JP2007054042A

JP2007054042A - Interferon-inducing molecule ips-1

Info

Publication number: JP2007054042A
Application number: JP2006111410A
Authority: JP
Inventors: Shizuo Akira; 静男審良; Taro Kawai; 太郎河合
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Osaka University NUC
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Osaka University NUC
Priority date: 2005-07-26
Filing date: 2006-04-13
Publication date: 2007-03-08
Also published as: WO2007013391A1

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new signal transducing molecule capable of inducing the production of a type I interferon (IFN) such as β-interferon (IFN-β) and a gene for the molecule. <P>SOLUTION: A new molecule IPS-1 can be identified by the high-throughput screening for a type I IFN-inducing molecule. The overexpression of IPS-1 induces the production of a type I IFN and an IFN-inducing gene through the activation of IRF3, IRF7 and NF-TB, leading to the induction of an anti-viral response. TBK1 and IKKi are necessary for the IPS-1-mediated activation of a type I IFN promoter. The expression of IPS-1 stimulates an endogenous promoter for a type I IFN gene. IPS-1 is composed of two domains: one is an N-terminal CARD-like domain which can associate with RIG-I; and the other is a C-terminal effecter domain which recruits FADD and RIP1. IPS-1 is considered to be a new adapter protein which mediates an RIG-I-dependent anti-viral response. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、Ｉ型インターフェロン誘導分子ＩＰＳ−１及びそれをコードするＩＰＳ−１遺伝子、ＩＰＳ−１遺伝子を発現することができる形質転換体等に関する。 The present invention relates to a type I interferon-inducing molecule IPS-1, an IPS-1 gene encoding the same, a transformant capable of expressing the IPS-1 gene, and the like.

また本発明は、Ｉ型インターフェロン誘導分子ＩＰＳ−１及びそれをコードするＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質を用いたＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法や、ＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物の抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法等に関する。 The present invention also relates to a method for activating the type I IFN promoter using a recombinant protein expressed in a host cell transformed with a type I interferon-inducing molecule IPS-1 and a DNA encoding the same, IPS-1 knockout The present invention relates to a method for use as a model animal in which the antiviral response function of a non-human animal is lost.

ウイルスやバクテリア等の微生物病原体に対する自然免疫応答は、細胞発現型認識レセプター（ＰＲＲ）が、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる侵入病原体の特異構造を認識することによって惹起される（例えば、非特許文献１及び２参照）。ＰＡＭＰを認識すると、ＰＲＲは、細胞内シグナル伝達経路を活性化し、炎症誘発性サイトカイン及びＩ型ＩＦＮの誘導と共に、適応免疫の発達に関与する樹状細胞（ＤＣ）の成熟を導く（例えば、非特許文献３参照）。その中で、ウイルス感染後のＩ型ＩＦＮ及びＩＦＮ誘導性遺伝子の産生は、抗ウイルス自然免疫応答の中核をなしている。ウイルスの複製中に産生された二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、トール様レセプター（ＴＬＲ）によってＰＡＭＰとして認識される（例えば、非特許文献４参照）。ｄｓＲＮＡのＴＬＲ３への会合は、アダプター分子Ｔｒｉｆ（ＴＩＣＡＭ１としても知られている）のリクルートを導く（例えば、非特許文献５及び６参照）。Ｔｒｉｆは、その後ＴＢＫ１（ＮＡＫ又はＴ２Ｋとしても知られている）、及び関連ＩＫＫｉ（ＩＫＫε）プロテインキナーゼをリクルートし、転写因子ＩＲＦ３及びＩＲＦ７を触媒し、核に移動させる（例えば、非特許文献７及び８参照）。Ｔｒｉｆは、ＴＮＦレセプター結合因子（ＴＲＡＦ６）及びレセプターと相互作用するタンパク質１（ＲＩＰ１）も、直接相互作用によって集め、その後、ＩＫＫβ依存性リン酸化を介して転写因子のＮＦ−κＢファミリーを活性化し、ＮＦ−κＢ阻害分子（ＩκＢｓ）をプロテアソームによって破壊する（例えば、非特許文献９及び１０参照）。これらの転写因子は協調して、Ｉ型ＩＦＮをコードする遺伝子のプロモーターを刺激し、その結果抗ウイルス生体防御を導く。ウイルス性一重鎖ＲＮＡ及びＤＮＡが、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９によってそれぞれ認識され、形質細胞様ＤＣによってＩＦＮαを誘導することが立証された（例えば、非特許文献１１〜１３参照）。ＴＬＲ３と異なり、これらのＴＬＲは、ＭｙＤ８８を主要なアダプターとして共有している（例えば、非特許文献１４参照）。リガンド刺激に続き、ＭｙＤ８８は、ＩＲＡＫ１、ＴＲＡＦ６及びＩＲＦ７とシグナル複合体を形成する（例えば、非特許文献１５〜１７参照）。ＩＲＡＫ１は、ＩＲＦ７の核転移及び、ＩＦＮαの発現を刺激するＩＲＦキナーゼとして作用する（例えば、非特許文献１７参照）。 Innate immune responses against microbial pathogens such as viruses and bacteria are triggered by the recognition of specific structures of invading pathogens called cell pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) by cell-recognized receptor (PRR) (eg, non-patented). Reference 1 and 2). Upon recognition of PAMP, PRR activates intracellular signaling pathways and leads to the maturation of dendritic cells (DCs) involved in the development of adaptive immunity along with induction of pro-inflammatory cytokines and type I IFNs (eg, non- (See Patent Document 3). Among them, the production of type I IFN and IFN-inducible genes after viral infection is central to the antiviral innate immune response. Double-stranded (ds) RNA produced during viral replication is recognized as PAMP by a toll-like receptor (TLR) (see, for example, Non-Patent Document 4). The association of dsRNA to TLR3 leads to recruitment of the adapter molecule Trif (also known as TICAM1) (see, for example, Non-Patent Documents 5 and 6). Trif then recruits TBK1 (also known as NAK or T2K) and related IKKi (IKKε) protein kinases to catalyze and translocate the transcription factors IRF3 and IRF7 (eg, 8). Trif also collects TNF receptor binding factor (TRAF6) and receptor interacting protein 1 (RIP1) by direct interaction and then activates the NF-κB family of transcription factors via IKKβ-dependent phosphorylation, NF-κB inhibitory molecules (IκBs) are destroyed by the proteasome (see, for example, Non-Patent Documents 9 and 10). These transcription factors cooperate to stimulate the promoter of the gene encoding type I IFN, thus leading to antiviral biodefense. Viral single-stranded RNA and DNA were recognized by TLR7 and TLR9, respectively, and it was demonstrated that IFNα is induced by plasmacytoid DC (see, for example, Non-Patent Documents 11 to 13). Unlike TLR3, these TLRs share MyD88 as a major adapter (see, for example, Non-Patent Document 14). Following ligand stimulation, MyD88 forms a signal complex with IRAK1, TRAF6, and IRF7 (see, for example, Non-Patent Documents 15 to 17). IRAK1 acts as an IRF kinase that stimulates nuclear translocation of IRF7 and the expression of IFNα (see, for example, Non-Patent Document 17).

ウイルス性ｄｓＲＮＡは、ＴＬＲ非依存性細胞内センサーを介して細胞を活性化すると考えられている（例えば、非特許文献１８及び１９参照）。ＴＬＲ３が欠損しているＤＣ及び繊維芽細胞は、細胞内へのｄｓＲＮＡ導入後も、Ｉ型ＩＦＮを分泌する（例えば、非特許文献２０参照）。この分泌には、Ｔｒｉｆは必須でないが、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３は必須であり（例えば、非特許文献２０〜２２参照）、ＴＬＲ３依存性経路も、ＴＬＲ３非依存性経路も、ＴＢＫ１に収束することを示している。最近、ＲＩＧ−Ｉは、細胞内ｄｓＲＮＡを感知するＰＲＲの新しいクラスとして作用する分子として同定された（例えば、非特許文献２３参照）。ＲＩＧ−Ｉは、カスパーゼをリクルートするドメイン（ＣＡＲＤ）様モジュールを２個有するＤＥｘＤ／Ｈｂｏｘ型ＲＮＡヘリカーゼである。へリカーゼドメインは、ｄｓＲＮＡの認識に関与していると考えられ、ＣＡＲＤは、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−κＢの活性化を導くダウンストリームシグナル伝達の開始に必須である（例えば、非特許文献２３参照）。ＲＩＧ−Ｉ欠損マウスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）の感染に対して、一貫してＩ型ＩＦＮを産生しなかった（例えば、非特許文献２４参照）。さらに、ウイルス感染に応答したＩＲＦ３及びＮＦ−κＢの活性化は、ＲＩＧ−Ｉ欠損細胞で障害されていた。したがって、ＲＩＧ−Ｉは、インビボの抗ウイルス応答に必須である。Ｍｄａ−５／ヘリカード（Helicard）は、ＲＩＧ−Ｉに類似した構造を有し、抗ウイルス応答の媒介に関与している（例えば、非特許文献２５及び２６参照）。これらのヘリカーゼは共同で、ウイルス感染を感知する細胞内センサーの新たなファミリーを構成している。さらに最近、Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）欠損細胞で、細胞内ｄｓＲＮＡ刺激に応答したＩ型ＩＦＮの産生が障害されることが立証され、ＦＡＤＤ欠損細胞は、ウイルス感染に対し感受性があると考えられている（例えば、非特許文献２７参照）。さらに、細胞内でｄｓＲＮＡが媒介するＩＦＮ誘導には、ＲＩＰ１が必須である（例えば、非特許文献２７参照）。ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１がシグナル伝達複合体を形成することが立証されたので、これらの観察結果は、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１が、ｄｓＲＮＡ依存性のシグナル伝達の主要な構成要素であることを示唆している。しかし、ＲＩＧ−ＩによるｄｓＲＮＡの認識が、どのようにＦＡＤＤ／ＲＩＰ１依存性及びＴＢＫ１依存性のＩ型ＩＦＮ誘導を導くのか明らかでなかった。 Viral dsRNA is thought to activate cells via a TLR-independent intracellular sensor (see, for example, Non-Patent Documents 18 and 19). DCs and fibroblasts lacking TLR3 secrete type I IFN even after introduction of dsRNA into the cell (see, for example, Non-Patent Document 20). Trif is not essential for this secretion, but TBK1 and IRF3 are essential (see, for example, Non-Patent Documents 20 to 22), indicating that both TLR3-dependent and TLR3-independent pathways converge to TBK1. ing. Recently, RIG-I was identified as a molecule that acts as a new class of PRR that senses intracellular dsRNA (see, for example, Non-Patent Document 23). RIG-I is a DExD / Hbox RNA helicase with two domain (CARD) -like modules that recruit caspases. The helicase domain is thought to be involved in dsRNA recognition, and CARD is essential for initiation of downstream signaling leading to activation of IRF3, IRF7 and NF-κB (see, for example, Non-Patent Document 23). reference). RIG-I-deficient mice did not consistently produce type I IFNs against vesicular stomatitis virus (VSV), Newcastle disease virus (NDV) and Sendai virus (SeV) infection (eg, non-patent literature). 24). Furthermore, the activation of IRF3 and NF-κB in response to viral infection was impaired in RIG-I deficient cells. RIG-I is therefore essential for in vivo antiviral responses. Mda-5 / Helicard has a structure similar to RIG-I and is involved in mediating an antiviral response (see, for example, Non-Patent Documents 25 and 26). Together, these helicases constitute a new family of intracellular sensors that sense viral infections. More recently, it has been demonstrated that Fas-related death domain (FADD) -deficient cells impair production of type I IFNs in response to intracellular dsRNA stimulation, and FADD-deficient cells are thought to be susceptible to viral infection. (For example, see Non-Patent Document 27). Furthermore, RIP1 is essential for dsRNA-mediated IFN induction in cells (see, for example, Non-Patent Document 27). These observations suggest that FADD and RIP1 are the major components of dsRNA-dependent signaling, as it was demonstrated that FADD and RIP1 form a signaling complex. However, it was not clear how recognition of dsRNA by RIG-I leads to FADD / RIP1-dependent and TBK1-dependent type I IFN induction.

Annu Rev Immunol.20, 197-216, 2002Annu Rev Immunol. 20, 197-216, 2002 Annu Rev Immunol. 21,335-376, 2003Annu Rev Immunol. 21,335-376, 2003 Nat Rev Immunol. 4, 499-511, 2004Nat Rev Immunol. 4, 499-511, 2004 Nature 413, 732-738. (2001).Nature 413, 732-738. (2001). J Immunol. 169, 6668-6672, 2002J Immunol. 169, 6668-6672, 2002 Nat Immunol. 4, 161-167, 2003Nat Immunol. 4, 161-167, 2003 Science 300, 1148-1151,2003; 8.Science 300, 1148-1151,2003; 8. Nat Immunol. 4, 491-496, 2003Nat Immunol. 4, 491-496, 2003 J Immunol. 171, 4304-4310, 2003;J Immunol. 171, 4304-4310, 2003; Nat Immunol 5, 503-507, 2004Nat Immunol 5, 503-507, 2004 Science 303, 1526-1529, 2004Science 303, 1526-1529, 2004 Science 303, 1529-1531,2004Science 303, 1529-1531,2004 J Immunol. 170, 3059-3064, 2003J Immunol. 170, 3059-3064, 2003 Int Immunol. 14, 1225-1231, 2002Int Immunol. 14, 1225-1231, 2002 Nat Immunol. 5, 1061-1068, 2004Nat Immunol. 5, 1061-1068, 2004 Proc Natl Acad Sci USA. 101, 15416-15421, 2004Proc Natl Acad Sci USA. 101, 15416-15421, 2004 J Exp Med. 201, 915-923, 2005J Exp Med. 201, 915-923, 2005 Science 301, 640-643, 2003Science 301, 640-643, 2003 Nat Immunol. 4, 1223-1229, 2003Nat Immunol. 4, 1223-1229, 2003 J Exp Med. 199, 1641-1650, 2004J Exp Med. 199, 1641-1650, 2004 J Exp Med. 199, 1651-1658, 2004J Exp Med. 199, 1651-1658, 2004 Proc Natl Acad Sci USA 101, 233-238, 2004Proc Natl Acad Sci USA 101, 233-238, 2004 Nat Immunol. 5, 730-737, 2004Nat Immunol. 5, 730-737, 2004 Immunity (2005) in pressImmunity (2005) in press Curr Biol. 12, 838-843, 2002Curr Biol. 12, 838-843, 2002 Proc Natl Acad Sci USA. 101, 17264-17269, 2004Proc Natl Acad Sci USA. 101, 17264-17269, 2004 Nature 432, 401-405, 2004Nature 432, 401-405, 2004

本発明の課題は、β−インターフェロン（ＩＦＮβ）等のＩ型ＩＦＮの産生を誘導する新規なシグナル伝達分子及びその遺伝子を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a novel signaling molecule that induces production of type I IFN such as β-interferon (IFNβ) and a gene thereof.

