JP2007075026A - Method for pathological diagnosis using spr imager - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a biosensor designed to simply and accurately assay a protease and to provide a method for assaying the protease using the biosensor. <P>SOLUTION: The biosensor for assaying a digestion pattern with the protease characterized as comprising a substrate composed of a metal surface or a metal film as follows is provided. In the metal surface or metal film, the surface is modified with a protease substrate selected from the group consisting of collagen, gelatin, a proteoglycan, a fibronectin, a laminin, an elastin, a casein, an albumin derivative, an ovalbumin derivative and a transferrin derivative. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、プロテアーゼの測定方法に関するものである。より具体的には、癌細胞の浸潤活性や転移活性などの癌の悪性度、歯周炎などの歯周病の進行度、リウマチ性関節炎などにおける破壊性病態などの正確な診断を可能にするプロテアーゼの測定方法に関するものである。   The present invention relates to a method for measuring protease. More specifically, it enables accurate diagnosis of cancer malignancy such as cancer cell invasive activity and metastatic activity, progression of periodontal disease such as periodontitis, and destructive pathology in rheumatoid arthritis. The present invention relates to a method for measuring protease.

腫瘍の良性、悪性の相違を規定する因子の一つとして、間質結合組織への浸潤の有無を挙げることができる。特に、腫瘍細胞の浸潤や転移にはプロテアーゼが関与することが明らかにされており、プロテアーゼを制御することによって悪性腫瘍細胞の浸潤や転移を抑制できる可能性がある。このようなプロテアーゼ（細胞外マトリックス分解酵素）のうち、特にマトリックス・メタロプロテアーゼ（MMP）が癌細胞の増殖、浸潤、血管新生に重要な役割をはたすことが明らかにされている。   One factor that defines the difference between benign and malignant tumors is the presence or absence of infiltration into the stromal connective tissue. In particular, it has been clarified that proteases are involved in tumor cell invasion and metastasis, and there is a possibility that malignant tumor cell invasion and metastasis can be suppressed by controlling the protease. Among such proteases (extracellular matrix degrading enzymes), it has been clarified that matrix metalloprotease (MMP) plays an important role in cancer cell proliferation, invasion, and angiogenesis.

一方、歯周病では歯肉溝上皮の破壊及びコラーゲンを主体とした結合組織の破壊が初期病変として進行するが、この組織の破壊にもマトリックス・メタロプロテアーゼが関与していることが知られている。さらに、プロテアーゼは、歯槽膿漏による骨組織や歯根膜の破壊、リウマチ性関節炎による骨膜や骨組織の破壊などの破壊性病変に関与している可能性がある。   On the other hand, in periodontal disease, destruction of the gingival crevicular epithelium and destruction of connective tissue mainly composed of collagen progress as initial lesions, and it is known that matrix metalloprotease is also involved in the destruction of this tissue. . Furthermore, proteases may be involved in destructive lesions such as destruction of bone tissue and periodontal ligament due to alveolar pus leakage and destruction of periosteum and bone tissue due to rheumatoid arthritis.

従って、細胞や組織中のプロテアーゼを定量することによって、浸潤活性及び転移活性などからみた癌細胞の悪性度や歯周病の病態、及びリウマチなどの破壊性病変の進行程度を正確に診断することが可能である。   Therefore, by quantifying proteases in cells and tissues, accurately diagnose the malignancy of cancer cells in terms of invasion activity and metastasis activity, the pathological condition of periodontal disease, and the degree of progression of destructive lesions such as rheumatism. Is possible.

従来、プロテアーゼの測定方法としては、基質の分解の程度から酵素活性を測定するザイモグラフィー法や各々のプロテアーゼに特異的な抗体を用いたイムノブロティング法などが利用されている。例えば、癌細胞や歯周病化細胞を粉砕した後、抽出液をゼラチン含有SDS−ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に付し、電気泳動後のゲルをアミドブラックで染色して、染色されずに白く透明なバンドを与える試料をプロテアーゼ陽性と判定する方法が知られている。しかしながら、この方法では測定毎にSDS−ポリアクリルアミドゲルを作成する必要があり、検出までに約30時間を要するという問題がある。 Conventionally, as a method for measuring protease, a zymography method for measuring enzyme activity based on the degree of degradation of a substrate, an immunoblotting method using an antibody specific for each protease, and the like have been used. For example, after crushing cancer cells and periodontal diseased cells, the extract is subjected to electrophoresis using gelatin-containing SDS-polyacrylamide gel, and the gel after electrophoresis is stained with amide black and not stained. A method is known in which a sample that gives a white transparent band is positive for protease. However, in this method, it is necessary to prepare an SDS-polyacrylamide gel for each measurement, and there is a problem that it takes about 30 hours to detect.

また、SDS−PAGEによる電気泳動後にゲルをメンブレンに密着させ、ブロッティング後の酵素をモノクローナル抗体で検出する方法もあるが、電気泳動を利用する点で上記の方法と同様の欠点を有しており、それに加えて、操作に熟練を要することと高価なモノクローナル抗体を用いることも問題である。さらに、これらの方法は個々の細胞のプロテアーゼを測定したものではなく、組織全体のプロテアーゼ総量を検出するものであり、個々の癌細胞の浸潤・転移活性の情報を得ることはできないという問題がある。   In addition, there is a method in which the gel is brought into close contact with the membrane after electrophoresis by SDS-PAGE, and the enzyme after blotting is detected with a monoclonal antibody, but has the same drawbacks as the above method in that electrophoresis is used. In addition, it is also problematic to require skill in operation and to use expensive monoclonal antibodies. Furthermore, these methods do not measure the protease of individual cells, but detect the total amount of protease in the entire tissue, and there is a problem that it is impossible to obtain information on the invasion / metastasis activity of individual cancer cells. .

ＰＥＴ支持体にゼラチン薄層を塗布した薄膜を使用して、組織切片中のマトリックス・メタロプロテアーゼの酵素活性を二次元像として検出する病理診断方法が報告されている（特許文献１）。この方法では、ＰＥＴ支持体にゼラチン薄層を塗布した薄膜に組織切片を貼り付け、３７℃でインキュベーションした後、マトリックス・メタロプロテアーゼのゼラチン分解活性を色素染色後、画像化し、組織の癌細胞の分布に対応する像を検出することが可能である。しかしながら、インキュベーション時間が長く、また検出方法が色素染色した後に顕微鏡観察で目視判定しているため組織中の酵素活性の検出感度にやや難点を有している。   A pathological diagnosis method has been reported in which a thin film obtained by applying a thin gelatin layer to a PET support is used to detect the enzyme activity of matrix metalloprotease in a tissue section as a two-dimensional image (Patent Document 1). In this method, a tissue section is attached to a thin film obtained by coating a thin gelatin layer on a PET support, incubated at 37 ° C., and then the gelatinolytic activity of the matrix metalloprotease is dye-stained and imaged. It is possible to detect an image corresponding to the distribution. However, since the incubation time is long and the detection method is visually determined by microscopic observation after dye staining, the detection sensitivity of the enzyme activity in the tissue is somewhat difficult.

