JP2007089496A

JP2007089496A - Method for screening medicine

Info

Publication number: JP2007089496A
Application number: JP2005284318A
Authority: JP
Inventors: Tomohiro Kurosaki; 知博黒崎; Hisaaki Shinohara; 久明篠原
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2005-09-29
Filing date: 2005-09-29
Publication date: 2007-04-12

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for screening medicines effective for prophylaxis and treatment of diseases such as autoimmune diseases and graft-versus-host diseases. <P>SOLUTION: The method for screening medicines comprises carrying out screening of medicines by using phosphorylation of CARMA1 after adding activation stimulation in an immunocyte or interaction between CARMA1 and TAK1 as an index. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は自己免疫疾患、移植片対宿主病、アレルギー性疾患、及びガンなどの疾患の予防又は治療に有効な医薬のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for screening a drug effective for prevention or treatment of diseases such as autoimmune diseases, graft-versus-host diseases, allergic diseases and cancer.

B細胞抗原受容体（BCR）の活性化は細胞増殖、未成熟ナイーブBリンパ球の生存、成熟B細胞のエフェクター機能などを調節する多くのシグナル経路を開始する（非特許文献１など参照）。その中でNF-κBの活性化につながるシグナル経路が非常に重要な役割を果たしている（非特許文献２など参照）。
NF-κBを活性化するシグナルの共通の特徴はIKKα及びIKKβの2つの触媒サブユニットおよびNEMO/IKKγの調節サブユニットからなるIκBキナーゼ(IKK)複合体の活性化である。IKKの活性化がIκBのリン酸化及びそれに伴う分解を引き起こし、NF-κBタンパク質を核に移行させる。BCRシグナルは主にこの経路によってNF-κBを活性化させる。
しかしながら、NF-κBはCD40及びToll様受容体(TLR)のような他の刺激によっても活性化されることから、BCRシグナル特異的なNF-κB活性化経路が存在することが示唆されていた（非特許文献３など参照）。 Activation of the B cell antigen receptor (BCR) initiates many signal pathways that regulate cell proliferation, survival of immature naive B lymphocytes, effector function of mature B cells, etc. (see Non-Patent Document 1, etc.). Among them, a signal pathway that leads to activation of NF-κB plays a very important role (see Non-Patent Document 2, etc.).
A common feature of the signal that activates NF-κB is the activation of the IκB kinase (IKK) complex, which consists of two catalytic subunits of IKKα and IKKβ and a regulatory subunit of NEMO / IKKγ. Activation of IKK causes IκB phosphorylation and concomitant degradation, translocating the NF-κB protein to the nucleus. The BCR signal activates NF-κB mainly through this pathway.
However, NF-κB is also activated by other stimuli such as CD40 and Toll-like receptor (TLR), suggesting the existence of a BCR signal-specific NF-κB activation pathway (See Non-Patent Document 3, etc.).

BCRシグナルではプロテインキナーゼC(PKC)βが活性化され、これがIKKの活性化に重要である（非特許文献４など参照）。また、NF-κBの活性化には、MAP3Kファミリーに属する別のタンパク質キナーゼであるTAK1がIKKの活性化に関与することも知られている（非特許文献５または６など参照）。BCR刺激によるNF-κBの活性化では、PKCβに加えてさらに、CARMA1、Bcl10及びMALT1のアダプター分子が必要であることが知られている（非特許文献７など参照）。実際、これらの因子のいずれかを欠損したB細胞ではBCR刺激によるIKKの活性化が起こらなかった（非特許文献８〜１０など参照）。
しかしながら、これらの分子がどのようにしてBCRシグナルに関与しているかは十分に解明されておらず、これらの分子を利用して医薬をスクリーニングするということは試みられていなかった。また、これまでにも、NF-κBの活性化を抑制する薬剤が免疫抑制剤として使用されていたが、免疫細胞特異的にNF-κBの活性化を抑制するものではなく、改良が望まれていた。
Nat. Rev. Immunol. 2:354-363, 2002 Nat. Rev. Immunol. 2:725-734, 2002 Cell. 109 Suppl:S81-96, 2002 Curr. Opin. Immunol. 16:367-373, 2004 J. Mol. Biol. 326:105-115, 2003 J. Biol. Chem. 278:48928-48934, 2003 Nat. Rev. Immunol. 4:348-359, 2004 Curr. Biol. 13:1252-1258, 2003 Immunity. 18:751-762, 2003 Curr. Biol. 13:1247-1251, 2003 Protein kinase C (PKC) β is activated in the BCR signal, and this is important for the activation of IKK (see Non-Patent Document 4 and the like). In addition, it is also known that TAK1, which is another protein kinase belonging to the MAP3K family, is involved in the activation of IKK in the activation of NF-κB (see Non-Patent Documents 5 and 6, etc.). It is known that activation of NF-κB by BCR stimulation requires adapter molecules of CARMA1, Bcl10, and MALT1 in addition to PKCβ (see Non-Patent Document 7, etc.). In fact, activation of IKK by BCR stimulation did not occur in B cells lacking any of these factors (see Non-Patent Documents 8 to 10, etc.).
However, how these molecules are involved in the BCR signal has not been fully elucidated, and it has not been attempted to screen drugs using these molecules. In the past, drugs that suppress NF-κB activation have been used as immunosuppressants, but they do not suppress NF-κB activation in an immune cell-specific manner, and improvements are desired. It was.
Nat. Rev. Immunol. 2: 354-363, 2002 Nat. Rev. Immunol. 2: 725-734, 2002 Cell. 109 Suppl: S81-96, 2002 Curr. Opin. Immunol. 16: 367-373, 2004 J. Mol. Biol. 326: 105-115, 2003 J. Biol. Chem. 278: 48928-48934, 2003 Nat. Rev. Immunol. 4: 348-359, 2004 Curr. Biol. 13: 1252-1258, 2003 Immunity. 18: 751-762, 2003 Curr. Biol. 13: 1247-1251, 2003

B細胞などの免疫細胞におけるNF-κBの活性化を特異的に抑制することができれば、自己免疫疾患、移植片対宿主病、アレルギー、ガンなどに対する有効な治療法が提供できると考えられる。そこで、本発明は、自己免疫疾患、移植片対宿主病、アレルギー、ガンなどの疾患の予防又は治療に有効な医薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする
。 If the activation of NF-κB in immune cells such as B cells can be specifically suppressed, an effective treatment for autoimmune disease, graft-versus-host disease, allergy, cancer, etc. can be provided. Then, this invention makes it a subject to provide the screening method of the pharmaceutical effective in prevention or treatment of diseases, such as an autoimmune disease, graft versus host disease, allergy, and cancer.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、BCR刺激によるNF-κBの活性化には、CARMA1のリン酸化及びそれに伴うCARMA1とTAK1の相互作用が重要であることを見出した。これらを指標にすることにより自己免疫疾患等の疾患の予防薬または治療薬が効率よくスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have made extensive studies to solve the above problems. As a result, we found that phosphorylation of CARMA1 and the interaction between CARMA1 and TAK1 are important for the activation of NF-κB by BCR stimulation. By using these as indicators, it has been found that prophylactic or therapeutic agents for diseases such as autoimmune diseases can be efficiently screened, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）CARMA1及びTAK1を発現する免疫細胞に化合物を添加し、さらに免疫細胞活性化刺激を加えた後、CARMA1のリン酸化、またはCARMA1とTAK1の相互作用を測定することを特徴とする、医薬のスクリーニング方法。
（２）免疫細胞がB細胞である、（１）の医薬のスクリーニング方法。
（３）B細胞がDT40細胞である、（２）の医薬のスクリーニング方法。
（４）医薬が自己免疫疾患、移植片対宿主病、アレルギー疾患、またはガンに対する医薬である、（１）〜（３）のいずれかの医薬のスクリーニング方法。
（５）CARMA1及びTAK1を発現する免疫細胞に化合物を添加し、さらに免疫細胞活性化刺激を加えた後、CARMA1のリン酸化、またはCARMA1とTAK1の相互作用を測定することを特徴とする、化合物のNF-κB活性化阻害能の評価方法。 That is, the present invention is as follows.
(1) A pharmaceutical comprising adding a compound to immune cells expressing CARMA1 and TAK1, and further stimulating immune cell activation, and then measuring phosphorylation of CARMA1 or the interaction between CARMA1 and TAK1 Screening method.
(2) The pharmaceutical screening method according to (1), wherein the immune cells are B cells.
(3) The pharmaceutical screening method according to (2), wherein the B cell is a DT40 cell.
(4) The method for screening a drug according to any one of (1) to (3), wherein the drug is a drug against autoimmune disease, graft-versus-host disease, allergic disease, or cancer.
(5) A compound characterized in that a compound is added to immune cells that express CARMA1 and TAK1, and after further stimulation of immune cell activation, the phosphorylation of CARMA1 or the interaction between CARMA1 and TAK1 is measured. For evaluating the ability of NF-κB activation to be inhibited.

