JP2007097470A

JP2007097470A - Ｄｎａ処理方法およびｄｎａ処理装置

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Publication number: JP2007097470A
Application number: JP2005291181A
Authority: JP
Inventors: Ikumasa Ikeda; 育正池田; Hideaki Okamoto; 英明岡本
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Priority date: 2005-10-04
Filing date: 2005-10-04
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2025-10-04
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Abstract

【課題】先の増幅工程において用いられた液体が、後の増幅工程時に混入することを防ぎ、良好な処理が行えるＤＮＡ処理方法およびＤＮＡ処理装置を提供する。
【解決手段】反応・保存容器３に設けられた多数のウェル間で、ピペット装置４０によって核酸溶液や磁性粒子溶液やプライマや溶出液等を移動させて、第１ＰＣＲ、精製、第２ＰＣＲを行う。第１ＰＣＲと精製が終わった時点で、ピペット装置４０のピペットチップ４２を交換し、新たなピペットチップ４２を用いて第２ＰＣＲを行なう。
【選択図】図６

Description

本発明はＤＮＡ処理方法およびＤＮＡ検査方法とＤＮＡ処理装置およびＤＮＡ検査装置に関し、特に、ＤＮＡ処理方法の各工程で用いられる液体をハンドリングする方法および装置に関する。

核酸の塩基配列の解析や核酸試料中の標的核酸の検出を迅速かつ正確に行なう方法として、ＤＮＡマイクロアレイに代表されるプローブ担体を用いるハイブリダイゼーション反応を利用する方法が多く提案されている。ＤＮＡマイクロアレイとは、標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブを、ビーズやガラス板等の固相上に高密度で固定したものである。このＤＮＡマイクロアレイを用いた標的核酸の検出方法は、一般に以下のような工程を有する。

第一に、ＰＣＲ（ポリメレースチェインリアクション）法に代表される増幅方法によって、標的核酸を増幅する。具体的には、まず、核酸試料中に第１および第２のプライマを加え、所定の温度サイクルをかける。これによって、第１のプライマは標的核酸の一部と特異的に結合し、第２のプライマは、標的核酸と相補的な核酸の一部と特異的に結合する。標的核酸を含む二本鎖核酸と第１および第２のプライマとが結合すると、伸長反応によって標的核酸を含む二本鎖核酸が増幅される。この処理が第１の増幅工程であり、第１ＰＣＲと称される。

次に、標的核酸を含む二本鎖核酸が十分に増幅された後に、未反応のプライマや核酸の断片など、増幅された二本鎖核酸以外の物質を精製によって除去する。精製方法としては、磁性粒子に二本鎖核酸を吸着させる方法や、カラムフィルタに二本鎖核酸を吸着させる方法などが用いられる。

次に、精製が完了した核酸試料中に第３のプライマを加えて温度サイクルをかける。第３のプライマは、酵素や蛍光物質や発光物質等で標識されており、標的核酸と相補的な核酸の一部と特異的に結合する。標的核酸に相補的な核酸と第３のプライマとが結合すると、酵素や蛍光物質や発光物質等で標識された標的核酸が伸長反応によって増幅される。この処理が第２の増幅工程であり、第２ＰＣＲと称される。第２ＰＣＲにおける標識の別の方法として、基質として用いるヌクレオチドに蛍光標識されたヌクレオチドを用いて標的核酸のみの標識化を行うことも知られている。

第１の工程として、前記した第１ＰＣＲと精製と第２ＰＣＲが行われ、その結果、核酸試料中に標的核酸が含まれている場合には、標識された標的核酸が生成される。しかし、核酸試料中に標的核酸が含まれていない場合には、標識された標的核酸は生成されない。

次に、第２の工程として、この核酸試料をＤＮＡマイクロアレイに接触させ、ＤＮＡマイクロアレイのプローブとハイブリダイゼーション反応させる。核酸試料中にプローブと相補的な標的核酸がある場合には、プローブと標的核酸がハイブリッド体を形成する。

その後、第３の工程として、標的核酸の検出を行なう。前記したようにプローブと標的核酸がハイブリッド体を形成しているかどうかは、標的核酸の標識物質によって検出が可能であり、これにより特定の塩基配列の有無を確認できる。

特許文献１は、１つの装置内で第１〜３の工程を連続的に処理することができる装置を開示している。この装置は移動可能な分注機を有し、必要な液体を各容器にそれぞれ搬送して反応させる構成になっている。

なお、生化学反応装置においては、使用する試薬によっては、その劣化を防ぐ必要がある。とりわけ、生化学反応を行なうために重要な酵素は、常温で劣化して生化学反応に使用できなくなる場合があるため、酵素を低温に保つ保冷部が必要である。
特開平７−１０７９９９号公報

前記した第１工程では、第１ＰＣＲで標的核酸の指数増幅を行い、第２ＰＣＲで、標識された標的核酸のみをさらに増幅する。この場合、第１ＰＣＲに用いられた第１または第２のプライマが第２ＰＣＲ時に混入すると、第２ＰＣＲ時に、第１ＰＣＲと同様な指数増幅が再び生じる。その結果、以下の問題が生じる。

