JP2007097580A

JP2007097580A - T CELL RECEPTOR beta CHAIN GENE

Info

Publication number: JP2007097580A
Application number: JP2006202029A
Authority: JP
Inventors: Yasuto Akiyama; 靖人秋山; Koji Maruyama; 宏二丸山
Original assignee: Shizuoka Prefecture
Current assignee: Shizuoka Prefecture
Priority date: 2005-09-06
Filing date: 2006-07-25
Publication date: 2007-04-19

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a TCR (T cell receptor) β chain, its gene and the like, specifically discriminating MART-1 27-35 (AAGIGILTV) of melanoma-specific peptide. <P>SOLUTION: A peripheral blood mononuclear cell is sampled from a patient, added, at a ratio 1:10 to 1:40, with dendritic cell pulsed with MART-1 A2 peptide, and stimulated twice in the presence of low concentration IL-2. To more increase the ratio of cytotoxic T cell, T2 cell pulsed with MART-1 A2 peptide is added to the cell line at a ratio of 1:10 and the obtained is stimulated. Cloning of MART-1 A2 tetramer-specific cytotoxic T cell is performed by magnetic activated cell sorting of cytotoxic T cell, using monoclonal antibody, DNA sequence of TCR β chain is analyzed and a new TCR β chain specifically discriminating MART-1 is identified. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、Ｔ細胞レセプターβ鎖タンパク質、並びにＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子、該遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質発現ベクター、及び該発現ベクターが導入された形質転換体に関する。 The present invention relates to a T cell receptor β chain protein, a T cell receptor β chain gene, a T cell receptor β chain protein expression vector into which the gene is incorporated, and a transformant into which the expression vector has been introduced.

悪性黒色腫は、インターロイキン２などを用いた免疫療法が比較的有効な癌である（例えば、非特許文献１参照）が、生体内における抗腫瘍効果には、腫瘍細胞に反応する細胞傷害性Ｔ細胞（Cytotoxic T lymphocyte：ＣＴＬ）が重要であることが示されている（例えば、非特許文献２参照）。免疫療法後、腫瘍反応性Ｔ細胞が活性化され、Ｔ細胞上のＴ細胞レセプター（T cell receptor：ＴＣＲ）が、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）分子によって腫瘍細胞表面に提示される腫瘍細胞タンパク質が分解されてできたペプチド（腫瘍抗原）を認識し、腫瘍細胞を傷害する。更に各種サイトカインを分泌し、マクロファージ等の他の免疫細胞をも誘導活性化し、生体内で腫瘍拒絶を起こすと考えられている。腫瘍反応性Ｔ細胞には自己腫瘍細胞のみならず、ＨＬＡを共有する他の患者からの腫瘍細胞にも反応するような共通腫瘍抗原を認識する場合と、自己腫瘍細胞しか反応しない固有抗原を認識する場合がある。 Malignant melanoma is a cancer in which immunotherapy using interleukin 2 or the like is relatively effective (see, for example, Non-Patent Document 1). However, in vivo antitumor effects include cytotoxicity that reacts with tumor cells. It has been shown that T cells (Cytotoxic T lymphocyte: CTL) are important (see, for example, Non-Patent Document 2). After immunotherapy, tumor-reactive T cells are activated, and T cell receptors (TCR) on T cells are degraded by tumor cell proteins presented on the surface of tumor cells by HLA (human leukocyte antigen) molecules. Recognize the peptide (tumor antigen) produced and damage tumor cells. Furthermore, it is considered that various cytokines are secreted and other immune cells such as macrophages are induced and activated to cause tumor rejection in vivo. Tumor-reactive T cells recognize not only autologous tumor cells but also common tumor antigens that react to tumor cells from other patients who share HLA, and unique antigens that react only to self-tumor cells There is a case.

ヒト腫瘍細胞に対する免疫応答機構を解明して、新しい免疫療法を開発するためには、これらの腫瘍反応性Ｔ細胞が認識する腫瘍抗原を同定することが重要である。腫瘍反応性Ｔ細胞が樹立されている場合には、その反応性を利用した機能的ｃＤＮＡ発現クローニング法を用い、悪性黒色腫抗原の単離が可能である。例えば、転移メラノーマ患者からの腫瘍反応性細胞傷害性Ｔ細胞と、ＨＬＡ−Ａ２を発現する腫瘍細胞株とを用いて、メラノーマの予防、診断及び治療に用いることができる悪性黒色腫抗原を単離することが可能であり（例えば、特許文献１参照）、その一つＭＡＲＴ−１は同様な方法によって単離、同定されたものである。現在までに代表的なものとして、上記ＭＡＲＴ−１やｇｐ１００のような色素細胞（メラノサイト）組織特異的タンパク質、各種腫瘍と正常組織では精巣に発現が認められるＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ等のＣＴ抗原（Cancer-Testis抗原）、腫瘍細胞の遺伝子異常により産生されるβカテニン、ＣＤＫ４（cyclin dependent kinase 4）、ｐ１５、ＧｎＴ−Ｖ等の変異ペプチド抗原が単離されている（例えば、非特許文献３参照）。 In order to elucidate the immune response mechanism against human tumor cells and develop new immunotherapy, it is important to identify tumor antigens recognized by these tumor-reactive T cells. When tumor-reactive T cells have been established, malignant melanoma antigens can be isolated using a functional cDNA expression cloning method utilizing the reactivity. For example, a malignant melanoma antigen that can be used for the prevention, diagnosis, and treatment of melanoma is isolated using tumor-reactive cytotoxic T cells from metastatic melanoma patients and a tumor cell line that expresses HLA-A2. One of these is MART-1, which has been isolated and identified by the same method. Representative examples to date include pigment cell (melanocyte) tissue-specific proteins such as MART-1 and gp100, MAGE, BAGE, GAGE, NY-ESO-, which are expressed in testis in various tumors and normal tissues. Mutant peptide antigens such as CT antigens such as I (Cancer-Testis antigen), β-catenin produced by gene abnormality of tumor cells, CDK4 (cyclin dependent kinase 4), p15, GnT-V have been isolated (for example, Non-Patent Document 3).

Ｔ細胞はＴ細胞レセプターによりＭＨＣ分子／抗原ペプチド複合体を認識して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの標的細胞に結合するが、ＣＴＬはＭＨＣクラスＩ分子／抗原ペプチドの複合体のみに結合し(ＭＨＣクラスＩ拘束性)、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞はＭＨＣクラスII分子／抗原ペプチドの複合体のみしか結合できない（ＭＨＣクラスII拘束性）とされている。また、ＭＨＣクラスＩ分子はほとんどの有核細胞に発現しているが、ＭＨＣクラスII分子は限られた一部の細胞しか発現していない。このためＴｈ細胞はＭＨＣクラスII分子を発現した樹状細胞やＢ細胞、活性化Ｔ細胞などとは結合できるが、これら以外の腫瘍細胞や感染細胞などには直接結合することができない。しかし遺伝子操作によってＭＨＣクラスＩ拘束性とされるＣＴＬ由来のＴ細胞レセプター遺伝子を導入したＭＨＣクラスII拘束性とされるＣＤ４陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞が、対応抗原をパルスしたＡＰＣとＣＤ８非依存的に反応して活性化されることができ、対応抗原に結合できるＴ細胞レセプターを発現していることが示された。また、非特異的な抗腫瘍活性をもつ末梢血リンパ球に腫瘍抗原特異的ＣＴＬ由来のＴ細胞レセプター遺伝子を導入することにより、特異的に腫瘍を傷害することができることが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。 T cells recognize MHC molecule / antigen peptide complexes by T cell receptors and bind to target cells such as antigen presenting cells (APCs), whereas CTL binds only to MHC class I molecule / antigen peptide complexes. (MHC class I-restricted), helper T (Th) cells can only bind to MHC class II molecule / antigen peptide complexes (MHC class II-restricted). MHC class I molecules are expressed in most nucleated cells, but MHC class II molecules are expressed only in a limited number of cells. For this reason, Th cells can bind to dendritic cells, B cells, activated T cells, etc. expressing MHC class II molecules, but cannot bind directly to other tumor cells or infected cells. However, MHC class II-restricted CD4-positive CD8-negative T cells into which a CTL-derived T cell receptor gene, which is MHC class I-restricted by genetic manipulation, are introduced in an APC and CD8-independent manner by pulsing the corresponding antigen. It was shown to express a T cell receptor that can be activated in response and bind to the corresponding antigen. It has also been reported that tumors can be specifically injured by introducing a tumor antigen-specific CTL-derived T cell receptor gene into peripheral blood lymphocytes having non-specific antitumor activity (for example, Non-Patent Document 4).