一方、専門の病理医が手術で摘出された組織の悪性腫瘍細胞の有無について検査するために現在でも繁用されている病理診断方法としては、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）やパパニコロウ染色により細胞核や細胞質を染色し、その形態から腫瘍かどうかを判断する方法が挙げられる。しかし、このような判断には知識と経験を有し、病理医と細胞スクリナーの有資格者のみがそれを行うことができ、細胞形態診断では腫瘍かどうかの判断が困難である場合も多い。   On the other hand, as a pathological diagnosis method that is still frequently used to examine the presence or absence of malignant tumor cells in a tissue extracted by a surgical specialist, cell nuclei can be obtained by hematoxylin-eosin staining (HE staining) or Papanicolaou staining. And staining the cytoplasm and determining whether it is a tumor from its morphology. However, such a judgment has knowledge and experience, and only a pathologist and a qualified person of a cell screener can make it. In many cases, it is difficult to judge whether a tumor is a cell form diagnosis.

特許第３３０２０２０号公報Japanese Patent No. 3302020

本発明の目的は、簡便かつ正確なプロテアーゼの測定を可能とするバイオセンサー、及びそれを用いたプロテアーゼの測定方法を提供することである。より具体的には、浸潤や転移活性などの癌細胞の悪性度、歯周病などの病態、及びリウマチなどの破壊性病変の進行度を短時間で正確かつ簡便に判定でき、癌の予後や破壊性病変の進行程度などを正確に予測するために有用なプロテアーゼ測定のためのバイオセンサー、及びそれを用いたプロテアーゼの測定方法を提供することにある。   An object of the present invention is to provide a biosensor capable of easily and accurately measuring a protease and a method for measuring a protease using the same. More specifically, cancer cell malignancy such as invasion and metastasis activity, pathological conditions such as periodontal disease, and progress of destructive lesions such as rheumatism can be determined accurately and easily in a short time, and the prognosis of cancer and It is an object of the present invention to provide a biosensor for measuring protease useful for accurately predicting the degree of progression of destructive lesions, and a method for measuring protease using the same.

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ゼラチンなどのプロテアーゼ基質で表面を被覆したバイオセンサーの表面にプロテアーゼを接触させ、表面プラズモン共鳴分析を行うことにより、プロテアーゼ基質へのプロテアーゼの作用により表面プラズモン共鳴シグナルに変化が生じることを見出し、これにより組織中の個々の細胞内に発現しているプロテアーゼを測定できることを見いだした。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。   As a result of diligent efforts to solve the above-mentioned problems, the present inventors contacted the protease with the surface of a biosensor whose surface is coated with a protease substrate such as gelatin, and conducted surface plasmon resonance analysis, thereby obtaining a protease substrate. It has been found that the surface plasmon resonance signal is changed by the action of the protease, and it has been found that the protease expressed in individual cells in the tissue can be measured. The present invention has been completed based on these findings.

すなわち本発明によれば、プロテアーゼ基質で表面が修飾されている基板からなることを特徴とする、プロテアーゼによる消化パターンを測定するためのバイオセンサーが提供される。   That is, according to the present invention, there is provided a biosensor for measuring a digestion pattern by a protease, which comprises a substrate whose surface is modified with a protease substrate.

好ましくは、プロテアーゼ基質が、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、カゼイン、アルブミン誘導体、卵白アルブミン誘導体、及びトランスフェリン誘導体からなる群かれ選ばれるプロテアーゼ基質である。   Preferably, the protease substrate is a protease substrate selected from the group consisting of collagen, gelatin, proteoglycan, fibronectin, laminin, elastin, casein, albumin derivative, ovalbumin derivative, and transferrin derivative.

好ましくは、基板は、金属表面又は金属膜から成る基板である。
好ましくは、金属表面あるいは金属膜は、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである。 Preferably, the substrate is a substrate made of a metal surface or a metal film.
Preferably, the metal surface or the metal film is made of a free electron metal selected from the group consisting of gold, silver, copper, platinum, and aluminum.

好ましくは、基板は、疎水性高分子化合物又はポリヒドロキシ高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜であって、その表面がプロテアーゼ基質で修飾されている基板である。   Preferably, the substrate is a metal surface or metal film coated with a hydrophobic polymer compound or a polyhydroxy polymer compound, or a metal surface or metal film having a self-assembled film, and the surface is a protease substrate. The substrate is modified with

好ましくは、本発明のバイオセンサーは、基板の上に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、及び前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる。   Preferably, the biosensor of the present invention has a metal film formed on a substrate, a light source that generates a light beam, and a total reflection condition is obtained at the interface between the light beam and the metal film, and And an optical system that makes the light incident so as to include various incident angle components; and a light detection means that detects the state of surface plasmon resonance by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.

好ましくは、本発明のバイオセンサーは、非電気化学的検出に使用され、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用される。   Preferably, the biosensor of the present invention is used for non-electrochemical detection, more preferably for surface plasmon resonance analysis.

本発明の別の側面によれば、上記した本発明のバイオセンサーに対してプロテアーゼを含む試料を接触させる工程、及びプロテアーゼの作用により該バイオセンサーの表面に形成された消化痕を検出する工程を含む、プロテアーゼの測定方法が提供される。   According to another aspect of the present invention, the step of bringing a sample containing a protease into contact with the biosensor of the present invention described above, and the step of detecting digestion traces formed on the surface of the biosensor by the action of the protease A method for measuring protease is provided.

好ましくは、試料は患者から分離・採取した生体試料である。
好ましくは、プロテアーゼはマトリックス・メタロプロテアーゼである。
好ましくは、本発明のプロテアーゼの測定方法は、プロテアーゼが関与する疾患の診断に用いる。 Preferably, the sample is a biological sample separated and collected from a patient.
Preferably, the protease is a matrix metalloprotease.
Preferably, the method for measuring a protease of the present invention is used for diagnosis of a disease involving a protease.

好ましくは、疾患は癌、リウマチ性疾患、歯周病、及び歯槽膿漏からなる群から選ばれる疾患である。
好ましくは、バイオセンサーの表面に形成された消化痕を非電気化学的方法により検出または測定することができ、さらに好ましくは、バイオセンサーの表面に形成された消化痕を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定することができる。 Preferably, the disease is a disease selected from the group consisting of cancer, rheumatic disease, periodontal disease, and alveolar pyorrhea.
Preferably, digestion traces formed on the surface of the biosensor can be detected or measured by a non-electrochemical method, and more preferably, digestion traces formed on the surface of the biosensor are detected or detected by surface plasmon resonance analysis. Can be measured.

本発明の方法は、組織中に局在する特定部位や組織中の個々の細胞に由来するプロテアーゼを正確かつ簡便に測定することができ、しかも短時間に判定できるという特徴がある。従って、本発明の方法は、浸潤や転移活性などの癌細胞の悪性度、歯周炎などの歯周病の進行度、リウマチや歯槽膿漏などの破壊性病態などの正確な診断に有用である。また、本発明の方法に従えば、極めて微量の試料からプロテアーゼ活性を測定することが可能である。   The method of the present invention is characterized in that a protease derived from a specific site localized in a tissue or an individual cell in the tissue can be accurately and easily measured and can be determined in a short time. Therefore, the method of the present invention is useful for accurate diagnosis of the malignancy of cancer cells such as invasion and metastatic activity, the progression of periodontal diseases such as periodontitis, and destructive pathologies such as rheumatism and alveolar pyorrhea. is there. Further, according to the method of the present invention, it is possible to measure protease activity from a very small amount of sample.