第１の問題として、第２ＰＣＲにおいて、標識されていない第１のプライマにより、標識されていない標的核酸が増える。この標識されていない標的核酸もプローブアレイと結合するので、本来目的としている標識された標的核酸のプローブアレイとの結合が阻害される。

第２の問題として、標的核酸と相補的な核酸が、第２ＰＣＲにおいても、第１ＰＣＲと同様に増幅し、標的核酸と相補的な核酸が増大する。核酸試料中に標的核酸と相補的な核酸が増えると、ハイブリダイゼーション効率が高い液中ハイブリダイゼーション状態となり、増加した相補的な核酸が、標識された標的核酸と結合する。その結果、核酸試料中の、１本鎖の標識された標的核酸が減少し、標識された標的核酸とプローブアレイとの結合が減少する。

そこで本発明の目的は、先の増幅工程において用いられた液体が、後の増幅工程時に混入することを防ぎ、良好な検査が行えるＤＮＡ検査方法およびＤＮＡ検査装置を提供することにある。

本発明の特徴は、標的核酸と標的核酸に相補的な核酸とを増幅する第１の増幅工程と、第１の増幅工程により増幅された所望の核酸を残してそれ以外の物質を除去する精製工程と、精製工程後に残った、増幅された標的核酸に相補的な核酸に対して、標的核酸の増幅を行なう第２の増幅工程とを含むＤＮＡ処理方法において、前記各工程中および前記各工程同士の間に、所望の液体をハンドリングする液体ハンドリング装置のうち少なくとも液体に接触する部分を、第２の増幅工程の前に交換または洗浄するところにある。

本発明のもう１つの特徴は、標的核酸と該標的核酸に相補的な核酸とを増幅する第１の増幅工程と、第１の増幅工程により増幅された所望の核酸を残してそれ以外の物質を除去する精製工程と、精製工程後に残った、増幅された標的核酸に相補的な核酸に対して、標的核酸の増幅を行なう第２の増幅工程とを含むＤＮＡ処理方法を行なうためのＤＮＡ処理装置において、前記各工程中および前記各工程同士の間に、所望の液体をハンドリングする液体ハンドリング装置を有し、液体ハンドリング装置は、着脱交換可能な、液体に接触する部分を有しているところにある。

本発明のもう１つの特徴は、標的核酸と標的核酸に相補的な核酸とを増幅する第１の増幅工程と、第１の増幅工程により増幅された所望の核酸を残してそれ以外の物質を除去する精製工程と、精製工程後に残った、増幅された標的核酸に相補的な核酸に対して、標的核酸の増幅を行なう第２の増幅工程とを含むＤＮＡ処理方法を行なうためのＤＮＡ処理装置において、前記各工程中および前記各工程同士の間に、所望の液体をハンドリングする液体ハンドリング装置と、液体ハンドリング装置の、液体に接触する部分を洗浄可能な洗浄部とを有しているところにある。

本発明によると、液体ハンドリング装置の、第１の増幅工程で使用された液体に接触した部分は、第２の増幅工程の前に交換または洗浄される。したがって、第１の増幅工程で使用された液体が液体ハンドリング装置を介して第２の増幅工程時に混入することがなく、所望のＤＮＡ処理が精度良く行える。

以下、本発明の実施形態について説明する。

まず、本発明のＤＮＡ検査装置の基本構成について概略的に説明する。本発明のＤＮＡ検査装置は、核酸の増幅工程とハイブリダイゼーション工程と検出工程とを１つの装置内で連続的に実施することができる。このＤＮＡ検査装置は反応・保存容器３（図２参照）と装置本体とからなる。装置本体の増幅部２０６（図１（ａ）参照）を例示すると、大きく分けてサーマルサイクル部と精製部と保冷部とから構成されている。サーマルサイクル部と精製部と保冷部は反応・保存容器３に近接している。

まず、反応・保存容器３について説明すると、これは、市販されている、９６個のウェルを有するＰＣＲマイクロプレート１、もしくはそれと同等の形状にウェルが形成されたものからなる。この反応・保存容器３には、ＰＣＲで用いられる試薬類が予め充填されている。反応・保存容器３の一方の側は第１および第２ＰＣＲを実施するウェル、中央部分は精製工程で使用するウェル、他方の側は精製工程と第１および第２ＰＣＲで用いられる試薬が充填されたウェルになっている。

増幅部２０６のサーマルサイクル部は、アルミや銅合金などの熱伝導性の良い金属で形成された、反応・保存容器３と嵌合し密着する複数の凹部からなるサーマルサイクルブロック１８（図３〜６参照）と、ペルチェ素子やヒータなどから構成されている。凹部は、第１および第２ＰＣＲを実施するウェル（図３〜６に示す実施例ではウェル４，５）と同数だけ形成されている。このサーマルサイクルブロック１８に反応・保存容器３を嵌合させた状態で、第１および第２ＰＣＲを実施する。一般的には、第１ＰＣＲでは、約９２℃−５５℃−７２℃の各温度について所定時間ずつ保持する温度サイクルを４０回程度繰り返し、第２ＰＣＲ処理ではその温度サイクルを２５回程度繰り返す。