他方、Ｔ細胞表面に存在する膜表面タンパク質であり、抗原認識を担うＴ細胞レセプターには、α鎖・β鎖から成るヘテロ二量体とγ鎖・δ鎖から成るヘテロ二量体の二種類が同定されている。Ｔ細胞レセプター遺伝子は免疫グロブリン遺伝子と同様に、可変領域（Ｖ：variable）、多様性領域（Ｄ：diversity）、結合領域（Ｊ：joining）からなり分子の多様性を生じるＶドメインと、細胞外定常領域、膜貫通領域、細胞内領域を含む定常領域（Ｃ：constant）からなるＣドメインにより構成されている。これらのアミノ酸配列はＴ細胞ごとに異なっていることから、Ｔ細胞レセプターは抗原認識分子であると同時に個々のＴ細胞の目印にもなっている。このＴ細胞レセプターの多様性は後天的なＴ細胞レセプター遺伝子の再構成によって生みだされており、Ｔ細胞レセプターβ，δ鎖はＶ−Ｄ−Ｊを、Ｔ細胞レセプターα，γ鎖はＶ−Ｊを再構成することが知られている。 On the other hand, it is a membrane surface protein present on the surface of T cells, and there are two types of T cell receptors responsible for antigen recognition: heterodimers composed of α and β chains and heterodimers composed of γ and δ chains. Has been identified. The T cell receptor gene, like the immunoglobulin gene, is composed of a variable region (V), a diversity region (D), a joining region (J), and a V domain that produces molecular diversity, and an extracellular region. It is composed of a C domain composed of a constant region (C: constant) including a constant region, a transmembrane region, and an intracellular region. Since these amino acid sequences differ from one T cell to another, the T cell receptor is an antigen recognition molecule and at the same time serves as a mark for individual T cells. This diversity of T cell receptors is generated by the rearrangement of the acquired T cell receptor gene. T cell receptor β and δ chains are VDJ, and T cell receptors α and γ chains are V-J. It is known to reconstruct J.

Ｔ細胞の初期分化は、Ｂ細胞と同様にＴ細胞レセプターのα鎖及びβ鎖遺伝子の再構成と密接に関わっている。Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子の再構成はＤＮ−Ｔ細胞（double negative：ＣＤ４⁻８⁻）の段階で開始され、β鎖遺伝子の再構成に成功した細胞はβ鎖タンパク質と代替α鎖（ｐｒｅＴα）の複合体、つまりプレＴ細胞レセプターを細胞表面に発現する。そして、ＣＤ４及びＣＤ８分子の発現が誘導され、ＤＰ−Ｔ細胞（double positive：ＣＤ４⁺８⁺）へと移行し、ＤＰとなったＴ細胞は、次にＴ細胞レセプターのα鎖遺伝子の再構成に成功した細胞のみが、Ｔ細胞レセプターを表面に発現できることが知られている。 The initial differentiation of T cells is closely related to the rearrangement of the α- and β-chain genes of the T cell receptor, as in B cells. T cell receptor beta reconstruction chain gene DN-T cells ^{(double negative: CD4 - 8 -} ) is started in step, beta chain gene cells which successfully reconstitution of beta-chain protein with an alternate α-chain (preTα) And the pre-T cell receptor is expressed on the cell surface. Then, the expression of CD4 and CD8 molecules is induced and transferred to DP-T cells (double positive: CD4 ⁺ 8 ⁺ ), and the T cells that become DP then reconstitute the α chain gene of the T cell receptor. It is known that only cells that have succeeded in expressing T cell receptors on the surface.

Ｔ細胞レセプターβ鎖の遺伝子構成に関しては、ヒトゲノム遺伝子配列情報データベースによれば、Ｔ細胞レセプターβ鎖の遺伝子は約３０種類の亜族（遺伝子自体は約７０種）からなるＶ遺伝子、２種類のＤ遺伝子、１４種類のＪ遺伝子、２種類のＣ遺伝子によって構成され、Ｖβ中に２つの可変領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２）が存在することも知られている。これらの中からＶβ、Ｄβ、Ｊβが各１つずつ選ばれて結合し、Ｔ細胞レセプターβ鎖をコードするＤＮＡが構成されている。この際、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβの結合部にはランダムな塩基の挿入や欠失が起こり、無限に近い多様性が生みだされている。このＶβ−Ｄβ−Ｊβの結合部位は、ＣＤＲ３（相補性決定領域３：third complementarity determining region）、結合部（junctional）領域と呼ばれ、Ｔ細胞レセプターの中で最も多型性に富む部分であり、塩基の挿入・欠失が起こるため、各遺伝子構成が同じであっても連結部分も含めて同一配列になることは極めて稀である。 Regarding the gene structure of the T cell receptor β chain, according to the human genome gene sequence information database, the T cell receptor β chain gene is composed of about 30 subgroups (the gene itself is about 70 types), the V gene, It is also known that it is composed of a D gene, 14 types of J genes, and 2 types of C genes, and two variable regions (CDR1, CDR2) are present in Vβ. Among these, Vβ, Dβ, and Jβ are selected and bonded one by one to constitute DNA encoding the T cell receptor β chain. At this time, random base insertions and deletions occur at the Vβ-Dβ-Jβ binding site, and infinite diversity is produced. This Vβ-Dβ-Jβ binding site is called CDR3 (third complementarity determining region) or junction region and is the most polymorphic portion of the T cell receptor. Since base insertion / deletion occurs, it is very rare that the same sequence including the linking portion is the same even if each gene structure is the same.

特表平１０−５０５４８１号公報Japanese National Patent Publication No. 10-505481 JAMA 271, 907, 1994JAMA 271, 907, 1994 Microbiol.Immunol. 42, 803, 1998Microbiol.Immunol. 42, 803, 1998 Immunol Res 16, 313, 1997Immunol Res 16, 313, 1997 J.Immunol.,171:3287-3295, 2003J. Immunol., 171: 3287-3295, 2003

Ｔ細胞レパートリーの多様性は、Ｔ細胞間での多様な抗原認識能と密接に関係していることから、Ｔ細胞の機能，免疫応答，免疫機能を考える上でＴ細胞レセプターレパートリーの機能解明を行うことは極めて重要である。最近、癌，自己免疫疾患，アレルギー疾患等において、患部局所に存在するＴ細胞のＴ細胞レセプターレパートリー解析の研究が進められ、疾患特異的なＴ細胞が解明されつつある。しかし、そのＴ細胞上のＴ細胞レセプター分子が、どのような働きをしているか、ということは、Ｔ細胞レセプター分子の単離が困難であること等の問題があり、まだその詳細が明らかにされるに至っていない。本発明の課題は、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＲＴ−１２７-３５ (ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ：以下、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドと称する。）を特異的に認識するＴ細胞レセプターβ鎖及びその遺伝子を提供することにある。 The diversity of the T cell repertoire is closely related to the ability to recognize various antigens between T cells, so the function of the T cell receptor repertoire should be elucidated when considering the function, immune response, and immune function of T cells. It is very important to do. Recently, in cancer, autoimmune diseases, allergic diseases, etc., research on T cell receptor repertoire analysis of T cells existing in the affected area has been advanced, and disease-specific T cells are being elucidated. However, the function of the T cell receptor molecule on the T cell is problematic because it is difficult to isolate the T cell receptor molecule, and the details are still clear. It has not been done. An object of the present invention is to provide a T cell receptor β chain and its gene that specifically recognize MART-1 27-35 (AAGIGILTV: hereinafter referred to as MART1-A2 peptide), which is a melanoma specific peptide. is there.