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のバイオセンサーは、プロテアーゼ基質で表面が修飾されている基板からなることを特徴とする、プロテアーゼによる消化パターンを測定するためのバイオセンサーである。また、本発明によるプロテアーゼの測定方法は、上記した本発明のバイオセンサーに対してプロテアーゼを含む試料を接触させる工程、及びプロテアーゼの作用により該バイオセンサーの表面に形成された消化痕を検出する工程を含む方法である。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
The biosensor of the present invention is a biosensor for measuring a digestion pattern by a protease, comprising a substrate whose surface is modified with a protease substrate. The method for measuring a protease according to the present invention includes a step of bringing a sample containing a protease into contact with the biosensor of the present invention described above, and a step of detecting digestion traces formed on the surface of the biosensor by the action of the protease. It is a method including.

本明細書において用いられる測定という用語は、定性及び定量を含めて最も広義に解釈されるべきである。本発明の方法では、試料中に含まれるプロテアーゼによってプロテアーゼ基質が消化され、バイオセンサーの表面に消化痕が形成される。この消化痕は、例えば、表面プラズモン共鳴分析などの非電気化学的な検出法により検出することができる。   The term measurement as used herein should be interpreted in the broadest sense, including qualitative and quantitative. In the method of the present invention, the protease substrate is digested by the protease contained in the sample, and a digestion trace is formed on the surface of the biosensor. This digestion trace can be detected by a non-electrochemical detection method such as surface plasmon resonance analysis.

本発明の方法の測定対象となるプロテアーゼとしては、例えば、マトリックス・メタロプロテアーゼ（MMP）及びマトリックス・セリンプロテアーゼ（MSP）を挙げることができる。これらの酵素については、鶴尾隆編「癌転移の分子機構」、pp.92−107、メジカルビュー社、1993年発行に詳細に説明されている。   Examples of the protease to be measured by the method of the present invention include matrix metalloprotease (MMP) and matrix serine protease (MSP). These enzymes are described in detail in Takaru Tsuruo, “Molecular mechanism of cancer metastasis”, pp.92-107, Medical View, 1993.

マトリックス・メタロプロテアーゼはコラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン、フィブロネクチン、及びゼラチンなどの細胞外基質を分解する酵素であり、MMP−1,2,3,7,9及び10など８種類の存在が明らかにされている。間質型コラーゲナーゼ（MMP−１）は最も古くから知られているマトリックス・メタロプロテアーゼであり、繊維芽細胞や軟骨などに分布しており、間質間のコラーゲンを1/4及び1/3に切断する。歯周病においては、主としてMMP−２（ゼラチナーゼＡ）及びMMP−９（ゼラチナーゼＢ）が歯周組織の構成成分であるIV型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、及びプロテオグリカンなどを破壊する。なお、マトリックス・メタロプロテアーゼの分泌は、細胞増殖因子であるEGFやTGF−βによって強く促進されており、他方、組織内の内在性インヒビターによって分泌や活性発現が制御されている。もっとも、増殖因子が関与した場合にその発現がどのように抑制されるのかは必ずしも明らかではない。   Matrix metalloprotease is an enzyme that degrades extracellular matrix such as collagen, proteoglycan, laminin, fibronectin, and gelatin. Eight types such as MMP-1,2,3,7,9 and 10 have been revealed. Yes. Interstitial collagenase (MMP-1) is the longest known matrix metalloprotease and is distributed in fibroblasts and cartilage. Disconnect. In periodontal disease, MMP-2 (gelatinase A) and MMP-9 (gelatinase B) mainly destroy type IV collagen, laminin, fibronectin, proteoglycan and the like, which are components of periodontal tissue. The secretion of matrix metalloprotease is strongly promoted by EGF and TGF-β, which are cell growth factors, and on the other hand, secretion and activity expression are controlled by endogenous inhibitors in tissues. However, it is not always clear how the expression is suppressed when a growth factor is involved.

また、腫瘍細胞の浸潤や転移に関与する他のプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼであるプラスミノーゲン・アクティベーター（PA）を挙げることができる。このプラスミノーゲン・アクティベーターはプラスミノーゲンをプラスミンに変換する酵素であり、プラスミノーゲン・アクティベーターの作用により生成したプラスミンがプロメタロプロテアーゼを活性型メタロプロテアーゼに変換する。従って、マトリックス・メタロプロテアーゼとプラスミノーゲン・アクティベーターとの間で形成されるカスケードによって、癌細胞の浸潤や転移が進行ないしは加速されると考えられる。   Further, as other proteases involved in tumor cell invasion and metastasis, plasminogen activator (PA), which is a serine protease, can be mentioned. This plasminogen activator is an enzyme that converts plasminogen into plasmin, and plasmin produced by the action of plasminogen activator converts prometalloprotease into active metalloprotease. Therefore, it is considered that invasion and metastasis of cancer cells are advanced or accelerated by a cascade formed between matrix metalloproteinase and plasminogen activator.

本発明の方法に特に好適なプロテアーゼとして、例えば、間質型コラーゲナーゼ（MMP−１）、ゼラチナーゼＡ（MMP−２）、及びゼラチナーゼＢ（MMP−９）などのマトリックス・メタロプロテアーゼ；及びプラスミノーゲン・アクティベーター（PA）などのマトリックスセリンプロテアーゼを挙げることができるが、本発明の方法の対象はこれらのプロテアーゼに限定されることはない。   Particularly suitable proteases for the methods of the present invention include, for example, matrix metalloproteases such as stromal collagenase (MMP-1), gelatinase A (MMP-2), and gelatinase B (MMP-9); Matrix serine proteases such as gene activators (PA) can be mentioned, but the object of the method of the present invention is not limited to these proteases.

プロテアーゼ基質は、プロテアーゼの基質として分解される高分子化合物であれば特に限定されない。例えば、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、カゼイン、アルブミン誘導体、卵白アルブミン誘導体、及びトランスフェリン 誘導体（例えば、特開２００３−２８４５９０号公報、特開２００３−７９３９５号公報、及び特開２００３−３８１９６号公報などを参照）などを用いることができる。好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、エラスチン、又はカゼインを用いることができ、より好ましくはゼラチン、フィブロネクチン、又はカゼインを用いることができる。プロテアーゼ基質は上記の物質の１種を用いてもよいが、２種以上を組み合わせて用いてもよい。   The protease substrate is not particularly limited as long as it is a polymer compound that can be decomposed as a protease substrate. For example, collagen, gelatin, proteoglycan, fibronectin, laminin, elastin, casein, albumin derivative, ovalbumin derivative, and transferrin derivative (for example, JP2003-284590, JP2003-79395, and JP2003) 38196, etc.) can be used. Preferably, collagen, gelatin, fibronectin, elastin, or casein can be used, more preferably gelatin, fibronectin, or casein can be used. As the protease substrate, one of the above substances may be used, or two or more of them may be used in combination.

