JP2007063190A - Angiogenesis inhibitor using cancer cell-specific gene expression method - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an angiogenesis inhibitor inhibiting the proliferation of cancer cells without causing side effects on a normal cell. <P>SOLUTION: The angiogenesis inhibitor contains a vector containing an angiogenesis-inhibiting gene at the downstream of a promoter region of the gene specifically expressing in the cancer cell. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、がん細胞特異的に血管新生を阻害することで、がん細胞の増殖を抑制する血管新生阻害薬に関する。   The present invention relates to an angiogenesis inhibitor that suppresses the growth of cancer cells by specifically inhibiting angiogenesis in cancer cells.

わが国では、がん患者は増加の一途を辿っており、死亡原因の第一位であり（２７万人、全体の３割）がん患者は１３６万人に及ぶ（平成８年実態調査）。ちなみに、平成５年では９０万人患者、２３万人死亡者であることからも増加の様子がわかる。現在がんの治療方法としては、外科手術、放射線療法や、抗がん剤での治療が主である。また、がん特異的遺伝子治療も新規治療方法として注目を浴びている（特許文献１）。また、国民医療費の概況（厚生省実施平成１４年）によると、がん患者の直接医療費が日本で２兆２１７１億円である。また、２００４年現在での新規がん患者数は世界７主要国で２００万人であり、そのうち１００万人が死亡しているのが現状である。したがって、より有効な治療方法が切望されている。   In Japan, the number of cancer patients continues to increase, and is the leading cause of death (270,000, 30% of the total). The number of cancer patients reaches 1.36 million (1996 survey). By the way, in 1993, we can see the increase from 900,000 patients and 230,000 deaths. Currently, the main treatment methods for cancer are surgery, radiation therapy, and treatment with anticancer agents. Cancer-specific gene therapy is also attracting attention as a new treatment method (Patent Document 1). Moreover, according to the general situation of national medical expenses (implemented by the Ministry of Health and Welfare in 2002), the direct medical expenses for cancer patients in Japan is 2,217.1 billion yen. As of 2004, there are 2 million new cancer patients in 7 major countries around the world, of which 1 million have died. Therefore, more effective treatment methods are eagerly desired.

がん細胞が***し、がん組織が大きくなるためには、酸素や栄養素をがん細胞全体にいきわたらせることが必須であり、そのためには、血管を新たにつくりだし栄養を補給・獲得する必要がある。つまり、がんの成長はがん組織の血管新生を伴うのでがん組織に血管が到達しないとがんは大きくなることができない。このようながんの特徴を利用した治療方法として、血管新生を阻害する手法が研究されている（特許文献２および３）。すなわち、血管新生を阻害することにより、がんが大きくなるのを止める、あるいは遅らせることができ、がんを長期間そのままの状態で維持させることができる。これをがん休眠療法と呼ぶ。このがん休眠療法は、たとえば手術が不可能な患者にも使用が可能であるという利点を有する。しかしながら、血管新生というものは、たとえば怪我の治癒過程に必須の事象であり、血管新生阻害を全身で行なうと、正常細胞においても血管新生が阻害され、怪我の治癒に支障をきたすなどの様々な副作用（悪事象）が起きる危険性がある。   In order for cancer cells to divide and the cancer tissue to grow, it is essential to spread oxygen and nutrients throughout the cancer cells. To that end, new blood vessels are created and nutrition is supplied and acquired. There is a need. In other words, cancer growth involves angiogenesis of the cancer tissue, so that the cancer cannot grow unless the blood vessel reaches the cancer tissue. Methods for inhibiting angiogenesis have been studied as therapeutic methods utilizing such characteristics of cancer (Patent Documents 2 and 3). That is, by inhibiting angiogenesis, the growth of cancer can be stopped or delayed, and cancer can be maintained as it is for a long time. This is called cancer dormancy therapy. This cancer dormancy therapy has the advantage that it can be used for patients who cannot be operated on, for example. However, angiogenesis is an essential event in the healing process of injuries, for example. When angiogenesis inhibition is performed throughout the body, angiogenesis is inhibited even in normal cells, and there are various problems such as hindering the healing of injuries. There is a risk of side effects (adverse events).

また、血管新生阻害作用を有することが非特許文献１において報告されているヒトα３鎖ＩＶ型コラーゲンのカルボキシル端の非コラーゲンドメイン（ＮＣ１）を治療に利用する場合、ＮＣ１がグッドパスチャー（Goodpasture）症候群の自己抗原認識部位であることから、全身性投与は自己抗原発現の発現を起こし、腎臓や肺に重篤な障害を与えてしまうという点からも望ましくない。   In addition, when the non-collagen domain (NC1) at the carboxyl end of human α3 chain type IV collagen, which is reported in Non-Patent Document 1 to have an angiogenesis inhibitory effect, is used for treatment, NC1 is a Goodpasture syndrome. Therefore, systemic administration is not desirable in that it causes expression of self-antigen and seriously damages the kidneys and lungs.

このような現状の中、本発明者らはＮＣ１を用いたがん細胞特異的遺伝子治療を試みたが、通常の遺伝子導入では効率が悪く、抗がん効果の確認には至らなかった（非特許文献２）。   Under these circumstances, the present inventors tried cancer cell-specific gene therapy using NC1, but the efficiency of normal gene transfer was poor, and the anti-cancer effect was not confirmed (non-native). Patent Document 2).

特表２００３−５１１０３２号公報Special table 2003-511032 gazette 特開２０００−２０１６８６号公報JP 2000-161686 A 特表２００４−５１７１１７号公報JP-T-2004-517117 プチクラーク（Petitclerc）ら、J.Biol.Chem., 275(11):8051-8061, 2000Petitclerc et al., J. Biol. Chem., 275 (11): 8051-8061, 2000 文部科学省編集・発行、「平成１４年度がん研究に係わる特定領域研究（がん特定）研究報告集録」、平成１５年３月３１日、ｐ.１３３およびｐ.１７２Edited and published by the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology, “Annual Report on Cancer Research (Cancer Identification) Related to Cancer Research 2002”, March 31, 2003, p.133 and p.172

本発明の目的は、正常細胞に副作用を及ぼすことなくがん細胞の増殖を阻害する血管新生阻害薬を提供することである。   An object of the present invention is to provide an angiogenesis inhibitor that inhibits the growth of cancer cells without causing side effects on normal cells.

前記問題点に鑑み鋭意検討した結果、がん細胞特異的に遺伝子発現を誘導するプロモーターと血管新生を阻害する遺伝子を組み込んだベクターを使用することで、がん細胞特異的に血管新生を阻害し、がん細胞の増殖を抑制できることを見出し、本発明を完成した。   As a result of intensive studies in view of the above problems, the use of a vector incorporating a promoter that induces gene expression specifically in cancer cells and a gene that inhibits angiogenesis inhibits angiogenesis specifically in cancer cells. The present inventors have found that cancer cell growth can be suppressed and completed the present invention.

本発明は、がん細胞特異的に発現するプロモーターの下流に血管新生阻害遺伝子を含むベクターを含有する血管新生阻害薬に関する。   The present invention relates to an angiogenesis inhibitor containing a vector containing an angiogenesis-inhibiting gene downstream of a promoter that is specifically expressed in cancer cells.

前記血管新生阻害薬は１回の投与量が好ましくは、ウイルスベクターの場合ウイルス量で１×１０⁹〜１×１０¹²ｐｆｕ／ｋｇ、非ウイルスベクターの場合１μｇ〜１００ｇ／ｋｇであり、間欠的に少なくとも２回以上投与されることが好ましい。 The angiogenesis inhibitor is preferably administered at a single dose, preferably 1 × 10 ⁹ to 1 × 10 ¹² pfu / kg in the case of viral vectors, and 1 μg to 100 g / kg in the case of non-viral vectors. Is preferably administered at least twice.

前記血管新生阻害薬の投与は毎日１回〜３０日毎に１回が好ましく、７〜１４日毎に１回がより好ましい。   The administration of the angiogenesis inhibitor is preferably once per day to once every 30 days, more preferably once every 7-14 days.

前記血管新生阻害薬は、前記血管新生阻害遺伝子が配列番号１の塩基配列からなるＲＧＤ−α３ＮＣ１であることが好ましい。   The angiogenesis inhibitor is preferably RGD-α3NC1 in which the angiogenesis inhibiting gene consists of the base sequence of SEQ ID NO: 1.

前記血管新生阻害薬は、前記プロモーターがｈＴＥＲＴプロモーターであることが好ましい。   In the angiogenesis inhibitor, the promoter is preferably an hTERT promoter.

本発明の血管新生阻害薬を使用することにより、がん細胞特異的に血管新生阻害遺伝子を発現させることができ、正常細胞における血管新生の阻害、自己免疫反応などの副作用を回避し、がん細胞のみの増殖を抑制することが可能である。   By using the angiogenesis inhibitor of the present invention, an angiogenesis inhibitor gene can be expressed specifically for cancer cells, avoiding side effects such as inhibition of angiogenesis and autoimmune reaction in normal cells, and cancer. It is possible to suppress the growth of only cells.

また、本発明の血管新生阻害薬は、間欠投与をおこなうことにより、さらに効率のよい治療が可能となる。   Further, the angiogenesis inhibitor of the present invention can be more efficiently treated by intermittent administration.

本発明は、がん細胞において特異的に発現し、正常細胞では発現しない性質を有する遺伝子のプロモーター領域を血管新生阻害遺伝子の上流に組み込むことにより、その血管新生阻害遺伝子を正常細胞では発現させず、がん細胞において特異的に発現させることが可能となるという知見に基づく。この血管新生阻害遺伝子のうち、ＲＧＤ−α３ＮＣ１は自己免疫疾患の自己抗原でもあり、標的とするがん細胞以外の細胞での自己抗原発現を避ける目的でも、本発明は合目的である。   The present invention prevents the angiogenesis inhibitory gene from being expressed in normal cells by incorporating a promoter region of a gene specifically expressed in cancer cells and not expressed in normal cells upstream of the angiogenesis inhibitory gene. Based on the knowledge that it can be expressed specifically in cancer cells. Among these angiogenesis inhibiting genes, RGD-α3NC1 is also an autoantigen for autoimmune diseases, and the present invention is also suitable for the purpose of avoiding self-antigen expression in cells other than the target cancer cells.