本発明者らは、Ｉ型ＩＦＮ誘導物質のハイスループットスクリーニングにより、ＩＰＳ−１と命名した新規分子を同定した。ＩＰＳ−１の過剰発現は、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−ｋＢの活性化を介して、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＮ誘導性遺伝子を産生して、抗ウイルス応答を誘導した。ＴＢＫ１及びＩＫＫｉは、ＩＰＳ−１が媒介するＩ型ＩＦＮプロモーター活性化に必須であった。さらに、ＩＰＳ−１の発現は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の内因性プロモーターを刺激した。ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉと会合するＮ末端ＣＡＲＤ様ドメインと、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１をリクルートするＣ末端エフェクタードメインとの２つのドメインからなる。ｓｉＲＮＡによるＩＰＳ−１のノックダウンにより、ｄｓＲＮＡ刺激に対する抗ウイルス応答とウイルス感染が減少した。したがって、ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉ依存性抗ウイルス応答を媒介する新規アダプタータンパク質であると考えられる。 The present inventors have identified a novel molecule named IPS-1 by high-throughput screening of type I IFN inducers. Overexpression of IPS-1 produced type I IFN and IFN-inducible genes via activation of IRF3, IRF7 and NF-kB to induce an antiviral response. TBK1 and IKKi were essential for IPS-1 mediated type I IFN promoter activation. Furthermore, IPS-1 expression stimulated the endogenous promoter of the type I IFN gene. IPS-1 consists of two domains, an N-terminal CARD-like domain that associates with RIG-I and a C-terminal effector domain that recruits FADD and RIP1. Knockdown of IPS-1 by siRNA reduced the antiviral response and viral infection to dsRNA stimulation. Thus, IPS-1 is thought to be a novel adapter protein that mediates RIG-I dependent antiviral responses.

また、ＲＩＧ−Ｉは、ウイルス性ｄｓＲＮＡを感知するＴＬＲ３非依存性の細胞内センサーであるとされてきた（Nat Immunol. 5, 730-737, 2004参照）。ＲＩＧ−Ｉ欠損マウスは、ＶＳＶ、ＮＤＶ、及びＳｅＶ感染後にＩ型ＩＦＮの誘導が障害され（Immunity, 2005参照）、ＲＩＧ−Ｉがこれらのウイルスを感知する唯一のインビボのセンサーであることを示した。ＲＩＧ−Ｉの類縁体である、Ｍｄａ５／ヘリカードは、ウイルス認識にも関与している（Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17264-17269, 2004）。ＲＩＧ−ＩもＭｄａ５／ヘリカードも、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−κＢの活性化を導くダウンストリームシグナル伝達の開始に必須である、ＣＡＲＤ様モジュールを２個有している。ＲＩＧ−Ｉ及びＭｄａ５／ヘリカードは、類似したＣＡＲＤ様モジュールを含むシグナル伝達アダプターを用いることが示唆された。ＩＰＳ−１が、これらのタンパク質との相互作用を媒介する、Ｍｄａ／ヘリカード及びＲＩＧ−Ｉと相同性のあるＣＡＲＤ様ドメインを有することを見い出したことは、非常に興味深い。ＴＢＫ１及びＩＫＫｉの両方が欠損している細胞は、細胞内ｄｓＲＮＡ刺激やウイルス感染に応答して、ＩＲＦ３活性化も、ＩＦＮβ産生もしなかった（J Exp Med. 199, 1641-1650, 2004; J Exp Med. 199, 1651-1658, 2004; Proc Natl Acad Sci US A 101, 233-238, 2004）。さらに、ＩＰＳ−１は、ＴＢＫ−１及びＩＫＫｉが欠損している細胞で、ＩＦＮα及びＩＦＮβプロモーターを活性化しなかった。したがって、ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−ＩとＭｄａ５／ヘリカードとを、ＴＢＫ１及びＩＫＫｉを活性化するダウンストリーム分子に結合するアダプターとして作用しうる。ＲＩＧ−Ｉ△Ｃの過剰発現は、ＩＦＮβプロモーターの恒常的な活性化を導くが、全長ＲＩＧ−Ｉがプロモーターを活性化しないことは、以前に報告されている（Nat Immunol. 5, 730-737, 2004）。この観察結果は、ＲＩＧ−ＩのＣ末端領域が、ダウンストリームエフェクター分子との相互作用を防止する制御機能を有することを示唆している。ＩＰＳ−１は、常にＲＩＧ−Ｉ△Ｃと結合するが、全長ＲＩＧ−Ｉとは結合しない。したがって、ＩＰＳ−１は、刺激されていない状態では、ＲＩＧ−Ｉと結合しないが、刺激後は、ＲＩＧ−Ｉと複合体を形成し、シグナル伝達を開始すると考えられる。 RIG-I has been considered to be a TLR3-independent intracellular sensor that senses viral dsRNA (see Nat Immunol. 5, 730-737, 2004). RIG-I deficient mice have impaired induction of type I IFN after infection with VSV, NDV, and SeV (see Immunity, 2005), indicating that RIG-I is the only in vivo sensor to sense these viruses It was. MDA5 / helicard, an analog of RIG-I, is also involved in virus recognition (Proc Natl Acad Sci USA A. 101, 17264-17269, 2004). Both RIG-I and Mda5 / Helicard have two CARD-like modules that are essential for the initiation of downstream signaling leading to activation of IRF3, IRF7 and NF-κB. RIG-I and Mda5 / Helicard were suggested to use signaling adapters containing similar CARD-like modules. It is very interesting to find that IPS-1 has a CARD-like domain homologous to Mda / Helicard and RIG-I that mediates interaction with these proteins. Cells lacking both TBK1 and IKKi did not activate IRF3 or produce IFNβ in response to intracellular dsRNA stimulation or viral infection (J Exp Med. 199, 1641-1650, 2004; J Exp Med. 199, 1651-1658, 2004; Proc Natl Acad Sci US A 101, 233-238, 2004). Furthermore, IPS-1 did not activate the IFNα and IFNβ promoters in cells lacking TBK-1 and IKKi. Thus, IPS-1 can act as an adapter that binds RIG-I and Mda5 / Helicard to downstream molecules that activate TBK1 and IKKi. Overexpression of RIG-IΔC leads to constitutive activation of the IFNβ promoter, but it has been previously reported that full-length RIG-I does not activate the promoter (Nat Immunol. 5, 730-737). , 2004). This observation suggests that the C-terminal region of RIG-I has a regulatory function that prevents interaction with downstream effector molecules. IPS-1 always binds to RIG-IΔC, but not to full length RIG-I. Therefore, IPS-1 does not bind to RIG-I in an unstimulated state, but after stimulation, forms a complex with RIG-I and initiates signal transduction.

最近、本来デスレセプターのＴＮＦレセプターファミリーのシグナル伝達分子として同定されているＦＡＤＤ及びＲＩＰ１が、細胞内ｄｓＲＮＡが媒介する機能に参画することが示された（Nature 432, 401-405, 2004）。免疫共沈澱分析で、ＩＰＳ−１はＴＢＫ１と直接会合しなかったが、そのＣ末端領域は、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１と相互作用するようである。これらの観察結果は、ＩＰＳ−１はウイルス感染時にＣ末端エフェクタードメインを介してＦＡＤＤ及びＲＩＰ１をリクルートし、ＴＢＫ１及びＩＫＫｉ依存性ＩＲＦ３リン酸化を惹起することを示唆した。一方、ＩＰＳ−１の過剰発現又はウイルス感染に応答したＮＦ−κＢの活性化は、ＴＢＫ１及びＩＫＫｉ欠損細胞で、正常であった。同時に、発現がＮＦ−κＢ依存性であるＩＬ−６のウイルス誘導が、これらの細胞で観察された。反対に、ＦＡＤＤ欠損細胞は、ウイルス感染時に、ＩＬ−６を産生せず（Nature 432, 401-405, 2004）、ＦＡＤＤの過剰発現は、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損細胞においても、ＮＦ−κＢプロモーターを活性化した（非公開データ）。したがって、ＲＩＧ−Ｉ依存性のＮＦ−κＢ活性化は、ＴＢＫ１とは独立して、ＩＰＳ−１とＦＡＤＤのダウンストリームで起こりうるが、ＩＫＫβ活性化を導く分子メカニズムは明らかになっていない。 Recently, FADD and RIP1, which were originally identified as signaling molecules of the TNF receptor family of death receptors, have been shown to participate in functions mediated by intracellular dsRNA (Nature 432, 401-405, 2004). In co-immunoprecipitation analysis, IPS-1 did not associate directly with TBK1, but its C-terminal region appears to interact with FADD and RIP1. These observations suggested that IPS-1 recruits FADD and RIP1 via the C-terminal effector domain during viral infection and induces TBK1 and IKKi-dependent IRF3 phosphorylation. On the other hand, NF-κB activation in response to IPS-1 overexpression or viral infection was normal in TBK1 and IKKi deficient cells. At the same time, viral induction of IL-6 whose expression is NF-κB dependent was observed in these cells. On the other hand, FADD-deficient cells do not produce IL-6 upon virus infection (Nature 432, 401-405, 2004), and overexpression of FADD is also observed in the NF-κB promoter in TBK1 / IKKi double-deficient cells. Was activated (private data). Thus, RIG-I-dependent NF-κB activation can occur downstream of IPS-1 and FADD, independent of TBK1, but the molecular mechanism leading to IKKβ activation remains unclear.

多くのウイルスが、ＩＦＮ誘導を拮抗する特異的タンパク質をコードするようである。例えば、ヒトＲＩＧ−Ｉは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡが誘導するＩＲＦ３活性化に関与している（J Virol. 79, 2689-2699, 2005; J Virol. 79, 3969-3978, 2005）。しかし、ＨＣＶのＮＳ３／４プロテアーゼはＩＲＦ３リン酸化の抑制に関与し、ＲＮＡが誘導するＩＦＮ産生をブロックする。パラミキソウイルスのＶタンパク質は、Ｍｄａ−５と会合し、ダウンストリームのシグナル伝達をブロックし、ＩＦＮ誘導を阻害することが示されている（Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17264-17269, 2004）。したがって、多くのウイルスタンパク質が、分解又はＦＡＤＤ又はＲＩＰ１等のダウンストリームシグナル伝達分子のリクルートを防止するために、ＩＰＳ−１が媒介するシグナル伝達経路を標的にすることによって拮抗しうる。さらに、細胞内へのグラム陽性菌、リステリア菌（ＬＭ）の感染が、ＴＢＫ−１依存的に、そしてＴＬＲ非依存的にＩ型ＩＦＮを誘導するようである（J Immunol. 173, 7416-7425, 2004; JImmunol. 174, 1602-1607, 2005）。ＬＭに応答したＩＦＮ誘導を惹起する細胞質レセプターはまだ同定されていないが、ＩＰＳ−１は、この細胞内バクテリアによってＩＦＮ誘導に関与している可能性がある。ＩＰＳ−１が、新たに同定された細胞質ＰＲＲのＲＩＧ−Ｉ及びＭｄａ５／ヘリカードファミリーのダウンストリームで、抗ウイルス自然免疫応答を誘導するアダプター分子として作用することを明らかにした。 Many viruses appear to encode specific proteins that antagonize IFN induction. For example, human RIG-I is involved in IRF3 activation induced by hepatitis C virus (HCV) RNA (J Virol. 79, 2689-2699, 2005; J Virol. 79, 3969-3978, 2005). . However, HCV NS3 / 4 protease is involved in the suppression of IRF3 phosphorylation and blocks RNA-induced IFN production. Paramyxovirus V protein has been shown to associate with Mda-5, block downstream signaling and inhibit IFN induction (Proc Natl Acad Sci US A. 101, 17264-17269, 2004). Thus, many viral proteins can antagonize by targeting IPS-1 mediated signaling pathways to prevent degradation or recruitment of downstream signaling molecules such as FADD or RIP1. Furthermore, infection of cells with Gram-positive bacteria, Listeria monocytogenes (LM), seems to induce type I IFN in a TBK-1 dependent and TLR-independent manner (J Immunol. 173, 7416-7425). , 2004; JImmunol. 174, 1602-1607, 2005). Although the cytoplasmic receptor that triggers IFN induction in response to LM has not yet been identified, IPS-1 may be involved in IFN induction by this intracellular bacterium. We revealed that IPS-1 acts as an adapter molecule that induces an antiviral innate immune response in the newly identified cytoplasmic PRR RIG-I and downstream of the Mda5 / Helicard family.

すなわち本発明は、（１）(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；をコードするＤＮＡや、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（３）配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、（４）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（５）前記（２）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（これらＤＮＡを総称して「本件ＤＮＡ」ということがある）に関する。 That is, the present invention relates to (1) (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or (b) one or several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A DNA encoding a protein having an IPS-1 activity, and (2) an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and IPS- DNA encoding a protein having 1 activity, (3) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, and (4) 1 or several of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 DNA encoding a protein consisting of a base sequence with a base deleted, substituted or added and having IPS-1 activity, (5 ) It relates to a DNA that hybridizes with the DNA described in (2) under stringent conditions and encodes a protein having IPS-1 activity (these DNAs may be collectively referred to as “the present DNA”).

また本発明は、（６）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（７）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質や、（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質や、（９）組換えタンパク質であることを特徴とする前記（６）〜（８）のいずれか記載のタンパク質に関する（これらタンパク質を総称して「本件タンパク質」ということがある）。 The present invention also relates to (6) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and (7) an amino acid wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A protein comprising a sequence and having IPS-1 activity, (8) a protein comprising an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having IPS-1 activity, (9) The protein according to any one of (6) to (8) above, which is a recombinant protein (these proteins may be collectively referred to as “the present protein”).