本発明のスクリーニング方法によれば、自己免疫疾患、移植片対宿主病、アレルギー疾患、ガン等の疾患の予防薬または治療薬を効率よくスクリーニングすることができる。
According to the screening method of the present invention, prophylactic or therapeutic agents for diseases such as autoimmune diseases, graft-versus-host diseases, allergic diseases, and cancer can be efficiently screened.

本発明のスクリーニング方法では、免疫細胞における活性化刺激添加後の、CARMA1のリン酸化またはそれに伴うCARMA1とTAK1の相互作用を指標とする。 In the screening method of the present invention, phosphorylation of CARMA1 or the accompanying interaction between CARMA1 and TAK1 after addition of activation stimuli in immune cells is used as an index.

ここで、免疫細胞とは、CARMA1とTAK1を発現し、刺激に応答してNF-κBが活性化される細胞であれば特に制限されないが、リンパ細胞が好ましく、B細胞またはT細胞がより好ましく、B細胞が特に好ましい。スクリーニングに用いる免疫細胞は脾臓などの組織から単離された細胞であってもよいし、株化された培養細胞であってもよい。ヒト由来細胞、マウス由来細胞、ニワトリ由来細胞、その他の動物由来細胞のいずれであってもよい。株化された培養B細胞として具体的には、例えば、ニワトリ由来のDT40細胞を用いることができる。この細胞はこの分野の研究者に一般的に使用されている細胞であるが、例えば、RIKEN細胞バンクから入手可能である。また、マウス成熟B細胞株A20、マウス未熟B細胞株WEHI、ヒトT細胞株Jurkat等を用いることもできる。これらの細胞はAmerican Type Culture
Collection (ATCC)などから入手することができる。
なお、これらの細胞におけるNF-κBの活性化は、NF-κBの核移行、NF-κBのDNAへの結合、標的遺伝子の発現の亢進のほか、IκBのリン酸化や分解などを指標にして確認することができる。 Here, the immune cell is not particularly limited as long as it expresses CARMA1 and TAK1 and activates NF-κB in response to stimulation, but is preferably a lymphocyte, and more preferably a B cell or a T cell. B cells are particularly preferred. The immune cells used for screening may be cells isolated from tissues such as the spleen, or may be cultured cells that have been established. Any of human-derived cells, mouse-derived cells, chicken-derived cells, and other animal-derived cells may be used. Specifically, for example, chicken-derived DT40 cells can be used as the established cultured B cells. This cell is commonly used by researchers in this field, but is available from, for example, the RIKEN cell bank. Also, mouse mature B cell line A20, mouse immature B cell line WEHI, human T cell line Jurkat, and the like can be used. These cells are American Type Culture
It can be obtained from Collection (ATCC).
The activation of NF-κB in these cells is based on NF-κB nuclear translocation, NF-κB binding to DNA, increased expression of target genes, and IκB phosphorylation and degradation as indicators. Can be confirmed.

CARMA1は膜結合型グアニル酸キナーゼファミリーに特徴的なPDZ、SH3、及びGUKドメインのモチーフを有し、様々なシグナル分子を膜サブドメインにつなぎとめるscaffoldタンパク質である（EMBO J. 21:5184-5194, 2002）。CARMA1としては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトCARMA1が挙げられる。このヒトCARMA1をコードする塩基配列を配列番号１に示す。ただし、本発明のスクリーニング方法に用いられるCARMA1はこれに限定されず、BCR刺激によってリン酸化され、TAK1と相互作用するものであれば、配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたアミノ
酸配列を有するタンパク質であってもよい。ここで、数個とは２〜１００個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜２０個をいう。この中にはマウスなど他の動物由来のCARMA１も含まれる。
CARMA1の発現はウエスタンブロッティングやRT-PCR、ノザンブロッティングなどで確認することができる。 CARMA1 is a scaffold protein that has the PDZ, SH3, and GUK domain motifs characteristic of the membrane-bound guanylate kinase family and anchors various signal molecules to membrane subdomains (EMBO J. 21: 5184-5194, 2002). Examples of CARMA1 include human CARMA1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The base sequence encoding this human CARMA1 is shown in SEQ ID NO: 1. However, CARMA1 used in the screening method of the present invention is not limited to this, and one or several amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as long as it is phosphorylated by BCR stimulation and interacts with TAK1. It may be a protein having an amino acid sequence that is deleted, inserted, or inserted. Here, several means 2 to 100, preferably 2 to 50, and more preferably 2 to 20. This includes CARMA1 derived from other animals such as mice.
The expression of CARMA1 can be confirmed by Western blotting, RT-PCR, Northern blotting and the like.

TAK1はMAP3Kファミリーに属するキナーゼである（J. Mol. Biol. 326:105-115, 2003）。TAK1としては、例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトTAK1が挙げられる。このヒトTAK1をコードする塩基配列を配列番号３に示す。ただし、本発明のスクリーニング方法に用いられるTAK1はこれに限定されず、刺激によってリン酸化されたCARMA1と相互作用するものであれば、配列番号４のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、または挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質を用いてもよい。ここで、数個とは２〜５０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個をいう。この中にはマウスなど他の動物由来のTAK１も含まれる。
TAK1の発現はウエスタンブロッティングやRT-PCR、ノザンブロッティングなどで確認することができる。 TAK1 is a kinase belonging to the MAP3K family (J. Mol. Biol. 326: 105-115, 2003). An example of TAK1 is human TAK1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. The nucleotide sequence encoding this human TAK1 is shown in SEQ ID NO: 3. However, TAK1 used in the screening method of the present invention is not limited to this, and one or several amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 as long as it interacts with CARMA1 phosphorylated by stimulation. A protein having a deleted or inserted amino acid sequence may be used. Here, several means 2 to 50, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10. This includes TAK1 derived from other animals such as mice.
TAK1 expression can be confirmed by Western blotting, RT-PCR, Northern blotting, and the like.

CARMA1のリン酸化を指標にしてスクリーニングを行う場合、CARMA1及びTAK1を発現する免疫細胞に化合物を添加し、活性化刺激を添加後、該細胞におけるCARMA1のリン酸化を測定し、CARMA1のリン酸化を阻害する化合物を医薬候補化合物として選択する。
免疫細胞活性化刺激としては、NF-κBを活性化させる刺激であれば特に制限されないが、抗IgM抗体や細胞表面抗原に対する抗体などが挙げられる。また、CpGオリゴヌクレオチド（CpG ODN）、BAFF（J Exp Med. 1999 Jun 7;189(11):1747-56.）、CD40リガンドなどを活性化刺激として用いることもできる。
なお、評価化合物の添加と活性化刺激の添加は同時に行ってもよい。
CARMA1のリン酸化は、抗リン酸化セリン／スレオニン抗体、抗リン酸化CARMA1抗体や³²P-ATPなどを用いて測定することができる。CARMA1特異的リン酸化を調べるために、抗CARMA1抗体を用いて免疫沈降などによりCARMA1を分離した後に、抗リン酸化セリン／スレオニン抗体などを用いてCARMA1のリン酸化を測定することが好ましい。また、必ずしも抗CARMA1抗体を用いる必要はなく、CARMA1をFlag、Mycなどのタグが結合した形で免疫細胞に発現させた場合、抗Flag抗体や抗Myc抗体などのタグを認識する抗体を用いて免疫沈降してもよい。
CARMA1のリン酸化は刺激後早期に起こるため、刺激添加後、短時間でのCARMA1のリン酸化を評価することが好ましい。ここで、短時間とは、例えば、30秒〜5分が例示される。 When screening using CARMA1 phosphorylation as an indicator, compounds are added to immune cells expressing CARMA1 and TAK1, and after activation stimuli are added, the phosphorylation of CARMA1 is measured by measuring the phosphorylation of CARMA1 in the cells. A compound that inhibits is selected as a pharmaceutical candidate compound.
The immune cell activation stimulus is not particularly limited as long as it is a stimulus that activates NF-κB, and examples thereof include an anti-IgM antibody and an antibody against a cell surface antigen. Moreover, CpG oligonucleotide (CpG ODN), BAFF (J Exp Med. 1999 Jun 7; 189 (11): 1747-56.), CD40 ligand, etc. can also be used as activation stimuli.
Note that the addition of the evaluation compound and the activation stimulus may be performed simultaneously.
The phosphorylation of CARMA1 can be measured using an anti-phosphorylated serine / threonine antibody, an anti-phosphorylated CARMA1 antibody, ³² P-ATP, or the like. In order to examine CARMA1-specific phosphorylation, it is preferable to measure CARMA1 phosphorylation using an anti-phosphorylated serine / threonine antibody or the like after separating CARMA1 by immunoprecipitation using an anti-CARMA1 antibody. In addition, it is not always necessary to use an anti-CARMA1 antibody. When CARMA1 is expressed in immune cells in a form in which a tag such as Flag or Myc is bound, an antibody that recognizes a tag such as an anti-Flag antibody or an anti-Myc antibody is used. Immunoprecipitation may be performed.
Since phosphorylation of CARMA1 occurs early after stimulation, it is preferable to evaluate phosphorylation of CARMA1 in a short time after addition of stimulation. Here, the short time is, for example, 30 seconds to 5 minutes.