サーマルサイクル部は反応・保存容器３の上方に加熱ユニット２６（図３参照）を備えている。この加熱ユニット２６は、アルミや銅合金などの熱伝導性の良い金属により構成された加熱ブロック２７と、ペルチェ素子２８やヒータなどからなる。加熱ブロック２７は、熱が付与されて反応・保存容器３を上方から加熱する。加熱ブロック２７は、第１および第２ＰＣＲの際に、ＰＣＲを行なうウェルの上部のみを覆う大きさに構成されており、保冷部を加熱しないように構成されている。この加熱ブロック２７により、ＰＣＲを行なうウェルの内壁面の温度が上昇するので、蒸発して上昇してきた溶液の蒸気が内壁面に付着して結露するのを防止できる。

増幅部２０６の精製部は、反応・保存容器３の中央部分に対向する位置に配置されている。精製は一般的に、ウェルに予め充填された磁性粒子およびウェル近傍に配置した磁石２０を用いて行なわれる。精製部のウェル（図３〜６に示す実施例ではウェル６，７）に核酸溶液と洗浄液とエタノールなどを別々に供給した後、攪拌して核酸を磁性粒子に吸着させる。その後、通常はウェルから離れた位置にある磁石２０を精製部のウェルに近づけることにより、核酸が付着した磁性粒子を１ヶ所に保持し、核酸が付着した磁性粒子をウェルに残して、ウェル内の溶液を吸引する。次に、このウェルに溶出液を供給して磁性粒子から核酸を分離させ、磁石２０を精製部のウェルに近づけて磁性粒子を１ヶ所に保持し、磁性粒子以外の溶液を吸引する。このようなステップを経て、精製された核酸溶液を得る。

保冷部は、反応・保存容器の、サーマルサイクル部と反対側に対向する位置に配置されている。保冷部は、アルミや銅合金などの熱伝導性の良い金属で形成され、反応・保存容器３と嵌合して密着する複数の凹部からなる冷却ブロック２４と、ペルチェ素子２５などから構成される（図３〜６参照）。凹部は、少なくとも試薬類が充填されたウェル（図３〜６に示す実施例ではウェル８〜１１）と同数だけ形成されている。冷却ブロック２４は周囲を断熱部材で覆われている。

本実施形態では、前記したサーマルサイクル部と保冷部と精製部にそれぞれ対向するウェル４〜１１同士の間で溶液を移動させるピペット装置４０（図６，７参照）が構成されている。ピペット装置４０は、ピペット部４１とその先端に着脱可能なピペットチップ４２を備えており、ピペットチップ４２は必要に応じて交換される。

反応・保存容器３が装置本体にセットされてから実際に使用されるまでの間、保冷部は試薬を劣化しない温度で保存している。試薬の保存温度は４℃〜２０℃程度の範囲であり、サーマルサイクル部の温度（５５〜９２℃）の影響を受けることなくこの温度を維持しなければならない。そこで、保冷部とサーマルサイクル部の間に精製部を配置することにより、サーマルサイクル部と保冷部との間の距離を長くし、それぞれの温度が相互影響しないように構成されている。サーマルサイクル部、精製部、保冷部をこの順番に配置することにより、ＰＣＲマイクロプレート１の限られたサイズを効率的に使っているので、ＤＮＡ検査装置の小型化が図れる。さらに、サーマルサイクル部、精製部、保冷部は、１個の反応・保存容器３によって、その反応・保存容器３を動かさなくても全てカバーできる程度に非常に近接している。従って、溶液を供給および吸引するピペット装置４０の移動距離を短くすることができる。

［実施例］
次に、本発明の具体的な実施例について、図面を参照して詳細に説明する。

図１（ａ）は本実施例のＤＮＡ検査装置の概略図である。ＤＮＡ検査装置は、生体試料からＤＮＡを抽出する抽出部２０５と、ＤＮＡを増幅する増幅部２０６と、増幅されたＤＮＡをプローブＤＮＡと結合させるハイブリダイゼーション部２０７と、ハイブリダイゼーション結合の有無を検出する検出部２０８を有する。このＤＮＡ検査装置において、検査工程は、抽出部２０５、増幅部２０６、ハイブリダイゼーション部２０７、検出部２０８の順番に進む。さらに、図１（ｂ）に示すように、各工程中に各部２０５〜２０８同士の間および各部２０５〜２０８内において液体のハンドリングを行なうピペット装置４０のピペットチップ４２のためのピペットチップ置場２０１が設けられている。ピペットチップ４２は、図１（ｂ）に示すようにピペット置場２０１に複数本用意されており、必要に応じてピペット部４１によって取り出されて使用され、使用後にはピペット置場２０１に戻されるか、図示しない廃棄場所に廃棄される。後述する通り本実施例では、ピペットチップ２０３は交換式のチップである。しかし、パーマネント方式の液体分注ユニットを洗浄しながら使用することも可能である。その場合、図１（ｃ）に示すように、ピペットチップ４２を洗浄するための洗浄部２０２が設けられる。この洗浄部２０２は、図１（ａ）には図示されているが、後述するように第２ＰＣＲの前にピペットチップ４２を交換する場合には不要である。ただし、ピペットチップ４２を交換することなく洗浄して繰り返し使用する場合に設けられる。