また本発明は、（１０）前記（６）〜（９）のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチドや、（１１）前記（１）〜（５）のいずれか記載のＤＮＡを含み、かつＩＰＳ−１を発現することができる組換えベクターや、（１２）組換えプラスミドベクターである前記（１１）記載の組換えベクターや、（１３）さらに、レポーター遺伝子を発現することができることを特徴とする前記（１１）又は（１２）記載の組換えベクターや、（１４）レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする前記（１１）又は（１２）記載の組換えベクターや、（１５）前記（１１）〜（１４）のいずれか記載の組換えベクターが導入され、かつＩＰＳ−１を発現する形質転換体に関する。 The present invention also provides (10) a fusion protein or fusion peptide obtained by binding the protein according to any one of (6) to (9) above with a marker protein and / or a peptide tag, or (11) the above (1) A recombinant vector comprising the DNA of any one of -5 and capable of expressing IPS-1, a recombinant vector of (11) which is a recombinant plasmid vector, (13) Further, a reporter gene can be expressed, the recombinant vector according to (11) or (12) above, or (14) the reporter gene is a firefly luciferase gene (11) ) Or (12), or (15) the recombinant vector according to any one of (11) to (14), and IPS Transformants expressing one related.

本発明はまた、（１６）ＩＰＳ−１遺伝子を有する組換えベクターによって形質転換された形質転換体や、（１７）形質転換体が、哺乳類細胞由来であることを特徴とする前記（１５）又は（１６）記載の形質転換体や、（１８）哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞又はＭＥＦ細胞である前記（１７）に記載の形質転換体や、（１９）前記（６）〜（９）のいずれか記載のタンパク質又はその部分ポリペプチドを認識する抗体や、（２０）モノクローナル抗体であることを特徴とする前記（１９）記載の抗体や、（２１）ＩＰＳ−１遺伝子の機能が染色体上で欠損し、野生型において発現されるＩＰＳ−１を発現する機能が失われていることを特徴とするＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物や、（２２）げっ歯類動物であることを特徴とする前記（２１）記載のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物や、（２３）げっ歯類動物が、マウスであることを特徴とする前記（２２）記載のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物に関する。 The present invention also provides (16) a transformant transformed with a recombinant vector having an IPS-1 gene, or (17) the transformant described above (15) or The transformant according to (16), (18) the transformant according to (17), wherein the mammalian cell is HEK293 cell, Hela cell, or MEF cell, (19) (6) to (9) An antibody that recognizes the protein according to any one of the above or a partial polypeptide thereof, (20) the antibody according to (19), which is a monoclonal antibody, and (21) the function of the IPS-1 gene on a chromosome IPS-1 knockout non-human animal or (22) rodent animal, characterized in that the function to express IPS-1 expressed in wild type is lost. Above, wherein (21) or IPS-1 knockout non-human animal, wherein (23) rodent animals, related to the (22) IPS-1 knockout non-human animal, wherein it is a mouse.

さらに本発明は、（２４）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；のいずれか記載ＤＮＡを、ＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法や、（２５）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；のいずれか記載のタンパク質を用いて、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法や、（２６）タンパク質が、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；のいずれか記載ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする上記（２５）記載のＩＦＮβプロモーターを活性化する方法や、（２７）（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；のいずれか記載のタンパク質を、Ｉ型ＩＦＮの製造に使用する方法や、（２８）タンパク質が、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；のいずれか記載ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする上記（２７）記載の使用する方法や、（２９）ＩＰＳ−１遺伝子の機能を染色体上で欠損させたＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物の、Ｉ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法や、（３０）非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする上記（２９）記載の抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法に関する。 Furthermore, the present invention provides (24) (a) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and (b) one or several amino acids deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, DNA comprising a substituted or added amino acid sequence and encoding a protein having IPS-1 activity, (c) comprising an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and DNA encoding a protein having IPS-1 activity, (d) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, (e) one or several bases deleted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, A DNA comprising a substituted or added base sequence and encoding a protein having IPS-1 activity, (f) SEQ ID NO: Any one of DNAs that hybridize under stringent conditions with a DNA comprising the base sequence shown in FIG. 5 and that encodes a protein having IPS-1 activity; (25) (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and (b) one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted or added A protein comprising an amino acid sequence and having IPS-1 activity; (c) a protein comprising an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having IPS-1 activity; A method of activating a type I IFN promoter using any one of the proteins described above, (26) (A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and (b) one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A DNA encoding a protein having IPS-1 activity and (c) an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and IPS-1 activity (D) DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, (e) one or several bases deleted, substituted or added in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 A DNA encoding a protein having an IPS-1 activity and (f) SEQ ID NO: 1 A recombinant protein expressed in a host cell transformed with any one of the DNAs hybridizing under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence and encoding a protein having IPS-1 activity; In the method for activating the IFNβ promoter described in (25) above, wherein (27) (a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and having IPS-1 activity, (c) having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 A protein comprising any one of the amino acid sequences and having IPS-1 activity; In the method used for the production of type I IFN, (28) the protein is (a) a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (b) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; Or a DNA encoding a protein having an IPS-1 activity consisting of an amino acid sequence in which several amino acids are deleted, substituted or added, and (c) at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 A DNA comprising an amino acid sequence having sex and encoding a protein having IPS-1 activity, (d) a DNA comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (e) a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 Alternatively, a protein having a base sequence in which several bases are deleted, substituted or added and having IPS-1 activity DNA encoding, (f) DNA which hybridizes with DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and encodes a protein having IPS-1 activity; A method for use according to (27) above, which is a recombinant protein expressed in a transformed host cell, and (29) an IPS-1 knockout non-human in which the function of the IPS-1 gene is deleted on the chromosome A method for using an animal as a model animal in which an antiviral response function is lost due to activation of a type I IFN promoter, or (30) the antiviral according to (29) above, wherein the non-human animal is a mouse The present invention relates to a method for use as a model animal in which the response function is lost.

本発明によると、ＩＦＮβ等のＩ型ＩＦＮの産生を誘導する新規なシグナル伝達分子ＩＰＳ−１及びＩＰＳ−１遺伝子を提供することができ、ＩＰＳ−１機能を標的とした薬剤は、ウイルス感染を制御するために、治療的に有用である。 According to the present invention, it is possible to provide a novel signaling molecule IPS-1 and IPS-1 gene that induces production of type I IFN such as IFNβ. It is therapeutically useful to control.

また、本発明の本件ＤＮＡをＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法や、本発明のＩＰＳ−１又はＩＰＳ−１をコードするＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質を用いたＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法や、本発明の本件タンパク質をＩ型ＩＦＮの製造に使用する方法は、ＩＰＳ−１が、ＩＦＮ−αをはじめとする各種サイトカイン産生の特異的な調節に対する治療上のターゲットとなる可能性を与え、ウイルス感染や自然免疫疾患への治療へ応用することができる。また、前記方法により、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化させてＩ型インターフェロン等を製造することも可能である。さらに、Ｉ型ＩＦＮプロモーターの活性化機能を阻害（又は増強）する化合物のスクリーニングに利用することが可能である。 In addition, a method of using the present DNA of the present invention for production of a protein having IPS-1 activity, or a recombinant protein expressed in a host cell transformed with IPS-1 of the present invention or a DNA encoding IPS-1 The method for activating the type I IFN promoter using, and the method for using the present protein of the present invention for the production of type I IFN are specific to IPS-1 producing various cytokines including IFN-α. It can be a therapeutic target for regulation and can be applied to the treatment of viral infections and innate immune diseases. Further, by the above method, type I interferon or the like can be produced by activating the type I IFN promoter. Furthermore, it can be used for screening for compounds that inhibit (or enhance) the activation function of the type I IFN promoter.

また、本発明のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物の抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法によれば、人工的に抗ウイルス応答機能が働かない状態を作り出すことができ、生体内におけるウイルス応答機能を明らかにするためや、ＲＮＡｉの作用機作の解明や、ウイルス感染症の治療方法の解明や、抗ウイルス薬をスクリーニングすることも可能である。 In addition, according to the method of using the IPS-1 knockout non-human animal of the present invention as a model animal in which the antiviral response function is lost, a state in which the antiviral response function does not work artificially can be created. In order to clarify the virus response function, it is also possible to elucidate the mechanism of RNAi action, elucidate a method for treating viral infections, and screen for antiviral drugs.

本発明のＤＮＡとしては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＩＰＳ−１をコードするＤＮＡ；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＩＰＳ−１遺伝子ＤＮＡ；（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；の何れかのＤＮＡであれば特に制限されず、また、本発明のタンパク質としては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＩＰＳ−１；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；又は（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質；の何れかのタンパク質であれば特に制限されず、ここで「ＩＰＳ−１活性を有する」とは、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する機能を有することを意味する。 The DNA of the present invention includes (A) DNA encoding protein IPS-1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (B) lacking one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. DNA comprising a deleted, substituted or added amino acid sequence and encoding a protein having IPS-1 activity; (C) consisting of an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 A DNA encoding a protein having IPS-1 activity; (D) an IPS-1 gene DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof; (E) a base sequence shown in SEQ ID NO: 1 1 or several bases deleted, substituted or added, and has IPS-1 activity Or (F) a DNA that hybridizes with a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and encodes a protein having IPS-1 activity. In particular, the protein of the present invention includes (A) protein IPS-1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (B) one or several in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 A protein having an IPS-1 activity, or (C) an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 And any protein of IPS-1 activity; "Having IPS-1 activity" means having a function of activating the type I IFN promoter.

上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。 The above “amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added” is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5. It means an amino acid sequence in which any number of amino acids are deleted, substituted or added. The “base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted or added” is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 It means a base sequence in which ˜5 arbitrary number of bases are deleted, substituted or added.

例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。 For example, DNA (mutant DNA) consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added can be obtained by any method known to those skilled in the art such as chemical synthesis, genetic engineering techniques, mutagenesis, etc. Can also be produced. Specifically, the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated into these DNAs by using a method of contacting with a mutagen agent, a method of irradiating with ultraviolet rays, a genetic engineering technique, etc. Mutant DNA can be obtained by introducing. Site-directed mutagenesis, which is one of genetic engineering techniques, is useful because it can introduce specific mutations at specific positions. Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, NY., 1989. (hereinafter abbreviated as "Molecular Cloning 2nd Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), etc. It can be carried out. By expressing this mutant DNA using an appropriate expression system, a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added can be obtained.

上記「配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であれば特に制限されるものではないが、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上であることを意味する。 The above-mentioned “amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2” is particularly limited as long as the homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is 90% or more However, it means preferably 95% or more, more preferably 98% or more.

上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。 The above-mentioned “DNA that hybridizes under stringent conditions” refers to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Specifically, the homology is 50 to 70% or more. 65 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, or 0. which is a condition in which DNAs having DNAs are hybridized and DNAs having lower homology are not hybridized with each other or washing in normal Southern hybridization. The conditions for hybridizing at a salt concentration corresponding to 1 × SSC and 0.1% SDS can be mentioned.

本発明のＩＰＳ−１遺伝子ＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１又は配列番号２に示される塩基配列又はアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、あるいは、常法に従って化学合成により調製することができる。 The method for obtaining and preparing the IPS-1 gene DNA of the present invention is not particularly limited, and is suitable based on the nucleotide sequence or amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 disclosed in the present specification. The target gene can be isolated by screening a cDNA library in which the gene is expected to exist, or prepared by chemical synthesis according to conventional methods. it can.

具体的には、本発明のＩＰＳ−１ｍＲＮＡが多く発現する心臓及び骨格筋より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することができる。また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、実施例記載のハイスループットスクリーニング方法や、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。 Specifically, a cDNA library is prepared according to a conventional method from heart and skeletal muscle in which a large amount of IPS-1 mRNA of the present invention is expressed, and then an appropriate probe specific to the gene of the present invention is used from this library. Thus, the gene of the present invention can be obtained by selecting a desired clone. In addition, separation of total RNA from these cells or tissues, separation and purification of mRNA, acquisition of cDNA, and cloning thereof can be performed according to conventional methods. Examples of the method for screening the gene of the present invention from a cDNA library include methods commonly used by those skilled in the art, such as the high-throughput screening method described in the Examples and the method described in Molecular Cloning Second Edition.

また、上記（Ｂ）〜（Ｆ）のいずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。 Further, as the mutant gene or homologous gene of the present invention consisting of the base sequence shown in any of the above (B) to (F), a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part thereof is used. It can be isolated from other organisms by screening homologs of the DNA under appropriate conditions. In addition, it can also be prepared by the aforementioned method for producing mutant DNA.

本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードするＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。 The method for obtaining and preparing the protein of the present invention is not particularly limited, and may be a naturally derived protein, a chemically synthesized protein, or a recombinant protein produced by a gene recombination technique. When a naturally derived protein is obtained, the protein of the present invention can be obtained by appropriately combining protein isolation / purification methods from cells or tissues expressing such protein. When preparing a protein by chemical synthesis, for example, the protein of the present invention can be synthesized according to a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). it can. In addition, the protein of the present invention can be synthesized using various commercially available peptide synthesizers. When a protein is prepared by a gene recombination technique, the protein of the present invention can be prepared by introducing DNA encoding the protein into a suitable expression system. Among these, preparation by a gene recombination technique that can be prepared in a large amount by a relatively easy operation is preferable.

例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。 For example, when the protein of the present invention is prepared by genetic recombination techniques, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography can be used to recover and purify the protein from cell culture. , Known methods including hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography, preferably high performance liquid chromatography. In particular, the column used for affinity chromatography is, for example, a column in which an antibody such as a monoclonal antibody against the protein of the present invention is bound, or when a normal peptide tag is added to the protein of the present invention, By using a column to which an affinity substance is bound, purified products of these proteins can be obtained.

さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてヒト以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。 Furthermore, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, or has 90% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A protein comprising an amino acid sequence can be appropriately prepared or obtained by those skilled in the art based on the information of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 showing an example of the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. . For example, the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part thereof can be used as a probe to isolate a DNA homolog by screening under appropriate conditions from a non-human organism. A protein encoded by the homologous DNA can be produced by cloning the full-length DNA of this homologous DNA, then incorporating it into an expression vector and expressing it in a suitable host.

本発明の融合ペプチドとしては、上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよい。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出や、本発明のペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。 The fusion peptide of the present invention may be any peptide as long as the protein of the present invention is bound to a marker protein and / or a peptide tag. The marker protein is not particularly limited as long as it is a conventionally known marker protein. Specific examples include an enzyme such as alkaline phosphatase and HRP, an Fc region of an antibody, and a fluorescent substance such as GFP. As peptide tags in the present invention, conventionally known peptide tags such as epitope tags such as HA, FLAG, and Myc, and affinity tags such as GST, maltose binding protein, biotinylated peptide, oligohistidine, etc. Specific examples can be given. Such a fusion protein can be prepared by a conventional method. Purification of the peptide of the present invention utilizing the affinity between Ni-NTA and His tag, detection of the peptide of the present invention, and quantification of an antibody against the peptide of the present invention It is also useful as a research reagent in this field.