Ｔ細胞レセプター分子が、Ｔ細胞を介する免疫応答および免疫機構に重要な役割を果たしていることから、これら免疫応答および免疫機構の解析には、個々のＴ細胞レセプター分子を得ることが必要である。しかし、膜表面タンパク質を細胞から精製すると、１０¹⁰個の細胞からせいぜい１０μｇ程度しか得られない。しかも、Ｔ細胞レセプターの多様性により、一種類のＴ細胞レセプターを分取するためには、それぞれのＴ細胞レセプターを持つＴ細胞株を樹立し、その各々からＴ細胞レセプターを単離することが必須となる。しかし、Ｔ細胞のＴ細胞レセプターレパートリーは１０¹⁰種類にも及んでおり、１０¹⁰種のＴ細胞株を樹立することは、実質的に極めて困難である。 Since T cell receptor molecules play an important role in T cell-mediated immune responses and immune mechanisms, it is necessary to obtain individual T cell receptor molecules for analysis of these immune responses and immune mechanisms. However, when membrane surface proteins are purified from cells, only about 10 μg can be obtained from 10 ¹⁰ cells. Moreover, in order to sort out one type of T cell receptor due to the diversity of T cell receptors, it is possible to establish T cell lines having respective T cell receptors and to isolate T cell receptors from each of them. Required. However, the T cell receptor repertoire of T cells is as large as 10 ¹⁰ types, and it is substantially difficult to establish 10 ¹⁰ types of T cell lines.

ＭＡＲＴ−１はメラノーマに発現する癌抗原であり、ペプチドワクチンによる治療を受けている転移性のメラノーマ患者において、抗原抗体反応を強く誘導するものである。ＭＡＲＴ−１はＨＬＡ−Ａ２限局的な抗原決定部位を持っており（ＭＡＲＴ−１２７−３５：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）、ＭＡＲＴ−１ＨＬＡ−Ａ２テトラマー染色により、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の発現頻度が明らかになった。本発明者らは、樹状細胞に基づくＭＡＲＴ−１特異的な細胞障害性Ｔ細胞の誘導方法を構築し、ＨＬＡ０２０１のケース７例においてＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー染色を使用してそれらの特徴付を行った。患者から末梢血単核細胞を採取し、低濃度のＩＬ２存在下、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドでパルスされた樹状細胞を１：１０〜１：４０の割合で加え２回刺激した。細胞障害性Ｔ細胞の割合をさらに上げるため、そのセルラインにさらにＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドでパルスされたＴ２細胞を１：１０の割合で加えて刺激した。刺激培養されたＴ細胞の総数は、培養前に比較して２つのケースで増え、４つのケースで減少した。ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー陽性の細胞障害性Ｔ細胞の割合は、刺激前は０．１％だったところ、樹状細胞による刺激後には１．３％、さらにＴ２細胞刺激後では３０％に増加した。ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー陽性の細胞障害性Ｔ細胞の絶対数は、樹状細胞刺激前とＴ２細胞刺激後では、４６倍から６１９倍の範囲に増加した。ＭＡＲＴ−１特異的な細胞障害性Ｔ細胞系列を用いた細胞障害性Ｔ細胞のアッセイは、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドでパルスされたＴ２細胞やＨＬＡＡ０２０１陽性メラノーマ細胞に対し、そのテトラマー陽性な細胞障害性Ｔ細胞の発生頻度に応じた強力な殺傷能力の発現を示した。精製されたＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー陽性の細胞障害性Ｔ細胞における、ＣＤＲ３フラグメントサイズ解析を用いたＴ細胞受容体のレパートリー解析は、ＴＣＲＶｂ１３とＴＣＲＶｂ１６が５例中３例使われていた。ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー特異的な細胞障害性Ｔ細胞のクローニングは、Ｔ細胞レセプターβ鎖特異的な抗体を基にしてモノクローナル抗体を使った細胞障害性Ｔ細胞のMagnetic activated cell sortingにより行い、Ｔ細胞レセプターβ鎖のＤＮＡシークエンスを解析し、新規なＭＡＲＴ−１を特異的に認識するＴ細胞レセプターβ鎖を同定した。本発明は、上記知見に基づき完成するに至ったものである。 MART-1 is a cancer antigen expressed in melanoma and strongly induces an antigen-antibody reaction in metastatic melanoma patients treated with peptide vaccines. MART-1 has an HLA-A2 localized antigen-determining site (MART-1 27-35: AAGIGILTV). By MART-1 HLA-A2 tetramer staining, cytotoxic T specific to MART1-A2 peptide The expression frequency of cells became clear. The present inventors constructed a method for inducing MART-1-specific cytotoxic T cells based on dendritic cells and characterized them using MART1-A2 tetramer staining in 7 cases of HLA0201. It was. Peripheral blood mononuclear cells were collected from the patient, and dendritic cells pulsed with MART1-A2 peptide were added at a ratio of 1:10 to 1:40 and stimulated twice in the presence of low concentration of IL2. In order to further increase the proportion of cytotoxic T cells, T2 cells pulsed with MART1-A2 peptide were further added to the cell line at a ratio of 1:10 for stimulation. The total number of stimulated T cells increased in 2 cases compared to before culture and decreased in 4 cases. The ratio of MART1-A2 tetramer positive cytotoxic T cells was 0.1% before stimulation, increased to 1.3% after stimulation with dendritic cells, and further increased to 30% after stimulation with T2 cells. The absolute number of MART1-A2 tetramer positive cytotoxic T cells increased from 46 times to 619 times before and after dendritic cell stimulation. Cytotoxic T cell assays using a MART-1 specific cytotoxic T cell lineage include tetramer positive cytotoxicity against T2 cells pulsed with MART1-A2 peptide and HLA A0201-positive melanoma cells. It showed a strong killing ability depending on the frequency of T cell generation. In purified MART1-A2 tetramer positive cytotoxic T cells, TCRVb13 and TCRVb16 were used in 3 out of 5 cases for T cell receptor repertoire analysis using CDR3 fragment size analysis. Cloning of MART1-A2 tetramer-specific cytotoxic T cells is carried out by magnetically activated cell sorting of cytotoxic T cells using monoclonal antibodies based on T-cell receptor β-chain specific antibodies. By analyzing the DNA sequence of the β chain, a T cell receptor β chain that specifically recognizes novel MART-1 was identified. The present invention has been completed based on the above findings.

すなわち本発明は、（１）配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子や、（２）上記（１）記載のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターや、（３）上記（２）記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターが導入された形質転換体や、（４）組換えベクターが導入されたリンパ球である上記（３）記載の形質転換体や、（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質や、（６）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を特異的に認識する抗体や、（７）配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球を有効成分とするメラノーマ治療用組成物に関する。 That is, the present invention relates to (1) a T cell receptor β chain gene comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (2) a T cell receptor β into which the T cell receptor β chain gene described in (1) above is incorporated. A recombinant vector capable of expressing a chain protein, (3) a transformant introduced with a recombinant vector capable of expressing the T cell receptor β chain protein described in (2) above, or (4) a recombinant vector introduced. (5) a T cell receptor β chain protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (6) an amino acid represented by SEQ ID NO: 2 An antibody specifically recognizing a T cell receptor β chain protein comprising the sequence; and (7) a T cell receptor incorporating a T cell receptor β chain gene comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Melanoma therapeutic compositions recombinant vectors capable of expressing the β-chain protein as an active ingredient the introduced lymphocytes in vitro related.

本発明によると、メラノーマにおけるＴ細胞の機能，免疫応答，免疫機能を解明する上で有用である。また、本発明のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子を利用した遺伝子治療や養子免疫療法により、メラノーマを治療しうる可能性がある。 According to the present invention, it is useful for elucidating the function, immune response, and immune function of T cells in melanoma. Moreover, there is a possibility that melanoma can be treated by gene therapy or adoptive immunotherapy using the T cell receptor β chain gene of the present invention.

