抗原提示細胞との接着面（免疫シナプス：ＩＳ）全体に形成され、初期活性化シグナルに重要な役割を果たし得るＴＣＲ含有ＭＣ、ならびに上記ＴＣＲ含有ＭＣのＩＳの中心への集合後にＩＳの辺縁部に形成される、持続活性化シグナルに重要な役割を果たし得るＴＣＲ含有ＭＣに大別できる。   The TCR-containing MC is formed on the entire adhesion surface (immunosynapse: IS) of T cells and antigen-presenting cells, and can play an important role in the initial activation signal, as well as the IS center of the TCR-containing MC It can be roughly divided into TCR-containing MCs that can play an important role in sustained activation signals that are formed at the edge of IS after assembly.

本明細書中で使用される場合、ＩＳの「辺縁部」とは、接着面の中心から、半径の約５〜２０％の距離、好ましくは半径の約５〜１５％の距離、より好ましくは半径の約５〜１０％の距離に位置する領域をいう。例えば、細胞直径１ｍｍ（半径５００ｎｍ）の場合、免疫シナプスの辺縁部は、接着面の中心から約４０〜５０ｎｍに位置し得る領域であり得る。   As used herein, an “edge” of IS is a distance of about 5-20% of the radius, preferably about 5-15% of the radius, more preferably from the center of the adhesive surface. Refers to a region located at a distance of about 5-10% of the radius. For example, when the cell diameter is 1 mm (radius 500 nm), the marginal part of the immune synapse may be an area that can be located about 40 to 50 nm from the center of the adhesion surface.

スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖および／または環を含む脂肪酸）、アミノ酸、蛋白質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。   The test substance to be subjected to the screening method may be any known compound or novel compound, such as a nucleic acid (eg, nucleoside, oligonucleotide, polynucleotide), carbohydrate (eg, monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide). , Polysaccharides), lipids (eg, saturated or unsaturated linear, branched and / or cyclic fatty acids), amino acids, proteins (eg, oligopeptides, polypeptides), organic low molecular weight compounds, using combinatorial chemistry technology Compound libraries prepared in this manner, random peptide libraries prepared by solid phase synthesis or phage display methods, or natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.

本発明のスクリーニング方法は、被験物質が細胞表面レセプター含有ＭＣの形成を調節するか否かを可視的に評価可能である限り如何なる形態でも行われ得るが、例えば、細胞表面レセプター含有ＭＣへの所定の分子（例、キナーゼ分子、アダプター分子）のリクルートを可視的に評価することが挙げられる。これらは、顕微鏡下で観察する等の自体公知の方法により行うことができる。なお、本発明のスクリーニング方法は、他の指標と組合せて行うこともできる。このような他の指標としては、細胞表面レセプター含有ＭＣのキナーゼ分子およびアダプター分子の活性化・リン酸化、細胞内カルシウムシグナル、細胞骨格の形成などが挙げられる。   The screening method of the present invention can be carried out in any form as long as it can visually evaluate whether or not a test substance regulates the formation of cell surface receptor-containing MC. The recruitment of molecules (eg, kinase molecules, adapter molecules) is visually evaluated. These can be performed by a method known per se such as observation under a microscope. The screening method of the present invention can also be performed in combination with other indicators. Examples of such other indicators include activation and phosphorylation of kinase molecules and adapter molecules of cell surface receptor-containing MC, intracellular calcium signal, and formation of cytoskeleton.

より詳細には、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ１）〜（ｃ１）または（ａ２）〜（ｃ２）を含み得る：
（ａ１）被験物質、Ｔ細胞等の細胞（またはＢ細胞等の細胞：本方法論においてＴ細胞等の細胞はＢ細胞等の細胞と読み替え可能であるが、以下では必要に応じて省略する）、およびＴ細胞活性化抗原等の抗原をロードした脂質二重層含有媒体（または抗原自体）を接触させる工程：
（ｂ１）被験物質の存在下において、二重層含有媒体を接触させたＴ細胞細胞等の細胞におけるＴＣＲ等のレセプター（または抗原を接触させたＢＣＲ等のレセプター：本方法論においてＴＣＲ等のレセプターはＢＣＲ等のレセプターと読み替え可能であるが、以下では必要に応じて省略する）含有ＭＣの形成能を測定し、該形成能を、該被験物質の不在下における形成能と比較する工程；
（ｃ１）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、該形成を調節する被験物質を選択する工程。
以下、Ｔ細胞等の細胞を単にＴ細胞と、ＴＣＲ等のレセプターをＴＣＲと、Ｔ細胞活性化抗原等の抗原をＴ細胞活性化抗原と必要に応じて記載するが、それらに限定されるものではない。 More specifically, the screening method of the present invention may include the following steps (a1) to (c1) or (a2) to (c2):
(A1) Test substance, cells such as T cells (or cells such as B cells: in this methodology, cells such as T cells can be read as cells such as B cells, but will be omitted below if necessary), And contacting a lipid bilayer-containing medium (or antigen itself) loaded with an antigen such as a T cell activating antigen:
(B1) A receptor such as TCR in a cell such as a T cell cell contacted with a bilayer-containing medium in the presence of a test substance (or a receptor such as BCR contacted with an antigen: in this methodology, a receptor such as TCR is a BCR A step of measuring the ability to form contained MC and comparing the ability to form in the absence of the test substance;
(C1) A step of selecting a test substance that regulates the formation based on the comparison result of (b).
Hereinafter, cells such as T cells are simply described as T cells, receptors such as TCR as TCRs, and antigens such as T cell activation antigens as T cell activation antigens as necessary, but are not limited thereto. is not.

（ａ２）被験物質、およびクラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有する細胞を接触させる工程：
（ｂ２）被験物質の存在下において、該細胞における、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成能を測定し、該形成能を、該被験物質の不在下における形成能と比較する工程；
（ｃ２）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、該形成を調節する被験物質を選択する工程。 (A2) contacting the test substance and a cell containing a cell surface receptor capable of forming a cluster:
(B2) In the presence of the test substance, the ability to form MC containing cell surface receptors capable of forming clusters in the cells is measured, and the ability to form is compared with the ability to form in the absence of the test substance. Process;
(C2) A step of selecting a test substance that regulates the formation based on the comparison result of (b).

上記工程（ａ１）では、Ｔ細胞、およびＴ細胞活性化抗原をロードした脂質二重層含有媒体に対して、被験物質が適切な培地中にて共存下におかれる。培地および培養条件は、Ｔ細胞が活性化し、ＴＣＲ含有ＭＣの観察が可能となり得るような条件である限り特に限定されない。上記工程（ａ２）は、Ｔ細胞活性化抗原をロードした脂質二重層含有媒体を使用しないこと以外は、工程（ａ１）と同様の方法により行われ得る。なお、工程（ａ２）は、細胞表面レセプターに対するリガンド（例、アゴニスト）の共存下で行われ得る。   In the step (a1), the test substance is placed in the presence of a T cell and a lipid bilayer-containing medium loaded with a T cell activation antigen in an appropriate medium. The medium and culture conditions are not particularly limited as long as T cells are activated and TCR-containing MCs can be observed. The step (a2) can be performed by the same method as the step (a1) except that the lipid bilayer-containing medium loaded with the T cell activation antigen is not used. The step (a2) can be performed in the presence of a ligand (eg, agonist) for the cell surface receptor.

本発明のスクリーニング方法で用いられる細胞は、当該細胞における細胞表面レセプター含有ＭＣの形成のモニターを可能とするため、検出可能であるように標識された、細胞表面レセプター含有ＭＣの構成分子が導入されたものであり得る。従って、本発明のスクリーニング方法でＴ細胞が用いられる場合、Ｔ細胞は、ＴＣＲ、ＣＤ３、上記キナーゼ分子（例、ＺＡＰ−７０）および上記アダプター分子（例、ＳＬＰ−７６）から選ばれる少なくとも１つの分子が蛍光標識された融合タンパク質を発現し得る。一方、本発明のスクリーニング方法でＢ細胞が用いられる場合、Ｂ細胞は、ＢＣＲ、Ｉｇａ／Ｉｇｂ、キナーゼ分子（例、Ｓｙｋ）、およびアダプター分子（例、ＢＬＮＫ）から選ばれる少なくとも１つの分子が蛍光標識された融合タンパク質を含み得る。なお、蛍光標識された複数種の分子（例、２または３種の分子）を発現するようにリンパ球を改変することもまた適切であり得る。このようなリンパ球は、例えば、蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現するベクター（後述）を導入することにより作製できる。用いられる蛍光タンパク質としては、例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙが挙げられる。なお、用いられる細胞は、動物細胞、例えばマウス、ラット、サル、ヒト等の哺乳動物細胞由来であり得る。細胞はまた、初代培養細胞および細胞株のいずれでもよい。   The cells used in the screening method of the present invention can be monitored for the formation of cell surface receptor-containing MCs in the cells, so that the constituent molecules of cell surface receptor-containing MCs labeled for detection are introduced. Can be. Therefore, when T cells are used in the screening method of the present invention, the T cells are at least one selected from TCR, CD3, the kinase molecule (eg, ZAP-70) and the adapter molecule (eg, SLP-76). The molecule can express a fluorescently labeled fusion protein. On the other hand, when B cells are used in the screening method of the present invention, B cells are fluorescent with at least one molecule selected from BCR, Iga / Igb, kinase molecules (eg, Syk), and adapter molecules (eg, BLNK). It may contain a labeled fusion protein. It may also be appropriate to modify lymphocytes to express multiple types of fluorescently labeled molecules (eg, 2 or 3 types of molecules). Such lymphocytes can be prepared, for example, by introducing a vector (described later) that expresses a fusion protein with a fluorescent protein. Examples of the fluorescent protein used include GFP, EGFP, YFP, CFP, mRFP, mCherry, Kusabila Orange, and mStrawberry. The cells used can be derived from animal cells, for example, mammalian cells such as mice, rats, monkeys, and humans. The cells can also be either primary culture cells or cell lines.

Ｔ細胞活性化抗原等の抗原は、Ｔ細胞等の細胞に対する抗原として機能し得る限り特に限定されない。このような抗原としては、例えば、チトクロームｃ、卵白アルブミン等のタンパク質、ペプチドが挙げられるが、リンパ球活性化の強さおよび合成・精製のし易さ、ならびに脂質二重層への結合性の観点より、アミノ酸１０個程度の抗原ペプチドが好ましい。   The antigen such as T cell activation antigen is not particularly limited as long as it can function as an antigen for cells such as T cells. Examples of such antigens include proteins and peptides such as cytochrome c and ovalbumin. From the viewpoint of the strength of lymphocyte activation, ease of synthesis and purification, and binding properties to lipid bilayers. More preferred is an antigenic peptide having about 10 amino acids.

脂質二重層含有媒体は、上記Ｔ細胞活性化抗原による抗原刺激をＴ細胞に導入できるものである限り特に限定されず、例えば、人工的に作製した平面二重層、抗原提示細胞（例、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞）が挙げられる。   The lipid bilayer-containing medium is not particularly limited as long as antigen stimulation by the above T cell activation antigen can be introduced into T cells. For example, artificially produced planar bilayers, antigen presenting cells (eg, B cells) , Dendritic cells, macrophages, Langerhans cells).

本発明において使用され得る平面二重層は、抗原提示に必要な分子を脂質二重層（例、リポソーム）に組み込むことにより作製できる。抗原提示に必要な分子としては、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＩＣＡＭ−１が挙げられる。抗原提示に必要な分子は、アンカー（例、ＧＰＩ）を有し得る。抗原提示能を有する平面二重層は、自体公知の方法により作製できる（例、Dustin et al., Science 283, 649-50 (1999) 参照）。   A planar bilayer that can be used in the present invention can be made by incorporating molecules necessary for antigen presentation into a lipid bilayer (eg, liposomes). Examples of molecules necessary for antigen presentation include MHC class II molecules and ICAM-1. Molecules required for antigen presentation can have anchors (eg, GPI). A planar bilayer having an antigen-presenting ability can be prepared by a method known per se (see, eg, Dustin et al., Science 283, 649-50 (1999)).

