JP2007104929A - Cell sorter chip and cell sorter - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for comparing a metabolic state of a cell or a difference in response caused by application of chemical stimulation to a cell and provide a method for the precise purification of a cell by its phenotype by separating the cell based on the comparison result. <P>SOLUTION: Snap images of a cell flowing in a flow channel are photographed at least twice at a prescribed time interval and the amount of the cell (metabolic quantity) changed between the photographing actions is measured to compare and determine the difference in metabolism of the cell or response caused by the stimulation of the cell. A cell separation is carried out based on the comparison result. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、個別の細胞を分離解析し、細胞を一細胞毎に分離回収するセルソーターチップおよびセルソーターに関する。   The present invention relates to a cell sorter chip and a cell sorter for separating and analyzing individual cells and separating and collecting the cells for each cell.

２０世紀の初頭に細胞を観察しようとすると、顕微鏡以外に手立ては無かった。１９４８年にＷａｌｌａｃｃｅ Ｃｏｕｌｔｅｒがセルソーターの検出部の原型と言える“コールターカウンター”（Coulter, W. Means for counting particles suspended in a fluid. US2,656,508 (1949)）を開発し、はじめて個々の細胞の特性を調べることが可能になった。コールターの技術にＪｅｔ−Ｉｎ−Ａｉｒ型のシースフロー技術（Crosland-Taylor, P.J. A device for counting small particles suspended in a fluid through a tube. Nature 171, 37-38(1956)）と静電的な細胞分離技術（Fluwer, M.J. Electronic separation of biological cells by volume. Science 150, 910-911(1965)）が組み合わさり、それまで困難であった細胞を１個毎に分離して性質を調べることが可能であるとともに、実際に細胞を分離回収する近代的なフローサイトメーターあるいはセルソーターが実現した。これらは細胞解析や分離の自動機器として改良され、ライフサイエンス分野での細胞解析技術、細胞分離技術の核となっている。   When I tried to observe cells at the beginning of the 20th century, there was no other way besides a microscope. In 1948, Wallace Coulter developed the “Coulter Counter” (Coulter, W. Means for counting particles suspended in a fluid. US2,656,508 (1949)), the prototype of the cell sorter detector. It became possible to investigate. Coulter technology, Jet-In-Air type sheath flow technology (Crosland-Taylor, PJA device for counting small particles suspended in a fluid through a tube. Nature 171, 37-38 (1956)) and electrostatic cells Separation technology (Fluwer, MJ Electronic separation of biological cells by volume. Science 150, 910-911 (1965)) is combined, and it is possible to isolate cells that have been difficult until now one by one and investigate their properties. In addition, a modern flow cytometer or cell sorter that actually separates and collects cells has been realized. These have been improved as automated devices for cell analysis and separation, and are the core of cell analysis technology and cell separation technology in the life science field.

セルソーターとしてはベックマンコールター社や、ベクトンデッキンソン社から全自動の装置が発売されている。これらの装置は、最高３万細胞／秒の細胞処理が可能である。そのほか、臨床検査装置で実績のあるＤａｋｏグループのＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社は１０万細胞／秒の処理ができる高速セルソーターＭｏＦｌｏを実用化している。日本国内では１９９５〜２０００年にＮＥＤＯプロジェクトとして６億６８００万円を投じた「微量情報検出システム」の研究開発（ＮＥＤＯ「微量細胞情報検出システム」事後評価報告書、コード０６０００１５３８（２００２））が行われている。開発されたセルソーターでは、光学検出部からチューニング部分をなくすことで、ソーティング設定条件設定を容易にしている。ＮＥＤＯ成果を基に、Ｂｅｙ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社がデスクトップセルソータＪＳＡＮ（処理能力：４５０００細胞／秒）を開発し、販売している。   As cell sorters, fully automatic devices are available from Beckman Coulter and Becton Dickinson. These devices are capable of processing cells up to 30,000 cells / second. In addition, DakoCytomation, a Dako group with a proven track record in clinical testing equipment, has put in practical use a high-speed cell sorter MoFlo capable of processing 100,000 cells / second. In Japan, the research and development of “trace information detection system” (NEDO “trace cell information detection system” ex-post evaluation report, code 060001538 (2002)), which invested 668 million yen as a NEDO project in 1995-2000, was conducted. It has been broken. In the developed cell sorter, the tuning setting condition is easily set by eliminating the tuning part from the optical detection part. Based on NEDO results, Bey bioscience developed and sells desktop cell sorter JSAN (processing capacity: 45000 cells / second).

これらの装置では、細胞の検出は一般的にはシースフローセル内で行われる。シースフローの登場する以前のコールター型のセルソーターでは、細孔の開いた仕切りの外側と内側に電極を置き、外側の溶液から細孔を通して細胞を吸い上げたときに電極間に流れる電流の低下を測定する原理（Coulter, W. Means for counting particles suspended in a fluid. US2,656,508 (1949)）に基づいている。シースフローを用いる系では光学的な検出が用いられる［Hulett, H. R., Bonner, W.A., Barrett, J. and Herzenberg, L.A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science 166, 747-9(1969); Kamaensky, L.A., Melamed, M.R., and Derman,H. Spectorphotometer: New instrument for ultrarapid cell analysis. Science 150, 630-631(1965)］。シースフローセルにレーザーを照射し、細胞がレーザー光を横切った時に散乱する光を検出する方法と、予め細胞を蛍光標識しておき、レーザーを横切ったときに発生する蛍光を検出する方法がある。散乱光を測定する系では、細胞が数μｍであるときに、大きさにしたがって入射光の進行方向に対して散乱する前方散乱と、より小さな粒子、すなわち細胞内の顆粒により散乱する側方散乱を検出する方法がある。現状のＪｅｔ−Ｉｎ−Ａｉｒ型のセルソーターでは前方散乱と側方散乱と蛍光のいずれも測定できるようになっている。蛍光に関しては６色蛍光を分離検出する装置が一般的になっている。散乱光や蛍光はレーザーパワーを大きくすれば短時間で計測を終えることができる。このため現在最も処理能力の高いセルソーターでは１０万イベント（測定液滴数）／秒の処理能力が得られている。セルにレーザーを照射して細胞を計測する部分では２５０μｍ径で、セルの先端部のノズル部分は１００μｍ程径となっている。レーザー照射を行なうために正方形の断面を持つ流路のセルを用いることもある。   In these devices, cell detection is generally performed in a sheath flow cell. Prior to the introduction of sheath flow, Coulter-type cell sorters placed electrodes on the outside and inside of a pore-open partition, and measured the decrease in the current flowing between the electrodes when cells were sucked up from the outside solution through the pore. (Coulter, W. Means for counting particles suspended in a fluid. US2,656,508 (1949)). Optical detection is used in systems using sheath flow [Hulett, HR, Bonner, WA, Barrett, J. and Herzenberg, LA Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science 166, 747- 9 (1969); Kamaensky, LA, Melamed, MR, and Derman, H. Spectorphotometer: New instrument for ultrarapid cell analysis. Science 150, 630-631 (1965)]. There are a method of irradiating a laser to the sheath flow cell and detecting light scattered when the cell crosses the laser beam, and a method of detecting fluorescence emitted when the cell is crossed and the cell is fluorescently labeled in advance. In a system that measures scattered light, when the cell is several μm, forward scattering that scatters in the direction of the incident light according to the size and side scattering that is scattered by smaller particles, that is, granules inside the cell There is a way to detect. The current Jet-In-Air type cell sorter can measure any of forward scattering, side scattering, and fluorescence. Regarding fluorescence, an apparatus for separating and detecting six-color fluorescence has become common. Scattered light and fluorescence can be measured in a short time if the laser power is increased. For this reason, the cell sorter with the highest processing capacity currently has a processing capacity of 100,000 events (number of measurement droplets) / second. The portion where the cell is irradiated with a laser to measure the cell has a diameter of 250 μm, and the nozzle portion at the tip of the cell has a diameter of about 100 μm. In order to perform laser irradiation, a cell having a square cross section may be used.

一般的なフローサイトメーターやセルソーターは高価であること、装置が大型であること、試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接、試料を観察できないことなどの問題がある。これらの問題を解決するため、近年、マイクロ加工技術を用いて微細な流路を作成し、流路内の層流中を流れる細胞を直接顕微鏡観察しながら分離するセルソーターが開発されている（Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998);Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)）。しかし、このマイクロ加工技術を用いて作成するセルソーターでは観察手段に対する試料分離の応答速度が遅く、実用化するためには、より応答の速い処理方法が必要である。   Typical flow cytometers and cell sorters are expensive, large in size, require a large amount of sample, can cause cell damage during the creation of droplets, There are problems such as inability to observe the sample. In order to solve these problems, a cell sorter has recently been developed that creates micro flow channels using microfabrication technology and separates cells flowing in the laminar flow in the flow channel while directly observing them under a microscope (Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998); Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)). However, the cell sorter produced by using this micromachining technique has a slow response speed of sample separation with respect to the observation means, and a processing method with a faster response is required for practical use.

また、細胞を精製するためには、細胞を分離する方法以外にも、不用な細胞のみの機能を失活させることで、細胞を分離することと同様の成果を得ることができる。細胞の機能を失活させる技術としては、集束光を細胞に照射して細胞の機能を失活させる技術があり、たとえば、培養皿上で培養している白血球細胞に波長５２３ｎｍの集束光レーザーを照射し、細胞内に取り込ませた吸収ピーク波長５０４ｎｍの色素に吸収させることで１０−６秒の照射で細胞を加熱し失活させることができたことが報告されている［Koller, M.R., Hanania, E.G., Stevens, J., Eisfeld, T.M., Sasaki, G.C., Fieck, A., Palsson, B. High-throughput laser-mediated in situ cell purification with high purity and yield. Cytometry Part A 61A: 153-161 (2004)］。しかし、この手法では、静止している細胞の位置を１細胞単位で同定して、その細胞位置に集束点を持ってゆくものであり、幅広い流路中をランダムに高速に流れてくる細胞の位置を同定し、その細胞のみに選択的に集束光を照射することは困難であった。 Moreover, in order to purify cells, in addition to the method of separating cells, the same result as that of separating cells can be obtained by inactivating the function of only unnecessary cells. As a technique for deactivating cell functions, there is a technique for irradiating cells with focused light to deactivate the functions of the cells. For example, a focused laser beam having a wavelength of 523 nm is applied to white blood cells cultured on a culture dish. It has been reported that cells can be heated and inactivated by irradiation for 10 −6 seconds by irradiation and absorption with a dye having an absorption peak wavelength of 504 nm incorporated into the cells [Koller, MR, Hanania , EG, Stevens, J., Eisfeld, TM, Sasaki, GC, Fieck, A., Palsson, B. High-throughput laser-mediated in situ cell purification with high purity and yield.Cytometry Part A 61A: 153-161 ( 2004)]. However, in this method, the position of stationary cells is identified on a cell-by-cell basis, and a focusing point is brought to that cell position. It was difficult to identify the position and selectively irradiate only the cells with focused light.

本願の発明者らは、このような問題点を解消するため、マイクロ加工技術を活用して、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えることなく、簡便に細胞試料を分析分離することのできる細胞分析分離装置を提案している（特開２００３−１０７０９９号公報、特開２００４−８５３２３号公報、国際公開第２００４／１０１７３１号パンフレット）。また、Journal of Nanobiotechnology Vol.2:5（オンラインジャーナルhttp://www.jnanobiotechnology.com/content/pdf/1477-3155-2-5.pdf)）にも、類似の技術が開示されている。 In order to solve such problems, the inventors of the present application utilize micromachining technology to fractionate a sample based on the microstructure of the sample and the fluorescence distribution in the sample, and damage the collected sample. There has been proposed a cell analysis / separation apparatus that can easily analyze and separate cell samples without giving them (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-107099, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-85323, International Publication No. 2004/101731). . Similar technology is also disclosed in Journal of Nanobiotechnology Vol. 2: 5 (online journal http://www.jnanobiotechnology.com/content/pdf/1477-3155-2-5.pdf ).

Coulter, W. Means for counting particles suspended in a fluid. US2,656,508 (1949)）Coulter, W. Means for counting particles suspended in a fluid. US2,656,508 (1949)) Crosland-Taylor, P.J. A device for counting small particles suspended in a fluid through a tube. Nature 171, 37-38(1956)Crosland-Taylor, P.J.A device for counting small particles suspended in a fluid through a tube.Nature 171, 37-38 (1956) Fluwer, M.J. Electronic separation of biological cells by volume. Science 150, 910-911(1965)Fluwer, M.J.Electronic separation of biological cells by volume.Science 150, 910-911 (1965) 「微量細胞情報検出システム」事後評価報告書、コード０６０００１５３８（２００２）"Micro-cell information detection system" ex-post evaluation report, code 060001538 (2002) Coulter, W. Means for counting particles suspended in a fluid. US2, 656,508 (1949)Coulter, W. Means for counting particles suspended in a fluid.US2, 656,508 (1949) Hulett, H. R., Bonner, W.A., Barrett, J. and Herzenberg, L.A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science 166, 747-9(1969)Hulett, H. R., Bonner, W.A., Barrett, J. and Herzenberg, L.A.Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence.Science 166, 747-9 (1969) Kamaensky, L.A., Melamed, M.R., and Derman,H. Spectorphotometer: New instrument for ultrarapid cell analysis. Science 150, 630-631(1965)Kamaensky, L.A., Melamed, M.R., and Derman, H.Spectorphotometer: New instrument for ultrarapid cell analysis.Science 150, 630-631 (1965) Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998);Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998); Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998) Koller, M.R., Hanania, E.G., Stevens, J., Eisfeld, T.M., Sasaki, G.C., Fieck, A., Palsson, B. High-throughput laser-mediated in situ cell purification with high purity and yield. Cytometry Part A 61A: 153-161 (2004)Koller, MR, Hanania, EG, Stevens, J., Eisfeld, TM, Sasaki, GC, Fieck, A., Palsson, B. High-throughput laser-mediated in situ cell purification with high purity and yield.Cytometry Part A 61A : 153-161 (2004) Journal of Nanobiotechnology Vol.2:5（オンラインジャーナルhttp://www.jnanobiotechnology.com/content/pdf/1477-3155-2-5.pdf)Journal of Nanobiotechnology Vol.2: 5 (online journal http://www.jnanobiotechnology.com/content/pdf/1477-3155-2-5.pdf) 特開２００３−１０７０９９号公報JP 2003-107099 A 特開２００４−８５３２３号公報JP 2004-85323 A 国際公開第２００４／１０１７３１号パンフレットInternational Publication No. 2004/101731 Pamphlet

上記Ｊｅｔ−Ｉｎ−Ａｉｒ型のセルソーターあるいは、上記文献、さらには、本願の発明者らの提案する特願２００４−３７９３２７号記載、特願２００４−２９７１８４号記載のセルソーターでは、流路中を流れる細胞の一瞬のスナップ写真から、細胞のそのときの状態を１回だけ解析し、これに基づいて細胞の種類を識別、分離するものである。この技術では、細胞が表面に発現しているタンパク質などの識別は出来るが、代謝状態などの、同一細胞の時間的変化を比較計測して初めて分かる細胞状態を計測することは出来ない。強いてやろうとすると、分離した細胞を一旦、回収し、所定時間インキュベーションした後に再度フローサイトメーターやセルソーターで分析することになる。   In the above-mentioned Jet-In-Air type cell sorter or the above-mentioned literature, and the cell sorter described in Japanese Patent Application Nos. 2004-379327 and 2004-297184 proposed by the inventors of the present application, the cells flowing in the flow path From the instant snapshot, the current state of the cell is analyzed only once, and the cell type is identified and separated based on this analysis. With this technology, proteins expressed on the surface of cells can be identified, but it is impossible to measure cell states that can be understood only by comparing and measuring temporal changes of the same cells, such as metabolic states. When it is forced to do so, the separated cells are collected once, incubated for a predetermined time, and then analyzed again with a flow cytometer or a cell sorter.

しかし、Ｊｅｔ−Ｉｎ−Ａｉｒ型のセルソーター等の従来のセルソーターでは繰り返し解析をするにしても、細胞を特定して繰り返し解析する構成にはなっていない。手段として分離した細胞群を再度セルソーターで分離回収することしかできない。したがって、細胞の代謝状態、あるいは細胞に薬物刺激を与えたことによる応答の違いを比較計測する方法、さらに、比較計測に基づいて細胞分離を行なうことで、細胞を表現型に応じて精密に精製する方法が求められている。   However, even with a conventional cell sorter such as a Jet-In-Air type cell sorter, even if repeated analysis is performed, the cell is not identified and repeatedly analyzed. As a means, the separated cell group can only be separated and collected again with a cell sorter. Therefore, a method for comparatively measuring the metabolic state of a cell or a difference in response due to drug stimulation on the cell, and further performing cell separation based on the comparative measurement, the cell is precisely purified according to the phenotype There is a need for a way to do that.