CARMA1とTAK1の相互作用を指標にしてスクリーニングを行う場合、CARMA1及びTAK1を発現する免疫細胞に化合物を添加し、刺激後のCARMA1とTAK1の相互作用を測定し、CARMA1とTAK1の相互作用を阻害する化合物を医薬候補化合物として選択する。
両者の相互作用を解析する方法としては、例えば、免疫沈降を用いる方法を挙げることができる。すなわち、CARMA1とTAK1とを発現する免疫細胞に化合物を加え、活性化刺激添加後に、一方のタンパク質に対する抗体等で複合体を回収したのち、他方のタンパク質を、そのタンパク質に対する抗体等を用いて検出することにより、両者のタンパク質の相互作用に与える被検化合物の影響を評価することができる。この場合において、両タンパク質は細胞が内因的に発現するタンパク質であってもよいが、どちらかまたは両方のタンパク質を外来的に細胞で発現させることもできる。免疫細胞内でタンパク質を外来的に発現させる場合、例えば、上述したようなCARMA1またはTAK1をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡＩ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで発現させることができる。なお、これらのタンパク質はＭｙｃタグやＦｌａｇタグなどのペプチドタグとの融合タンパク質として発現させてもよい。 When screening using the interaction between CARMA1 and TAK1 as an indicator, compounds are added to immune cells that express CARMA1 and TAK1, and the interaction between CARMA1 and TAK1 after stimulation is measured to inhibit the interaction between CARMA1 and TAK1. The compound to be selected is selected as a pharmaceutical candidate compound.
Examples of a method for analyzing the interaction between the two include a method using immunoprecipitation. That is, a compound is added to immune cells expressing CARMA1 and TAK1, and after addition of an activation stimulus, the complex is recovered with an antibody against one of the proteins, and then the other protein is detected using an antibody against that protein. By doing so, it is possible to evaluate the influence of the test compound on the interaction between the two proteins. In this case, both proteins may be proteins endogenously expressed by the cell, but either or both proteins can be expressed exogenously in the cells. When a protein is expressed exogenously in immune cells, for example, the gene encoding CARMA1 or TAK1 as described above is inserted into a vector for expressing a foreign gene such as pSV2neo, pcDNA I, or pCD8. Can do. These proteins may be expressed as fusion proteins with peptide tags such as Myc tag and Flag tag.

CARMA1とTAK1の相互作用は、また、２−ハイブリッド法によって解析することもできる。２−ハイブリッド法においては、CARMA１またはTAK１のどちらか一方のタンパク質またはその部分ペプチドを、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域等と融合させた融合タンパク質を発現する第1のベクター、そして他方のタンパク質またはその部分ペプチドをＶＰ１６またはＧＡＬ４等の転写活性化領域と融合させた融合タンパク質を発現する第2のベクターをそれぞれ構築し、これらを、レポーター遺伝子をコードするベクターと共に細胞に導入して、被検化合物を含む試料の存在下でレポーター活性を指標に化合物のアッセイを行う。CARMA１とTAK1との相互作用によりレポーター遺伝子の発現が誘導されるが、被検化合物により両者のタンパク質の相互作用が阻害されると、レポーター遺伝子の発現が抑制される。レポーター遺伝子としては、例えば、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。
CARMA1とTAK1の相互作用もまた、刺激後早期に起こるため、刺激添加後、短時間でのCARMA1とTAK1の相互作用を評価することが好ましい。 The interaction between CARMA1 and TAK1 can also be analyzed by the two-hybrid method. In the two-hybrid method, a first vector that expresses a fusion protein in which either one of CARMA1 or TAK1 protein or a partial peptide thereof is fused with a GAL4 DNA binding region, and the other protein or a partial peptide thereof is used. A second vector that expresses a fusion protein fused with a transcriptional activation region such as VP16 or GAL4 is constructed, and these are introduced into a cell together with a vector encoding a reporter gene. In the presence, the compound is assayed using the reporter activity as an indicator. The expression of the reporter gene is induced by the interaction between CARMA1 and TAK1, but when the interaction between the two proteins is inhibited by the test compound, the expression of the reporter gene is suppressed. Examples of the reporter gene include, but are not limited to, a LacZ gene, a CAT gene, a luciferase gene, and a GFP gene.
Since the interaction between CARMA1 and TAK1 also occurs early after stimulation, it is preferable to evaluate the interaction between CARMA1 and TAK1 in a short time after the addition of stimulation.

上記のようなスクリーニング方法によって得られる医薬は、免疫細胞におけるNF-κBの活性化を抑制するため、自己免疫疾患、移植の際に拒絶反応を呈する移植片対宿主病、ガン、アレルギーなどの治療薬や予防薬として有用である。自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデス、進行性全身性硬化症、多発性筋炎、慢性関節リウマチなどが挙げられ、アレルギーとしては、アトピー型気管支喘息、アトピー性皮膚炎、及びアレルギー性鼻炎や花粉症等のアレルギー性鼻炎などが挙げられる。ガンとしては白血病などが挙げられる。 The medicine obtained by the screening method as described above suppresses the activation of NF-κB in immune cells, and thus treats autoimmune disease, graft-versus-host disease that shows rejection during transplantation, cancer, allergy, etc. It is useful as a medicine or a preventive drug. Autoimmune diseases include systemic lupus erythematosus, progressive systemic sclerosis, polymyositis, rheumatoid arthritis, etc. Allergies include atopic bronchial asthma, atopic dermatitis, allergic rhinitis and hay fever And allergic rhinitis. Examples of cancer include leukemia.

スクリーニングの対象とする化合物としては特に制限はなく、例えば、低分子合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドであってもよい。スクリーニングには個々の被検化合物を用いてもよいが、化合物ライブラリーを用いてもよい。
なお、CARMA1及びTAK1を発現する免疫細胞に化合物を添加し、さらに免疫細胞活性化刺激を加えた後、CARMA1のリン酸化、またはCARMA1とTAK1の相互作用を測定することによって、化合物のNF-κB活性化阻害能の評価する方法も本発明に含まれる。
There is no restriction | limiting in particular as a compound made into the object of screening, For example, a low molecular synthetic compound may be sufficient and the compound contained in a natural product may be sufficient. Moreover, a peptide may be sufficient. Although individual test compounds may be used for screening, a compound library may be used.
In addition, after adding the compound to immune cells expressing CARMA1 and TAK1, and further stimulating immune cell activation, the phosphorylation of CARMA1 or the interaction between CARMA1 and TAK1 is measured to measure the NF-κB of the compound. A method for evaluating the ability to inhibit activation is also included in the present invention.

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.

