JP2007093336A - Measuring method of material to be tested - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、被検物質の測定方法に関する。詳しくは、本発明は、抗原抗体反応などの被検物質に対する特異的結合を利用する被検物質の測定方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring a test substance. Specifically, the present invention relates to a method for measuring a test substance that uses specific binding to the test substance such as an antigen-antibody reaction.
従来、ヒトの臨床検査をはじめとして、獣医検査、食品検査など多くの分野で、被検物質に対する特異結合物質を用いる被検物質の測定法が広く普及している。例えば、抗原、抗原に対して特異的に結合する抗体であって固相に固定された抗体、および抗原に対して特異的に結合する抗体であって標識された抗体の３つの因子からなる免疫複合体を固相上に形成させ、免疫複合体中の標識を測定する抗原の測定法が知られている。しかしながら、そのような方法においては、もともと固相自体に標識抗体が非特異的に結合しやすい場合、形成された免疫複合体の正確な量を図ることが困難となる。また非特異的なシグナルが大きいほど、測定感度が低下することになる。 2. Description of the Related Art Conventionally, a method for measuring a test substance using a specific binding substance for a test substance has been widely used in many fields such as human clinical tests, veterinary tests, food tests, and the like. For example, an immunity comprising three factors: an antigen, an antibody that specifically binds to the antigen and is immobilized on a solid phase, and an antibody that specifically binds to the antigen and is labeled. A method for measuring an antigen is known in which a complex is formed on a solid phase and a label in the immune complex is measured. However, in such a method, when the labeled antibody tends to bind nonspecifically to the solid phase itself, it is difficult to obtain an accurate amount of the formed immune complex. In addition, the greater the non-specific signal, the lower the measurement sensitivity.
固相上の複合体を測定する従来の測定法については、非特異結合の回避、測定感度の向上などを目的とする様々な試みがなされている。たとえば、特許文献１には、固相上に形成された複合体を別の固相に移し変えた後に、固相上の複合体を測定する測定法が開示されている。しかしながら、そのような方法では、固相上に複合体を形成する工程が２回必要であるため、操作が煩雑である。 With respect to conventional measurement methods for measuring a complex on a solid phase, various attempts have been made for the purpose of avoiding non-specific binding and improving measurement sensitivity. For example, Patent Document 1 discloses a measurement method for measuring a complex on a solid phase after the complex formed on the solid phase is transferred to another solid phase. However, in such a method, since the process of forming a complex on a solid phase is required twice, the operation is complicated.
本発明の目的は、固相と標識抗体との非特異反応により生じるバックグラウンド（ノイズ）の影響を回避し、より正確な測定結果を得ることができる、被検物質の測定方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method for measuring a test substance capable of avoiding the influence of background (noise) caused by non-specific reaction between a solid phase and a labeled antibody and obtaining a more accurate measurement result. It is.
前記課題を解決するための手段として、本発明は、
（ａ）被検物質を含み得る試料に対して、固相に固定された捕捉体、被検物質に特異的に結合する第一部位と捕捉体に特異的に結合する第二部位とを有する第一の特異結合物質、および被検物質に特異的に結合し標識された第二の特異結合物質を用いて、固相上に捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第一の複合体を形成させる工程、
（ｂ）第一の複合体が形成された固相を洗浄する工程、
（ｃ）捕捉体または第二部位に特異的に結合する遊離剤を含む溶液中で、遊離剤が第一の複合体中の捕捉体または第二部位に結合することにより、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第二の複合体を固相から溶液に遊離させる工程、
（ｄ）第二の複合体を含む溶液を固相から分離する工程、および
（ｅ）分離された溶液中の標識を測定する工程
を含む被検物質の測定方法を提供する。
As means for solving the above problems, the present invention provides:
(A) A sample that can contain a test substance has a capture body fixed on a solid phase, a first site that specifically binds to the test substance, and a second site that specifically binds to the capture body Using the first specific binding substance and the second specific binding substance that specifically binds and is labeled to the test substance, the capture body, the first specific binding substance, the test substance, and the second on the solid phase. Forming a first complex comprising a specific binding substance of
(B) washing the solid phase on which the first complex is formed,
(C) In a solution containing a release agent that specifically binds to the capture body or the second site, the release agent binds to the capture body or the second site in the first complex, thereby causing the first specific binding. Releasing the second complex containing the substance, the test substance and the second specific binding substance from the solid phase to the solution;
(D) A method for measuring a test substance comprising a step of separating a solution containing a second complex from a solid phase, and (e) a step of measuring a label in the separated solution.
前記方法において、工程（ａ）は、被検物質を含み得る試料と第一の特異結合物質を混合して、被検物質と第一の特異結合物質とが結合した第一反応物を形成する工程、固相に固定された捕捉体と第一反応物中の第一の特異結合物質とが結合した第二反応物を形成する工程、および第二反応物中の被検物質と第二の特異結合物質とを結合させることにより第一の複合体を形成する工程からなることが好ましい。 In the method, in the step (a), a sample that may contain a test substance and a first specific binding substance are mixed to form a first reactant in which the test substance and the first specific binding substance are bound. A step, a step of forming a second reactant in which a capturing body fixed on a solid phase and a first specific binding substance in the first reaction are bound, and a test substance in the second reactant and a second It preferably comprises a step of forming a first complex by binding a specific binding substance.
さらに、前記方法において、捕捉体はアビジン、第一の特異結合物質の第一部位は被検物質特異抗体、第一の特異結合物質の第二部位はデスチオビオチン、第二の特異結合物質は、標識された被検物質特異抗体、および遊離剤はビオチンであることが好ましい。 Further, in the above method, the capturing body is avidin, the first site of the first specific binding substance is a test substance-specific antibody, the second site of the first specific binding substance is desthiobiotin, and the second specific binding substance is The labeled analyte-specific antibody and the releasing agent are preferably biotin.
また、本発明は、前記方法を実施するためのキットであって、固相に固定された捕捉体、被検物質と捕捉体とに結合する第一の特異結合物質、被検物質に結合する標識された第二の特異結合物質および／または遊離剤を含むキットを提供する。 Further, the present invention is a kit for carrying out the above method, which binds to a capturing body fixed on a solid phase, a first specific binding substance that binds to the test substance and the capturing body, and the test substance. A kit comprising a labeled second specific binding agent and / or release agent is provided.
本発明を用いれば、バックグラウンドの影響を回避することができ、たとえ被検物質が微量であっても十分に測定することができる。 By using the present invention, the influence of the background can be avoided, and even if the amount of the test substance is very small, it can be measured sufficiently.
また本発明によれば、たとえば、被検物質、第一の特異結合物質および標識された第二の特異結合物質を含む複合体のみを分離して被検物質を測定するため、測定の際、非特異的に固相に結合した第二の特異結合物質からのシグナルの影響を受けない。したがって、より高いS/N比を得ることが可能となり、感度の上昇を実現することができる。 Further, according to the present invention, for example, only the complex containing the test substance, the first specific binding substance and the labeled second specific binding substance is separated to measure the test substance. It is not affected by the signal from the second specific binding substance nonspecifically bound to the solid phase. Accordingly, it is possible to obtain a higher S / N ratio and realize an increase in sensitivity.