本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子を含み、かつＩＰＳ−１を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクター、好ましくは発現プラスミドベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。 The recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains the gene of the present invention and can express IPS-1. The recombinant vector of the present invention is not limited to the gene of the present invention. Can be constructed by appropriately integrating into an expression vector, preferably an expression plasmid vector. Such an expression vector is preferably one that is capable of autonomous replication in a host cell, or one that can be integrated into the host cell chromosome, and includes a promoter, enhancer, terminator, etc. at a position where the gene of the present invention can be expressed. Those containing a control sequence can be preferably used.

上記発現ベクターとして、例えば、ｐＣＭＶ６−ＸＬ３（OriGene Technologies Inc.社製）、ＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3,133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307,1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。また、プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。さらに、プロモーターの下流に蛍光蛋白質をコードする遺伝子等のレポーター遺伝子を融合することができる。蛍光蛋白質としては、緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescence Protein（ＧＦＰ））、赤色蛍光蛋白質（Cyan Fluorescence Protein（ＣＦＰ））、青色蛍光蛋白質（Blue Fluorescence Protein（ＢＦＰ））、黄色蛍光蛋白質（Yellow Fluorescence Protein（ＹＦＰ））、ルシフェラーゼ（luciferase）を例示することができる。 Examples of the expression vector include pCMV6-XL3 (OriGene Technologies Inc.), EGFP-C1 (Clontech), pGBT-9 (Clontech), pcDNAI (Funakoshi), pcDM8 (Funakoshi). PAGE107 (Cytotechnology, 3,133, 1990), pCDM8 (Nature, 329, 840, 1987), pcDNAI / AmP (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J. Blochem., 101, 1307, 1987) , PAGE210 and the like. Examples of promoters include cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate early) gene promoter, SV40 early promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter, SRα promoter, and the like. . Furthermore, a reporter gene such as a gene encoding a fluorescent protein can be fused downstream of the promoter. Fluorescent proteins include green fluorescent protein (GFP), red fluorescent protein (Cyan Fluorescence Protein (CFP)), blue fluorescent protein (Blue Fluorescence Protein (BFP)), and yellow fluorescent protein (YFP). )), Luciferase can be exemplified.

また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが宿主細胞に導入され、かつＩＰＳ−１を発現する形質転換体であれば特に制限されず、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）を挙げることができるが、形質転換動物細胞が好ましい。 The transformant of the present invention is not particularly limited as long as the recombinant vector of the present invention is introduced into a host cell and expresses IPS-1. (Cells, tissues, individuals), transformed bacteria, and transformed animals (cells, tissues, individuals) can be mentioned, but transformed animal cells are preferred.

遺伝子工学により形質転換される株化された宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＥＦ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ヒト腎細胞株等が挙げられる。具体的には、ＣＨＯ−Ｋ1（チャイニーズハムスター卵巣細胞：ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、ＢＨＫ（ハムスター腎細胞：ＡＴＣＣＣＣＬ１０）、ＣＯＳ−７（ＣＶ−１Ｏｒｉｇｉｎ，ＳＶ−４０細胞：ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞：ＡＴＣＣＣＣＬ８１）等があり、更にはマウスミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ８−６５３；Ｐ３Ｕ１）、ヒトリンパ芽球細胞（ＩＭ−９，ＡＴＣＣＣＣＬ１５９）、ヒトヒトハイブリドーマ作製用親細胞、ならびにこれらのｄｈｆｒ欠損株、ＨＧＰＲＴ欠損株、ウアバイン耐性株等を例示することができる。動物細胞への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（モレキュラークローニング第２版）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。 The established host cells transformed by genetic engineering include HEK293 cells, MEF cells, Vero cells, Hela cells, CHO cells, WI38 cells, BHK cells, COS-7 cells, MDCK cells, C127 cells, HKG cells. And human kidney cell lines. Specifically, CHO-K1 (Chinese hamster ovary cell: ATCC CCL61), BHK (hamster kidney cell: ATCC CCL10), COS-7 (CV-1 Origin, SV-40 cell: ATCC CRL1651), Vero cell (African green monkey) Kidney cells: ATCC CCL81), mouse myeloma cells (X63-Ag8-653; P3U1), human lymphoblasts (IM-9, ATCCCCL159), parent cells for producing human human hybridomas, and dhfr-deficient strains thereof And HGPRT-deficient strains, ouabain resistant strains, and the like. Methods for introducing recombinant vectors into animal cells include those described in many standard laboratory manuals such as Davis et al. (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) and Sambrook et al. (Molecular Cloning 2nd Edition). For example, calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, transvection, microinjection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, scrape loading, ballistic introduction It can be done by infection.

昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。 When insect cells are used as the host, the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into the insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected with the insect cells. And protein can be expressed (for example, as described in Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1; and Current Protocols in Molecular Biology, Bio / Technology, 6, 47 (1988), etc.). As the baculovirus, for example, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects Coleoptera insects, can be used. Insect cells include Sf9, Sf21 (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company), New York, which is an ovarian cell of Spodoptera frugiperda (1992)], HiFive (manufactured by Invitrogen), which is an ovarian cell of Trichoplusia ni, can be used. Examples of the method for co-introducing a recombinant gene introduction vector into insect cells and the baculovirus for preparing a recombinant virus include the calcium phosphate method and the lipofection method.

形質転換細菌の作製に用いられる細菌の宿主細胞の具体例としては、エッシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、バチラス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、エルウニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物を挙げることができる。細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法やプロトプラスト法等を挙げることができる。 Specific examples of bacterial host cells used to produce transformed bacteria include Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, microbacteria ( Microbacterium genus, Serratia genus, Pseudomonas genus, Agrobacterium genus, Arthrobacter genus, Erwinia genus, Methylobacterium genus, Rhodobacter genus ), Microorganisms belonging to the genus Streptomyces, the genus Zymomonas and the like. Examples of the method for introducing a recombinant vector into a bacterial host include a method using calcium ions and a protoplast method.

ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドを認識する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドを抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等のＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、例えば、ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質の変異又は欠失に起因する疾病の診断やＩＰＳ−１等の分子機構を明らかにする上で有用である。 Specific examples of antibodies that recognize the protein of the present invention such as IPS-1 or partial polypeptides thereof include immunospecific antibodies such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, humanized antibodies and the like. These can be prepared by a conventional method using the above-mentioned protein of the present invention such as IPS-1 or a partial polypeptide thereof as an antigen. Among them, a monoclonal antibody is more preferable in terms of its specificity. preferable. An antibody that specifically binds to the protein of the present invention such as IPS-1 such as a monoclonal antibody or a partial polypeptide thereof is, for example, a disease caused by mutation or deletion of the protein of the present invention such as IPS-1. It is useful for diagnosing the above and clarifying molecular mechanisms such as IPS-1.

ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該ＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチド若しくはエピトープを含む断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）など任意の方法を用いることができる。以下にＩＰＳ−１等の前記本発明のタンパク質又はその部分ポリペプチドとして、ヒトＩＰＳ−１を例に挙げてＩＰＳ−１に対して特異的に結合するマウスのモノクローナル抗体、すなわち抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体の作製方法を説明する。 The antibody against the protein of the present invention such as IPS-1 or a partial polypeptide thereof can be obtained from an animal (preferably other than human) by using a conventional protocol, and the protein of the present invention such as IPS-1 or a partial polypeptide thereof. Alternatively, a hybridoma method (Nature 256, 495-497, 1975), a trioma method, which produces an antibody produced by administration of a fragment containing an epitope, for example, monoclonal antibody preparation results in an antibody produced by a continuous cell line culture. Any method such as human B cell hybridoma method (Immunology Today 4, 72, 1983) and EBV-hybridoma method (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985) should be used. Can do. Hereinafter, as a protein of the present invention such as IPS-1 or a partial polypeptide thereof, a mouse monoclonal antibody that specifically binds to IPS-1 by taking human IPS-1 as an example, that is, anti-human IPS-1 A method for producing a monoclonal antibody will be described.

上記抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体は、抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、ヒトＩＰＳ−１を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。 The anti-human IPS-1 monoclonal antibody can be produced by culturing an anti-human IPS-1 monoclonal antibody-producing hybridoma in vivo or in vitro by a conventional method. For example, in an in vivo system, it can be obtained by culturing in the abdominal cavity of a rodent, preferably a mouse or a rat. In an in vitro system, it can be obtained by culturing in an animal cell culture medium. As a medium for culturing a hybridoma in an in vitro system, a cell culture medium such as RPMI 1640 or MEM containing an antibiotic such as streptomycin or penicillin can be exemplified. The anti-human IPS-1 monoclonal antibody-producing hybridoma immunizes, for example, BALB / c mice with human IPS-1, and spleen cells of the immunized mice and mouse NS-1 cells (ATCC TIB-18), Anti-human IPS-1 monoclonal antibody-producing hybridomas can be produced by cell fusion using conventional methods and screening using immunofluorescent staining patterns. In addition, as a method for separating and purifying the monoclonal antibody, any method can be used as long as it is a method generally used for protein purification, and liquid chromatography such as affinity chromatography can be specifically exemplified. .

また、本発明の上記ヒトＩＰＳ−１に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、そのヒトＩＰＳ−１を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。ヒトＩＰＳ−１に対する抗体は、ヒトＩＰＳ−１の分子機構を明らかにする上で有用である。 In order to produce a single-chain antibody against the human IPS-1 of the present invention, a single-chain antibody preparation method (US Pat. No. 4,946,778) can be applied. In addition, in order to express a humanized antibody, a transgenic mouse or other mammal is used, a clone expressing the human IPS-1 is isolated and identified using the above antibody, or affinity chromatography is used. The polypeptide can also be purified graphically. Antibodies against human IPS-1 are useful in clarifying the molecular mechanism of human IPS-1.

また上記抗ヒトＩＰＳ−１モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^３５Ｓ又は^３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記ヒトＩＰＳ−１の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。 Examples of the anti-human IPS-1 monoclonal antibody include fluorescent substances such as FITC (fluorescein isocyanate) or tetramethylrhodamine isocyanate, and radioisotopes such as ¹²⁵ I, ³² P, ¹⁴ C, ³⁵ S or ³ H. Or by using a fusion protein fused with an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase or phycoerythrin, or a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). Functional analysis can be performed. Examples of the immunological measurement method include RIA method, ELISA method, fluorescent antibody method, plaque method, spot method, hemagglutination method, and octalony method.

本発明のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物としては、ＩＰＳ−１遺伝子の機能が染色体上で欠損し、野生型において発現されるＩＰＳ−１を発現する機能が失われている非ヒト動物であれば特に制限されるものではない。本発明のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物としては、マウスやラット等のげっ歯類、特に、ＩＰＳ−１遺伝子の機能が染色体上で欠損したＩＰＳ−１ノックアウトマウスを好適に挙げることができ、ＩＰＳ−１ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用い、ＩＰＳ−１遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＩＰＳ−１遺伝子を、ウイルスベクターやプラスミドベクター等を用いてサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡシーケンシングにより特定することができる。次に、このＩＰＳ−１をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス：＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交雑させることによって、ＩＰＳ−１ノックアウトマウスを作製することができる。また、ＩＰＳ−１ノックアウトマウスにおいて、ＩＰＳ−１がノックアウトされているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＩＰＳ−１の発現の有無をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。ＩＰＳ−１ノックアウトマウスは、分子レベルでのＩＰＳ−１の作用を調べる上で有用である。 The IPS-1 knockout non-human animal of the present invention is a non-human animal in which the function of the IPS-1 gene is lost on the chromosome and the function of expressing IPS-1 expressed in the wild type is lost. There is no particular limitation. Preferred examples of the IPS-1 knockout non-human animal of the present invention include rodents such as mice and rats, in particular, IPS-1 knockout mice lacking the function of the IPS-1 gene on the chromosome. -1 knockout mice use gene fragments obtained from a mouse gene library by a method such as PCR, screen the IPS-1 gene, and use the virus vector or plasmid vector to screen the IPS-1 gene. It can be subcloned and identified by restriction enzyme mapping and DNA sequencing. Next, all or part of the gene encoding IPS-1 is replaced with a pMC1 neo gene cassette or the like, and the diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene and herpes simplex virus thymidine kinase (HSV) are placed on the 3 ′ end side. -Tk) A target vector is prepared by introducing a gene such as a gene. The prepared targeting vector is linearized, introduced into ES cells by electroporation (electroporation), etc., and homologous recombination is performed. Among the homologous recombinants, G418 and ganciclovia (GANC) ES cells that have undergone homologous recombination with antibiotics such as are selected. In addition, it is preferable to confirm whether the selected ES cell is the target recombinant by Southern blotting or the like. The confirmed ES cell clone is microinjected into a blastocyst of a mouse, and the blastocyst is returned to a temporary parent mouse to produce a chimeric mouse. When this chimeric mouse is crossed with a wild-type mouse, a heterozygous mouse (F1 mouse: +/−) can be obtained, and an IPS-1 knockout mouse is produced by crossing this heterozygous mouse. can do. In addition, as a method for confirming whether IPS-1 is knocked out in an IPS-1 knockout mouse, for example, RNA is isolated from the mouse obtained by the above method and examined by Northern blotting, etc. There is a method for examining the presence or absence of IPS-1 expression in the mouse by Western blotting or the like. IPS-1 knockout mice are useful for examining the action of IPS-1 at the molecular level.

本発明のＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法としては、本件タンパク質又は本件ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質を用いて、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法であれば特に制限されず、例えば、上記本件タンパク質又は組換えタンパク質を用いてＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化させ、Ｉ型インターフェロン等を製造することも可能である。また、被験物質が存在する細胞内でＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化させ、該プロモーターの活性化の程度を、被験物質を投与していない場合と比較・評価することにより、Ｉ型ＩＦＮプロモーター活性化機能を阻害（又は増強）する化合物をスクリーニングすることも可能である。さらに、ＩＰＳ−１は、インターフェロンαをはじめとする各種サイトカインの産生に関与する分子であることから、インターフェロンαが必要とされる疾病、例えば、ウイルス感染症の遺伝子治療に使用することができ、ＩＰＳ−１等の遺伝子のアンチセンス鎖は、形質細胞様樹状細胞からのインターフェロンαの過剰産生が病態と考えられているＳＬＥ(全身性エリテマトーデス)の遺伝子治療に使用することができる。また、ウイルス感染や自然免疫疾患の治療への遺伝子レベルでの研究において使用することも可能である。 As a method for activating the type I IFN promoter of the present invention, any method may be used as long as it activates the type I IFN promoter using a recombinant protein expressed in the host cell transformed with the present protein or the present DNA. Without being limited, for example, it is also possible to produce a type I interferon or the like by activating the type I IFN promoter using the present protein or recombinant protein. In addition, the type I IFN promoter is activated by activating the type I IFN promoter in a cell in which the test substance is present and comparing and evaluating the degree of activation of the promoter compared to the case where the test substance is not administered. It is also possible to screen for compounds that inhibit (or enhance) function. Furthermore, since IPS-1 is a molecule involved in the production of various cytokines including interferon α, it can be used for gene therapy for diseases requiring interferon α, for example, viral infections, Antisense strands of genes such as IPS-1 can be used for gene therapy of SLE (systemic lupus erythematosus), which is considered to be a pathological condition of overproduction of interferon α from plasmacytoid dendritic cells. It can also be used in genetic studies to treat viral infections and innate immune diseases.