抗原提示細胞は、動物細胞、例えばマウス、ラット、サル、ヒト等の哺乳動物細胞由来であり得る。抗原提示細胞はまた、初代培養細胞および細胞株のいずれでもよい。脂質二重層含有媒体として抗原提示細胞が使用される場合、Ｔ細胞と同種動物由来の細胞を用いることが好ましい。   Antigen presenting cells can be derived from animal cells, eg, mammalian cells such as mice, rats, monkeys, humans and the like. Antigen-presenting cells may be either primary cultured cells or cell lines. When antigen-presenting cells are used as the lipid bilayer-containing medium, it is preferable to use cells derived from the same species as T cells.

脂質二重層含有媒体としては、上記のいずれも用いることができるが、ＴＣＲ含有ＭＣの形成を精密にモニターし得るという観点より、平面二重層が好ましく用いられる。   Any of the above can be used as the lipid bilayer-containing medium, but a planar bilayer is preferably used from the viewpoint that the formation of the TCR-containing MC can be accurately monitored.

上記工程（ｂ１）では、先ず、被験物質の存在下において、抗原をロードした二重層含有媒体を接触させたＴ細胞（または抗原を接触させたＢ細胞）におけるＴＣＲ（またはＢＣＲ）含有ＭＣの形成能が測定される。ＴＣＲ含有ＭＣの形成能の測定は、自体公知の方法により行われ得る。例えば、ＴＣＲ含有ＭＣに見出される、標識された構成分子をモニターすることにより行われ得る。上記工程（ｂ２）では、細胞表面レセプター含有ＭＣの形成能の測定および以下の比較は、工程（ｂ１）と同様の方法により行われ得る。   In the step (b1), first, formation of TCR (or BCR) -containing MC in T cells (or B cells contacted with an antigen) contacted with a bilayer-containing medium loaded with an antigen in the presence of a test substance. Performance is measured. The ability to form TCR-containing MC can be measured by a method known per se. For example, it can be done by monitoring the labeled constituent molecules found in TCR-containing MCs. In the above step (b2), the measurement of the ability to form cell surface receptor-containing MC and the following comparison can be performed by the same method as in step (b1).

次いで、被験物質の存在下において、抗原をロードした二重層含有媒体を接触させたＴ細胞におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成能が、被験物質の不在下における、二重層含有媒体を接触させたＴ細胞におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成能と比較される。形成能の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質の不在下における形成能は、被験物質の存在下における形成能の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものであることが好ましい。   Then, in the presence of the test substance, the ability of the TCR-containing MC to form in the T cell contacted with the antigen-loaded bilayer-containing medium is determined in the T cell contacted with the bilayer-containing medium in the absence of the test substance. Compared to the ability to form TCR-containing MC. The comparison of forming ability is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference. The ability to form in the absence of the test substance may be measured in advance or at the same time as the measurement of the ability to form in the presence of the test substance. From the viewpoint of the above, it is preferable that they are measured simultaneously.

上記方法の工程（ｃ１）では、二重層含有媒体を接触させたＴ細胞（または抗原を接触させたＢ細胞）におけるＴＣＲ（またはＢＣＲ）含有ＭＣの形成を調節する被験物質が選択される。例えば、該形成を促進する被験物質は、Ｔ細胞活性化が所望される疾患の予防・治療などのために使用され得る。Ｔ細胞活性化が所望される疾患としては、例えば、免疫不全症、感染症（例、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＨＣＶ）、癌が挙げられる。一方、該形成を抑制する被験物質は、Ｔ細胞活性化の阻害が所望される疾患の予防・治療などのために使用され得る。Ｔ細胞活性化の阻害が所望される疾患としては、例えば、自己免疫疾患（例、全身性エリトマトーデス、強皮症、シェーグレン症）、関節リウマチ、I型糖尿病、アレルギー（例、気管支喘息、花粉症、アトピー）が挙げられる。上記工程（ｃ２）は、工程（ｃ１）と同様の方法により行われ得る。なお、例えば、細胞としてＢ細胞を用いた場合には、Ｂ細胞活性化が所望される疾患、およびＢ細胞活性化の阻害が所望される疾患の予防・治療などに有用な物質を得ることができる。Ｂ細胞活性化が所望される疾患としては、例えば、免疫不全症（先天性免疫不全症を含む）、ＡＩＤＳ、感染症、慢性腎炎症候群が挙げられる。Ｂ細胞活性化の阻害が所望される疾患としては、例えば、自己免疫疾患（例、全身性エリトマトーデス、リウマチ）、溶血性貧血、重症筋無力症が挙げられる。   In step (c1) of the above-described method, a test substance that modulates the formation of TCR (or BCR) -containing MC in T cells (or B cells contacted with an antigen) contacted with a bilayer-containing medium is selected. For example, the test substance that promotes the formation can be used for prevention / treatment of a disease in which T cell activation is desired. Examples of the disease for which T cell activation is desired include immunodeficiency, infection (eg, HIV, EBV, HCV), and cancer. On the other hand, the test substance that suppresses the formation can be used for prevention / treatment of a disease in which inhibition of T cell activation is desired. Diseases for which inhibition of T cell activation is desired include, for example, autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus, scleroderma, Sjogren's disease), rheumatoid arthritis, type I diabetes, allergies (eg, bronchial asthma, pollinosis) , Atopy). The step (c2) can be performed by the same method as the step (c1). For example, when B cells are used as cells, it is possible to obtain a substance useful for prevention / treatment of diseases for which B cell activation is desired and diseases for which inhibition of B cell activation is desired. it can. Examples of the disease for which B cell activation is desired include immunodeficiency (including congenital immunodeficiency), AIDS, infection, and chronic nephritis syndrome. Examples of diseases for which inhibition of B cell activation is desired include autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus, rheumatism), hemolytic anemia, and myasthenia gravis.

なお、本発明のスクリーニング方法においては、初期活性化シグナルに重要な役割を果たし得るＴＣＲ含有ＭＣ、ならびに持続活性化シグナルに重要な役割を果たし得るＴＣＲ含有ＭＣのいずれか一方および／または双方の形成を、被験物質が調節し得るか否かを評価することもできる。なお、初期活性化シグナルを調節し得る被験物質のスクリーニングは、被験物質がＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節するか否かを可視的に評価することに加え、ＣＤ３、Ｌｃｋ、ＺＡＰ−７０、ＬＡＴ、ＳＬＰ−７６のリン酸化、細胞内カルシウム動員、イノシトールリン脂質の代謝、細胞骨格の形成等の他の指標と組合せて行うことができる。持続活性化シグナルを調節し得る被験物質のスクリーニングは、ＭＡＰＫ（例、Ｅｒｋ）の持続的リン酸化、ＮＦ−kＢの活性化、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋの持続的活性化と細胞膜への局在、サイトカイン産生、細胞増殖、細胞骨格の形成等の他の指標と組合せて行うことができる。持続活性化シグナルは、漸増効果および機能的エフェクターＴ細胞分化に必要とされることが示されている（例、Huppa et al., Nat Immunol 4, 749-55 (2003); Dustin et al., Immunity 21, 305-14 (2004); Stoll et al., Science 296, 1873-6 (2002); Miller et al., Science 296, 1869-73 (2002); Maldonado et al., Nature 431, 527-32 (2004)参照）。従って、本発明のスクリーニング方法においては、特に、持続活性化シグナルの発生に重要な役割を担い得る、ＩＳの辺縁部におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成を評価することもまた好ましい。   In the screening method of the present invention, formation of one and / or both of a TCR-containing MC that can play an important role in the initial activation signal and a TCR-containing MC that can play an important role in the sustained activation signal. It is also possible to evaluate whether the test substance can be adjusted. It should be noted that screening for test substances that can modulate the initial activation signal includes CD3, Lck, ZAP-70, LAT, in addition to visually evaluating whether the test substance regulates the formation of TCR-containing MC. It can be performed in combination with other indicators such as phosphorylation of SLP-76, intracellular calcium mobilization, inositol phospholipid metabolism, cytoskeleton formation. Screening for test substances that can modulate the sustained activation signal includes continuous phosphorylation of MAPK (eg, Erk), activation of NF-kB, sustained activation of Akt and PI3K and localization to the cell membrane, cytokine production , Cell proliferation, cytoskeleton formation and other indicators. Sustained activation signals have been shown to be required for increasing effects and functional effector T cell differentiation (eg, Huppa et al., Nat Immunol 4, 749-55 (2003); Dustin et al., Immunity 21, 305-14 (2004); Stoll et al., Science 296, 1873-6 (2002); Miller et al., Science 296, 1869-73 (2002); Maldonado et al., Nature 431, 527- 32 (2004)). Therefore, in the screening method of the present invention, it is also preferable to evaluate the formation of TCR-containing MCs at the edge of IS, which can play an important role in the generation of sustained activation signals.

本発明はまた、上記スクリーニング方法を簡便に実施することを可能とするスクリーニング用キットを提供する。   The present invention also provides a screening kit that allows the above screening method to be easily carried out.

本発明のキットは、上述のように、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの構成分子（この構成分子は検出可能に標識されている）の発現ベクターまたは該発現ベクターが導入されたＴ細胞等の細胞を含み得る。本発明のキットはさらに、抗原および／または脂質二重層含有媒体を含んでいてもよい。   In the kit of the present invention, as described above, an expression vector of a component molecule of MC containing a cell surface receptor capable of forming a cluster (this component molecule is detectably labeled) or the expression vector is introduced. Cells such as T cells can be included. The kit of the present invention may further contain an antigen and / or lipid bilayer-containing medium.

発現ベクターで使用されるプロモーターは、導入対象であるＴ細胞で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、ならびにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。また、使用されるプロモーターとしては、Ｔ細胞に特異的なプロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターは、Ｔ細胞に特異的に発現している任意の遺伝子のプロモーターであり得るが、例えば、ＣＤ２プロモーター、ＣＤ４プロモーター、Ｌｃｋプロモーターを使用できる。   The promoter used in the expression vector is not particularly limited as long as it can function in the T cell to be introduced. For example, SV40-derived early promoter, cytomegalovirus LTR, Rous sarcoma virus LTR, MoMuLV-derived LTR, adeno Examples include viral promoters such as virus-derived early promoters, and mammalian constituent protein gene promoters such as β-actin gene promoter, PGK gene promoter, transferrin gene promoter, and the like. Moreover, as a promoter to be used, a promoter specific for T cells may be used. Such a promoter can be a promoter of any gene that is specifically expressed in T cells. For example, a CD2 promoter, a CD4 promoter, and an Lck promoter can be used.

発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。好適なウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスなどのウイルス由来のベクターが挙げられる。   The basic backbone vector used as the expression vector can be a plasmid or a viral vector. Suitable viral vectors include, for example, vectors derived from viruses such as retroviruses, lentiviruses, adenoviruses.

本発明はさらに、クラスターを形成し得る細胞表面レセプター（例、ＴＣＲ）を含有するＭＣの形成を調節し得る物質を含む、細胞（例、Ｔ細胞）活性化制御剤を提供する。   The present invention further provides a cell (eg, T cell) activation regulator comprising a substance capable of regulating the formation of MC containing a cell surface receptor (eg, TCR) capable of forming a cluster.

クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節し得る物質としては特に限定されるものではなく、例えば、該ＭＣの構成分子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、抗体、ドミナントネガティブ変異体の他、有機低分子化合物が挙げられる。好ましくは、このような物質としては、ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質が挙げられる。   The substance capable of regulating the formation of MC containing a cell surface receptor capable of forming a cluster is not particularly limited. For example, antisense nucleic acids, ribozymes, siRNA, antibodies, dominant negative mutations to the constituent molecules of the MC In addition to the body, organic low molecular weight compounds can be mentioned. Preferably, such substances include substances that can modulate the formation of TCR-containing MC.

ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質としては、例えば、ＴＣＲ含有ＭＣへのキナーゼ分子および／またはアダプター分子のリクルートを調節し得る物質、細胞骨格の形成を調節し得る物質が挙げられる。より詳細には、ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質としては、ＴＣＲ含有ＭＣの形成を抑制し得る物質を用いることができる。ＴＣＲ含有ＭＣの形成を抑制し得る物質としては、例えば、Ｓｒｃファミリーキナーゼインヒビター（例、ＰＰ２）、アクチン重合インヒビター（例、サイトカラシンＢ、ラトランキュリンＡ）、脂質ラフト阻害剤（例、メチルβサイクロデキストリン）、マイクロチューブル阻害剤（例、タキソール）が挙げられる。   Examples of substances that can regulate the formation of TCR-containing MC include substances that can regulate the recruitment of kinase molecules and / or adapter molecules to TCR-containing MC, and substances that can regulate the formation of cytoskeleton. More specifically, as a substance that can regulate the formation of TCR-containing MC, a substance that can suppress the formation of TCR-containing MC can be used. Examples of substances that can suppress the formation of TCR-containing MC include, for example, Src family kinase inhibitors (eg, PP2), actin polymerization inhibitors (eg, cytochalasin B, latrunculin A), lipid raft inhibitors (eg, methyl β cyclodextrin) ), Microtubule inhibitors (eg, taxol).

本発明の剤は、ＭＣの形成を調節し得る物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。   The agent of the present invention can contain any carrier, for example, a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to the substance capable of regulating the formation of MC. Examples of pharmaceutically acceptable carriers include sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate, and other excipients, cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, polypropylpyrrolidone. , Gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch and other binders, starch, carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, sodium-glycol starch, sodium bicarbonate, calcium phosphate, calcium citrate and other disintegrants, magnesium stearate , Aerosil, Talc, Sodium lauryl sulfate lubricant, Citric acid, Menthol, Glycyllysine / Ammonium salt, Glycine, Orange powder, Fragrance, Sodium benzoate Preservatives such as lithium, sodium hydrogen sulfite, methyl paraben, propyl paraben, stabilizers such as citric acid, sodium citrate, acetic acid, suspensions such as methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, aluminum stearate, dispersants such as surfactants, Examples include, but are not limited to, water, physiological saline, diluents such as orange juice, base waxes such as cacao butter, polyethylene glycol, and white kerosene.

経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。   Preparations suitable for oral administration include solutions in which an effective amount of a substance is dissolved in a diluent such as water or physiological saline, capsules, sachets or tablets containing an effective amount of the substance as a solid or granule. A suspension in which an effective amount of a substance is suspended in a suitable dispersion medium, an emulsion in which a solution in which an effective amount of a substance is dissolved is dispersed in an appropriate dispersion medium and emulsified, or a powder, a granule or the like.

非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。   Formulations suitable for parenteral administration (eg, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, local infusion, etc.) include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions, which include antioxidants Further, a buffer solution, an antibacterial agent, an isotonic agent and the like may be contained. Aqueous and non-aqueous sterile suspensions are also included, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like. The preparation can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses like ampoules and vials. In addition, the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.

本発明の剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１ｍｇ〜約２．０ｇである。   The dosage of the agent of the present invention includes the activity and type of the active ingredient, the mode of administration (eg, oral and parenteral), the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration target, body weight, age Usually, it is about 0.001 mg to about 2.0 g as an active ingredient amount per day for an adult, although it cannot be generally stated.

本発明の剤は、例えば、医薬または試薬として有用である。本発明の剤が医薬または試薬として使用される場合、Ｔ細胞等の細胞の活性化またはその阻害のために、あるいは上述したようなＴ細胞等の細胞の活性化が所望される疾患またはＴ細胞等の細胞の活性化の阻害が所望される疾患の予防・治療のために用いることができる。   The agent of the present invention is useful, for example, as a medicine or a reagent. When the agent of the present invention is used as a medicine or reagent, a disease or T cell for which activation of a cell such as T cell or inhibition thereof, or activation of a cell such as T cell as described above is desired It can be used for the prevention and treatment of diseases where inhibition of cell activation is desired.

本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。   The contents of all publications, including patents and patent application specifications cited in this specification, are hereby incorporated by reference herein to the same extent as if all were explicitly stated. Is.

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。   The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.

材料及び方法
試薬
染色抗体および試薬は、以下の販売元から購入した：ビオチン化抗CD3ε (2C11)，eBioscienceから; 抗リン酸化ZAP-70, Cell Signalingから; 抗リン酸化チロシン, Upstateから； ストレプトアビジンAlexa Fluor 633および抗ウサギIgG Alexa Fluor 647, Molecular Probesから; 抗マウスIgG Cy3, Amercham Biosciencesから。Indo-1 AMは、Molecular Probesから購入した。PP2-Srcキナーゼインヒビターは、Calbiochemから購入した。 Materials and Methods Reagents Stained antibodies and reagents were purchased from the following vendors: biotinylated anti-CD3ε (2C11) from eBioscience; anti-phosphorylated ZAP-70, from Cell Signaling; anti-phosphotyrosine, from Upstate; streptavidin Alexa Fluor 633 and anti-rabbit IgG from Alexa Fluor 647, Molecular Probes; anti-mouse IgG Cy3, from Amercham Biosciences. Indo-1 AM was purchased from Molecular Probes. PP2-Src kinase inhibitor was purchased from Calbiochem.

プラスミド構築
マウスCD3ζ-EGFP、ZAP-70-EGFP、SLP-76-EGFPおよびZAP-70-mRFP融合タンパク質は、マウスcDNAおよびpEGFP-N1 (BD Clontech, NJ, USA) またはpRSETB-mRFP1 (Campbell et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 7877-82 (2002)) (Dr.Roger Y. Tisien, UCSDより供与) を用いて組換えPCRにより作製し、レトロウイルスベクターpMX (T. Kitamura, Tokyo Universityより供与) にサブクローニングした。全ての融合タンパク質はリンカー配列を含まない。 Plasmid Construction Mouse CD3ζ-EGFP, ZAP-70-EGFP, SLP-76-EGFP and ZAP-70-mRFP fusion proteins are mouse cDNA and pEGFP-N1 (BD Clontech, NJ, USA) or pRSETB-mRFP1 (Campbell et al , Proc Natl Acad Sci USA 99, 7877-82 (2002)) (provided by Dr. Roger Y. Tisien, UCSD) and prepared by recombinant PCR and retroviral vector pMX (from T. Kitamura, Tokyo University) Subcloned in the donor). All fusion proteins do not contain a linker sequence.

初代培養細胞および導入
構築物は、リポフェクタミン (Invitrogen, CA, USA) を用いて、パッケージング細胞Phoenix (Dr. G. Norlan, Stanford Universityより供与) に一過性に導入した。レトロウイルス上清を、8000gで12時間遠心分離し、10倍に濃縮した。CD4+ T細胞をRag2-/-バックグラウンドAND-Tgマウスから精製し、3μm PCC88-104 (KAERADLIAYLKQATAK：配列番号１) と放射線処理したC3H/HeNマウス由来の全脾細胞とで刺激した。刺激の1日および2日後、細胞をレトロウイルス上清中に懸濁し、8μg/mlポリブレン (Sigma, MO, USA) および200 U/mlヒト組換えIL-2 (Ajinomonoto, Japan) の存在下で、1000gで90分間遠心分離した。4日目に、EGFPを発現している60-80%のT細胞を、FACSAria (BD, NJ, USA) により選別し、蛍光強度の点で均質な集団を得た。細胞を、組換えIL-2とRPMI培地＋10% FCSで5-14日間維持した。Srcキナーゼブロッキングアッセイでは、CD3ζ-EGFPまたはZAP-70-EGFP発現AND-Tg細胞を、培養培地においてSrcキナーゼブロッカーPP2 (10μM) とともに37℃で20分間予めインキュベートした。この薬物を、実験を通じてアッセイ培地中に含ませた。 Primary culture cells and transfer constructs were transiently introduced into packaging cells Phoenix (provided by Dr. G. Norlan, Stanford University) using Lipofectamine (Invitrogen, CA, USA). The retroviral supernatant was centrifuged at 8000 g for 12 hours and concentrated 10 times. CD4 + T cells were purified from Rag2 − / − background AND-Tg mice and stimulated with 3 μm PCC 88-104 (KAERADLIAYLKQATAK: SEQ ID NO: 1) and whole splenocytes from radiation treated C3H / HeN mice. One and two days after stimulation, cells were suspended in retroviral supernatant and in the presence of 8 μg / ml polybrene (Sigma, MO, USA) and 200 U / ml human recombinant IL-2 (Ajinomonoto, Japan). And centrifuged at 1000 g for 90 minutes. On day 4, 60-80% T cells expressing EGFP were sorted by FACSAria (BD, NJ, USA) to obtain a population that was homogeneous in terms of fluorescence intensity. Cells were maintained for 5-14 days in recombinant IL-2 and RPMI medium + 10% FCS. For the Src kinase blocking assay, CD3ζ-EGFP or ZAP-70-EGFP expressing AND-Tg cells were preincubated with Src kinase blocker PP2 (10 μM) for 20 minutes at 37 ° C. in culture medium. This drug was included in the assay medium throughout the experiment.

平面二重層
グリコホスファチジルイノシトール (GPI) アンカーを有するマウスクラスII分子I-Ek (Ek-GPI) およびGPIアンカーを有するマウスICAM-1 (ICAM-1-GPI) を、トランスフェクトしたCHOおよびBHK細胞からそれぞれ精製し、DOPCリポソーム (Avanti Polar Lipid, AL. USA) に組み込んだ。Ek-GPIおよびICAM-1-GPIを含む平面二重層を、フローセルチャンバーシステム (Bioptechs, PA, USA) で形成させた。I-Ekの定量のため、C3Hマウス由来の活性化B細胞およびEk-GPI含有DOPCリポソームをロードしたシリカビーズ (Bangs Laboratories, USA) を、FITC標識抗I-Ek mAbs (14-4-4) で染色し、FACSにより解析した。二重層のI-Ekの密度は、活性化B細胞上での密度よりも2.3倍高かった。pH4.5クエン酸緩衝液中において、平面二重層に100μM PCC88-104を37℃で一晩ロードし、5%脱脂粉乳PBS中にて37℃で1時間ブロッキングし、その上にＴ細胞をのせた。各GPIアンカータンパク質の移動度を、実験前に蛍光標識した同じGPIアンカータンパク質を用いた解析において調べた。平面二重層の全ての実験を、1%ヒト血清アルブミン、2 mM MgCl2、および1 mM CaCl2を含むHBS培地を用いて行った。 Planar bilayer Glycophosphatidylinositol (GPI) anchored mouse class II molecule IE k (E k -GPI) and GPI anchored mouse ICAM-1 (ICAM-1-GPI) were transfected from transfected CHO and BHK cells. Each was purified and incorporated into DOPC liposomes (Avanti Polar Lipid, AL. USA). A planar bilayer containing E k -GPI and ICAM-1-GPI was formed with a flow cell chamber system (Bioptechs, PA, USA). For quantification of IE k , activated B cells from C3H mice and silica beads loaded with E k -GPI-containing DOPC liposomes (Bangs Laboratories, USA) were treated with FITC-labeled anti-IE k mAbs (14-4-4). Stained and analyzed by FACS. The density of IE k in the bilayer was 2.3 times higher than that on activated B cells. In a pH 4.5 citrate buffer, 100 μM PCC 88-104 was loaded onto a flat bilayer overnight at 37 ° C., blocked in 5% nonfat dry milk PBS at 37 ° C. for 1 hour, and T cells were placed on it. I put it. The mobility of each GPI anchor protein was examined in an analysis using the same GPI anchor protein fluorescently labeled before the experiment. All experiments with planar bilayers were performed using HBS medium containing 1% human serum albumin, 2 mM MgCl 2 , and 1 mM CaCl 2 .