２種以上の異なるプロテアーゼ基質を組み合わせて用いることにより、生体試料中に含まれるプロテアーゼの種類を正確に特定できる場合がある。例えば、生体試料中の実質的に連続した２以上の切片のうちの一つをプロテアーゼ基質で被覆したバイオセンサー基板に接触させ、残りの切片を上記のバイオセンサー基板に含まれるプロテアーゼ基質とは異なるプロテアーゼ基質を含む他のバイオセンサー基板に接触させた後、それぞれのバイオセンサー基板を用いて測定した表面プラズモン共鳴シグナルを対比する方法を採用することができる。この方法では、異なるプロテアーゼ基質をそれぞれ含有する３以上のバイオセンサー基板を用いて測定を行なうことが可能である。また、例えば、プロテアーゼ基質で被覆した第一のバイオセンサー基板と、第一のバイオセンサー基板に含まれるプロテアーゼ基質とは異なるプロテアーゼ基質を含有する第二のバイオセンサー基板を製造し、プロテアーゼを含む試料を接触させた後に、それぞれのバイオセンサー基板を用いて測定した表面プラズモン共鳴シグナルを対比する方法を採用してもよい。この方法では、異なる種類のプロテアーゼをそれぞれ含有する３以上のバイオセンサー基板を用いることも可能である。   By using two or more different protease substrates in combination, the type of protease contained in the biological sample may be accurately identified. For example, one of two or more substantially continuous sections in a biological sample is brought into contact with a biosensor substrate coated with a protease substrate, and the remaining sections are different from the protease substrate contained in the biosensor substrate. A method of comparing the surface plasmon resonance signal measured using each biosensor substrate after contacting with another biosensor substrate containing a protease substrate can be employed. In this method, measurement can be performed using three or more biosensor substrates each containing a different protease substrate. In addition, for example, a first biosensor substrate coated with a protease substrate and a second biosensor substrate containing a protease substrate different from the protease substrate contained in the first biosensor substrate are manufactured, and the sample contains the protease. After contacting each other, a method of comparing surface plasmon resonance signals measured using each biosensor substrate may be employed. In this method, it is possible to use three or more biosensor substrates each containing different types of proteases.

また、プロテアーゼ・インヒビターを用いることにより、インヒビターに関連するプロテアーゼの同定やプロテアーゼの特性の判定が容易になる場合もある。プロテアーゼ・インヒビターとしては、例えば、ティッシュ・インヒビター・オブ・メタプロテアーゼ１（TIMP1）、ティッシュ・インヒビター・オブ・メタプロテアーゼ２（TIMP2）、ラージ・インヒビター・オブ・メタロプロテアーゼ（LIMP）、チッキン・インヒビター・オブ・メタロプロテアーゼ（ChIMP）、オポスタチン、血小板第IV因子（PF−４）、α₂マクログロブリン、EDTA、1,10−フェナントロリン、BB94、ミノサイクリン、マトリスタチン、SC−44463、又は、ジチオトレイトール（DTT）などを挙げることができる。 In addition, by using a protease inhibitor, it may be easy to identify a protease related to the inhibitor and to determine the characteristics of the protease. Examples of protease inhibitors include tissue inhibitor of metaprotease 1 (TIMP1), tissue inhibitor of metaprotease 2 (TIMP2), large inhibitor of metalloprotease (LIMP), and chicken inhibitor. of metalloprotease (Chimp), Oposutachin, platelet IV factor (PF-4), α ₂ macroglobulin, EDTA, 1,10-phenanthroline, BB94, minocycline, Matricaria statin, SC-44463, or dithiothreitol ( DTT).

例えば、生体試料中の実質的に連続した２以上の切片のうちの一つをプロテアーゼ基質を含むバイオセンサー基板に接触させ、残りの切片をプロテアーゼ基質とプロテアーゼ・インヒビターとを含む他のバイオセンサー基板に接触させた後、それぞれのバイオセンサー基板を用いて測定した表面プラズモン共鳴シグナルを対比する方法を採用することができる。   For example, one of two or more substantially continuous sections in a biological sample is contacted with a biosensor substrate containing a protease substrate, and the remaining sections are other biosensor substrates containing a protease substrate and a protease inhibitor. A method of comparing the surface plasmon resonance signal measured using each biosensor substrate after contacting with the biosensor substrate can be employed.

本発明の方法に用いる試料としては、例えば、ヒトを含む哺乳類動物から分離・採取した生体試料を用いることができる。生体試料としては、組織又は組織滲出液などを用いることができる。例えば、肺癌、胃癌、食道癌、乳癌、脳腫瘍などの固形癌組織から手術や組織検査などにより分離・採取した癌組織切片；リウマチ性関節炎の滑膜や骨組織、及び歯槽膿漏の歯根膜や骨組織などの破壊性病変組織切片や抽出液（例えば、リウマチ性病変組織抽出液又は歯槽膿漏組織抽出液）、並びに歯周病の歯肉溝滲出液などを用いることができる。   As a sample used in the method of the present invention, for example, a biological sample separated and collected from mammals including humans can be used. As the biological sample, a tissue or a tissue exudate can be used. For example, cancer tissue sections separated and collected by surgery or histological examination from solid cancer tissues such as lung cancer, stomach cancer, esophageal cancer, breast cancer, brain tumor; synovium and bone tissue of rheumatoid arthritis, and periodontal ligament of alveolar pus Destructive lesion tissue sections such as bone tissue and extracts (for example, rheumatic lesion tissue extract or alveolar pyorrhea extract) and periodontal disease gingival crevicular fluid can be used.

試料が組織の場合には、例えば、液体窒素で急速凍結した試料から凍結切片作成装置を用いて厚さ１〜10μｍ、好ましくは５μｍ程度の切片を調製し、この切片をバイオセンサー基板に貼付することによって試料とバイオセンサー基板とを接触させることができる。また、リウマチ性関節炎の患者から採取した滑膜液を試料として用いる場合には、滑膜液約５〜50μｌ、好ましくは20μｌ程度をバイオセンサー基板上に滴下すればよい。歯周病の歯肉溝滲出液を試料として用いる場合には、歯肉溝内に濾紙を挿入して約５〜10μｌ程度の歯肉溝滲出液を採取し、該濾紙をバイオセンサーの表面に貼付する方法を採用することができる。歯肉溝滲出液の採取後、必要に応じて蒸留水や適宜の緩衝液（例えば、50mM Tris−HCl,pH7.5,10mM CaCl₂,0.2M NaClなど）を用いて濾紙から歯肉溝滲出液を抽出し、抽出液をバイオセンサーの表面上に滴下してもよい。 When the sample is a tissue, for example, a section having a thickness of 1 to 10 μm, preferably about 5 μm, is prepared from a sample rapidly frozen with liquid nitrogen using a frozen section preparation device, and the section is attached to a biosensor substrate. Thus, the sample and the biosensor substrate can be brought into contact with each other. When synovial fluid collected from a patient with rheumatoid arthritis is used as a sample, about 5 to 50 μl, preferably about 20 μl of synovial fluid may be dropped on the biosensor substrate. When using a periodontal disease gingival crevicular fluid as a sample, a filter paper is inserted into the gingival crevice to collect about 5 to 10 μl of gingival crevicular fluid, and the filter paper is affixed to the biosensor surface Can be adopted. After collecting the gingival crevicular fluid, remove the gingival crevicular fluid from the filter paper using distilled water or an appropriate buffer (eg, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 0.2 M NaCl, etc.) as necessary. Extraction may be performed and the extract may be dropped on the surface of the biosensor.