また、本発明は、本件ＤＮＡをＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法に関する。ＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造における使用形態は特に制限されないが、本件ＤＮＡで形質転換した宿主細胞を培養することにより、組換えタンパク質として発現させる、ＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法などを好適に例示することができる。また、本発明は、本件タンパク質をＩ型ＩＦＮの製造に使用する方法にも関する。Ｉ型ＩＦＮの製造における使用形態は特に制限されないが、本件タンパク質を用いてＩ型ＩＦＮプロモーターを活性化させる、Ｉ型インターフェロン等の製造に使用する方法などを好適に例示することができる。 The present invention also relates to a method of using the present DNA for the production of a protein having IPS-1 activity. The form of use in the production of a protein having IPS-1 activity is not particularly limited, but is used for the production of a protein having IPS-1 activity that is expressed as a recombinant protein by culturing host cells transformed with the present DNA. The method of performing etc. can be illustrated suitably. The present invention also relates to a method of using the present protein for the production of type I IFN. Although there are no particular limitations on the form of use in the production of type I IFN, preferred examples include the method used for the production of type I interferon, etc., in which the present protein is used to activate the type I IFN promoter.

本発明のＩ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法としては、ＩＰＳ−１遺伝子の機能を染色体上で欠損させたＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物をＩ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物として使用する方法であれば特に制限されず、Ｉ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したとは、各種ウイルス（例えば、ニューカッスル病ウイルス：ＮＤＶ、水疱性口内炎ウイルス：ＶＳＶ、センダイウイルス：ＳｅＶ、及び脳心筋炎ウイルス：ＥＭＣＶ等のＲＮＡウイルス）の感染に対する各種サイトカイン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＬ−６など）による抗ウイルス応答機能が喪失していることをいい、上記ＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物は、I型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失していることから、マウス内においてウイルスがより活発に増殖するという性質を有している。従って、ＩＰＳ−１ノックアウトマウスは、ウイルス感染のモデルマウスとして利用することができ、このマウスを用いて抗ウイルス薬の開発などへの応用が期待される。また、インターフェロン等のウイルス応答機能により、ｉｎｖｉｔｒｏでは培養が難しいとされているウイルスであっても、このマウス由来の細胞を適用すれば、インターフェロン等の抗ウイルス応答機能が抑制されているため、培養することが可能であり、培養可能になれば、ウイルスのライフサイクルや感染メカニズムの理解、長鎖ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉの作用メカニズムの解明、さらにはそのウイルスに対する薬剤開発への応用が期待される。 As a method for use as a model animal in which the antiviral response function is lost due to the activation of the type I IFN promoter of the present invention, an IPS-1 knockout non-human animal in which the function of the IPS-1 gene is deleted on the chromosome is type I. The method is not particularly limited as long as the method is used as a model animal in which the antiviral response function is lost due to the activation of the IFN promoter, and the loss of the antiviral response function due to the activation of the type I IFN promoter means that various viruses (for example, Newcastle disease virus: NDV, vesicular stomatitis virus: VSV, Sendai virus: SeV, and encephalomyocarditis virus: RNA virus such as EMCV) (for example, interferon α, interferon β, IP-10, RANTES and IL-6, etc.) This means that the IPS-1 knockout non-human animal has lost the antiviral response function due to the activation of the type I IFN promoter, so that the virus is more active in the mouse. It has the property of proliferating. Therefore, the IPS-1 knockout mouse can be used as a model mouse for virus infection and is expected to be applied to the development of antiviral drugs using this mouse. In addition, even if it is a virus that is difficult to cultivate in vitro due to virus response functions such as interferon, if this mouse-derived cell is applied, antiviral response functions such as interferon are suppressed, Culturing is possible, and if culturing becomes possible, understanding of the life cycle and infection mechanism of the virus, elucidation of the action mechanism of RNAi by long dsRNA, and application to drug development for the virus are expected.

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.

（ＩＰＳ−１の同定）
本発明者らは、発現クローニングストラテジーにより、ＩＦＮβプロモーターを活性化する分子を同定した。発現プラスミドにクローニングしたｃＤＮＡライブラリーの一部を、１００個のｃＤＮＡのプールに細分し、各ＤＮＡプールを、ＩＦＮβプロモーターＬｕｃレポタープラスミドと共にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。平均的活性と比較して、５倍以上の活性を示すプールを陽性とした（図１ａ）。ヒトの胎盤、脾臓、抹消血白血球（ＰＢＬ）の各ｃＤＮＡライブラリーの一次スクリーニングにより、２８の陽性プールを得た。各陽性プールから、ＩＦＮβプロモーター活性化に関与する単一のクローンを単離した（図１ｂ）。 (Identification of IPS-1)
The inventors have identified a molecule that activates the IFNβ promoter by an expression cloning strategy. A portion of the cDNA library cloned into the expression plasmid was subdivided into pools of 100 cDNAs, and each DNA pool was transfected into HEK293 cells with the IFNβ promoter Luc reporter plasmid. Pools showing more than 5-fold activity compared to average activity were considered positive (FIG. 1a). Primary screening of human placenta, spleen, and peripheral blood leukocyte (PBL) cDNA libraries yielded 28 positive pools. From each positive pool, a single clone involved in IFNβ promoter activation was isolated (FIG. 1b).

２４００個のプールをスクリーニングした結果、合計１５のクローンを同定した。ＩＲＦ７のクローン６個、ＩＲＦ３のクローン３個、ＩＲＦ１のクローン２個及びＩＲＦ８のクローン１個を含む、１２個のクローンはプロモーターを活性化することがすでに報告されている（表１）。この他に、本発明者らは、新規ＩＦＮ誘導物質としてジンクフィンガータンパク質ＣＸＸＣ５及びプロテインキナーゼＣｄｃ４２ｂｐｂを同定した。さらに、本発明者らは、約８００倍の活性化を誘導する新規分子を単離した。このクローンは、５４０個のアミノ酸のオープンリーディングフレームからなり（図２ａ、２ｂ）、相同性検索により、Ｎ末端にＭｄａ−５／ヘリカードのＣＡＲＤに類似した領域が明らかとなった（同一性２７％）（図２ｃ）。比較分析により、かかるタンパク質が、ＲＩＧ−ＩのＣＡＲＤとも相同性を有することが示された（図２ｄ）。しかし、かかるタンパク質と他のＣＡＲＤ含有タンパク質との類似性は見い出せなかった。そこで、ＧＷＸＸＸＦφＸＡＬ（φは、疎水性）の保存配列を有するかかるドメインをＣＡＲＤ様ドメイン（ＣＬＤ）と命名した。Ｃ末端の非ＣＬＤ領域は、他の既知のタンパク質又はドメインと類似性はなかった。ＩＦＮβプロモーターの活性化能に基づき、このタンパク質をＩＦＮβプロモーター刺激剤−１としてＩＰＳ−１と命名した。
ヒトＩＰＳ−１の発現を、多組織ノーザンブロットによって調べた（図２ｅ）。ＩＰＳ−１ｍＲＮＡは、心臓及び骨格筋で多く発現したが、脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓及び膵臓ではわずかしか発現しなかった。
As a result of screening 2400 pools, a total of 15 clones were identified. Twelve clones, including six IRF7 clones, three IRF3 clones, two IRF1 clones and one IRF8 clone, have already been reported to activate the promoter (Table 1). In addition, the present inventors identified zinc finger protein CXXC5 and protein kinase Cdc42bpb as novel IFN inducers. In addition, we have isolated a novel molecule that induces about 800-fold activation. This clone consists of an open reading frame of 540 amino acids (FIGS. 2a and 2b), and a homology search revealed a region similar to the MDA-5 / Helicard CARD at the N-terminus (identity 27). %) (FIG. 2c). Comparative analysis showed that such proteins are also homologous to RIG-I CARD (FIG. 2d). However, no similarity was found between such proteins and other CARD containing proteins. Therefore, such a domain having a conserved sequence of GWXXXFφXAL (φ is hydrophobic) was named CARD-like domain (CLD). The C-terminal non-CLD region was not similar to other known proteins or domains. Based on the ability to activate the IFNβ promoter, this protein was named IPS-1 as IFNβ promoter stimulator-1.
Human IPS-1 expression was examined by multi-tissue northern blot (FIG. 2e). IPS-1 mRNA was highly expressed in heart and skeletal muscle, but only slightly in brain, placenta, lung, liver, kidney and pancreas.

（ＩＰＳ−１は、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する。）
ＨＥＫ２９３細胞内でのＦｌａｇ標識ＩＰＳ−１発現プラスミドの過剰発現は、ＩＦＮβプロモーターを用量依存的に活性化した（図３ａ）。同様に、ＩＰＳ−１の過剰発現は、ＩＲＦファミリーによって制御されているＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＳＲＥプロモーターを用量依存的に活性化した（図３ａ）。次に、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモーターＬｕｃコンストラクトを用いて、ＩＦＮαプロモーター活性化を分析した。ＩＰＳ−１のみの過剰発現は、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモーター活性化をわずかに誘導した（図３ｂ）。しかし、ＩＲＦ７が同時発現すると、ＩＦＮα４プロモーター、ＩＦＮα６プロモーターの両方が相乗的に活性化し（図３ｂ）、ＩＰＳ−１が、ＩＲＦ７媒介性転写活性を増強したことを示した。さらに、Ｆｌａｇ−ＩＰＳ−１と同時発現すると、Ｍｙｃ−ＩＲＦ３及びＭｙｃ−ＩＲＦ７がゆっくりと移動することを見い出した（図３ｃ）。この移動は、リン酸化によるものである。なぜなら、ホスファターゼ処理により、ゆっくりとした移動は消失し（データは示されていない）、ＩＰＳ−１が、ＩＲＦ３及びＩＲＦ７のリン酸化を誘導することを明らかにしたからである。 (IPS-1 activates the type I IFN promoter.)
Overexpression of Flag-tagged IPS-1 expression plasmid in HEK293 cells activated the IFNβ promoter in a dose-dependent manner (FIG. 3a). Similarly, IPS-1 overexpression activated the IP-10, RANTES and ISRE promoters controlled by the IRF family in a dose-dependent manner (FIG. 3a). Next, IFNα promoter activation was analyzed using IFNα4 and IFNα6 promoter Luc constructs. Overexpression of IPS-1 alone slightly induced IFNα4 and IFNα6 promoter activation (FIG. 3b). However, co-expression of IRF7 synergistically activated both IFNα4 and IFNα6 promoters (FIG. 3b), indicating that IPS-1 enhanced IRF7-mediated transcriptional activity. Furthermore, it was found that Myc-IRF3 and Myc-IRF7 migrate slowly when co-expressed with Flag-IPS-1 (FIG. 3c). This migration is due to phosphorylation. This is because phosphatase treatment abolished slow migration (data not shown) and revealed that IPS-1 induces phosphorylation of IRF3 and IRF7.

次に、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損マウス由来のマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）を用いて、ＩＰＳ−１が媒介するＩＦＮ誘導がこれらのキナーゼに依存するか否かを調べた。ＩＦＮβプロモーター活性は、ＩＰＳ−１発現プラスミドをトランスフェクトした野生型ＭＥＦで増加したが、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損ＭＥＦでは活性化は観察されなかった（図３ｄ）。他方、ＴＢＫ１の過剰発現は、野生型とＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損ＭＥＦとの両方でプロモーターを活性化した。同様に、ＴＢＫ１の発現は、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損細胞でＩＦＮα４プロモーターを活性化したが、ＩＰＳ−１の発現は活性化せず、ＩＰＳ−１依存性のＩＦＮプロモーター活性化にＴＢＫ１及びＩＫＫｉが必須であるあることを示した（図３ｄ）。 Next, using mouse embryo fibroblasts (MEF) derived from TBK1 / IKKi double-deficient mice, it was examined whether IPS-1-mediated IFN induction is dependent on these kinases. IFNβ promoter activity increased with wild-type MEFs transfected with IPS-1 expression plasmid, but no activation was observed with TBK1 / IKKi double-deficient MEFs (FIG. 3d). On the other hand, overexpression of TBK1 activated the promoter in both wild type and TBK1 / IKKi double-deficient MEFs. Similarly, TBK1 expression activated the IFNα4 promoter in TBK1 / IKKi double-deficient cells, but not IPS-1 expression, and TBK1 and IKKi activated IPS-1-dependent IFN promoter activation. It was shown to be essential (FIG. 3d).

本発明者らは、２つのＩＰＳ−１の欠損変異体、Ｎ末端ＣＬＤのみをコードするＩＰＳ−１Ｎと、Ｃ末端非ＣＬＤ領域のみを含むＩＰＳ−１Ｃとを作製した。ＩＰＳ−１Ｎの過剰発現は、ＩＦＮβプロモーターを活性化したが、全長の過剰発現と比べると活性化は弱かった。ＩＰＳ−１Ｃの発現は、プロモーターを活性化せず（図３ｅ）、ＩＰＳ−１が媒介するＩＦＮβプロモーター活性化には、構造全体が必要であることを示した。 The present inventors made two IPS-1 deletion mutants, IPS-1N encoding only the N-terminal CLD and IPS-1C containing only the C-terminal non-CLD region. Overexpression of IPS-1N activated the IFNβ promoter, but activation was weaker than full-length overexpression. Expression of IPS-1C did not activate the promoter (FIG. 3e), indicating that IPS-1 mediated IFNβ promoter activation required the entire structure.