図２は反応・保存容器３のウェル部分を示す斜視図である。図１（ａ）には示されていないが、この反応・保存容器３が、装置本体にセットされてＤＮＡ検査装置が構成されている。反応・保存容器３のウェル部分は、市販されているポリプロピレン製のＰＣＲマイクロプレート１もしくはそれと同等の形状に形成されたものであり、９６個のウェルが９ｍｍのピッチで８×１２のマトリクス状に配置されている。各ウェルの先端部（底部）２は、後述するサーマルサイクルブロックおよび冷却ブロックと嵌合する形状になっている。

図３はＤＮＡ検査装置の増幅部２０６を正面から見た図であり、反応・保存容器３の構造およびウェルの配列と、増幅部２０６の、サーマルサイクル部、保冷部、精製部との位置関係などを示すものである。図３には、第１および第２ＰＣＲ中の状態が示されている。

反応・保存容器３は８×１２個のウェルを８個ずつ１２列に分けて使用し、同時に１２検体の検査が可能となっている。図３中で最も右にあるウェル４は、第２ＰＣＲを行なうウェルであり、最初は空である。その次のウェル５は第１ＰＣＲを行なうウェルであり、第１のＰＣＲで用いられる酵素試薬やプライマなどの溶液１０１が予め充填されている。ウェル６，７は精製を行なうウェルであり、ウェル７が先に用いられ、ウェル６はその後に用いられる。ウェル７には磁性粒子溶液１０２が予め充填されており、ウェル６は最初は空である。そして、ウェル８には洗浄液１０３、ウェル９にはエタノール１０４、ウェル１０には溶出液１０５がそれぞれ充填されている。図面中で最も左にあるウェル１１には、第２ＰＣＲで用いられる試薬やプライマなどの溶液１０６が予め充填されている。このような８つのウェルの組み合わせが、図面に垂直な方向に１２列並んでいる。

９６個のウェルの開口部は、アルミなどで構成されたラミネートフィルム１２が接着もしくは溶着されることなどによって封止されている。これによって、外部からウェル内への異物混入を防ぐことができる。ウェルから溶液を吸引する前、またはウェル内に溶液を吐出する前に、図示しないカッター部によってラミネートフィルム１２に穴をあけるようになっている。

ウェル４，５上のラミネートフィルム１２上には、シリコンゴム製の蓋１３と蓋保持部材１４が、支点軸１５によって回動可能に保持されている。蓋１３は１２列のウェル４，５のみ（合計２４ウェル）を覆う大きさに構成されており、これは後述する加熱ブロックと同等の大きさである。支点軸１５には、蓋１３および蓋保持部材１４をウェル４，５を密閉する方向に付勢する不図示のねじりコイルバネが取り付けられている。支点軸１５は、軸受部１６によって回動可能に保持されている。ウェル部分として市販のＰＣＲマイクロプレート１を使用する場合には、軸受部１６は接着もしくはネジ止めなどでＰＣＲマイクロプレート１の縁部分１７に固定される。また、市販のＰＣＲマイクロプレート１を使用しない場合には、ＰＣＲマイクロプレート１に相当する部分と軸受部を一体化して作成してもよい。

サーマルサイクル部に設けられたサーマルサイクルブロック１８は、アルミや銅合金などの熱伝導性の良い金属により構成され、周囲を樹脂で形成された断熱部材（不図示）で覆われており、周囲に熱が逃げない構成になっている。このサーマルサイクルブロック１８には、２４個のウェル（穴部）が形成されている。サーマルサイクルブロック１８はウェル４，５と対向しており、サーマルサイクルブロック１８のウェルの内壁面がウェル４，５の外周面と密着する寸法になっている。サーマルサイクルブロック１８の下方には、それを加熱するペルチェ素子１９が配置されている。ペルチェ素子１９は、反応・保存容器３の１２列のウェルをすべて均等に加熱できる個数だけ配置されている。ペルチェ素子１９とサーマルサイクルブロック１８の接触面には、互いに完全に密着させて熱を確実に伝えるためのグリス（不図示）が塗布されている。グリスの代わりに熱伝導性の良いシート材料を用いても同様な効果を得ることができる。

ウェル６、７の間には、磁石２０と磁石固定部材２１と磁石回動支点２２が配置されている。磁石２０と磁石固定部材２１は、ウェルの各列に対応して１２個存在し、それぞれ磁石回動支点２２に回動可能に保持されている。磁石回動支点２２は、後述する保持板３２に形成された不図示の軸受手段により保持されている。磁石固定部材２１は磁石２０と反対側の端部が不図示のソレノイドと連結されている。精製工程における磁性粒子捕集の際には、磁性粒子をウェルの壁面に集中させるために、ソレノイドに電流を流して磁石固定部材２１を引き込むことによって、磁石２０が上昇してくる。その結果、磁石２０と磁石固定部材２１は図３の実線の位置から破線の位置に移動する。

保冷部に配置された冷却ブロック２４は、アルミや銅合金などの熱伝導性の良い金属により構成され、周囲を樹脂で形成された断熱部材（不図示）で覆われており、周囲温度の影響を受けにくい構成になっている。この冷却ブロック２４には、４８個のウェル（穴部）が形成されている。冷却ブロック２４はウェル８〜１１と対向しており、冷却ブロック２４のウェルの内壁面がウェル８〜１１の外周面と密着する寸法になっている。冷却ブロック２４の下方には、それを冷却するペルチェ素子２５が配置されている。ペルチェ素子２５は、反応・保存容器３の１２列のウェルをすべて均等に冷却できる個数だけ配置されている。ペルチェ素子２５と冷却ブロック２４の接触面には、互いに完全に密着させて熱を確実に伝えるためのグリス（不図示）が塗布されている。グリスの代わりに熱伝導性の良いシート材料を用いても同様な効果を得ることができる。