TIRF画像化
細胞を、既報（Axelrod, D. J Cell Biol 89, 141-5 (1981); Tokunaga et al., Biochem Biophys Res Commun 235, 47-53 (1997)）のTIRFMasを用いて画像化した。固相状態レーザーからのビーム (488nm, 20mW, SAPPHIRE 488-20-OPS, COHERENT, CA) を、照射のために倒立顕微鏡 (IX-81, Olympus, Japan) に導入した。画像を、EB-CCDカメラ (C-7190-23, Hamamatsu Photonics, Japan) で捕捉した。画像記録および解析は、AquaCosmos Software (Hamamatsu Photonics, Japan) を用いて行った。本発明者らのTIRF顕微鏡システムの高い感度および解像度は、Photo bleachingに起因する最小の蛍光減衰により、蛍光MCの形成およびシグナル伝達プロセスの観察を可能とする。 TIRF imaging Cells were imaged using TIRFMas (Axelrod, D. J Cell Biol 89, 141-5 (1981); Tokunaga et al., Biochem Biophys Res Commun 235, 47-53 (1997)). . A beam from a solid state laser (488 nm, 20 mW, SAPPHIRE 488-20-OPS, COHERENT, CA) was introduced into an inverted microscope (IX-81, Olympus, Japan) for irradiation. Images were captured with an EB-CCD camera (C-7190-23, Hamamatsu Photonics, Japan). Image recording and analysis were performed using AquaCosmos Software (Hamamatsu Photonics, Japan). The high sensitivity and resolution of our TIRF microscope system allows the formation of fluorescent MC and the observation of signal transduction processes with minimal fluorescence decay due to photo bleaching.

脂質二重層を用いた蛍光画像化
平面二重層上の細胞を、示された時点で固定し、4%パラホルムアルデヒドで一晩固定した。次いで、細胞を一次および二次抗体で室温にて30分間染色した。細胞内分子の染色前に、細胞を、0.05% Triton X-100 PBS中にて室温にて1時間、3% BSA PBS中にて室温にて30分間、それぞれ、透過処理 (permeabilization) およびブロッキング処理した。各抗体を以下の濃度で用いた: 抗CD3ε, 5μg/ml; 抗pZAP-70, 1μg/ml; 抗リン酸化チロシン, 2μg/ml; 抗マウスIgG, 10μg/ml; 抗ウサギIgG, 10μg/ml。全ての画像を、Leica DMIRES2システムで収集し、データをLeica confocal softwareを用いて解析および表した。 Fluorescence imaging with lipid bilayers Cells on planar bilayers were fixed at the indicated time points and fixed overnight with 4% paraformaldehyde. Cells were then stained with primary and secondary antibodies for 30 minutes at room temperature. Prior to staining for intracellular molecules, cells were permeabilized and blocked in 0.05% Triton X-100 PBS for 1 hour at room temperature and in 3% BSA PBS for 30 minutes at room temperature, respectively. did. Each antibody was used at the following concentrations: anti-CD3ε, 5 μg / ml; anti-pZAP-70, 1 μg / ml; anti-phosphotyrosine, 2 μg / ml; anti-mouse IgG, 10 μg / ml; anti-rabbit IgG, 10 μg / ml . All images were collected with a Leica DMIRES2 system and data were analyzed and represented using Leica confocal software.

カルシウム誘導アッセイ
CD3ζ-EGFP発現AND-Tg CD4+ T細胞を、1%ウシ血清アルブミンを含む20μM Indo-1 HBSS緩衝液中で37℃で20分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、アッセイ培地に再懸濁し、平面二重層上にロードした。15秒毎にCD3ε-EGFPとIndo-1の405nm/495nm波長強度を測定し、MC形成と細胞内カルシウム濃度を同時に観察した。Olympus IX81蛍光顕微鏡により全ての画像を収集し、蛍光強度の測定および算出は、MetaMorph (Universal Imaging Corporation, PA, USA) により行った。 Calcium induction assay
CD3ζ-EGFP expressing AND-Tg CD4 + T cells were incubated for 20 minutes at 37 ° C. in 20 μM Indo-1 HBSS buffer containing 1% bovine serum albumin. Cells were washed twice, resuspended in assay medium and loaded onto a flat bilayer. Every 15 seconds, the 405 nm / 495 nm wavelength intensities of CD3ε-EGFP and Indo-1 were measured, and MC formation and intracellular calcium concentration were observed simultaneously. All images were collected with an Olympus IX81 fluorescence microscope, and fluorescence intensity was measured and calculated by MetaMorph (Universal Imaging Corporation, PA, USA).

T-B細胞相互作用アッセイ
B細胞をC3H/HeN脾細胞から精製し、10μg/ml LPSおよび3μM PCCを含む培養培地中でインキュベートした。24-36時間後、死細胞を、Lympholyte-M（Cedarlane,Canada）によりLPS刺激B細胞から除き、AND-Tg CD4+ T細胞のためのAPCとして用いた。ポリ-Lリジンでコーティングしたカバースリップ上にB細胞をアプライし、その後、T細胞をロードした。結合後、細胞を4%パラホルムアルデヒトで示された時間固定し、ビオチン化抗CD3ε抗体およびAlexa Fluor標識ストレプトアビジンで染色した。全ての画像を、Leica DMIRES2顕微鏡により収集した。CD3ζ-EGFP、ZAP-70-EGFPおよびSLP-76-EGFPをそれぞれ、野生型、ZAP-70-欠損 (p116) およびSLP-76欠損Jurkat T細胞 (J14) に導入した。Jurkat T細胞を、記載されるようにSEEで予めパルスしたRaji細胞に結合させた。 TB cell interaction assay
B cells were purified from C3H / HeN splenocytes and incubated in culture medium containing 10 μg / ml LPS and 3 μM PCC. 24-36 hours later, dead cells were removed from LPS-stimulated B cells with Lympholyte-M (Cedarlane, Canada) and used as APC for AND-Tg CD4 + T cells. B cells were applied onto poly-L lysine-coated coverslips and then T cells were loaded. After binding, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for the time indicated and stained with biotinylated anti-CD3ε antibody and Alexa Fluor labeled streptavidin. All images were collected with a Leica DMIRES2 microscope. CD3ζ-EGFP, ZAP-70-EGFP and SLP-76-EGFP were introduced into wild type, ZAP-70-deficient (p116) and SLP-76-deficient Jurkat T cells (J14), respectively. Jurkat T cells were bound to Raji cells pre-pulsed with SEE as described.

画像処理およびデータ解析
MC中の分子数を、単一EGFP分子の平均蛍光強度で除算した単一MCの蛍光強度として算出した。キモグラフおよび表面プロットをそれぞれ、「Montage」および「Surface plot」により表した。個々のMCを、「Manual tracking」により追跡し、各MCの面積および強度をImageJ (NIH, MD, USA) における「Analyze particles」により算出した。 Image processing and data analysis
The number of molecules in the MC was calculated as the fluorescence intensity of a single MC divided by the average fluorescence intensity of a single EGFP molecule. Chymographs and surface plots were represented by “Montage” and “Surface plot”, respectively. Each MC was tracked by “Manual tracking”, and the area and intensity of each MC were calculated by “Analyze particles” in ImageJ (NIH, MD, USA).

実施例１：pMHCとの初期接触部位でのTCRマイクロクラスター
本発明者らは、IS形成のマクロ構造の基礎を解析することを意図したため、GPIアンカー型ICAM-1およびハトチトクロームcペプチド88-104 (PCC88-104) をロードしたMHCクラスII (I-Ek) を取り込んだ平面二重層（Dustin et al., Science 283, 649-50 (1999)）と、T細胞のAg刺激の際にクラスター化分子の動的なリクルートを検出するための指向型TIRFMとの組合せシステムを利用した。インビトロで活性化され、レトロウイルス媒介遺伝子移入によりEGFPタグ化CD3ζ、ZAP-70およびSLP-76に感染したAND TCRトランスジェニック (AND-Tg) マウス由来のPCC88-104特異的T細胞を平面二重層上にアプライした。既報（Monks et al., Nature 395, 82-6 (1998); Grakoui et al., Science 285, 221-7 (1999)）の通り、細胞-二重層の接触後5-10分で、TCRから構成されるc-SMACとLFA-1から構成されるp-SMACが観察され、ISが形成された。
CD3ζ-EGFP発現T細胞におけるc-SMACをこのシステムで解析したとき、本発明者らは、既報（Freiberg et al., Nat Immunol 3, 911-7 (2002); Bunnell et al., J Cell Biol 158, 1263-75 (2002); Barda-Saad et al, Nat Immunol 6, 80-9 (2004)）により示唆されるように、c-SMACが単に蓄積したCD3ζからではなく多量のCD3ζ-MCから構成されることを見出した。次いで、本発明者らは、これらのMCの起源に疑問をもち、初期細胞−二重層接触を再度追跡した（タイム０）。CD3ζ-MCは、平面二重層との細胞接触後5秒で生じた（図１Ａａ）。最初の1-2分間、T細胞は接触領域上で増殖し、多数のMCがexpansion phase全体にわたって生じた。MC形成が、pMHCとの相互作用により誘導された。なぜなら、MCは、Agの非存在下では平面二重層で生じず、また、細胞内にも観察されなかったためである。このことは、MCが予め形成されなかったことを示す。expansion phaseの間、各CD3ζ-MCは移動せず、同じ位置に残存した。最大の細胞スプレッディングに到達後、CD3ζ-MCは中心に移動し始め、5分でc-SMACを形成した（contraction phase）（図１Ｂａ、１Ｃａ、ｄ、ｇ）。移動の時間経過をキモグラフに示す（図１Ｂ）。この画像から、CD3ζ-MCのサイズおよび強度が、MCが中心に移動するにつれて増加したことは明らかである。このことは、MCが中心へのそれらの路で融合したことを示唆する。CD3ζを含む個々のMCの移動の軌跡は、殆どのCD3ζタンパク質がc-SMACにトランスロケートしたことを明確に示した（図１Ｃｄ、ｇ）。
このような個々の追跡により、本発明者らは、平均速度および移動距離を定量した。expansion phaseの間、CD3ζ-MCは、最初に中心に、次いで辺縁部に出現し、同じ位置に残存した。平均速度は、中心では6.8±1.9 nm/sであり、辺縁部では19.0±7.9 nm/sであった。contraction phaseの間、より遠位の領域にある辺縁部MCは、中心領域のもの (4.4±1.9 nm/s) よりも、中心に向かってより早く移動した (92.5±31.0 nm/s)。contraction phaseの後、速度は、定常速度 (24.9±12.6 nm/s) に減少した。CD3ζ-MCの大部分が中心に到達し、平均移動距離は、中心MCについては0.84±0.45μm/sであり、辺縁部MCについては3.1±1.2μm/sであった。
単一MC内のCD3ζ-EGFPタンパク質数は、蛍光強度から評価する限り、このシステムではおよそ30-100であった。CD3ζ-EGFPおよび内因性CD3ζの発現レベルは、細胞内染色により比較すると、前者が後者よりも2-3倍高く発現していることが見出された（データ示さず）。従って、本発明者らは、1つのMC内のCD3ζタンパク質数はおよそ40-150であると見積もった。
本発明者らはまた、MC内に蓄積したCD3ζ-EGFPの占有度を知るため、個々のCD3ζ-MCの面積および相対蛍光強度を定量した。MCの面積および相対強度の平均合計は、バックグランドと比較したとき全接触面積のうち9.0±3.0%および32.4±7.5%であった。MCの内側の蛍光強度は、MCの外側のものよりも10.4±4.7倍であった。これらのデータは、検出不能な小さなクラスターの潜在的存在に起因して、MC数および蛍光強度をより少なく見積もっているのかもしれない。 Example 1: TCR microclusters at the initial contact site with pMHC Since we intended to analyze the basis of the macrostructure of IS formation, the GPI-anchored ICAM-1 and the pig cytochrome c peptide 88-104 Planar bilayer (Dustin et al., Science 283, 649-50 (1999)) loaded with MHC class II (IE k ) loaded with (PCC 88-104 ) and clustered upon T cell Ag stimulation A combination system with directed TIRFM was used to detect the dynamic recruitment of molecules. Two-dimensional PCC 88-104 specific T cells from AND TCR transgenic (AND-Tg) mice activated in vitro and infected with EGFP-tagged CD3ζ, ZAP-70 and SLP-76 by retrovirus-mediated gene transfer Applied on the overlay. As previously reported (Monks et al., Nature 395, 82-6 (1998); Grakoui et al., Science 285, 221-7 (1999)), 5-10 minutes after cell-bilayer contact, from TCR A p-SMAC composed of c-SMAC and LFA-1 was observed, and an IS was formed.
When c-SMAC in CD3ζ-EGFP-expressing T cells was analyzed with this system, the present inventors have already reported (Freiberg et al., Nat Immunol 3, 911-7 (2002); Bunnell et al., J Cell Biol 158, 1263-75 (2002); Barda-Saad et al, Nat Immunol 6, 80-9 (2004)), c-SMAC was not just from accumulated CD3ζ, but from large amounts of CD3ζ-MC. I found out that it was composed. The inventors then questioned the origin of these MCs and followed the initial cell-bilayer contact again (time 0). CD3ζ-MC occurred 5 seconds after cell contact with the planar bilayer (FIG. 1Aa). During the first 1-2 minutes, T cells proliferated on the contact area and numerous MCs occurred throughout the expansion phase. MC formation was induced by interaction with pMHC. This is because MC did not occur in the planar bilayer in the absence of Ag and was not observed intracellularly. This indicates that MC was not previously formed. During the expansion phase, each CD3ζ-MC did not move and remained in the same position. After reaching maximum cell spreading, CD3ζ-MC began to move to the center and formed c-SMAC (contraction phase) in 5 minutes (FIG. 1Ba, 1Ca, d, g). The chronograph shows the time course of movement (FIG. 1B). From this image, it is clear that the size and intensity of CD3ζ-MC increased as the MC moved to the center. This suggests that the MCs have fused on their way to the center. The trajectory of movement of individual MCs containing CD3ζ clearly showed that most CD3ζ proteins were translocated to c-SMAC (FIG. 1Cd, g).
With such individual tracking, we quantified the average speed and distance traveled. During the expansion phase, CD3ζ-MC appeared first in the center and then at the edge and remained in the same position. The average speed was 6.8 ± 1.9 nm / s at the center and 19.0 ± 7.9 nm / s at the edge. During the contraction phase, the marginal MC in the more distal region moved faster (92.5 ± 31.0 nm / s) towards the center than in the central region (4.4 ± 1.9 nm / s). After the contraction phase, the velocity decreased to a steady velocity (24.9 ± 12.6 nm / s). Most of the CD3ζ-MC reached the center, and the average moving distance was 0.84 ± 0.45 μm / s for the center MC and 3.1 ± 1.2 μm / s for the edge MC.
The number of CD3ζ-EGFP proteins within a single MC was approximately 30-100 in this system as assessed by fluorescence intensity. The expression levels of CD3ζ-EGFP and endogenous CD3ζ were found to be 2-3 times higher than the latter in the former when compared by intracellular staining (data not shown). Therefore, the inventors estimated that the number of CD3ζ proteins in one MC is approximately 40-150.
We also quantified the area and relative fluorescence intensity of each CD3ζ-MC to know the occupancy of CD3ζ-EGFP accumulated in the MC. The average sum of MC area and relative intensity was 9.0 ± 3.0% and 32.4 ± 7.5% of the total contact area when compared to the background. The fluorescence intensity inside the MC was 10.4 ± 4.7 times higher than that outside the MC. These data may underestimate the MC number and fluorescence intensity due to the potential presence of undetectable small clusters.