上記課題を解決するために、本発明では、流路中を流れる細胞のスナップ像を少なくても２回、所定の時間間隔で撮影し、この２回の撮影の間に細胞で変化した量（代謝量）を計測することで、細胞の代謝状態、あるいは細胞に刺激を与えたことによる応答の違いを比較計測する。さらに、比較計測結果に基づいて細胞分離を行なう。   In order to solve the above-described problem, in the present invention, a snap image of a cell flowing in a flow path is photographed at a predetermined time interval at least twice, and the amount of change in the cell during the two photographing operations ( By measuring (metabolism), the difference in response due to the metabolic state of the cells or the stimulation of the cells is compared and measured. Furthermore, cell separation is performed based on the comparative measurement result.

また上記課題のうち、細胞を選別するために、本発明では、細胞を分岐を持つ微細流路中で各分岐に分離する方法を用いる。あるいは、流路中を流れる細胞に、細胞を破壊あるいは細胞に細胞死（アポトーシス）を誘導する手段によって流路を通過することでほしい細胞のみ生存して通過する細胞精製を行なう。   Further, among the above problems, in order to select cells, the present invention uses a method of separating cells into respective branches in a fine channel having branches. Alternatively, the cells flowing through the flow path are purified by passing only the desired cells by passing the flow path by means of destroying the cells or inducing cell death (apoptosis) in the cells.

この時間比較型セルソーター技術により、表現型のそろった細胞の精製が可能となる。これにより、たとえば基板上に細胞を任意に配置する細胞チップ（臓器モデルチップ）を作成する上で、品質のそろった細胞チップを構成することができる様になる。同時に、単独で成立する分析技術として、浮遊状態で流れる細胞の代謝の違いや薬物に対する応答を、１回目のスナップ写真と２回目のスナップ写真の比較で直接計測するスクリーニング系として独立に利用することが可能となる。このとき、代謝系に特徴を持つ細胞であれば、薬剤に対する代謝などの応答特性を調べることが可能となる。   This time comparison type cell sorter technology makes it possible to purify cells having a uniform phenotype. Thereby, for example, when a cell chip (organ model chip) in which cells are arbitrarily arranged on a substrate is created, a cell chip with uniform quality can be configured. At the same time, as an independent analysis technique, it should be used independently as a screening system that directly measures the difference in metabolism of cells flowing in a floating state and the response to drugs by comparing the first and second snapshots. Is possible. At this time, if it is a cell characterized by a metabolic system, it becomes possible to examine response characteristics such as metabolism to a drug.

また、細胞を選別するために分岐流路を用いた細胞分離手段を用いることで、分離したい細胞種類の数だけの分岐によって、複数の種類の細胞を１回の分離操作で分離精製することができる。さらに、一直線の分岐を持たない流路を流れる細胞のうち、必要でない細胞を破壊あるいはアポトーシスを誘導する手段を組み込むことで、光学的照射手段のみによって、上記流路の分岐を用いた分離手段と異なり、細胞に外力を加えて細胞の移動方向を制御する手法が必要なくなり、光学的照射手段のみによって細胞を精製することが可能となる。   In addition, by using a cell separation means using a branch channel to sort cells, a plurality of types of cells can be separated and purified by a single separation operation by branching as many as the number of cell types to be separated. it can. Furthermore, by incorporating a means for destroying unnecessary cells or inducing apoptosis among the cells flowing through the flow path that does not have a straight branch, the separation means using the branch of the flow path only by the optical irradiation means In contrast, it is not necessary to apply an external force to the cells to control the direction of cell movement, and the cells can be purified only by optical irradiation means.

本発明は、流路中を流れる細胞のスナップ像を少なくても２回、所定の時間間隔で撮影し、この２回の撮影の間に細胞で変化した量（代謝量）を計測することで、細胞の代謝状態、あるいは細胞に刺激を与えたことによる応答の違いを比較計測し、比較計測結果に基づいて細胞分離を行なうものであるから、もっと単純な構成としては、流路中を流れる細胞を所定の時間を置いて２回撮影して比較することでよい。   The present invention captures a snap image of a cell flowing in a flow path at least twice at a predetermined time interval, and measures the amount (metabolism) changed in the cell during the two imaging operations. Since the cell metabolic state or the difference in response due to the stimulation of the cell is comparatively measured and the cells are separated based on the comparative measurement result, the simpler configuration is to flow in the flow path. The cells may be photographed twice for a predetermined time and compared.

図１は、本発明の最も基本的な処理工程を表す図である。細胞は流路の中を最上流から１方向に移動する。１は試料細胞（以下、細胞という）を含む懸濁液をセルソーターの流路の最上流に添加する工程である。流路の最上流に添加された細胞は流路中を下流の方向に流れる。２は流下の過程で第１の細胞識別処理により細胞の種類と状態を指定したパラメータにより１個ずつ識別する第１の識別工程である。３は細胞を流路下流の方向に流下させる時間調整工程である。４は時間調整工程３の時間が経過した後、第１の細胞識別処理で識別したのと同じ細胞を第２の細胞識別処理により再度細胞の種類と状態を指定したパラメータにより１個ずつ識別する第２の識別工程である。第２の識別工程でも細胞の種類と状態を指定したパラメータにより１個ずつ識別する。第１の細胞識別処理と第２の細胞識別処理による識別工程の間の時間は、時間調整工程３の流路長を設定することで任意の経過時間で識別することができる。５は第１の識別工程２で得られる情報と第２の識別工程４で得られる情報を比較する比較解析工程である。６は細胞分別器による細胞分別工程であり、比較解析工程５でパラメータの変化量が所定の閾値を超えていると判定された細胞については、細胞回収容器７に回収し、所定の閾値を超えていないと判定された細胞については、その他の細胞回収容器８に回収する。   FIG. 1 is a diagram showing the most basic processing steps of the present invention. The cells move in one direction in the flow path from the uppermost stream. Reference numeral 1 denotes a step of adding a suspension containing sample cells (hereinafter referred to as cells) to the uppermost stream of the flow path of the cell sorter. The cells added to the uppermost stream of the channel flow in the downstream direction in the channel. Reference numeral 2 denotes a first identification step for identifying one cell at a time in accordance with a parameter in which the type and state of the cell are designated by the first cell identification process in the flow-down process. 3 is a time adjustment process in which cells flow down in the direction downstream of the flow path. 4, after the time of the time adjustment step 3 has elapsed, the same cells identified in the first cell identification process are identified one by one by the second cell identification process, again with the parameters specifying the cell type and state. This is the second identification step. Even in the second identification step, the cells are identified one by one using parameters specifying the cell type and state. The time between the identification process by the first cell identification process and the second cell identification process can be identified at an arbitrary elapsed time by setting the channel length of the time adjustment process 3. Reference numeral 5 denotes a comparative analysis process for comparing the information obtained in the first identification process 2 and the information obtained in the second identification process 4. 6 is a cell sorting step by a cell sorter. The cells determined in the comparative analysis step 5 that the parameter change amount exceeds a predetermined threshold are collected in the cell collection container 7 and exceed the predetermined threshold. The cells determined not to be collected are collected in another cell collection container 8.

ここで、細胞を含む懸濁液は流路の断面積と懸濁液の粘度により、予め予想される流速で第１の細胞識別工程２と第２の細胞識別工程３と細胞分別工程６を通過する。第１の細胞識別工程２を通過した細胞が第２の細胞識別工程３を通過するまでは時間的な差があり、この間に細胞の代謝に変化があるものは第１の細胞識別工程２と第２の細胞識別工程３での測定結果の差が生じる。実質的に状態に変化の無い細胞では両識別工程で差が出ない。このため、細胞の状態変化を指標に細胞を分離することができる。   Here, the suspension containing the cells is subjected to the first cell identification step 2, the second cell identification step 3, and the cell sorting step 6 at a flow rate predicted in advance according to the cross-sectional area of the flow path and the viscosity of the suspension. pass. There is a time difference until the cell that has passed through the first cell identification step 2 passes through the second cell identification step 3, and during this period, the change in cell metabolism is different from the first cell identification step 2 A difference in measurement results in the second cell identification step 3 occurs. There is no difference between the two identification steps in cells that have substantially no change in state. For this reason, it is possible to separate the cells using the change in the state of the cells as an index.

図２は、図１に示した基本的な処理工程と比べ、細胞を刺激する工程が加わった処理工程を示す図である。図１と図２とを対比して明らかなように、図２では、第１の細胞識別工程２と第２の細胞識別工程３との間に、細胞を刺激する工程２３が設けられる点において、図１に示す基本的な処理工程と異なる。細胞を刺激する工程２３が加わったことから、細胞刺激により、同じ時間でも、より効果的な細胞の変異の発生が期待でき、細胞刺激により細胞がどのような変化を示すか効率よく検証できる。   FIG. 2 is a diagram showing a processing step in which a step of stimulating cells is added compared to the basic processing step shown in FIG. As is clear by comparing FIG. 1 and FIG. 2, in FIG. 2, a step 23 for stimulating cells is provided between the first cell identification step 2 and the second cell identification step 3. This is different from the basic processing steps shown in FIG. Since the step 23 for stimulating cells has been added, more effective cell mutation can be expected even at the same time due to the cell stimulation, and it is possible to efficiently verify what kind of change the cell shows due to the cell stimulation.

細胞刺激工程２３では、薬剤を流路に注入し細胞を化学的に刺激する。あるいは、流路内または流路を挟むように、電極を儲け、通過する細胞を電界により刺激する。または、流路を流れる細胞に特定波長の光や電磁波を照射して刺激し、あるいは、熱で刺激する。熱による刺激（温度ストレス）では、流路内の一定部分に光吸収体を設けて、この部分に集束光を照射して加熱したり、ペルチェ素子を流路の特定領域に接触させて、特定細胞が流路中を流れてきたときのみ温度を上げたり下げたりできる構造とすることで達成できる。   In the cell stimulation step 23, a drug is injected into the flow channel to chemically stimulate the cells. Alternatively, the electrodes are placed so as to sandwich the channel or between the channels, and the passing cells are stimulated by the electric field. Alternatively, the cells flowing in the flow path are stimulated by irradiating light or electromagnetic waves having a specific wavelength, or stimulated by heat. In the case of thermal stimulation (temperature stress), a light absorber is provided in a certain part of the flow path, and this part is irradiated with focused light and heated, or the Peltier element is brought into contact with a specific area of the flow path to specify This can be achieved by adopting a structure in which the temperature can be raised or lowered only when cells flow through the flow path.

図１、図２では、同一の細胞を所定の時間間隔で、種類と状態に着目して細胞変化を識別する工程を示しているが、識別の対象となる細胞を同定することについては説明していない。図３は、識別の対象となる細胞の同定を確実に行なうための工夫を盛り込んだ細胞変化を識別する工程を示す図である。３０は細胞を含む懸濁液をセルソーターの流路の最上流に添加する工程である。３１は細胞を１個だけ含むように懸濁液にスペーサーを挿入するスペーサー挿入工程である。すなわち、細胞を含む懸濁液の細胞ごとにスペーサーを挿入する。工程３０と工程３１は、順序を逆にしても良い。工程３１を先に実施する場合は、細胞を１個ずつに区切るスペーサーを作成するためのオイルや気相を流路内に挿入する工程でできたオイルや気相によるスペーサーで区切られた個々の領域に細胞を１個だけ含む溶液を挿入することになる。スペーサーはインデックスとして使用する。すなわち、スペーサーを構成しているオイルや気相の長さ、あるいは、オイルや気相の挿入のパターンを、このスペーサーに続いて流下して来る細胞のＩＤとして利用するのである。３９は細胞の配列情報としてのスペーサーインデックスを検出する工程である。３２はスペーサーで区切られた細胞の種類や状態を識別する工程である。工程３２を通過した細胞は工程３３−１に移動する。工程３３−１は細胞に刺激を与える工程である。刺激を受けた細胞は工程３６−１に移動する。工程３６−１は時間調整工程であるとともに、ここで所定時間インキュベーションする工程である。工程３６−１は、例えば、所定の温度に維持された所定の長さの流路をスペーサーで挟まれた細胞を含む懸濁液が通過する構成で実現される。工程３６−１でインキュベーションされた細胞は、再び、スペーサーインデックス検出工程３９、細胞識別工程３２に戻り、ここで、再度、スペーサーインデックスの検出、細胞の状態をチェックする。工程３８は細胞分別器で細胞を分別する工程である。スペーサーインデックス検出工程３９、細胞識別工程３２で得られる細胞情報を比較解析工程４２で処理し、所定のパラメータが所定の範囲にある細胞の情報が細胞分離工程３８に与えられている。比較解析工程４２から与えられる情報が所定の条件を満足しているものは容器４０−１に回収される。所定の条件を満足していない細胞は容器４０−２に回収される。   1 and 2 show a process of identifying cell changes by focusing on the type and state of the same cell at a predetermined time interval. However, identification of a cell to be identified will be described. Not. FIG. 3 is a diagram showing a step of identifying a cell change incorporating a device for reliably identifying a cell to be identified. 30 is a step of adding a suspension containing cells to the uppermost stream of the flow path of the cell sorter. 31 is a spacer insertion step in which a spacer is inserted into the suspension so as to contain only one cell. That is, a spacer is inserted for each cell in a suspension containing cells. Step 30 and step 31 may be reversed in order. When step 31 is performed first, the oil for creating spacers for separating cells one by one or individual gas-spaced spacers made by inserting oil or gas-phase into the flow path A solution containing only one cell will be inserted into the region. The spacer is used as an index. That is, the length of the oil or gas phase constituting the spacer or the pattern of insertion of the oil or gas phase is used as the ID of the cell that flows down following this spacer. 39 is a step of detecting a spacer index as cell sequence information. 32 is a process for identifying the type and state of the cells separated by the spacer. The cells that have passed through step 32 move to step 33-1. Step 33-1 is a step of stimulating the cells. The stimulated cell moves to step 36-1. Step 36-1 is a time adjustment step and is a step of incubation for a predetermined time here. Step 36-1 is realized, for example, by a configuration in which a suspension containing cells sandwiched by spacers passes through a channel having a predetermined length maintained at a predetermined temperature. The cells incubated in the step 36-1 are returned to the spacer index detection step 39 and the cell identification step 32 again, where the spacer index is detected and the cell state is checked again. Step 38 is a step of sorting cells with a cell sorter. The cell information obtained in the spacer index detection step 39 and the cell identification step 32 is processed in the comparative analysis step 42, and information on cells whose predetermined parameters are within a predetermined range is given to the cell separation step 38. Information in which the information given from the comparative analysis step 42 satisfies a predetermined condition is collected in the container 40-1. Cells that do not satisfy the predetermined conditions are collected in the container 40-2.

図３に示す工程は、識別の対象となる細胞がインデックスであるスペーサーと対になって扱われるから、細胞に刺激を与える工程３３−１と所定時間インキュベーションする工程３６−１を経過した細胞と、この工程に入る前の細胞との比較は、スペーサーによって同定されるから、異なった細胞の比較を行なうことは確実に防止できる。   In the step shown in FIG. 3, since the cell to be identified is paired with the index spacer, the step 33-1 for giving stimulation to the cell and the cell having passed the step 36-1 for incubation for a predetermined time are used. Since the comparison with the cell before entering this step is identified by the spacer, it is possible to reliably prevent comparison of different cells.