本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。   The biosensor referred to in the present invention is interpreted in the broadest sense, and means a sensor that measures and detects a target substance by converting an interaction between biomolecules into a signal such as an electrical signal. A normal biosensor is composed of a receptor site for recognizing a chemical substance to be detected and a transducer site for converting a physical change or chemical change generated therein into an electrical signal. In the living body, there are enzymes / substrates, enzymes / coenzymes, antigens / antibodies, hormones / receptors and the like as substances having affinity for each other. Biosensors use the principle that one of these substances having affinity with each other is immobilized on a substrate and used as a molecular recognition substance, thereby selectively measuring the other substance to be matched.

本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。   In the biosensor of the present invention, a metal surface or a metal film can be used as a substrate. The metal constituting the metal surface or metal film is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur when, for example, a surface plasmon resonance biosensor is considered. Preferred examples include free electron metals such as gold, silver, copper, aluminum, and platinum, with gold being particularly preferred. These metals can be used alone or in combination. In consideration of adhesion to the substrate, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.

金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。   Although the thickness of the metal film is arbitrary, for example, when considering use for a surface plasmon resonance biosensor, the thickness is preferably 0.1 nm to 500 nm, particularly preferably 1 nm to 200 nm. If it exceeds 500 nm, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. Moreover, when providing the intervening layer which consists of chromium etc., it is preferable that the thickness of the intervening layer is 0.1 to 10 nm.

金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。   The metal film may be formed by a conventional method, for example, sputtering, vapor deposition, ion plating, electroplating, electroless plating, or the like.

金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。   The metal film is preferably disposed on the substrate. Here, “arranged on the substrate” means that the metal film is arranged so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not directly in contact with the substrate, but through other layers. This also includes the case where they are arranged. As a substrate that can be used in the present invention, for example, in the case of a surface plasmon resonance biosensor, generally, optical glass such as BK7, or synthetic resin, specifically polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polycarbonate A material made of a material transparent to laser light such as a cycloolefin polymer can be used. Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability.

本発明において好ましくは、基板は、疎水性高分子化合物又はポリヒドロキシ高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜である。以下、疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物及び自己組織化膜について説明する。   In the present invention, the substrate is preferably a metal surface or metal film coated with a hydrophobic polymer compound or a polyhydroxy polymer compound, or a metal surface or metal film having a self-assembled film. Hereinafter, the hydrophobic polymer compound, the polyhydroxy polymer compound, and the self-assembled film will be described.

本発明で用いる疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。   The hydrophobic polymer compound used in the present invention is a polymer compound having no water absorption, and its solubility in water (25 ° C.) is 10% or less, more preferably 1% or less, most preferably 0.1% or less. It is.

疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。   Hydrophobic monomers that form hydrophobic polymer compounds include vinyl esters, acrylic acid esters, methacrylic acid esters, olefins, styrenes, crotonic acid esters, itaconic acid diesters, and maleic acid diesters. , Fumaric acid diesters, allyl compounds, vinyl ethers, vinyl ketones and the like. The hydrophobic polymer compound may be a homopolymer composed of one type of monomer or a copolymer composed of two or more types of monomers.

本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。   Examples of the hydrophobic polymer compound preferably used in the present invention include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, polymethyl methacrylate, polyester, and nylon.

疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。   Coating of the hydrophobic polymer compound on the substrate can be performed by a conventional method, for example, spin coating, air knife coating, bar coating, blade coating, slide coating, curtain coating, spraying, vapor deposition, casting, It can be performed by an immersion method or the like.

浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。   In the dipping method, coating is performed by bringing the substrate into contact with a hydrophobic polymer solution and then bringing the substrate into contact with a liquid not containing the hydrophobic polymer solution. Preferably, the solvent of the hydrophobic polymer compound solution and the solvent of the liquid not containing the hydrophobic polymer compound are the same solvent. In the dipping method, a hydrophobic polymer compound layer having a uniform coating thickness can be obtained on the surface of the substrate by appropriately selecting a solvent for coating the hydrophobic polymer compound, regardless of the unevenness, curvature, and shape of the substrate.

疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。   The coating thickness of the hydrophobic polymer compound is not particularly limited, but is preferably 0.1 nm to 500 nm, particularly preferably 1 nm to 300 nm.

本発明で用いるポリヒドロキシ高分子化合物としては、例えば多糖類（例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース）、または合成高分子化合物（例えばポリビニルアルコール）などを挙げることができる。本発明においては、多糖類が好ましく用いられ、デキストランが最も好ましい。   Examples of the polyhydroxy polymer compound used in the present invention include polysaccharides (eg, agarose, dextran, carrageenan, alginic acid, starch, cellulose), or synthetic polymer compounds (eg, polyvinyl alcohol). In the present invention, polysaccharides are preferably used, and dextran is most preferred.

本発明においては、好ましくは、平均分子量１万以上２００万以下のポリヒドロキシ高分子化合物が用いられる。好ましくは２万以上２００万以下、さらに好ましくは３万以上１００万以下、最も好ましくは２０万以上８０万以下のポリヒドロキシ高分子化合物を用いることができる。   In the present invention, a polyhydroxy polymer compound having an average molecular weight of 10,000 to 2,000,000 is preferably used. Preferably, a polyhydroxy polymer compound having a molecular weight of 20,000 to 2,000,000, more preferably 30,000 to 1,000,000, and most preferably 200,000 to 800,000 can be used.

ポリヒドロキシ高分子化合物は、例えば塩基性条件下でブロモ酢酸と反応させることでカルボキシ化できる。反応条件の制御により、ポリヒドロキシ化合物が初期状態で含有するヒドロキシ基の一定の割合をカルボキシ化できる。本発明においては例えば、１〜９０％のヒドロキシ基をカルボキシ化することができる。なお、任意のポリヒドロキシ高分子化合物で表面被覆された表面について、例えば、以下の方法でカルボキシ化率を算出することができる。膜表面をジ−tert−ブチルカルボジイミド／ピリジン触媒を用いてトリフルオロエタノールで50℃、16時間、気相修飾し、ＥＳＣＡ（electron spectroscopy for chemical analysis）でトリフルオロエタノール由来のフッ素量を測定し、膜表面の酸素量との比率（以下、Ｆ／Ｏ値と呼ぶ）を算出する。全てのヒドロキシ基がカルボキシ化された場合の理論的なＦ／Ｏ値をカルボキシ化率１００％とし、任意の条件でカルボキシ化した時のＦ／Ｏ値を測定することで、その時のカルボキシ化率を算出することができる。   The polyhydroxy polymer compound can be carboxylated, for example, by reacting with bromoacetic acid under basic conditions. By controlling the reaction conditions, it is possible to carboxylate a certain proportion of the hydroxy groups that the polyhydroxy compound contains in the initial state. In the present invention, for example, 1 to 90% of hydroxy groups can be carboxylated. In addition, about the surface coat | covered with arbitrary polyhydroxy polymer compounds, a carboxylation rate is computable with the following method, for example. The membrane surface was gas-phase modified with trifluoroethanol at 50 ° C. for 16 hours using a di-tert-butylcarbodiimide / pyridine catalyst, and the amount of fluorine derived from trifluoroethanol was measured by ESCA (electron spectroscopy for chemical analysis). A ratio with the amount of oxygen on the film surface (hereinafter referred to as F / O value) is calculated. Carboxylation rate at that time by measuring the F / O value when carboxylation is carried out under arbitrary conditions with the theoretical F / O value when all hydroxy groups are carboxylated as 100% carboxylation rate Can be calculated.