反応・保存容器３の上方には、加熱ユニット２６が設けられている。加熱ユニット２６の加熱ブロック２７は、アルミや銅合金により構成されており、ウェル４，５の上方のみを覆う大きさに形成され、ウェル６〜１１を加熱しないように構成されている。加熱ブロック２７の上方にはペルチェ素子２８が配置されており、ペルチェ素子２８と加熱ブロック２７の接触面には、互いに完全に密着させて熱を確実に伝えるためのグリス（不図示）が塗布されている。また、ペルチェ素子２８の上部には、金属材料で形成された冷却ブロック２９が、前記した構成と同様に、接触面にグリスを介して固定されている。冷却ブロック２９は、出入口を備えた中空構造であり、その出入口に接続された不図示の配管を介して冷却水が流れる構造である。ペルチェ素子２８の裏側から放熱するときに、この冷却ブロック２９が冷却を促進させる。

加熱ブロック２７とペルチェ素子２８と冷却ブロック２９は、上面に開口３１を備えた保持部材３０によって保持され、かつ断熱されている。この加熱ブロック２７とペルチェ素子２８と冷却ブロック２９と保持部材３０は、１つのユニット（天板ユニット２６）として構成されており、不図示の駆動手段によって図３左右方向へ移動可能である。この天板ユニット２６は、反応・保存容器３の１２列のウェルをすべて均等に加熱できるような幅に構成されており、増幅時には反応・保存容器３のウェル４，５と密着する位置にあってそれらを上方から加熱する。

ペルチェ素子１９，２５の下には、サーマルサイクル部と保冷部と精製部全体を保持する保持板３２が配置されている。保持板３２は、装置本体のベース３３に不図示の軸受を介して支持されたリードスクリュー３４と不図示のモータおよび駆動伝達系に駆動されて、サーマルサイクル部と保冷部と精製部と一体的に図３の上下方向に移動可能である。

反応・保存容器３とサーマルサイクルブロック１８および冷却ブロック２４とを嵌合させ、この保持板３２を上昇させることによって、反応・保存容器３を天板ユニット２６に対して押圧することができる。これにより、反応・保存容器３のウェル外周と、サーマルサイクルブロック１８および冷却ブロック２４との密着性が向上しウェルへの熱伝導性がよくなる。

保持板３２の下面には金属材料で形成された水冷ブロック３５，３６が、接触面にグリスを介して固定されている。水冷ブロック３５，３６は、出入口を備えた中空構造であり、出入口に接続された不図示の配管を介して冷却水が流れる構造である。水冷ブロック３５，３６はペルチェ素子１９，２５と対向する位置にそれぞれ固定されており、ペルチェ素子１９，２５の下面からの冷却を促進させる。ペルチェ素子１９の下方に配置された水冷ブロック３５は、磁石固定部材２１と干渉しない位置関係に配置されており、図３中では点線で示されている。

反応・保存容器３をセットするキャリッジ３７が、図３中に点線で概略的に示されている。すなわち、この図３には、キャリッジ３７のうち、そのキャリッジ３７が装置前面にあるときに反応・保存容器３をセットする高さの部分が示されている。キャリッジ３７は、図面に垂直な方向に配置されているリードスクリュー３８と不図示のモータおよび駆動伝達系に駆動されて、ガイドシャフト３９に沿って前後に移動可能である。キャリッジ３７は、装置後方に駆動されて反応・保存容器３がサーマルサイクル部、保冷部、精製部と対向する位置に到達すると停止する。このとき、保持板３２は、図３に示されている位置よりも下方の、反応・保存容器３とぶつからない位置にある。その後、リードスクリュー３４によって保持板３２は図３に示す位置まで上昇させられる。

なお、ＤＮＡ検査装置には、図６，７に示すピペット装置４０が設けられている。ピペット装置４０は、溶液の供給、吐出、および攪拌を行なうピペット部４１と、ピペット部４１の先端に着脱可能に取り付けられたピペットチップ４２と、ピペット搬送部である不図示のモータおよびリードスクリューなどから構成されている。ピペット部４１は、不図示のピペット搬送部により上下前後左右に移動可能に構成されている。さらに、カッター部（図示せず）と、ピペット置場２０１（図１（ａ），（ｂ）参照）と、ピペット廃棄部（図示せず）などが設けられている。このカッター部は、図６においてピペットチップ４２の右側に位置し、ピペット搬送部によって所定の位置に搬送可能であり、ウェルを密閉しているラミネートフィルム１２に穴をあけるものである。ピペット置場２０１は、前記した通り、ピペットの周辺に位置して未使用のピペットチップ４２を保持しておくものである。ピペット廃棄部は、使用済みのピペットチップ４２を収容するものである。