実施例２：初期マイクロクラスターは、TCR、キナーゼおよびアダプタータンパク質を含む
MCの生成およびトランスロケーションにおけるTCRシグナル伝達複合体の空間-時間ダイナミズムを理解するため、本発明者らは、CD3に会合する重要なキナーゼとしてZAP-70-EGFPを、活性化シグナルを下流に伝達する重要なアダプター分子としてSLP-76-EGFPをそれぞれ発現するT細胞を解析した。ZAP-70-EGFPおよびSLP-76-EGFPの双方はそれぞれ、ZAP-70欠損およびSLP-76欠損Jurkat細胞におけるIL-2産生のTCRシグナル伝達を回復させ得た（データ示さず）。ZAP-70およびSLP-76は、細胞-二重層の接触後速やかにMCとして出現し、MC数は、CD3ζ-EGFPと同様に、最大細胞スプレッドに到達するまで増加する（図１Ａｂ、ｃ）。これらのMCは、expansion phaseの間移動しなかった（図１Ｂｂ、ｃ、およびＣｂ、ｃ）。しかし、それらの挙動は、contraction phase後のCD3ζのものとは異なっていた。ZAP-70-MCの大部分は中心に到達せず、辺縁部付近に留まり消失した（図１Ａｂ、Ｂｂ）が、幾らかのZAP-70は、c-SMAC付近に蓄積した。これと一致して、ZAP-70-MCの総移動距離は、はるかに短かった（図１Ｃｅ）。対照的に、SLP-76-EGFPを含む初期MCが、expansion phaseにCD3ζおよびZAP-70と同様に形成されたが、幾らかのSLP-76-MCが初期のcontraction phaseに中心に移動し（図１Ｃｃ、ｆ、ｉ）、殆ど全てがcontraction phase後に消失した（図１Ｂｃ）。これらの結果は、ZAP-70およびSLP-76がIS形成に冗長ではない機能を有し得ることを実証する。ZAP-70およびSLP-76を含むMCの消失は、CD3ζとは異なり、ZAP-70-およびSLP-76-MCの大部分がcontraction phase後に辺縁部でのみ生じ、c-SMACにトランスロケートしないことを示唆する。
単一のMCがT細胞活性化に必要とされる全ての分子を含むか否かを試験するため、TCR、ZAP-70およびSLP-76の共局在を解析した。ZAP-70-EGFP（図２Ａ、Ｂ）およびSLP-76-EGFP（図２Ｃ、Ｄ）をトランスフェクトしたAND-Tg T細胞を、細胞-二重層接触後の種々の時点で固定し、次いで抗CD3εAbで染色した。接触開始時およびexpansion phaseの間（1分）、ZAP-70およびCD3ε、SLP76およびCD3εは、同じMCに共局在した（図２Ａａ−ｄ、Ｃａ−ｄ）。ZAP-70およびSLP-76は、CD3εが中心にトランスロケートし始めてから３分で辺縁部に主に存在した（contraction phase、図２Ａｅ−ｈおよびＣｅ−ｈ）。次いで、ZAP-70およびSLP-76の共局在を解析するため、ZAP-70-mRFPおよびSLP-76-EGFP融合タンパク質の構築物をAND-Tg T細胞に共トランスフェクトし、細胞を平面二重層上にのせた。ZAP-70およびSLP-76の共局在は、細胞−二重層接触の初期に認められた（図２Ｅ−Ｆ）。本発明者らはさらに、タンパク質の３つの異なる組合せにおける８つの代表的な細胞における全てのMCを計測することによって、これらの３つの分子の共局在を統計学的に解析し（例、図２Ａａ−ｄ、Ｃａ−ｄおよびＥａ―ｄ）、２つの分子の共局在を試験した。ZAP-70およびCD3ζ、SLP-76およびCD3ζ、ZAP-70およびSLP-76の共局在の百分率はそれぞれ、90.2±7.7%、85.3±6.5%および88.5±7.2%であった。このことは、大部分のMCが共局在を示すことを示唆する。これらの結果は、CD3ζ、ZAP-70およびSLP-76が全ての初期MCにおいて共局在することを示す。
次いで、本発明者らは、これらのMCがより生理学的条件下で生成されるかを試験した。本発明者らは2つの局面（低濃度のアゴニスティックペプチドによる刺激および細胞間接触のMC）を解析した。PCC88-104の濃度をインビトロ刺激の至適下濃度まで希釈した場合、c-SMACのサイズおよび密度の双方が徐々に減少した。しかし、全てのCD3ζ-、ZAP-70-およびSLP-76-MCが、0.8μMの至適下PCC88-104濃度で有意に検出された。これらの特徴は、全ての濃度のPCC88-104でZAP-70-およびSLP-76-MCで同様に観察された。次いで、T細胞-APC相互作用下にあるMC形成を解析するため、本発明者らは、CD3ζ、ZAP-70またはSLP-76を発現するJurkat T細胞株を作製し、これらの細胞を、SEEをロードしたRaji細胞に結合させた。これらの分子のそれぞれのMC形成は、細胞間接触部位で明確に観察された。成熟ISの形成後、CD3ζおよびZAP-70の一部がc-SMACに蓄積され、TCRと共局在した。SLP-76は、サイトゾル中に主に検出され、刺激の非存在下では接触部位に検出されなかった（図４Ｃｄ−ｇ）。これらの結果は、T細胞-二重層相互作用からの本発明らのデータと一致する。さらに、本発明者らはまた、細胞間接触の初期のMC形成を、SLP-76-EGFPを発現するAND-Tg T細胞およびPCC88-104をパルスした活性化B細胞を用いて試験した。実際、MCは、細胞接触の非常に初期に界面上に観察された。成熟ISの形成後、SLP-76はMCに局在しないようであった。小さなMCではなく輝くクラスターのみがこのシステムで検出され得たことは注目すべきである。 Example 2: Early microcluster contains TCR, kinase and adapter protein
To understand the spatio-temporal dynamism of the TCR signaling complex in MC generation and translocation, we transmit ZAP-70-EGFP as an important kinase associated with CD3 and downstream activation signals T cells expressing SLP-76-EGFP as important adapter molecules were analyzed. Both ZAP-70-EGFP and SLP-76-EGFP were able to restore IL-2 production TCR signaling in ZAP-70-deficient and SLP-76-deficient Jurkat cells, respectively (data not shown). ZAP-70 and SLP-76 appear as MC immediately after cell-bilayer contact, and the number of MC increases until reaching the maximum cell spread, similar to CD3ζ-EGFP (FIG. 1Ab, c). These MCs did not move during the expansion phase (FIG. 1Bb, c, and Cb, c). However, their behavior was different from that of CD3ζ after the contraction phase. Most of ZAP-70-MC did not reach the center and remained near the edge and disappeared (FIGS. 1Ab and Bb), but some ZAP-70 accumulated near c-SMAC. Consistent with this, the total travel distance of ZAP-70-MC was much shorter (FIG. 1Ce). In contrast, an initial MC containing SLP-76-EGFP was formed in the expansion phase similar to CD3ζ and ZAP-70, but some SLP-76-MC moved to the initial contraction phase ( 1Cc, f, i), almost all disappeared after the contraction phase (FIG. 1Bc). These results demonstrate that ZAP-70 and SLP-76 can have non-redundant functions for IS formation. Loss of MC containing ZAP-70 and SLP-76, unlike CD3ζ, most of ZAP-70- and SLP-76-MC occur only at the edge after the contraction phase and do not translocate to c-SMAC I suggest that.
To test whether a single MC contains all the molecules required for T cell activation, the colocalization of TCR, ZAP-70 and SLP-76 was analyzed. AND-Tg T cells transfected with ZAP-70-EGFP (FIG. 2A, B) and SLP-76-EGFP (FIG. 2C, D) were fixed at various time points after cell-bilayer contact and then anti-antigen Stained with CD3εAb. At the start of contact and during the expansion phase (1 minute), ZAP-70 and CD3ε, SLP76 and CD3ε co-localized in the same MC (FIGS. 2Aa-d, Ca-d). ZAP-70 and SLP-76 were mainly present at the edge 3 minutes after CD3ε began translocating to the center (contraction phase, FIGS. 2Ae-h and Ce-h). To analyze the co-localization of ZAP-70 and SLP-76, the ZAP-70-mRFP and SLP-76-EGFP fusion protein constructs were then co-transfected into AND-Tg T cells and the cells were planar bilayered. I put it on top. Co-localization of ZAP-70 and SLP-76 was observed early in cell-bilayer contact (FIGS. 2E-F). We further analyzed the co-localization of these three molecules statistically by measuring all MCs in eight representative cells in three different combinations of proteins (eg, figure 2Aa-d, Ca-d and Ea-d) the co-localization of the two molecules was tested. The percentage of co-localization of ZAP-70 and CD3ζ, SLP-76 and CD3ζ, ZAP-70 and SLP-76 were 90.2 ± 7.7%, 85.3 ± 6.5% and 88.5 ± 7.2%, respectively. This suggests that most MCs are colocalized. These results indicate that CD3ζ, ZAP-70 and SLP-76 are colocalized in all initial MCs.
The inventors then tested whether these MCs are produced under more physiological conditions. We analyzed two aspects: stimulation with low concentrations of agonistic peptides and MC of cell-cell contact. When the concentration of PCC 88-104 was diluted to a sub-optimal concentration for in vitro stimulation, both c-SMAC size and density gradually decreased. However, all CD3ζ-, ZAP-70- and SLP-76-MC were significantly detected at an optimal PCC 88-104 concentration of 0.8 μM. These features were similarly observed with ZAP- 70- and SLP-76-MC with all concentrations of PCC 88-104 . To analyze MC formation under T cell-APC interaction, we then generated a Jurkat T cell line expressing CD3ζ, ZAP-70 or SLP-76, and these cells were Were bound to the loaded Raji cells. The MC formation of each of these molecules was clearly observed at the cell-cell contact site. Following the formation of mature IS, CD3ζ and part of ZAP-70 accumulated in c-SMAC and colocalized with TCR. SLP-76 was detected mainly in the cytosol and was not detected at the contact site in the absence of stimulation (FIG. 4Cd-g). These results are consistent with our data from T cell-bilayer interactions. In addition, we also tested the early MC formation of cell-cell contact using AND-Tg T cells expressing SLP-76-EGFP and activated B cells pulsed with PCC 88-104 . In fact, MC was observed on the interface very early in cell contact. After the formation of mature IS, SLP-76 did not appear to localize in MC. It should be noted that only bright clusters, not small MCs, could be detected with this system.