本発明の遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列、好ましくは５’側端部のＡＴＧの上流側に６塩基（ＧＣＡＧＣＣ）が付加された塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子であり、本発明の発現ベクターは、配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターであり、本発明の形質転換体は、配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターが導入された形質転換体、好ましくは形質転換ヒト細胞であり、本発明のタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質であり、本発明の抗体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を特異的に認識記する抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。 The gene of the present invention is a T cell receptor β chain gene comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, preferably a nucleotide sequence in which 6 nucleotides (GCAGCC) are added upstream of ATG at the 5 ′ end. The expression vector of the present invention is a recombinant vector capable of expressing a T cell receptor β chain protein into which a T cell receptor β chain gene comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been incorporated. The body is a transformant into which a recombinant vector capable of expressing a T cell receptor β chain protein into which a T cell receptor β chain gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been introduced, preferably a transformed human. The protein of the present invention is a T cell receptor β chain protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the antibody of the present invention is SEQ ID NO: In specifically recognizing serial antibodies to T cell receptor β chain protein consisting of the amino acid sequence represented, preferably a monoclonal antibody.

本発明の遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１に示される塩基配列又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の各情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。例えば、細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。 The method for obtaining and preparing the gene of the present invention is not particularly limited, and is appropriate based on each information of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 disclosed in the present specification. The target gene can be isolated by preparing a suitable probe or primer and screening a human cDNA library in which the gene is predicted to exist, or can be prepared by chemical synthesis according to a conventional method . For example, isolation of total RNA from cells or tissues, isolation and purification of mRNA, acquisition of cDNA, and cloning thereof can be performed according to conventional methods. Methods for screening the gene of the present invention from a cDNA library are commonly used by those skilled in the art, such as the method described in Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989. Can be mentioned.

本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現しているＴ細胞からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。 The method for obtaining and preparing the protein of the present invention is not particularly limited, and may be a naturally derived protein, a chemically synthesized protein, or a recombinant protein produced by a gene recombination technique. When a naturally derived protein is obtained, the protein of the present invention can be obtained by appropriately combining protein isolation / purification methods from T cells expressing such protein. When preparing a protein by chemical synthesis, for example, the protein of the present invention can be synthesized according to a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). it can. In addition, the protein of the present invention can be synthesized using various commercially available peptide synthesizers. When a protein is prepared by a gene recombination technique, the protein of the present invention can be prepared by introducing DNA consisting of a base sequence encoding the protein into a suitable expression system. Among these, preparation by a gene recombination technique that can be prepared in a large amount by a relatively easy operation is preferable.

例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。 For example, when the protein of the present invention is prepared by genetic recombination techniques, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography can be used to recover and purify the protein from cell culture. , Known methods including hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography, preferably high performance liquid chromatography. In particular, the column used for affinity chromatography is, for example, a column in which an antibody such as a monoclonal antibody against the protein of the present invention is bound, or when a normal peptide tag is added to the protein of the present invention, By using a column to which an affinity substance is bound, purified products of these proteins can be obtained. In addition, when the protein of the present invention is expressed on the cell membrane, a purified sample can be obtained by carrying out the above purification treatment after allowing the cell membrane degrading enzyme to act.

また、本発明のタンパク質をマーカータンパク質やペプチドタグと結合させることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製や、本発明のタンパク質の検出や、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。 In addition, the protein of the present invention can be bound to a marker protein or a peptide tag. The marker protein is not particularly limited as long as it is a conventionally known marker protein. Specific examples include an enzyme such as alkaline phosphatase and HRP, an Fc region of an antibody, and a fluorescent substance such as GFP. As peptide tags in the present invention, conventionally known peptide tags such as epitope tags such as HA, FLAG, and Myc, and affinity tags such as GST, maltose binding protein, biotinylated peptide, oligohistidine, etc. Specific examples can be given. Such a fusion peptide can be prepared by a conventional method. Purification of the protein of the present invention utilizing the affinity between Ni-NTA and His tag, detection of the protein of the present invention, and quantification of an antibody against the protein of the present invention. It is also useful as a research reagent in this field.

本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子を含み、かつ前記本発明のタンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されないが、動物細胞において発現しうるものが好ましい。本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。 The recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains the gene of the present invention and can express the protein of the present invention, but is preferably a vector that can be expressed in animal cells. The recombinant vector of the present invention can be constructed by appropriately integrating the gene of the present invention into an expression vector. Such an expression vector is preferably one that is capable of autonomous replication in a host cell, or one that can be integrated into the host cell chromosome, and includes a promoter, enhancer, terminator, etc. at a position where the gene of the present invention can be expressed. Those containing a control sequence can be preferably used.

動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307, 1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。 Examples of expression vectors for animal cells include pEGFP-C1 (Clontech), pGBT-9 (Clontech), pcDNAI (Funakoshi), pcDM8 (Funakoshi), pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133, 1990), pCDM8 (Nature, 329, 840, 1987), pcDNAI / AmP (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J. Blochem., 101, 1307, 1987), pAGE210, etc. Can do. Examples of promoters for animal cells include cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate early) gene promoter, SV40 early promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter, SRα promoter and the like. Can do.

本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入された宿主細胞であれば特に制限されないが、リンパ球が好ましく、中でもナイーブＴ細胞が好ましい。特に、配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球、好ましくは、ナイーブＴ細胞は、養子免疫療法等に好適に用いることができるメラノーマ治療用組成物として有用である。養子免疫療法等免疫治療剤に用いる場合は、形質転換Ｔ細胞クローンを精製することが好ましく、その手法としては、リン酸緩衝液等に混合して遠心する方法、分離剤を用いた比重遠心法などを用いることができる。メラノーマ治療用組成物の投与量は、１回あたり形質転換リンパ球として１０⁶〜１０¹²個の細胞が好ましい。投与形態としては、注射剤、点滴剤等の液体が好ましく、形質転換リンパ球をヒト血清アルブミンを０．０１〜５％となるように添加した生理食塩液に分散した注射剤又は点滴剤がより好ましい。投与方法としては、静脈への点滴又は静脈、動脈、局所等への注射が好ましい。投与する液量は、投与方法、投与する場所等に異なるが、５０〜５００ccとするのが好ましく、この液量に前記の形質転換リンパ球が含まれるようにするのが好ましい。投与頻度は１回／日〜１回／月とするのが好ましく、投与回数は少なくとも１回、好ましくは５回以上とすることができる。 The transformant of the present invention is not particularly limited as long as it is a host cell into which the above-described recombinant vector of the present invention has been introduced. However, lymphocytes are preferable, and naive T cells are particularly preferable. In particular, a lymphocyte into which a recombinant vector capable of expressing a T cell receptor β chain protein into which a T cell receptor β chain gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been incorporated, preferably naïve T The cells are useful as a composition for melanoma treatment that can be suitably used for adoptive immunotherapy and the like. When used as an immunotherapeutic agent such as adoptive immunotherapy, it is preferable to purify a transformed T cell clone. As the method, a method of mixing and centrifuging in a phosphate buffer or the like, a specific gravity centrifugation using a separating agent Etc. can be used. The dose of the composition for treating melanoma is preferably 10 ⁶ to 10 ¹² cells as transformed lymphocytes per time. As the dosage form, liquids such as injections and infusions are preferable, and injections or infusions in which transformed lymphocytes are dispersed in physiological saline supplemented with human serum albumin at 0.01 to 5% are more preferable. preferable. As the administration method, intravenous drip or injection into veins, arteries, and the like is preferable. The amount of liquid to be administered varies depending on the administration method, the place to administer, etc., but it is preferably 50 to 500 cc, and the liquid lymphocyte is preferably included in this liquid amount. The frequency of administration is preferably 1 time / day to 1 time / month, and the frequency of administration can be at least once, preferably 5 times or more.