次に、このＤＮＡ検査装置の動作について説明する。以下の説明では、ウェル１列（１検体分）の動作について説明するが、他の列も同様に動作している。

図４は、図３に示すＤＮＡ検査装置の、天板ユニット２６などを除いた要部を示す平面図である。

使用者が、図４の破線の位置にあるキャリッジ３７に反応・保存容器３をセットすると、不図示の駆動モータおよびリードスクリュー３８によって、反応・保存容器３を後方（図４上方）に搬送する。キャリッジ３７が図４の実線の位置まで到達すると、リードスクリュー３８によって支持板３２を上昇させ、図５に示す状態にする。この図５に示す状態は、図３に示す状態よりも支持板３２がわずかに下にあり加熱ブロック２７と蓋１３が接触していない状態である。

血液や尿などの生体試料から、抽出部２０５（図１（ａ）参照）において公知の方法によって既に抽出された核酸を含む溶液を、ウェル５へ移動させる。核酸溶液の移動にはピペット装置４０（図６，７参照）を用いる。このようにピペット装置４０を用いて核酸溶液をウェル５へ吐出する様子が図６に示されている。

核酸溶液をウェル５へ吐出するのに先立って、まず、天板ユニット２６および蓋１３を、不図示の駆動機構によってそれぞれ図６右方へ移動させ、さらに略９０度回転させて、ウェル４，５の上方を開放状態にしておく。その後、カッター部によって、ラミネートフィルム１２のウェル５に対向する部分に穴をあけ、ピペットチップ４２がウェル５内に進入できる状態にしておく。それから、図６右方にある抽出部２０５から核酸溶液を吸引したピペットチップ４２を、ウェル５の上方まで移動させて下降させ、ウェル５内に進入させる。ピペットチップ４２をウェル５内の所定の深さまで進入させたら、ピペット部４１によって核酸溶液を吐出させる。その後、ウェル５にピペットチップ４２を進入させたまま、吸引と吐出を所定回数繰り返し、ウェル５内に予め充填されていた試薬類と核酸溶液とを十分混合させるように攪拌する。

混合を終了したら、ピペット部４１を反応・保存容器３上から退避させ、天板ユニット２６および蓋１３を図５に示す状態にする。そして、リードスクリュー３４によって保持板３２を上昇させて図３に示す状態にする。このとき、蓋１３は、保持板３２を天板ユニット２６に向けて付勢することにより、１つのウェルあたり５０〜１００ｇｆの力、また、場合によってはそれ以上の力で押圧される構造となっている。

図３に示す状態で第１ＰＣＲ（第１の増幅工程）を開始する。第１ＰＣＲは、約９２℃−５５℃−７２℃の各温度について所定時間ずつ保持する温度サイクルを４０回程度繰り返すことによって、試料管内の核酸を増幅する。第１ＰＣＲ中に、保冷部は試薬類を、それらが劣化しない温度、例えば４℃程度に維持する。サーマルサイクル部のウェル４，５と、保冷部のウェル８〜１１は、図示しない断熱部材で主要部が覆われている。さらに、サーマルサイクル部のウェル４，５と保冷部のウェル８〜１１の間には、精製部のウェル６，７が配置され、ある程度大きい間隔が確保されている。このように配置することによって、サーマルサイクル部と保冷部の温度が相互に影響を与えないようになっている。なお、第１ＰＣＲが終了したら、サーマルサイクルブロック１８の温度を室温程度にしてよい。

第１ＰＣＲの終了後に精製工程を始める。図７は、増幅産物を磁性粒子に吸着させた後に、磁石２０で磁性粒子を集めて、核酸が付着した磁性粒子４３以外の物質をピペットチップ４２により吸引した状態を示している。

この精製工程において、まず、第１ＰＣＲの場合と同様に、図示しないカッター部によって、ウェル７を覆うラミネートフィルム１２に穴をあける。そして、ピペット部４１がピペットチップ４２をウェル５内に進入させて、ウェル５内の溶液（第１ＰＣＲ処理された試料溶液）を吸引する。それからピペットが移動して、ピペット部４１がピペットチップ４２をウェル７内に進入させて、ウェル５から吸引した溶液をウェル７内に吐出する。次に、ウェル７に予め充填されている磁性粒子溶液１０２と、ウェル５から移動させた溶液とをピペットチップ４２で攪拌することによって、核酸を磁性粒子に十分に吸着させる。その後、磁石２０を図７に示す位置まで上昇させて、核酸が付着した磁性粒子４３をウェル７の内壁の１ヶ所に集中させる。ここで図７に示すように、核酸が付着した磁性粒子４３以外の物質をピペットチップ４２により吸引して、不図示の廃液処理部分に吐出する。

次に、磁石２０をウェル７から遠ざける。また、図示しないカッター部によって、ウェル８を覆うラミネートフィルム１２に穴をあける。そして、ピペット部４１がピペットチップ４２をウェル８内に進入させて、ウェル８内の洗浄液１０３を吸引する。それからピペットが移動して、ピペット部４１がピペットチップ４２をウェル７内に進入させて、ウェル８から吸引した洗浄液をウェル７内に吐出する。次に、洗浄液とウェル７内の溶液とをピペットチップ４２で攪拌し、磁石２０を上昇させて、核酸が付着した磁性粒子４３をウェル７の内壁の１ヶ所に集中させる。ここで、核酸が付着した磁性粒子４３以外の物質をピペットチップ４２により吸引して（図７と同様の状態にし）、不図示の廃液処理部分に吐出する。