＜材料と方法＞
野生型及び変異型DT40細胞は10％ウシ胎児血清、1％ニワトリ血清、50μM 2-ME ( Sigma-Aldrich社)、4mM L-グルタミン、及び抗生物質を含むRPMI 1640 (GIBCO^TM;Invitrogen社)を用いて培養した。野生型C57BL/6JマウスはClea Japan社から購入した。抗CARMA1抗体は合成ペプチド(CLQFVSRSENKYKRMNSNERVRI：配列番号５)を用いてウサギを免疫することによって作製した。抗IκBα抗体は大腸菌で発現させたGST融合ニワトリIκBα(アミノ酸番号1-103)を用いてウサギを免疫することによって作製した。抗ニワトリIgM モノクローナル抗体M4（J. Exp. Med. 198:1841-1851, 2003）をB細胞抗原受容体（BCR）刺激に用いた。抗ERK抗体、抗JNK抗体、抗TAK1モノクローナル抗体(C9)、抗Bcl10モノクローナル抗体(331.3)、抗MALT1抗体はSanta Cruz Biotechnology Incより購入した。抗リン酸化PKCβ(T 500)抗体、抗PKCβII抗体、抗CARMA1抗体、抗TAK1抗体は Abcam社から購入した。抗IKKγモノクローナル抗体はBD pharmingen社から購入した。抗リン酸化ERK抗体、抗リン酸化IκBαモノクローナル抗体(5A5)、抗リン酸化IKKα/β(S177 /S181) 及び抗リン酸化スレオニン抗体はCell Signaling Technology Incから購入した。抗リン酸化セリン抗体はZymed社から購入した。抗リン酸化セリン抗体と抗リン酸化スレオニン抗体の混合物
を抗リン酸化セリン／スレオニン抗体として用いた。抗Flagモノクローナル抗体(M2)はSIGMA社から購入した。 <Materials and methods>
Wild-type and mutant DT40 cells are RPMI 1640 (GIBCO ^™ ; Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum, 1% chicken serum, 50 μM 2-ME (Sigma-Aldrich), 4 mM L-glutamine, and antibiotics. And cultured. Wild type C57BL / 6J mice were purchased from Clea Japan. The anti-CARMA1 antibody was produced by immunizing a rabbit with a synthetic peptide (CLQFVSRSENKYKRMNSNERVRI: SEQ ID NO: 5). Anti-IκBα antibody was prepared by immunizing rabbits with GST-fused chicken IκBα (amino acid number 1-103) expressed in E. coli. Anti-chicken IgM monoclonal antibody M4 (J. Exp. Med. 198: 1841-1851, 2003) was used for B cell antigen receptor (BCR) stimulation. Anti-ERK antibody, anti-JNK antibody, anti-TAK1 monoclonal antibody (C9), anti-Bcl10 monoclonal antibody (331.3), and anti-MALT1 antibody were purchased from Santa Cruz Biotechnology Inc. Anti-phosphorylated PKCβ (T 500) antibody, anti-PKCβII antibody, anti-CARMA1 antibody, and anti-TAK1 antibody were purchased from Abcam. Anti-IKKγ monoclonal antibody was purchased from BD pharmingen. Anti-phosphorylated ERK antibody, anti-phosphorylated IκBα monoclonal antibody (5A5), anti-phosphorylated IKKα / β (S177 / S181) and anti-phosphorylated threonine antibody were purchased from Cell Signaling Technology Inc. Anti-phosphorylated serine antibody was purchased from Zymed. A mixture of anti-phosphorylated serine antibody and anti-phosphorylated threonine antibody was used as anti-phosphorylated serine / threonine antibody. Anti-Flag monoclonal antibody (M2) was purchased from SIGMA.

報告されているマウスのPKCβII, CARMA1, 及びTAK1の配列に基づいて、expressed sequence tag (EST) データベースを用いてニワトリホモログを検索し、DT40 細胞からのRNAを用いてRT-PCRによりそれぞれのニワトリcDNAを得た。PKCβII, CARMA1, 及びTAK1のゲノムクローンをそれぞれの配列に基づいたオリゴヌクレオチド及びゲノムDNAの鋳型を用いてPCRにより得た。
マウスPKCβII のATP結合領域に相当するエクソンを含むニワトリゲノムフラグメントをneoまたは hisDカセットに置換することで、ターゲッティングベクターpPKCβII-neo および pPKCβII-hisDを構築した。ニワトリCARMA1 のエクソン2-7のゲノムフラグメントをneo 及び hisD カセットで置換することによって、CARMA1のターゲッティングベクターを設計した。マウスTAK-1のATP結合領域に相当するニワトリゲノムフラグメントをneo 及び hisD カセットで置換することによって、TAK1のターゲッティングベクターを設計した。これらのターゲッティングベクターをDT40細胞にトランスフェクトし、PKCβII欠損 DT40 細胞、CARMA1欠損 DT40 細胞、TAK1欠損 DT40 細胞を得た。各欠損型DT40細胞の細胞表面のBCRの発現をAllophycocyanin (Dojindo社)結合抗ニワトリIgM 抗体 (Bethyl社)及びFACSCalibur^TM (Becton Dickinson社)を用いて確認した。 Based on the reported mouse PKCβII, CARMA1, and TAK1 sequences, chicken homologues were searched using the expressed sequence tag (EST) database, and each chicken cDNA was analyzed by RT-PCR using RNA from DT40 cells. Got. Genomic clones of PKCβII, CARMA1, and TAK1 were obtained by PCR using oligonucleotides and genomic DNA templates based on the respective sequences.
The targeting vectors pPKCβII-neo and pPKCβII-hisD were constructed by replacing chicken genomic fragments containing exons corresponding to the ATP-binding region of mouse PKCβII with neo or hisD cassette. A CARMA1 targeting vector was designed by replacing the genomic fragment of chicken CARMA1 exon 2-7 with the neo and hisD cassettes. A targeting vector for TAK1 was designed by replacing the chicken genomic fragment corresponding to the ATP binding region of mouse TAK-1 with the neo and hisD cassettes. DT40 cells were transfected with these targeting vectors to obtain PKCβII-deficient DT40 cells, CARMA1-deficient DT40 cells, and TAK1-deficient DT40 cells. Expression of BCR on the cell surface of each deficient DT40 cell was confirmed using Allophycocyanin (Dojindo) -conjugated anti-chicken IgM antibody (Bethyl) and FACSCalibur ^™ (Becton Dickinson).

Flag結合マウス野生型TAK1及びその変異型cDNAをPCRによって調製した。K63W点突然変異（63位のリジンをトリプトファンに置換する変異）を有するキナーゼ不活化TAK1, 内部配列（アミノ酸401−530）を欠損したdA TAK1、および C末端配列（アミノ酸531−579）を欠損したdB TAK1 を作製した。各cDNAをIRES-GFP（J. Exp. Med. 201:333-339, 2005）とともにpApuroベクターにクローン化した。これらのコンストラクトを各欠損型DT40細胞にエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。 Flag-conjugated mouse wild type TAK1 and its mutant cDNA were prepared by PCR. Kinase-inactivated TAK1, which has a K63W point mutation (mutation replacing lysine at position 63 with tryptophan), dA TAK1 lacking the internal sequence (amino acids 401-530), and C-terminal sequence (amino acids 531-579) dB TAK1 was fabricated. Each cDNA was cloned into the pApuro vector along with IRES-GFP (J. Exp. Med. 201: 333-339, 2005). These constructs were transfected into each defective DT40 cell by electroporation.

免疫沈降は、細胞をプロテアーゼ阻害剤及びフォスファターゼ阻害剤を含むNP-40溶解バッファーを用いて溶解し、細胞溶解物を各抗体及びプロテインG-セファロース(Amersham Biosciences社)とともにインキュベートすることにより行った。
ウエスタンブロッティングは以下のようにして行った。すなわち、免疫沈降物または細胞溶解物をSDS-PAGEに供し、polyvinyldifluoride (PVDF) 膜 (Bio-Rad Laboratories社)に移し、ワサビペルオキシダーゼ標識抗体(Amersham Biosciences社)又はアルカリフォスファターゼ標識抗体(Santa Cruz Biotechnology社)と反応させた後、ブロット膜を洗浄し、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (PIERCE社) または BCIP/NBT Color Development system (Promega社)を用いて検出した。 Immunoprecipitation was performed by lysing the cells using NP-40 lysis buffer containing a protease inhibitor and a phosphatase inhibitor, and incubating the cell lysate with each antibody and protein G-Sepharose (Amersham Biosciences).
Western blotting was performed as follows. That is, the immunoprecipitate or cell lysate was subjected to SDS-PAGE, transferred to a polyvinyldifluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad Laboratories), and horseradish peroxidase labeled antibody (Amersham Biosciences) or alkaline phosphatase labeled antibody (Santa Cruz Biotechnology) ), The blot membrane was washed and detected using SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (PIERCE) or BCIP / NBT Color Development system (Promega).

NF-κBのDNA結合活性は電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって解析した。すなわち、M4 (10 mg/ml)で処理したDT40 細胞 (2 x 10⁶個) の核抽出物を調製し、NF-κB のDNA結合領域特異的プローブ(5'-CAACGGCAGGGGAATTCCCCTCTCCTT-3'：配列番号６)とインキュベートし、電気泳動し、オートラジオグラフィーにより検出した。 The DNA binding activity of NF-κB was analyzed by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Specifically, a nuclear extract of DT40 cells (2 x 10 ⁶ cells) treated with M4 (10 mg / ml) was prepared, and a DNA binding region specific probe of NF-κB (5'-CAACGGCAGGGGAATTCCCCTCTCCTT-3 ': SEQ ID NO: Incubated with 6), electrophoresed and detected by autoradiography.