ポリヒドロキシ高分子化合物は有機分子Ｘ¹−Ｒ¹−Ｙ¹を介して金属膜に付着させることができる。有機分子Ｘ¹−Ｒ¹−Ｙ¹について詳細に説明する。 The polyhydroxy polymer compound can be attached to the metal film via the organic molecule X ¹ —R ¹ —Y ¹ . The organic molecule X ¹ —R ¹ —Y ¹ will be described in detail.

Ｘ¹は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR¹¹Ｙ¹¹、−SSR¹Y¹）、スルフィド（−SR¹¹Ｙ¹¹、−SR¹Y¹）、ジセレニド（−SeSeR¹¹Ｙ¹¹、−SeSeR¹Y¹）、セレニド（SeR¹¹Ｙ¹¹、−SeR¹Y¹）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO₂）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。 X ¹ is a group having a binding property to the metal film. Specifically, asymmetric or symmetric sulfide (—SSR ¹¹ Y ¹¹ , —SSR ¹ Y ¹ ), sulfide (—SR ¹¹ Y ¹¹ , —SR ¹ Y ¹ ), diselenide (—SeSeR ¹¹ Y ¹¹ , —SeSeR ¹ Y) ¹ ), selenide (SeR ¹¹ Y ¹¹ , —SeR ¹ Y ¹ ), thiol (—SH), nitrile (—CN), isonitrile, nitro (—NO ₂ ), selenol (—SeH), trivalent phosphorus compound, iso Thiocyanate, xanthate, thiocarbamate, phosphine, thioacid or dithioacid (-COSH, -CSSH) is preferably used.

Ｒ¹（とＲ¹¹）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。 R ¹ (and R ¹¹ ) is optionally interrupted by a heteroatom, preferably straight-chain (unbranched) for reasonably close packing, and optionally carbon containing double and / or triple bonds It is a hydrogen chain. The chain length is preferably greater than 10 atoms. The carbon chain can optionally be perfluorinated.

Ｙ¹とＹ¹¹はポリヒドロキシ高分子化合物を結合させるための基である。Ｙ¹とＹ¹¹は好ましくは同一であり、ポリヒドロキシ高分子化合物に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。 Y ¹ and Y ¹¹ are groups for binding the polyhydroxy polymer compound. Y ¹ and Y ¹¹ are preferably the same and have the property that they can be bonded directly or after activation to the polyhydroxy polymer compound. Specifically, hydroxyl, carboxyl, amino, aldehyde, hydrazide, carbonyl, epoxy, vinyl group, or the like can be used.

有機分子Ｘ¹−Ｒ¹−Ｙ¹の具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどが挙げられる。 Specific examples of the organic molecule X ¹ -R ¹ -Y ¹ include 10-carboxy-1-decanethiol, 4,4′-dithiodibutylic acid, 11-hydroxy-1-undecanethiol, 11-amino-1- And undecanethiol.

チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。   Sulfur compounds such as thiols and disulfides spontaneously adsorb on a noble metal substrate such as gold to give an ultra-thin film of single molecular size. The aggregate is called a self-assembled film because it shows an arrangement depending on the crystal lattice of the substrate and the molecular structure of adsorbed molecules. In the present invention, for example, as a self-assembling compound, 7-carboxy-1-heptanethiol, 10-carboxy-1-decanethiol, 4,4′-dithiodibutylic acid, 11-hydroxy-1-undecanethiol, 11 -Amino-1-undecanethiol and the like can be used.

本発明においては、上記したような疎水性高分子化合物又はポリヒドロキシ高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜の表面にプロテアーゼ基質を固定化することができる。   In the present invention, a protease substrate is immobilized on a metal surface or metal film coated with a hydrophobic polymer compound or polyhydroxy polymer compound as described above, or a metal surface or metal film surface having a self-assembled film. be able to.

本発明の方法では、例えば、組織切片をバイオセンサー基板に貼付するか、あるいは液体試料をバイオセンサー基板上に滴下することによってバイオセンサー基板とプロテアーゼを含む試料とを接触させた後、好ましくは37℃の湿潤箱内で、組織切片については例えば１〜24時間、好ましくは２〜12時間、さらに好ましくは３〜６時間程度、液体試料については0.5〜12時間、好ましくは１〜６時間、さらに好ましくは１〜３時間程度インキュベートする。試料中にプロテアーゼが含まれる場合には、バイオセンサー基板上のプロテアーゼ基質がプロテアーゼによって分解され、バイオセンサー基板上に消化痕が形成される。   In the method of the present invention, for example, after a tissue section is affixed to the biosensor substrate or a liquid sample is dropped on the biosensor substrate, the biosensor substrate and the sample containing the protease are contacted, and then preferably 37 In a wet box at 0 ° C., for tissue sections, for example, 1 to 24 hours, preferably 2 to 12 hours, more preferably about 3 to 6 hours, for liquid samples 0.5 to 12 hours, preferably 1 to 6 hours, Preferably, it is incubated for about 1 to 3 hours. When protease is contained in the sample, the protease substrate on the biosensor substrate is decomposed by the protease, and digestion traces are formed on the biosensor substrate.

本発明では、プロテアーゼの作用によりバイオセンサーの表面に形成された消化痕を、非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。   In the present invention, it is preferable to detect and / or measure digestion traces formed on the surface of the biosensor by the action of protease by a non-electrochemical method. Non-electrochemical methods include surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, measurement technology using functionalized surfaces from gold colloidal particles to ultrafine particles.

本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。   According to a preferred aspect of the present invention, the biosensor of the present invention can be used as a surface plasmon resonance biosensor characterized by including a metal film disposed on a transparent substrate, for example.

表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。   The surface plasmon resonance biosensor is a biosensor used in the surface plasmon resonance biosensor, and includes a part that transmits and reflects light emitted from the sensor, and a part that fixes a physiologically active substance. And may be fixed to the main body of the sensor or may be removable.

表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。   The phenomenon of surface plasmon resonance is due to the fact that the intensity of monochromatic light reflected from the boundary between an optically transparent substance such as glass and the metal thin film layer depends on the refractive index of the sample on the metal exit side. Yes, so the sample can be analyzed by measuring the intensity of the reflected monochromatic light.

表面プラズモン共鳴測定装置とは、表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析するための装置である。本発明で用いられる表面プラズモン共鳴測定装置は、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備える。   A surface plasmon resonance measuring apparatus is an apparatus for analyzing the characteristics of a substance to be measured using a phenomenon in which surface plasmons are excited by light waves. The surface plasmon resonance measuring apparatus used in the present invention is provided with a metal film, a light source for generating a light beam, a total reflection condition at the interface between the light beam and the metal film, and various incident angle components. And an optical system for detecting the surface plasmon resonance state by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.