本発明で使用される血管新生阻害遺伝子は、血管新生阻害作用を有するものであれば特に制限することなく使用できる。具体的には、タムスタチン（α３ＮＣ１）、ＲＧＤ−α３ＮＣ１、エンドスタチン、アンジオスタチン、アレスチン、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＡＤＡＭＴＳ１、キャンスタチン、コンドロモジュリン、バゾスタチン、バゾヒビンおよびＴＩＭＰなどがあげられ、血管新生阻害効果および内皮細胞特異性の点からＲＧＤ−α３ＮＣ１が好ましい。また、これら遺伝子の塩基配列において数個の塩基が置換、欠失または付加された配列も、血管新生阻害効果が損なわれていない限り、本発明の血管新生阻害遺伝子として使用することができる。   The angiogenesis inhibitory gene used in the present invention can be used without particular limitation as long as it has an angiogenesis inhibitory action. Specific examples include tumstatin (α3NC1), RGD-α3NC1, endostatin, angiostatin, arrestin, TSP-1, TSP-2, ADAMTS1, canstatin, chondromodulin, vasostatin, vazohibin and TIMP. RGD-α3NC1 is preferred from the standpoint of angiogenesis inhibitory effect and endothelial cell specificity. In addition, sequences in which several bases are substituted, deleted or added in the base sequences of these genes can also be used as the angiogenesis inhibitory gene of the present invention as long as the angiogenesis inhibitory effect is not impaired.

ここで、α３ＮＣ１とは、ヒトα３鎖ＩＶ型コラーゲンのカルボキシル端の非コラーゲンドメインであるアミノ酸番号１４３９−１６７０領域のタンパク質である（プチクラークら、J.Biol.Chem., 275(11):8051-8061, 2000）。   Here, α3NC1 is a protein in the amino acid number 1439-1670 region which is a non-collagen domain at the carboxyl end of human α3 chain type IV collagen (Petit Clark et al., J. Biol. Chem., 275 (11): 8051. -8061, 2000).

また、ＲＧＤ−α３ＮＣ１とは、α３ＮＣ１のアミノ端にＲＧＤ配列を含む４つのＧ−Ｘ−Ｙからなるコラーゲン領域（ＰＧＬＫＧＫＲＧＤＳＧＳＰ配列（配列番号２））を付加したアミノ酸配列を有する蛋白質であり、その塩基配列は配列番号１に示すとおりである。   RGD-α3NC1 is a protein having an amino acid sequence in which a collagen region (PGLKKGRGDSGSP sequence (SEQ ID NO: 2)) consisting of four GXY containing RGD sequences is added to the amino terminus of α3NC1, and its base The sequence is as shown in SEQ ID NO: 1.

本発明で使用されるプロモーターは、がん細胞特異的に遺伝子発現を誘導し得るものであり、正常細胞と区別化が可能、つまりがん細胞にのみ遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限することなく使用できる。具体的には、ヒトテロメラーゼ遺伝子（ｈＴＥＲＴ）のプロモーター、ヒト前立腺がん特異抗原（ＰＳＡ）のプロモーターおよびヒトアルファプロテイン（ＡＦＰ）のプロモーターなどの腫瘍マーカーとなり得る分子のプロモーター領域や、異常な細胞***、細胞増殖が起きるときに働く、たとえば細胞周期に関する遺伝子プロモーターなどがあげられ、多くの種類のがん細胞に広範に特異的にプロモーター活性を示し、かつ正常細胞には活性が非常に限られているという点からｈＴＥＲＴのプロモーターが好ましい。これらのプロモーター領域としては、プロモーター活性を有する限り、種々の長さのものが使用でき、たとえば、ｈＴＥＲＴのプロモーター領域としては、−３７８〜＋７７、−１８１〜＋７７および−３７８〜＋１０などがあげられる。また、これらプロモーターの塩基配列においては、数個の塩基が置換、欠失または付加された配列も、がん細胞特異的に遺伝子発現を誘導し得る限り、本発明のプロモーター領域として使用することができる。   The promoter used in the present invention can induce gene expression specifically in cancer cells and can be distinguished from normal cells, that is, can express genes only in cancer cells. Can be used without any particular restrictions. Specifically, a promoter region of a molecule that can serve as a tumor marker, such as a human telomerase gene (hTERT) promoter, a human prostate cancer specific antigen (PSA) promoter, or a human alpha protein (AFP) promoter, or abnormal cell division It works when cell proliferation occurs, such as gene promoters related to the cell cycle, and has a broad and specific promoter activity in many types of cancer cells, and the activity is very limited in normal cells The hTERT promoter is preferable in view of the above. These promoter regions can have various lengths as long as they have promoter activity. Examples of hTERT promoter regions include -378 to +77, -181 to +77, and -378 to +10. . Further, in the base sequences of these promoters, sequences in which several bases are substituted, deleted or added can be used as the promoter region of the present invention as long as gene expression can be specifically induced in cancer cells. it can.

本発明で使用されるベクターとしては、アデノウイルスベクターやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクターなどがあげられ、安全かつ効率的に目的遺伝子の導入が可能なものであれば、特に制限されるものではない。   Examples of vectors used in the present invention include viral vectors such as adenovirus vectors and adeno-associated virus vectors, plasmid vectors, phage vectors, and the like, as long as the target gene can be introduced safely and efficiently, There is no particular limitation.

これらベクターの中でも、アデノウイルスベクターは、風邪ウイルスとしてごくありふれたものであり、一般に利用されているものであれば、どのようなものでも使用することができるが、ウイルス増殖の観点から自己複製できないものを使用することが好ましい。そのようなアデノウイルスベクターとしては、たとえば人為的にＥ１ＡおよびＥ３領域を欠失させたもの、アデノキメラウイルス、改良型アデノウイルスベクターなど市販されているものを使用することができる。   Among these vectors, the adenovirus vector is a common cold virus and can be used as long as it is commonly used, but it cannot self-replicate from the viewpoint of virus propagation. It is preferable to use one. As such an adenovirus vector, for example, commercially available products such as artificially deleted E1A and E3 regions, adenochimeric virus, improved adenovirus vector and the like can be used.

自己複製ができないアデノウイルスベクターを使用する場合、相当する欠失領域を有するパッケージング細胞を用いて相同組換えを行なう必要がある。パッケージング細胞としては、Ｅ１ＡおよびＥ３領域を有するＨＥＫ２９３細胞（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団製）などがあげられる。   When using an adenovirus vector that is not capable of self-replication, it is necessary to perform homologous recombination using a packaging cell having a corresponding deletion region. Examples of the packaging cell include HEK293 cells (manufactured by Human Science Promotion Foundation) having E1A and E3 regions.

本発明のベクターは、その他、製造過程で有用となる制限酵素切断部位などの付加的な塩基配列、公知の薬物耐性遺伝子、ＧＦＰ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグなどを含有することができる。   The vector of the present invention includes additional base sequences such as restriction enzyme cleavage sites that are useful in the production process, marker genes such as known drug resistance genes, GFP gene, and luciferase gene, FLAG tag, His tag, Myc tag , V5 tags and the like.

本発明の血管新生阻害薬において使用されるベクターは以下に例示する方法により得ることができる。
（１）がん細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域、たとえばｈＴＥＲＴを含むプラスミドを適当な制限酵素で切断し、プロモーター領域を切り出す工程、
（２）血管新生阻害遺伝子、たとえばＲＧＤ−α３ＮＣ１を含むプラスミドのプロモーター領域を適当な制限酵素で切断し、かわりに（１）で得られるがん細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域を適当なリガーゼで連結する工程、
（３）（２）で得られるプラスミドを適当な制限酵素で切断して目的遺伝子を含む発現コンストラクトを得、適当なベクターに組み込む工程、および
（４）（３）で得られるベクターを宿主細胞にパッケージングし、増幅させ、遠心分離により組換えベクター（たとえば、ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１）を精製する工程
を含む方法。 The vector used in the angiogenesis inhibitor of the present invention can be obtained by the method exemplified below.
(1) cleaving a promoter region of a gene specifically expressed in cancer cells, for example, a plasmid containing hTERT with an appropriate restriction enzyme, and cutting out the promoter region;
(2) The promoter region of a plasmid containing an angiogenesis inhibiting gene, for example, RGD-α3NC1, is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and instead of the promoter region of the gene specifically expressed in cancer cells obtained in (1) Connecting with ligase,
(3) cleaving the plasmid obtained in (2) with an appropriate restriction enzyme to obtain an expression construct containing the target gene and incorporating it into an appropriate vector; and (4) introducing the vector obtained in (3) into a host cell. A method comprising the steps of packaging, amplifying, and purifying a recombinant vector (eg, hTERT / RGD-α3NC1) by centrifugation.

本発明の血管新生阻害薬を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターの場合は、単に細胞と接触させ感染させるだけで導入することができ、非ウイルスベクターの場合は、リポフェクション法、ＨＶＪリポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などを使用することができる。   As a method for introducing the angiogenesis inhibitor of the present invention into a cell, in the case of a viral vector, it can be introduced simply by contacting the cell and infecting it. In the case of a non-viral vector, the lipofection method, HVJ liposome Method, electroporation method, calcium phosphate method and the like can be used.

本発明の血管新生阻害薬は、単独で使用してもよく、また他の医薬成分やがんに対する治療、たとえば化学療法や放射線療法などと組み合わせて使用することもできる。   The angiogenesis inhibitor of the present invention may be used alone, or may be used in combination with other pharmaceutical ingredients or cancer treatments such as chemotherapy and radiation therapy.

本発明の血管新生阻害薬の投与経路としては、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。たとえば、経口投与、経気管投与または非経口経路があげられ、非経口経路としては、たとえばがん組織内直接投与、経静脈的投与などが挙げられ、効率、安全性、患者への負担、副作用などの点から、可能であればがん組織内直接投与が望ましい。   As an administration route of the angiogenesis inhibitor of the present invention, either systemic administration or local administration can be selected. For example, oral administration, tracheal administration or parenteral route can be mentioned, and examples of parenteral routes include direct administration into cancer tissue, intravenous administration, etc., efficiency, safety, burden on patients, side effects In view of the above, direct administration into cancer tissue is desirable if possible.

本発明の血管新生阻害薬は、単回投与より、間欠投与を行なう方が治療効果の観点から好ましい。   The angiogenesis inhibitor of the present invention is preferably administered intermittently rather than single administration from the viewpoint of therapeutic effect.

本明細書において、「間欠投与」とは、遺伝子治療を繰り返し行なうことを意味し、たとえば、１回の投与量は好ましくは、ウイルスベクターの場合ウイルス量で１×１０⁹〜１×１０¹²ｐｆｕ／ｋｇ、非ウイルスベクターの場合１μｇ〜１００ｇ／ｋｇであり、間欠的に少なくとも２回以上投与することが好ましい。投与間隔は特に制限されるものではないが、毎日１回〜３０日毎に１回が好ましく、副作用の観点から７〜１４日毎に１回がより好ましい。 In the present specification, “intermittent administration” means that gene therapy is repeatedly performed. For example, one dose is preferably 1 × 10 ⁹ to 1 × 10 ¹² pfu in the case of a virus vector. In the case of a non-viral vector, it is 1 μg to 100 g / kg, and it is preferable to administer at least twice intermittently. The administration interval is not particularly limited, but is preferably once every day to once every 30 days, and more preferably once every 7-14 days from the viewpoint of side effects.