IKK及びTAK1のキナーゼアッセイは以下のようにして行った。M4 (10 mg/ml)で刺激したDT40 細胞 (2 × 10⁷個) を1% NP-40 溶解バッファーで溶解した。細胞溶解物を1 μg の抗IKKγモノクローナル抗体または1 μg の抗Flag モノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、40 μl のプロテインG-セファロースでインキュベートした。ビーズを溶解バッファーで3回、キナーゼバッファー(25 mM Tris, pH 7.5, 5 mM β-Glycerolphosphate, 2 mM DTT, 0.1 mM Na₃VO₄, 10 mM MgCl₂)で2回洗浄した。次いで、免疫沈降物を100 mM ATPを含むキナーゼバッファーで再懸濁し、GST-IκBα(マウスIκBαのN末端の1-72アミノ酸をGSTと結合させたもの) またはGST-IKKβ(ヒトIKKβの活性ループのアミノ酸 DLGYAKELDQGSLCTSFVGTLQYLAPELLEQQ （配列番号７）もしくはその変異体DLGYAKELDQGALCTAFVGTLQYLAP
ELLEQQ（配列番号８）をGSTに結合させたもの) をそれぞれ0.2 μg ずつ、IKK または TAK1の基質として添加した。30° C で30分インキュベートした後、SDSバッファーを加えて5分ボイルして反応を終結させた。サンプルをSDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、抗リン酸化IκBαモノクローナル抗体、または抗リン酸化IKKα/β抗体を用いて検出した。
JNKキナーゼアッセイは、JNKキナーゼアッセイキット(Cell Signaling社)を用い、製品のマニュアルにしたがって行った。 IKK and TAK1 kinase assays were performed as follows. DT40 cells (2 × 10 ⁷ cells) stimulated with M4 (10 mg / ml) were lysed with 1% NP-40 lysis buffer. Cell lysates were immunoprecipitated with 1 μg anti-IKKγ monoclonal antibody or 1 μg anti-Flag monoclonal antibody and incubated with 40 μl protein G-Sepharose. The beads were washed 3 times with lysis buffer and twice with kinase buffer (25 mM Tris, pH 7.5, 5 mM β-Glycerolphosphate, 2 mM DTT, 0.1 mM Na ₃ VO ₄ , 10 mM MgCl ₂ ). The immunoprecipitate was then resuspended in a kinase buffer containing 100 mM ATP, and GST-IκBα (mouse IκBα N-terminal 1-72 amino acids combined with GST) or GST-IKKβ (active loop of human IKKβ) Amino acid DLGYAKELDQG SLCTS FVGTLQYLAPELLEQQ (SEQ ID NO: 7) or its mutant DLGYAKELDQG ALCTA FVGTLQYLAP
0.2 μg of ELLEQQ (SEQ ID NO: 8) bound to GST) was added as a substrate for IKK or TAK1. After incubating at 30 ° C. for 30 minutes, SDS buffer was added and boiled for 5 minutes to terminate the reaction. Samples were separated by SDS-PAGE, transferred to PVDF membrane, and detected using anti-phosphorylated IκBα monoclonal antibody or anti-phosphorylated IKKα / β antibody.
The JNK kinase assay was performed using a JNK kinase assay kit (Cell Signaling) according to the product manual.

＜実験結果＞
野生型DT40細胞 (wt)、PKCβ欠損DT40細胞(PKCβ^-/-) 及びCARMA1欠損DT40細胞(CARMA1^-/-)におけるBCRを介したIKKの活性化を調べた（図1）。図1の上段（2段）では１レーンあたり10⁷ 個の細胞を IKK キナーゼアッセイに供した。IKKの活性化はGST-IκBαのリン酸化を指標にし、抗リン酸化IκBαモノクローナル抗体を用いて検出した。図１中段（2段）では、IκBαの分解を抗IκBα抗体を用いたウエスタンブロッティングによって測定した。図１下段（１段）では、NF-κB活性を電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）によって調べた。
その結果、PKCβ欠損細胞およびCARMA1欠損細胞ではいずれも、BCR刺激を加えてもIKKの活性化、IκBαの分解およびNF-κB 活性化はおこらなかった。なお、このNF-κB 活性化の欠失はBCRの発現低下によるものではなかった。これらの結果から、BCR刺激によるIKKの活性化にはPKCβ及び CARMA1が重要であることがわかった。 <Experimental result>
Wild-type DT40 cells (wt), PKC beta-deficient DT40 cells (PKC beta ^{- / -)} and CARMA1 deficient DT40 cells (CARMA1 ^{- / -)} in was examined activation of IKK via BCR (Figure 1). In the upper part (second stage) of FIG. 1, 10 ⁷ cells per lane were subjected to the IKK kinase assay. The activation of IKK was detected using phosphorylation of GST-IκBα as an index and using an anti-phosphorylated IκBα monoclonal antibody. In the middle (second) of FIG. 1, the degradation of IκBα was measured by Western blotting using an anti-IκBα antibody. In the lower part of FIG. 1 (first stage), NF-κB activity was examined by electrophoresis mobility shift assay (EMSA).
As a result, in both PKCβ-deficient cells and CARMA1-deficient cells, IKK activation, IκBα degradation and NF-κB activation did not occur even when BCR stimulation was applied. This lack of NF-κB activation was not due to decreased expression of BCR. From these results, it was found that PKCβ and CARMA1 are important for the activation of IKK by BCR stimulation.

IKKの活性化にはIKKαまたは IKKβのリン酸化が重要であることが知られている。したがって、その候補キナーゼとして、TAK1を選択し、BCRシグナルにおける役割を調べた。
まず、BCR刺激によって TAK1 が実際に活性化されるかどうかを調べた。C57BL/6Jマウスの脾臓からB細胞を調製し、抗マウスIgM F(ab)₂(anti-m)を用いて刺激した。約4 x 10⁷ 個の細胞からの細胞質抽出物を抗TAK1抗体を用いて免疫沈降し、沈降物をインビトロキナーゼアッセイに供した。TAK1活性として、TAK1の自己リン酸化を抗リン酸化セリン／スレオニン抗体を用いて検出した。その結果、BCR刺激後3分以内にTAK1が活性化されることがわかった (図 2 A) It is known that phosphorylation of IKKα or IKKβ is important for IKK activation. Therefore, TAK1 was selected as the candidate kinase, and its role in BCR signal was examined.
First, it was investigated whether TAK1 was actually activated by BCR stimulation. B cells were prepared from the spleen of C57BL / 6J mice and stimulated with anti-mouse IgM F (ab) ₂ (anti-m). Cytoplasmic extracts from approximately 4 × 10 ⁷ cells were immunoprecipitated using anti-TAK1 antibody and the precipitate was subjected to in vitro kinase assay. As TAK1 activity, autophosphorylation of TAK1 was detected using an anti-phosphorylated serine / threonine antibody. As a result, it was found that TAK1 was activated within 3 minutes after BCR stimulation (Figure 2A).

次に、DT40細胞においてBCR 刺激後のFlag結合TAK１のセリン／スレオニンのリン酸化状態をモニターした。TAK1欠損 DT40細胞にFlag結合野生型TAK1 (TAK1 wt) 又はFlag結合キナーゼ不活性化TAK1 (TAK1 K63W) をトランスフェクトした。細胞溶解物(2 x 10⁷ 個/ レーン) を抗Flagモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、沈降物を抗セリン／スレオニン抗体を用いたウエスタンブロッティングによって解析した。
このFlag結合TAK１はBCR 刺激後3分以内にリン酸化を受けたが、キナーゼ欠損変異体はほとんどリン酸化されなかった (図 2 D上段)。これらのことから、TAK1 はBCR 刺激によって活性化されることがわかった。 Next, the serine / threonine phosphorylation state of Flag-bound TAK1 after BCR stimulation was monitored in DT40 cells. TAK1-deficient DT40 cells were transfected with Flag-binding wild type TAK1 (TAK1 wt) or Flag-binding kinase inactivated TAK1 (TAK1 K63W). Cell lysates (2 × 10 ⁷ cells / lane) were immunoprecipitated using an anti-Flag monoclonal antibody, and the precipitate was analyzed by Western blotting using an anti-serine / threonine antibody.
This Flag-bound TAK1 was phosphorylated within 3 minutes after BCR stimulation, but the kinase-deficient mutant was hardly phosphorylated (FIG. 2D, upper panel). These results indicate that TAK1 is activated by BCR stimulation.