実施例３：T細胞活性化の開始のための部位としてのTCRマイクロクラスター
活性化シグナルを生じる部位を同定するため、本発明者らは、CD3ζ-EGFP発現T細胞におけるチロシンリン酸化状態を、抗リン酸化ZAP-70 (ZAP-70) mAb（図３Ａ、Ｂ）および抗リン酸化チロシン(pY) mAb（図３Ｃ、Ｄ）を用いて試験した。expansion phaseの間、殆どのCD3ζ含有MCは、抗pZAP-70（図３Ａｃ）および抗pYAbs（図３Ｃｃ）で共染色されたが、辺縁部のMCのみが収縮の開始後に染色された（図３Ａｇ、Ｃｇおよび図３Ｅｃ、Ｆｃ）。この共局在は、辺縁部に限定され、細胞の内側には限定されなかった。このことは、ZAP-70および他の分子のリン酸化がexpansion phaseにおいて殆どのMCで誘導され、次いでcontraction phase後においてMCの辺縁部で主に誘導されることを示唆する。T細胞活性化の再設定を示唆するFreibergらの報告によれば、pZAP-70の中心クラスター化が、T細胞-APC接触の3分後ではなく７分後に一過的に示された。従って、本発明者らは、成熟ISの形成を通じてT細胞-二重層接触におけるpZAP-70含有MCのキネティクスを注意深く解析した。しかし、およそ７分でのpZAP-70の蓄積は明らかではなかった。pZAP-70は、１分以内にTCR-MCと共局在した。初期pZAP-70-MCはまもなく消失し、辺縁部pZAP-70-MCのみ残存した。これは、おそらく、ZAP-70-MCが辺縁部で持続的に生じ、pZAP-70-MCがそこで新生されたためである。
TCR、キナーゼおよびアダプター分子を含有するMCが、初期活性化シグナルを生じる部位であるという知見をさらに証明するため、本発明者らは、MC形成のキネティクスおよび細胞内カルシウムレベルを同時にモニターした。CD3ζ-EGFPを発現するAND-Tg T細胞を、Indo-1で標識し、PCC88-104をパルスした平面二重層上にのせた。図４Ａに示されるように、細胞内カルシウムレベルは、細胞-二重層接触の30秒以内に速やかに上昇し、実験期間全体（少なくとも10分）を通じて保持された。これらのカルシウム動員は、expansion phaseにおける幾らかのMCの形成と並行して誘発された。持続的カルシウムレベルは、contraction phaseにおけるc-SMAC形成により変化せず、細胞内カルシウムレベルの振幅は認められなかった。本発明者らがペプチドをパルスすることなく、平面二重層上にIndo-1ロード細胞をのせたとき、細胞は、MC形成も細胞内カルシウム上昇も示さなかった（図４Ｂ）。これらの結果は、MCがリン酸化およびカルシウムフラックスの開始に十分であること、ならびにシグナル伝達分子が刺激後にMCへと速やかにリクルートされることを示唆する。 Example 3: TCR microcluster as a site for initiation of T cell activation To identify the site producing the activation signal, we determined the tyrosine phosphorylation status in CD3ζ-EGFP expressing T cells as anti-tyrosine. Phosphorylated ZAP-70 (ZAP-70) mAb (FIG. 3A, B) and anti-phosphotyrosine (pY) mAb (FIG. 3C, D) were tested. During the expansion phase, most CD3ζ-containing MCs were co-stained with anti-pZAP-70 (Fig. 3Ac) and anti-pYAbs (Fig. 3Cc), but only marginal MCs were stained after the onset of expansion (Fig. 3Ag, Cg and FIG. 3Ec, Fc). This co-localization was limited to the margin and not to the inside of the cell. This suggests that phosphorylation of ZAP-70 and other molecules is induced in most MCs during the expansion phase and then mainly at the MC margin after the contraction phase. According to a report by Freiberg et al. Suggesting re-establishment of T cell activation, central clustering of pZAP-70 was transiently shown after 7 minutes rather than 3 minutes after T cell-APC contact. Therefore, we carefully analyzed the kinetics of pZAP-70-containing MC at T cell-bilayer contacts through the formation of mature IS. However, pZAP-70 accumulation at approximately 7 minutes was not evident. pZAP-70 colocalized with TCR-MC within 1 minute. The initial pZAP-70-MC disappeared soon and only the marginal part pZAP-70-MC remained. This is probably because ZAP-70-MC occurred persistently at the margin and pZAP-70-MC was born there.
To further prove the finding that the MC containing TCR, kinase and adapter molecule is the site that produces the early activation signal, we simultaneously monitored the kinetics of MC formation and intracellular calcium levels. AND-Tg T cells expressing CD3ζ-EGFP were labeled with Indo-1 and mounted on a planar bilayer pulsed with PCC 88-104 . As shown in FIG. 4A, intracellular calcium levels rose rapidly within 30 seconds of cell-bilayer contact and were maintained throughout the experimental period (at least 10 minutes). These calcium mobilizations were induced in parallel with some MC formation in the expansion phase. Sustained calcium levels were not altered by c-SMAC formation in the contraction phase, and no amplitude of intracellular calcium levels was observed. When we placed Indo-1 loaded cells on a planar bilayer without pulsing the peptide, the cells showed neither MC formation nor increased intracellular calcium (FIG. 4B). These results suggest that MC is sufficient for the initiation of phosphorylation and calcium flux, and that signaling molecules are rapidly recruited to MC after stimulation.

実施例４：機能的マイクロクラスターのチロシンキナーゼ依存性形成
SrcファミリーキナーゼLckおよびFynは、CD3ζのリン酸化およびZAP-70のリクルートによる近位TCRシグナル伝達に重要なチロシンキナーゼである。従って、本発明者らは、SrcキナーゼインヒビターPP2の存在下でMC形成およびZAP-70のリクルートを試験した。CD3ζ-EGFPまたはZAP-70-EGFPを発現するAND-Tg T細胞をPP2で処理し、平面二重層上にのせた。予期された通り、ZAP-70のMC形成は、未処理T細胞で観察されたZAP-70-MC（図５Ａｅ−ｈ）に比し、初期および後期の双方のタイムコースにおいてPP2によりブロックされた（図５Ｂｅ−ｈ）。予想外なことに、CD3ζ-MCは、PP2処理T細胞でさえも生じ（図５Ａｅ−ｈ）、中心領域にトランスロケートした（図５Ｂａ−ｄ）が、未処理細胞のものとは様式が異なっていた。PP2処理T細胞では、CD3ζクラスターは、多方向に移動し、互いに融合し、c-SMAC様蓄積を生じたが、細胞はスプレッディングしなかった。これらの結果は、CD3ζ-MC形成がSrcファミリーキナーゼ非依存性様式で初期に誘発され得るが、機能的MCのその後の生成およびc-SMACを形成するMCの単一方向へのトランスロケーションが、キナーゼ依存性様式で進行することを示唆する。 Example 4: Tyrosine kinase-dependent formation of functional microclusters
Src family kinases Lck and Fyn are tyrosine kinases important for phosphorylation of CD3ζ and proximal TCR signaling by ZAP-70 recruitment. Therefore, we tested MC formation and ZAP-70 recruitment in the presence of the Src kinase inhibitor PP2. AND-Tg T cells expressing CD3ζ-EGFP or ZAP-70-EGFP were treated with PP2 and placed on a planar bilayer. As expected, ZAP-70 MC formation was blocked by PP2 in both early and late time courses compared to ZAP-70-MC observed in untreated T cells (FIG. 5Ae-h). (FIG. 5 Be-h). Unexpectedly, CD3ζ-MC occurred even in PP2-treated T cells (FIG. 5Ae-h) and translocated to the central region (FIG. 5Ba-d), but in a different manner from that of untreated cells. It was. In PP2-treated T cells, the CD3ζ cluster migrated in multiple directions and fused together, resulting in c-SMAC-like accumulation, but the cells did not spread. These results indicate that CD3ζ-MC formation can be induced early in an Src family kinase-independent manner, but that subsequent generation of functional MC and translocation of MC to form c-SMAC Suggests progression in a kinase-dependent manner.

実施例５：ISの辺縁部での新しいマイクロクラスターにおける持続シグナルの発生
シグナル伝達MCの迅速なアッセンブリーとは対照的に、TCR媒介シグナル伝達は、T細胞-APCの結合後数時間にわたり持続し、IS形成が連続的なTCRシグナル伝達に必要とされる（Huppa et al., Nat Rev Immunol 3, 973-83 (2003)）。成熟IS形成後でさえもシグナル伝達が持続する部位を同定するため、本発明者らは、IS形成の終了後、TIRFMにより、CD3ζ、ZAP-70およびSLP-76含有MCを解析した。驚くべきことに、lamellipodia様構造の多数のCD3ζ-MCが、辺縁部で連続的に生じ、中心に連続的にトランスロケートした（図６Ａａ−Ｄａ）。一つのMCを構成するCD3ζタンパク質の数は、細胞がc-SMACを有する場合、辺縁部でおよそ40-110であり、c-SMACにより近い位置では110-290であると推定された。対照的に、ZAP-70-MCもまた、辺縁部で生じ、ZAP-70-MCの大部分は、図６Ａｂ−Ｄｂに示されるように中心への路にディスロケートした。同様に、SLP-76-MCは、辺縁部に広く連続的に生じたが、完全に消失した（図６Ａｃ−Ｄｃ）。これらの結果は、個々のMCを追跡、定量することにより確認できた。ZAP-70-およびSLP-76-MCの移動距離 (それぞれ0.64±0.43および0.59±0.38μm/s) は、CD3ζ-MCのもの (2.18±0.81μm/s) よりもはるかに短かった。これらの結果は、CD3ζが中心に蓄積するものの、細胞内シグナル伝達分子ZAP-70およびSLP-76が、ISの辺縁部にあるMCのTCR-CD3のみと主に会合することを示す。これを確認するため、本発明者らは、新たに生成したMCにおけるCD3ζおよびZAP-70の共局在を試験した。図７に示されるように、これらの分子は、成熟IS形成後に辺縁部で同じMCに共局在した。さらに、pZAP-70およびリン酸化チロシン染色は、成熟ISの中心よりもむしろISの辺縁部に主に局在した（図３Ａｊ、ｋおよびＣｊ、ｋ）。このことは、リン酸化が、連続的に生成した新たな辺縁部MCにて主に生じていることを示唆する。まとめると、これらの結果は、シグナル伝達分子が、持続性シグナルが進行する辺縁部にて、TCR-MCと一過的に会合することを示唆する。 Example 5: Generation of persistent signals in new microclusters at the margin of IS In contrast to the rapid assembly of signaling MCs, TCR-mediated signaling persists for several hours after T cell-APC binding. IS formation is required for continuous TCR signaling (Huppa et al., Nat Rev Immunol 3, 973-83 (2003)). To identify sites where signal transduction persists even after mature IS formation, we analyzed MC containing CD3ζ, ZAP-70 and SLP-76 by TIRFM after IS formation was completed. Surprisingly, a large number of CD3ζ-MC with a lamellipodia-like structure occurred continuously at the edge and continuously translocated to the center (FIGS. 6Aa-Da). The number of CD3ζ proteins constituting one MC was estimated to be approximately 40-110 at the edge when the cells have c-SMAC and 110-290 at a position closer to c-SMAC. In contrast, ZAP-70-MC also occurred at the edge, and the majority of ZAP-70-MC was located in the way to the center as shown in FIGS. 6Ab-Db. Similarly, SLP-76-MC occurred widely and continuously at the edge, but disappeared completely (FIG. 6Ac-Dc). These results were confirmed by tracking and quantifying individual MCs. The travel distance of ZAP-70- and SLP-76-MC (0.64 ± 0.43 and 0.59 ± 0.38 μm / s, respectively) was much shorter than that of CD3ζ-MC (2.18 ± 0.81 μm / s). These results indicate that although CD3ζ accumulates in the center, intracellular signaling molecules ZAP-70 and SLP-76 mainly associate only with TCR-CD3 of MC at the margin of IS. To confirm this, we tested the co-localization of CD3ζ and ZAP-70 in newly generated MC. As shown in FIG. 7, these molecules co-localized with the same MC at the margin after mature IS formation. Furthermore, pZAP-70 and phosphotyrosine staining were mainly localized at the margin of IS rather than at the center of mature IS (FIGS. 3Aj, k and Cj, k). This suggests that phosphorylation occurs mainly at the newly generated new marginal part MC. Taken together, these results suggest that signaling molecules transiently associate with TCR-MC at the margins where persistent signals progress.