本発明の被検物質の測定方法は、
（ａ）被検物質を含み得る試料に対して、固相に固定された捕捉体、被検物質に特異的に結合する第一部位と捕捉体に特異的に結合する第二部位とを有する第一の特異結合物質、および被検物質に特異的に結合し標識された第二の特異結合物質を用いて、固相上に捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第一の複合体を形成させる工程、
（ｂ）第一の複合体が形成された固相を洗浄する工程、
（ｃ）捕捉体または第二部位に特異的に結合する遊離剤を含む溶液中で、遊離剤が第一の複合体中の捕捉体または第二部位に結合することにより、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第二の複合体を固相から溶液に遊離させる工程、
（ｄ）第二の複合体を含む溶液を固相から分離する工程、および
（ｅ）分離された溶液中の標識を測定する工程
を含む。
The method for measuring a test substance of the present invention comprises:
(A) A sample that can contain a test substance has a capture body fixed on a solid phase, a first site that specifically binds to the test substance, and a second site that specifically binds to the capture body Using the first specific binding substance and the second specific binding substance that specifically binds and is labeled to the test substance, the capture body, the first specific binding substance, the test substance, and the second on the solid phase. Forming a first complex comprising a specific binding substance of
(B) washing the solid phase on which the first complex is formed,
(C) In a solution containing a release agent that specifically binds to the capture body or the second site, the release agent binds to the capture body or the second site in the first complex, thereby causing the first specific binding. Releasing the second complex containing the substance, the test substance and the second specific binding substance from the solid phase to the solution;
(D) separating the solution containing the second complex from the solid phase, and (e) measuring the label in the separated solution.
本明細書において、「被検物質」は、検出または定量すべき対象の物質を意味する。被検物質としては、糖、脂質、核酸、ペプチド、タンパク質、細胞などが例示されるが、これらに限定されるものではない。 In the present specification, the “test substance” means a target substance to be detected or quantified. Examples of the test substance include sugars, lipids, nucleic acids, peptides, proteins, cells and the like, but are not limited thereto.
「試料」は、被検物質を含む疑いのある溶液、懸濁液、抽出液などの液体試料であれば特に限定されない。たとえば、尿、血清、血漿、血液、胆汁、胃腸分泌物、リンパ液、骨髄液、唾液、組織抽出液、組織ホモジネート、細胞抽出液、細胞ホモジネートなどを試料として用いることができる。 The “sample” is not particularly limited as long as it is a liquid sample such as a solution, suspension, or extract suspected of containing a test substance. For example, urine, serum, plasma, blood, bile, gastrointestinal secretions, lymph, bone marrow, saliva, tissue extract, tissue homogenate, cell extract, cell homogenate and the like can be used as samples.
「固相」は、捕捉体を固定することができる限り、その形状、サイズおよび材質などに特に制限はない。たとえば、マイクロタイタープレート、チューブ、またはゼラチン粒子、ラテックス粒子、磁性粒子などの粒子など本分野において常用されている固相を適宜使用することができる。溶液と固相との分離を容易に行うことができるという観点から、固相としては、磁性粒子を用いることが好ましい。磁性粒子としては、たとえば、フェライト粒子を用いることができる。 The “solid phase” is not particularly limited in shape, size, material and the like as long as the capture body can be immobilized. For example, a microtiter plate, a tube, or a solid phase commonly used in this field such as gelatin particles, latex particles, magnetic particles and the like can be appropriately used. From the viewpoint that the solution and the solid phase can be easily separated, it is preferable to use magnetic particles as the solid phase. For example, ferrite particles can be used as the magnetic particles.
「捕捉体」は、第一の特異結合物質の一部（以下、「第一の特異結合物質の第二部位」または「第二部位」と称する）に特異的に結合する物質である。 The “capturer” is a substance that specifically binds to a part of the first specific binding substance (hereinafter, referred to as “second part of the first specific binding substance” or “second part”).
固相上に捕捉体を固定させるための方法は、たとえば、吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの常法を適宜使用することができる。 As a method for immobilizing the capturing body on the solid phase, for example, a conventional method such as an adsorption method, a covalent bond method, an ion bond method, a cross-linking method can be used as appropriate.
「特異的に結合する」または「特異結合」とは、抗原と抗体との結合、ホルモンとホルモンレセプターとの結合、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応におけるＤＮＡ配列とその相補配列との結合、アビジンとビオチンとの結合、アビジンとデスチオビオチンとの結合などに例示されるような、特定の物質が結合することを意味する。 “Specific binding” or “specific binding” means binding between an antigen and an antibody, binding between a hormone and a hormone receptor, binding between a DNA sequence and its complementary sequence in a DNA hybridization reaction, and binding between avidin and biotin. It means that a specific substance is bound, as exemplified by binding, binding of avidin and desthiobiotin.
「第一の特異結合物質」は、少なくとも被検物質に特異的に結合する部位（以下、「第一の特異結合物質の第一部位」または「第一部位」と称する）および捕捉体に特異的に結合する第二部位を有する。第一の特異結合物質としては、たとえば、捕捉体に特異的に結合する物質と被検物質に特異的に結合する物質とを化学的に結合したものを用いることができる。捕捉体に特異的に結合する物質および被検物質に特異的に結合する物質の双方がタンパク質である場合は、遺伝子組み換え技術を用いて製造した双方の融合タンパク質を、第一の特異結合物質として使用することもできる。 The “first specific binding substance” is specific to at least a site that specifically binds to a test substance (hereinafter referred to as “first site of the first specific binding substance” or “first site”) and a capturing body. Has a second site for binding. As the first specific binding substance, for example, a substance obtained by chemically binding a substance that specifically binds to the capturing body and a substance that specifically binds to the test substance can be used. When both the substance that specifically binds to the capture body and the substance that specifically binds to the test substance are proteins, both fusion proteins produced using genetic recombination technology are used as the first specific binding substances. It can also be used.
「第二の特異結合物質」は、少なくとも、被検物質に特異的に結合し、被検物質との結合を検出することができるよう標識されている。たとえば、被検物質がタンパク質である場合には、そのタンパク質に対する抗体に標識を結合させた複合体を第二の特異結合物質として使用することができる。ここで、第二の特異結合物質が結合する被検物質中の領域は、第一部位が結合する領域と異なるものでなければならない。 The “second specific binding substance” is labeled so as to at least specifically bind to the test substance and detect the binding with the test substance. For example, when the test substance is a protein, a complex in which a label is bound to an antibody against the protein can be used as the second specific binding substance. Here, the region in the test substance to which the second specific binding substance binds must be different from the region to which the first site binds.
「標識」としては、本技術分野において通常用いられる標識を適宜用いることができる。標識としては、たとえば、α−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはペルオキシダーゼなどの酵素、フルオレセイン、クマリン、エオシン、フェナントロリン、ピレンもしくはローダミンなどの蛍光物質、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸、またはラジオアイソトープなどを使用することができる。これらの標識を用いることにより、第二の特異結合物質と被検物質とが結合した場合には被検物質を検出することができる。標識が酵素の場合には、酵素と基質との反応により生じる発色によって、被検物質を検出することができる。標識が蛍光物質の場合には、所定の波長を照射することにより生じる蛍光によって、被検物質を検出することができる。 As the “label”, a label usually used in this technical field can be appropriately used. As the label, for example, an enzyme such as α-galactosidase, alkaline phosphatase or peroxidase, a fluorescent substance such as fluorescein, coumarin, eosin, phenanthroline, pyrene or rhodamine, a nucleic acid such as DNA or RNA, or a radioisotope may be used. it can. By using these labels, the test substance can be detected when the second specific binding substance and the test substance are bound. When the label is an enzyme, the test substance can be detected by color development caused by the reaction between the enzyme and the substrate. When the label is a fluorescent substance, the test substance can be detected by fluorescence generated by irradiating a predetermined wavelength.