表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。   As a surface plasmon measuring device for analyzing the characteristics of a substance to be measured using a phenomenon in which surface plasmons are excited by light waves, there is an apparatus using a system called Kretschmann arrangement (for example, JP-A-6-167443). See the official gazette). A surface plasmon measuring apparatus using the above system basically includes a dielectric block formed in a prism shape, for example, and a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a substance to be measured such as a sample liquid. A light source that generates a light beam; an optical system that causes the light beam to enter the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the metal film; and It comprises light detecting means for detecting the surface plasmon resonance state, that is, the state of total reflection attenuation by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.

なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。   In order to obtain various incident angles as described above, a relatively thin light beam may be incident on the interface by changing the incident angle, or a component incident on the light beam at various angles is included. As described above, a relatively thick light beam may be incident on the interface in a convergent light state or a divergent light state. In the former case, a light beam whose reflection angle changes according to the change in the incident angle of the incident light beam is detected by a small photodetector that moves in synchronization with the change in the reflection angle, or the direction in which the reflection angle changes Can be detected by an area sensor extending along the line. On the other hand, in the latter case, it can be detected by an area sensor extending in a direction in which each light beam reflected at various reflection angles can be received.

上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。   In the surface plasmon measuring apparatus having the above configuration, when a light beam is incident on a metal film at a specific incident angle that is greater than the total reflection angle, an evanescent wave having an electric field distribution is generated in the measured substance in contact with the metal film. The evanescent wave excites surface plasmons at the interface between the metal film and the substance to be measured. When the wave number vector of the evanescent light is equal to the wave number of the surface plasmon and the wave number matching is established, both are in a resonance state and the energy of the light is transferred to the surface plasmon. The intensity of the reflected light decreases sharply. This decrease in light intensity is generally detected as a dark line by the light detection means. The resonance described above occurs only when the incident beam is p-polarized light. Therefore, it is necessary to set in advance so that the light beam is incident as p-polarized light.

この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。   If the wave number of the surface plasmon is known from the incident angle at which this total reflection attenuation (ATR) occurs, that is, the total reflection attenuation angle (θSP), the dielectric constant of the substance to be measured can be obtained. In this type of surface plasmon measurement apparatus, as shown in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-326194, in order to measure the total reflection attenuation angle (θSP) with high accuracy and a large dynamic range, It is considered to use detection means. This light detection means is provided with a plurality of light receiving elements arranged in a predetermined direction, and arranged so that different light receiving elements receive light beam components totally reflected at various reflection angles at the interface. Is.

そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。   In that case, there is provided differential means for differentiating the light detection signals output from the light receiving elements of the arrayed light detection means with respect to the arrangement direction of the light receiving elements, and based on the differential value output by the differential means. In many cases, the total reflection attenuation angle (θSP) is specified to obtain a characteristic related to the refractive index of the substance to be measured.

また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。   Moreover, as a similar measuring device using total reflection attenuation (ATR), for example, “Spectroscopic Research” Vol. 47, No. 1, (1998), pages 21 to 23 and pages 26 to 27 are described. Devices are also known. This leakage mode measuring device is basically a dielectric block formed in a prism shape, for example, a clad layer formed on one surface of the dielectric block, and formed on the clad layer to be in contact with the sample liquid. Optical waveguide layer to be generated, a light source for generating a light beam, and the light beam to the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at the interface between the dielectric block and the cladding layer. The optical system includes an incident optical system and light detection means for detecting the excitation state of the waveguide mode, that is, the total reflection attenuation state by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.

上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。   In the leakage mode measuring apparatus having the above-described configuration, when a light beam is incident on the cladding layer through the dielectric block at an incident angle greater than the total reflection angle, the light waveguide layer transmits a specific wave number after passing through the cladding layer. Only light having a specific incident angle having a wave length propagates in the waveguide mode. When the waveguide mode is excited in this way, most of the incident light is taken into the optical waveguide layer, resulting in total reflection attenuation in which the intensity of light totally reflected at the interface is sharply reduced. Since the wave number of guided light depends on the refractive index of the substance to be measured on the optical waveguide layer, knowing the specific incident angle at which total reflection attenuation occurs, the refractive index of the substance to be measured and the measurement object related thereto The properties of the substance can be analyzed.

なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。   In this leakage mode measuring apparatus, the above-mentioned array-shaped light detecting means can be used to detect the position of the dark line generated in the reflected light due to the total reflection attenuation, and the above-described differentiating means is applied in conjunction therewith. Often done.

さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。   Furthermore, a measuring apparatus using total reflection attenuation capable of measuring a large number of samples in a short time by sequentially measuring a plurality of measuring chips mounted on a turntable or the like is disclosed in JP-A-2001-2001. No. 330560.

本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。   When the biosensor of the present invention is used for surface plasmon resonance analysis, it can be applied as a part of various surface plasmon measurement devices as described above.

本発明の方法の別の態様に従えば、癌組織などから連続凍結切片を作成し、実質的に連続した二切片のうちの一方の切片を、例えば、ヘマトキシリン・エオシン染色切片などの通常の組織標本として調製し、他の切片を本発明の測定方法に従って処理し、両者の観察結果を比較・対比することによって組織中の個々の細胞に由来するプロテアーゼの存在を正確に把握することが可能である。このようなプロテアーゼの測定方法により、組織中に存在する個々の癌細胞の悪性度（浸潤活性及び転移活性など）を正確に判定することが可能であり、癌疾患の予後についての的確な判定が可能になる。   According to another embodiment of the method of the present invention, a continuous frozen section is prepared from a cancer tissue or the like, and one of the substantially continuous two sections is replaced with a normal tissue such as a hematoxylin-eosin stained section. It is possible to accurately determine the presence of proteases derived from individual cells in the tissue by preparing as a specimen, processing other sections according to the measurement method of the present invention, and comparing and comparing the observation results of both. is there. By using such a protease measurement method, it is possible to accurately determine the malignancy (invasion activity, metastasis activity, etc.) of individual cancer cells present in the tissue, and accurate determination of the prognosis of cancer diseases can be achieved. It becomes possible.

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples.

（１）デキストラン測定チップの作製
ガラス版（HOYA社製SF10）を厚さ1mm,18mm角に光学研磨した金属膜として50nmの金が蒸着し、Model-208UV-オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、エタノール/水(80/20)中11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行う。 (1) Preparation of dextran measurement chip 50nm gold is deposited as a metal film optically polished with a glass plate (SF10 made by HOYA) to a thickness of 1mm and 18mm square, and model-208UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.) Is used. After treatment for 30 minutes, a 5.0 mM solution of 11-hydroxy-1-undecanthiol in ethanol / water (80/20) was added so as to contact the metal film, and surface treatment was performed at 25 ° C. for 18 hours. Then, wash 5 times with ethanol, once with ethanol / water mixed solvent, and 5 times with water.

次に、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールで被覆した表面を10質量％のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの1：1混合溶液）に接触させ、25℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。表面をエタノールで2回、水で5回洗浄する。   Next, the surface coated with 11-hydroxy-1-undecanthiol was brought into contact with a 10% by mass epichlorohydrin solution (solvent: 1: 1 mixture of 0.4M sodium hydroxide and diethylene glycol dimethyl ether), The reaction was allowed to proceed for 4 hours in a shaking incubator. Wash the surface twice with ethanol and five times with water.