本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に特異的に結合する抗体は、例えば、メラノーマの診断や本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。 Specific examples of antibodies that specifically bind to the T cell receptor β chain protein of the present invention include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, humanized antibodies and the like. These can be prepared by a conventional method using the T cell receptor β chain protein of the present invention as an antigen, and among them, a monoclonal antibody is more preferable in view of its specificity. An antibody that specifically binds to the T cell receptor β chain protein of the present invention, such as a monoclonal antibody, is useful, for example, in diagnosing melanoma and clarifying the molecular mechanism of the T cell receptor β chain protein of the present invention. .

本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。以下に本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質として、ヒトＴ細胞由来の本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を例に挙げてマウス由来の本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に対して特異的に結合するモノクローナル抗体、すなわち抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖マウスモノクローナル抗体の作製方法を説明する。 The antibody against the T cell receptor β-chain protein of the present invention is administered to an animal (preferably a non-human) animal by expressing the T cell receptor β-chain protein of the present invention or a cell expressing the protein on the membrane surface using a conventional protocol. For example, for the preparation of monoclonal antibodies, the hybridoma method (Nature 256, 495-497, 1975), the trioma method, the human B cell hybridoma method (Immunology) Today 4, 72, 1983) and EBV-hybridoma method (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985) can be used. Specific examples of the T cell receptor β chain protein of the present invention derived from a mouse T cell receptor β chain protein of the present invention are exemplified below. A method for producing a binding monoclonal antibody, that is, an anti-hT cell receptor β-chain mouse monoclonal antibody will be described.

上記抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体は、抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。 The anti-hT cell receptor β-chain monoclonal antibody can be produced by culturing an anti-hT cell receptor β-chain monoclonal antibody-producing hybridoma in vivo or in vitro by a conventional method. For example, in an in vivo system, it can be obtained by culturing in the abdominal cavity of a rodent, preferably a mouse or a rat. In an in vitro system, it can be obtained by culturing in an animal cell culture medium. As a medium for culturing a hybridoma in an in vitro system, a cell culture medium such as RPMI 1640 or MEM containing an antibiotic such as streptomycin or penicillin can be exemplified.

抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質又は該タンパク質を膜表面に発現したＴ細胞を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。 An anti-hT cell receptor β chain monoclonal antibody-producing hybridoma can be obtained by, for example, immunizing a BALB / c mouse using the T cell receptor β chain protein of the present invention or a T cell expressing the protein on the membrane surface. Spleen cells and mouse NS-1 cells (ATCC TIB-18) are fused by a conventional method and screened with an immunofluorescent staining pattern to produce an anti-hT cell receptor β-chain monoclonal antibody-producing hybridoma. . In addition, as a method for separating and purifying the monoclonal antibody, any method can be used as long as it is a method generally used for protein purification, and liquid chromatography such as affinity chromatography can be specifically exemplified. .

また、本発明の上記本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。 In order to produce a single chain antibody against the T cell receptor β chain protein of the present invention, the method for preparing a single chain antibody (US Pat. No. 4,946,778) can be applied. In order to express a humanized antibody, a clone expressing the T cell receptor β chain protein of the present invention can be isolated and identified using a transgenic mouse or other mammals, or using the above antibody. Alternatively, the polypeptide can be purified by affinity chromatography.

また上記本発明の抗ｈＴ細胞レセプターβ鎖モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^３５Ｓ又は^３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記本発明のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。 Examples of the anti-hT cell receptor β chain monoclonal antibody of the present invention include fluorescent substances such as FITC (fluorescein isocyanate) or tetramethylrhodamine isocyanate, ¹²⁵ I, ³² P, ¹⁴ C, ³⁵ S or ³ H. By using a fusion protein fused with a radioisotope such as alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase or phycoerythrin, or a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). Functional analysis of the T cell receptor β chain protein of the invention can be performed. Examples of the immunological measurement method include RIA method, ELISA method, fluorescent antibody method, plaque method, spot method, hemagglutination method, and octalony method.

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、実施例１における実験概要は、メラノーマ患者（ＨＬＡ−Ａ２陽性）リンパ球→メラノーマ抗原ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドにて処理した樹状細胞の作製→樹状細胞刺激によるＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ細胞の誘導→Auto MACS法によるＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマーによるＭＡＲＴ−１特異的ＣＴＬの純化→ＲＮＡ抽出→逆転写反応→ＰＣＲによるＴ細胞レセプター遺伝子の増幅→ＤＮＡＡｎａｌｙｚｅｒ (ＡＢＩ３１００) を用いたＤＮＡ断片解析（Ｔ細胞レセプター遺伝子の同定）→ＰＣＲによる蛋白コード領域の増幅とクローニング→ＡＢＩ３１００による塩基配列の決定である。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations. The outline of the experiment in Example 1 is as follows: melanoma patient (HLA-A2 positive) lymphocytes → preparation of dendritic cells treated with melanoma antigen MART1-A2 peptide → MART1-A2 peptide-specific CTL cells by dendritic cell stimulation -> Purification of MART-1-specific CTL by MART1-A2 tetramer by Auto MACS method-> RNA extraction-> Reverse transcription reaction-> Amplification of T cell receptor gene by PCR-> DNA fragment analysis using DNA Analyzer (ABI3100) (T Identification of cell receptor gene) → Amplification and cloning of protein coding region by PCR → Determination of base sequence by ABI3100.

国立がんセンター倫理審査委員会の承認を受けて実施された臨床研究（悪性黒色腫に対する樹状細胞を用いた腫瘍特異的免疫療法）で得られたメラノーマ患者由来のリンパ球を用いた。この臨床研究は、ＨＬＡ−Ａ２及びＡ２４の患者を対象に５種類の腫瘍関連抗原ペプチドにて処理した樹状細胞を患者皮下に投与し、腫瘍免疫を誘導する臨床試験である。本研究では、ＨＬＡ-Ａ２陽性の患者由来のリンパ球を、メラノーマ特異的ペプチドであるＭＡＲＴ−１２７-３５ (ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号３)にて処理した樹状細胞を用いて数回刺激を行った。誘導されたＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＣＴＬ細胞は、ＰＥ−ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマーにて染色し、定量的な評価を行った。テトラマー染色陽性のＣＴＬ細胞の比率は、３８％であり、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的な細胞障害活性を示した。磁気ビーズ細胞分離装置（Auto-magnet cell sorting system）を用いて、ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー陽性ＣＴＬ細胞を純化した。ＭＡＲＴ１−Ａ２テトラマー陽性細胞の樹状細胞刺激後とＭＡＣＳ法による純化後について解析を行ったところ、陽性細胞は９６％であった（図１）。これらのＣＴＬ細胞は、次のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のレパトワ解析に利用された。 We used lymphocytes derived from melanoma patients obtained in clinical studies (tumor-specific immunotherapy using dendritic cells for malignant melanoma) conducted with the approval of the National Cancer Center Ethics Review Board. This clinical study is a clinical trial that induces tumor immunity by administering dendritic cells treated with 5 types of tumor-associated antigen peptides subcutaneously to HLA-A2 and A24 patients. In this study, lymphocytes derived from HLA-A2-positive patients were treated with dendritic cells treated with melanoma-specific peptide MART-1 27-35 (MART1-A2 peptide: AAGIGILTV; SEQ ID NO: 3). Stimulation was performed several times. The induced MART1-A2 peptide-specific CTL cells were stained with PE-MART1-A2 tetramer and quantitatively evaluated. The ratio of CTL cells positive for tetramer staining was 38%, indicating cytotoxic activity specific to MART1-A2 peptide. MART1-A2 tetramer positive CTL cells were purified using an auto-magnet cell sorting system. When analysis was performed after dendritic cell stimulation of the MART1-A2 tetramer positive cells and after purification by the MACS method, the number of positive cells was 96% (FIG. 1). These CTL cells were used for subsequent repertoire analysis of the T cell receptor (TCR).