「第一の複合体」は、少なくとも捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む。第一の複合体において、捕捉体は第一の特異結合物質の第二部位に結合し、第一の特異結合物質の第一部位は被検物質に結合し、被検物質は第二の特異結合物質に結合している。第一の複合体を固相上に形成させる方法としては、たとえば、第一の特異結合物質と被検物質を含み得る試料とを混合することにより第一反応物を製造し、次に第一反応物と固相に固定された捕捉体とを混合することにより第二反応物を製造し、ついで第二反応物と第二の特異結合物質とを混合する方法が挙げられる。あるいは、固相に固定された捕捉体と第一の特異結合物質とを混合することにより第一反応物を製造し、次に第一反応物と被検物質を含み得る試料とを混合することにより第二反応物を製造し、ついで第二反応物と第二の特異結合物質とを混合することにより、第一の複合体を製造してもよい。さらにたとえば、固相に固定された捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質を含み得る試料および第二の特異結合物質を混合することにより、第一の複合体を製造してもよい。 The “first complex” includes at least a capturing body, a first specific binding substance, a test substance, and a second specific binding substance. In the first complex, the capture body binds to the second site of the first specific binding substance, the first site of the first specific binding substance binds to the test substance, and the test substance is the second specific binding substance. It is bound to the binding substance. As a method for forming the first complex on the solid phase, for example, a first reactant is produced by mixing a first specific binding substance and a sample that can contain a test substance, and then the first complex is prepared. There is a method in which a second reactant is produced by mixing the reactant and a capturing body fixed on a solid phase, and then the second reactant and the second specific binding substance are mixed. Alternatively, the first reactant is produced by mixing the capture body immobilized on the solid phase and the first specific binding substance, and then the first reactant and the sample that may contain the test substance are mixed. The first complex may be produced by producing the second reactant and then mixing the second reactant and the second specific binding substance. Further, for example, the first complex may be produced by mixing a capture body fixed on a solid phase, a first specific binding substance, a sample that may contain a test substance, and a second specific binding substance. .
「固相の洗浄」は、測定に不要な物質を固相から除去する目的で行う作業であり、常法に基づき適宜実施することができる。たとえば、固相がマイクロタイタープレートまたはチューブの場合、固相の洗浄は、マイクロタイタープレートまたはチューブから液相を吸引除去し、洗浄液を添加し、ついで、洗浄液を吸引除去することにより実施することができる。固相が磁性粒子の場合、磁石を用いて粒子を容器の壁面に固定しながら液相を吸引除去し、洗浄液を添加して粒子を懸濁させ、ついで磁石を用いて粒子を固定しながら洗浄液を吸引除去することにより、固相の洗浄を実施してもよい。固相がゼラチン粒子またはラテックス粒子の場合、粒子が沈殿することができる程度の遠心力により粒子を沈降させ、上清を吸引除去し、洗浄液を添加して粒子を懸濁させ、ついで遠心により再度粒子を沈降させて洗浄液を吸引除去することにより、固相の洗浄を行うことができる。 “Washing of the solid phase” is an operation performed for the purpose of removing substances unnecessary for measurement from the solid phase, and can be appropriately performed based on a conventional method. For example, when the solid phase is a microtiter plate or tube, washing of the solid phase can be performed by aspirating and removing the liquid phase from the microtiter plate or tube, adding a washing solution, and then removing the washing solution by aspiration. it can. When the solid phase is magnetic particles, the liquid phase is sucked and removed while fixing the particles to the wall surface of the container using a magnet, the cleaning liquid is added to suspend the particles, and then the cleaning liquid is fixed while fixing the particles using a magnet. The solid phase may be washed by removing by suction. If the solid phase is gelatin particles or latex particles, the particles are sedimented by a centrifugal force enough to allow the particles to settle, the supernatant is removed by suction, the washing solution is added to suspend the particles, and then centrifuged again. The solid phase can be washed by precipitating the particles and removing the washing liquid by suction.
洗浄液としては、被検物質と第一の特異結合物質との結合を解離させるなど、固相上に形成された第一の複合体に影響を及ぼすものでなければ、特に限定されない。洗浄液としては、たとえば、ＴＢＳ−Ｔ（0.02M Tris-HCl (pH7.6), 0.137M NaCl, 0.1% Tween 20）などの緩衝液を用いることができる。 The washing solution is not particularly limited as long as it does not affect the first complex formed on the solid phase, such as dissociating the binding between the test substance and the first specific binding substance. As the washing solution, for example, a buffer solution such as TBS-T (0.02 M Tris-HCl (pH 7.6), 0.137 M NaCl, 0.1% Tween 20) can be used.
「遊離剤」は、捕捉体または第一の特異結合物質中の第二部位に結合することができ、かつ、捕捉体または第二部位に結合することによって捕捉体と第二部位との結合を分離または解離することができる物質である。固相上に形成された第一の複合体に遊離剤を混合すれば、遊離剤が捕捉体または第二部位に結合、すなわち、遊離剤が捕捉体または第二部位と置換される。その結果、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む複合体、または遊離剤、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む複合体（これらを「第二の複合体」と称する）が固相から溶液に遊離する。たとえば、捕捉体がアビジン、第二部位がデスチオビオチンである場合には、遊離剤としてビオチンを用いることができる。また、捕捉体がデスチオビオチン、第二部位がアビジンである場合にも、遊離剤としてビオチンを用いることができる。しかしながら、ビオチンとアビジンとの結合は、デスチオビオチンとアビジンとの結合よりも強力であるため、たとえば、ビオチンを第一部位として使用し、遊離剤としてデスチオビオチンを使用することはできない。 The “release agent” can bind to the second site in the capture body or the first specific binding substance, and binds the capture body to the second site by binding to the capture body or the second site. A substance that can be separated or dissociated. When the release agent is mixed with the first complex formed on the solid phase, the release agent binds to the capture body or the second site, that is, the release agent is replaced with the capture body or the second site. As a result, a complex containing the first specific binding substance, the test substance and the second specific binding substance, or a complex containing the release agent, the first specific binding substance, the test substance and the second specific binding substance (These are referred to as “second complexes”) are released from the solid phase into solution. For example, when the capture body is avidin and the second site is desthiobiotin, biotin can be used as the release agent. Also, biotin can be used as a release agent when the capture body is desthiobiotin and the second site is avidin. However, since the bond between biotin and avidin is stronger than the bond between desthiobiotin and avidin, for example, biotin cannot be used as the first site and desthiobiotin cannot be used as the release agent.
たとえば、ある物質Ａを遊離剤として使用し得るか否かは、次のようにして確認することができる。捕捉体が固定されたマイクロタイタープレートに、標識された第二部位を混合することにより、プレート上に捕捉体と標識された第二部位との反応物を形成させる。プレートを洗浄した後、物質Ａの溶液をプレートに添加し、捕捉体または第二部位との反応に十分な時間プレートを静置する。そのプレートから溶液を分離し、溶液に含まれる標識量を測定する。溶液中に標識が含まれている場合、物質Ａは遊離剤として使用することができる。遊離剤としては、捕捉体を介してプレート上に固定された第二部位の３０％以上を溶液中に遊離させることができる物質を使用することが好ましい。さらに好ましくは、プレート上に固定された第二部位の５０％以上を溶液中に遊離させることができる物質を遊離剤として使用する。 For example, whether or not a certain substance A can be used as a release agent can be confirmed as follows. By mixing the labeled second site with the microtiter plate on which the capture body is fixed, a reaction product of the capture body and the labeled second site is formed on the plate. After washing the plate, the solution of substance A is added to the plate and the plate is allowed to stand for a time sufficient for reaction with the capturer or the second site. The solution is separated from the plate, and the amount of label contained in the solution is measured. If the solution contains a label, substance A can be used as a release agent. As the releasing agent, it is preferable to use a substance capable of releasing 30% or more of the second site fixed on the plate through the capturing body into the solution. More preferably, a substance capable of releasing 50% or more of the second site immobilized on the plate into the solution is used as the release agent.
「測定」は、被検物質を検出すること、または被検物質の量もしくは濃度を測定することを意味する。検出または測定は、常法に基づき適宜実施することができる。たとえば発光を測定する場合、市販のフォトンカウンタを用いて実施することができる。 “Measurement” means detecting a test substance or measuring the amount or concentration of a test substance. Detection or measurement can be appropriately performed based on a conventional method. For example, when measuring luminescence, it can carry out using a commercially available photon counter.