しかしながら、投与量は、前記範囲に限定されるものではなく、投与形態、投与経路、患者の状態（体重、年齢、病状など）などに応じて適宜選択される。   However, the dose is not limited to the above range, and is appropriately selected according to the administration form, administration route, patient condition (weight, age, medical condition, etc.) and the like.

本発明の血管新生阻害薬の剤形としては、従来から使用されている種々の剤形のうち、投与経路に適したものを適宜選択することができる。たとえば、カプセル剤、噴霧剤、注射剤または点滴剤などの液剤、ゲル、またはリポソーム製剤など、通常ベクターを含有する製剤において多用される剤形を制限なく使用でき、効率および安全性の点から液剤が好ましい。さらに、本発明の血管新生阻害薬は、液剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。   As a dosage form of the angiogenesis inhibitor of the present invention, among various conventionally used dosage forms, one suitable for the administration route can be appropriately selected. For example, liquid forms such as capsules, sprays, injections or infusions, gels, liposome preparations, and the like, which are commonly used in preparations usually containing vectors, can be used without limitation. Is preferred. Furthermore, the angiogenesis inhibitor of the present invention can be used as a liquid agent, and after lyophilized and stored, it can be dissolved in a buffer solution containing water, saline, etc. at the time of use. It is also possible to use after adjusting to an appropriate concentration.

本発明の血管新生阻害薬は、活性成分のみならず、剤形に合わせて通常使用される医薬用の担体を使用することができる。そのような担体としては、製剤の剤形に応じて通常使用される、賦形剤、安定化剤、充填剤、増粘剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、希釈剤などを添加することができる。   As the angiogenesis inhibitor of the present invention, not only the active ingredient but also a pharmaceutical carrier usually used in accordance with the dosage form can be used. As such carriers, excipients, stabilizers, fillers, thickeners, binders, disintegrants, lubricants, diluents, etc. that are usually used depending on the dosage form of the preparation should be added. Can do.

安定化剤としては、たとえば、ヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などがあげられ、これらは単独でまたは界面活性剤などと組み合わせて使用することができる。   Examples of the stabilizer include human serum albumin, ordinary L-amino acids, saccharides, cellulose derivatives and the like, and these can be used alone or in combination with a surfactant.

本発明を以下の実施例によりさらに詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   The present invention will be described in further detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.

培養細胞株の購入先および、培養条件
ヒト前立腺癌ＤＵ１４５細胞およびＰＣ３細胞ならびにヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞およびヒト肺癌Ｈ１２９９細胞は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から購入した。ＤＵ１４５細胞、ＰＣ３細胞、ＨＴ１０８０細胞およびＨ１２９９細胞は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、ＪＲＨ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０(シグマ、セントルイス、ＭＯ)を用いて培養した。ヒト臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ細胞、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、サンディエゴ、カリホルニア)は、ＥＧＭ−２で培養した。ヒト***角化細胞(ＨＦＫ細胞；カスケード バイオロジクス（Cascade Biologics）、オレゴン、米国)は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＫ１１０−ＴｙｐｅＩＩ培池（Ｋｙｏｋｕｔｏ製薬、東京、日本）で培養した。ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＳＦ細胞）は、成人ボランティアから供給され、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンの入ったＤＭＥＭで培養した。ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３細胞は財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より購入し１０％ＦＣＳの入ったＭＥＭで培養した。
全ての実験は継代数３〜６の細胞を用いた。継代はＰＢＳ（−）＋０．０２％ＥＤＴＡで細胞を培養皿からはがした後、約１０％細胞密度になるように細胞を新たな培養皿にまくことで行ない、細胞培養はＣＯ₂インキュベーター（３７℃、９５％湿度、３％ＣＯ₂濃度）を用いた。統計解析は対応の無いｔ検定テストにより行ない、Ｐ値＜０．０５を統計的有意とした。 Purchasers of culture cell lines and culture conditions Human prostate cancer DU145 cells and PC3 cells, human fibrosarcoma HT1080 cells, and human lung cancer H1299 cells were purchased from ATCC (American Type Culture Collection). DU145 cells, PC3 cells, HT1080 cells and H1299 cells are DMEM or RPMI1640 (Sigma, St. Louis, with 10% fetal bovine serum (FBS, JRH, Bioscience, Lenexa, KS), 100 U / ml penicillin and 100 U / ml streptomycin. MO). Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC cells, Clonetics, San Diego, Calif.) Were cultured in EGM-2. Human foreskin keratinocytes (HFK cells; Cascade Biologics, Oregon, USA) are K110-Type II culture ponds (Kyokuto Pharmaceutical, Tokyo, Japan) supplemented with 10% FBS, 100 U / ml penicillin and 100 U / ml streptomycin. ). Human skin fibroblasts (HSF cells) were supplied from adult volunteers and cultured in DMEM containing 10% FBS, 100 U / ml penicillin and 100 U / ml streptomycin. Human embryonic kidney cells HEK293 cells were purchased from the Human Science Foundation and cultured in MEM containing 10% FCS.
All experiments used cells with passage numbers 3-6. Passaging PBS (-) + After the cells are detached from culture dishes with 0.02% EDTA, performed by seeding the cells to about 10% cell density into new culture dishes, cell culture CO ₂ incubator (37 ° C., 95% humidity, 3% CO ₂ concentration) was used. Statistical analysis was performed by an unmatched t-test, and a P value <0.05 was considered statistically significant.

［試験例１］
各細胞におけるｈＴＥＲＴｍＲＮＡの発現量の比較
各細胞は６ｃｍ培養皿を使用し９０％細胞密度になるまで培養後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。全ＲＮＡ量は、ＲＮＡ−Ｓｔａｔ６０（テル−テスト フレンズウッド（Tel-Test, Friendswood）、テキサス、米国）を取り扱い説明書に従って培養細胞から抽出した。ｈＴＥＲＴｍＲＮＡの定量は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ機器（ロッシュ ダイアグノスティクス製）を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ ｈＴＥＲＴ定量化キット（ロッシュ ダイアグノスティクス製）により行なった。ｈＴＥＲＴシグナルは、コントロールとしてポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）ｍＲＮＡの割合により標準化し、ＤＵ１４５細胞におけるｈＴＥＲＴのｍＲＮＡ発現レベルを１として他の細胞と比較した。各細胞の結果は、３つの独立した実験からの平均±ＳＤで示す（図１）。レーン１〜６はそれぞれＤＵ１４５細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＰＣ３細胞、Ｈ１２９９細胞、ＨＳＦおよびＨＦＫ示す。 [Test Example 1]
Comparison of the expression level of hTERT mRNA in each cell Each cell was cultured using a 6 cm culture dish until the cell density reached 90%, and then washed twice with PBS (−). For the total RNA amount, RNA-Stat60 (Tel-Test, Friendswood, Texas, USA) was extracted from cultured cells according to the instruction manual. Quantification of hTERT mRNA was performed by a LightCycler TeloTAGGG hTERT quantification kit (Roche Diagnostics) using a LightCycler instrument (Roche Diagnostics) by real-time RT-PCR. The hTERT signal was normalized by the proportion of porphobilinogen deaminase (PBGD) mRNA as a control, and compared with other cells by setting the mRNA expression level of hTERT in DU145 cells to 1. Results for each cell are shown as mean ± SD from three independent experiments (FIG. 1). Lanes 1-6 show DU145 cells, HT1080 cells, PC3 cells, H1299 cells, HSF and HFK, respectively.

がん細胞株においては、細胞の種類によってｈＴＥＲＴｍＲＮＡ発現量に差はあるものの、いずれの細胞株においてもｈＴＥＲＴｍＲＮＡは発現している（図１、レーン１〜４）。一方、正常細胞株においては、ｈＴＥＲＴｍＲＮＡ発現は確認されなかった（図１、レーン５および６）。この結果、ｈＴＥＲＴの発現はがん細胞株に特異的であることが確認された。   In cancer cell lines, although there is a difference in hTERT mRNA expression level depending on the cell type, hTERT mRNA is expressed in all cell lines (FIG. 1, lanes 1 to 4). On the other hand, hTERT mRNA expression was not confirmed in normal cell lines (FIG. 1, lanes 5 and 6). As a result, it was confirmed that the expression of hTERT is specific to the cancer cell line.

［実施例１］
（Ａ）プラスミドの構築
ルシフェラーゼ発現プラスミドであるｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）にｈＴＥＲＴプロモーターを組み込んだベクターｐＧＬ３−３７８（図２参照、金沢大学 京哲先生より提供：(参考文献)高倉ら、Cancer Research, 59:551-557, 1999）と、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの下流に、５′側にＢＭ４０シグナルペプチドとＦＬＡＧタグおよび３′側にｐｏｌｙＡを付加したＲＧＤ−α３ＮＣ１ｃＤＮＡを有するベクター（ｐＣＭＶ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１）（図２参照、バンダービルト大学ビリーハドソン教授より提供：(参考文献)プチクラークら、J.Biol.Chem., 275(11):8051-8061, 2000）とを以下の条件にて組み合わせた。 [Example 1]
(A) Construction of plasmid Vector pGL3-378 in which hTERT promoter is incorporated into pGL3-Basic vector (Promega), which is a luciferase expression plasmid (see FIG. 2, provided by Dr. Kyotetsu Kanazawa University) (Reference) Takakura et al. Cancer Research, 59: 551-557, 1999) and a vector having RGD-α3NC1 cDNA with BM40 signal peptide and FLAG tag on the 5 ′ side and polyA on the 3 ′ side downstream of the cytomegalovirus (CMV) promoter ( pCMV / RGD-α3NC1) (see FIG. 2, provided by Professor Billy Hudson, Vanderbilt University: (reference) Petit Clark et al., J. Biol. Chem., 275 (11): 8051-8061, 2000) Combined with conditions.

ｈＴＥＲＴプロモーター領域（ジーンバンク、Ｎｏ．ＡＢ０１６７６７の−３７８から＋７７に相当）をｐＧＬ３−３７８からMluI/HindIII切断部位にて３７℃で３時間反応させて切り出した後、ｐＣＭＶ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１のＣＭＶプロモーター領域のMluI/HindIII切断部位にＴ４ＤＮＡリガーゼで１４℃一晩反応させて置き換え、ｈＴＥＲＴプロモーター領域およびＲＧＤ−α３ＮＣ１を含むプラスミド（ｐｈｒｋ８）を作製した（図２参照）。   The hTERT promoter region (equivalent to −378 to +77 of Genebank No. AB016767) was excised from pGL3-378 by reacting at 37 ° C. for 3 hours at the MluI / HindIII cleavage site, and then the CMV promoter of pCMV / RGD-α3NC1 The MluI / HindIII cleavage site of the region was replaced with T4 DNA ligase by overnight reaction at 14 ° C. to prepare a plasmid (phrk8) containing the hTERT promoter region and RGD-α3NC1 (see FIG. 2).