実施例６：細胞骨格形成インヒビターによるマイクロクラスター形成の阻害
細胞骨格形成インヒビターとして、アクチン重合を阻害するサイトカラシンＢを用いた。CD3ζ-EGFPを遺伝子導入したAND-Tg T細胞を、サイトカラシンBの存在下にて、抗原がのせてある脂質二重層に接着させた。T細胞と脂質二重層との接着面上にCD3ζ-MCが形成され、また、抗リン酸化ZAP-70抗体にて染色されたことより、このCD3ζ-MCが機能的であることが判明した。しかし、T細胞はスプレッディングせず、それ以降のCD3ζ-MCやc-SMACしいてはISも形成されなかった。以上より、細胞骨格形成の阻害によりMC形成が阻害されることが示唆された。 Example 6: Inhibition of microcluster formation by cytoskeleton formation inhibitor Cytochalasin B that inhibits actin polymerization was used as a cytoskeleton formation inhibitor. In the presence of cytochalasin B, AND-Tg T cells transfected with CD3ζ-EGFP were adhered to the lipid bilayer on which the antigen was placed. CD3ζ-MC was formed on the adhesion surface between the T cell and the lipid bilayer and stained with an anti-phosphorylated ZAP-70 antibody, which revealed that this CD3ζ-MC was functional. However, T cells did not spread, and subsequent CD3ζ-MC and c-SMAC did not form IS. From the above, it was suggested that inhibition of cytoskeleton formation inhibits MC formation.

細胞-二重層接触を通じて空間-時間的様式で動的に分布する、CD3ζ、ZAP-70およびSLP-76のマクロクラスターを示す図である。CD3ζ-EGFP (a)、ZAP-70-EPGF (b) またはSLP-76-EGFP (c) を発現するAND-Tg T細胞を、未標識I-EkおよびICAM-1を含有する平面二重層 (PCC88-104で予めパルス) 上にのせ、TIRFMを用いて映像速度 (30フレーム/秒) で画像化した。各画像を示された時点にて一つだけ選んだ。FIG. 6 shows CD3ζ, ZAP-70 and SLP-76 macroclusters dynamically distributed in a spatio-temporal manner through cell-bilayer contacts. AND-Tg T cells expressing CD3ζ-EGFP (a), ZAP-70-EPGF (b) or SLP-76-EGFP (c) were treated with planar bilayers (PCC) containing unlabeled IE k and ICAM-1. 88-104 , pulsed in advance) and imaged at video speed (30 frames / second) using TIRFM. Only one of each image was selected at the time indicated. 細胞-二重層接触を通じて空間-時間的様式で動的に分布する、CD3ζ、ZAP-70およびSLP-76のマクロクラスターを示す図である。CD3ζ- (a)、ZAP-70- (b) またはSLP-76- (c) MCの、中心への移動および蓄積または消失を、キモグラフで水平要素により示す。FIG. 6 shows CD3ζ, ZAP-70 and SLP-76 macroclusters dynamically distributed in a spatio-temporal manner through cell-bilayer contacts. CD3ζ- (a), ZAP-70- (b) or SLP-76- (c) Migration to the center and accumulation or disappearance of MC are shown by horizontal elements in a chymograph. 細胞-二重層接触を通じて空間-時間的様式で動的に分布する、CD3ζ、ZAP-70およびSLP-76のマクロクラスターを示す図である。代表的なCD3ζ- (a, d, g)、ZAP-70- (b, e, h) およびSLP-76- (c, f, i) MCを、細胞-二重層接触後に追跡し、移動経路を3つのphase (expansion phase (aおよびbでは0-75秒、ならびにcでは0-35秒)、contraction phase (dおよびeでは75-150秒、ならびにfでは35-70秒)、ならびにc-SMACによる post-contraction phase (gおよびhでは150-225秒、ならびにiでは70-105秒) において別々に示す。FIG. 6 shows CD3ζ, ZAP-70 and SLP-76 macroclusters dynamically distributed in a spatio-temporal manner through cell-bilayer contacts. Representative CD3ζ- (a, d, g), ZAP-70- (b, e, h) and SLP-76- (c, f, i) MC are tracked after cell-bilayer contact 3 phases (expansion phase (0-75 seconds for a and b, and 0-35 seconds for c), contraction phase (75-150 seconds for d and e, and 35-70 seconds for f), and c- Shown separately in the post-contraction phase by SMAC (150-225 seconds for g and h, and 70-105 seconds for i). 細胞-二重層接触直後にCD3ζ-MCにリクルートされるZAP-70を示す図である。ZAP-70-EGFP発現AND-Tg T細胞を、I-EkおよびICAM-1を含む平面二重層上にのせた。細胞を1分 (a-d)、3分 (e-h) または30分 (i-l) 後に固定し、CD3ε (Alexa Fluor633) について染色した。EGFP融合タンパク質およびCD3εはそれぞれ、偽着色した緑および赤である (スケールバー=5μm)。FIG. 4 shows ZAP-70 recruited to CD3ζ-MC immediately after cell-bilayer contact. ZAP-70-EGFP expressing AND-Tg T cells were mounted on a planar bilayer containing IE k and ICAM-1. Cells were fixed after 1 min (ad), 3 min (eh) or 30 min (il) and stained for CD3ε (Alexa Fluor 633 ). EGFP fusion protein and CD3ε are false colored green and red, respectively (scale bar = 5 μm). 対角線 (図２Ａにおける黄色線) 上のZAP-70-EGFP (a, c, e)、ならびにCD3ε (b, d, f) の蛍光強度の定量を示す図である。It is a figure which shows the fixed_quantity | quantitative_assay of the fluorescence intensity of ZAP-70-EGFP (a, c, e) and CD3 (epsilon) (b, d, f) on a diagonal line (yellow line in FIG. 2A). 細胞-二重層接触直後にCD3ζ-MCにリクルートされるSLP-76を示す図である。SLP-76-EGFP発現AND-Tg T細胞を、I-EkおよびICAM-1を含む平面二重層上にのせた。細胞を1分 (a-d)、3分 (e-h) または30分 (i-l) 後に固定し、CD3ε (Alexa Fluor633) について染色した。EGFP融合タンパク質およびCD3εはそれぞれ、偽着色した緑および赤である (スケールバー=5μm)。FIG. 7 shows SLP-76 recruited to CD3ζ-MC immediately after cell-bilayer contact. SLP-76-EGFP expressing AND-Tg T cells were mounted on a planar bilayer containing IE k and ICAM-1. Cells were fixed after 1 min (ad), 3 min (eh) or 30 min (il) and stained for CD3ε (Alexa Fluor 633 ). EGFP fusion protein and CD3ε are false colored green and red, respectively (scale bar = 5 μm). 対角線 (図２Ｃにおける黄色線) 上のSLP-76-EGFP (a, c, e)、ならびにCD3ε (b, d, f) の蛍光強度の定量を示す図である。It is a figure which shows the fixed_quantity | quantitative_assay of the fluorescence intensity of SLP-76-EGFP (a, c, e) and CD3 (epsilon) (b, d, f) on a diagonal line (yellow line in FIG. 2C). 細胞-二重層接触直後にCD3ζ-MCにリクルートされるZAP-70およびSLP-76を示す図である。SLP-76-EGFPおよびZAP-70-mRFPを同時に発現するAND-Tg T細胞を、I-EkおよびICAM-1を含む平面二重層上にのせた。細胞を1分 (a-d)、3分 (e-h) または30分 (i-l) 後に固定した。EGFPおよびmRFP融合タンパク質はそれぞれ、偽着色した緑および赤である (スケールバー=5μm)。FIG. 3 shows ZAP-70 and SLP-76 recruited to CD3ζ-MC immediately after cell-bilayer contact. AND-Tg T cells that simultaneously express SLP-76-EGFP and ZAP-70-mRFP were mounted on a planar bilayer containing IE k and ICAM-1. Cells were fixed after 1 minute (ad), 3 minutes (eh) or 30 minutes (il). EGFP and mRFP fusion proteins are false colored green and red, respectively (scale bar = 5 μm). 細胞-二重層接触直後にCD3ζ-MCにリクルートされるZAP-70およびSLP-76を示す図である。対角線 (図２Eにおける黄色線) 上のSLP-76-EGFP (a, c, e)、ならびにZAP-70-mRFP (b, d, f) の蛍光強度を定量した。FIG. 3 shows ZAP-70 and SLP-76 recruited to CD3ζ-MC immediately after cell-bilayer contact. The fluorescence intensity of SLP-76-EGFP (a, c, e) and ZAP-70-mRFP (b, d, f) on the diagonal (yellow line in FIG. 2E) was quantified. ISの辺縁部でのみリン酸化ZAP-70を含むCD3ζ-MCを示す図である。CD3ζ-EGFP発現AND-Tg T細胞を、示された時点で固定し、pZAP-70 (Alexa Fluor633) について染色した。白四角で囲まれた領域を、図３Ｅで拡大した (スケールバー=5μm)。It is a figure which shows CD3ζ-MC containing phosphorylated ZAP-70 only at the edge part of IS. CD3ζ-EGFP expressing AND-Tg T cells were fixed at the indicated time points and stained for pZAP-70 (Alexa Fluor 633 ). The area surrounded by the white square was enlarged in FIG. 3E (scale bar = 5 μm). 対角線 (図３Ａにおける黄色線) 上のCD3ζ-EGFP (a, c, e)、およびpZAP-70 (b, d, f) の蛍光強度を示す図である。It is a figure which shows the fluorescence intensity of CD3ζ-EGFP (a, c, e) and pZAP-70 (b, d, f) on a diagonal line (yellow line in FIG. 3A). ISの辺縁部でのみチロシンリン酸化タンパク質を含むCD3ζ-MCを示す図である。CD3ζ-EGFP発現AND-Tg T細胞を、示された時点で固定しリン酸化チロシン (Alexa Fluor633) について染色した。白四角で囲まれた領域を、図３Ｆで拡大した (スケールバー=5μm)。It is a figure which shows CD3ζ-MC containing a tyrosine phosphorylated protein only at the edge part of IS. CD3ζ-EGFP expressing AND-Tg T cells were fixed at the indicated time points and stained for phosphorylated tyrosine (Alexa Fluor 633 ). The area surrounded by the white square was enlarged in FIG. 3F (scale bar = 5 μm). 対角線 (図３Ｃにおける黄色線) 上のCD3ζ-EGFP (a, c, e)、およびリン酸化チロシン (b, d, f) の蛍光強度を示す。The fluorescence intensity of CD3ζ-EGFP (a, c, e) and phosphorylated tyrosine (b, d, f) on the diagonal (yellow line in FIG. 3C) is shown. 図３Ａの四角領域の拡大画像を示す図である。矢頭は、CD3ζおよびpZAP-70 (a-c) の双方を含むMCを示す。It is a figure which shows the enlarged image of the square area | region of FIG. 3A. Arrowheads indicate MCs containing both CD3ζ and pZAP-70 (a-c). 図３Ｃの四角領域の拡大画像を示す図である。矢頭は、CD3ζおよびリン酸化チロシン (Fa-c) の双方を含むMCを示す。It is a figure which shows the enlarged image of the square area | region of FIG. 3C. Arrowheads indicate MCs that contain both CD3ζ and phosphorylated tyrosine (Fa-c). 初期接触部位におけるMCの形成によるカルシウムインフラックス (influx) の誘導を示す図である。CD3ζ-EGFP発現AND-Tg T細胞にIndo-1をロードし、I-EkおよびICAM-1を含む、PCC88-104パルスした平面二重層上にのせた。CD3ζ-MC (a) およびカルシウムインフラックス (b) を、EGFPおよびIndo-1の同時モニタリングよる蛍光顕微鏡により検出した。5つの代表的な細胞を異なる色で示す。(a) における1フレームおよび (b) における1ポイントはそれぞれ、30および15秒に対応する。It is a figure which shows the induction | guidance | derivation of the calcium influx (influx) by formation of MC in an initial contact part. CD3ζ-EGFP expressing AND-Tg T cells were loaded with Indo-1 and placed on a PCC 88-104 pulsed planar bilayer containing IE k and ICAM-1. CD3ζ-MC (a) and calcium influx (b) were detected by fluorescence microscopy with simultaneous monitoring of EGFP and Indo-1. Five representative cells are shown in different colors. One frame in (a) and one point in (b) correspond to 30 and 15 seconds, respectively. 初期接触部位におけるMCの形成によるカルシウムインフラックス (influx) の誘導を示す図である。CD3ζ-EGFP発現AND-Tg T細胞を、ペプチドをパルスしなかった平面二重層上にのせた。CD3ζ-MC (a) およびカルシウムインフラックス (b) を 図４Ａと同様の方法により検出した。It is a figure which shows the induction | guidance | derivation of the calcium influx (influx) by formation of MC in an initial contact part. CD3ζ-EGFP expressing AND-Tg T cells were mounted on a planar bilayer that was not pulsed with peptide. CD3ζ-MC (a) and calcium influx (b) were detected by the same method as in FIG. 4A. Srcファミリーキナーゼによる、MCへのZAP-70リクルートの調節、およびCD3ζ-MC形成の非調節を示す図である。CD3ζ-EGFP (a-d) またはZAP-70-EGFP (e-h) を発現するAND-Tg T細胞を、I-EkおよびICAM-1を含む、PCC88-104パルスした平面二重層上にのせた。細胞を、細胞接触の3または30分後に固定し、共焦点顕微鏡により画像化した (スケールバー=5μm)。FIG. 3 shows regulation of ZAP-70 recruitment to MC and non-regulation of CD3ζ-MC formation by Src family kinases. AND-Tg T cells expressing CD3ζ-EGFP (ad) or ZAP-70-EGFP (eh) were placed on a PCC 88-104 pulsed planar bilayer containing IE k and ICAM-1. Cells were fixed 3 or 30 minutes after cell contact and imaged by confocal microscopy (scale bar = 5 μm). Srcファミリーキナーゼによる、MCへのZAP-70リクルートの調節、およびCD3ζ-MC形成の非調節を示す図である。同じ細胞を、10μM PP2とともに37℃で20分間予めインキュベートし、図５Ａに記載されるように画像化した。FIG. 3 shows regulation of ZAP-70 recruitment to MC and non-regulation of CD3ζ-MC formation by Src family kinases. The same cells were preincubated with 10 μM PP2 for 20 minutes at 37 ° C. and imaged as described in FIG. 5A. 成熟IS形成後に辺縁部に連続的に生じる、CD3ζ-、ZAP-70-およびSLP-76-MCを示す図である。CD3ζ-EGFP (a)、ZAP-70-EGFP (b) またはSLP-76-EGFP (c) を発現するAND-Tg T細胞を、未標識I-EkおよびICAM-1を含む、PCC88-104で予めパルスした平面二重層上にのせた。細胞-二重層接触の15分後の画像を、TIRFMにより映像速度 (30フレーム/秒) で収集した。It is a figure which shows CD3ζ-, ZAP-70-, and SLP-76-MC which are continuously generated at the edge after the formation of mature IS. AND-Tg T cells expressing CD3ζ-EGFP (a), ZAP-70-EGFP (b) or SLP-76-EGFP (c) were treated with PCC 88-104 containing unlabeled IE k and ICAM-1. Placed on a pre-pulsed planar bilayer. Images 15 minutes after cell-bilayer contact were collected by TIRFM at video rate (30 frames / second). CD3ζ- (a)、ZAP-70- (b) およびSLP-76- (c) MCのTIRF画像の表面プロッティングを示す図である。FIG. 7 is a diagram showing surface plotting of TIRF images of CD3ζ- (a), ZAP-70- (b) and SLP-76- (c) MC. CD3ζ- (a)、ZAP-70- (b) またはSLP-76- (c) MCの90秒の移動を示すキモグラフである。CD3ζ- (a), ZAP-70- (b) or SLP-76- (c) Chymograph showing 90 second movement of MC. 代表的CD3ζ- (a)、ZAP-70- (b)またはSLP-76- (c) MCの追跡による移動経路を示す図である。It is a figure which shows the movement path | route by tracking of typical CD3ζ- (a), ZAP-70- (b) or SLP-76- (c) MC. 成熟IS形成後に辺縁部に新たに生じたMCにおけるTCRおよびZAP-70の共局在を示す図である。ZAP-70-EGFP発現AND-Tg T細胞を、TCRβ (赤) について染色し、平面二重層上にのせた。細胞を、細胞接触の20分後に固定し、共焦点顕微鏡により画像化して、ZAP-70およびTCR (a-d) の共局在を解析した。(e-h) (a-d) における四角領域の拡大画像。矢頭は、pZAP-70およびTCRβの双方を含むMCを示す (スケールバー=5μm)。It is a figure which shows the co-localization of TCR and ZAP-70 in MC newly produced in the marginal part after mature IS formation. ZAP-70-EGFP expressing AND-Tg T cells were stained for TCRβ (red) and mounted on a planar bilayer. Cells were fixed 20 minutes after cell contact and imaged by confocal microscopy to analyze the co-localization of ZAP-70 and TCR (a-d). (e-h) Enlarged image of the square area in (a-d). Arrowheads indicate MC containing both pZAP-70 and TCRβ (scale bar = 5 μm).