さらに、前記したのと同様な工程によって、ウェル９内のエタノール１０４をウェル７に移動させて攪拌し、磁石２０を上昇させて、核酸が付着した磁性粒子４３をウェル７の内壁の１ヶ所に集中させる。そして、核酸が付着した磁性粒子４３以外の物質をピペットチップ４２により吸引して（図７と同様の状態にし）、不図示の廃液処理部分に吐出する。

以上の各工程によって、精製工程中の洗浄処理が完了する。そして、核酸が付着した磁性粒子４３から核酸を溶出させる処理に移行する。

前記した各工程と同様に、ピペット装置４０を用いて、ウェル７内の溶液をウェル６内へ移動させるとともに、ウェル１０内の溶出液をウェル６内へ移動させる。それから、ウェル６内の混合液を攪拌してから放置し、磁石２０を上昇させてウェル６の内壁の１ヶ所に磁性粒子を集める。ウェル１０から移動させられた溶出液によって磁性粒子から核酸が離れているため、磁性粒子を除くウェル６内の溶液が、精製を経て得られた核酸溶液である。この核酸溶液を、ピペットによってウェル６から所定量吸引し、カッター部によって予めラミネートフィルム１２に穴があけられて開放されているウェル４内に移動させる。これで本実施例の精製工程が完了する。

次に、第２ＰＣＲに移行する前に、ピペットチップ４２の交換を行なう。第１ＰＣＲと精製工程で使用されたピペットチップ４２を廃棄し、新しいピペットチップ４２をセットする。すなわち、第１ＰＣＲの前に、図１に示すピペット置場２０１からピペットチップ４２を取り出してピペット部４１に装着し、第１ＰＣＲと精製工程を行なった後に、ピペットチップ４２をピペット置場２０１内の元の場所に戻す。そして、第２ＰＣＲで使用するための新たなピペットチップ４２をピペット置場２０１から取り出してピペット部４１にセットする。

ピペットチップ４２を交換したら、第２ＰＣＲ（第２の増幅工程）に移行する。まず、ウェル１１を覆うラミネートフィルム１２に穴をあけて、新しいピペットチップ４２をウェル１１内に挿入する。そして、ウェル１１内に予め充填されている、第２ＰＣＲで使用される溶液１０６をウェル４内に移動させる。そして、ピペットチップ４２により、ウェル４内の核酸溶液と第２ＰＣＲで使用される溶液１０６とを攪拌する。攪拌が終了したら、第１ＰＣＲと同様に、ピペット部４１を反応・保存容器３上から退避させ、天板ユニット２６および蓋１３を図５に示す状態にする。そして、リードスクリュー３４によって保持板３２を上昇させて図３に示す状態にする。それから、約９２℃−５５℃−７２℃の各温度について所定時間ずつ保持する温度サイクルを２５回程度繰り返すことによって、試料管内の核酸を増幅する第２ＰＣＲを行なう。なお、この時点で試薬類は既にすべて使い切っているので、第２ＰＣＲ中は冷却ブロック２４の冷却を停止してもよい。

第２ＰＣＲの標識化の別の方法として背景技術の中で述べたような、標識された基質により標的核酸を生成させる方法を用いた場合も本発明の主旨に沿うものである。

このようにして第２ＰＣＲが完了したら、天板ユニット２６および蓋１３を図６に示す状態にする。そして、ピペットチップ４２により増幅産物をウェル４から不図示のハイブリダイゼーション部２０７に移動させる。この移動が終了したら、再度図３に示す状態にしてから保持板３２を下降させ、キャリッジ部３７を手前に搬送することによって、反応・保存容器３をＤＮＡ検査装置から取り外し可能な状態になる。

その後、ハイブリダイゼーション部２０７においてハイブリダイゼーション結合を生じさせるための処理が行われ、さらに検出部２０８においてハイブリダイゼーション結合の有無が検出される。ただし、これらの工程は従来から公知の方法によって行えばよいので説明は省略する。

本実施例の増幅部２０６では、図３を参照して説明したように、各工程で使用される溶液を、使用される順番通りに並ぶように反応・保存容器３に予め充填しておく。従って、溶液を吸引して保持しているピペットチップ４２が、上方のラミネートフィルム１２に穴が開いていない未使用のウェルの上方をなるべく通過しないような構成になっている。このような構成にすることにより、仮にピペットチップ４２から少量の溶液が落下しても、未使用のウェル内に落下する可能性は小さいので、増幅工程および精製工程に影響を与えることはない。なお、各ウェル４〜１１を覆うラミネートフィルム１２は、適宜のタイミングでカッター部によって穴があけられる。この穴をあけるタイミングは、各ウェル４〜１１にピペットチップ４２を進入させる前であれば、特に限定されない。ただし、前記したように各溶液のピペットチップ４２からの落下による混入をより確実に防ぐために、内部の溶液を使用する工程の直前に穴をあけるのが好ましい。