なお、比較解析工程４２から与えられる情報が所定の条件を満足していない細胞に対しては、破線で示すように、細胞に刺激を与える工程３３−２および時間調整工程と所定時間インキュベーションする工程３６−２を経て、細胞識別工程３２に戻して、先に得られている情報と新たに得られた情報を工程４２で比較処理し、工程４２の指令により、再度、細胞分別工程３８で分別することにしても良い。ここで所定の条件を満足している場合は容器４０−１に回収され、そうでないものは４０−２に回収される。この処理が可能になるのは、識別の対象となる細胞がインデックスであるスペーサーと対になって扱われるからである。すなわち、どういうルートでどのように扱われても、スペーサーの持っている細胞を特定するための情報が細胞と対として一緒に検出できるからである。なお、この場合、再評価のために独立したスペーサーインデックス検出工程３９、細胞識別工程３２が備えられていないときは、工程３０，３１による新たな細胞の流下は停止することが必要である。また、工程３０，３１による新たな細胞の流下を停止すれば、細胞に刺激を与える工程３３−１および時間調整工程と所定時間インキュベーションする工程３６−１を繰り返し実行し、その繰り返しの都度、細胞の状態を評価した後、繰り返し実行の評価結果を工程４２で比較解析して細胞分別工程３８で分別することにしても良い。   For cells whose information given from the comparative analysis step 42 does not satisfy a predetermined condition, as shown by a broken line, a step 33-2 for giving stimulation to the cell and a step for incubation with a time adjustment step for a predetermined time The process returns to the cell identification step 32 through 36-2, and the previously obtained information and the newly obtained information are compared in the step 42, and are sorted again in the cell sorting step 38 according to the command of the step 42. You may decide to do it. Here, when a predetermined condition is satisfied, it is recovered in the container 40-1, and the other is recovered in 40-2. This processing is possible because the cells to be identified are handled in pairs with spacers that are indexes. That is, information for identifying the cells possessed by the spacer can be detected together as a pair with the cells regardless of what route is used. In this case, if the independent spacer index detection step 39 and cell identification step 32 are not provided for re-evaluation, it is necessary to stop the flow of new cells in steps 30 and 31. If the flow of new cells in steps 30 and 31 is stopped, the step 33-1 for giving stimulation to the cells and the time adjustment step and the step 36-1 for incubation for a predetermined time are repeatedly executed. After evaluating the state, the evaluation result of repeated execution may be compared and analyzed in step 42 and sorted in the cell sorting step 38.

（実施例１）
図４は本発明のセルソーターチップと、このチップを利用したセルソーターの実施例１の概要を示す平面図である。実施例１は図３で説明した処理工程に基づく実施例（ただし、破線で示す処理は含まないものとした）である。細胞を流路に添加した後に細胞間にスペーサーを導入し、細胞を１個ずつ区切る機構と、個々の細胞に刺激を与える機構と、刺激を与える前後で細胞の状態を測定する、すなわち細胞スペーサーによるインデックスで特定し、細胞状態を２回測定する機構を有するセルソーターである。 Example 1
FIG. 4 is a plan view showing an outline of the cell sorter chip of the present invention and a cell sorter using the chip according to the first embodiment. The first embodiment is an embodiment based on the processing steps described in FIG. 3 (however, the processing indicated by a broken line is not included). After adding cells to the flow path, a spacer is introduced between the cells, the cells are separated one by one, the mechanism for applying stimulation to individual cells, and the state of the cells before and after applying the stimulation, that is, the cell spacer It is a cell sorter having a mechanism for measuring the cell state twice by specifying with the index by.

６１はセルソーターチップ基板であり、ポリメタクリル樹脂あるいはシクロオレフィン系樹脂を、金型に対して、射出成型あるいはホットエンボス法で作成する。一般的には、射出成型で作成するほうが微細な構造を作成する上で良い結果が得られる。基板６１の底面には流路パターンが射出成型で形成され、全面をプラスチックシートで覆って流路６４が形成される。流路６４に細胞を添加し、あるいは、スペーサー用のオイル、細胞刺激用の薬剤を添加するためには、流路６４の適当な位置に基板表面まで貫通する開口を有する添加口を形成する。また、流路から細胞を排出するためには流路６４の適当な位置に基板表面まで貫通する開口を有する外部コネクターを形成する。   Reference numeral 61 denotes a cell sorter chip substrate, which is made of polymethacrylic resin or cycloolefin-based resin by injection molding or hot embossing with respect to a mold. In general, a better result can be obtained by producing by injection molding. A flow path pattern is formed on the bottom surface of the substrate 61 by injection molding, and the flow path 64 is formed by covering the entire surface with a plastic sheet. In order to add cells to the channel 64 or to add spacer oil or cell stimulating agent, an addition port having an opening penetrating to the substrate surface is formed at an appropriate position of the channel 64. In order to discharge cells from the flow path, an external connector having an opening penetrating to the substrate surface at an appropriate position of the flow path 64 is formed.

６３−１は細胞添加口ハウジングであり、流路６４の最上流部に設けられる。６２−１は流路６４から基板６１の表面まで連通している開口である。１６１はシリンジポンプ１６３のニードルであり、細胞添加口ハウジング６３−１の上面を貫通して開口６２−１に対して垂直方向から細胞を含む懸濁液を連続して添加する。１６４はシリンジポンプ１６３の駆動装置であり、後述するパソコン３００の与える信号により操作される。６７−１はシース液供給路であり、開口６２−１にポンプ１６５-１から送り込まれるシース液を供給する。１６６はシース液溜めである。ポンプ１６５-１は後述するパソコン３００の与える信号により操作される。図５（Ａ），（Ｂ）に細胞添加口ハウジング６３−１の部分の断面を示す。（Ａ）は流路６４に沿った面で断面にしてシース液供給路６７−１の方向に見た断面図、（Ｂ）はシース液供給路６７−１に沿った面で断面にして流路６４の方向に見た断面図である。６１は基板であり、底面に流路６４が形成される。６８はプラスチックシートであり、基板６１の裏面に形成される流路６４のパターンを覆って流路６４を完成する。開口６２−１が基板６１の裏面に形成される流路６４から基板６１の表面まで延びている。シース液供給路６７−１は基板６１の表面で開口６２−１と結合する。   63-1 is a cell addition port housing and is provided in the most upstream part of the flow path 64. 62-1 is an opening communicating from the flow path 64 to the surface of the substrate 61. Reference numeral 161 denotes a needle of the syringe pump 163, which continuously adds a suspension containing cells from the vertical direction through the upper surface of the cell addition port housing 63-1 to the opening 62-1. Reference numeral 164 denotes a drive device for the syringe pump 163, which is operated by a signal given by the personal computer 300 described later. Reference numeral 67-1 denotes a sheath liquid supply path for supplying the sheath liquid fed from the pump 165-1 to the opening 62-1. Reference numeral 166 denotes a sheath liquid reservoir. The pump 165-1 is operated by a signal given by the personal computer 300 described later. 5A and 5B show a cross section of the cell addition port housing 63-1. (A) is a cross-sectional view taken along the plane along the flow path 64 and viewed in the direction of the sheath liquid supply path 67-1, and (B) is a cross-sectional view taken along the plane along the sheath liquid supply path 67-1. FIG. 6 is a cross-sectional view seen in the direction of the path 64. 61 is a board | substrate and the flow path 64 is formed in a bottom face. A plastic sheet 68 covers the pattern of the flow path 64 formed on the back surface of the substrate 61 and completes the flow path 64. An opening 62-1 extends from a flow path 64 formed on the back surface of the substrate 61 to the surface of the substrate 61. The sheath liquid supply path 67-1 is coupled to the opening 62-1 on the surface of the substrate 61.

ニードル１６１は細胞添加口ハウジング６３−１の上部を貫通して、開口６２−１の中心部に突き出る構造とされ、シース液供給路６７−１から供給されるシース液はニードル１６１の周りを流れる構造となっているので、ニードル１６１より添加される細胞を含む懸濁液の周囲には流路６７−１より供給されるシース液の相が形成される。ニードル１６１より添加された細胞４１はシース液により流路６４の中央部に１列に整列され、かつ、細胞間隔はシース液により引き伸ばされる。各部のサイズを見ると、基板６１の厚さは１〜２ｍｍ、流路６４は２０〜５０μｍ（高さ）×２０〜５０μｍ（幅）、プラスチックシート６８の厚さは５０〜１７０μｍ、開口６２−１は５００〜６００μｍφ、ニードル１６１は２００μｍφ、ニードル１６１の開口は細胞より大きければよい、といった程度である。   The needle 161 passes through the upper part of the cell addition port housing 63-1, and protrudes to the center of the opening 62-1. The sheath liquid supplied from the sheath liquid supply path 67-1 flows around the needle 161. Since it has a structure, a phase of the sheath liquid supplied from the channel 67-1 is formed around the suspension containing the cells added from the needle 161. The cells 41 added from the needle 161 are aligned in a row at the center of the flow path 64 by the sheath liquid, and the cell interval is extended by the sheath liquid. Looking at the size of each part, the thickness of the substrate 61 is 1-2 mm, the flow path 64 is 20-50 μm (height) × 20-50 μm (width), the thickness of the plastic sheet 68 is 50-170 μm, and the opening 62 − 1 is 500 to 600 μmφ, the needle 161 is 200 μmφ, and the opening of the needle 161 may be larger than the cell.

図４に戻り説明する。５６は細胞検出領域で、細胞添加口ハウジング６３−１の下流の流路６４に設けられる。細胞４１が流路６４を流れてくるとき、この領域で細胞を検出する。細胞検出領域５６で細胞を検出するのは、細胞で光の透過が阻止される時間を検出することで容易に検出できる。細胞検出領域５６で細胞が検出されたことは後述するパソコン３００に入力する。細胞検出領域５６の下流の流路６４にはインデックス用のオイルが供給される流路６４−２が連結されている。流路６４−２の端部には、オイル添加コネクター６３−２が設けられる。６２−２は流路６４−２の端部から基板６１の表面まで連通しており、配管６７−２が結合している。６７−２はオイル供給路であり、コネクター６２−２を介した流路６４−２にポンプ１６５-２から送り込まれるオイルを供給する。１６７はオイル溜めである。ポンプ１６５-２は後述するパソコン３００の与える信号により操作される。図６はオイル添加コネクター６３−２の部分の断面を示す図である。流路６４−２に沿った面で見た断面図である。６１は基板であり、底面に流路６４−２が形成される。６８はプラスチックシートである。開口６２−２が基板６１の裏面に形成される流路６４−２から基板６１の表面まで延びている。オイル供給路６７−２は基板６１の表面で開口６２−２と結合する。   Returning to FIG. A cell detection area 56 is provided in the flow path 64 downstream of the cell addition port housing 63-1. When the cell 41 flows through the flow path 64, the cell is detected in this region. The detection of cells in the cell detection region 56 can be easily detected by detecting the time during which light transmission is blocked by the cells. The fact that a cell is detected in the cell detection area 56 is input to a personal computer 300 described later. A flow path 64-2 to which index oil is supplied is connected to the flow path 64 downstream of the cell detection region 56. An oil addition connector 63-2 is provided at the end of the flow path 64-2. 62-2 communicates from the end of the flow path 64-2 to the surface of the substrate 61, and a pipe 67-2 is coupled thereto. 67-2 is an oil supply path, which supplies oil fed from the pump 165-2 to the flow path 64-2 via the connector 62-2. Reference numeral 167 denotes an oil reservoir. The pump 165-2 is operated by a signal given by the personal computer 300 described later. FIG. 6 is a view showing a cross section of a portion of the oil addition connector 63-2. It is sectional drawing seen in the surface along the flow path 64-2. 61 is a board | substrate and the flow path 64-2 is formed in the bottom face. 68 is a plastic sheet. An opening 62-2 extends from the flow path 64-2 formed on the back surface of the substrate 61 to the surface of the substrate 61. The oil supply path 67-2 is coupled to the opening 62-2 on the surface of the substrate 61.

図４に戻り説明する。流路６４の流路６４−２より下流部には流路６４−２より注入されたインデックス用のオイルを検出するインデックス検出領域５７−１が設けられるとともに、これに続けて、細胞識別領域５８−１が設けられる。インデックス検出領域５７−１でオイルを検出するのは、オイルで光の透過が阻止される（あるいは低減される）時間を検出することで容易に検出できる。さらに、オイルに色素を混入させることで、より検出を容易にすることができる。検出領域５７−１でオイルが検出されたことは後述するパソコン３００に入力する。細胞識別領域５８−１では、後述するパソコン３００により与えられる撮像タイミング信号により、流路６４を流下している細胞を撮像する。   Returning to FIG. An index detection area 57-1 for detecting the index oil injected from the flow path 64-2 is provided downstream of the flow path 64-2 of the flow path 64, and subsequently, the cell identification area 58 is provided. -1 is provided. The detection of oil in the index detection region 57-1 can be easily detected by detecting a time during which light transmission is blocked (or reduced) by the oil. Furthermore, detection can be facilitated by mixing a pigment into the oil. The fact that oil has been detected in the detection area 57-1 is input to the personal computer 300 described later. In the cell identification area 58-1, the cells flowing down the flow path 64 are imaged by an imaging timing signal given by the personal computer 300 described later.

流路６４の細胞識別領域５８−１の下流に細胞刺激領域５９が設けられる。細胞刺激領域５９では細胞刺激用の刺激物質溶液が供給される流路６４−３が流路６４に連結されている。流路６４−３の端部には、刺激物質溶液添加口ハウジング６３−３が設けられる。６２−３は流路６４−３の端部から基板６１の表面まで連通している開口である。６７−３は刺激物質溶液供給路であり、開口６２−３にポンプ１６５-３から送り込まれるオイルを供給する。１６８は刺激物質溶液溜めである。ポンプ１６５-３は後述するパソコン３００の与える信号により操作される。刺激物質溶液添加口ハウジング６３−３の構成は、図６で説明したオイル添加コネクター６３−２と同じであるから、断面図による説明は省略する。   A cell stimulation region 59 is provided downstream of the cell identification region 58-1 of the flow path 64. In the cell stimulation region 59, a channel 64-3 to which a stimulating substance solution for cell stimulation is supplied is connected to the channel 64. A stimulating substance solution addition port housing 63-3 is provided at the end of the flow path 64-3. 62-3 is an opening communicating from the end of the flow path 64-3 to the surface of the substrate 61. 67-3 is an irritant solution supply path for supplying oil fed from the pump 165-3 to the opening 62-3. Reference numeral 168 denotes a stimulant solution reservoir. The pump 165-3 is operated by a signal given by the personal computer 300 described later. The configuration of the stimulating substance solution addition port housing 63-3 is the same as that of the oil addition connector 63-2 described with reference to FIG.

流路６４の細胞刺激領域５９の下流に時間調整器６０が設けられる。時間調整器６０には、流路６４に連結された流路６０−１が備えられ、流路６４を流下する細胞に必要な時間インキュベーションを行なう。流路６０−１は流路６４と同じ断面積の流路でよい。この領域は、必要により温度制御を施すものとするのがよい。   A time adjuster 60 is provided downstream of the cell stimulation region 59 in the flow path 64. The time adjuster 60 includes a flow channel 60-1 connected to the flow channel 64, and performs incubation for a time necessary for cells flowing down the flow channel 64. The channel 60-1 may be a channel having the same cross-sectional area as the channel 64. This region is preferably temperature-controlled if necessary.

流路６４の時間調整器６０の下流にインデックス用のオイルを検出するインデックス検出領域５７−２が設けられるとともに、これに続けて、細胞識別領域５８−２が設けられる。インデックス検出領域５７−２はインデックス検出領域５７−１と同様に、オイルで光の透過が阻止される（あるいは低減される）時間を検出することで容易にオイルを検出できる。検出領域５７−２でオイルが検出されたことは後述するパソコン３００に入力する。細胞識別領域５８−２では、細胞識別領域５８−１と同様、後述するパソコン３００により与えられる撮像タイミング信号により、流路６４を流下している細胞を撮像する。   An index detection area 57-2 for detecting index oil is provided downstream of the time adjuster 60 in the flow path 64, and a cell identification area 58-2 is provided following this. Similar to the index detection region 57-1, the index detection region 57-2 can easily detect oil by detecting the time during which light transmission is blocked (or reduced) by oil. The fact that oil has been detected in the detection region 57-2 is input to the personal computer 300 described later. In the cell identification area 58-2, as in the cell identification area 58-1, the cells flowing down the flow path 64 are imaged by an imaging timing signal given by the personal computer 300 described later.

流路６４の細胞識別領域５８−２の下流に回収用流路６４−５、６４−６を接続し、それぞれに止め弁６５―１，６５−２を設け、外部コネクター６６−１または６６−２からそれぞれの回収用流路を流下してくる細胞を回収する。止め弁６５―１，６５−２の操作は後述するパソコン３００により制御される。止め弁６５の構造を図２０（Ａ）に示す。基板６１の止め弁部には穴９９９が開いており、シリコンラバーの構造体１０００が装着さている。シリコンラバー構造体は外部からのピン１００１による押し付けで、図２０（Ｂ）のように流路６４をふさぐことができる。ピン１００１の圧力を除くと図２０（Ａ）のようにシリコンラバーの弾性で基に戻り、流路６４が貫通する。   The recovery channels 64-5 and 64-6 are connected downstream of the cell identification region 58-2 of the channel 64, and stop valves 65-1 and 65-2 are respectively provided to the external connectors 66-1 or 66-. 2. Collect the cells flowing down through the collection channels from 2. The operation of the stop valves 65-1 and 65-2 is controlled by a personal computer 300 described later. The structure of the stop valve 65 is shown in FIG. A hole 999 is opened in the stop valve portion of the substrate 61, and a silicon rubber structure 1000 is attached. The silicon rubber structure can be blocked by pressing with a pin 1001 from the outside as shown in FIG. When the pressure of the pin 1001 is removed, the flow returns to the base due to the elasticity of the silicon rubber as shown in FIG.