次に、TAK1欠損DT40 細胞 (TAK^-/-) 、DT40 野生型細胞(wt)における、IKK 活性、IκBαの分解及びNF-κB の活性化を図１と同様にして調べた。図2 Bに示すように、BCR刺激によるNF-κBの活性化はTAK1欠損DT40 細胞では消失した。
次に、TAK1 のERK 及びJNKに対する効果を調べた。ERKの活性化は全細胞溶解物(1 x 10⁶ 細胞/ レーン) について、抗リン酸化p44/p42 MAPK ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行うことによって解析した。JNKの活性化は、2 x 10⁷ 個の細胞を用いてインビトロキナーゼアッセイを行うことにより解析した。その結果、ERKキナーゼはTAK1欠損細胞においてBCR刺激によって通常に活性化された。一方、JNKの活性化は完全に消失した(図2 C)。また、TAK1欠損細胞に野生型TAK1を導入するとBCR刺激によるIKK 及び JNK の活性化は回復したが、キナーゼ欠損変異体を導入しても回復しなかった (図2
D)。これらのことから、TAK1 キナーゼ活性が DT40 細胞におけるBCR刺激によるIKK 及び JNKの活性化に必要であることがわかった。 Next, IKK activity, IκBα degradation and NF-κB activation in TAK1-deficient DT40 cells (TAK ^{− / −} ) and DT40 wild type cells (wt) were examined in the same manner as in FIG. As shown in FIG. 2B, the activation of NF-κB by BCR stimulation disappeared in TAK1-deficient DT40 cells.
Next, the effect of TAK1 on ERK and JNK was examined. Activation of ERK was analyzed by western blotting using whole-cell lysate (1 × 10 ⁶ cells / lane) using anti-phosphorylated p44 / p42 MAPK polyclonal antibody. JNK activation was analyzed by performing an in vitro kinase assay using 2 × 10 ⁷ cells. As a result, ERK kinase was normally activated by BCR stimulation in TAK1-deficient cells. On the other hand, JNK activation completely disappeared (FIG. 2C). In addition, when wild-type TAK1 was introduced into TAK1-deficient cells, the activation of IKK and JNK by BCR stimulation was restored, but it was not restored even when a kinase-deficient mutant was introduced (Fig. 2).
D). From these results, it was found that TAK1 kinase activity is necessary for the activation of IKK and JNK by BCR stimulation in DT40 cells.

上記のようにTAK1欠損DT40 細胞は、PKCβ欠損細胞及びCARM1欠損細胞と同様にBCRを介したIKK活性化の欠損を示した。これは、TAK1とPKCβ/CARMA1の間に何らかの関係があることが考えられた。そこで、まず、PKCβ及びCARMA1に対するTAK1欠損の影響を調べた。
野生型 (wt) 又は TAK１欠損DT40 細胞において、抗リン酸化PKCβ抗体(T500; ヒト PKCβスレオニン500に相当)を用いてPKCβ自身のリン酸化状態を調べることによって、PKCβ活性を測定した。その結果、TAK1欠損 DT40 細胞ではPKCβ活性は野生型DT40細胞と比べては変化しなかった (図3 A)。したがって, BCR刺激によるIKKの活性化経路では、PKCβはTAK1の上流に位置することが考えられた。 As described above, TAK1-deficient DT40 cells showed a defect in IKK activation via BCR, similar to PKCβ-deficient cells and CARM1-deficient cells. This was considered to have some relationship between TAK1 and PKCβ / CARMA1. Therefore, first, the influence of TAK1 deficiency on PKCβ and CARMA1 was examined.
PKCβ activity was measured in wild-type (wt) or TAK1-deficient DT40 cells by examining the phosphorylation state of PKCβ itself using an anti-phosphorylated PKCβ antibody (T500; equivalent to human PKCβ threonine 500). As a result, PKCβ activity was not changed in TAK1-deficient DT40 cells compared to wild-type DT40 cells (FIG. 3A). Therefore, it was considered that PKCβ is located upstream of TAK1 in the activation pathway of IKK by BCR stimulation.

次に、野生型 (wt) 又は TAK1欠損DT40 細胞における CARMA1 のリン酸化を、4 x 10⁷ 個の細胞からの細胞質抽出物を抗CARMA1 抗体を用いて免疫沈降し、抗リン酸化セリン／スレオニン抗体(P-ST)を用いてウエスタンブロッティングを行うことにより解析した。その結果、野生型DT40 細胞ではBCR刺激によってCARMA1 がリン酸化されることがわかった。このCARMA1のリン酸化はTAK1欠損細胞においても見られた。しかし、その程度は刺激後3分で野生型細胞と比較して約20 % まで減少し、このリン酸化は10分間は続かなかった(図3 B)。これらのことから TAK1 はCARMA1のリン酸化を開始するというよりはむしろ維持するために働いていることが考えられた。 Next, phosphorylation of CARMA1 in wild type (wt) or TAK1-deficient DT40 cells, and cytoplasmic extracts from 4 x 10 ⁷ cells were immunoprecipitated using anti-CARMA1 antibody, and anti-phosphorylated serine / threonine antibody Analysis was performed by Western blotting using (P-ST). As a result, it was found that CARMA1 was phosphorylated by BCR stimulation in wild-type DT40 cells. This phosphorylation of CARMA1 was also observed in TAK1-deficient cells. However, the extent decreased to about 20% at 3 minutes after stimulation compared to wild-type cells, and this phosphorylation did not last for 10 minutes (FIG. 3B). These results suggest that TAK1 works to maintain rather than initiate CARMA1 phosphorylation.

また、TAK^-/-, PKCβ^-/-細胞又はTAK^-/-, CARMA1^-/- DT40 細胞にFlag融合野生型TAK1
(TAK1 wt) をトランスフェクトし、TAK1の活性化状態を上記（図2 D）と同様にして測定した。その結果、PKCβまたは CARMA1の欠損時には, 抗リン酸化セリン／スレオニン抗体によるブロッティングで調べたTAK1の活性化は野生型DT40 細胞と比較して大幅に減少していた (図3 C)。以上のことから、PKCβおよびCARMA1を介した反応がBCR刺激におけるTAK1活性の亢進に重要であることが示唆された。 ^{^{Further, TAK - / -, PKCβ -}} / - cells or ^{^{TAK - / -, CARMA1 - /}} - DT40 cells Flag fusion wild-type TAK1
(TAK1 wt) was transfected, and the activation state of TAK1 was measured in the same manner as described above (FIG. 2D). As a result, when PKCβ or CARMA1 was deficient, activation of TAK1 examined by blotting with an anti-phosphorylated serine / threonine antibody was significantly reduced compared to wild-type DT40 cells (FIG. 3C). From the above, it was suggested that the reaction via PKCβ and CARMA1 is important for the enhancement of TAK1 activity in BCR stimulation.

TAK1 からIKKの活性化につながる経路をさらに解明するために、TAK1 がDT40 細胞においてCARMA1と相互作用するかについて調べた。これらの相互作用は、Flag融合野生型TAK1を発現させたTAK1欠損DT40細胞の細胞溶解物を抗Flagモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、抗CARMA1抗体を用いてウエスタンブロッティングを行うことにより解析した。また、C57BL/6Jマウスの脾臓からB 細胞を調製し、抗マウスIgM F(ab)₂(anti-m)を用いて刺激し、4 x 10⁷ 個の細胞からの細胞質抽出物を抗CARMA1抗体を用いて免疫沈降し、沈降物について抗TAK1抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。
その結果、TAK1 と CARMA1 の相互作用は刺激3分後DT40 細胞で観察された (図4 A)。この誘導的な相互作用はBCR刺激初代培養B細胞でも見られた(図4 B)。 To further elucidate the pathway leading from TAK1 to IKK activation, we investigated whether TAK1 interacts with CARMA1 in DT40 cells. These interactions were analyzed by immunoprecipitation of cell lysates of TAK1-deficient DT40 cells expressing Flag-fused wild type TAK1 using an anti-Flag monoclonal antibody and Western blotting using an anti-CARMA1 antibody. In addition, B cells were prepared from the spleen of C57BL / 6J mice, stimulated with anti-mouse IgM F (ab) ₂ (anti-m), and cytoplasmic extract from 4 x 10 ⁷ cells was anti-CARMA1 antibody The precipitate was subjected to Western blotting using an anti-TAK1 antibody.
As a result, the interaction between TAK1 and CARMA1 was observed in DT40 cells 3 minutes after stimulation (FIG. 4A). This inductive interaction was also observed in BCR-stimulated primary cultured B cells (Fig. 4B).