分離細胞からtotal ＲＮＡを抽出し、逆転写反応にてｃＤＮＡ合成後、ＰＣＲ法を用いたＴ細胞レセプターレパトワ解析により発現Ｔ細胞レセプターの遺伝子分類を行い、解析結果に基づいてＴ細胞レセプター蛋白コード領域遺伝子をクローニングした。樹状細胞による刺激前のリンパ球を用いた解析結果を図２、樹状細胞による刺激後及びテトラマー陽性細胞の純化後のＣＴＬ細胞を用いた解析結果図３に示す。樹状細胞による刺激の前後では、Ｔ細胞レセプターの遺伝子発現に関して、明らかな収束性が認められた。 Extract total RNA from isolated cells, synthesize cDNA by reverse transcription reaction, classify expressed T cell receptor genes by T cell receptor repertoire analysis using PCR method, and based on the analysis results T cell receptor protein code The region gene was cloned. The analysis results using lymphocytes before stimulation with dendritic cells are shown in FIG. 2, and the analysis results using CTL cells after stimulation with dendritic cells and after purification of tetramer positive cells are shown in FIG. A clear convergence was observed for T cell receptor gene expression before and after stimulation with dendritic cells.

Ｔ細胞レセプターレパトワ解析の結果に基づいて４種類の遺伝子（ＢＶ３、ＢＶ１２、ＢＶ１３Ａ、ＢＶ１３Ｂ）に対応するプライマー（配列番号４−８）を用いてＰＣＲ増幅を行い（図４）、各増幅断片の塩基配列を解析した。レパトワ解析では４種類の遺伝子の使用が示されたが、塩基配列の解析により単一の遺伝子に由来することが明らかになった（図５）。解析の結果、このＴ細胞レセプターのＶ遺伝子はＢＶ３（新統一名称ＴＲＢＶ２８、以下こちらの統一名称を使用）であり、他の３種類のプライマーはこの遺伝子に交叉反応して増幅を生じていたことが判明した。 Based on the results of T cell receptor repertoire analysis, PCR amplification was performed using primers (SEQ ID NOs: 4-8) corresponding to four types of genes (BV3, BV12, BV13A, BV13B) (FIG. 4), and each amplified fragment The nucleotide sequence of was analyzed. Repatois analysis showed the use of four types of genes, but base sequence analysis revealed that they were derived from a single gene (FIG. 5). As a result of the analysis, the V gene of this T cell receptor was BV3 (new unified name TRBV28, hereinafter referred to as this unified name), and the other three types of primers cross-reacted with this gene, resulting in amplification. There was found.

ＴＲＢＶ２８遺伝子に対応するセンスプライマー（配列番号９）とＴＲＢＣ１（Ｃ遺伝子）に対応するアンチセンスプライマー（配列番号１０）を用いて、本Ｔ細胞レセプター遺伝子蛋白コード領域全域（配列番号１）の遺伝子増幅を行い、これをクローニングした（図６）。塩基配列決定の結果、Ｔ細胞レセプター遺伝子の構成はＴＲＢＶ２８^＊０１―ＴＲＢＤ１―ＴＲＢＪ１−５^＊０１―ＴＲＢＣ１であった。また、Ｖ−Ｄ−Ｊの接合部分の塩基配列につき、ＩＭＧＴ^※１の公開ソフト（JunctionAnalysis）を用いた解析結果を図６に示す。また、Ｔ細胞レセプター遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列についてＮＣＢＩ^※２の相同性検索プログラム（ＢＬＡＳＴ）による解析を行った。その結果、全長及びＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃの接合領域を含む部分断片（２７１−４５０、１８０塩基）の塩基配列については、完全に一致するものはなかった。全長及びＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃの接合部を中心とした部分断片（６０アミノ酸）のアミノ酸配列について検索した場合でも、相同性が高いものはあるが、抗原特異性を決定する接合領域に関して完全に一致する登録はなかった。 Using the sense primer (SEQ ID NO: 9) corresponding to the TRBV28 gene and the antisense primer (SEQ ID NO: 10) corresponding to TRBC1 (C gene), gene amplification of the entire T cell receptor gene protein coding region (SEQ ID NO: 1) This was cloned (FIG. 6). As a result of the nucleotide sequence determination, the structure of the T cell receptor gene was TRBV28 ^* 01-TRBD1-TRBJ1-5 ^* 01-TRBC1. Further, FIG. 6 shows the results of analysis using IMGT ^{* 1} public software (Junction Analysis) for the base sequence of the VDJ junction. Further, the nucleotide sequence and amino acid sequence of the T cell receptor gene were analyzed by the NCBI ^{* 2} homology search program (BLAST). As a result, the base sequence of the partial fragment (271-450, 180 bases) including the full length and the VD-J-C junction region did not completely match. Even when searching for the full-length and the amino acid sequence of a partial fragment (60 amino acids) centered on the VD-J-C junction, there are those with high homology, but the junction region that determines antigen specificity is complete. There were no registrations matching.

本研究に使用したプライマーの配列は、Ｔ細胞レセプターレパトワ解析ではJeffry R. Currier and Mary Ann Robinsonが成書Current Protocols in Immunology^※３に記載したものを使用し、蛋白コード領域のクローニングでは、公開データベース（ＮＣＢＩ）に収載されるゲノム配列にもとづいた。
※１ ImMunoGeneTics:1125985409921_0
※２ National Center for Biotechnology Information:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
※３ Current Protocols in Immunology, John E. Coligan et al. ed. (2000) 10.28.1-10.28.24. John Wiley & Sons, Inc. The primer sequences used in this study were those described by Jeffry R. Currier and Mary Ann Robinson in the book Current Protocols in Immunology ^{* 3} for the T cell receptor repertoire analysis. Based on the genome sequence listed in the database (NCBI).
* 1 ImMunoGeneTics: 1125985409921_0
* 2 National Center for Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
* 3 Current Protocols in Immunology, John E. Coligan et al. Ed. (2000) 10.28.1-10.28.24. John Wiley & Sons, Inc.

実施例１で得られたＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的ＣＴＬ由来のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子がＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞へ導入された場合に、該遺伝子産物である受容体タンパク質が発現し、腫瘍特異的な細胞障害活性を誘導しうるか否かにつき検討した。ここで、ナイーブＴ細胞とは、胸腺での分化後、抗原にまだ遭遇していないＴ細胞のことである。 When the T cell receptor β-chain gene derived from MART1-A2 peptide-specific CTL obtained in Example 1 is introduced into an HLA-A2-positive naive T cell, the receptor protein as the gene product is expressed, and tumor Whether specific cytotoxic activity could be induced was examined. Here, naive T cells are T cells that have not yet encountered an antigen after differentiation in the thymus.

まず、抗ＣＤ３抗体での刺激によるＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のナイーブＴ細胞の増殖に与える影響を２種類の培地について検討した。ＧＴ−Ｔ５０３（タカラバイオ）＋５％ヒト血清（Cambrex）培地、あるいはＰＲＭＩ１６４０＋５％ヒト血清培地に、抗ヒトＣＤ３抗体を各濃度（０、１、２、５、１０μｇ／ｍｌ，ヤンセンファーマ）にて添加し、ナイーブＴ細胞（臨床試験に登録されたメラノーマ患者由来）を５日間培養した後、培養液のＯＤ４５０ｎｍにおける吸光度を吸光光度計（Narge Nunc International社製）で測定した。結果を図７に示す。その結果、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のナイーブＴ細胞は、抗ヒトＣＤ３抗体の濃度依存的に刺激され増殖することが確認された。また、ＧＴ−Ｔ５０３培地は、既存のＲＰＭＩ１６４０培地に比較して良好な増殖支持効果があることから、今回の実験で用いることとした。 First, the effect of stimulation with anti-CD3 antibody on the proliferation of HLA-A0201-positive naive T cells was examined for two types of media. Anti-human CD3 antibody was added to GT-T503 (Takara Bio) + 5% human serum (Cambrex) medium or PRMI1640 + 5% human serum medium at various concentrations (0, 1, 2, 5, 10 μg / ml, Janssen Pharma) After naive T cells (derived from melanoma patients registered in clinical trials) were cultured for 5 days, the absorbance at OD 450 nm of the culture solution was measured with an absorptiometer (Narge Nunc International). The results are shown in FIG. As a result, it was confirmed that HLA-A0201-positive naive T cells were stimulated and proliferated depending on the concentration of anti-human CD3 antibody. In addition, since the GT-T503 medium has a better growth support effect than the existing RPMI1640 medium, it was decided to use it in this experiment.