図７は、セルソーターチップの細胞検出領域５６、インデックス検出領域５７−１，５７−２、細胞識別領域５８−１、５８−２と、それぞれの領域の光学系の関係の概略を示す図であり、図８は、パソコンによる操作の処理に関するフローチャートの概要を示す図である。図７において、セルソーターチップの基板６１は細胞添加口ハウジング６３−１が端部に設けられた流路６４に沿った断面とされているが、インデックス検出領域５７−２、細胞識別領域５８−２は、便宜上、この流路６４に存在するものとして表示した。   FIG. 7 is a diagram showing an outline of the relationship between the cell detection area 56, the index detection areas 57-1 and 57-2, the cell identification areas 58-1 and 58-2 of the cell sorter chip, and the optical system of each area. FIG. 8 is a diagram showing an outline of a flowchart regarding operation processing by a personal computer. In FIG. 7, the substrate 61 of the cell sorter chip has a cross section along the flow path 64 in which the cell addition port housing 63-1 is provided at the end, but the index detection region 57-2 and the cell identification region 58-2. Is indicated as existing in the flow path 64 for convenience.

流路６４の最上流には、細胞添加口ハウジング６３−１が設けられ、細胞検出領域５６、インデックス検出領域５７−１、細胞識別領域５８−１、インデックス検出領域５７−２、細胞識別領域５８−２が流路に沿って設けられる。細胞検出領域５６、インデックス検出領域５７−１，５７−２では、光の有無、あるいは強弱を検出できればよいから、光源１１とフォトダイオード１２からなる簡易な光学系が設けられる。細胞識別領域５８−１、５８−２では、領域を通過する細胞の像を撮る必要があるから、いわゆる顕微鏡の機能を持つ光源１３と撮像装置１４からなる光学系が設けられる。細胞検出領域５６、インデックス検出領域５７−１，５７−２のフォトダイオード１２−１，１２−２，１２−３のオン、オフ信号はパソコン３００に入力される。細胞識別領域５８−１、５８−２の映像は、パソコン３００の指示により撮像装置１４−１，１４−２によって撮影され、この画像信号はパソコン３００に入力される。パソコン３００には、これらの計測データのほかに、使用者が与える各種の設定値等のデータ（操作入力）が入力される。   A cell addition port housing 63-1 is provided in the uppermost stream of the flow path 64, and includes a cell detection region 56, an index detection region 57-1, a cell identification region 58-1, an index detection region 57-2, and a cell identification region 58. -2 is provided along the flow path. In the cell detection area 56 and the index detection areas 57-1 and 57-2, a simple optical system including the light source 11 and the photodiode 12 is provided because it is only necessary to detect the presence or absence or intensity of light. In the cell identification regions 58-1 and 58-2, since it is necessary to take an image of cells passing through the region, an optical system including a light source 13 having a so-called microscope function and an imaging device 14 is provided. On / off signals of the photodiodes 12-1, 12-2, and 12-3 in the cell detection region 56 and the index detection regions 57-1 and 57-2 are input to the personal computer 300. The images of the cell identification regions 58-1 and 58-2 are taken by the imaging devices 14-1 and 14-2 according to instructions from the personal computer 300, and the image signals are input to the personal computer 300. In addition to these measurement data, the personal computer 300 receives data (operation inputs) such as various setting values given by the user.

パソコン３００では、これらの入力に応じて、あらかじめ与えられているプログラムに従って所定の操作を行なう。この処理に関するフローチャートの概要を図８に示す。ＳＴＡＲＴは使用者が分別したい細胞を含む懸濁液をシリンジポンプ１６３に入れて、ニードル１６１を細胞添加口ハウジング６３−１に装着した後、パソコン３００にスタート指示を入力したことを意味する。この段階で、パソコン３００はセルソーターチップの初期化を実行する。例えば、ポンプ１６５-１，１６５-２および１６５-３を短時間運転する指示をだす。その結果、流路６４は全領域がシース液で満たされ、流路６４−２は全領域がオイルで満たされ、流路６４−３は全領域が細胞刺激用の刺激物質溶液で満たされる。このことは、以後の処理に対して、パソコン３００の指示に遅滞無く応答できるようになることを意味する。   The personal computer 300 performs a predetermined operation in accordance with a program given in advance in response to these inputs. An outline of a flowchart relating to this processing is shown in FIG. START means that the user puts the suspension containing the cells to be sorted into the syringe pump 163, attaches the needle 161 to the cell addition housing 63-1, and then inputs a start instruction to the personal computer 300. At this stage, the personal computer 300 executes initialization of the cell sorter chip. For example, an instruction to operate the pumps 165-1, 165-2, and 165-3 for a short time is issued. As a result, the entire area of the flow path 64 is filled with the sheath liquid, the entire area of the flow path 64-2 is filled with oil, and the entire area of the flow path 64-3 is filled with the stimulating substance solution for cell stimulation. This means that it becomes possible to respond to instructions from the personal computer 300 without delay for subsequent processing.

ステップ３０１はポンプ１６５-１の運転指示である。ステップ３０２は駆動装置１６４の運転指示である。ステップ３０３は細胞検出領域５６で細胞が検出されたか否かをチェックする。すなわち、ステップ３０３で細胞が検出されたと判定されるまで、シース液を供給しながら、細胞を含む懸濁液を流路６４に供給する。ステップ３０３で細胞が検出されたと判定されると、ステップ３０４でポンプ１６５−１の運転停止を指示し、さらに、ステップ３０５で駆動装置１６４の運転停止を指示することにより、細胞を流路６４の細胞検出領域５６近傍に保持する。一方、且つ、ステップ３０６でポンプ１６５−２の運転を指示し、次いで、ステップ３０７で、細胞の検出ごとに決まるポンプ１６５−２の所定の運転時間が経過したか否かをチェックする。すなわち、ステップ３０７でポンプ１６５−２の運転時間が細胞の検出ごとに決められている所定時間に達したと判定されるまで、検出された細胞が流路６４を流下するのを停止し、インデックス用のオイルを流路６４−２から流路６４に供給する。すなわち、細胞の検出の順番に応じた長さのインデックス用のオイルを流路６４に注入することになる。ステップ３０７で所定時間に達したと判定されると、ステップ３０８でポンプ１６５−２の運転停止を指示するとともに、ステップ３０１に戻り、流路６４に細胞を含む懸濁液とシース液を注入する。   Step 301 is an operation instruction for the pump 165-1. Step 302 is an operation instruction for the driving device 164. Step 303 checks whether or not a cell is detected in the cell detection area 56. That is, the suspension containing the cells is supplied to the flow path 64 while supplying the sheath liquid until it is determined in step 303 that the cells have been detected. If it is determined in step 303 that a cell has been detected, the operation of pump 165-1 is instructed in step 304, and further, the operation of drive device 164 is instructed in step 305. It is held near the cell detection region 56. On the other hand, in step 306, the operation of the pump 165-2 is instructed, and then in step 307, it is checked whether or not a predetermined operation time of the pump 165-2 determined for each cell detection has elapsed. That is, until it is determined in step 307 that the operation time of the pump 165-2 has reached a predetermined time determined for each cell detection, the detected cells stop flowing down the flow path 64, and the index Is supplied from the flow path 64-2 to the flow path 64. That is, the index oil having a length corresponding to the detection order of the cells is injected into the flow path 64. If it is determined in step 307 that the predetermined time has been reached, in step 308, the pump 165-2 is instructed to stop operation, and the process returns to step 301 to inject a suspension containing cells and sheath fluid into the flow path 64. .

この結果、再び、ステップ３０３で細胞が検出されたと判定されるまで、インデックス用のオイルに続いて最初に検出された細胞を流路６４に流下させることができる。再び、ステップ３０３で細胞が検出されたと判定されると、細胞の流下を停止して、長さの異なるインデックス用のオイルを流路６４に挿入した後、ステップ３０１に戻り、流路６４に細胞を含む懸濁液とシース液を注入する処理を繰り返す。   As a result, the cells detected first after the index oil can be caused to flow down to the flow path 64 until it is determined again in step 303 that the cells are detected. When it is determined again in step 303 that the cells have been detected, the flow of the cells is stopped, and indexing oils having different lengths are inserted into the flow path 64, and then the process returns to step 301, and the cells flow into the flow path 64. The process of injecting the suspension containing the sheath liquid and the sheath liquid is repeated.

流路６４には、したがって、インデックス用のオイルと細胞の対が、次々に流下することになる。ステップ３０９で、インデックス検出領域５７−１の信号を検出し、パソコン３００に送る。ステップ３１０で、パソコン３００はインデックス検出領域５７−１の信号の検出に応じて撮像装置１４−１に細胞識別領域５８−１の映像の取得指示を与える。これにより撮像装置１４−１によって細胞識別領域５８−１の映像が撮影され、この画像信号がパソコン３００に入力される。ステップ３１１で、インデックス検出領域５７−１の信号の検出から所定時間が経過したか判定する。すなわち、分別されるべき細胞が流路６４の細胞識別領域５８−１の下流の細胞刺激領域５９に到達したか否かが判定される。ステップ３１１で所定時間が経過したと判定されると、ステップ３１２でポンプ１６５−３の運転を指示する。ポンプ１６５−３の運転により、細胞刺激領域５９の流路６４に細胞刺激用の刺激物質溶液が供給される。ステップ３１３でポンプ１６５−３の運転時間が所定時間を経過したか否か判定される。所定時間を経過したと判定されるとステップ３１４でポンプ１６５−３の運転停止が指示される。この所定時間内に細胞刺激領域５９で流路６４に供給される刺激物質溶液の量がインデックス用のオイルで区切られた領域にある懸濁液およびシース液量の２０％程度までなら、微量であるので、駆動装置１６４および他のポンプ１６５−１，１６５−２を停止する必要は無い。   Therefore, the index oil and cell pairs flow down in the flow path 64 one after another. In step 309, the signal in the index detection area 57-1 is detected and sent to the personal computer 300. In step 310, the personal computer 300 gives an image acquisition instruction for the cell identification area 58-1 to the imaging device 14-1 in response to detection of the signal in the index detection area 57-1. As a result, an image of the cell identification region 58-1 is captured by the imaging device 14-1, and this image signal is input to the personal computer 300. In step 311, it is determined whether a predetermined time has elapsed since the detection of the signal in the index detection area 57-1. That is, it is determined whether or not the cells to be sorted have reached the cell stimulation region 59 downstream of the cell identification region 58-1 of the flow path 64. If it is determined in step 311 that the predetermined time has elapsed, in step 312, operation of the pump 165-3 is instructed. By the operation of the pump 165-3, the stimulating substance solution for cell stimulation is supplied to the flow path 64 of the cell stimulation region 59. In step 313, it is determined whether the operation time of the pump 165-3 has passed a predetermined time. If it is determined that the predetermined time has elapsed, in step 314, the operation of the pump 165-3 is instructed to stop. If the amount of the stimulating substance solution supplied to the flow path 64 in the cell stimulation region 59 within this predetermined time is up to about 20% of the suspension and sheath fluid amount in the region partitioned by the indexing oil, the amount is very small. Therefore, it is not necessary to stop the driving device 164 and the other pumps 165-1 and 165-2.

ステップ３１５で、インデックス検出領域５７−２の信号を検出し、パソコン３００に送る。ステップ３１６で、パソコン３００はインデックス検出領域５７−２の信号の検出に応じて撮像装置１４−２に細胞識別領域５８−２の映像の取得指示を与える。これにより撮像装置１４−２によって細胞識別領域５８−２の映像が撮影され、この画像信号がパソコン３００に入力される。ステップ３１７で、インデックス検出領域５７−１，５７−２の信号が同じレベルにあるインデックスに続いて現れる細胞の映像比較を行なう。ステップ３１８で、同じレベルにあるインデックスの細胞の差が所定値を越えているときは止め弁６５―１，６５−２を操作し、止め弁６５―１を閉、６５−２を開として流路６４を回収用流路６４−６に接続し、外部コネクター６６−２から細胞を回収し、所定値内にあれば、、止め弁６５―１を開、６５−２を閉として流路６４を回収用流路６４−５に接続し、外部コネクター６６−１から細胞を回収する。   In step 315, the signal in the index detection area 57-2 is detected and sent to the personal computer 300. In step 316, the personal computer 300 gives an image acquisition instruction for the cell identification area 58-2 to the imaging device 14-2 in response to the detection of the signal in the index detection area 57-2. As a result, an image of the cell identification region 58-2 is captured by the imaging device 14-2, and this image signal is input to the personal computer 300. In step 317, image comparison is performed for cells that appear following the index in which the signals in the index detection areas 57-1 and 57-2 are at the same level. In step 318, when the difference between the cells of the index at the same level exceeds a predetermined value, the stop valves 65-1 and 65-2 are operated, the stop valve 65-1 is closed, and the flow is started with 65-2 open. The channel 64 is connected to the recovery channel 64-6, and the cells are recovered from the external connector 66-2. If the cell 64 is within the predetermined value, the stop valve 65-1 is opened and the channel 65-2 is closed. Is connected to the recovery flow path 64-5, and the cells are recovered from the external connector 66-1.

このように、実施例１では、細胞刺激用の刺激物質溶液で刺激を受ける前後の細胞の映像がパソコンで比較されるに際し、インデックスオイルで同一のコードが与えられた細胞について行われるから、異なった細胞のデータを比較するということは無い。   Thus, in Example 1, when the images of the cells before and after being stimulated with the stimulating substance solution for cell stimulation are compared on the personal computer, the comparison is performed on the cells given the same code with the index oil. There is no comparison of the data of the cells.

ここで、オイル区切によるインデックスの具体例についてみると、流路６４が幅２０μｍで深さ２５μｍの場合、オイル長さが４０μｍ以上１０００μｍ程度までの範囲で作成するのが実用的に有効である。オイル長の差はオイル長さが４０μｍから２００μｍ程度までは２０μｍの差で作成すれば容易に区別できる。すなわち、４０μｍ、６０μｍ、８０μｍ、１００μｍなどは長さの区別がきる。２００μｍより長いオイル区切りを区別するには長さそのものの誤差があるのでオイル長の２０％の差をつけることでお互いに長さの違うオイル区切りを区別できる。   Here, regarding a specific example of an index by oil separation, when the flow path 64 is 20 μm wide and 25 μm deep, it is practically effective to create an oil length in the range of 40 μm to 1000 μm. The difference in the oil length can be easily distinguished if the oil length is 40 μm to 200 μm with a difference of 20 μm. That is, 40 μm, 60 μm, 80 μm, 100 μm, etc. can be distinguished from each other. Since there is an error in the length itself to distinguish an oil break longer than 200 μm, it is possible to distinguish between oil breaks having different lengths by making a difference of 20% of the oil length.

なお、実施例１に示す基板６１には、図７からも明らかなように、細胞検出領域５６、インデックス検出領域５７−１，５７−２および細胞識別領域５８−１，５８−２に、それぞれの細胞検出器、インデックス検出器、細胞識別器が実装されるわけではない。これらの装置は、光の遮蔽で物質が認識できる程度の光学系、あるいは、細胞を識別できるレベルの顕微鏡の機能を持った光学系で構成されるので、本発明によるセルソーターをこの光学系に装着して細胞分離を行なうことになる。このことは、ポンプによる液体の注入についても同様であり、各ポンプに連結された供給路を各添加口ハウジングに、適当な連絡具、例えば、キャピラリーチューブで連結するものとされる。   As is clear from FIG. 7, the substrate 61 shown in Example 1 has cell detection areas 56, index detection areas 57-1 and 57-2, and cell identification areas 58-1 and 58-2, respectively. Cell detectors, index detectors, and cell identifiers are not implemented. These devices are composed of an optical system that can recognize a substance by shielding light, or an optical system that has a microscopic function that can identify cells. Therefore, the cell sorter according to the present invention is attached to this optical system. Cell separation. The same applies to the liquid injection by the pump, and the supply path connected to each pump is connected to each addition port housing by an appropriate communication device such as a capillary tube.