（Ｂ）アデノウイルス組換え体の調製
前記（Ａ）で得られたプラスミドｐｈｒｋ８からMluI/XhoI切断部位よりｈＴＥＲＴプロモーターおよびＲＧＤ−α３ＮＣ１遺伝子を３７℃２時間反応させて切り出し、アデノウイルスゲノムからＥ１領域とＥ３領域を除いたコスミドベクター（ｐＡＦＣ３）のMluI/XhoI部位へ連結（１６℃、２時間）した（図３参照）。得られたライゲーション産物は、インビトロパッケージングキット(ニッポンジーン社製)を用いて添付のプロトコールに従い、λファージにパッケージング後、E.coliに感染させ作製した、発現ユニットを連結したｐＡＦＣ３をＨＥＫ２９３細胞へリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）でトランスフェクションし、増殖させ、遠心分離法にてウイルス成分を取り出すことで組換えアデノウイルスベクターｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１を作製した。 (B) Preparation of Adenovirus Recombinant The hTERT promoter and RGD-α3NC1 gene were excised from the plasmid phrk8 obtained in (A) above from the MluI / XhoI cleavage site by reacting at 37 ° C. for 2 hours, and E1 region from the adenovirus genome. And ligated to the MluI / XhoI site of the cosmid vector (pAFC3) excluding the E3 region (16 ° C., 2 hours) (see FIG. 3). The obtained ligation product was prepared by infecting E. coli with pAFC3, which was prepared by infecting E. coli after packaging into λ phage using an in vitro packaging kit (manufactured by Nippon Gene) according to the attached protocol to HEK293 cells. Recombinant adenovirus vector hTERT / RGD-α3NC1 was prepared by transfection with Lipofectamine 2000 (Invitrogen), growing, and removing the viral component by centrifugation.

ネガティブコントロールとして、がん細胞を含む全ての細胞において一定の発現量をもたらすことが知られているＣＡＧプロモーターを有し、その下流にレポーター遺伝子としてｌａｃＺ遺伝子を持つアデノウイルスＣＡＧ／ｌａｃＺ(ｃｌｏｎｅ、ＡｘＣＡＬａｃＺ、理化学研究所製)も同様にＨＥＫ２９３細胞にリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）でトランスフェクションし増殖させ、遠心分離法にてウイルス成分を取り出すことで組換えアデノウイルスベクターＣＡＧ／ｌａｃＺを分離精製した。   As a negative control, an adenovirus CAG / lacZ (clone, AxCALacZ having a CAG promoter known to bring a constant expression level in all cells including cancer cells and having a lacZ gene downstream as a reporter gene. (Manufactured by RIKEN) was similarly transfected into HEK293 cells with Lipofectamine 2000 (Invitrogen), proliferated, and virus components were removed by centrifugation to separate and purify the recombinant adenoviral vector CAG / lacZ. .

（Ｃ）細胞への遺伝子導入
ＤＵ１４５細胞を、２４ウェルプレートに培養液５００μｌ中５×１０⁴〜１×１０⁵細胞数／ウェルの濃度で培養した。２４時間後この細胞にプラスミドｐＣＭＶ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１または組換えアデノウイルスベクターＣＡＧ／ｌａｃＺもしくはｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１を以下の手順で導入した。 (C) Gene transfer to cells DU145 cells were cultured in a 24-well plate at a concentration of 5 × 10 ⁴ to 1 × 10 ⁵ cells / well in 500 μl of culture medium. After 24 hours, plasmid pCMV / RGD-α3NC1 or recombinant adenoviral vector CAG / lacZ or hTERT / RGD-α3NC1 was introduced into the cells by the following procedure.

プラスミド
１．０μｇのｐＣＭＶ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１をリポフェクトアミン２０００(１μｌ)（インビトロジェン社）とマイクロチューブ内で混合し、各ウェルにそれぞれ全量を加え遺伝子を導入した。さらに一晩静置し、翌日に培養上清を新しい培地に交換した。 Plasmid 1.0 μg of pCMV / RGD-α3NC1 was mixed with Lipofectamine 2000 (1 μl) (Invitrogen) in a microtube, and the entire amount was added to each well to introduce the gene. Furthermore, it was left still overnight, and the culture supernatant was replaced with a new medium on the next day.

アデノウイルスベクター
ＣＡＧ／ｌａｃＺまたはｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１（１×１０⁹ｐｆｕ）を感染効率（ＭＯＩ：multiplicity of infection）１００で感染させた。なお、ＭＯＩはＣＡＧ／ｌａｃＺとＤＵ１４５細胞とを用い、既知の方法にしたがいＬａｃＺの濃度により最適値を求めた。 Adenoviral vectors CAG / lacZ or hTERT / RGD-α3NC1 (1 × 10 ⁹ pfu) were infected with an infection efficiency (MOI) of 100. The MOI used CAG / lacZ and DU145 cells, and the optimum value was determined by the LacZ concentration according to a known method.

［試験例２］
（Ａ）ＲＧＤ−α３ＮＣ１の発現の確認
前記実施例１の（Ｃ）で得られた各ＤＵ１４５細胞を４８時間培養したのち、培養上清を採取し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）により浮遊細胞を除去した。このようにして得られたｐＣＭＶ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１、ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１またはＣＡＧ／ｌａｃＺを導入したＤＵ１４５細胞の培養上清は、それぞれ以下ＣＭ−ＮＣ１、ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１およびＣＭ−ｌａｃＺと表わす。 [Test Example 2]
(A) Confirmation of expression of RGD-α3NC1 After culturing each DU145 cell obtained in (C) of Example 1 for 48 hours, the culture supernatant is collected and centrifuged (3000 rpm, 10 minutes) for floating cells. Was removed. The culture supernatants of DU145 cells introduced with pCMV / RGD-α3NC1, hTERT / RGD-α3NC1 or CAG / lacZ thus obtained are hereinafter referred to as CM-NC1, CM-RGD-α3NC1 and CM-lacZ, respectively. .

培養上清中のＲＧＤ−α３ＮＣ１は、以下の手順でウエスタンブロット法により確認した。各上清に２×サンプルバッファー（シグマ社）を加え、１００℃で５分間加熱した。サンプルは各１２μｌずつ各レーン（レーン１〜３は、それぞれＣＭ−ＮＣ１、ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１およびＣＭ−ｌａｃＺに対応）に流した。１２％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を２００Ｖ、２０ｍＡで１時間行なった後にゲル中のタンパク質をニトロセルロースメンブレンに２０Ｖで一晩転写した。転写後に、２５℃で１時間、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）に終濃度５％となるように加えたスキムミルクで非特異反応を抑えた。ニトロセルロースメンブレンは、一次抗体（マウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（シグマ社）またはラット抗ヒトα３（ＩＶ）コラーゲンモノクローナル抗体（Ｈ３１）（重井医学研究所より購入）で室温（２５℃）にて１：１００の濃度比にて１時間反応させた。過剰な抗体をＰＢＳ−Ｔ液中で５分間、３回洗い落とした後、二次抗体で反応させた。二次抗体としては、西洋ワサビ過酸化酵素で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社）または西洋ワサビ過酸化酵素で標識したウサギ抗ラットＩｇＧ抗体(ジャクソン社)を用いた。反応は１：２０００の濃度比で２５℃１時間行ない、反応後に過剰な抗体を一次抗体のときと同様に、ＰＢＳ−Ｔにて５分間、３回洗浄した。   RGD-α3NC1 in the culture supernatant was confirmed by Western blotting according to the following procedure. 2 × sample buffer (Sigma) was added to each supernatant and heated at 100 ° C. for 5 minutes. Samples were run in 12 μl each to each lane (lanes 1 to 3 correspond to CM-NC1, CM-RGD-α3NC1 and CM-lacZ, respectively). After electrophoresis on a 12% polyacrylamide gel at 200 V and 20 mA for 1 hour, the protein in the gel was transferred to a nitrocellulose membrane at 20 V overnight. After the transfer, nonspecific reaction was suppressed with skim milk added to PBS (PBS-T) containing 0.1% Tween 20 at a final concentration of 5% for 1 hour at 25 ° C. The nitrocellulose membrane is a primary antibody (mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma) or rat anti-human α3 (IV) collagen monoclonal antibody (H31) (purchased from Shigei Medical Research Institute) at room temperature (25 ° C.) 1: 100. The excess antibody was washed out 3 times for 5 minutes in PBS-T solution and then reacted with the secondary antibody.The secondary antibody was horseradish peroxidase. A labeled rabbit anti-mouse IgG antibody (Jackson) or a rabbit anti-rat IgG antibody (Jackson) labeled with horseradish peroxidase was used at a concentration ratio of 1: 2000 at 25 ° C. for 1 hour. Excess antibody was washed 3 times with PBS-T for 5 minutes in the same manner as for the primary antibody.

反応物は化学発光法であるＥＣＬ（enhanced chemiluminescence）法にて、キット（ＥＣＬプラス、アマシャム社）を使用し、キット添付のプロトコールに従い、プラスチック製ラップフィルムを机上に敷き、その上にブロッティング膜のタンパク質吸着側が上側になるように置き、溶液Ａと溶液Ｂとを１：１で混合し（発光用混合液）、ブロッティング膜に対して約０．１２５ｍｌ／ｃｍ²になる量を加え１分間反応させた。キムワイプで膜上の余分な混合液を取り除き、膜を充分に包める程度の大きさの新しいプラスチック製ラップフィルムにタンパク質吸着側の面が下側になるようにブロッティング膜を置いた。次に、化学発光をＬＡＳ−１０００ミニ（富士フィルム社製）にてメンブレンを撮影した。−２５℃の状態でカメラを作動させ、１０秒後、３０秒後、１分後、５分後にそれぞれ撮影し、画像をコンピューターに取り込んだ。 The reaction product is a chemiluminescent ECL (enhanced chemiluminescence) method, using a kit (ECL plus, Amersham), laying a plastic wrap film on a desk according to the protocol attached to the kit, and then placing a blotting membrane on it. Place the protein adsorbing side on top, mix solution A and solution B 1: 1 (mixture for luminescence), add about 0.125 ml / cm ² to the blotting membrane, and react for 1 minute I let you. The excess mixed solution on the membrane was removed with Kimwipe, and the blotting membrane was placed on a new plastic wrap film large enough to wrap the membrane with the protein adsorption side down. Next, the membrane was photographed for chemiluminescence with LAS-1000 Mini (manufactured by Fuji Film). The camera was operated at −25 ° C., 10 seconds later, 30 seconds later, 1 minute later, and 5 minutes later, and images were taken into a computer.