次に、抗ヒトＣＤ３抗体と抗ヒトＣＤ２８抗体のＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞増殖に対する効果を検討した。ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のメラノーマ患者由来のナイーブＴ細胞をＧＴ−Ｔ５０３＋５％ヒト血清培地に懸濁し、あらかじめ抗ヒトＣＤ３抗体単独（５μｇ／ｍｌ）、抗ヒトＣＤ２８抗体単独（２μｇ／ｍｌ，BD Pharmingen）又は抗ヒトＣＤ３抗体（２．５μｇ／ｍｌ）と抗ヒトＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ）との併用にて２時間コーティングを行った７５ｃｍ^２フラスコに、上記のリンパ球を２ｘ１０^６／ｍｌの濃度で播種し、５日間培養した後、培養液のＯＤ４５０ｎｍにおける吸光度を、吸光光度計で測定した。結果を図８に示す。その結果、抗ヒトＣＤ２８抗体は、最終濃度１μｇ／ｍｌで抗ヒトＣＤ３抗体（２．５μｇ／ｍｌ）との併用によりナイーブＴ細胞の増殖刺激効果を促進することを確認した。 Next, the effect of anti-human CD3 antibody and anti-human CD28 antibody on the proliferation of HLA-A2-positive naive T cells was examined. Naive T cells derived from HLA-A0201-positive melanoma patients are suspended in GT-T503 + 5% human serum medium, and anti-human CD3 antibody alone (5 μg / ml), anti-human CD28 antibody alone (2 μg / ml, BD Pharmingen) or The above lymphocytes were seeded at a concentration of 2 × 10 ⁶ / ml in a 75 cm ² flask coated with anti-human CD3 antibody (2.5 μg / ml) and anti-human CD28 antibody (1 μg / ml) for 2 hours. Then, after culturing for 5 days, the absorbance of the culture solution at OD450 nm was measured with an absorptiometer. The results are shown in FIG. As a result, it was confirmed that the anti-human CD28 antibody promotes the proliferation stimulating effect of naive T cells when used in combination with the anti-human CD3 antibody (2.5 μg / ml) at a final concentration of 1 μg / ml.

さらに、上記の抗ヒトＣＤ３抗体と抗ヒトＣＤ２８抗体との併用により増殖刺激されたナイーブＴ細胞を回収し、Human T cell Nucleofector kit（Amaxa）を用いて、取扱い説明書に従い当該Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子のエレクトロポレーション法（Nucleofector装置，Amaxa）による遺伝子導入を行った。まず、５×１０^６個の刺激後のリンパ球をそれぞれ１００μｌのエレクトロポレーション用ｂｕｆｆｅｒに懸濁した後、ｍｏｃｋ（４μｇ）、ＧＦＰ発現プラスミド（２μｇ）、及びＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子発現プラスミド（２μｇ又は４μｇ）を加え、キュベットに移し変えてNucleofector装置にサンプルをセットし、プログラムＮｏ．２３でエレクトロポレーションを実施した。その際、ｍｏｃｋとして使用したベクターはAmaxa社のHuman T cell Nucleofector kitに付属のｐｍａｘＧＦＰベクターからＧＦＰ遺伝子を切り出したものを、Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子発現プラスミドは、ｐｍａｘＧＦＰベクターからＧＦＰ遺伝子をＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子に乗せ変えたものを作成し、使用した。細胞を回収後、１２−ウェルプレートに移してＧＴ−Ｔ５０３＋５％ヒト血清培地にて４８時間培養を行った後、フローサイトメトリー（FACSCalibur, BD）にてＧＦＰおよびＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子の導入効率を検討した。結果を図９に示す。その結果、エレクトロポレーション法によりＧＦＰ遺伝子はナイーブＴ細胞全体の５４．７％に効率良く導入された。Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子は、投与量４μｇでリンパ球全体の３５．６％に、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の５１．５％に導入発現が確認された。 Furthermore, naive T cells that have been proliferated and stimulated by the combined use of the above-mentioned anti-human CD3 antibody and anti-human CD28 antibody are collected, and the T cell receptor β chain is collected using the Human T cell Nucleofector kit (Amaxa) according to the instruction manual. Gene transfer was performed by gene electroporation (Nucleofector apparatus, Amaxa). First, 5 × 10 ⁶ lymphocytes after stimulation were suspended in 100 μl of an electroporation buffer, followed by mock (4 μg), GFP expression plasmid (2 μg), and T cell receptor β chain gene expression plasmid ( 2 μg or 4 μg), transfer to a cuvette and set the sample in the Nucleofector device. Electroporation was performed at 23. At that time, the vector used as mock was a GFP gene excised from the pmaxGFP vector attached to Amaxa's Human T cell Nucleofector kit. It was created by using a β-chain gene. After recovering the cells, the cells were transferred to a 12-well plate and cultured in GT-T503 + 5% human serum medium for 48 hours, and then introduced with GFP and T cell receptor β chain gene by flow cytometry (FACSCalibur, BD). It was investigated. The results are shown in FIG. As a result, the GFP gene was efficiently introduced into 54.7% of the whole naive T cells by electroporation. The T cell receptor β chain gene was confirmed to be introduced and expressed in 35.6% of all lymphocytes and 51.5% of CD3 positive T cells at a dose of 4 μg.

ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドにて処理したＴ２細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１９９２）に対する、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴ細胞レセプターβ鎖を発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞の細胞障害活性を評価した。Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子を導入発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞としては、前記エレクトロポレーションによりＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子発現プラスミドを２μｇ又は４μｇ導入した細胞を使用した。また、Ｔ２細胞は、ヒトＴ／Ｂ細胞のハイブリッドであるＴ１細胞（不死化したリンパ芽球細胞）からＨＬＡ−Ａ２を発現するクローンを選別して取られた細胞である。該Ｔ２細胞をＰＢＳ＋１％ヒト血清アルブミン溶液に懸濁し、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドを最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で２時間インキュベートした。該ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド処理したＴ２細胞１×１０^５個を、同数の前記Ｔ細胞レセプターβ鎖を発現したナイーブＴ細胞と共に混合培養した。２４時間刺激後、培養上清を回収し、刺激により産生されたＩＦＮ−γを定量し、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド処理したＴ２細胞に対する、前記ナイーブＴ細胞の細胞障害活性の指標とした。 Cytotoxic activity of HLA-A2-positive naive T cells expressing MART1-A2 peptide-specific T cell receptor β chain was evaluated against T2 cells (ATCC No. CRL-1992) treated with MART1-A2 peptide. As HLA-A2-positive naive T cells into which the T cell receptor β chain gene was introduced and expressed, cells into which 2 μg or 4 μg of the T cell receptor β chain gene expression plasmid was introduced by the electroporation were used. T2 cells are cells obtained by selecting clones expressing HLA-A2 from T1 cells (immortalized lymphoblast cells) which are hybrids of human T / B cells. The T2 cells were suspended in PBS + 1% human serum albumin solution, MART1-A2 peptide was added to a final concentration of 20 μg / ml, and incubated at 37 ° C. for 2 hours. 1 × 10 ⁵ T2 cells treated with the MART1-A2 peptide were mixed and cultured with naive T cells expressing the same number of the T cell receptor β chains. After stimulation for 24 hours, the culture supernatant was collected, IFN-γ produced by stimulation was quantified, and used as an index of the cytotoxic activity of the naive T cells against T2 cells treated with MART1-A2 peptide.

その結果、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴ細胞レセプターを発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞は、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドで処理したＴ２細胞特異的にＩＦＮ−γ産生を示した。（図１０）。 As a result, HLA-A2-positive naive T cells expressing a MART1-A2 peptide-specific T cell receptor showed IFN-γ production specifically for T2 cells treated with the MART1-A2 peptide. (FIG. 10).