捕捉体、第一の特異結合物質の第一部位および第二部位、第二の特異結合物質ならびに遊離剤の組み合わせとしては、たとえば以下のものを例示することができる。 Examples of the combination of the capturing body, the first and second sites of the first specific binding substance, the second specific binding substance, and the release agent include the following.
表１において、「アビジン類」とは、たとえばアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなど、ビオチンおよびビオチン類似体と特異的に結合し得るものを意味する。 In Table 1, “avidins” means those that can specifically bind to biotin and biotin analogues such as avidin, streptavidin, neutravidin, and the like.
表１において、「ビオチン類」は、たとえばビオチン、またはビオチン誘導体を含む。ビオチン誘導体としては、具体的には、デスチオビオチンなどが例示される。デスチオビオチンを第一の特異結合物質の第一部位として使用する場合、遊離剤としては、デスチオビオチンとアビジン類との結合を解離することができる物質、たとえばビオチンを用いることができる。 In Table 1, “biotins” include, for example, biotin or biotin derivatives. Specific examples of the biotin derivative include desthiobiotin. When desthiobiotin is used as the first site of the first specific binding substance, a substance capable of dissociating the bond between desthiobiotin and avidins, such as biotin, can be used as the release agent.
「ハプテン類似体」としては、ハプテン誘導体などが挙げられる。具体的には、ハプテンとして２，４−ジニトロフェニル基が例示され、ジニトロフェニル基の類似体としてはε−Ｎ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンが例示される。 “Hapten analogs” include hapten derivatives and the like. Specifically, 2,4-dinitrophenyl group is exemplified as a hapten, and ε-N-2,4-dinitrophenyl-L-lysine is exemplified as an analog of the dinitrophenyl group.
「ホルモン類似体」としては、ホルモン誘導体などが挙げられる。 Examples of the “hormone analog” include hormone derivatives.
抗被検物質抗体、抗ハプテン抗体などの抗体は、常法に基づき製造することができる。たとえば、被検物質に対する抗体は、マウス、ラット、ウマ、ヤギおよびウサギなどの適当な動物を被検物質で免疫することによって製造することができる。また、抗体を産生するハイブリドーマの培養液からモノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマを投与したマウスの腹水から、モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、ハプテンは遊離の状態では抗体の産生を誘導することができない。抗ハプテン抗体を製造する際には、免疫原として、ハプテンと異種由来の生体高分子（担体）とを共有結合して得られるハプテン−担体複合体を使用する。担体としては、たとえば、オボアルブミン、ニワトリγグロブリン、スカシガイのヘモシアニンなどのタンパク質が用いられる。 Antibodies such as anti-test substance antibodies and anti-hapten antibodies can be produced based on conventional methods. For example, an antibody against a test substance can be produced by immunizing a suitable animal such as a mouse, rat, horse, goat and rabbit with the test substance. In addition, a monoclonal antibody can be obtained from a culture solution of a hybridoma that produces the antibody. Monoclonal antibodies can also be obtained from the ascites of mice administered with hybridomas. It should be noted that haptens cannot induce antibody production in a free state. When producing an anti-hapten antibody, a hapten-carrier complex obtained by covalently bonding a hapten and a biopolymer (carrier) derived from a different species is used as an immunogen. As the carrier, for example, proteins such as ovalbumin, chicken γ globulin, and mussel hemocyanin are used.
ハイブリドーマは、通常の方法、たとえば以下の手順により得ることができる。すなわち、感作抗原として、被検物質をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）等の適当な緩衝液中に溶解あるいは懸濁した抗原液を用いる。抗原液において、抗原濃度は、たとえば50〜500μg/mLとすることができる。免疫の際には、免疫原と、たとえば不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントとの混合物を動物に投与することが好ましい。また、キャリアータンパク質としてアルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等を用いてもよい。Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫を行う場合、アジュバント混合抗原液０．０５〜１ｍＬ（抗原物質１０〜２００μｇ）を腹腔内、皮下または筋肉内に注射する。さらに、初回の免疫から約４〜２１日毎に１〜４回免疫を行う。最終免疫より約３〜５日後、免疫動物から脾細胞を分離してリンパ球を得る。得られたリンパ球は、常法に基づき、たとえばマウスのミエローマ細胞と融合する。ハイブリドーマを適当な方法を用いてスクリーニングし、限界希釈法などにより、所望のハイブリドーマを単一クローンとして分離する。 The hybridoma can be obtained by an ordinary method, for example, the following procedure. That is, as a sensitizing antigen, an antigen solution in which a test substance is dissolved or suspended in a suitable buffer such as a phosphate buffer (PBS) is used. In the antigen solution, the antigen concentration can be, for example, 50 to 500 μg / mL. In immunization, it is preferable to administer a mixture of an immunogen and an adjuvant such as incomplete Freund's adjuvant to an animal. Further, albumin, keyhole limpet hemocyanin (KLH) or the like may be used as a carrier protein. When immunizing Balb / c mice, an adjuvant mixed antigen solution 0.05 to 1 mL (antigen substance 10 to 200 μg) is injected intraperitoneally, subcutaneously or intramuscularly. Furthermore, immunization is performed 1 to 4 times about every 4 to 21 days from the first immunization. About 3 to 5 days after the final immunization, spleen cells are separated from the immunized animal to obtain lymphocytes. The obtained lymphocytes are fused with, for example, mouse myeloma cells based on a conventional method. The hybridoma is screened using an appropriate method, and the desired hybridoma is isolated as a single clone by limiting dilution or the like.
抗体は、たとえば、ハイブリドーマを適当な培地にて培養することにより、培養液中に分泌される。したがって、たとえば、ハイブリドーマの培養液または培養液からの精製物を、本発明の方法に用いることができる。あるいは、ハイブリドーマを投与したマウスの腹水またはその精製物を、本発明の方法に用いることができる。抗体の精製は、たとえば沈殿分画法、イオン交換樹脂カラムによるIgG精製および／または抗原固定化カラムによる精製などの常法により、適宜実施することができる。 The antibody is secreted into the culture medium, for example, by culturing the hybridoma in an appropriate medium. Therefore, for example, a hybridoma culture solution or a purified product from the culture solution can be used in the method of the present invention. Alternatively, ascites fluid of a mouse administered with a hybridoma or a purified product thereof can be used in the method of the present invention. Purification of the antibody can be appropriately performed by a conventional method such as precipitation fractionation, IgG purification using an ion exchange resin column, and / or purification using an antigen-immobilized column.
本発明のキットは、本発明の方法を実施する目的のキットである限り、特に限定されない。固相に固定された捕捉体、被検物質と捕捉体とに結合する第一の特異結合物質、被検物質に結合する標識された第二の特異結合物質および遊離剤のうち、少なくとも１つの試薬を含むものであればよい。たとえば、固相に固定された捕捉体、被検物質と捕捉体とに結合する第一の特異結合物質、被検物質に結合する標識された第二の特異結合物質および遊離剤が１つの箱に納められているものを、本発明のキットとすることができる。あるいは、個別に包装される各試薬を本発明のキットとしてもよい。たとえば、標識としてラジオアイソトープを用いた場合など、保管条件が異なる試薬を使用する場合は、第二の特異結合物質のみを個別に包装してもよい。また、本発明のキットは、希釈液、洗浄液または標準液を備えていてもよい。 The kit of the present invention is not particularly limited as long as it is a kit for carrying out the method of the present invention. At least one of a capture body fixed to a solid phase, a first specific binding substance that binds to the test substance and the capture body, a labeled second specific binding substance that binds to the test substance, and a release agent It only needs to contain a reagent. For example, a box containing a capture body fixed to a solid phase, a first specific binding substance that binds to a test substance and the capture body, a labeled second specific binding substance that binds to the test substance, and a release agent Can be used as the kit of the present invention. Alternatively, each reagent individually packaged may be a kit of the present invention. For example, when using a reagent with different storage conditions, such as when a radioisotope is used as a label, only the second specific binding substance may be individually packaged. In addition, the kit of the present invention may include a diluent, a cleaning solution, or a standard solution.