（実施例２）
実施例２では、細胞刺激領域５９が物理的な刺激を与える構成である場合の例を説明する。セルソーターの構成としては、図４に示す細胞刺激領域５９が変更される他は、実施例１と同じ構成である。物理的な刺激の第１例では通過する細胞を電気的に刺激する方法である。この場合には、図４に示した流路６４−３から刺激物質溶液溜め１６８の構成は不要となり、代わりに流路６４に電極を設けることが必要となる。図９は流路６４に配置された細胞刺激領域５９に電極５９−２と５９−３を設けた例を示す平面図である。電極５９−２と５９−３にはそれぞれ外部から電気的な入力を与えるためのリード部分５９−４と５９−５が接続されている。いずれも薄膜であり、基板６１を成形した段階で流路６４の細胞刺激領域５９の領域に作成される。電極５９−２と５９−３は基板上にクロムを蒸着した後に白金を蒸着して作成する。電気刺激としては、細胞が通過するときに電極５９−２と５９−３間に数ｋＨｚから数十ＭＨｚの高周波、直流矩形波など必要に応じて使用する。 (Example 2)
In the second embodiment, an example in which the cell stimulation region 59 is configured to give physical stimulation will be described. The configuration of the cell sorter is the same as that of the first embodiment except that the cell stimulation area 59 shown in FIG. 4 is changed. The first example of physical stimulation is a method of electrically stimulating passing cells. In this case, the configuration of the stimulating substance solution reservoir 168 from the flow path 64-3 shown in FIG. 4 is not necessary, and an electrode is required to be provided in the flow path 64 instead. FIG. 9 is a plan view showing an example in which electrodes 59-2 and 59-3 are provided in the cell stimulation region 59 arranged in the flow path 64. Lead portions 59-4 and 59-5 are connected to the electrodes 59-2 and 59-3, respectively, for applying electrical input from the outside. Both are thin films, and are formed in the region of the cell stimulation region 59 of the flow path 64 when the substrate 61 is formed. The electrodes 59-2 and 59-3 are prepared by depositing chromium on the substrate and then depositing platinum. As electrical stimulation, a high frequency of several kHz to several tens of MHz, a DC rectangular wave, or the like is used between the electrodes 59-2 and 59-3 when cells pass.

一例として、５ｋＨｚの高周波（サイン波）を外部に接続したパルスジェネレーターで発生させ、電極５９−２と５９−３の間に常に印加する。両電極の流路方向の長さは２５μｍで、間隔は２５μｍである。電極部位の流路６４の流路断面は２５×２５μｍの矩形である。細胞は１００μｍ／ｓで流れてくるように調整してある。両電極は同一平面上に作成しているので、電気力線のかかり方は実質電極５９−２と電極５９−３の間の２５μｍ領域程度となる。したがって高周波にさらされるのは約２５０ｍｓということになる。電圧は１ｋＶとする。ヒト白血球の混合物を流路６４に流し、細胞識別領域５８−１通過後に図９の電極構造を用いて上記条件の高周波刺激を与える。時間調整器６０の流路６０−１の流路長を６０ｍｍとすると、他の流路を通過する時間も含めて細胞識別領域５８−２を同じ細胞が通過する間隔はおおよそ１４分かかる。この間に、細胞の形状が球形から変化するものが約１２％存在する。細胞形状を細胞識別領域５８−１，５８−２から得られる画像信号をパソコン３００で逐次処理し比較する。同一細胞の２枚の画像の比較結果から自動的にパソコン３００が判断してバルブ６５に指令を出し、形状の変化が見られる細胞を外部コネクター６６−２のほうへ振り分ける。形状に変化の見られないと判断される細胞は外部コネクター６６−１のほうに振り分ける。   As an example, a high frequency (sine wave) of 5 kHz is generated by a pulse generator connected to the outside, and is always applied between the electrodes 59-2 and 59-3. The length of both electrodes in the flow path direction is 25 μm, and the interval is 25 μm. The cross section of the flow path 64 of the electrode part is a rectangle of 25 × 25 μm. The cells are adjusted to flow at 100 μm / s. Since both electrodes are formed on the same plane, the method of applying the electric lines of force is about a 25 μm region between the electrode 59-2 and the electrode 59-3. Therefore, exposure to high frequency is about 250 ms. The voltage is 1 kV. A mixture of human leukocytes is passed through the flow path 64, and after passing through the cell identification region 58-1, high-frequency stimulation under the above conditions is applied using the electrode structure of FIG. Assuming that the flow path length of the flow path 60-1 of the time adjuster 60 is 60 mm, it takes approximately 14 minutes for the same cell to pass through the cell identification region 58-2 including the time for passing through the other flow paths. During this time, there are about 12% of cells whose shape changes from spherical. The image signals obtained from the cell identification regions 58-1 and 58-2 are sequentially processed by the personal computer 300 for comparison. The personal computer 300 automatically determines from the comparison result of two images of the same cell, issues a command to the valve 65, and distributes the cell in which the shape is changed to the external connector 66-2. Cells that are judged not to change in shape are distributed to the external connector 66-1.

物理的な刺激の他の例としては、流路を流れる細胞に特定波長の光や電磁波を照射して刺激する方法である。図１０は光照射で細胞を刺激する場合の照射光学系と細胞刺激領域５９の構成を示す断面図である。特定波長の光を発生する光源５９−６の光をレンズで絞って集束光５９−７として、プラスチックシート６８、基板６１を通して、流路６４を流れる細胞４１に照射する。細胞がシロイヌナズナの細胞、集束光５９−７の波長を５１４ｎｍで、０．３ｍＷ、時間調整器６０の流路６０−１の流路長を６０ｍｍとして集束光被爆前と被爆後の細胞を細胞識別領域５８−１，５８−２で観察し、画像をパソコンに取り込んで比較する。この場合、シロイヌナズナの細胞は集束光被爆前に比較し、集束光被爆後では細胞質の葉緑体が配向し、見かけ上面積が少なくなったような状態の細胞が検出される。この変化に着目して、細胞を分離できる。ＵＶ光やＸ線も外部から細胞刺激領域５９に照射することが可能である。   Another example of physical stimulation is a method of stimulating a cell flowing through a channel by irradiating it with light or electromagnetic waves having a specific wavelength. FIG. 10 is a cross-sectional view showing the configuration of the irradiation optical system and the cell stimulation region 59 when cells are stimulated by light irradiation. The light from a light source 59-6 that generates light of a specific wavelength is focused by a lens and irradiated as focused light 59-7 to the cells 41 flowing through the flow path 64 through the plastic sheet 68 and the substrate 61. The cell is an Arabidopsis cell, the wavelength of the focused light 59-7 is 514 nm, 0.3 mW, the channel length of the channel 60-1 of the time adjuster 60 is 60 mm, and the cells before and after exposure to the focused light are identified. The observation is made in the regions 58-1 and 58-2, and the images are taken into a personal computer and compared. In this case, Arabidopsis thaliana cells are detected in a state where the cytoplasmic chloroplasts are oriented and the apparent area is reduced after the focused light exposure, compared to before the focused light exposure. Focusing on this change, the cells can be separated. It is possible to irradiate the cell stimulation region 59 from the outside with UV light or X-rays.

光の照射に代えて、細胞刺激領域５９で細胞を磁場にさらすことも可能である。この場合はコーン状に絞ったサマリウム／コバルト系やネオジウム系のような強力な希土類磁石を用いる。磁石先端から細胞までの距離は１００μｍ程度で数Ｔの磁場に曝露する前後の細胞状態比較から特定の細胞群を分離することを試みることができる。細胞内のスピンラジカル反応は強磁場の影響を受ける可能性があるので、磁場感受性の細胞を検出分離することができる可能性がある。   Instead of irradiating with light, the cells can be exposed to a magnetic field in the cell stimulation region 59. In this case, a strong rare earth magnet such as a samarium / cobalt type or neodymium type constricted in a cone shape is used. The distance from the tip of the magnet to the cell is about 100 μm, and it is possible to try to separate a specific cell group from a cell state comparison before and after exposure to a magnetic field of several T. Since the intracellular spin radical reaction may be affected by a strong magnetic field, it may be possible to detect and separate magnetic field sensitive cells.

細胞刺激領域５９で、細胞を熱による刺激（温度ストレス）にさらすことができる。細胞刺激領域５９の流路６４のプラスチックシート６８の外面に光吸収体を固着させ、これに集束光を照射して加熱することができる。あるいは、光吸収体に代えて、ペルチェ素子を固着させ、細胞が流路６４を流下してきたときのみ温度を上げたり下げたりできる構造とすることで達成できる。   In the cell stimulation region 59, the cell can be exposed to heat stimulation (temperature stress). A light absorber can be fixed to the outer surface of the plastic sheet 68 in the flow path 64 of the cell stimulation region 59, and it can be heated by being irradiated with focused light. Alternatively, it can be achieved by fixing the Peltier element in place of the light absorber and having a structure in which the temperature can be raised or lowered only when the cells flow down the flow path 64.

（実施例３）
実施例３では、他のインデックス用オイルのパターンの作成例を示す。実施例１では、インデックス用オイルの長さを細胞に対応させるものとして説明したが、実施例３では“１”、“０”でコード化されたパターンとする例について、図１１を参照して説明する。図１１は、図４の細胞検出領域５６の下流の流路６４に連結されているインデックス用のオイルが供給される流路６４−２に対応する部分を示す図である。流路６４−２の流路６４とオイル添加口ハウジング６３−２との間に流路６４−４を連結し、流路６４−４の端部には水添加口ハウジング６３−４を設ける。６２−４は流路６４−４の端部から基板６１の表面まで連通している開口である。水添加口ハウジング６３−４の開口６２−４に水供給路６７−４を介して、開口６２−４にポンプ１６５-４から送り込まれる液を供給する。１６９は水溜めである。ポンプ１６５-４はポンプ１６５-２と同様にパソコン３００の与える信号により操作される。 (Example 3)
Example 3 shows another example of creating an index oil pattern. In the first embodiment, the length of the index oil is described as corresponding to the cell. In the third embodiment, an example of a pattern encoded with “1” and “0” is described with reference to FIG. explain. FIG. 11 is a diagram illustrating a portion corresponding to the flow path 64-2 to which the index oil connected to the flow path 64 downstream of the cell detection region 56 of FIG. 4 is supplied. A flow path 64-4 is connected between the flow path 64 of the flow path 64-2 and the oil addition port housing 63-2, and a water addition port housing 63-4 is provided at an end of the flow path 64-4. 62-4 is an opening communicating from the end of the flow path 64-4 to the surface of the substrate 61. The liquid fed from the pump 165-4 to the opening 62-4 is supplied to the opening 62-4 of the water addition port housing 63-4 via the water supply path 67-4. Reference numeral 169 denotes a water reservoir. The pump 165-4 is operated by a signal given by the personal computer 300 in the same manner as the pump 165-2.

実施例１では、細胞検出領域５６で細胞が検出されたときは、ポンプ１６５−１の運転が停止、駆動装置１６４の運転が停止され、細胞検出領域５６近傍に細胞を保持する（ステップ３０３−３０５）とともにポンプ１６５−２が運転される。実施例１では、ポンプ１６５−２の運転時間を制御して細胞のインデックス用オイルの長さを細胞に対応させるものとした（ステップ３０６−３０７）。実施例３では、このステップ３０６−３０７に対応する制御をポンプ１６５−２、ポンプ１６５−４に対してパソコン３００から行なうことにより、オイルと水とを利用したコードとして構成する。   In Example 1, when cells are detected in the cell detection region 56, the operation of the pump 165-1 is stopped, the operation of the driving device 164 is stopped, and the cells are held in the vicinity of the cell detection region 56 (step 303-). 305) and the pump 165-2 is operated. In Example 1, the operation time of the pump 165-2 was controlled so that the length of the cell index oil corresponded to the cells (steps 306-307). In the third embodiment, the control corresponding to the steps 306 to 307 is performed from the personal computer 300 to the pump 165-2 and the pump 165-4, so that a code using oil and water is configured.

ポンプ１６５−２が運転されるときは流路６４−２にあるオイルまたは水が流路６４に注入され、ポンプ１６５−４が運転されるときは流路６４−２に水が注入される。したがって、ポンプ１６５−２，１６５−４をパソコンの指示によって適当に運転すれば、オイルまたは水の混在とそれぞれの長さを制御されたコードを流路６４に挿入することができる。図１１では、細胞４４−１に対して“１０１０１０１”のコードを、細胞４４−２に対して“１１０１０１１”のコードを付与し、細胞４４−３に対して“１０１０１１０”のコードを付与しようとしているところを示す。   When the pump 165-2 is operated, oil or water in the flow path 64-2 is injected into the flow path 64, and when the pump 165-4 is operated, water is injected into the flow path 64-2. Therefore, if the pumps 165-2 and 165-4 are appropriately operated in accordance with instructions from the personal computer, a mixture of oil or water and a cord whose length is controlled can be inserted into the flow path 64. In FIG. 11, the code “1010101” is assigned to the cell 44-1, the code “1101011” is assigned to the cell 44-2, and the code “1010110” is assigned to the cell 44-3. Indicates where you are.

ここで、オイルと水によるインデックスの具体例についてみると、流路６４が幅２０μｍで深さ２５μｍの場合、オイル長さの単位長が４０μｍ、水の長さの単位長が４０μｍとなるようにして、“１”または“０”をこの単位長とするのが好ましい。インデックス検出領域５７−１では、フォトダイオード１２−１はオイルの部分と水の部分に対して、異なった信号（例えば、検出光強度の大きさ）をパソコン３００に送ることになる。実施例３では、パソコン３００は細胞の検出に対応して所定のコードを与えるようにプログラムされているとともに、これに応じて、ポンプ１６５−２，１６５−４を運転する。ステップ３０７は、したがって、「ポンプ１６５−２，１６５−４のトータルの運転時間は所定時間を経過したか」、あるいは、「ポンプ１６５−２，１６５−４は所定の運転パターンの運転を完了したか」と読み替えたものとなる。   Here, regarding a specific example of the index by oil and water, when the flow path 64 is 20 μm wide and 25 μm deep, the unit length of the oil length is 40 μm and the unit length of the water length is 40 μm. Thus, “1” or “0” is preferably set as the unit length. In the index detection region 57-1, the photodiode 12-1 sends different signals (for example, the magnitude of the detected light intensity) to the personal computer 300 for the oil portion and the water portion. In the third embodiment, the personal computer 300 is programmed to give a predetermined code corresponding to the detection of the cell, and the pumps 165-2 and 165-4 are operated in accordance with this. Step 307 is therefore “whether the total operation time of the pumps 165-2 and 165-4 has passed the predetermined time” or “the pumps 165-2 and 165-4 have completed the operation of the predetermined operation pattern” Or "".

（実施例４）
実施例４は、１回の細胞刺激と流路６０−１を細胞が通過する時間によるインキュベーション時間では、十分な細胞の変化が期待できないとき、ｎ０回の細胞刺激とｎ０回の流路６０−１を細胞が通過する時間によるインキュベーションを実行するセルソーターの例を示す。 Example 4
In Example 4, when a sufficient cell change cannot be expected with one cell stimulation and the time required for the cells to pass through the flow channel 60-1, n 0 cell stimulations and n 0 flow channels are possible. An example of a cell sorter that performs incubation according to the time that cells pass through 60-1 is shown.

図１２は、実施例４のセルソーターチップと、このチップを利用したセルソーターの概要を示す平面図である。図１２と図４とを対比して容易に分かるように、セルソーターチップ自体は以下の点で異なるに過ぎない。すなわち、流路６４の細胞識別領域５８−２の下流部と流路６４のインデックス検出領域５７−１の上流部とを結ぶバイパス流路６４−７が設けられ、この流路６４−７に止め弁６５−３が設けられる。また、バイパス流路６４−７に沿って、細胞識別領域５８−２の下流部と流路６４のインデックス検出領域５７−１の上流部の方向に向かうリニアポンプ１６５−５用の移動磁界発生コイルが備えられる。また、図には表れないが、インデックス用にオイル溜め１６７に保持されるオイルが磁性オイルとされる。ここで、磁性オイルとはオイルにナノ磁性体を分散させたものである。もっとも、インデックス用に利用できる流体であれば、オイルである必要は無く、磁性流体であれば良い。この点に関しては、他の実施例でもオイルに代えて、インデックス用に利用できる流体が利用できる。また、この例では、水溜め１６９は、色違いのオイル溜め１６９としてオイルにナノ磁性体を分散させたものを利用するのが良い。こうすれば、オイルの色の違いで光学的な明るさの違いが検出でき、インデックスとして利用できるとともに、リニアポンプ１６５−５の動作に有利である。   FIG. 12 is a plan view showing an outline of a cell sorter chip of Example 4 and a cell sorter using the chip. As can be easily understood by comparing FIG. 12 and FIG. 4, the cell sorter chip itself is only different in the following points. That is, a bypass channel 64-7 that connects the downstream part of the cell identification region 58-2 of the channel 64 and the upstream part of the index detection region 57-1 of the channel 64 is provided, and is stopped by this channel 64-7. A valve 65-3 is provided. In addition, the moving magnetic field generating coil for the linear pump 165-5 is directed along the bypass flow path 64-7 toward the downstream portion of the cell identification region 58-2 and the upstream portion of the index detection region 57-1 of the flow path 64. Is provided. Although not shown in the figure, the oil retained in the oil sump 167 for the index is magnetic oil. Here, the magnetic oil is obtained by dispersing a nanomagnetic material in oil. However, any fluid that can be used for indexing need not be oil, and may be a magnetic fluid. In this regard, in another embodiment, a fluid that can be used for the index can be used instead of the oil. Further, in this example, the water reservoir 169 is preferably an oil reservoir 169 of different colors in which nanomagnetic materials are dispersed in oil. In this way, a difference in optical brightness can be detected by the difference in the color of oil, which can be used as an index and is advantageous for the operation of the linear pump 165-5.