この相互作用の重要性について調べるために、TAK1 変異体を作製し（図５A）、その機能を調べた。各種TAK1変異体をTAK1欠損DT40細胞にトランスフェクトした。細胞溶解物(サンプルあたり2 x 10⁷ 細胞) を抗Flag モノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、抗CARMA1抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った（図５B）。また、IκBαの分解を図1と同様にして検出した（図５C）。さらに、図５Aに示す各コンストラクトをTAB1とともに293T細胞に一過的にトランスフェクトし、各変異体TAK1の活性を調べた（図５D）。細胞を溶解し、抗Flagモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、得られた免疫複合体をGST-IKKβを基質に用いてキナーゼアッセイに供した。図５Dのレーン１（＊）では, 177位及び181位のセリンがアラニンに置換されたIKKβのGST融合タンパク質をネガティブコントロールの基質として用いた。
その結果、dB変異体とは異なり, dA変異体はBCR刺激によってCARMA1 と相互作用せず、IKKを活性化しなかった(図5B, C)。免疫沈降されたdA変異体が293T 細胞で過剰発現させたときに野生型と同様のキナーゼ活性を示したことから、これはキナーゼ活性の消失によるものではなく相互作用の欠如によるものであると考えられた(図5 D)。以上より、BCR
刺激後, TAK1 はCARMA1 に結合し, IKK の活性化をもたらすことがわかった。 In order to investigate the importance of this interaction, a TAK1 mutant was prepared (FIG. 5A) and its function was examined. Various TAK1 mutants were transfected into TAK1-deficient DT40 cells. Cell lysates (2 × 10 ⁷ cells per sample) were immunoprecipitated using anti-Flag monoclonal antibody and Western blotted using anti-CARMA1 antibody (FIG. 5B). Further, IκBα degradation was detected in the same manner as in FIG. 1 (FIG. 5C). Furthermore, each construct shown in FIG. 5A was transiently transfected into 293T cells together with TAB1, and the activity of each mutant TAK1 was examined (FIG. 5D). Cells were lysed and immunoprecipitated using an anti-Flag monoclonal antibody, and the resulting immune complex was subjected to a kinase assay using GST-IKKβ as a substrate. In Lane 1 (*) of FIG. 5D, a GST fusion protein of IKKβ in which serines at positions 177 and 181 were substituted with alanine was used as a substrate for negative control.
As a result, unlike the dB mutant, the dA mutant did not interact with CARMA1 by BCR stimulation and did not activate IKK (FIG. 5B, C). The immunoprecipitated dA mutant showed the same kinase activity when overexpressed in 293T cells, suggesting that this was due to lack of interaction rather than loss of kinase activity. (FIG. 5D). From the above, BCR
After stimulation, TAK1 was found to bind to CARMA1 and lead to IKK activation.

TAK1 とCARMA1の相互作用についてさらに詳しく調べた。
まず、野生型 (wt) 又はPKCβ欠損DT40細胞における CARMA1 のリン酸化を免疫沈降及びウエスタンブロットを行うことによって測定した。その結果、PKCβ欠損細胞では CARMA1 のリン酸化はBCR刺激によって誘導されなかった(図6 A)。
TAK1 とCARMA1の相互作用は、Flag融合野生型TAK1を発現させた、TAK1欠損DT40細胞又はTAK1欠損PKCβ欠損DT40細胞の細胞溶解物を抗Flagモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、抗CARMA1抗体を用いてウエスタンブロッティングすることによって解析した。その結果、PKCβ欠損DT40 細胞ではTAK1とCARMA1の相互作用も大きく減少した。図６Aと図６Bを比較すると、BCR刺激3分後の CARMA1 のリン酸化状態がTAK1とCARMA1の相互作用の状態とよく相関することがわかった。
さらに、PKCβ欠損細胞におけるCARMA1とBcl10 又はMALT1の相互作用を、４ x 10⁷ 個の細胞からの細胞質抽出物について抗CARMA1抗体を用いて免疫沈降し、抗Bcl10抗体又は抗MALT1抗体を用いてウエスタンブロッティングを行うことにより解析した（図６C）。その結果、CARMA1 が Bcl10 およびMALT1 とも相互作用することが明らかとなり、その相互作用の程度はCARMA1のリン酸化状態と相関した。これらの結果から、CARMA1はリン酸化され、それによってTAK1やBcl10、MALTと相互作用することが考えられた。 The interaction between TAK1 and CARMA1 was investigated in more detail.
First, phosphorylation of CARMA1 in wild type (wt) or PKCβ-deficient DT40 cells was measured by immunoprecipitation and Western blotting. As a result, phosphorylation of CARMA1 was not induced by BCR stimulation in PKCβ-deficient cells (FIG. 6A).
The interaction between TAK1 and CARMA1 was carried out by immunoprecipitation of cell lysates of TAK1-deficient DT40 cells or TAK1-deficient PKCβ-deficient DT40 cells expressing Flag-fused wild-type TAK1, using anti-Flag monoclonal antibodies, and using anti-CARMA1 antibodies. And analyzed by Western blotting. As a result, the interaction between TAK1 and CARMA1 was greatly reduced in PKCβ-deficient DT40 cells. Comparing FIG. 6A and FIG. 6B, it was found that the phosphorylation state of CARMA1 3 minutes after BCR stimulation correlated well with the interaction state of TAK1 and CARMA1.
Furthermore, the interaction between CARMA1 and Bcl10 or MALT1 in PKCβ-deficient cells was immunoprecipitated with anti-CARMA1 antibody on cytoplasmic extracts from 4 × 10 ⁷ cells, and Western with anti-Bcl10 antibody or anti-MALT1 antibody. Analysis was performed by blotting (FIG. 6C). As a result, it was clarified that CARMA1 interacts with Bcl10 and MALT1, and the degree of the interaction correlated with the phosphorylation state of CARMA1. These results suggest that CARMA1 is phosphorylated, thereby interacting with TAK1, Bcl10, and MALT.

以上の結果から、リン酸化されたCARMA1と相互作用することにより、TAK1はその基質であるIKKに近づきやすくなり、これによってIKKのリン酸化が促進されるという可能性が考えられた。そこで、IKK がBCR 刺激後にCARMA1 と相互作用するか、およびその相互作用はPKCβ依存的かについて調べた。
まず、野生型DT40細胞及びPKCβ欠損細胞の溶解物(ぞれぞれ2 x 10⁷個)について抗IKKγモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、抗CARMA1抗体を用いたウエスタンブロッティングによって解析した（図７A）。その結果、CARMA1とIKKγの相互作用は野生型細胞でのみ見られ、PKCβ依存的であることがわかった。
Flag融合野生型TAK1導入細胞またはFlag融合キナーゼ活性欠損型TAK1導入細胞からの細胞溶解物を抗Flag モノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、GST-IKKβを基質に用いてインビトロキナーゼアッセイを行った（図７B）。その結果、野生型TAK1のみ、刺激後に、GST-IKKβをリン酸化した。レーン 4 (＊)では, 177位及び181位のセリンがアラニンに置換されたIKKβのGST融合タンパク質をネガティブコントロールの基質として用いた。これらのサイトがTAK1によってリン酸化されていることが明らかとなった。以上の結果から、TAK1がIKKキナーゼのひとつであることが示唆された。 From the above results, it was considered that by interacting with phosphorylated CARMA1, TAK1 can easily approach IKK, which is its substrate, and this promotes phosphorylation of IKK. Therefore, we investigated whether IKK interacts with CARMA1 after BCR stimulation and whether the interaction is PKCβ-dependent.
First, lysates of wild type DT40 cells and PKCβ-deficient cells (each 2 × 10 ⁷ cells) were immunoprecipitated using an anti-IKKγ monoclonal antibody and analyzed by Western blotting using an anti-CARMA1 antibody (FIG. 7A). ). As a result, it was found that the interaction between CARMA1 and IKKγ was found only in wild-type cells and was PKCβ-dependent.
Cell lysates from Flag-fused wild type TAK1-introduced cells or Flag fusion kinase activity-deficient TAK1-introduced cells were immunoprecipitated using anti-Flag monoclonal antibody, and in vitro kinase assay was performed using GST-IKKβ as a substrate (Fig. 7B). As a result, only wild type TAK1 phosphorylated GST-IKKβ after stimulation. In Lane 4 (*), a GST fusion protein of IKKβ in which serine at positions 177 and 181 was substituted with alanine was used as a substrate for negative control. It became clear that these sites were phosphorylated by TAK1. These results suggested that TAK1 is one of the IKK kinases.

以上の結果から、BCR刺激によるNF-κBの活性化には以下のようなモデルが考えられた（図８）。
まず、BCR刺激によりSyk及びBtkなどのタンパク質チロシンキナーゼが活性化される。Btk はホスホリパーゼC-γ2 (PLC-γ2)のいくつかのtyrosine 残基をリン酸化し、それによりプロテインキナーゼ Cβ(PKCβ)が活性化される。活性化されたPKCβはCARMA１をリン酸化する。それによってTAK1がリン酸化されたCARMA1 に結合する。一方、IKK複合体はおそらく Bcl10/ MALT1 複合体を介してリン酸化CARMA1に結合する。これらの相互作用はTAK1 にIKKを引き寄せ、IKK複合体のリン酸化、NF-κBの活性化をもたらす。
なお、本実施例ではB細胞におけるNF-κBの活性化経路について示したが、T細胞においてもCARMA1及びTAK1の存在が知られており、同様のメカニズムでNF-κBが活性化されると考えられる。したがって、本発明のスクリーニング方法はT細胞を用いても行うことができる。 From the above results, the following model was considered for the activation of NF-κB by BCR stimulation (FIG. 8).
First, protein tyrosine kinases such as Syk and Btk are activated by BCR stimulation. Btk phosphorylates several tyrosine residues of phospholipase C-γ2 (PLC-γ2), thereby activating protein kinase Cβ (PKCβ). Activated PKCβ phosphorylates CARMA1. As a result, TAK1 binds to phosphorylated CARMA1. On the other hand, the IKK complex binds to phosphorylated CARMA1 probably through the Bcl10 / MALT1 complex. These interactions attract IKK to TAK1, leading to phosphorylation of the IKK complex and activation of NF-κB.
In this example, the activation pathway of NF-κB in B cells was shown, but the presence of CARMA1 and TAK1 is also known in T cells, and it is considered that NF-κB is activated by the same mechanism. It is done. Therefore, the screening method of the present invention can also be performed using T cells.