本発明の方法の実施態様として、たとえば、次の方法を例示することができる。第一の特異結合物質と被検物質を含み得る試料とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第一の特異結合物質と被検物質とからなる第一反応物を得る。次に、第一反応物と固相に固定された捕捉体とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第一反応物と捕捉体とからなる第二反応物、すなわち、固相に固定された捕捉体、第一の特異結合物質および被検物質からなる第二反応物を得る。ここで、第二反応物が固定された固相を洗浄してもよい。固相の洗浄は、上述した方法により実施することができる。ついで、第二反応物と第二の特異結合物質とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第一の複合体、すなわち固相に固定された捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質からなる第一の複合体を得る。第一の複合体が固定されている固相を洗浄した後、第一の複合体と遊離剤とを混合する。混合手順は特に限定されない。第一の複合体と遊離剤とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第二の複合体、すなわち第一の特異結合物質、第二の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質からなる第二の複合体が、固相から溶液に遊離する。ついで、遊離した第二の複合体を含む溶液を固相から分離する。第二の複合体を含む溶液を固相から分離する際には、常法を用いることができる。たとえば、固相がマイクロタイタープレートまたはチューブの場合、シリンジおよびピペット等を用いて溶液を吸引することにより、第二の複合体を含む溶液を固相から分離してもよい。固相が磁性粒子の場合、磁石を用いて粒子を容器の壁面に固定しながらシリンジおよびピペット等を用いて溶液を吸引することにより、第二の複合体を含む溶液を固相から分離してもよい。あるいは、固相がゼラチン粒子またはラテックス粒子の場合、粒子が沈殿することができる程度の遠心力により粒子を沈降させ、シリンジおよびピペット等を用いて溶液を吸引することにより、第二の複合体を含む溶液を固相から分離してもよい。次に、第二の複合体を含む溶液中に含まれる標識を測定する。測定は、常法に基づき適宜実施することができる。 As an embodiment of the method of the present invention, for example, the following method can be exemplified. The first specific binding substance and the sample that can contain the test substance are mixed and allowed to stand for a sufficient time for the reaction, thereby obtaining a first reactant comprising the first specific binding substance and the test substance. Next, the first reactant and the capture body fixed on the solid phase are mixed and allowed to stand for a sufficient time for the reaction, whereby the second reactant consisting of the first reactant and the capture body, that is, the solid body. A second reactant comprising a capture body, a first specific binding substance, and a test substance immobilized on the phase is obtained. Here, the solid phase on which the second reactant is immobilized may be washed. The solid phase can be washed by the method described above. Next, the second reactant and the second specific binding substance are mixed and allowed to stand for a sufficient time for the reaction, whereby the first complex, that is, the capture body immobilized on the solid phase, the first specific binding. A first complex consisting of a substance, a test substance and a second specific binding substance is obtained. After washing the solid phase on which the first complex is fixed, the first complex and the release agent are mixed. The mixing procedure is not particularly limited. The first complex and the release agent are mixed and allowed to stand for a sufficient time for the reaction, whereby the second complex, that is, the first specific binding substance, the second specific binding substance, the test substance, and the first complex A second complex composed of two specific binding substances is released from the solid phase into the solution. The solution containing the liberated second complex is then separated from the solid phase. A conventional method can be used to separate the solution containing the second complex from the solid phase. For example, when the solid phase is a microtiter plate or tube, the solution containing the second complex may be separated from the solid phase by aspirating the solution using a syringe, pipette, or the like. When the solid phase is magnetic particles, the solution containing the second complex is separated from the solid phase by sucking the solution using a syringe and pipette while fixing the particles to the wall surface of the container using a magnet. Also good. Alternatively, when the solid phase is gelatin particles or latex particles, the particles are settled by centrifugal force enough to precipitate the particles, and the solution is sucked using a syringe, pipette, etc. The containing solution may be separated from the solid phase. Next, the label contained in the solution containing the second complex is measured. The measurement can be appropriately performed based on a conventional method.
本発明の方法の他の実施態様として、たとえば、次の方法を例示することができる。固相に固定された捕捉体と第一の特異結合物質とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、固相に固定された捕捉体と第一の特異結合物質とからなる第一反応物を得る。ここで、第一反応物が固定された固相を洗浄してもよい。固相の洗浄は、上述の方法により実施することができる。次に、第一反応物と被検物質を含み得る試料とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第一反応物と被検物質とからなる第二反応物、すなわち、固相に固定された捕捉体、第一の特異結合物質および被検物質からなる第二反応物を得る。ここで、第二反応物が固定された固相を、たとえば上述の方法にしたがって洗浄してもよい。ついで、第二反応物と第二の特異結合物質とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第一の複合体を得る。第一の複合体が固定されている固相を洗浄した後、第一の複合体と遊離剤とを混合する。混合手順は特に限定されない。第一の複合体と遊離剤とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第二の複合体が固相から溶液に遊離する。ついで、遊離した第二の複合体を含む溶液を固相から分離する。第二の複合体を含む溶液を固相から分離する方法としては、上述したように常法を用いることができ、特に限定されない。次に、第二の複合体を含む溶液中に含まれる標識を測定する。測定は、常法に基づき適宜実施することができる。 As another embodiment of the method of the present invention, for example, the following method can be exemplified. The capture body fixed to the solid phase and the first specific binding substance are mixed and allowed to stand for a sufficient time for the reaction, whereby the first capture substance consisting of the capture body fixed to the solid phase and the first specific binding substance is obtained. One reactant is obtained. Here, the solid phase on which the first reactant is fixed may be washed. The solid phase can be washed by the method described above. Next, the first reactant and a sample that can contain the test substance are mixed and allowed to stand for a sufficient time for the reaction, whereby a second reactant consisting of the first reactant and the test substance, that is, a solid substance. A second reactant comprising a capture body, a first specific binding substance, and a test substance immobilized on the phase is obtained. Here, the solid phase on which the second reactant is fixed may be washed, for example, according to the method described above. Next, the first complex is obtained by mixing the second reactant and the second specific binding substance and allowing to stand for a sufficient time for the reaction. After washing the solid phase on which the first complex is fixed, the first complex and the release agent are mixed. The mixing procedure is not particularly limited. The second complex is released from the solid phase into the solution by mixing the first complex and the release agent and allowing to stand for a sufficient time for the reaction. The solution containing the liberated second complex is then separated from the solid phase. As a method for separating the solution containing the second complex from the solid phase, a conventional method can be used as described above, and the method is not particularly limited. Next, the label contained in the solution containing the second complex is measured. The measurement can be appropriately performed based on a conventional method.
本発明の方法のさらなる実施態様として、たとえば、次の方法を例示することができる。固相に固定された捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含み得る試料を混合し、反応に十分な時間静置することにより、固相に固定された捕捉体、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質からなる第一の複合体を得る。第一の複合体が固定されている固相を洗浄した後、第一の複合体と遊離剤とを混合する。混合手順は特に限定されない。第一の複合体と遊離剤とを混合し、反応に十分な時間静置することにより、第二の複合体が固相から溶液に遊離する。ついで、遊離した第二の複合体を含む溶液を固相から分離する。第二の複合体を含む溶液を固相から分離する方法としては、前述したように常法を用いることができ、特に限定されない。次に、第二の複合体を含む溶液中に含まれる標識を測定する。測定は、常法に基づき適宜実施することができる。 As a further embodiment of the method of the present invention, for example, the following method can be exemplified. A sample that can contain the capture body, the first specific binding substance, the test substance, and the second specific binding substance fixed on the solid phase is mixed and allowed to stand for a sufficient time for the reaction. A first complex comprising the captured body, the first specific binding substance, the test substance and the second specific binding substance is obtained. After washing the solid phase on which the first complex is fixed, the first complex and the release agent are mixed. The mixing procedure is not particularly limited. The second complex is released from the solid phase into the solution by mixing the first complex and the release agent and allowing to stand for a sufficient time for the reaction. The solution containing the liberated second complex is then separated from the solid phase. As a method for separating the solution containing the second complex from the solid phase, a conventional method can be used as described above, and the method is not particularly limited. Next, the label contained in the solution containing the second complex is measured. The measurement can be appropriately performed based on a conventional method.