図１２に示す構成においては、細胞識別領域５８−２に最初の細胞が到達した時点には、細胞検出領域５６以下の流路６４の範囲は、すべて、インデックス用オイルと対になった細胞とが入っているということを意味する。したがって、この両端をバイパス用の流路６４−７で短絡した閉ループとして、インデックス用オイルと対になった細胞とを移動磁界発生コイルと磁性オイルとの関係で実現されるリニアポンプ１６５−５により循環させるとともに、この循環のたびに細胞を刺激し、細胞の映像を撮ることにする。これにより、細胞に十分な刺激を与え、且つ、刺激に応じた映像を得ることができる。   In the configuration shown in FIG. 12, when the first cell arrives at the cell identification area 58-2, the range of the flow path 64 below the cell detection area 56 is all the cells paired with the index oil. Means that Therefore, as a closed loop in which both ends are short-circuited by the bypass flow path 64-7, the index oil and the paired cells are connected by the linear pump 165-5 realized by the relationship between the moving magnetic field generating coil and the magnetic oil. In addition to the circulation, the cells are stimulated each time this circulation is performed, and an image of the cells is taken. Thereby, sufficient stimulation can be given to the cell and an image corresponding to the stimulation can be obtained.

図１３は、実施例４の動作を実現する処理フローを示す図である。図１３と図８とを対比して容易に分かるように、ステップ３０１からステップ３１６までの処理は実施例１と同一である。図１３では、ステップ３１６で細胞識別領域５８−２の映像取得をした後、ステップ３２１で、これが所定の映像取得に該当するか否かチェックする。最初の映像取得であれば、当然、該当しないからステップ３２２に進みカウンターを１だけ進ませた後、ステップ３２３で止め弁６５‐３開、ポンプ１６５−１，１６５−２および駆動装置１６４の運転停止をパソコン３００は指令する。続けて、ステップ３２３でリニアポンプ１６５−５の運転を指令する。その後、ステップ３０９に進む。これにより、細胞検出領域５６から細胞識別領域５８−２の範囲の流路６４はバイパス用の流路６４−７で短絡された閉ループとなり、この閉ループにある細胞および磁性流体がリニアポンプ１６５−５で循環されながら、細胞刺激領域５９にポンプ１６５−３により供給される刺激物質溶液により繰り返し刺激されるとともに、時間調整器６０の流路６０−１の前後の細胞の映像を繰り返し得ることができる。この例では、繰り返し刺激を与え、それにより応答する細胞を分離する形になっているが、工程３１２、３１３、３１４に係る刺激物質添加用のポンプ駆動をスキップすることで、最初の刺激からの細胞応答の時間経過を追跡し、所定の状態になった細胞を分離することもできる。   FIG. 13 is a diagram illustrating a processing flow for realizing the operation of the fourth embodiment. As can be easily understood by comparing FIG. 13 and FIG. 8, the processing from step 301 to step 316 is the same as that of the first embodiment. In FIG. 13, after acquiring the video of the cell identification region 58-2 in step 316, it is checked in step 321 whether this corresponds to predetermined video acquisition. If it is the first video acquisition, of course, it does not apply, so the process proceeds to step 322 and the counter is incremented by 1. Then, in step 323, the stop valve 65-3 is opened, the pumps 165-1 and 165-2 and the driving device 164 are operated. The personal computer 300 commands the stop. Subsequently, in step 323, the operation of the linear pump 165-5 is commanded. Then, it progresses to step 309. As a result, the flow path 64 in the range from the cell detection area 56 to the cell identification area 58-2 becomes a closed loop short-circuited by the bypass flow path 64-7, and the cells and magnetic fluid in the closed loop are transferred to the linear pump 165-5. The cell stimulation area 59 is repeatedly stimulated by the stimulating substance solution supplied by the pump 165-3, and images of the cells before and after the flow path 60-1 of the time adjuster 60 can be repeatedly obtained. . In this example, the stimulus is repeatedly applied, and the responding cells are thereby separated. However, by skipping the pumping operation for adding the stimulant according to steps 312, 313, and 314, it is possible to start from the first stimulus. It is also possible to isolate the cells that have reached a predetermined state by tracking the time course of the cell response.

ステップ３２１で、これが所定の映像取得に該当すると判定されたときは、パソコン３００は止め弁６５‐３を閉とし、ポンプ１６５−１の運転を指令する。すなわち、細胞検出領域５６から細胞識別領域５８−２の範囲の流路６４はバイパス用の流路６４−７で短絡された閉ループを解消するとともに、流路６４内にあるインデックス用オイルと対になった細胞を外部コネクター６６−１または６６−２の方に排出して細胞を回収する。そのため、ステップ３１７，３１８に進んで、得られた細胞の映像から選択をすることになる。実施例４では、繰り返し細胞を撮像しているから、実施例１よりも豊富な情報がパソコン３００に蓄積されている。したがって、図１３のステップ３１７，３１８に表示されているよりも多様な評価ができる。本発明を用いると、刺激を与えて細胞の変化が起きる場合、刺激応答が速く、２回目の測定で細胞に変化をきたしたものと、応答が遅く、より長時間インキュベーションしないと細胞の変化が見られないものとを分離することができる。   If it is determined in step 321 that this corresponds to predetermined image acquisition, the personal computer 300 closes the stop valve 65-3 and commands the operation of the pump 165-1. That is, the flow path 64 in the range from the cell detection area 56 to the cell identification area 58-2 eliminates the closed loop short-circuited by the bypass flow path 64-7 and is paired with the index oil in the flow path 64. The formed cells are discharged toward the external connector 66-1 or 66-2, and the cells are collected. Therefore, the process proceeds to steps 317 and 318 to select from the obtained cell image. In the fourth embodiment, since cells are repeatedly imaged, abundant information is accumulated in the personal computer 300 as compared to the first embodiment. Therefore, various evaluations can be performed as compared with those displayed in steps 317 and 318 of FIG. When the present invention is used, when a change occurs in a cell when a stimulus is applied, the stimulus response is fast, and the cell changes in the second measurement, and the response is slow. You can separate what you can't see.

（実施例５）
上述の実施例では、時間調整器６０の流路６０−１の長さが固定されていた。このため、インキュベーション時間は、流路６０−１を細胞が通過する時間で、常に一定となり、使用者の都合で変えることができない。細胞の種類や刺激物質によってこのインキュベーション時間を変えたい場合も多い。基板１の成形時に、これに対応するためには、流路６０−１の長さを変えた多種類の金型を用意する必要がある。一方、基板１上でインキュベーション時間を可変にできるようになれば、色々な長さの流路６０−１を持つチップを予め用意しておく必要が無いので、製造者にとって好都合であるとともに、使用者にとっても、特異なケースの注文により高価なものを購入する必要がなくなり、ユーザーにとっても利点がある。実施例５ではセルソーターチップの時間調整器６０の流路６０−１の長さを可変として、任意の時間でインキュベーションを行なえるようにする１例に関する。 (Example 5)
In the above-described embodiment, the length of the flow path 60-1 of the time adjuster 60 is fixed. For this reason, the incubation time is always the time that the cells pass through the flow path 60-1, and cannot be changed for the convenience of the user. In many cases, you may want to change this incubation time depending on the cell type and stimulating substance. In order to cope with this when the substrate 1 is molded, it is necessary to prepare various types of dies having different lengths of the flow path 60-1. On the other hand, if the incubation time can be varied on the substrate 1, it is not necessary to prepare chips having various lengths of the channel 60-1 in advance, which is convenient for the manufacturer and used. There is also an advantage for the user because there is no need to purchase an expensive item by ordering a special case. The fifth embodiment relates to an example in which the length of the flow path 60-1 of the time adjuster 60 of the cell sorter chip is variable, so that incubation can be performed at an arbitrary time.

図１４（Ａ）は、実施例５のセルソーターチップの時間調整器６０の部分に着目した平面図、（Ｂ）は、図１４（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図、（Ｃ）は、図１４（Ａ）のＢ−Ｂ位置で矢印方向に見た断面図である。６１は基板、６４は流路、６０は時間調整器の領域、６８はプラスチックシートである。実施例５では、時間調整器の領域６０は、流路６４と同じ高さのアガロースゲル膜が組み込まれている。６０−２，６０−３はアガロースゲルを注入するための開口である。アガロースゲルの注入について説明すると以下のようである。終濃度が重量／容量％で１．５％のアガロース粉末を懸濁した０．１５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を沸騰させてアガロースを溶解させる。アガロース溶解液を６５℃前後まで冷却し、直ちにアガロース注入口６０−２から注入する。このときチップそのもの熱容量があるので、チップも６５℃に加熱しておくのがよい。過剰なアガロース溶解液は排出口６０−３からオーバーフローさせる。３０分間室温に放置するとアガロースがゲル状に凝固する。実施例５のセルソーターチップはアガロースゲル膜を組み込んだだけで製造者から使用者に提供されて、使用者が自由に流路６０-１を設定しても良いし、使用者の注文に応じて製造者が流路６０-１を設定して、提供することにしても良い。   FIG. 14A is a plan view focusing on the time adjuster 60 portion of the cell sorter chip of Example 5, and FIG. 14B is a cross-sectional view seen in the arrow direction at the position AA in FIG. (C) is sectional drawing seen in the arrow direction in the BB position of FIG. 14 (A). 61 is a substrate, 64 is a flow path, 60 is a time adjuster region, and 68 is a plastic sheet. In Example 5, the time adjuster region 60 incorporates an agarose gel membrane having the same height as the flow path 64. 60-2 and 60-3 are openings for injecting the agarose gel. The injection of the agarose gel will be described as follows. Agarose is dissolved by boiling 0.15 M NaCl, 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) in which agarose powder having a final concentration of 1.5% by weight / volume is suspended. The agarose solution is cooled to around 65 ° C. and immediately injected from the agarose inlet 60-2. At this time, since the chip itself has a heat capacity, the chip is preferably heated to 65 ° C. Excess agarose solution is allowed to overflow from outlet 60-3. When left at room temperature for 30 minutes, the agarose solidifies in a gel form. The cell sorter chip of Example 5 is provided from the manufacturer to the user only by incorporating the agarose gel membrane, and the user may freely set the flow path 60-1, or according to the order of the user. The manufacturer may set and provide the channel 60-1.

図１５はレーザー集束光照射装置を用いて、時間調整器６０の領域のアガロースゲル膜にレーザー集束光を照射する方法を説明する概念図である。セルソーターチップの基板６１をステージ４０１にのせて加工する。ステージ４０１はＸＹ駆動機構４０２で自在に動かすことができる。レーザー光源４０３から発せられるレーザー光はダイクロイックミラー４０４を通過し、レンズ４０５でセルソーターチップ６１の時間調整器６０の領域のアガロースゲル膜にフォーカスする。レーザーとしては水に吸収のある１４８０ｎｍの波長を用いることができる。ＸＹ駆動機構４０２を動かすことで流路を作成することができる。流路作成の進行は光源４０６からの白色光でチップ基板６１を照明し、得られる像をレンズ４０５から可視光を透過するダイクロイックミラー４０４を介してＣＣＤカメラ４０７で検出する。４０８は制御用のコンピューターで、画像から加工された線幅を算出し、移動速度をＸＹ駆動機構４０２に伝え、一定の線幅で加工ができるようになっている。また、コンピューター４０８は、予め記憶した経路に従い加工を行なうようＸＹ駆動機構４０２の移動と、レーザー４０３の出力をコントロールする。   FIG. 15 is a conceptual diagram illustrating a method of irradiating laser focused light on the agarose gel film in the region of the time adjuster 60 using a laser focused light irradiation device. The cell sorter chip substrate 61 is placed on the stage 401 and processed. The stage 401 can be freely moved by an XY drive mechanism 402. Laser light emitted from the laser light source 403 passes through the dichroic mirror 404 and is focused on the agarose gel film in the region of the time adjuster 60 of the cell sorter chip 61 by the lens 405. As the laser, a wavelength of 1480 nm that is absorbed in water can be used. A flow path can be created by moving the XY drive mechanism 402. Progress of the flow path creation is performed by illuminating the chip substrate 61 with white light from the light source 406 and detecting the obtained image by the CCD camera 407 through the lens 405 through the dichroic mirror 404 that transmits visible light. Reference numeral 408 denotes a control computer that calculates a processed line width from the image, transmits the movement speed to the XY drive mechanism 402, and can perform processing with a constant line width. In addition, the computer 408 controls the movement of the XY drive mechanism 402 and the output of the laser 403 so as to perform processing according to a path stored in advance.

図１６（Ａ）は時間調整器６０の領域のアガロースゲル膜にレーザー照射して流路６０−１を作成している様子を模式的に示す平面図、（Ｂ）は断面図である。レーザーに照射された部分が極所加熱されアガロースゲルを溶融除去する。１００は時間調整器６０の領域のアガロースゲル膜にフォーカスし、移動しながら流路６０−１を作成しているレーザー光を示す。フォーカスしたレーザー光により溶解したアガロースは周辺のアガロースゲル膜の隙間に拡散してしまうので、流路６０−１は半恒久的に残る。図１６では基板６１に形成された流路６４から時間調整器６０の領域のアガロースゲル膜に流路６０−１を作成している過程を示す。   FIG. 16A is a plan view schematically showing a state in which the agarose gel film in the region of the time adjuster 60 is irradiated with laser to create the flow path 60-1, and FIG. 16B is a cross-sectional view. The portion irradiated with the laser is heated at an extreme location to melt and remove the agarose gel. Reference numeral 100 denotes a laser beam that focuses on the agarose gel film in the region of the time adjuster 60 and creates the flow path 60-1 while moving. Since the agarose dissolved by the focused laser beam diffuses into the gaps between the surrounding agarose gel films, the flow path 60-1 remains semi-permanently. FIG. 16 shows a process in which the flow path 60-1 is created in the agarose gel film in the region of the time adjuster 60 from the flow path 64 formed on the substrate 61.

図１７は、時間調整器６０の領域のアガロースゲル膜に流路６０−１を完成させたときの一例を示す平面図である。流路６０−１は、両端で流路６４と連結している。図１７の流路６０−１の長さと、図４の流路６０−１の長さとを比較して明らかなように、図１７の流路６０−１の長さは短い。このように、アガロースゲル膜をレーザーで加熱して流路を作成すれば、時間調整器６０の流路６０−１の長さは、任意の長さに作成できるので、使用目的に合わせた最適なインキュベーション時間に調整できる。   FIG. 17 is a plan view showing an example when the flow channel 60-1 is completed in the agarose gel film in the region of the time adjuster 60. The flow path 60-1 is connected to the flow path 64 at both ends. As apparent from a comparison between the length of the flow path 60-1 in FIG. 17 and the length of the flow path 60-1 in FIG. 4, the length of the flow path 60-1 in FIG. 17 is short. In this way, if the agarose gel film is heated with a laser to create a flow path, the length of the flow path 60-1 of the time adjuster 60 can be made to an arbitrary length. The incubation time can be adjusted appropriately.