（ＩＰＳ−１の発現は、抗ウイルス応答を与える。）
ＩＰＳ−１発現後の、内因性Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＮ誘導性遺伝子の誘導を分析した。ＨＥＫ２９３細胞におけるＦｌａｇ−ＩＰＳ−１の過剰発現は、内因性ＩＦＮβ（Ifnb）及び、ＩＰ−１０（Cxcl10）及びＧＡＲＧ１６（Ifit1）等のＩＦＮ誘導性遺伝子の誘導を刺激した（図４ａ）。さらに、培養上清内のＩＦＮα産生は、ＩＰＳ−１をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞でも観察され、この誘導は、ＩＲＦ７の同時発現によって増強した（図４ｂ）。このように、ＩＰＳ−１の発現は、これらの遺伝子の内因性プロモーター活性化を導く。次に、コントロール又はＩＰＳ−１をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞にＶＳＶを感染し、感染の２４時間後にウイルス力価を測定した。ウイルス力価は、コントロール細胞と比較してＩＰＳ−１発現細胞で著しく減少した（図４ｃ）。これらの結果は、ＩＰＳ−１のみの発現が、恐らくＩ型ＩＦＮ等の抗ウイルス性サイトカインを産生することによって、抗ウイルス応答を与えるのに十分であることを示唆した。 (Expression of IPS-1 gives an antiviral response.)
Induction of endogenous type I IFN and IFN-inducible genes after IPS-1 expression was analyzed. Overexpression of Flag-IPS-1 in HEK293 cells stimulated the induction of endogenous IFNβ (Ifnb) and IFN-inducible genes such as IP-10 (Cxcl10) and GARG16 (Ifit1) (FIG. 4a). Furthermore, IFNα production in the culture supernatant was also observed in HEK293 cells transfected with IPS-1, and this induction was enhanced by co-expression of IRF7 (FIG. 4b). Thus, IPS-1 expression leads to endogenous promoter activation of these genes. Next, control or IPS-1 transfected HEK293 cells were infected with VSV, and the virus titer was measured 24 hours after infection. Viral titer was significantly reduced in IPS-1-expressing cells compared to control cells (FIG. 4c). These results suggested that expression of IPS-1 alone was sufficient to confer an antiviral response, possibly by producing antiviral cytokines such as type I IFN.

（ＩＰＳ−１はＮＦ-κＢを活性化する。）
ＩＰＳ−１の発現がＮＦ−κＢを活性化するか否かを調べるために、ＨＥＫ２９３細胞に、ＩＰＳ−１を、ＥＬＡＭ１プロモーターＬｕｃコンストラクトとトランジェントにトランスフェクトした。ＩＰＳ−１の発現は、用量依存的にＮＦ-κＢ活性化を導いた（図５ａ）。さらに、この活性化は、触媒陰性（catalytic negative）ＩＫＫβ（Ｋ４４Ａ）の同時発現によって阻害された（図５ｂ）。ＩＰＳ−１ＮもＩＰＳ−１ＣもＮＦ−κＢを活性化しなかった（図５ｃ）。さらに、ＩＰＳ−１発現プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の培養上清において、ＩＬ−８の産生が観察されたが、コントロールプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞では観察されなかった。これは、ＩＰＳ−１が内因性ＮＦ−κＢプロモーターも活性化することを示唆している（図５ｄ）。ＩＦＮα及びＩＦＮβプロモーター活性化と異なり、ＩＰＳ−１の過剰発現は、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損ＭＥＦでＥＬＡＭ１活性化を誘導した（図５ｅ）。さらに、ＴＲＡＦ６欠損ＭＥＦでは、ＩＰＳ−１によるＮＦ−κＢ及びＩＦＮβプロモーター活性化が引き続き観察された。これらの結果は、ＩＰＳ−１によるＮＦ−κＢ活性化は、ＩＫＫβ依存的であるが、ＴＲＡＦ６及びＴＢＫ１／ＩＫＫｉに非依存的であることを示している。 (IPS-1 activates NF-κB.)
To examine whether IPS-1 expression activates NF-κB, HEK293 cells were transfected with IPS-1 transiently with the ELAM1 promoter Luc construct. Expression of IPS-1 led to NF-κB activation in a dose-dependent manner (FIG. 5a). Furthermore, this activation was inhibited by the co-expression of catalytic negative IKKβ (K44A) (FIG. 5b). Neither IPS-1N nor IPS-1C activated NF-κB (FIG. 5c). Furthermore, IL-8 production was observed in the culture supernatant of HEK293 cells transfected with the IPS-1 expression plasmid, but not in HEK293 cells transfected with the control plasmid. This suggests that IPS-1 also activates the endogenous NF-κB promoter (FIG. 5d). Unlike IFNα and IFNβ promoter activation, overexpression of IPS-1 induced ELAM1 activation in TBK1 / IKKi double-deficient MEFs (FIG. 5e). Furthermore, in TRAF6-deficient MEFs, NF-κB and IFNβ promoter activation by IPS-1 was continuously observed. These results indicate that NF-κB activation by IPS-1 is IKKβ-dependent but independent of TRAF6 and TBK1 / IKKi.

（ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉ、Ｍｄａ５、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１と複合体を形成する。）
ＩＰＳ−１、Ｍｄａ５及びＲＩＧ−Ｉの配列類似性により、これらの分子が物理的に互いに会合するかどうかを調べてみた。ＨＥＫ２９３細胞に、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１を、Ｆｌａｇ−Ｍｄａ５、Ｆｌａｇ−Ｍｄａ５△Ｃ、Ｆｌａｇ−ＲＩＧ−Ｉ又はＦｌａｇ−ＲＩＧ−Ｉ△Ｃとトランスフェクトし、細胞可溶化液を抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降した。Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１及びＦｌａｇ−ＲＩＧ−Ｉ△Ｃの両方を発現する細胞で、免疫共沈降が観察された（図６ａ）。さらに、弱いものの、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１及びＦｌａｇ−Ｍｄａ５△Ｃ間で会合が観察された（図６ａ）。ＩＰＳ−１のＣＬＤが発現したときにも、類似した会合が観察された（データは示されていない）。これらの結果は、ＩＰＳ−１のＣＬＤがＲＩＧ−Ｉ及びＭｄａ−５のＮ末端ＣＡＲＤ含有領域と会合することを示した。 (IPS-1 forms a complex with RIG-I, Mda5, FADD and RIP1.)
We examined whether these molecules are physically associated with each other due to the sequence similarity of IPS-1, Mda5 and RIG-I. HEK293 cells were transfected with Myc-IPS-1 with Flag-Mda5, Flag-Mda5ΔC, Flag-RIG-I or Flag-RIG-IΔC and the cell lysate was immunoprecipitated with anti-Myc antibody did. Co-immunoprecipitation was observed in cells expressing both Myc-IPS-1 and Flag-RIG-IΔC (FIG. 6a). Furthermore, although weak, an association was observed between Myc-IPS-1 and Flag-Mda5ΔC (FIG. 6a). Similar association was also observed when IPS-1 CLD was expressed (data not shown). These results indicated that IPS-1 CLD was associated with the N-terminal CARD containing region of RIG-I and Mda-5.

ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１が、ｄｓＲＮＡが誘導する抗ウイルス応答に関連していたので、これらの分子の相互作用を調べた。Ｆｌａｇ−ＦＡＤＤ及びＦｌａｇ−ＲＩＰ１は、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１と共沈殿したが、Ｆｌａｇ−ＴＢＫ１はしなかった（図６ｂ）。ＦＡＤＤとの相互作用に、ＩＰＳ−１Ｃは必須であったが、ＩＰＳ−１Ｎは必須でなかった（図６ｃ）。さらに、ＩＰＳ−１が媒介するＩＦＮβプロモーター活性化は、Ｎ末端デスエフェクタードメインをコードするＦＡＤＤＤＥＤの発現によって減少し、ＦＡＤＤＤＥＤがＩＰＳ−１依存性シグナル伝達に関連するドミナントネガティブな変異体として作用することを示唆した（図６ｄ）。 Since FADD and RIP1 were associated with dsRNA-induced antiviral responses, the interaction of these molecules was investigated. Flag-FADD and Flag-RIP1 co-precipitated with Myc-IPS-1, but not Flag-TBK1 (FIG. 6b). IPS-1C was essential for interaction with FADD, but IPS-1N was not essential (FIG. 6c). Furthermore, IPS-1 mediated IFNβ promoter activation is reduced by the expression of FADD DED encoding the N-terminal death effector domain, and FADD DED acts as a dominant negative mutant associated with IPS-1-dependent signaling (Fig. 6d).

（ＩＰＳ−１ノックダウンはＩＦＮ応答をブロックする。）
ｓｉＲＮＡオリゴを用いてＩＰＳ−１の内因性発現を減少し、ＩＰＳ−１の生理機能を調べた。ヒトＩＰＳ−１ｍＲＮＡの異なる部分を標的とする二本鎖２１−ｍｅｒＲＮＡを３個用意した。パイロット実験では、トランスフェクションの４８時間後に、２個のｓｉＲＮＡ（Ｉｐｓ−１−１、Ｉｐｓ−１−２）が、ＲＴ−ＰＣＲで定量したように、Ｈｅｌａ細胞内のＩＰＳ−１のノックダウンを誘導した（図７ａ）。かかるｓｉＲＮＡによるＩＰＳ−１の発現の減少は、７日間続いた（データは示されていない）。そこで、かかる２つのｓｉＲＮＡを新たな分析に使用した。コントロールｓｉＲＮＡ（コントロール）、Ｉｐｓ−１−１又はＩｐｓ−１−２を、ＨＤＫ２９３細胞にトランスフェクトし、全ＲＮＡを、４８時間後にＲＴ−ＰＣＲ分析用に調製し、標的遺伝子の発現の減少を確認したが、Ｇａｐｄｈの発現には何の影響もなかった（図７ａ）。 (IPS-1 knockdown blocks the IFN response.)
The endogenous expression of IPS-1 was decreased using siRNA oligos, and the physiological function of IPS-1 was examined. Three double-stranded 21-mer RNAs targeting different parts of human IPS-1 mRNA were prepared. In a pilot experiment, 48 hours after transfection, two siRNAs (Ips-1-1, Ips-1-2) knocked down IPS-1 in Hela cells as quantified by RT-PCR. Induced (Figure 7a). This reduction in IPS-1 expression by siRNA lasted for 7 days (data not shown). Therefore, these two siRNAs were used for new analysis. Control siRNA (control), Ips-1-1 or Ips-1-2, was transfected into HDK293 cells and total RNA was prepared for RT-PCR analysis 48 hours later to confirm reduced expression of the target gene However, it had no effect on Gapdh expression (FIG. 7a).

ｄｓＲＮＡトランスフェクションが誘導するＩＦＮβプロモーター活性化に対する、ｓｉＲＮＡの影響を調べてみた。コントロール、Ｉｐｓ−１−１又はＩｐｓ−１−２で処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＩＦＮβプロモーターＬｕｃコンストラクトをトランスフェクトし、その後、合成ｄｓＲＮＡポリ（Ｉ：Ｃ）を異なる濃度でトランスフェクトした。Ｉｐｓ−１発現のノックダウンは、ポリ（Ｉ：Ｃ）刺激後にプロモーター活性の減少を導いた（図７ｂ）。さらに、コントロール又はＩｐｓ−１−１ｓｉＲＮＡをトランジェントにトランスフェクション処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＲＩＧ−Ｉ△Ｃ又はＴｒｉｆを発現させた。ＲＩＧ−Ｉ△Ｃは恒常的にＩＦＮβプロモーターを活性化することを示した（Nat Immunol. 5, 730-737, 2004）。ＲＩＧ−Ｉ△Ｃが誘導するプロモーター活性化は、Ｉｐｓ−１−１処理細胞で減少したが、Ｔｒｉｆが誘導する活性化は、これらの細胞で減少しなかった（図７ｃ）。したがって、ＩＰＳ−１は、ＲＩＧ−Ｉ依存性シグナル伝達に必須であるが、Ｔｒｉｆ依存性シグナル伝達には必須でない。 We examined the effect of siRNA on IFNβ promoter activation induced by dsRNA transfection. HEK293 cells treated with control, Ips-1-1 or Ips-1-2 were transfected with the IFNβ promoter Luc construct and then transfected with different concentrations of synthetic dsRNA poly (I: C). Knockdown of Ips-1 expression led to a decrease in promoter activity after poly (I: C) stimulation (FIG. 7b). Furthermore, RIG-IΔC or Trif was expressed in HEK293 cells transiently transfected with control or Ips-1-1 siRNA. RIG-IΔC has been shown to constitutively activate the IFNβ promoter (Nat Immunol. 5, 730-737, 2004). Promoter activation induced by RIG-IΔC was reduced in Ips-1-1 treated cells, whereas activation induced by Trif was not reduced in these cells (FIG. 7c). Thus, IPS-1 is essential for RIG-I dependent signaling but not for Trif dependent signaling.

ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激したＩＦＮβ及びＩＦＮ誘導性遺伝子の発現を調べた。ポリ（Ｉ：Ｃ）トランスフェクションの３時間後のＩＦＮβ及びＩＰ−１０メッセージの誘導は、コントロールで処理した細胞と比較して、Ｉｐｓ−１−１及びＩｐｓ−１−２で処理したＨＥＫ２９３細胞で著しく減少し（図７ｄ）、ＩＰＳ−１が、ｄｓＲＮＡが媒介する遺伝子誘導に必須であることを示唆した。次に、ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞を、細胞変異性でないＶＳＶ変異体（ＶＳＶｍｔ）（J Virol. 76, 8011-8018, 2002）又はＮＤＶで感染し、ＩＦＮαを測定した。Ｉｐｓ−１−１又はＩｐｓ−１−２で処理した細胞における、ウイルス感染２４時間後のＩＦＮα産生は、コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞と比較して、顕著に減少した（図７ｅ）。したがって、ＩＰＳ−１は、ウイルス感染に対する抗ウイルス応答にも、ｄｓＲＮＡ刺激にも必須である。 The expression of IFNβ and IFN-inducible genes stimulated with poly (I: C) was examined. Induction of IFNβ and IP-10 message 3 hours after poly (I: C) transfection was observed in HEK293 cells treated with Ips-1-1 and Ips-1-2 compared to cells treated with control. Significantly decreased (FIG. 7d), suggesting that IPS-1 is essential for dsRNA-mediated gene induction. Next, HEK293 cells treated with siRNA were infected with non-cell-mutable VSV mutant (VSVmt) (J Virol. 76, 8011-8018, 2002) or NDV, and IFNα was measured. In cells treated with Ips-1-1 or Ips-1-2, IFNα production 24 hours after virus infection was significantly reduced compared to cells treated with control siRNA (FIG. 7e). Therefore, IPS-1 is essential for both antiviral response to viral infection and dsRNA stimulation.