以下に、実施例および比較例を示すことにより、本発明をさらに詳細に説明する。ただし、以下の実施例により、本発明が限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by showing examples and comparative examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
（実施例１）
TBS-T-BSA（0.1% Tween 20、1% BSA、0.02% NaN3；調製後、0.2μmメッシュのフィルターでろ過）で4μg/mLに希釈したDSB-X Biotin-1053を、50μLずつ8連チューブに分注した。そのチューブに、TBS-T-BSAに溶解した0.01、0.1、1 ng/mLのリコンビナントHBsAg（BIODESIGN International製、0.48mg/mL、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原サブタイプadr、 カタログ番号R86783、Lot 4A01303）を20μLずつ添加し、チューブを室温で1分間静置した。なお、TBS-T-BSAのみを20μL添加したものをコントロールとし、HBsAgを添加したものと同様に以下の処理を行った。ここで使用したDSB-X Biotin-1053は、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAG）に対するモノクローナル抗体1053とデスチオビオチンとのコンジュゲートであり、DSB-X Biotin Protein Labeling Kit（Molecular Probes製、カタログ番号D20655）を用いて調製された。DSB-X Biotin-1053はTBS-T-BSA中に溶解しており、その濃度は2.22 mg/mLであった。
Example 1
DSB-X Biotin-1053 diluted to 4 μg / mL with TBS-T-BSA (0.1% Tween 20, 1% BSA, 0.02% NaN 3 ; prepared and then filtered with a 0.2 μm mesh filter), 50 μL each 8 times Dispense into tubes. In this tube, 0.01, 0.1, 1 ng / mL recombinant HBsAg dissolved in TBS-T-BSA (BIODESIGN International, 0.48 mg / mL, hepatitis B virus s antigen subtype adr, catalog number R86783, Lot 4A01303) 20 μL each was added, and the tube was allowed to stand at room temperature for 1 minute. The control was performed by adding 20 μL of TBS-T-BSA alone, and the following treatment was carried out in the same manner as in the case of adding HBsAg. The DSB-X Biotin-1053 used here is a conjugate of the monoclonal antibody 1053 against hepatitis B surface antigen (HBsAG) and desthiobiotin. The DSB-X Biotin Protein Labeling Kit (manufactured by Molecular Probes, catalog number D20655). ). DSB-X Biotin-1053 was dissolved in TBS-T-BSA, and its concentration was 2.22 mg / mL.
前記チューブに、TBS-T-BSAに懸濁した磁性粒子（0.5% M-PVA SAV1；Chemagen製）を30μlずつ添加し、チューブを室温で5分間静置した。なお、0.5% M-PVA SAV1はストレプトアビジンが表面に固定された磁性粒子である。 30 μl of magnetic particles (0.5% M-PVA SAV1; manufactured by Chemagen) suspended in TBS-T-BSA were added to the tube, and the tube was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Note that 0.5% M-PVA SAV1 is a magnetic particle having streptavidin immobilized on the surface.
次に、磁性粒子を３回洗浄した。なお、粒子の洗浄は次のようにして行った。磁性粒子を集磁し、上清を吸引除去した。チューブに200μLのTBS-T（0.02M Tris-HCl (pH7.6), 0.137M NaCl, 0.1% Tween 20）を添加し、磁性粒子を懸濁したのち、再び粒子を集磁して反応液を吸引除去した。 Next, the magnetic particles were washed three times. The particles were washed as follows. Magnetic particles were collected and the supernatant was removed by suction. Add 200 μL of TBS-T (0.02M Tris-HCl (pH7.6), 0.137M NaCl, 0.1% Tween 20) to the tube, suspend the magnetic particles, collect the particles again, and collect the reaction solution. Removed by suction.
チューブにTBS-T-BSAで1,000倍希釈したALP-Fab′(149)を100μLずつ添加し、磁性粒子を懸濁させた。ついで、チューブを室温で5分間静置したのち、磁性粒子を前述の方法で３回洗浄した。ALP-Fab′(149)は、Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH（同仁化学製）を用い、149抗体のFab′断片をアルカリホスファターゼで標識することにより作製した。なお、149抗体はHBsAGに対するモノクローナル抗体であり、1053抗体の認識部位とは異なるHBsAGの部位を認識する。 100 μL each of ALP-Fab ′ (149) diluted 1,000 times with TBS-T-BSA was added to the tube to suspend the magnetic particles. Next, after the tube was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, the magnetic particles were washed three times by the method described above. ALP-Fab ′ (149) was prepared by labeling the Fab ′ fragment of 149 antibody with alkaline phosphatase using Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH (manufactured by Dojindo). The 149 antibody is a monoclonal antibody against HBsAG and recognizes a site of HBsAG that is different from the recognition site of the 1053 antibody.
チューブに50μLのビオチン溶液(pH8.0)を添加して、磁性粒子を懸濁させた。ついで、磁性粒子を5分毎に懸濁させながら、懸濁液を室温で15分間静置した。なお、ビオチン溶液は、10mM sodium carbonate buffer (pH10.0)に溶解された50mM D-ビオチン溶液（Molecular Probes製、カタログ番号B20656）に1/50量の1M Tris-HCl (pH7.5)を添加することによりD-ビオチン溶液のpHを8.0に調整したものを使用した。 50 μL of biotin solution (pH 8.0) was added to the tube to suspend the magnetic particles. Subsequently, the suspension was allowed to stand at room temperature for 15 minutes while suspending the magnetic particles every 5 minutes. As for the biotin solution, 1/50 amount of 1M Tris-HCl (pH 7.5) was added to 50 mM D-biotin solution (Molecular Probes, catalog number B20656) dissolved in 10 mM sodium carbonate buffer (pH 10.0). Thus, the D-biotin solution adjusted to pH 8.0 was used.
磁性粒子を集磁し、上清をNuncローバインディングプレート（Nunc製、カタログ番号245395、ホワイト）に移した。プレートに37℃で保温しておいたCDP-Starを100μL添加し、基質反応を実施した。フォトンカウントはMTP-700CL（コロナ電気製）を用いて行った（感度x 1）。なお、CDP-Starはアルカリホスファターゼの基質であり、CDP-Star Ready-to-Use with Sapphire II（ABI製、カタログ番号T2214）に含まれる。 The magnetic particles were collected, and the supernatant was transferred to a Nunc low binding plate (Nunc, catalog number 245395, white). 100 μL of CDP-Star kept at 37 ° C. was added to the plate, and a substrate reaction was performed. Photon counting was performed using MTP-700CL (Corona Electric) (sensitivity x 1). CDP-Star is a substrate for alkaline phosphatase and is included in CDP-Star Ready-to-Use with Sapphire II (ABI, catalog number T2214).
フォトンカウントの値およびシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を下記表２に示す。 The values of the photon count and the signal / noise ratio (S / N ratio) are shown in Table 2 below.