以上説明した通り、本実施例では、第１ＰＣＲおよび精製の後、すなわち第２ＰＣＲの直前に、ピペットチップ４２を交換し、その後、新しいピペットチップ４２を用いて標的核酸を第２ＰＣＲの増幅溶液に移動させる。そして第２ＰＣＲを行い、それ以降はそのピペットチップ４２を使用して処理を行なう。また、別の実施例では、第１ＰＣＲおよび精製の後、すなわち第２ＰＣＲの直前に、ピペットチップ４２を洗浄部２０２において洗浄してから、標的核酸を第２ＰＣＲの増幅溶液に移動させ、第２ＰＣＲを行うことも考えられる。前記したいずれの実施例でも、第１ＰＣＲにて用いた溶液（第１および第２のプライマなど）が、第２ＰＣＲを行なうウェル４に混入するおそれがない。その結果、標識された標的核酸を所望の比率で存在させることができるので、ハイブリダイゼーション時に効率よくプローブと結合させることが可能となる。また、第２ＰＣＲで標的核酸と相補的な核酸を増幅させないので、標識された標的核酸を液中ハイブリダイゼーションにより無駄に消費させない。それによって、標識された標的核酸をハイブリダイゼーション時に効率よくプローブと結合させることが可能となる。

本発明のＤＮＡ検査装置の概略平面図である。図１に示すＤＮＡ検査装置の反応・保存容器を示す斜視図である。図１に示すＤＮＡ検査装置の増幅部の正面図である。図３に示す増幅部の平面図である。図３に示す増幅部の増幅開始前の状態を示す正面図である。図３に示す増幅部の核酸溶液を吐出している状態を示す正面図である。図３に示す増幅部における精製工程を示す拡大正面図である。

符号の説明

４０ピペット装置
４２ピペットチップ
１０１酵素試薬やプライマなどの溶液
１０２磁性粒子溶液
１０３洗浄液
１０４エタノール
１０５溶出液
１０６第２ＰＣＲで用いられる試薬やプライマなどの溶液

Claims

標的核酸と該標的核酸に相補的な核酸とを増幅する第１の増幅工程と、前記第１の増幅工程により増幅された所望の核酸を残してそれ以外の物質を除去する精製工程と、前記精製工程後に残った、増幅された前記標的核酸に相補的な核酸に対して、前記標的核酸の増幅を行なう第２の増幅工程とを含むＤＮＡ処理方法において、
前記各工程中および前記各工程同士の間に、所望の液体をハンドリングする液体ハンドリング装置のうち少なくとも前記液体に接触する部分を、前記第２の増幅工程の前に交換または洗浄することを特徴とするＤＮＡ処理方法。
前記液体ハンドリング装置としてピペット装置を用いて液体をハンドリングし、前記液体に接触する部分であるピペットチップを前記第２の増幅工程の前に交換または洗浄する、請求項１に記載のＤＮＡ処理方法。
前記第２の増幅工程の前を除く工程では、前記液体に接触する部分を交換せずに使用を続ける、請求項１に記載のＤＮＡ処理方法。
請求項１に記載の処理工程を含むＤＮＡ検査方法。
標的核酸と該標的核酸に相補的な核酸とを増幅する第１の増幅工程と、前記第１の増幅工程により増幅された所望の核酸を残してそれ以外の物質を除去する精製工程と、前記精製工程後に残った、増幅された前記標的核酸に相補的な核酸に対して、前記標的核酸の増幅を行なう第２の増幅工程とを含むＤＮＡ処理方法を行なうためのＤＮＡ処理装置において、
前記各工程中および前記各工程同士の間に、所望の液体をハンドリングする液体ハンドリング装置を有し、該液体ハンドリング装置は、着脱交換可能な、前記液体に接触する部分を有していることを特徴とするＤＮＡ処理装置。
前記液体に接触する部分は前記第２の増幅工程の前に交換されるものである、請求項５に記載のＤＮＡ処理装置。
前記第２の増幅工程の前を除く工程では、前記液体に接触する部分を交換せずに使用を続けるように構成されている、請求項５に記載のＤＮＡ処理装置。
請求項５に記載のＤＮＡ処理装置を備えるＤＮＡ検査装置。
標的核酸と該標的核酸に相補的な核酸とを増幅する第１の増幅工程と、前記第１の増幅工程により増幅された所望の核酸を残してそれ以外の物質を除去する精製工程と、前記精製工程後に残った、増幅された前記標的核酸に相補的な核酸に対して、前記標的核酸の増幅を行なう第２の増幅工程とを含むＤＮＡ処理方法を行なうためのＤＮＡ処理装置において、
前記各工程中および前記各工程同士の間に、所望の液体をハンドリングする液体ハンドリング装置と、該液体ハンドリング装置の、前記液体に接触する部分を洗浄可能な洗浄部とを有していることを特徴とするＤＮＡ処理装置。
前記洗浄部は、前記液体に接触する部分を前記第２の増幅工程の前に洗浄するものである、請求項９に記載のＤＮＡ処理装置。
前記第２の増幅工程の前を除く工程では、前記液体に接触する部分を交換せずに使用を続けるように構成されている、請求項９に記載のＤＮＡ処理装置。
請求項９に記載のＤＮＡ処理装置を備えるＤＮＡ検査装置。
前記液体ハンドリング装置はピペット装置であり、前記液体に接触する部分はピペットチップである、請求項５〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡ処理装置。