さらに、各種培養メラノーマ細胞に対する、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴ細胞レセプターβ鎖を発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞の細胞障害活性についても評価した。Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子を導入発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞１×１０^５個と同数の、ＨＬＡ−Ａ２陽性かつＭＡＲＴ１陽性メラノーマ細胞（Ｃ３２：ＡＴＣＣ社製）、ＨＬＡ−Ａ２陽性かつＭＡＲＴ１陰性メラノーマ細胞（ＲＰＭＩ：ＡＴＣＣ社製）、ＨＬＡ−Ａ１１陽性かつＭＡＲＴ１陽性メラノーマ細胞の３種メラノーマ培養細胞と混合培養した。２４時間刺激後、培養上清を回収し、刺激により産生されたＩＦＮ−γを定量し、メラノーマ細胞に対する前記ナイーブＴ細胞の細胞障害活性の指標とした。 Furthermore, the cytotoxic activity of HLA-A2 positive naive T cells expressing TART receptor β chain specific to MART1-A2 peptide against various cultured melanoma cells was also evaluated. HLA-A2-positive and MART1-positive melanoma cells (C32: manufactured by ATCC), HLA-A2-positive and MART1-negative as many as 1 × 10 ⁵ HLA-A2-positive naive T cells into which the T cell receptor β chain gene has been introduced and expressed Melanoma cells (RPMI: manufactured by ATCC), HLA-A11 positive and MART1 positive melanoma cells were mixed and cultured with 3 types of melanoma cells. After 24 hours of stimulation, the culture supernatant was collected, and IFN-γ produced by the stimulation was quantified to serve as an index of the cytotoxic activity of the naive T cells against melanoma cells.

その結果、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴ細胞レセプターを発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２陽性で、かつＭＡＲＴ１陽性のメラノーマ細胞Ｃ３２に対して、特異的なＩＦＮ−γ産生を示したが、ＭＡＲＴ１陰性のメラノーマ細胞ＲＰＭＩやＨＬＡ−Ａ１１陽性のメラノーマ細胞に対して、特異的なＩＦＮ−γ産生を示さなかった。この結果、メラノーマ細胞Ｃ３２は腫瘍特異的な細胞障害活性を有することが示唆された（図１１）。 As a result, HLA-A2 positive naive T cells expressing a MART1-A2 peptide-specific T cell receptor produced specific IFN-γ for HLA-A2 positive and MART1 positive melanoma cells C32. Although it showed, it did not show specific IFN-γ production against MART1-negative melanoma cells RPMI and HLA-A11-positive melanoma cells. As a result, melanoma cell C32 was suggested to have tumor-specific cytotoxic activity (FIG. 11).

今回ＤＮＡクローニングに成功したＭＲＡＴ１−Ａ２ペプチド特異的Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞への遺伝子導入により機能的なＴ細胞レセプターを発現しうることが確認され、ＨＬＡ−Ａ２陽性でかつＭＡＲＴ１を発現する標的細胞に特異的な細胞障害活性を担うことが明らかになった。 It has been confirmed that the MRAT1-A2 peptide-specific T cell receptor β chain gene which has been successfully cloned this time can express a functional T cell receptor by gene transfer into HLA-A2 positive naive T cells. It became clear that it is responsible for cytotoxic activity specific to target cells that are positive and express MART1.

樹状細胞刺激後とＭＡＣＳ法による純化後の解析結果を示す図である。It is a figure which shows the analysis result after dendritic cell stimulation and after purification by MACS method. 樹状細胞による刺激前のリンパ球を用いた解析結果を示す図である。It is a figure which shows the analysis result using the lymphocyte before stimulation by a dendritic cell. 樹状細胞による刺激後及びテトラマー陽性細胞の純化後のＣＴＬ細胞を用いた解析結果を示す図である。It is a figure which shows the analysis result using the CTL cell after stimulation by a dendritic cell and after purification of a tetramer positive cell. ４種類の遺伝子（ＢＶ３、ＢＶ１２、ＢＶ１３Ａ、ＢＶ１３Ｂ）増幅断片の電気泳動像を示す図である。It is a figure which shows the electrophoresis image of four types of genes (BV3, BV12, BV13A, BV13B) amplification fragment. ４種類の遺伝子（ＢＶ３、ＢＶ１２、ＢＶ１３Ａ、ＢＶ１３Ｂ）増幅断片塩基配列のアラインメントを示す図である。It is a figure which shows the alignment of four types of genes (BV3, BV12, BV13A, BV13B) amplification fragment base sequences. ＴＲＢＶ２８遺伝子に対応するセンスプライマーとＴＲＢＣ１（Ｃ遺伝子）に対応するアンチセンスプライマーの塩基配列及びＶ−Ｄ−Ｊ接合部構成の解析結果を示す図である。It is a figure which shows the analysis result of the base sequence of a sense primer corresponding to TRBV28 gene, and the antisense primer corresponding to TRBC1 (C gene), and a VDJ junction structure. ＧＴ−Ｔ５０３培地の、ＣＤ３抗体によるＴ細胞の増殖への影響を示す図である。（○）はＲＰＭＩ１６４０＋５％ＨＳ、（●）はＧＴ−Ｔ５０３＋５％ＨＳを示す。It is a figure which shows the influence on the proliferation of T cell by a CD3 antibody of GT-T503 culture medium. (◯) indicates RPMI 1640 + 5% HS, and (●) indicates GT-T503 + 5% HS. 各抗ＣＤ抗体のリンパ球増殖に対する効果を示す図である。It is a figure which shows the effect with respect to lymphocyte proliferation of each anti-CD antibody. 増殖刺激されたリンパ球におけるＧＦＰおよびＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子の導入効率をフローサイトメトリーにて検討した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having investigated the introduction | transduction efficiency of the GFP and T cell receptor beta chain gene in the proliferation-stimulated lymphocyte by flow cytometry. ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチドにて処理したＴ２細胞を標的細胞とした、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴ細胞レセプターβ鎖を発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞の細胞障害活性を、ＩＮＦ−γを指標として評価した結果である。Using T2 cells treated with MART1-A2 peptide as target cells, cytotoxic activity of HLA-A2-positive naive T cells expressing a TART receptor β chain specific to MART1-A2 peptide, using INF-γ as an index It is the result of evaluation. 各種メラノーマ細胞を標的細胞とした、ＭＡＲＴ１−Ａ２ペプチド特異的なＴ細胞レセプターβ鎖を発現したＨＬＡ−Ａ２陽性ナイーブＴ細胞の細胞障害活性を、ＩＮＦ−γを指標として評価した結果である。It is the result of having evaluated the cytotoxic activity of the HLA-A2 positive naive T cell which expressed the T cell receptor (beta) chain specific to MART1-A2 peptide which made various melanoma cells the target cell, using INF- (gamma) as a parameter | index.

Claims

配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子。 A T cell receptor β chain gene comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.

請求項１記載のＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクター。 A recombinant vector capable of expressing a T cell receptor β chain protein in which the T cell receptor β chain gene according to claim 1 is incorporated.

請求項２記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターが導入された形質転換体。 A transformant into which a recombinant vector capable of expressing the T cell receptor β chain protein according to claim 2 has been introduced.

組換えベクターが導入されたリンパ球である請求項３記載の形質転換体。 The transformant according to claim 3, which is a lymphocyte into which a recombinant vector has been introduced.

配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質。 A T cell receptor β chain protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を特異的に認識する抗体。 An antibody that specifically recognizes a T cell receptor β chain protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

配列番号１で表される塩基配列からなるＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子が組み込まれたＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質を発現しうる組換えベクターがインビトロで導入されたリンパ球を有効成分とするメラノーマ治療用組成物。 For the treatment of melanoma comprising as an active ingredient a lymphocyte introduced in vitro with a recombinant vector capable of expressing a T cell receptor β chain protein in which a T cell receptor β chain gene comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been incorporated Composition.