図１８は、時間調整器６０の流路の長さ調整の他の例を示す平面図である。図１７から分かるように、流路の全長をアガロースゲル膜に使用者が作成するのは、流路が長くなるほど負担が大きくなる。図１８では、このため、時間調整器６０の領域にあらかじめ、いくつかの長さの異なる流路を基板１の成形時に形成しておき、使用者は、いずれの流路を使用するかの選択に応じたパスだけを形成すれば良いように工夫したものである。６０ａはアガロースゲル膜の領域であり、これに接するように、長さを異にする流路６０−３，６０−４，６０−５，６０−６および６０−７が設けられている。これらの流路は基板６１にあらかじめ形成されている。また、流路６４もアガロースゲル膜の領域６０ａまで延伸されている。したがって、使用者は、長い流路を使用したければ、アガロースゲル膜の領域６０ａに６０−１ａ，６０−１ｂのように、選択した流路と流路６４とをつなぐ流路のみを形成すればよい。   FIG. 18 is a plan view showing another example of the channel length adjustment of the time adjuster 60. As can be seen from FIG. 17, the user creates the full length of the flow path in the agarose gel membrane as the flow path becomes longer. In FIG. 18, for this reason, several channels having different lengths are formed in advance in the region of the time adjuster 60 when the substrate 1 is formed, and the user selects which channel to use. It is devised so that only a path corresponding to the above needs to be formed. Reference numeral 60a denotes an agarose gel film region, and channels 60-3, 60-4, 60-5, 60-6, and 60-7 having different lengths are provided so as to be in contact therewith. These flow paths are formed in the substrate 61 in advance. The flow path 64 is also extended to the region 60a of the agarose gel film. Therefore, if the user wants to use a long flow path, the user should form only the flow path connecting the selected flow path and the flow path 64, such as 60-1a and 60-1b, in the region 60a of the agarose gel membrane. That's fine.

図１９は、時間調整器６０の流路の長さ調整のさらに他の例を示す平面図である。この例では、時間調整器６０の領域に流路６４を平行に延伸し、これの間を平行したパス６０-８,６０-９，６０−１０および６０−１１で結ぶとともに、各パスに止め弁６５−４，６５−５，６５−６および６５−６を設けたものである。したがって、使用者は、これらの止め弁の一つのみを残して他のすべてを閉とすれば、開のまま残された止め弁に対応する長さの流路長が得られる。   FIG. 19 is a plan view showing still another example of adjusting the length of the flow path of the time adjuster 60. In this example, the flow path 64 is extended in parallel to the region of the time adjuster 60 and is connected by parallel paths 60-8, 60-9, 60-10 and 60-11, and is stopped at each path. Valves 65-4, 65-5, 65-6 and 65-6 are provided. Therefore, if the user leaves only one of these stop valves and closes all others, the flow path length of the length corresponding to the stop valve left open can be obtained.

図２１は、１つの直線状の流路を持つチップ中の流路を流れる細胞を光学的に認識し、不要な細胞を集束光によって不活性化あるいは破壊する細胞精製装置の構成の一例を示す図である。細胞を流す流路が内部に構成されているチップに、チップ内の状態を観察するための透過光光源となる透過照明２１０１、チップに流れる液を供給する、溶液貯め２１０４、ポンプ２１０３が接合され、この供給路にサンプルインジュエクタ２１０２が配置されることで、サンプル細胞がチップ中で流れるように構成されている。透過照明２１０１によって照明されたチップ２１０５中の直線状の流路の一部に流れる細胞を観察する観察・判定領域２１０７の像が、対物レンズ２１０７を通過して、ミラー２１０８および、観察したい波長の光を選択するフィルター２１１０を通過して、高速カメラ２１１１の受光素子面に結像する。また、同様に、ミラー２１０８および、観察したい波長の光を選択するフィルター２１１０を通過して、フォトン・カウンター２１１２の光電素子面に結像する構成となっている。他方、細胞の蛍光像を観察するために、特定の冷機波長の蛍光を供給する蛍光光源２１１３がミラー２１０８を経由して光路上に配置されており、これによって観察・判定領域２１０６を通過する細胞の計構造を観察するための蛍光励起光を供給できる校正となっている。、また、さらにミラー２１０９を経由して、光路上に細胞破壊あるいは細胞死（アポトーシス）を誘導するレーザー集束光を照射するためのレーザー光源２１１４が配置されており、高速カメラ２１１１あるいはフォトン・カウンターから得られた細胞情報に基づいて、不要な細胞には集束レーザー光を照射することができる。このとき、レーザー光源としては、細胞破壊を行なう場合は、３５０ｎｍより短波長の紫外光、細胞死を起こす場合は、細胞を加熱することが可能な、水の吸収がある波長の赤外光、たとえば１４８０ｎｍの近赤外光を用いることが望ましい。また、レーザー光源２１１４の集束光については、装置の出光口にレンズを配置することで、チップ上での集束位置、集束光の直径を制御することができる。また、円形レンズに替わって、シリンダー型レンズを用いることで、チップ中の流路の流れに直行する方向に楕円型の形状に集束して、流路全体に効率的に集束光を照射することができる。また、本実施例では、本細胞精製手段を説明するために、細胞識別については、従来の１回の観察のみのものを用いたが、上記、別実施例において記載した、２回以上の観察の結果を比較して、その結果に基づいて細胞にレーザー光を照射することができる。   FIG. 21 shows an example of the configuration of a cell purification apparatus that optically recognizes cells flowing through a channel in a chip having one linear channel and inactivates or destroys unnecessary cells with focused light. FIG. A chip having a flow path for flowing cells is joined with a transmission illumination 2101 serving as a transmitted light source for observing the state inside the chip, a solution reservoir 2104 for supplying a liquid flowing to the chip, and a pump 2103. By arranging the sample injector 2102 in this supply path, the sample cells are configured to flow in the chip. An image of the observation / determination area 2107 for observing cells flowing in a part of the linear flow path in the chip 2105 illuminated by the transmitted illumination 2101 passes through the objective lens 2107 and has a mirror 2108 and a wavelength to be observed. The light passes through the filter 2110 for selecting light and forms an image on the light receiving element surface of the high-speed camera 2111. Similarly, the light passes through a mirror 2108 and a filter 2110 that selects light having a wavelength to be observed, and forms an image on the photoelectric element surface of the photon counter 2112. On the other hand, in order to observe a fluorescence image of a cell, a fluorescence light source 2113 that supplies fluorescence having a specific cold wavelength is disposed on the optical path via a mirror 2108, and thereby a cell that passes through the observation / determination region 2106. It is a calibration that can supply fluorescence excitation light for observing the total structure. Further, a laser light source 2114 for irradiating a laser focused light for inducing cell destruction or cell death (apoptosis) on the optical path via the mirror 2109 is arranged. From the high-speed camera 2111 or the photon counter Based on the obtained cell information, unnecessary cells can be irradiated with focused laser light. At this time, as a laser light source, when performing cell destruction, ultraviolet light having a wavelength shorter than 350 nm, when causing cell death, infrared light having a wavelength of water absorption capable of heating the cell, For example, it is desirable to use near infrared light of 1480 nm. Further, with respect to the focused light of the laser light source 2114, a focusing position on the chip and the diameter of the focused light can be controlled by arranging a lens at the light exit of the apparatus. In addition, by using a cylindrical lens instead of a circular lens, it converges into an elliptical shape in a direction perpendicular to the flow of the flow path in the chip, and efficiently irradiates the entire flow path with focused light. Can do. Further, in this example, in order to explain the present cell purification means, the conventional cell identification was performed using only one observation, but the two or more observations described in the above other examples were used. The cells can be irradiated with laser light based on the results.

図２２は、１つの直線状の流路を持つチップ中の流路を流れる細胞を光学的に認識し、不要な細胞を集束光によって不活性化あるいは破壊する手順を説明する図である。（１）は判定領域に細胞が到達する前、（２）は細胞が判定領域に到達したとき、（３）は細胞の種類、状態の判別、（４ａ）、（４ｂ）は判断の結果、（５ａ）は必要な細胞と判断された場合の細胞の通過、（５ｂ）は不要な細胞と判断された場合の細胞の破壊を示す。   FIG. 22 is a diagram for explaining a procedure for optically recognizing cells flowing through a channel in a chip having one linear channel and inactivating or destroying unnecessary cells with focused light. (1) before the cell reaches the determination region, (2) when the cell reaches the determination region, (3) the determination of the type and state of the cell, (4a) and (4b) are the determination results, (5a) shows the passage of cells when judged as necessary cells, and (5b) shows the destruction of cells when judged as unnecessary cells.

本発明の最も基本的な処理工程を表す図である。It is a figure showing the most basic processing process of this invention. 図１に示した基本的な処理工程と比べ、細胞を刺激する工程が加わった処理工程を示す図である。It is a figure which shows the process process in which the process which stimulates a cell was added compared with the basic process process shown in FIG. 識別の対象となる細胞の同定を確実に行なうための工夫を盛り込んだ細胞変化を識別する工程を示す図である。It is a figure which shows the process of identifying the cell change incorporating the device for identifying the cell used as the object of identification reliably. 本発明のセルソーターチップと、このチップを利用したセルソーターの実施例１の概要を示す平面図である。It is a top view which shows the outline | summary of Example 1 of the cell sorter chip | tip of this invention and the cell sorter using this chip | tip. （Ａ），（Ｂ）に細胞添加口ハウジングの部分の断面を示す。(A), (B) shows a cross section of the cell addition port housing. オイル添加口ハウジングの部分の断面を示す図である。It is a figure which shows the cross section of the part of an oil addition port housing. セルソーターチップの細胞検出領域、インデックス検出領域、細胞識別領域とそれぞれの領域の光学系の関係の概略を示す図である。It is a figure which shows the outline of the relationship between the cell detection area | region of a cell sorter chip, an index detection area | region, a cell identification area | region, and the optical system of each area | region. パソコンによる操作の処理に関するフローチャートの概要を示す図である。It is a figure which shows the outline | summary of the flowchart regarding the process of operation by a personal computer. 流路に配置された細胞刺激領域に電極を設けた例を示す平面図である。It is a top view which shows the example which provided the electrode in the cell stimulation area | region arrange | positioned at the flow path. 光照射で細胞を刺激する場合の照射光学系と細胞刺激領域の構成を示す断面図である。It is sectional drawing which shows the structure of the irradiation optical system in the case of stimulating a cell by light irradiation, and a cell stimulation area | region. 図４の細胞検出領域の下流の流路に連結されているインデックス用のオイルが供給される流路に対応する部分を示す図である。It is a figure which shows the part corresponding to the flow path to which the oil for an index connected with the flow path downstream of the cell detection area | region of FIG. 実施例４のセルソーターチップと、このチップを利用したセルソーターの概要を示す平面図である。It is a top view which shows the outline | summary of the cell sorter chip | tip of Example 4, and the cell sorter using this chip | tip. 実施例４の動作を実現する処理フローを示す図である。FIG. 10 is a diagram illustrating a processing flow for realizing the operation of the fourth embodiment. （Ａ）は、実施例５のセルソーターチップの時間調整器の部分に着目した平面図、（Ｂ）は、図１４（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図、（Ｃ）は、図１４（Ａ）のＢ−Ｂ位置で矢印方向に見た断面図である。(A) is the top view which paid its attention to the part of the time adjuster of the cell sorter chip of Example 5, (B) is sectional drawing seen in the arrow direction in the AA position of FIG. 14 (A), (C). These are sectional views seen in the direction of the arrows at the BB position in FIG. レーザー集束光照射装置を用いて、時間調整器の領域のアガロースゲル膜にレーザー集束光を照射する方法を説明する概念図である。It is a conceptual diagram explaining the method of irradiating laser focused light to the agarose gel film | membrane of the area | region of a time adjuster using a laser focused light irradiation apparatus. （Ａ）は時間調整器の領域のアガロースゲル膜にレーザー照射して流路を作成している様子を模式的に示す平面図、（Ｂ）は断面図である。(A) is a top view which shows typically a mode that the agarose gel film | membrane of the area | region of a time adjuster is irradiated with a laser and the flow path is created, (B) is sectional drawing. 時間調整器の領域のアガロースゲル膜に流路を完成させたときの一例を示す平面図である。It is a top view which shows an example when a flow path is completed in the agarose gel film | membrane of the area | region of a time adjuster. 時間調整器の流路の長さ調整の他の例を示す平面図である。It is a top view which shows the other example of length adjustment of the flow path of a time adjuster. 時間調整器６０の流路の長さ調整のさらに他の例を示す平面図である。It is a top view which shows the further another example of the length adjustment of the flow path of the time adjuster. （Ａ）、（Ｂ）は止め弁の構造を示す図であり、（Ａ）は開。（Ｂ）は閉の状態を示す図である。(A), (B) is a figure which shows the structure of a stop valve, (A) is open. (B) is a diagram showing a closed state. １つの直線状の流路を持つチップ中の流路を流れる細胞を光学的に認識し、不要な細胞を集束光によって不活性化あるいは破壊する細胞精製装置の構成の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of the structure of the cell purification apparatus which optically recognizes the cell which flows through the flow path in the chip | tip with one linear flow path, and inactivates or destroys an unnecessary cell with focused light. １つの直線状の流路を持つチップ中の流路を流れる細胞を光学的に認識し、不要な細胞を集束光によって不活性化あるいは破壊する手順を説明する図である。（１）は判定領域に細胞が到達する前、（２）は細胞が判定領域に到達したとき、（３）は細胞の種類、状態の判別、（４ａ）、（４ｂ）は判断の結果、（５ａ）は必要な細胞と判断された場合の細胞の通過、（５ｂ）は不要な細胞と判断された場合の細胞の破壊を示す。It is a figure explaining the procedure which optically recognizes the cell which flows through the flow path in the chip | tip with one linear flow path, and inactivates or destroys an unnecessary cell with focused light. (1) before the cell reaches the determination region, (2) when the cell reaches the determination region, (3) the determination of the type and state of the cell, (4a) and (4b) are the determination results, (5a) shows the passage of cells when judged as necessary cells, and (5b) shows the destruction of cells when judged as unnecessary cells.

符号の説明Explanation of symbols

１１，１３，５９−６…光源、１２−１，１２−２，１２−３…フォトダイオード、１４−１，１４−２…撮像装置、４１，４１−１，４１−２，４１−３…細胞、５６…細胞検出領域、５７−１，５７−２…インデックス検出領域、５８−１，５８−２…細胞識別領域、５９…細胞刺激領域、５９−２，５９−３…電極、５９−４，５９−５…リード部分、５９−７…集束光、６０…時間調整器、６０ａ…アガロースゲル膜の領域、６０-８,６０-９，６０−１０，６０−１…パス、６０−２，６０−３…アガロースゲルを注入するための開口、６１…セルソーターチップ基板、６２−１，６２−２．６２−３，６２−４…コネクター、６３−１…細胞添加口ハウジング、６３−２…オイル添加口ハウジング、６３−３…刺激物質溶液添加口ハウジング、６０−３，６０−４，６０−５，６０−６，６０−７，６０−１，６０−１ａ，６０−１ｂ，６４，６４−２,６４−３，６４−４，６４−５，６４−６，６４−７…流路、止め弁６５―１，６５−２,６５−４，６５−５，６５−６，６５−６…止め弁、６６−１，６６−２…外部コネクター、６７−１…シース液供給路、６７−２…オイル供給路、６７−３…刺激物質溶液供給路、６８…プラスチックシート、１００…レーザー光、１６３…シリンジポンプ、１６１…ニードル、１６４…駆動装置、１６５-１,１６５−２，１６５−３，１６５−４…ポンプ、１６５-５…リニアポンプ、１６７…オイル溜め、１６８…刺激物質溶液溜め、３００…パソコン、４０１…ステージ、４０２…ＸＹ駆動機構、４０３…レーザー光源、４０４…ダイクロイックミラー、４０５…レンズ、４０６…光源、４０７…ＣＣＤカメラ、４０８…制御用のコンピューター、２１０１…透過照明、２１０２…サンプルインジェクタ、２１０３…ポンプ、２１０４…溶液貯め、２１０５…チップ、２１０６…観察・判定領域、２１０７…対物レンズ、２１０８…ミラー、２１０９…ミラー、２１１０…フィルター、２１１１…高速カメラ、２１１２…フォトン・カウンター、２１１３…蛍光光源、２１１４…アポトーシス用レーザー、２２０２…細胞、２２０３…判定領域、２２０１…流路、２２０４…レーザー。   11, 13, 59-6 ... light source, 12-1, 12-2, 12-3 ... photodiode, 14-1, 14-2 ... imaging device, 41, 41-1, 41-2, 41-3 ... 56, cell detection region, 57-1, 57-2 ... index detection region, 58-1, 58-2 ... cell identification region, 59 ... cell stimulation region, 59-2, 59-3 ... electrode, 59- 4, 59-5: lead portion, 59-7: focused light, 60: time adjuster, 60a: agarose gel film region, 60-8, 60-9, 60-10, 60-1 ... pass, 60- 2, 60-3 ... opening for injecting agarose gel, 61 ... cell sorter chip substrate, 62-1, 62-2.62-3, 62-4 ... connector, 63-1 ... cell addition port housing, 63- 2 ... Oil addition port housing, 63-3 ... irritation substance solution addition port USING, 60-3, 60-4, 60-5, 60-6, 60-7, 60-1, 60-1a, 60-1b, 64, 64-2, 64-3, 64-4, 64- 5, 64-6, 64-7 ... flow path, stop valve 65-1, 65-2, 65-4, 65-5, 65-6, 65-6 ... stop valve, 66-1, 66-2 ... External connector, 67-1 ... sheath liquid supply path, 67-2 ... oil supply path, 67-3 ... stimulus substance solution supply path, 68 ... plastic sheet, 100 ... laser light, 163 ... syringe pump, 161 ... needle, 164 ... Drive device, 165-1, 165-2, 165-3, 165-4 ... Pump, 165-5 ... Linear pump, 167 ... Oil reservoir, 168 ... Stimulator solution reservoir, 300 ... PC, 401 ... Stage, 402 ... XY drive mechanism, 403 ... Laser light source, 4 04 ... Dichroic mirror, 405 ... Lens, 406 ... Light source, 407 ... CCD camera, 408 ... Computer for control, 2101 ... Transmitted illumination, 2102 ... Sample injector, 2103 ... Pump, 2104 ... Solution reservoir, 2105 ... Chip, 2106 ... Observation / determination area, 2107 ... objective lens, 2108 ... mirror, 2109 ... mirror, 2110 ... filter, 2111 ... high-speed camera, 2112 ... photon counter, 2113 ... fluorescent light source, 2114 ... laser for apoptosis, 2202 ... cell, 2203 ... Determination region, 2201... Flow path, 2204.