（比較例１）
TBS-T-BSAで4μg/mLに希釈したDSB-X Biotin-1053を50μLずつ8連チューブに分注した。そのチューブに、TBS-T-BSAに溶解したリコンビナントHBsAg（0.01、0.1、1 ng/mL）を20μLずつ添加し、チューブを室温で1分間静置した。なお、TBS-T-BSAのみを20μL添加したものをコントロールとし、HBsAgを添加したものと同様に以下の処理を行った。
(Comparative Example 1)
50 μL of DSB-X Biotin-1053 diluted to 4 μg / mL with TBS-T-BSA was dispensed into 8 tubes. 20 μL of recombinant HBsAg (0.01, 0.1, 1 ng / mL) dissolved in TBS-T-BSA was added to the tube, and the tube was allowed to stand at room temperature for 1 minute. The control was performed by adding 20 μL of TBS-T-BSA alone, and the following treatment was carried out in the same manner as in the case of adding HBsAg.
前記チューブに、TBS-T-BSAに懸濁した磁性粒子（0.5% M-PVA SAV1）を30μlずつ添加し、チューブを室温で5分間静置した。 30 μl of magnetic particles (0.5% M-PVA SAV1) suspended in TBS-T-BSA were added to the tube, and the tube was allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
次に、磁性粒子を３回洗浄した。なお、粒子の洗浄は、実施例１に記載した方法により実施した。 Next, the magnetic particles were washed three times. The particles were washed by the method described in Example 1.
チューブにTBS-T-BSAで1,000倍希釈したALP-Fab′(149)を100μLずつ添加し、磁性粒子を懸濁させた。ついで、チューブを室温で5分間静置したのち、磁性粒子を前述の方法で３回洗浄した。 100 μL each of ALP-Fab ′ (149) diluted 1,000 times with TBS-T-BSA was added to the tube to suspend the magnetic particles. Next, after the tube was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, the magnetic particles were washed three times by the method described above.
チューブに37℃で保温しておいたCDP-Starを100μL添加し、磁性粒子を懸濁させた。得られた懸濁液をNuncローバインディングプレートに移し、そのプレートをマグネティックプレート上に置いて磁性粒子を底面に集磁した。フォトンカウントはMTP-700CLを用いて行った（感度x 1）。 100 μL of CDP-Star kept at 37 ° C. was added to the tube to suspend the magnetic particles. The obtained suspension was transferred to a Nunc low binding plate, and the plate was placed on a magnetic plate to collect magnetic particles on the bottom surface. Photon counting was performed using MTP-700CL (sensitivity x 1).
フォトンカウントの値およびＳ／Ｎ比を下記表２に示す。 The photon count values and S / N ratio are shown in Table 2 below.
（抗体の製造例）
実施例１および比較例１で使用した抗体（１４９抗体、１０５３抗体）は、以下に示す方法で製造し、選択した。
(Example of antibody production)
The antibodies (149 antibody and 1053 antibody) used in Example 1 and Comparative Example 1 were produced and selected by the method shown below.
（１）モノクローナル抗体の作製
１−１． マウスの免疫
ヒト血清から精製された不活性化ａｄｒ型ＨＢｓＡｇ（ＴＲＩＮＡ製）を５０μｇ含有するＰＢＳ１００μｌにフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）１００μｌを添加し、ボルテクスで混合して乳化させ、ＦＣＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを作製した。また、ＦＣＡではなくフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）を用いること以外は同様にしてＦＩＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを作製した。
(1) Production of monoclonal antibody 1-1. Immunization of mouse 100 μl of Freund's complete adjuvant (FCA) was added to 100 μl of PBS containing 50 μg of inactivated adr type HBsAg (manufactured by TRINA) purified from human serum, mixed by vortexing to emulsify, and 200 μl of FCA mixed HBsAg solution was mixed. Produced. Further, 200 μl of FIA mixed HBsAg solution was prepared in the same manner except that Freund's incomplete adjuvant (FIA) was used instead of FCA.
ＦＣＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与により初回免疫した。初回免疫後、二週間毎にＦＩＡ混合ＨＢｓＡｇ溶液２００μｌを用いて追加免疫を五回行った。最後の追加免疫から四日後に脾細胞を分離し、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３マウス骨髄腫細胞とＰＥＧ法により融合させ、ハイブリドーマを作製した。 First immunization was carried out by intraperitoneal administration of 200 μl of FCA mixed HBsAg solution to 8-week-old female BALB / c mice. After the first immunization, booster immunizations were performed 5 times using 200 μl of FIA mixed HBsAg solution every two weeks. Four days after the last boost, spleen cells were isolated and fused with P3X63-Ag8 / 653 mouse myeloma cells by the PEG method to prepare hybridomas.
１−２． ハイブリドーマの培養
ハイブリドーマを２．５×１０６cells/mlとなるようにヒポキサンチン−チミジン培地（ＨＴ培地）に懸濁させ、９６穴プレート（コーニング製；以下、培養用プレートとする）の各ウェルに２．５×１０５cells/wellとなるように分注した。培養用プレートを３７度、５％ＣＯ２の恒温槽内に静置し、ハイブリドーマの培養を開始した。翌日、ＨＡＴ培地を２５μｌずつ培養用プレートの各ウェルに添加し、さらに培養を継続した。１０日間培養してハイブリドーマのコロニーを出現させたところで、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行なった。
1-2. Hybridoma culture Hybridomas are suspended in hypoxanthine-thymidine medium (HT medium) at 2.5 × 10 6 cells / ml, and each well of a 96-well plate (manufactured by Corning; hereinafter referred to as culture plate). To 2.5 × 10 5 cells / well. The culture plate was allowed to stand in a 37 ° C., 5% CO 2 constant temperature bath, and hybridoma culture was started. On the next day, 25 μl of HAT medium was added to each well of the culture plate, and the culture was further continued. When hybridoma colonies appeared after 10 days of culture, screening for hybridomas producing monoclonal antibodies was performed.
１−３． ハイブリドーマのスクリーニング
０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ３を含む０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．５）に、ａｄｒ型ＨＢｓＡｇ（ＴＲＩＮＡ製）の濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるようａｄｒ型ＨＢｓＡｇを添加し、固定用ＨＢｓＡｇ溶液を調整した。固定用ＨＢｓＡｇ溶液１００μｌを９６穴プレート（Nunc製；以下、抗原固定プレートとする）の各ウェルに分注した。４度で一晩静置した後、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液（以下、第一緩衝液とする）で三回洗浄した。洗浄後、抗原固定プレートの各ウェルに２ｗ／ｖ％の濃度でＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液（以下、第二緩衝液とする）３００μｌを添加し、室温で二時間静置した。
1-3. Screening of hybridoma Adr-type HBsAg was added to 0.1 M PBS (pH 7.5) containing 0.1 w / v% NaN 3 so that the concentration of adr-type HBsAg (manufactured by TRINA) was 0.5 μg / ml. An HBsAg solution was prepared. 100 μl of the fixing HBsAg solution was dispensed into each well of a 96-well plate (Nunc; hereinafter referred to as “antigen-fixing plate”). After leaving still at 4 degrees overnight, it was washed three times with a TBS buffer solution (hereinafter referred to as a first buffer solution) containing Tween 20 at a concentration of 0.05%. After washing, 300 μl of TBS buffer (hereinafter referred to as second buffer) containing BSA at a concentration of 2 w / v% was added to each well of the antigen-fixed plate, and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
第二緩衝液を抗原固定プレートの各ウェルに７５μｌずつ添加した。さらに、１−２．で作製したハイブリドーマ培養上清を培養用プレートの各ウェルから取り出し、抗原固定プレートの各ウェルに２５μｌずつ添加した。第二緩衝液及び培養上清添加後、３７度で一時間インキュベートした。インキュベート後、３００μｌの第一緩衝液で抗原固定プレートの各ウェルを洗浄した。洗浄後、第二緩衝液で１００００倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ製；Code No. P0447）を抗原固定プレートの各ウェルに１００μｌずつ添加した。室温で３０分間反応させ、３００μｌの第一緩衝液で抗原固定プレートの各ウェルを洗浄してTMB peroxidase EIA Substrate Kit (Bio-Rad製)を用いて陽性を示すウェルを検出した。その結果、２６８８ウェル中、約３００ウェルにおいて抗ＨＢｓモノクローナル抗体が産生されていることが確認された。 75 μl of the second buffer was added to each well of the antigen fixing plate. Furthermore, 1-2. The hybridoma culture supernatant prepared in (1) was taken out from each well of the culture plate, and 25 μl was added to each well of the antigen fixing plate. After addition of the second buffer and the culture supernatant, incubation was performed at 37 degrees for 1 hour. After the incubation, each well of the antigen fixing plate was washed with 300 μl of the first buffer. After washing, horseradish peroxidase-labeled anti-mouse Ig polyclonal antibody (manufactured by DAKO; Code No. P0447) diluted 10,000-fold with the second buffer was added to each well of the antigen-immobilized plate in an amount of 100 μl. The reaction was allowed to proceed at room temperature for 30 minutes, each well of the antigen fixing plate was washed with 300 μl of the first buffer, and positive wells were detected using TMB peroxidase EIA Substrate Kit (manufactured by Bio-Rad). As a result, it was confirmed that anti-HBs monoclonal antibody was produced in about 300 wells out of 2688 wells.