Claims (16)

被験物質が、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節するか否かを評価することを含む、細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法。 A screening method for a substance capable of controlling cell activation, comprising evaluating whether a test substance regulates the formation of MC containing a cell surface receptor capable of forming a cluster. 免疫シナプスを形成し得る細胞の活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法である、請求項１記載の方法。 The method according to claim 1, which is a screening method for a substance capable of controlling activation of cells capable of forming an immunological synapse. ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節するか否かを評価することを含む、Ｔ細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法。 A method for screening a substance capable of controlling T cell activation, comprising evaluating whether or not the formation of TCR-containing MC is regulated. ＴＣＲ含有ＭＣが免疫シナプス辺縁部におけるＴＣＲ含有ＭＣである、請求項３記載の方法。 4. The method of claim 3, wherein the TCR-containing MC is a TCR-containing MC at the immune synaptic margin. 被験物質がＴＣＲ含有ＭＣの形成を抑制するか否かを評価することを含むＴ細胞活性化を阻害し得る物質のスクリーニング方法である、請求項３または４記載の方法。 The method according to claim 3 or 4, which is a screening method for a substance capable of inhibiting T cell activation, comprising evaluating whether a test substance suppresses the formation of TCR-containing MC. ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節するか否かの評価が、ＴＣＲ含有ＭＣへのキナーゼ分子および／またはアダプター分子のリクルートの評価である、請求項３または４記載の方法。 The method according to claim 3 or 4, wherein the evaluation of whether or not to modulate the formation of TCR-containing MC is an evaluation of recruitment of kinase molecules and / or adapter molecules to TCR-containing MC. キナーゼ分子およびアダプター分子がそれぞれ、ＺＡＰ−７０およびＳＬＰ−７６である、請求項４記載の方法。 The method of claim 4, wherein the kinase molecule and the adapter molecule are ZAP-70 and SLP-76, respectively. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、請求項３記載のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、Ｔ細胞、およびＴ細胞活性化抗原をロードした脂質二重層含有媒体を接触させる工程：
（ｂ）被験物質の存在下において、二重層含有媒体を接触させたＴ細胞におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成能を測定し、該形成能を、該被験物質の不在下における形成能と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、該形成を調節する被験物質を選択する工程。 The screening method according to claim 3, comprising the following steps (a) to (c):
(A) A step of contacting a test substance, a T cell, and a lipid bilayer-containing medium loaded with a T cell activating antigen:
(B) measuring the ability of TCR-containing MC to be formed in T cells contacted with the bilayer-containing medium in the presence of the test substance, and comparing the ability to form in the absence of the test substance;
(C) A step of selecting a test substance that regulates the formation based on the comparison result of (b). 脂質二重層含有媒体が、抗原提示能を有する平面二重層または抗原提示細胞である、請求項８記載の方法。 The method according to claim 8, wherein the lipid bilayer-containing medium is a planar bilayer or antigen-presenting cell having antigen-presenting ability. 細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング用キットであって、
クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの構成分子の発現ベクターまたは該発現ベクターが導入されたＴ細胞を含み、
該構成分子が検出可能に標識されている、キット。 A kit for screening a substance capable of controlling cell activation,
An expression vector of a component molecule of MC containing a cell surface receptor capable of forming a cluster, or a T cell into which the expression vector has been introduced,
A kit wherein the constituent molecules are detectably labeled. クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節し得る物質を含む、細胞活性化制御剤。 A cell activation control agent comprising a substance capable of regulating the formation of MC containing a cell surface receptor capable of forming a cluster. 免疫シナプスを形成する細胞の活性化制御剤である、請求項１１記載の剤。 The agent according to claim 11, which is an agent for controlling activation of cells that form immune synapses. ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質を含む、Ｔ細胞活性化制御剤。 A T cell activation regulator comprising a substance capable of regulating the formation of a TCR-containing MC. ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質が、免疫シナプス辺縁部におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質である、請求項１３記載の剤。 The agent according to claim 13, wherein the substance capable of regulating the formation of TCR-containing MC is a substance capable of regulating the formation of TCR-containing MC at the immunosynaptic margin. ＴＣＲ含有ＭＣの形成を抑制し得る物質を含むＴ細胞活性化阻害剤である、請求項１３記載の剤。 The agent of Claim 13 which is a T cell activation inhibitor containing the substance which can suppress formation of TCR containing MC. ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質が、ＴＣＲ含有ＭＣへのキナーゼ分子および／またはアダプター分子のリクルートを調節し得る物質、または細胞骨格の形成を調節し得る物質である、請求項１３または１４記載の剤。

15. The substance capable of regulating the formation of TCR-containing MC is a substance capable of regulating recruitment of kinase molecules and / or adapter molecules to TCR-containing MC, or a substance capable of regulating cytoskeleton formation. The agent described.

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