次に、25質量％のデキストラン（T500,Pharmacia）水溶液40.5mlに4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で25℃で20時間インキュベートした。表面を50℃の水で10回洗浄する。   Next, 4.5 ml of 1 M sodium hydroxide was added to 40.5 ml of 25% by weight dextran (T500, Pharmacia) aqueous solution, and the solution was brought into contact with the epichlorohydrin treated surface. It was then incubated for 20 hours at 25 ° C. in a shaking incubator. Wash the surface 10 times with 50 ° C water.

続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返す。   Subsequently, a mixture of 3.5 g of bromoacetic acid dissolved in 27 g of 2M sodium hydroxide solution was brought into contact with the dextran-treated surface and incubated for 16 hours in a shaking incubator at 28 ° C. The surface is washed with water and then the above procedure is repeated once.

（２）ゼラチン固定チップの作製
上記のデキストラン測定チップ内の溶液を除去した後、200mM EDC(N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド ハイドロクロライド)と50mM NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)の混合溶液に浸漬し、10分間放置した。混合溶液を除去した後、水で3回バッファ１(10mM HEPES(N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸), 150mM NaCl, 10mM CaCl₂)で3回洗浄する。次いで、ゼラチン溶液(1mg/mlになるようバッファ１に溶解したもの)を固定する。チップ内を1M エタノールアミン溶液に置き換え、10分間放置したバッファーで10回洗浄することで固定化チップが完成する。 (2) Preparation of gelatin fixed chip After removing the solution in the above dextran measuring chip, 200 mM EDC (N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) and 50 mM NHS (N-hydroxysuccinimide) ) And then left for 10 minutes. After removing the mixed solution, it is washed with buffer 1 (10 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl ₂ ) three times with water. Next, a gelatin solution (dissolved in buffer 1 to 1 mg / ml) is fixed. The inside of the chip is replaced with a 1M ethanolamine solution, and the immobilized chip is completed by washing 10 times with a buffer left for 10 minutes.

（３）ＳＰＲイメージャー測定
ゼラチン固定化チップ上に0.5units/ml,0.25units/ml, 0.125units/ml ＭＭＰ２（ 活性型IV型コラゲナーゼ （株）ヤガイ）それぞれ1μl滴下し、湿潤箱内に入れて37℃で２〜６時間インキュベーションした。その後、水洗しSPRイメージャー（GWC Technologies社製）を使用し、酵素滴下周辺部分を測定し、酵素活性評価をした。結果を図１に示す。 (3) SPR imager measurement 1 μl each of 0.5 units / ml, 0.25 units / ml, and 0.125 units / ml MMP2 (active type IV collagenase Co., Ltd. potato) was placed on a gelatin-immobilized chip and placed in a wet box. Incubated at 37 ° C for 2-6 hours. Thereafter, the plate was washed with water and an SPR imager (manufactured by GWC Technologies) was used to measure the peripheral portion of the enzyme dropping to evaluate the enzyme activity. The results are shown in FIG.

図１は、ＭＭＰ２消化部位とSPRイメージャー信号を示す。信号強度；１ｍｍ径の消化部位の中心部の信号強度を「１」とし、未消化部位（MMP2未滴下部分）の部分を「０」とした時の相対強度で表した。FIG. 1 shows the MMP2 digestion site and SPR imager signal. Signal intensity: The signal intensity at the central portion of the digestion site having a diameter of 1 mm was expressed as a relative intensity when the portion of the undigested site (MMP2 non-dropped portion) was set to “0”.

Claims (15)

プロテアーゼ基質で表面が修飾されている基板からなることを特徴とする、プロテアーゼによる消化パターンを測定するためのバイオセンサー。 A biosensor for measuring a digestion pattern by a protease, comprising a substrate whose surface is modified with a protease substrate. プロテアーゼ基質が、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、カゼイン、アルブミン誘導体、卵白アルブミン誘導体、及びトランスフェリン誘導体からなる群かれ選ばれるプロテアーゼ基質である、請求項１に記載ノバイオセンサー。 2. The biosensor according to claim 1, wherein the protease substrate is a protease substrate selected from the group consisting of collagen, gelatin, proteoglycan, fibronectin, laminin, elastin, casein, albumin derivative, ovalbumin derivative, and transferrin derivative. 基板が、金属表面又は金属膜から成る基板である、請求項１又は２に記載のバイオセンサー。 The biosensor according to claim 1 or 2, wherein the substrate is a substrate made of a metal surface or a metal film. 金属表面あるいは金属膜が、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである、請求項３に記載のバイオセンサー。 The biosensor according to claim 3, wherein the metal surface or the metal film is made of a free electron metal selected from the group consisting of gold, silver, copper, platinum, and aluminum. 基板が、疎水性高分子化合物又はポリヒドロキシ高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜であって、その表面がプロテアーゼ基質で修飾されている基板である、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー。 The substrate is a metal surface or metal film coated with a hydrophobic polymer compound or a polyhydroxy polymer compound, or a metal surface or metal film having a self-assembled film, and the surface is modified with a protease substrate. The biosensor according to claim 1, wherein the biosensor is a substrate. 基板の上に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、及び前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー。 A metal film formed on the substrate, a light source that generates a light beam, and the light beam is incident so that a total reflection condition is obtained at an interface with the metal film and includes various incident angle components. The biosensor according to any one of claims 1 to 5, further comprising: an optical system; and a light detection unit that detects the state of surface plasmon resonance by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface. 非電気化学的検出に使用される、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー。 The biosensor according to any one of claims 1 to 6, which is used for non-electrochemical detection. 表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー。 The biosensor according to any one of claims 1 to 7, which is used for surface plasmon resonance analysis. 請求項１から８の何れかに記載のバイオセンサーに対してプロテアーゼを含む試料を接触させる工程、及びプロテアーゼの作用により該バイオセンサーの表面に形成された消化痕を検出する工程を含む、プロテアーゼの測定方法。 A method comprising: contacting a sample containing a protease with the biosensor according to any one of claims 1 to 8; and detecting a digestion trace formed on a surface of the biosensor by the action of the protease. Measuring method. 該試料が患者から分離・採取した生体試料である、請求項９に記載の方法。 The method according to claim 9, wherein the sample is a biological sample separated and collected from a patient. プロテアーゼがマトリックス・メタロプロテアーゼである、請求項９又は１０に記載の方法。 The method according to claim 9 or 10, wherein the protease is a matrix metalloprotease. プロテアーゼが関与する疾患の診断に用いる、請求項９から１１の何れかに記載の方法。 The method according to any one of claims 9 to 11, which is used for diagnosis of a disease involving a protease. 該疾患が癌、リウマチ性疾患、歯周病、及び歯槽膿漏からなる群から選ばれる疾患である、請求項１２に記載の方法。 The method according to claim 12, wherein the disease is a disease selected from the group consisting of cancer, rheumatic disease, periodontal disease, and alveolar pyorrhea. バイオセンサーの表面に形成された消化痕を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項９から１３の何れかに記載の方法。 The method according to any one of claims 9 to 13, wherein a digestion trace formed on the surface of the biosensor is detected or measured by a non-electrochemical method. バイオセンサーの表面に形成された消化痕を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項９から１４の何れかに記載の方法。


The method according to any one of claims 9 to 14, wherein a digestion trace formed on the surface of the biosensor is detected or measured by surface plasmon resonance analysis.

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