（ホモ型ノックアウトマウスは健康に生育する。）
ＩＰＳ^-/-マウスは、予想されたメンデル比で生まれ、繁殖性であり、健康に育ち、１０週の年齢まで異常を示さなかった。また、ホモ接合体（−／−）において、ＩＰＳ−１遺伝子の機能が欠損していることを確認するためサザンブロット分析を行った。マウスの尾部より抽出したゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した遺伝子断片と、以下に示した放射能標識をしたマウスゲノム由来のプローブ（配列番号２７）を用いてサザンブロット法により確認した。その結果、野生型（＋／＋）には単一の１１．３ｋｂバンドが、ホモ接合体（−／−）には７．０ｋｂバンドが、ヘテロ接合体（＋／−）にはその両方のバンドが得られた（図８ｂ参照）。次に、ホモ接合体（−／−）において、ＩＰＳ−１遺伝子が発現していないことを確認するためノーザンブロット分析を行った（図８ｃ参照）。さらに、ＩＰＳ−１の発現がタンパク質レベルでも消失していることを確認するために、ウェスタンブロット分析を行った（図８ｄ参照）。図８のｄの矢印に示した箇所が内在性ＩＰＳ−１タンパクであり、野生型（＋／＋）では現れているバンドが、ホモ接合体（−／−）には現れていないのが確認できる。
マウスゲノム由来のプローブ：AACCATGCAGGCCAGGAAGCTGGATTGTTACAATGACCTTCGTGGTTCAGCA
AGGACAAGGCTATCTATAACTGCATTTAGACGCTGGTCCTCACAGGCCTGGTGCTCTTTTTGCAAGAATTAAATAAGAGGCCCTTGTTGCTTTCAACAAGACTAAGTCACTAAACCTCACTTCAGAGTTGTTTTTTACATTTTCAAATTTGTTTTGTAGGGACAGGCAGTTGTGGACATCAGA（配列番号２７） (Homo knockout mice grow healthy.)
IPS ^{− / −} mice were born at the expected Mendelian ratio, were fertile, grew up healthy and showed no abnormalities until the age of 10 weeks. In addition, Southern blot analysis was performed to confirm that the function of the IPS-1 gene was defective in the homozygote (− / −). It was confirmed by Southern blotting using a gene fragment obtained by digesting genomic DNA extracted from the tail of the mouse with EcoRI and a probe (SEQ ID NO: 27) derived from the mouse genome labeled as shown below. As a result, the wild type (+ / +) has a single 11.3 kb band, the homozygote (-/-) has a 7.0 kb band, and the heterozygote (+/-) has both. A band was obtained (see FIG. 8b). Next, Northern blot analysis was performed to confirm that the IPS-1 gene was not expressed in the homozygote (− / −) (see FIG. 8c). Furthermore, Western blot analysis was performed to confirm that IPS-1 expression was also lost at the protein level (see FIG. 8d). The part indicated by the arrow d in FIG. 8 is the endogenous IPS-1 protein, and it is confirmed that the band appearing in the wild type (+ / +) does not appear in the homozygote (− / −). it can.
Mouse genome-derived probe: AACCATGCAGGCCAGGAAGCTGGATTGTTACAATGACCTTCGTGGTTCAGCA
AGGACAAGGCTATCTATAACTGCATTTAGACGCTGGTCCTCACAGGCCTGGTGCTCTTTTTGCAAGAATTAAATAAGAGGCCCTTGTTGCTTTCAACAAGACTAAGTCACTAAACCTCACTTCAGAGTTGTTTTTTACATTTTCAAATTTGTTTTGTAGGGACAGGCAGTTGTGGACATCAGA (SEQ ID NO: 27)

（ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスは、各ＲＮＡウイルスに対する反応性を喪失し、ウイルス感染のモデルマウスとして利用できる。）
ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおける各ＲＮＡウイルス、具体的にはニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）に対する反応性を調べた。まず、野生型（＋／＋）、及びＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦに１本鎖ＲＮＡウイルスであるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）を感染させ、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα，ＩＦＮβ，ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した。結果は図９のａに示すとおりである。次に、野生型（＋／＋）、及びＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶ、ＶＳＶ、ＳｅＶを感染させ、０、９、１８時間後に細胞からＲＮＡを回収し、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６の各ｍＲＮＡに相補的なプローブを用いて、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＲＮＡＴＥＳ、及びＩＬ−６の遺伝子発現をノーザンブロット法にて検討した。なお、プローブは以下の（１）〜（５）に示した。また、ポジティブコントロールとして、β−ａｃｔｉｎを用い、プローブは、Hemmi H et al., J. Exp. Med., 199: 1641-1650, 2004に記載のプローブを用いた。結果は図９のｂに示すとおりである。図９のａ及びｂより、ＩＰＳ−１欠損マウスは、上記ウイルス（ＮＤＶ、ＶＳＶ及びＳｅＶ）による各種サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６）の産生が抑制されることが確認された。
（１）ＩＦＮ−β；CCTGCTGTGCTTCTCCACCACAGCCCTCTCCATCAACTATAAGCAGCTCCAGCTCCAAGAAA
GGACGAACATTCGGAAATGTCAGGAGCTCCTGGAGCAGCTGAATGGAAAGATCAACCTCACCTACAGGGCGGACTTCAAGATCCCTATGGAGATGACGGAGAAGATGCAGAAGAGTTACACTGCCTTTGCCATCCAAGAGATGCTCCAGAATGTCTTTCTTGTCTTCAGAAACAATTTCTCCAGCACTGGGTGGAATGAGACTATTGTTGTACGTCTCCTGGATGAACTCCACCAGCAGACAGTGTTTCTGAAGACAGTACTAGAGGAAAAGCAAGAGGAAAGATTGACGTGGGAGATGTCCTCAACTGCTCTCCACTTGAAGAGCTATTACTGGAGGGTGCAAAGGTACCTTAAACTCATGAAGTACAACAGCTACGCCTG（配列番号２８）
（２）ＩＦＮα；Hemmi H et al., J. Exp. Med., 199: 1641-1650, 2004に記載のプローブ
（３）ＩＰ−１０；CATCAGCACCATGAACCCAAGTGCTGCCGTCATTTTCTGCCTCATCCTGCTGGGTCTGAGTG
GGACTCAAGGGATCCCTCTCGCAAGGACGGTCCGCTGCAACTGCATCCATATCGATGACGGGCCAGTGAGAATGAGGGCCATAGGGAAGCTTGAAATCATCCCTGCGAGCCTATCCTGCCCACGTGTTGAGATCATTGCCACGATGAAAAAGAATGATGAGCAGAGATGTCTGAATCCGGAATCTAAGACCATCAAGAATTTAATGAAAGCGTTTAGCCAAAAAAGGTCTAAAAGGGCTCCTTAACTGGAGAGAAGCCACGCACACACCCCGGTGCTGTGATGGACAGCAGAGAGCCTGTCTCTCCATCACTCCCCTTTACCCAGTGGATGGCTAGTCCTAATTGCCCTTGGTCTTCTGAAAGGTGACCAGCCGTGGTCACATCAGCTGCTACTCCTCCTGCAGGATGATGGTTAAGCCATGGTCCTGAGACAAAAGTAACTGCCGAAGCAAGAATTCTTTAAGGGCTGGTCTGAGTCCTCACTCAAGTGGCTGGGATGGCTGTCCTAGCTC（配列番号２９）
（４）ＲＡＮＴＥＳ；CAGCCGCCCTCTGCACCCCCGCACCTGCCTCACCATATGGCTCGGACACCACTCCCTGCT
GCTTTGCCTACCTCTCCCTCGCGCTGCCTCGTGCCCACGTCAAGGAGTATTTCTACACCAGCAGCAAGTGCTCCAATCTTGCAGTCGTGTTTGTCACTCGAAGGAACCGCCAAGTGTGTGCCAACCCAGAGAAGAAGTGGGTTCAAGAATACATCAACTATTTGGAGATGAGCTAGGATAGAGGGTTTCTTGATTCTGACCCTGTATAGCTTCCCTGTCATTGCTTGCTCTAGTCC（配列番号３０）
（５）ＩＬ−６；GTTCCTCTCTGCAAGAGACTTCCATCCAGTTGCCTTCTTGGGACTGATGCTGGTGACAACCACG
GCCTTCCCTACTTCACAAGTCCGGAGAGGAGACTTCACAGAGGATACCACTCCCAACAGACCTGTCTATACCACTTCACAAGTCGGAGGCTTAATTACACATGTTCTCTGGGAAATCGTGGAAATGAGAAAAGAGTTGTGCAATGGCAATTCTGATTGTATGAACAACGATGATGCACTTGCAGAAAACAATCTGAAACTTCCAGAGATACAAAGAAATGATGGATGCTACCAAACTGGATATAATCAGGAAATTTGCCTATTGAAAATTTCCTCTGGTCTTCTGGAGTACCATAGCTACCTGGAGTACATGAAGAACAACTTAAAAGATAACAAGAAAGACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGAGATAC（配列番号３１） (IPS-1 deficient (− / −) mice lose reactivity to each RNA virus and can be used as model mice for virus infection.)
The reactivity of each IPS-1-deficient (− / −) mouse to each RNA virus, specifically Newcastle disease virus (NDV), vesicular stomatitis virus (VSV), and Sendai virus (SeV) was examined. First, Newcastle disease virus (NDV), vesicular stomatitis virus (VSV), and Sendai virus (SeV) which are single-stranded RNA viruses in wild-type (+ / +) and IPS-1-deficient (-/-) MEFs ) And the concentration of cytokines (IFNα, IFNβ, IL-6) in the culture supernatant 24 hours later was measured by the ELISA method. The result is as shown in FIG. Next, wild type (+ / +) and IPS-1-deficient (-/-) MEFs were infected with NDV, VSV, and SeV, and RNA was recovered from the cells after 0, 9, and 18 hours, and IFNβ, IFNα The gene expression of IFNα, IFNβ, IFNα, IP-10, RNATES, and IL-6 was examined by Northern blotting using probes complementary to mRNAs of IP-10, RANTES, and IL-6. The probes are shown in the following (1) to (5). Moreover, (beta) -actin was used as positive control and the probe as described in Hemmi H et al., J. Exp. Med., 199: 1641-1650, 2004 was used for the probe. The result is as shown in FIG. From a and b in FIG. 9, in IPS-1-deficient mice, the production of various cytokines (IFNα, IFNβ, IP-10, RANTES, IL-6) by the viruses (NDV, VSV, and SeV) is suppressed. confirmed.
(1) IFN-β; CCTGCTGTGCTTCTCCACCACAGCCCTCTCCATCAACTATAAGCAGCTCCAGCTCCAAGAAA
GGACGAACATTCGGAAATGTCAGGAGCTCCTGGAGCAGCTGAATGGAAAGATCAACCTCACCTACAGGGCGGACTTCAAGATCCCTATGGAGATGACGGAGAAGATGCAGAAGAGTTACACTGCCTTTGCCATCCAAGAGATGCTCCAGAATGTCTTTCTTGTCTTCAGAAACAATTTCTCCAGCACTGGGTGGAATGAGACTATTGTTGTACGTCTCCTGGATGAACTCCACCAGCAGACAGTGTTTCTGAAGACAGTACTAGAGGAAAAGCAAGAGGAAAGATTGACGTGGGAGATGTCCTCAACTGCTCTCCACTTGAAGAGCTATTACTGGAGGGTGCAAAGGTACCTTAAACTCATGAAGTACAACAGCTACGCCTG (SEQ ID NO: 28)
(2) IFNα; probe described in Hemmi H et al., J. Exp. Med., 199: 1641-1650, 2004 (3) IP-10; CATCAGCACCATGAACCCAAGTGCTGCCGTCATTTTCTGCCTCATCCTGCTGGGTCTGAGTG
GGACTCAAGGGATCCCTCTCGCAAGGACGGTCCGCTGCAACTGCATCCATATCGATGACGGGCCAGTGAGAATGAGGGCCATAGGGAAGCTTGAAATCATCCCTGCGAGCCTATCCTGCCCACGTGTTGAGATCATTGCCACGATGAAAAAGAATGATGAGCAGAGATGTCTGAATCCGGAATCTAAGACCATCAAGAATTTAATGAAAGCGTTTAGCCAAAAAAGGTCTAAAAGGGCTCCTTAACTGGAGAGAAGCCACGCACACACCCCGGTGCTGTGATGGACAGCAGAGAGCCTGTCTCTCCATCACTCCCCTTTACCCAGTGGATGGCTAGTCCTAATTGCCCTTGGTCTTCTGAAAGGTGACCAGCCGTGGTCACATCAGCTGCTACTCCTCCTGCAGGATGATGGTTAAGCCATGGTCCTGAGACAAAAGTAACTGCCGAAGCAAGAATTCTTTAAGGGCTGGTCTGAGTCCTCACTCAAGTGGCTGGGATGGCTGTCCTAGCTC (SEQ ID NO: 29)
(4) RANTES; CAGCCGCCCTCTGCACCCCCGCACCTGCCTCACCATATGGCTCGGACACCACTCCCTGCT
GCTTTGCCTACCTCTCCCTCGCGCTGCCTCGTGCCCACGTCAAGGAGTATTTCTACACCAGCAGCAAGTGCTCCAATCTTGCAGTCGTGTTTGTCACTCGAAGGAACCGCCAAGTGTGTGCCAACCCAGAGAAGAAGTGGGTTCAAGAATACATCAACTATTTGGAAGTGCCTGTCTCTATCTCTCTCTC
(5) IL-6; GTTCCTCTCTGCAAGAGACTTCCATCCAGTTGCCTTCTTGGGACTGATGCTGGTGACAACCACG
GCCTTCCCTACTTCACAAGTCCGGAGAGGAGACTTCACAGAGGATACCACTCCCAACAGACCTGTCTATACCACTTCACAAGTCGGAGGCTTAATTACACATGTTCTCTGGGAAATCGTGGAAATGAGAAAAGAGTTGTGCAATGGCAATTCTGATTGTATGAACAACGATGATGCACTTGCAGAAAACAATCTGAAACTTCCAGAGATACAAAGAAATGATGGATGCTACCAAACTGGATATAATCAGGAAATTTGCCTATTGAAAATTTCCTCTGGTCTTCTGGAGTACCATAGCTACCTGGAGTACATGAAGAACAACTTAAAAGATAACAAGAAAGACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGAGATAC (SEQ ID NO: 31)

さらに、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスの腹腔マクロファージに脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を感染させ、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した。結果は図９のｃに示すとおりである。次に、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスの腹腔マクロファージにＥＭＣＶを感染させ、０、６、９時間経過後、細胞よりＲＮＡを回収し、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＲＮＡＴＥＳ、及びＩＬ−６の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。なお、ポジティブコントロールとして、β−ａｃｔｉｎを用いた。結果は図９のｄに示すとおりである。図９のｃ及びｄより、ＩＰＳ−１欠損マウスは、ＥＭＣＶによる各種サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６）の産生が抑制されることが確認された。 Furthermore, peritoneal macrophages of wild type (+ / +) and IPS-1 deficient (− / −) mice were infected with encephalomyocarditis virus (EMCV), and cytokines (IFNα, IFNβ) in the culture supernatant 24 hours later , IL-6) concentration was measured by the ELISA method. The result is as shown in FIG. Next, EMCV was infected to peritoneal macrophages of wild-type (+ / +) and IPS-1-deficient (-/-) mice, and after 0, 6, and 9 hours, RNA was collected from the cells, and IFNβ, IFNα , IP-10, RNATES, and IL-6 gene expression were examined by RT-PCR. Note that β-actin was used as a positive control. The result is as shown in d of FIG. From c and d in FIG. 9, it was confirmed that production of various cytokines (IFNα, IFNβ, IP-10, RANTES, IL-6) by EMCV was suppressed in IPS-1-deficient mice.