Claims (20)

基板に形成された細胞を搬送する流路を備え、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、前記流路内の細胞を画像信号として検出する第１の細胞識別領域と、該第１の細胞識別領域の下流に形成された時間調整器と、該時間調整器の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第２の細胞識別領域と、該第２の細胞識別領域の下流に形成された前記流路内の細胞を二つの流路に選択的に排出する流路と、からなるセルソーターチップ。   A flow path for conveying cells formed on the substrate; means for injecting cells into the upstream end of the flow path; a first cell identification region for detecting cells in the flow path as an image signal; A time adjuster formed downstream of one cell identification region, a second cell identification region for detecting cells in the flow path formed downstream of the time adjustor as image signals, the second A cell sorter chip comprising: a channel that selectively discharges cells in the channel formed downstream of the cell identification region into two channels. 前記第１の細胞識別領域と、前記時間調整器との間の流路に細胞を刺激する機構が付加された請求項１記載のセルソーターチップ。   The cell sorter chip according to claim 1, wherein a mechanism for stimulating cells is added to a flow path between the first cell identification region and the time adjuster. 基板に形成された細胞を搬送する流路を備え、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、該細胞を注入する手段の下流に形成された流路内の細胞を検出する領域と、該細胞を検出する領域の下流に形成された前記検出された細胞を特定するためのインデックス流体を注入する領域と、該インデックス流体を注入する領域の下流に形成された前記インデックス流体を検出する第１のインデックス検出領域と、該インデックス検出領域の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第１の細胞識別領域と、該第１の細胞識別領域の下流に形成された時間調整器と、該時間調整器の下流に形成された前記インデックス流体を検出する第２のインデックス検出領域と、該インデックス検出領域の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第２の細胞識別領域と、該第２の細胞識別領域の下流に形成された前記流路内の細胞を二つの流路に選択的に排出する流路と、からなるセルソーターチップ。   A flow path for transporting cells formed on the substrate; means for injecting cells into the upstream end of the flow path; and a region for detecting cells in the flow path formed downstream of the means for injecting the cells; A region for injecting an index fluid for identifying the detected cell formed downstream of the region for detecting the cell, and the index fluid formed for the downstream of the region for injecting the index fluid. A first index detection area; a first cell identification area for detecting a cell in the flow path formed downstream of the index detection area as an image signal; and a downstream of the first cell identification area. A time adjuster, a second index detection region for detecting the index fluid formed downstream of the time adjuster, and a cell in the flow path formed downstream of the index detection region. A cell sorter comprising: a second cell identification area to be detected as an image signal; and a flow path for selectively discharging cells in the flow path formed downstream of the second cell identification area into two flow paths. Chip. 前記第１の細胞識別領域と、前記時間調整器との間の流路に細胞を刺激する機構が付加された請求項３記載のセルソーターチップ。   The cell sorter chip according to claim 3, wherein a mechanism for stimulating cells is added to a flow path between the first cell identification area and the time adjuster. 前記時間調整器が前記流路に連結されたアガロースゲル膜に形成される請求項１ないし４のいずれかに記載のセルソーターチップ。   The cell sorter chip according to any one of claims 1 to 4, wherein the time adjuster is formed on an agarose gel film connected to the flow path. 前記時間調整器が、前記基板に形成された複数の長さの異なる流路と、前記複数の長さの異なる流路の両端に連結されたアガロースゲル膜と、該アガロースゲル膜に連結された前記第１の細胞識別領域に連通した流路と前記第２のインデックス検出領域に連通した流路と、よりなる請求項１ないし４のいずれかに記載のセルソーターチップ。   The time regulator is connected to the agarose gel film, a plurality of different length channels formed in the substrate, an agarose gel film connected to both ends of the plurality of different length channels, and the agarose gel film The cell sorter chip according to any one of claims 1 to 4, further comprising: a channel communicating with the first cell identification region and a channel communicating with the second index detection region. 前記時間調整器が、前記第１の細胞識別領域に連通した流路と前記第２のインデックス検出領域に連通した流路のそれぞれを延伸して配列された流路と、前記流路をバイパスする並列に配列された流路と、該並列に配列された流路に設けられた止め弁と、よりなる請求項１ないし４のいずれかに記載のセルソーターチップ。   The time adjuster bypasses the flow path, the flow path arranged by extending each of the flow path communicating with the first cell identification area and the flow path communicating with the second index detection area. The cell sorter chip according to any one of claims 1 to 4, comprising flow paths arranged in parallel and stop valves provided in the flow paths arranged in parallel. 基板に形成された細胞を搬送する流路と、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、前記流路内の細胞を画像信号として検出する第１の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段と、該第１の細胞識別領域の下流に形成された時間調整器と、該時間調整器の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第２の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段と、前記流路を流下する細胞を分類する手段と、前記第１の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段が与える画像信号と前記第２の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段が与える画像信号とを比較して前記細胞を分類する手段に選択の指示を与えるパソコンと、からなるセルソーター。   A flow path for transporting cells formed on the substrate; means for injecting cells into the upstream end of the flow path; and a first cell identification region for detecting cells in the flow path as an image signal. Means for imaging the cells that flow down, a time adjuster formed downstream of the first cell identification region, and a cell that detects cells in the flow path formed downstream of the time adjuster as image signals. Means for imaging cells flowing down the flow path in two cell identification regions, means for classifying cells flowing down the flow path, and images cells flowing down the flow path in the first cell identification region A personal computer that gives a selection instruction to the means for classifying the cells by comparing the image signal given by the means and the image signal given by the means for imaging the cells flowing down the flow path in the second cell identification region; A cell sorter. 前記第１の細胞識別領域と、前記時間調整器との間の流路に細胞を刺激する機構が付加された請求項８記載のセルソーター。   The cell sorter according to claim 8, wherein a mechanism for stimulating cells is added to a flow path between the first cell identification region and the time adjuster. 基板に形成された細胞を搬送する流路と、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、該細胞を注入する手段の下流に形成された流路内の細胞を検出する領域で前記流路を流下する細胞の有無を検出する光学装置と、該細胞を検出する領域の下流に形成された前記検出された細胞を特定するためのインデックス流体を注入する領域にインデックス流体を注入する手段と、該インデックス流体を注入する領域の下流に形成された前記インデックス流体を検出する第１のインデックス検出領域で前記流路を流下するインデックス流体の構成を検知する光学装置と、と、該インデックス検出領域の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第１の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段と、該第１の細胞識別領域の下流に形成された時間調整器と、該時間調整器の下流に形成された前記インデックス流体を検出する第２のインデックス検出領域で前記流路を流下するインデックス流体の構成を検知する光学装置と、該インデックス検出領域の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第２の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段と、該第２の細胞識別領域の下流に形成された前記流路内の細胞を二つの流路に選択的に排出する流路と、前記光学装置から得られる信号を基礎に各種手段を制御し、かつ、前記第１の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段が与える画像信号と前記第２の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段が与える画像信号とを比較して前記細胞を分類する手段に選択の指示を与えるパソコンと、からなるセルソーター。   A flow path for conveying cells formed on the substrate; means for injecting cells into the upstream end of the flow path; and a region for detecting cells in the flow path formed downstream of the means for injecting the cells. Optical device for detecting presence / absence of cells flowing down flow path, and means for injecting index fluid into region for injecting index fluid for identifying the detected cells formed downstream of the region for detecting the cells An optical device that detects a configuration of the index fluid flowing down the flow path in a first index detection region that detects the index fluid formed downstream of the region into which the index fluid is injected, and the index detection Means for imaging a cell flowing down the flow path in a first cell identification area that detects cells in the flow path formed downstream of the area as an image signal; and A time adjuster formed in the flow, and an optical device for detecting the configuration of the index fluid flowing down the flow path in the second index detection region for detecting the index fluid formed downstream of the time adjuster; Means for imaging a cell flowing down the flow path in a second cell identification area that detects cells in the flow path formed downstream of the index detection area as an image signal; and Controlling various means based on a flow path for selectively discharging cells in the flow path formed downstream into two flow paths, and a signal obtained from the optical device, and identifying the first cell The cells are classified by comparing the image signal provided by the means for imaging the cells flowing down the flow path in the region with the image signal provided by the means for imaging the cells flowing down the flow path in the second cell identification area. Select the means to And a personal computer which gives an indication, consisting of a cell sorter. 前記第１の細胞識別領域と、前記時間調整器との間の流路に細胞を刺激する機構が付加された請求項１０記載のセルソーター。   The cell sorter according to claim 10, wherein a mechanism for stimulating cells is added to a flow path between the first cell identification region and the time adjuster. 前記時間調整器が前記流路に連結されたアガロースゲル膜に形成される請求項８ないし１１のいずれかに記載のセルソーター。   The cell sorter according to any one of claims 8 to 11, wherein the time adjuster is formed on an agarose gel film connected to the flow path. 前記時間調整器が、前記基板に形成された複数の長さの異なる流路と、前記複数の長さの異なる流路の両端に連結されたアガロースゲル膜と、該アガロースゲル膜に連結された前記第１の細胞識別領域に連通した流路と前記第２のインデックス検出領域に連通した流路と、よりなる請求項８ないし１１のいずれかに記載のセルソーター。   The time regulator is connected to the agarose gel film, a plurality of different length channels formed in the substrate, an agarose gel film connected to both ends of the plurality of different length channels, and the agarose gel film The cell sorter according to any one of claims 8 to 11, further comprising a flow channel communicating with the first cell identification region and a flow channel communicating with the second index detection region. 前記時間調整器が、前記第１の細胞識別領域に連通した流路と前記第２のインデックス検出領域に連通した流路のそれぞれを延伸した平行に配列された流路と、該平行に配列された流路をバイパスする並列に配列された流路と、該並列に配列された流路に設けられた止め弁と、よりなる請求項８ないし１１のいずれかに記載のセルソーター。   The time adjuster is arranged in parallel with the parallelly arranged channels extending from the channel communicating with the first cell identification region and the channel communicating with the second index detection region. The cell sorter according to any one of claims 8 to 11, further comprising: a flow path arranged in parallel that bypasses the flow path, and a stop valve provided in the flow path arranged in parallel. 前記インデックス流体が複数の流体を断続的に配列したものである請求項８ないし１１のいずれかに記載のセルソーター。   The cell sorter according to any one of claims 8 to 11, wherein the index fluid is formed by intermittently arranging a plurality of fluids. 基板に形成された細胞を搬送する流路と、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、該細胞を注入する手段の下流に形成された流路内の細胞を検出する領域で前記流路を流下する細胞の有無を検出する光学装置と、該細胞を検出する領域の下流に形成された前記検出された細胞を特定するためのインデックス流体を注入する領域に磁性インデックス流体を注入する手段と、該インデックス流体を注入する領域の下流に形成された前記磁性インデックス流体を検出する第１のインデックス検出領域で前記流路を流下する磁性インデックス流体の構成を検知する装置と、該インデックス検出領域の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第１の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段と、該第１の細胞識別領域の下流に形成された時間調整器と、該時間調整器の下流に形成された前記磁性インデックス流体を検出する第２のインデックス検出領域と、該インデックス検出領域の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第２の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段と、該第２の細胞識別領域の下流に形成された前記流路内の細胞を二つの流路に選択的に排出する流路と、前記第２の細胞識別領域の下流の流路を前記第１のインデックス検出領域の上流の流路に選択的に接続する流路と、前記選択的に接続する流路に沿って前記磁性インデックス流体に移動磁界を付与する手段と、前記光学装置から得られる信号を基礎に各種手段を制御し、かつ、前記第１の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段が与える画像信号と前記第２の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段が与える画像信号とを比較して前記細胞を分類する手段に選択の指示を与えるパソコンと、からなるセルソーター。   A flow path for conveying cells formed on the substrate; means for injecting cells into the upstream end of the flow path; and a region for detecting cells in the flow path formed downstream of the means for injecting the cells. An optical device for detecting the presence or absence of cells flowing down the flow path, and injecting a magnetic index fluid into a region for injecting an index fluid for identifying the detected cells formed downstream of the cell detection region Means, a device for detecting the configuration of the magnetic index fluid flowing down the flow path in the first index detection region for detecting the magnetic index fluid formed downstream of the region for injecting the index fluid, and the index detection Means for imaging a cell flowing down the flow path in a first cell identification area for detecting cells in the flow path formed downstream of the area as an image signal; and the first cell identification area A time adjuster formed downstream of the time adjuster, a second index detection region for detecting the magnetic index fluid formed downstream of the time adjuster, and the flow path formed downstream of the index detection region Means for imaging the cells flowing down the flow path in the second cell identification area for detecting the cells as image signals, and two cells in the flow path formed downstream of the second cell identification area. A flow path for selectively discharging to the flow path, a flow path for selectively connecting a flow path downstream of the second cell identification area to a flow path upstream of the first index detection area, and the selective Means for applying a moving magnetic field to the magnetic index fluid along a flow path connected to the optical index fluid, and controls various means based on a signal obtained from the optical device, and the flow path in the first cell identification region To image cells flowing down And a personal computer that gives a selection instruction to the means for classifying the cells by comparing the image signal given by the image signal given by the means for imaging the cells flowing down the flow path in the second cell identification region. Cell sorter. 基板に形成された細胞を搬送する流路を備え、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、前記流路内の細胞の形状あるいは状態を画像信号として検出する細胞識別領域および検出手段と、該細胞識別領域の下流に形成された前記流路内の細胞に、前期細胞識別の結果に基づいて、不要な細胞のみに細胞を破壊あるいはアポトーシスを誘導する集束光を選択的に照射する光源および光学系からなるセルソーター。   A flow path for transporting cells formed on the substrate; means for injecting cells into the upstream end of the flow path; and a cell identification region and detection means for detecting the shape or state of the cells in the flow path as an image signal And selectively irradiating the cells in the channel formed downstream of the cell identification region with focused light that only destroys unnecessary cells or induces apoptosis based on the result of the previous cell identification. A cell sorter consisting of a light source and an optical system. 前記光源の波長として、水の吸収がある近赤外光を用いた請求項１７記載のセルソーター。   The cell sorter according to claim 17, wherein near infrared light having water absorption is used as the wavelength of the light source. 前記光源の波長として、細胞を変性させ破壊する機能がある近紫外光を用いた請求項１７記載のセルソーター。   The cell sorter according to claim 17, wherein near-ultraviolet light having a function to denature and destroy cells is used as the wavelength of the light source. 前記光源の光の集束手段として、シリンダー型のレンズを用いて、流路に垂直な方向に直線状に流路全体にまたがるように集束線領域を有する請求項１７記載のセルソーター。
18. The cell sorter according to claim 17, wherein a cylindrical lens is used as the light focusing means of the light source, and the focusing line area has a linear line extending across the entire flow path in a direction perpendicular to the flow path.
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