３０秒後の結果を図４Ａに示す。レーン１〜３は、それぞれＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１、ＣＭ−ＮＣ１およびＣＭ−ＣＡＧ／ｌａｃＺを示す。ＲＧＤ−α３ＮＣ１は、２８ｋＤａタンパク質としてマウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体で検出した。ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１（レーン１）ではＣＭ−ＮＣ１（レーン２）と比較して発現量は弱いが、発現を確認できた。   The result after 30 seconds is shown in FIG. 4A. Lanes 1 to 3 show CM-RGD-α3NC1, CM-NC1 and CM-CAG / lacZ, respectively. RGD-α3NC1 was detected with a mouse anti-FLAG M2 antibody as a 28 kDa protein. Although the expression level of CM-RGD-α3NC1 (lane 1) was weaker than that of CM-NC1 (lane 2), the expression could be confirmed.

（Ｂ）ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１感染ＤＵ１４５細胞におけるＲＧＤ−α３ＮＣ１の発現量の経時変化
前記実施例１の（Ｂ）と同様にしてｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１をＤＵ１４５細胞に感染させた。感染直後、感染後２４時間、感染後４８時間および感染後７２時間の全４回細胞上清を前記（Ａ）と同様にして採取し、マウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体で検出した。 (B) Time-dependent change of RGD-α3NC1 expression level in hTERT / RGD-α3NC1-infected DU145 cells In the same manner as in Example 1 (B), hTERT / RGD-α3NC1 was infected into DU145 cells. Immediately after the infection, 24 hours after the infection, 48 hours after the infection, and 72 hours after the infection, all the cell supernatants were collected in the same manner as in the above (A) and detected with the mouse anti-FLAG M2 antibody.

結果を図４Ｂに示す。レーン１〜４は、それぞれ感染直後、感染後２４時間、感染後４８時間および感染後７２時間に採取された細胞上清に対応する。ＲＧＤ−α３ＮＣ１の発現量は時間と共に増加しつづけることが７２時間後まで確認できた。   The results are shown in FIG. 4B. Lanes 1 to 4 correspond to cell supernatants collected immediately after infection, 24 hours after infection, 48 hours after infection and 72 hours after infection, respectively. It was confirmed that the expression level of RGD-α3NC1 continued to increase with time until 72 hours later.

（Ｃ）ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１を感染させた各種細胞におけるＲＧＤ−α３ＮＣ１の発現
前記実施例１の（Ｂ）と同様にしてｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１をＤＵ１４５細胞（レーン１）、ＰＣ３細胞（レーン２）、ＨＴ１０８０細胞（レーン３）、Ｈ１２９９細胞（レーン４）、ＨＳＦ細胞（レーン５）またはＨＦＫ細胞（レーン６）に感染させた。感染から４８時間に細胞上清を前記（Ａ）と同様にして採取し、マウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体で検出した。 (C) Expression of RGD-α3NC1 in various cells infected with hTERT / RGD-α3NC1 In the same manner as in Example 1 (B), hTERT / RGD-α3NC1 was expressed in DU145 cells (lane 1), PC3 cells (lane 2). ), HT1080 cells (lane 3), H1299 cells (lane 4), HSF cells (lane 5) or HFK cells (lane 6). Forty-eight hours after infection, the cell supernatant was collected in the same manner as in the above (A) and detected with a mouse anti-FLAG M2 antibody.

結果を図４Ｃに示す。ＲＧＤ−α３ＮＣ１は正常細胞であるＨＳＦ細胞やＨＦＫ細胞からのＣＭ中からは検出されず（レーン５および６）、がん細胞株からのみ検出された（レーン１〜４）。この結果から、ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１によるＲＧＤ−α３ＮＣ１の発現はがん細胞特異的であることが証明された。   The results are shown in FIG. 4C. RGD-α3NC1 was not detected in CM from normal cells such as HSF cells and HFK cells (lanes 5 and 6), but was detected only from cancer cell lines (lanes 1 to 4). From this result, it was proved that the expression of RGD-α3NC1 by hTERT / RGD-α3NC1 is specific to cancer cells.

［試験例３］
ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１による細胞増殖および細胞生存率への影響
（Ａ）各種細胞に対するＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１の影響
各細胞を９６ウェルプレート（７０００細胞個／ウェル）で２４時間培養した。その後細胞培養液を前記試験例２の（Ａ）で得られたＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１と交換し、４８時間培養した。細胞増殖の定量化はＢｒｄＵアッセイキット（オンコジーン社）を用いキットに添付のＢｒｄＵ使用プロトコールに従い測定した。ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１の代わりにＣＭ−ｌａｃＺで処置した各細胞と比較して相対的なパーセンテージとして検討した。実験はそれぞれｎ＝３で行ない、結果はそれらの平均±ＳＤで示した。 [Test Example 3]
Effect on cell proliferation and cell viability by CM-RGD-α3NC1 (A) Effect of CM-RGD-α3NC1 on various cells Each cell was cultured in a 96-well plate (7000 cells / well) for 24 hours. Thereafter, the cell culture solution was replaced with CM-RGD-α3NC1 obtained in (A) of Test Example 2 and cultured for 48 hours. Quantification of cell proliferation was measured using a BrdU assay kit (Oncogene) according to the BrdU protocol attached to the kit. Considered as a relative percentage compared to each cell treated with CM-lacZ instead of CM-RGD-α3NC1. Each experiment was performed with n = 3 and the results are shown as their mean ± SD.

結果を図５に示す。レーン１〜７は、それぞれＤＵ１４５細胞、ＰＣ３細胞、Ｈ１２９９細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＨＵＶＥＣ、ＨＦＫおよびＨＳＦを示す。血管新生阻害剤に感受性を示すと予想される内皮細胞であるＨＵＶＥＣ細胞（レーン５）の増殖が他細胞株と比較してＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１処置により抑制されたことが明らかとなった。これにより、ＲＧＤ−α３ＮＣ１が内皮細胞に特異的に増殖抑制をかけることが証明された。   The results are shown in FIG. Lanes 1-7 show DU145 cells, PC3 cells, H1299 cells, HT1080 cells, HUVEC, HFK, and HSF, respectively. It was revealed that the proliferation of HUVEC cells (lane 5), which are endothelial cells expected to be sensitive to angiogenesis inhibitors, was suppressed by CM-RGD-α3NC1 treatment as compared with other cell lines. This proved that RGD-α3NC1 specifically inhibits proliferation of endothelial cells.

（Ｂ）各上清による細胞増殖および細胞生存率への影響
前記（Ａ）と同様にＨＵＶＥＣ細胞を、ＣＭ−ｌａｃＺ（レーン１）、ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１（レーン２）またはＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１からＲＧＤ−α３ＮＣ１を除去したＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１ΔＦＬＡＧ（レーン３）で処理し、ＤＵ１４５細胞をＣＭ−ｌａｃＺ（レーン１）またはＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１（レーン２）で処理した。細胞増殖の定量化は前記（Ａ）と同様に行なった。細胞生存率は、ＭＴＴアッセイ（ケミコン）を用いて決定した。実験はそれぞれｎ＝３で行ない、結果はそれらの平均±ＳＤで示した。 (B) Effect on cell proliferation and cell viability by each supernatant As in (A) above, HUVEC cells were treated with CM-lacZ (lane 1), CM-RGD-α3NC1 (lane 2) or CM-RGD-α3NC1. Was treated with CM-RGD-α3NC1ΔFLAG (lane 3) from which RGD-α3NC1 was removed, and DU145 cells were treated with CM-lacZ (lane 1) or CM-RGD-α3NC1 (lane 2). Quantification of cell proliferation was performed in the same manner as (A) above. Cell viability was determined using MTT assay (Chemicon). Each experiment was performed with n = 3 and the results are shown as their mean ± SD.

細胞増殖の結果を図６に、細胞生存率の結果を図７に示す。   The results of cell proliferation are shown in FIG. 6, and the results of cell viability are shown in FIG.

ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１は有意にＨＵＶＥＣの増殖を抑制した（図６（Ａ）、レーン２）が、ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１ΔＦＬＡＧは増殖の抑制を引き起こさなかった（図６（Ａ）、レーン３）。この結果により、内皮細胞であるＨＵＶＥＣの増殖を抑制するのは、ＲＧＤ−α３ＮＣ１そのものであり、上清中のほかの成分ではないことが明らかになった。これに対し、ＤＵ１４５細胞の増殖はＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１によって抑制されなかった（図６（Ｂ）、レーン２）。これらの結果より、ＲＧＤ−α３ＮＣ１が、がん細胞ではなく、内皮細胞の増殖を抑制することが示された（図６（Ａ）および（Ｂ））。   CM-RGD-α3NC1 significantly suppressed the proliferation of HUVEC (FIG. 6 (A), lane 2), whereas CM-RGD-α3NC1ΔFLAG did not cause the suppression of proliferation (FIG. 6 (A), lane 3). From this result, it was clarified that RGD-α3NC1 itself suppresses the growth of HUVEC, which is an endothelial cell, and not other components in the supernatant. In contrast, the proliferation of DU145 cells was not suppressed by CM-RGD-α3NC1 (FIG. 6B, lane 2). From these results, it was shown that RGD-α3NC1 suppresses proliferation of endothelial cells, not cancer cells (FIGS. 6A and 6B).

また、ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１はＨＵＶＥＣ細胞の生存率をも有意に低下させた（図７（Ａ）、レーン２）、一方、ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１ΔＦＬＡＧはＨＵＶＥＣ細胞の生存率に影響を与えなかった（図７（Ａ）、レーン３）これにより、内皮細胞であるＨＵＶＥＣの生存率を低下させるのは、ＲＧＤ−α３ＮＣ１そのものであり、上清中の他の成分ではないことが明らかとなった。一方で、がん細胞であるＤＵ１４５細胞の生存率にはＲＧＤ−α３ＮＣ１が影響を及ぼさないことが明らかとなった（図７（Ｂ）、レーン２）。   CM-RGD-α3NC1 also significantly reduced the survival rate of HUVEC cells (FIG. 7 (A), lane 2), whereas CM-RGD-α3NC1ΔFLAG did not affect the survival rate of HUVEC cells. (FIG. 7 (A), lane 3) Thus, it became clear that RGD-α3NC1 itself decreased the survival rate of HUVEC, which is an endothelial cell, and not other components in the supernatant. On the other hand, it was revealed that RGD-α3NC1 does not affect the survival rate of DU145 cells, which are cancer cells (FIG. 7B, lane 2).

なお、ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１ΔＦＬＡＧは、ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１をＦＬＡＧ Ｍ２抗体アフィニティーゲル（シグマ社）と共に２時間４℃で反応させ、ゲルと結合した上清中のＲＧＤ−α３ＮＣ１を遠心分離（４０００ｒｐｍ、２分、４℃）し、ＲＧＤ−α３ＮＣ１を除去することにより作製した。   CM-RGD-α3NC1ΔFLAG was prepared by reacting CM-RGD-α3NC1 with FLAG M2 antibody affinity gel (Sigma) for 2 hours at 4 ° C., and centrifuging RGD-α3NC1 in the supernatant bound to the gel (4000 rpm, 2 minutes, 4 ° C.), and prepared by removing RGD-α3NC1.