各細胞におけるB細胞抗原受容体（BCR）を介したIKKの活性化を示す図（写真）。野生型DT40細胞 (wt), PKCβ欠損DT40細胞(PKCβ^-/-) 及びCARMA1欠損DT40細胞(CARMA1^-/-)におけるBCRを介したIKKの活性化を、IKKキナーゼアッセイ（上段）、ウエスタンブロッティングによるIκBα分解の測定（中段）、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）によるNF-κB 活性の測定によって調べた（下段）。下図では、NF-κB 複合体の位置を矢印で示した。The figure (photograph) which shows activation of IKK via B cell antigen receptor (BCR) in each cell. Wild-type DT40 cells (wt), PKC beta-deficient DT40 cells (PKC beta ^{- / -)} and CARMA1 deficient DT40 cells (CARMA1 ^{- / -)} activation of IKK via BCR in, IKK kinase assay (top), by Western blotting The measurement was performed by measuring IκBα degradation (middle panel) and NF-κB activity by electrophoresis mobility shift assay (EMSA) (lower panel). In the figure below, the position of the NF-κB complex is indicated by an arrow. BCR刺激によるIKKの活性化に対するTAK1の影響を示す図（写真）。(A)はBCR刺激後のTAK1の自己リン酸化を抗リン酸化セリン／スレオニン抗体を用いて検出した図である。(B)はTAK1欠損DT40 細胞 (TAK^-/-) 、DT40 野生型細胞(wt)における、IKK 活性、IκBαの分解, 及びNF-κBの活性化を示す図である。(C)はERKおよびJNKの活性化をウエスタンブロッティングによって解析した図である。(D)はTAK1欠損 DT40細胞に野生型TAK1 (TAK1 wt) 又はキナーゼ不活性型TAK1 (TAK1 K63W) を導入したときのTAK1の自己リン酸化、IKK 活性、IκBα分解およびJNK活性化を示す図である。The figure which shows the influence of TAK1 with respect to the activation of IKK by BCR stimulation (photograph). (A) is a diagram in which autophosphorylation of TAK1 after BCR stimulation was detected using an anti-phosphorylated serine / threonine antibody. (B) shows IKK activity, IκBα degradation, and NF-κB activation in TAK1-deficient DT40 cells (TAK ^{− / −} ) and DT40 wild type cells (wt). (C) shows the analysis of ERK and JNK activation by Western blotting. (D) shows TAK1 autophosphorylation, IKK activity, IκBα degradation and JNK activation when wild-type TAK1 (TAK1 wt) or kinase inactive TAK1 (TAK1 K63W) is introduced into TAK1-deficient DT40 cells. is there. TAK1とPKCβとCARMA1の関係を示す図（写真）。(A)は野生型 (wt) 又は TAK１欠損DT40 細胞におけるPKCβ活性の測定結果を示す図。(B)は野生型 (wt) 又は TAK１欠損DT40 細胞における CARMA1 のリン酸化を示す図。(C)は各欠損DT40細胞にTAK1を導入したときのTAK1活性を示す図。The figure (photograph) which shows the relationship between TAK1, PKCβ, and CARMA1. (A) is a figure which shows the measurement result of PKC (beta) activity in a wild type (wt) or TAK1-deficient DT40 cell. (B) shows the phosphorylation of CARMA1 in wild type (wt) or TAK1-deficient DT40 cells. (C) is a diagram showing TAK1 activity when TAK1 is introduced into each defective DT40 cell. TAK1とCARMA1の相互作用を示す図（写真）。(A)は抗Flagモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、抗CARMA1抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す。(B)は抗CARMA1抗体を用いて免疫沈降し、抗TAK1抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す。Diagram showing the interaction between TAK1 and CARMA1 (photo). (A) shows the results of immunoprecipitation using an anti-Flag monoclonal antibody and Western blotting using an anti-CARMA1 antibody. (B) shows the results of immunoprecipitation using an anti-CARMA1 antibody and Western blotting using an anti-TAK1 antibody. TAK1 とCARMA1 の相互作用のNF-κB 活性化に対する影響を示す図（写真）。(A)は各TAK1 変異体コンストラクトの模式図である。(B)は各変異体TAK1とCARMA1の相互作用を示す。(C)は各変異体TAK1を導入した細胞におけるIκBαの分解を示す。(D)は各変異体TAK1によるIKKβのリン酸化を示す。Diagram showing the effect of TAK1 and CARMA1 interaction on NF-κB activation (photo). (A) is a schematic diagram of each TAK1 mutant construct. (B) shows the interaction between each mutant TAK1 and CARMA1. (C) shows degradation of IκBα in cells into which each mutant TAK1 was introduced. (D) shows phosphorylation of IKKβ by each mutant TAK1. TAK1 とCARMA1の相互作用に対するPKCβの影響を示す図（写真）。(A)は野生型 (wt) 又はPKCβ欠損DT40細胞におけるCARMA1 のリン酸化を示す。(B)は野生型 (wt) 又はPKCβ欠損DT40細胞におけるTAK1 とCARMA1の相互作用を示す。(C)は野生型 (wt) 又はPKCβ欠損DT40細胞におけるCARMA1とBcl10 又は MALT1 の相互作用を示す。The figure which shows the influence of PKC (beta) with respect to interaction of TAK1 and CARMA1 (photograph). (A) shows phosphorylation of CARMA1 in wild type (wt) or PKCβ-deficient DT40 cells. (B) shows the interaction between TAK1 and CARMA1 in wild type (wt) or PKCβ-deficient DT40 cells. (C) shows the interaction between CARMA1 and Bcl10 or MALT1 in wild type (wt) or PKCβ-deficient DT40 cells. TAK1 によるIKKのリン酸化を示す図（写真）。(A)は野生型 (wt) 又はPKCβ欠損DT40細胞におけるIKKとCARMA1の相互作用を示す。(B)は野生型TAK1またはキナーゼ活性欠損型TAK1導入細胞におけるIKKβのリン酸化を示す。Figure (Photo) showing phosphorylation of IKK by TAK1. (A) shows the interaction between IKK and CARMA1 in wild type (wt) or PKCβ-deficient DT40 cells. (B) shows phosphorylation of IKKβ in wild-type TAK1 or kinase activity-deficient TAK1-introduced cells. B細胞抗原受容体刺激によるNF-κBの活性化のモデル図。Model diagram of activation of NF-κB by B cell antigen receptor stimulation.

Claims

CARMA1及びTAK1を発現する免疫細胞に化合物を添加し、さらに免疫細胞活性化刺激を加えた後、CARMA1のリン酸化、またはCARMA1とTAK1の相互作用を測定することを特徴とする、医薬のスクリーニング方法。 A method for screening a drug, comprising adding a compound to immune cells expressing CARMA1 and TAK1, and further stimulating immune cell activation, and then measuring phosphorylation of CARMA1 or the interaction between CARMA1 and TAK1 .

免疫細胞がB細胞である、請求項１に記載の医薬のスクリーニング方法。 The method for screening a pharmaceutical according to claim 1, wherein the immune cell is a B cell.

B細胞がDT40細胞である、請求項２に記載の医薬のスクリーニング方法。 The method for screening a pharmaceutical according to claim 2, wherein the B cell is a DT40 cell.

医薬が自己免疫疾患、移植片対宿主病、アレルギー疾患、またはガンに対する医薬である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬のスクリーニング方法。 The method for screening a drug according to any one of claims 1 to 3, wherein the drug is a drug against autoimmune disease, graft-versus-host disease, allergic disease, or cancer.

CARMA1及びTAK1を発現する免疫細胞に化合物を添加し、さらに免疫細胞活性化刺激を加えた後、CARMA1のリン酸化、またはCARMA1とTAK1の相互作用を測定することを特徴とする、化合物のNF-κB活性化阻害能の評価方法。 Compound NF-, characterized in that the compound is added to immune cells expressing CARMA1 and TAK1, and after further stimulation of immune cell activation, phosphorylation of CARMA1 or the interaction between CARMA1 and TAK1 is measured. A method for evaluating the ability to inhibit κB activation.