（２）変異型ＨＢｓＡｇの作製
野生型ＨＢｓＡｇ（サブタイプ：ａｄｒ型）を有するＨＢＶに感染した患者の血液試料からＨＢＶのＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法を用いて野生型ＨＢｓＡｇをコードする領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片がコードする野生型ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に記載する。このＤＮＡ断片を真核細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Invitrogen）に組み込み、野生型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドを作製した。次にこの発現プラスミドをテンプレートとして、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて部位特異的変異導入を行い、下記表３に示す２０種類の変異型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドを構築した。野生型ＨＢｓＡｇ発現プラスミド及び変異型ＨＢｓＡｇ発現プラスミドをEndoFree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN)を用いて精製した。精製後の発現プラスミドをそれぞれPolyMagII (OZ Bioscience)を用いてサル腎臓由来のＣＯＳ７細胞に導入し、５％ ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養した。また、ネガティブコントロールとしてＨＢｓＡｇをコードするＤＮＡを組み込まずに、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のみを導入したＣＯＳ７細胞を作製し、同様に培養した。
(2) Production of mutant HBsAg HBV DNA is prepared from a blood sample of a patient infected with HBV having wild-type HBsAg (subtype: adr type), and includes a region encoding wild-type HBsAg using PCR. The DNA fragment was amplified. The amino acid sequence of wild type HBsAg encoded by this DNA fragment is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. This DNA fragment was incorporated into an eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) to prepare a wild type HBsAg expression plasmid. Next, using this expression plasmid as a template, site-directed mutagenesis was performed using QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), and 20 types of mutant HBsAg expression plasmids shown in Table 3 below were constructed. Wild type HBsAg expression plasmid and mutant type HBsAg expression plasmid were purified using EndoFree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN). The purified expression plasmids were introduced into monkey kidney-derived COS7 cells using PolyMagII (OZ Bioscience), respectively, and cultured in a 5% CO 2 incubator for 24 hours. As a negative control, COS7 cells into which only pcDNA3.1 (+) was introduced without incorporating DNA encoding HBsAg were prepared and cultured in the same manner.
（３）ＨＢｓＡｇに反応する抗体の選択
（２）で調製したＣＯＳ７細胞を、Trypsin-EDTA溶液（Sigma製）によりシャーレから剥がし、細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄後の細胞を適量のＰＢＳ中に懸濁させ、細胞浮遊液を調製した。細胞浮遊液をスライドグラスに適量スポットし、風乾後アセトン(和光純薬工業社製)で固定した。アセトン固定後のスライドグラスに（１）で作製した、抗ＨＢｓモノクローナル抗体を含む約３００クローンの培養上清をそれぞれ反応させた。各モノクローナル抗体の野生型ＨＢｓＡｇ及び２０種類の変異型ＨＢｓＡｇに対する反応性を、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇ抗体を用いて蛍光顕微鏡観察により判定した。その結果、表４に示されるようにハイブリドーマＨＢｓ−１０５３が産生する１０５３抗体及びハイブリドーマＨＢｓ−１４９が産生する１４９抗体に広範な反応性が認められた。ハイブリドーマＨＢｓ−１０５３およびハイブリドーマＨＢｓ−１４９は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０４９３およびＦＥＲＭ Ｐ−２０４９４として受託された。
(3) Selection of antibody reacting with HBsAg COS7 cells prepared in (2) were detached from a petri dish with Trypsin-EDTA solution (manufactured by Sigma), and the cells were washed with PBS. The washed cells were suspended in an appropriate amount of PBS to prepare a cell suspension. An appropriate amount of the cell suspension was spotted on a slide glass, air-dried, and fixed with acetone (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). About 300 clones of the culture supernatant containing the anti-HBs monoclonal antibody prepared in (1) were reacted with the slide glass after fixation with acetone. The reactivity of each monoclonal antibody to wild type HBsAg and 20 types of mutant HBsAg was determined by observation with a fluorescence microscope using a FITC-labeled anti-mouse Ig antibody. As a result, as shown in Table 4, a broad reactivity was observed for the 1053 antibody produced by the hybridoma HBs-1053 and the 149 antibody produced by the hybridoma HBs-149. Hybridoma HBs-1053 and Hybridoma HBs-149 were entrusted to the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession numbers FERM P-20493 and FERM P-20494, respectively.
表４中の「＋」は抗体が抗原を認識して結合したことを示し、「−」は抗体と抗原との反応が起こらなかったことを示す。 “+” In Table 4 indicates that the antibody recognizes and binds to the antigen, and “−” indicates that the reaction between the antibody and the antigen does not occur.
表４より、１４９抗体は表３に示す１４５位のアミノ酸変異を有する変異型ＨＢｓＡｇを除く全ての変異型ＨＢｓＡｇ及び野生型ＨＢｓＡｇと結合した。また、１０５３抗体は表３に示す全ての変異型ＨＢｓＡｇ及び野生型ＨＢｓＡｇと結合した。 From Table 4, the 149 antibody bound to all mutant HBsAg and wild type HBsAg except the mutant HBsAg having the amino acid mutation at position 145 shown in Table 3. The 1053 antibody bound to all mutant HBsAg and wild type HBsAg shown in Table 3.
Claims (4)
（ｂ）第一の複合体が形成された固相を洗浄する工程、
（ｃ）捕捉体または第二部位に特異的に結合する遊離剤を含む溶液中で、遊離剤が第一の複合体中の捕捉体または第二部位に結合することにより、第一の特異結合物質、被検物質および第二の特異結合物質を含む第二の複合体を固相から溶液に遊離させる工程、
（ｄ）第二の複合体を含む溶液を固相から分離する工程、および
（ｅ）分離された溶液中の標識を測定する工程
を含む被検物質の測定方法。 (A) A sample that can contain a test substance has a capture body fixed on a solid phase, a first site that specifically binds to the test substance, and a second site that specifically binds to the capture body Using the first specific binding substance and the second specific binding substance that specifically binds and is labeled to the test substance, the capture body, the first specific binding substance, the test substance, and the second on the solid phase. Forming a first complex comprising a specific binding substance of
(B) washing the solid phase on which the first complex is formed,
(C) In a solution containing a release agent that specifically binds to the capture body or the second site, the release agent binds to the capture body or the second site in the first complex, thereby causing the first specific binding. Releasing the second complex containing the substance, the test substance and the second specific binding substance from the solid phase to the solution;
(D) A method for measuring a test substance comprising a step of separating a solution containing the second complex from a solid phase, and (e) a step of measuring a label in the separated solution.
A kit for carrying out the method according to claim 1, 2 or 3, comprising: a capture body fixed on a solid phase; a first specific binding substance that binds to the test substance and the capture body; and a test substance. A kit comprising a labeled second specific binding substance and / or release agent that binds.
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