［試験例４］
各細胞における細胞表面インテグリンαｖβ３の発現
αｖβ３インテグリンの発現はフローサイトメトリーで行なった。操作はすべて氷上で行なった。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液１ｍｌに各細胞（１×１０⁶）を懸濁し、これにＬＭ６０９（αｖβ３に対する抗体、ケミコン）１０μｌずつ添加し、３０分〜１時間インキュベートした。陰性コントロールとしてはフローサイトメトリー用のＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ１（ＢＤファーミンゲン社）を用いた。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液１ｍｌで２回洗浄し、遠心分離は３００ｇ、５分、４℃で行なった。その後、回収した細胞を再度１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液１ｍｌに懸濁し、抗マウスＦＩＴＣ抗体を１０μｌ添加し、３０〜４５分インキュベートした。陰性コントロールにおいては、洗浄後回収した細胞を、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液１００μｌに懸濁し、抗マウスＦＩＴＣ抗体は４０μｌ添加した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液１ｍｌで２回洗浄し、遠心分離は３００ｇ、５分、４℃で行なった。その後、回収した細胞を再度１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液１０ｍｌに懸濁し、フローサイトメトリーにより、抗体購入時に添付されているプロトコールに従いＦＬ１で蛍光を検出した。 [Test Example 4]
Expression of cell surface integrin αvβ3 in each cell Expression of αvβ3 integrin was performed by flow cytometry. All operations were performed on ice. Each cell (1 × 10 ⁶ ) was suspended in 1 ml of 1% BSA-containing PBS solution, 10 μl of LM609 (antibody against αvβ3, Chemicon) was added thereto, and incubated for 30 minutes to 1 hour. As a negative control, FITC-conjugated anti-mouse IgG1 (BD Pharmingen) for flow cytometry was used. The plate was washed twice with 1 ml of 1% BSA-containing PBS solution and centrifuged at 300 g for 5 minutes at 4 ° C. Thereafter, the collected cells were suspended again in 1 ml of 1% BSA-containing PBS solution, 10 μl of anti-mouse FITC antibody was added, and incubated for 30 to 45 minutes. In the negative control, the cells collected after washing were suspended in 100 μl of 1% BSA-containing PBS solution, and 40 μl of anti-mouse FITC antibody was added. The plate was washed twice with 1 ml of 1% BSA-containing PBS solution and centrifuged at 300 g for 5 minutes at 4 ° C. Thereafter, the collected cells were suspended again in 10 ml of 1% BSA-containing PBS solution, and fluorescence was detected with FL1 by flow cytometry according to the protocol attached at the time of antibody purchase.

１０，０００個の細胞をカウントした結果をヒストグラムとして図８に示す。灰色のヒストグラムはアイソタイプの一致したＩｇＧ１コントロールで得られた非特異的な蛍光を表し、黒線のヒストグラムは特異的な蛍光を表す。ＨＵＶＥＣ細胞は他の細胞株と比較して増殖抑制にかかわるタンパク質である細胞表面インテグリンαｖβ３を発現していることが示された（図８（Ｇ））。この結果は、ＲＧＤ−α３ＮＣ１の細胞増殖抑制作用には細胞表面インテグリンがかかわっていることを示唆する。   The result of counting 10,000 cells is shown in FIG. 8 as a histogram. Gray histograms represent non-specific fluorescence obtained with isotype matched IgG1 controls, and black line histograms represent specific fluorescence. HUVEC cells were shown to express cell surface integrin αvβ3, which is a protein involved in growth inhibition compared to other cell lines (FIG. 8 (G)). This result suggests that cell surface integrin is involved in the cell growth inhibitory action of RGD-α3NC1.

［試験例５］
ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１による内皮細胞の管腔形成抑制
ＨＵＶＥＣ細胞（５，０００個／ウェル）を、マトリジェルを敷いた９６ウェルプレートにて３７℃で２４時間培養することにより管腔形成させた後、ＣＭ−ｌａｃＺ、ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１またはＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１ΔＦＬＡＧをＨＵＶＥＣ細胞に加え、それぞれ２４時間３７℃でインキュベートし、光学顕微鏡で観察した（図９（Ａ）〜（Ｃ））。弱拡大での視野内の管腔形成の分岐数を数えた。結果は、３つの独立したウェルを数え、平均±ＳＤで示す（図９（Ｄ））。ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１（レーン２）はコントロール（ＣＭ−ｌａｃＺ（レーン１）およびＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１ΔＦＬＡＧ（レーン３））に比べ有意に管腔形成を低下させた。＊はｐ＜０．０５を示す。 [Test Example 5]
Inhibition of tube formation of endothelial cells by CM-RGD-α3NC1 After culturing HUVEC cells (5,000 cells / well) at 37 ° C. for 24 hours in a 96-well plate with matrigel spread, CM-lacZ, CM-RGD-α3NC1 or CM-RGD-α3NC1ΔFLAG was added to HUVEC cells, incubated for 24 hours at 37 ° C., respectively, and observed with a light microscope (FIGS. 9A to 9C). The number of branching of lumen formation in the field of view at low magnification was counted. Results are expressed as mean ± SD, counting 3 independent wells (FIG. 9D). CM-RGD-α3NC1 (lane 2) significantly reduced lumen formation compared to controls (CM-lacZ (lane 1) and CM-RGD-α3NC1ΔFLAG (lane 3)). * Indicates p <0.05.

この結果から、ＲＧＤ−α３ＮＣ１がＨＵＶＥＣ細胞の管腔形成を強く抑制することが明らかとなった。   From this result, it was revealed that RGD-α3NC1 strongly suppresses tube formation of HUVEC cells.

［実施例２］
ＤＵ１４５細胞を移植したＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの作製におけるインビボでのｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１遺伝子治療 [Example 2]
In vivo hTERT / RGD-α3NC1 gene therapy in the generation of BALB / C nude mice transplanted with DU145 cells

（Ａ）腫瘍モデルの作製
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本ＳＬＣ株式会社から購入）の皮下にＤＵ１４５細胞（１×１０⁶個）を接種した。腫瘍の大きさは、バーニアカリパス（Vernier calipers）で３〜４日おきに計測した。腫瘍が３５〜５０ｍｍ³の平均容積に達したマウスをモデルマウスとして以下の実験に使用した。 (A) Preparation of tumor model DU145 cells (1 × 10 ⁶ cells) were inoculated subcutaneously into 6-8 week old female BALB / c nude mice (purchased from Japan SLC Co., Ltd.). Tumor size was measured every 3-4 days with Vernier calipers. Mice whose tumors reached an average volume of 35-50 mm ³ were used as model mice in the following experiments.

（Ｂ）各組織におけるＲＧＤ−α３ＮＣ１の検出
前記（Ａ）で作製したモデルマウス（各群ｎ＝５）に１×１０⁹ｐｆｕのｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１またはＣＡＧ／ｌａｃＺを腫瘍内に注入した。１０日後に腫瘍、肝臓、腎臓、肺を切り出し、７μｍの切片を作製した。アセトン固定(２５℃、１０分)後、非特異反応を１％ウシアルブミン含有ＰＢＳにより２５℃で１時間ブロックした後に、一次抗体と共に４℃で一晩処理し、ＰＢＳで１０分×３回過剰な抗体を洗い落とした。その後、二次抗体で２５℃、２時間処理し、ＰＢＳで１０分×３回過剰な抗体を落とした。一次抗体には、ウサギポリクローナル抗−ＦＬＡＧ抗体（シグマ）、ラット抗−ＣＤ３１モノクローナル抗体（ＢＤバイオサイエンス社）または、Ｈ３１をそれぞれ、１：１００、１：１００、１：１０の濃度で用いた。二次抗体には、ヤギＦＩＴＣ−蛍光標識抗ウサギＩｇＧ抗体（モレュラープローブ社）を１：２００の濃度でおよびロバＣｙ３蛍光標識抗ラットＩｇＧ抗体を１：５００の濃度で用いて二重染色を行なった。二次抗体処理後、切片をＰＥＲＭＡＦＬＵＯＲ^TM(ベックマン)で封入し、蛍光顕微鏡にて観察した。 (B) Detection of RGD-α3NC1 in each tissue 1 × 10 ⁹ pfu of hTERT / RGD-α3NC1 or CAG / lacZ was injected into the tumor in the model mice (in each group n = 5) prepared in (A). Ten days later, the tumor, liver, kidney and lung were excised and 7 μm sections were prepared. After fixation with acetone (25 ° C., 10 minutes), the non-specific reaction was blocked with PBS containing 1% bovine albumin for 1 hour at 25 ° C., then treated with the primary antibody at 4 ° C. overnight, and excess for 10 minutes × 3 times with PBS. The antibody was washed away. Thereafter, the mixture was treated with the secondary antibody at 25 ° C. for 2 hours, and the excess antibody was removed with PBS for 10 minutes × 3 times. As the primary antibody, rabbit polyclonal anti-FLAG antibody (Sigma), rat anti-CD31 monoclonal antibody (BD Bioscience) or H31 was used at concentrations of 1: 100, 1: 100, and 1:10, respectively. The secondary antibody was double-stained with goat FITC-fluorescent labeled anti-rabbit IgG antibody (Molecular Probes) at a concentration of 1: 200 and donkey Cy3 fluorescently labeled anti-rat IgG antibody at a concentration of 1: 500. Was done. After the secondary antibody treatment, the sections were sealed with PERMAFLUOR ^™ (Beckman) and observed with a fluorescence microscope.

ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１治療腫瘍切片およびＣＡＧ／ｌａｃＺ治療腫瘍切片の二重染色蛍光顕微鏡写真をそれぞれ図１０（Ａ）および図１０（Ｂ）に示す。図中、ＦＩＴＣシグナル（緑）がＲＧＤ−α３ＮＣ１（符号ｂ）を、またＣｙ３シグナル（赤）がＣＤ３１（符号ｃ、赤）染色陽性領域として内皮細胞を示している。ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１治療腎臓切片の二重染色顕微鏡写真を図１１（Ａ）に、近接する切片のヘマトキシリン・エオジン染色を図１１（Ｂ）に示す。ＲＧＤ−α３ＮＣ１（符号ｂ）は腫瘍内にのみ発現しており（図１０（Ａ））、腎臓（図１１（Ａ））など他の臓器には見られなかった。また、ＣＡＧ／ｌａｃＺを用いた場合には、腫瘍においてもＲＧＤ−α３ＮＣ１（符号ｂ）の発現は見られず、さらにｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１治療群（図１０（Ａ））と比較して、内皮細胞を示すＣＤ３１（符号ｃ）染色陽性領域が多く確認された（図１０（Ｂ））。さらに、ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１で治療したマウスの腎臓には細胞浸潤などの炎症のあとは観察されなかった（図１１（Ｂ））。したがって、ＲＧＤ−α３ＮＣ１による自己免疫疾患の兆候はなく、このことからもＲＧＤ−α３ＮＣ１が腎臓において発現されていないことを示唆する。   Double-stained fluorescence micrographs of hTERT / RGD-α3NC1 treated tumor sections and CAG / lacZ treated tumor sections are shown in FIGS. 10 (A) and 10 (B), respectively. In the figure, FITC signal (green) indicates RGD-α3NC1 (symbol b), and Cy3 signal (red) indicates endothelial cells as CD31 (symbol c, red) staining positive regions. A double-stained micrograph of a hTERT / RGD-α3NC1-treated kidney section is shown in FIG. 11 (A), and hematoxylin-eosin staining of adjacent sections is shown in FIG. 11 (B). RGD-α3NC1 (symbol b) was expressed only in the tumor (FIG. 10 (A)) and was not found in other organs such as the kidney (FIG. 11 (A)). In addition, when CAG / lacZ was used, the expression of RGD-α3NC1 (symbol b) was not observed in the tumor, and compared with the hTERT / RGD-α3NC1 treatment group (FIG. 10 (A)), the endothelium Many CD31 (symbol c) staining positive areas indicating cells were confirmed (FIG. 10B). Furthermore, no inflammation after cell infiltration was observed in the kidneys of mice treated with hTERT / RGD-α3NC1 (FIG. 11 (B)). Therefore, there is no sign of autoimmune disease due to RGD-α3NC1, which also suggests that RGD-α3NC1 is not expressed in the kidney.

（Ｃ）単回投与および間欠投与
前記（Ａ）で作製したモデルマウス（各群ｎ＝５）の腫瘍内に、ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１（１×１０⁹ｐｆｕ）、ＣＡＧ／ｌａｃＺ（１×１０⁹ｐｆｕ）または溶媒（ＰＢＳ）を打ち込み、投与０日とした。単回投与治療では、この後腫瘍の大きさを随時計測し、投与２０日まで観察した。また、間欠投与では、同様に初回の投与を行なったのち、さらに７日毎に合計４回の投与を実施し、４回目の治療後は、新たな追加投与は実施しなかった。間欠投与治療においても、初回投与から随時腫瘍の大きさを計測し、観察した。腫瘍の容積は以下の計算式に基づき算出し、それぞれ投与０日との相対的なパーセンテージとして表した。
容積＝長さ×幅の二乗×０．５２ (C) Single administration and intermittent administration In the tumor of the model mouse (n = 5 for each group) prepared in (A), hTERT / RGD-α3NC1 (1 × 10 ⁹ pfu), CAG / lacZ (1 × 10 ⁹ pfu) or solvent (PBS) was injected, and the administration day 0 was reached. In single-dose treatment, the size of the tumor was then measured as needed and observed up to 20 days after administration. In the intermittent administration, after the same initial administration, a total of 4 administrations were carried out every 7 days, and no new additional administration was conducted after the fourth treatment. In the intermittent administration treatment, the size of the tumor was measured and observed from time to time. Tumor volume was calculated based on the following calculation formula and expressed as a percentage relative to day 0 of administration.
Volume = square of length x width x 0.52

なお腫瘍の大きさが１０００ｍｍ³を超えた段階で動物愛護の倫理的理由により、これ以上の苦痛を与えないようにペントバルビタール麻酔にてマウスを処理して観察終了とした。 When the tumor size exceeded 1000 mm ³ , the mouse was treated with pentobarbital anesthesia for the ethical reasons of animal welfare to prevent further pain and the observation was terminated.

単回投与治療におけるｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１治療群の投与２０日の腫瘍の大きさは、ＰＢＳ治療群およびＣＡＧ／ｌａｃＺ治療群と比較して有意に小さく、腫瘍の成長を抑制した（図１２Ａ）。その抑制効果は、投与１０日まで持続し、その後の成長率は他の治療群と同様であった（図１２Ａ）。   The tumor size on the 20th day of administration of the hTERT / RGD-α3NC1 treatment group in a single administration treatment was significantly smaller than that in the PBS treatment group and the CAG / lacZ treatment group, and suppressed tumor growth (FIG. 12A). . The inhibitory effect lasted until 10 days after administration, and the subsequent growth rate was the same as in the other treatment groups (FIG. 12A).

間欠投与治療におけるｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１治療群の投与２０日の腫瘍の大きさは、ＰＢＳ治療群およびＣＡＧ／ｌａｃＺ治療群と比較して有意に小さく、腫瘍の成長を抑制した（図１２Ｂ）。特に、間欠投与はがん細胞の休眠状態を成し遂げた。＊はｐ＜０．０５を示す。   The tumor size on day 20 of the hTERT / RGD-α3NC1 treatment group in the intermittent administration treatment was significantly smaller than that in the PBS treatment group and the CAG / lacZ treatment group, and the tumor growth was suppressed (FIG. 12B). In particular, intermittent administration achieved a dormant state of cancer cells. * Indicates p <0.05.

間欠投与開始６０日後のマウスの生存率を表１に示す。   Table 1 shows the survival rate of mice 60 days after the start of intermittent administration.

前述したように、腫瘍の大きさが１０００ｍｍ³を超えた段階でマウスをペントバルビタール処理したが、ＰＢＳ治療群では全例処理され、ＣＡＧ／ｌａｃＺ治療群では１匹しか残らなかったのに対して、ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１治療群では全例が６０日間生存した。 As described above, mice were treated with pentobarbital when the tumor size exceeded 1000 mm ³ , whereas all mice were treated in the PBS treatment group, whereas only one remained in the CAG / lacZ treatment group. In the hTERT / RGD-α3NC1 treatment group, all patients survived for 60 days.

（Ｄ）ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１処置による腫瘍血管新生抑制の免疫染色法による評価
腫瘍内の血管新生は免疫染色法にて検討した。前記（Ｂ）と同様にモデルマウスにｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１を投与し、投与１０日に腫瘍を切り出し、凍結保存した。クリオスタット（ライカ社製）にて６μｍの切片としてアセトン固定した。凍結腫瘍切片は、抗ＣＤ３１抗体で前記（Ｂ）の方法にて染色し、二次抗体を含む一連の発色反応には、ＭＡＸ−ＰＯキット（ニチレイ社製）を用い、光学顕微鏡により観察した(図１２Ａ、Ｂ、Ｃ)。微小血管密度の定量分析は異なる５視野(×２００)で陽性に染色されている細胞をカウントすることにより行なった(図１３Ｄ)。 (D) Evaluation of tumor angiogenesis inhibition by hTERT / RGD-α3NC1 treatment by immunostaining method Intratumor angiogenesis was examined by immunostaining method. Similarly to (B), hTERT / RGD-α3NC1 was administered to model mice, and tumors were excised and stored frozen on the 10th day after administration. Acetone was fixed as a 6 μm section with a cryostat (manufactured by Leica). The frozen tumor section was stained with the anti-CD31 antibody by the method (B), and the series of color reaction including the secondary antibody was observed with an optical microscope using a MAX-PO kit (manufactured by Nichirei) ( 12A, B, C). Quantitative analysis of microvessel density was performed by counting cells that stained positive in 5 different fields (× 200) (FIG. 13D).

ＰＢＳ処置群（図１３（Ａ））およびＣＡＧ／ｌａｃＺ治療群（図１３（Ｂ））では、腫瘍の中に血管内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１陽性細胞が多数観察され、腫瘍における活発な血管新生（符号ｅ）を示している。一方、ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１治療群では、腫瘍中のＣＤ３１陽性細胞は非常に少なかった（図１３（Ｃ））。微小血管密度の定量分析の結果を図１３（Ｄ）に示す。ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１処置したグループの腫瘍切片で有意に血管が少なかった。＊はｐ＜０．０５を示す。ＲＧＤ−α３ＮＣ１が発現した結果、がん組織での血管新生阻害効果が確認された。   In the PBS treatment group (FIG. 13 (A)) and the CAG / lacZ treatment group (FIG. 13 (B)), many CD31 positive cells, which are markers of vascular endothelial cells, were observed in the tumor, and active angiogenesis in the tumor (Symbol e) is shown. On the other hand, in the hTERT / RGD-α3NC1 treatment group, there were very few CD31-positive cells in the tumor (FIG. 13C). The result of quantitative analysis of microvessel density is shown in FIG. There were significantly fewer blood vessels in the tumor sections of the hTERT / RGD-α3NC1-treated group. * Indicates p <0.05. As a result of RGD-α3NC1 expression, an angiogenesis inhibitory effect in cancer tissues was confirmed.

各細胞におけるｈＴＥＲＴのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。レーン１〜６はそれぞれＤＵ１４５細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＰＣ３細胞、Ｈ１２９９細胞、正常線維芽細胞（ＨＳＦ）および正常皮膚角化細胞（ＨＦＫ）を示す。It is a graph which shows the expression level of hTERT mRNA in each cell. Lanes 1-6 show DU145 cells, HT1080 cells, PC3 cells, H1299 cells, normal fibroblasts (HSF) and normal skin keratinocytes (HFK), respectively. ｈＴＥＲＴプロモーターとＲＧＤ−α３ＮＣ１とを含有するプラスミドの製造方法を示すスキームである。図中、ＢＭ４０ＳＰはＢＭ４０シグナルペプチドを意味する。It is a scheme which shows the manufacturing method of the plasmid containing hTERT promoter and RGD- (alpha) 3NC1. In the figure, BM40SP means BM40 signal peptide. 本発明の組換えアデノウイルスベクターの一実施様態を示す概略図である。図中、ＢＭ４０ＳＰおよびＡｄ ＤＮＡは、それぞれＢＭ４０シグナルペプチドおよびアデノウイルスゲノムＤＮＡを意味する。It is the schematic which shows one embodiment of the recombinant adenovirus vector of this invention. In the figure, BM40SP and Ad DNA mean BM40 signal peptide and adenovirus genomic DNA, respectively. ＤＵ１４５細胞の細胞上清中に分泌されたタンパク質のウエスタンブロットの写真である。レーン１〜３は、それぞれｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１、ｐＣＭＶ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１およびＣＡＧ／ｌａｃＺを導入したＤＵ１４５細胞を示す。It is the photograph of the western blot of the protein secreted in the cell supernatant of DU145 cell. Lanes 1 to 3 show DU145 cells into which hTERT / RGD-α3NC1, pCMV / RGD-α3NC1 and CAG / lacZ were introduced, respectively. ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１を導入したＤＵ１４５細胞におけるＲＧＤ−α３ＮＣ１の分泌量の経時変化を示すウエスタンブロットの写真である。レーン１〜４はそれぞれｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１の感染直前、感染後２４時間、４８時間および７２時間で採取したＤＵ１４５細胞の培養上清を示す。It is a photograph of the Western blot which shows the time-dependent change of the secretion amount of RGD- (alpha) 3NC1 in DU145 cell which introduce | transduced hTERT / RGD- (alpha) 3NC1. Lanes 1 to 4 show culture supernatants of DU145 cells collected just before infection with hTERT / RGD-α3NC1, 24 hours, 48 hours and 72 hours after infection, respectively. ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１を感染させた各細胞におけるＲＧＤ−α３ＮＣ１の分泌を示すウエスタンブロットの写真である。レーン１〜６はそれぞれＤＵ１４５細胞、ＰＣ３細胞、ＨＴ１０８０細胞、Ｈ１２９９細胞、ＨＳＦおよびＨＦＫを示す。It is a photograph of a Western blot showing secretion of RGD-α3NC1 in each cell infected with hTERT / RGD-α3NC1. Lanes 1-6 show DU145 cells, PC3 cells, HT1080 cells, H1299 cells, HSF and HFK, respectively. ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１感染ＤＵ１４５細胞の培養上清の、各細胞増殖に対する効果を示すグラフである。各細胞の細胞増殖は、ｌａｃＺで処理した細胞との相対的な％として示す。レーン１〜７は、それぞれＤＵ１４５細胞、ＰＣ３細胞、Ｈ１２９９細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＨＵＶＥＣ、ＨＦＫおよびＨＳＦを示す。It is a graph which shows the effect with respect to each cell growth of the culture supernatant of hTERT / RGD- (alpha) 3NC1-infected DU145 cell. Cell growth of each cell is shown as a percentage relative to cells treated with lacZ. Lanes 1-7 show DU145 cells, PC3 cells, H1299 cells, HT1080 cells, HUVEC, HFK, and HSF, respectively. 細胞の細胞増殖を示すグラフである。（Ａ）は、ＣＭ−ｌａｃＺ（レーン１）、ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１（レーン２）およびＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１ΔＦＬＡＧ（陰性コントロール：レーン３）で処理したＨＵＶＥＣ細胞を示し、（Ｂ）は、ＣＭ−ｌａｃＺ（レーン１）およびＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１（レーン２）で処理したＤＵ１４５細胞を示す。It is a graph which shows cell growth of a cell. (A) shows HUVEC cells treated with CM-lacZ (lane 1), CM-RGD-α3NC1 (lane 2) and CM-RGD-α3NC1ΔFLAG (negative control: lane 3), (B) shows CM- DU145 cells treated with lacZ (lane 1) and CM-RGD-α3NC1 (lane 2) are shown. ＭＴＴアッセイにより評価した細胞の細胞生存率を示すグラフである。（Ａ）は、ＣＭ−ｌａｃＺ（レーン１）、ＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１（レーン２）およびＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１ΔＦＬＡＧ（陰性コントロール：レーン３）で処理したＨＵＶＥＣ細胞を示し、（Ｂ）は、ＣＭ−ｌａｃＺ（レーン１）およびＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１（レーン２）で処理したＤＵ１４５細胞を示す。It is a graph which shows the cell viability of the cell evaluated by the MTT assay. (A) shows HUVEC cells treated with CM-lacZ (lane 1), CM-RGD-α3NC1 (lane 2) and CM-RGD-α3NC1ΔFLAG (negative control: lane 3), (B) shows CM- DU145 cells treated with lacZ (lane 1) and CM-RGD-α3NC1 (lane 2) are shown. 各細胞における細胞表面インテグリンの発現を示すヒストグラムである。灰色のヒストグラムはアイソタイプの一致したＩｇＧコントロールで得られた非特異的な蛍光を表わし、黒色のヒストグラムは特異的な蛍光を示す。各グラフ（Ａ）〜（Ｇ）は、それぞれ順にＤＵ１４５細胞、ＰＣ３細胞、Ｈ１２９９細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＨＳＦ、ＨＦＫおよびＨＵＶＥＣを示す。It is a histogram which shows the expression of the cell surface integrin in each cell. Gray histograms represent non-specific fluorescence obtained with isotype-matched IgG controls, and black histograms show specific fluorescence. Each graph (A)-(G) shows DU145 cell, PC3 cell, H1299 cell, HT1080 cell, HSF, HFK, and HUVEC, respectively. ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１感染ＤＵ１４５細胞に由来するｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１による内皮細胞の血管形成の抑制を示す顕微鏡写真である。（Ａ）はＣＭ−ｌａｃＺ、（Ｂ）はＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１および（Ｃ）はＣＭ−ＲＧＤ−α３ＮＣ１ΔＦＬＡＧで処理した細胞を示し、形成された管腔を符号ａで示す。（Ｄ）は、（Ａ）〜（Ｃ）の弱拡大での視野内の管腔形成の分岐数を計測した結果を、３つの試料の平均±ＳＤで示す。レーン１〜３が、それぞれ（Ａ）〜（Ｃ）に対応する。It is a microscope picture which shows suppression of the blood vessel formation of the endothelial cell by hTERT / RGD- (alpha) 3NC1 derived from hTERT / RGD- (alpha) 3NC1 infected DU145 cell. (A) is CM-lacZ, (B) is a cell treated with CM-RGD-α3NC1 and (C) is a cell treated with CM-RGD-α3NC1ΔFLAG, and the formed lumen is denoted by a. (D) shows the result of measuring the number of branching of lumen formation in the visual field at the weak expansion of (A) to (C) as the mean ± SD of three samples. Lanes 1 to 3 correspond to (A) to (C), respectively. がん細胞移植ヌードマウスの腫瘍切片の、抗ＦＬＡＧ抗体および抗ＣＤ３１抗体による二重染色の顕微鏡写真である。（Ａ）はｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１治療を行なったものであり、ＲＧＤ−α３ＮＣ１（符号ｂ、緑）が観察される。（Ｂ）はコントロールとしてＰＢＳを替わりに注入したものであり、内皮細胞がＣＤ３１（符号ｃ、赤）染色陽性領域として観察される。It is a microscope picture of the double staining by the anti- FLAG antibody and the anti- CD31 antibody of the tumor section | slice of a cancer cell transplant nude mouse. (A) is a hTERT / RGD-α3NC1 treatment, and RGD-α3NC1 (symbol b, green) is observed. (B) shows PBS injected instead of control, and endothelial cells are observed as a positive region of CD31 (symbol c, red) staining. ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１治療を行なったヌードマウスの腎の顕微鏡写真である。（Ａ）は、抗ＦＬＡＧ抗体およびＨ３１抗体による二重染色を行なったものであり、（Ｂ）は（Ａ）に近接する切片のヘマトキシリン・エオジン染色を行なったものである。It is a microscope picture of the kidney of the nude mouse which performed hTERT / RGD- (alpha) 3NC1 treatment. (A) shows double staining with anti-FLAG antibody and H31 antibody, and (B) shows hematoxylin-eosin staining of a section close to (A). ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１による単回治療の腫瘍容積に及ぼす効果を示すグラフである。腫瘍容積は、それぞれのグループやプロットにおいて治療開始時との相対的な％として表わした。＊はｐ＜０．０１を示す。It is a graph which shows the effect which acts on the tumor volume of the single treatment by hTERT / RGD- (alpha) 3NC1. Tumor volume was expressed as a percentage relative to the start of treatment in each group or plot. * Indicates p <0.01. ｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１による間欠治療の腫瘍容積に及ぼす効果を示すグラフである。腫瘍容積は、それぞれのグループやプロットにおいて治療開始時との相対的な％として表わした。＊はｐ＜０．０１を示す。It is a graph which shows the effect which acts on the tumor volume of the intermittent treatment by hTERT / RGD- (alpha) 3NC1. Tumor volume was expressed as a percentage relative to the start of treatment in each group or plot. * Indicates p <0.01. がん細胞移植ヌードマウスの凍結腫瘍切片の抗ＣＤ３１抗体染色の光学顕微鏡写真である。（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれＰＢＳ、ＣＡＧ／ｌａｃＺおよびｈＴＥＲＴ／ＲＧＤ−α３ＮＣ１による治療を示し、形成された微小血管を符号ｅで示す。（Ｄ）は、（Ａ）〜（Ｃ）の弱拡大での５つの視野内の微小血管の数を計測した結果を、平均±ＳＤで示す。レーン１〜３が、それぞれ（Ａ）〜（Ｃ）に対応する。It is a light micrograph of anti-CD31 antibody staining of a frozen tumor section of a cancer cell transplanted nude mouse. (A) to (C) show the treatment with PBS, CAG / lacZ and hTERT / RGD-α3NC1, respectively, and the formed microvessels are indicated by symbol e. (D) shows the result of measuring the number of microvessels in the five fields of view at (A) to (C) with weak expansion, as mean ± SD. Lanes 1 to 3 correspond to (A) to (C), respectively.

符号の説明Explanation of symbols

ａ 管腔
ｂ ＲＧＤ−α３ＮＣ１
ｃ ＣＤ３１
ｄ 糸球体
ｅ 微小血管 a Lumen b RGD-α3NC1
c CD31
d Glomera e Microvessel

Claims (6)

がん細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域の下流に血管新生阻害遺伝子を含むベクターを含有する血管新生阻害薬。 An angiogenesis inhibitor comprising a vector containing an angiogenesis inhibitory gene downstream of a promoter region of a gene that is specifically expressed in cancer cells. １回の投与量が、ウイルスベクターの場合ウイルス量で１×１０⁹〜１×１０¹²ｐｆｕ／ｋｇ、非ウイルスベクターの場合１μｇ〜１００ｇ／ｋｇであり、間欠的に少なくとも２回以上投与されることを特徴とする請求項１記載の血管新生阻害薬。 A single dose is 1 × 10 ⁹ to 1 × 10 ¹² pfu / kg in the case of a viral vector, and 1 μg to 100 g / kg in the case of a non-viral vector, and is administered at least twice intermittently. The angiogenesis inhibitor according to claim 1. 毎日１回〜３０日毎に１回の間隔で投与される請求項２記載の血管新生阻害薬。 The angiogenesis inhibitor according to claim 2, wherein the angiogenesis inhibitor is administered once per day to once every 30 days. ７〜１４日毎に１回の間隔で投与される請求項３記載の血管新生阻害薬。 The angiogenesis inhibitor according to claim 3, which is administered at an interval of once every 7-14 days. 血管新生阻害遺伝子が配列番号１の塩基配列からなるＲＧＤ−α３ＮＣ１である請求項１、２、３または４記載の血管新生阻害薬。 The angiogenesis inhibitor according to claim 1, 2, 3 or 4, wherein the angiogenesis inhibiting gene is RGD-α3NC1 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. がん細胞特異的に発現するプロモーターがｈＴＥＲＴプロモーターである請求項１、２、３、４または５記載の血管新生阻害薬。 6. The angiogenesis inhibitor according to claim 1, wherein the cancer cell-specific promoter is an hTERT promoter.