これらの結果より、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスは、I型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失しており、マウス内においてウイルスがより活発に増殖するという性質を有している。したがって、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスは、ウイルス感染のモデルマウスとして利用できることが明らかとなった。 From these results, IPS-1-deficient (− / −) mice have lost the antiviral response function due to the activation of the type I IFN promoter, and have the property that the virus proliferates more actively in the mice. is doing. Therefore, it was revealed that IPS-1-deficient (− / −) mice can be used as model mice for virus infection.

（ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおけるポリＩ：Ｃに対する反応性を喪失し、ウイルス感染のモデルマウスとして利用できる。）
次に、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにポリＩ：Ｃを投与し、ポリＩ：Ｃの投与量及び投与時間における各種サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、及びＩＬ−６）の産生を調べた。まず、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおけるＮＤＶ感染応答性シグナル伝達経路を解析した。野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦを図で示した濃度のポリＩ：Ｃで刺激し、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した。結果は図１０ａに示すとおりである。次に、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦをポリＩ：Ｃで刺激した。０、２、４、６時間後に細胞からＲＮＡを回収し、上記に示したＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＩＬ−６の各ｍＲＮＡに相補的なプローブを用いて、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、及びＩＬ−６の遺伝子発現をノーザンブロット法にて検討した。なお、ポジティブコントロールとして、β−アクチン（β−actin）を用いた。結果は図１０のｂに示すとおりである。さらに、ヘテロ型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにポリＩ：Ｃを静脈内注射し、計時的に採取した血清中におけるサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した。結果は図１０のｃに示すとおりである。 (The responsiveness to poly I: C in IPS-1-deficient (− / −) mice is lost and can be used as a model mouse for virus infection.)
Next, poly I: C was administered to IPS-1-deficient (-/-) mice, and various cytokines (IFNα, IFNβ, IP-10, and IL-6) at the dose and administration time of poly I: C The production of was examined. First, NDV infection responsive signal transduction pathways in IPS-1 deficient (− / −) mice were analyzed. Wild-type (+ / +), IPS-1-deficient (-/-) MEFs were stimulated with the indicated concentrations of poly I: C, and cytokines (IFNα, IFNβ, IL in the culture supernatant after 24 hours) -6) The concentration was measured by the Eliza method. The result is as shown in FIG. 10a. Next, wild type (+ / +) and IPS-1 deficient (− / −) MEFs were stimulated with poly I: C. RNA was collected from the cells after 0, 2, 4, and 6 hours, and IFNβ, IFNα, IP-10 was probed using probes complementary to the IFNβ, IFNα, IP-10, and IL-6 mRNAs shown above. , And IL-6 gene expression was examined by Northern blotting. In addition, (beta) -actin ((beta) -actin) was used as positive control. The result is as shown in FIG. Furthermore, cytokines (IFNα, IFNβ, IL-6) in serum obtained by intravenous injection of poly I: C into heterozygous (+ / +) and IPS-1-deficient (− / −) mice The concentration was measured by the Eliza method. The result is as shown in FIG.

図１０のａ〜ｃに示される結果より、ＩＰＳ−１欠損マウスはポリＩ：Ｃにより誘導される各種サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、ＩＬ−６）の産生が抑制されることが確認された。これらの結果は、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスが、ウイルス感染のモデルマウスとして利用できることを支持するものである。 From the results shown in FIGS. 10a to 10c, it is confirmed that IPS-1-deficient mice suppress the production of various cytokines (IFNα, IFNβ, IP-10, IL-6) induced by poly I: C. It was done. These results support that IPS-1-deficient (− / −) mice can be used as model mice for virus infection.

（ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおけるＮＤＶ感染応答性シグナル伝達経路を活性化し、抗ウイルス応答を誘導する。）
さらに本発明者らは、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにおけるウイルス感染応答のシグナル伝達経路を解析した。まず、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶを感染させ、０、１０、２０時間後に核タンパク質を抽出し、ＮＦ−ｋＢの活性化をＥＭＳＡ法により検討した。ＩＰＳ−１野生型（＋／＋）において観察されるＮＦ−κＢの発現が、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）においては、観察されなかった（図１１のａ）。次に、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶを感染させ、０、６、８時間後にライセートを調整した。調整したライセートをＮａｔｉｖｅＰＡＧＥで展開後、フィルターに転写し、フィルターを抗ＩＲＦ３抗体でブロットし、ダイマー（二量体）形成を検討した。ＩＲＦ３の活性化をダイマー形成により確認したところ、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）においては、これらダイマー形成が観察されなかった（図１１のｂ）。 (Activates the NDV infection responsive signaling pathway in IPS-1-deficient (− / −) mice and induces an antiviral response.)
Furthermore, the present inventors analyzed the signal transduction pathway of the viral infection response in IPS-1-deficient (− / −) mice. First, NDV was infected with wild-type (+ / +) and IPS-1-deficient (-/-) MEFs, and nucleoprotein was extracted after 0, 10 and 20 hours, and activation of NF-kB was performed by EMSA method. investigated. The expression of NF-κB observed in the IPS-1 wild type (+ / +) was not observed in the IPS-1 deficient type (− / −) (a in FIG. 11). Next, NDV was infected with wild type (+ / +) and IPS-1 deficient (− / −) MEFs, and lysates were prepared after 0, 6, and 8 hours. The prepared lysate was developed with NativePAGE, transferred to a filter, and the filter was blotted with an anti-IRF3 antibody to examine dimer (dimer) formation. When activation of IRF3 was confirmed by dimer formation, formation of these dimers was not observed in the IPS-1-deficient type (− / −) (b in FIG. 11).

以上の結果より、ＩＰＳ−１のＮＤＶ感染応答のシグナル伝達は、ＮＦ−κＢや、ＩＲＦ３の活性化を介して、Ｉ型ＩＦＮを産生したり、ＩＦＮ誘導性遺伝子を発現したりすることにより、抗ウイルス応答を誘導するものであることが示唆された。 From the above results, signaling of IPS-1 NDV infection response can be achieved by producing type I IFN or expressing an IFN-inducible gene through activation of NF-κB or IRF3. It was suggested to induce an antiviral response.

［材料と方法］
（ハイスループットスクリーニング）
スクリーニングは、若干修正を加えた文献（EMBO J. 21, 5184-5194, 2002）に従って行った。ヒト胎盤、脾臓又はＰＢＬのｃＤＮＡライブラリーを、ｐＣＭＶ６−ＸＬ３（OriGene Technologies Inc.社製）にクローニングしたプラスミドＤＮＡでE. coli ＤＨ５αを形質転換し、１プレートあたり１００コロニーまでの密度でＬＢ寒天アンピシリンプレートに播種した。一晩インキュベートした後、ニトロセルロースフィルター膜を用いてレプリカプレートを作製した。一次形質転換プレートのコロニーを掻爬し、ＱＩＡprep 8 Miniprep Kit (QIAGEN社製) を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ｃＤＮＡプールとして用いた。２４ウェル皿に播種したＨＥＫ２９３細胞（１×１０^５／ウエル）に、Lipofectamine 2000 （Invitrogen社製）を用いて、１．０μｇのｃＤＮＡプールと、１００ｎｇのＩＦＮβ―Ｌｕｃコンストラクトとをトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞を１００μｌのレポーター溶解バッファー（Promega社製）で溶解した。デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega社製）で、可溶化液５μｌのルシフェラーゼ活性を測定した。５０ｎｇのウミシイタケ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、内部コントロールとして同時にトランスフェクトとした。 [Materials and methods]
(High-throughput screening)
Screening was performed according to a slightly modified document (EMBO J. 21, 5184-5194, 2002). E. coli DH5α was transformed with a plasmid DNA obtained by cloning a human placenta, spleen or PBL cDNA library into pCMV6-XL3 (OriGene Technologies Inc.), and LB agar ampicillin at a density of up to 100 colonies per plate. Plates were seeded. After overnight incubation, replica plates were made using nitrocellulose filter membranes. The colonies on the primary transformation plate were scraped, and plasmid DNA was prepared using QIAprep 8 Miniprep Kit (QIAGEN) and used as a cDNA pool. HEK293 cells (1 × 10 ⁵ / well) seeded in a 24-well dish were transiently transfected with 1.0 μg cDNA pool and 100 ng IFNβ-Luc construct using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). . After 36 hours, the cells were lysed with 100 μl of reporter lysis buffer (Promega). The luciferase activity of 5 μl of the lysate was measured with a dual luciferase assay system (Promega). 50 ng Renilla luciferase reporter gene was simultaneously transfected as an internal control.

陽性プールに対応するレプリカプレートの個別コロニーを選択し、１．０ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地で培養した。培養物より調製したプラスミドＤＮＡを、ＩＦＮβ−ＬｕｃとＨＥＫ２９３にコトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を分析し、プールの活性化に関与する単一のクローンを単離した。５’及び３’プライマーを用いて、陽性ＤＮＡをシークエンシングし、ＢＬＡＳＴサーチにより特徴づけた。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから入手した単一ヒトＩＰＳ−１クローンは、最初のＡＴＧのアップストリームで、インフレームストップコドンを有するオープンリーディングフレーム全体をコードしていた。ポリＡテールも得られたクローンに含まれていた。 Individual colonies on the replica plate corresponding to the positive pool were selected and cultured in 1.0 ml ampicillin-containing LB medium. Plasmid DNA prepared from the culture was cotransfected into IFNβ-Luc and HEK293, analyzed for luciferase activity, and isolated a single clone involved in pool activation. Positive DNA was sequenced using 5 'and 3' primers and characterized by BLAST search. A single human IPS-1 clone obtained from a human placenta cDNA library encoded the entire open reading frame with an in-frame stop codon upstream of the first ATG. A poly A tail was also included in the resulting clone.

（プラスミド）
テンプレートとして、スクリーニングによって得たＩＰＳ−１−ｐＣＭＶ６−ＸＬ３を用いて、ＰＣＲによりＩＰＳ−１、ＩＰＳ−１Ｎ（a．a．１−１１７）及びＩＰＳ−１Ｃ（ａ．ａ．１１８−５４０）を増幅し、pFLAG-CMV2（Sigma社製）、又はpEF-BOSに結紮し、それぞれＦｌａｇ標識、Ｍｙｃ標識発現コンストラクトを作製した。ヒトＩＲＦ３及びＩＲＦ７をＲＴ−ＰＣＲにより入手し、pEF-BOSに結紮した。ＩＫＫβ Ｋ４４Ａ、ＴＢＫ１及びＴｒｉｆコンストラクトは、文献に記載されている（J Immunol. 171, 4304-4310, 2003）。ＲＴ−ＰＣＲで増幅した、ヒトＦＡＤＤＤＥＤ（ａ．ａ．１−８５）をＲＴ−ＰＣＴにより増幅し、pFLAG-CMV2に結紮した。ＲＴ−ＰＣＴにより増幅したヒトＲＩＧ−Ｉ、ＲＩＧ−Ｉ△Ｃ（ａ．ａ．１−６０４）、Ｍｄａ５、Ｍｄａ５△Ｃ（ａ．ａ１−５７５）及びＲＩＰ１を、pFLAG-CMV6（Sigma社製）に結紮した。ＩＦＮβ、ＩＦＮα４、ＩＦＮα６及びＥＬＡＭ１のルシフェラーゼレポーターコンストラクトは文献に記載されている（Nat Immunol. 5, 1061-1068, 2004）。ＩＳＲＥ−ＬｕｃはStratageneより入手した。ＩＰ−１０−Ｌｕｃ及びＲＡＮＴＥＳ−ＬｕｃはD.T. Golenbock (マッサチューセット大学医学部、ＭＡ)より提供された。 (Plasmid)
Using IPS-1-pCMV6-XL3 obtained by screening as a template, IPS-1, IPS-1N (aa 1-117) and IPS-1C (aa 118-540) were obtained by PCR. Amplified and ligated to pFLAG-CMV2 (manufactured by Sigma) or pEF-BOS to produce Flag-labeled and Myc-labeled expression constructs, respectively. Human IRF3 and IRF7 were obtained by RT-PCR and ligated into pEF-BOS. IKKβ K44A, TBK1 and Trif constructs have been described in the literature (J Immunol. 171, 4304-4310, 2003). Human FADD DED (aa-85) amplified by RT-PCR was amplified by RT-PCT and ligated to pFLAG-CMV2. Human RIG-I, RIG-IΔC (aa 1-604), Mda5, Mda5ΔC (aa 1-575) and RIP1 amplified by RT-PCT were added to pFLAG-CMV6 (Sigma). ) The luciferase reporter constructs for IFNβ, IFNα4, IFNα6 and ELAM1 have been described in the literature (Nat Immunol. 5, 1061-1068, 2004). ISRE-Luc was obtained from Stratagene. IP-10-Luc and RANTES-Luc were provided by DT Golenbock (Massachusett University School of Medicine, MA).

（細胞、ウイルス及び試薬）
ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞及びＭＥＦ細胞を、５％ＣＯ_２のインキュベーター内の１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭで培養した。ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重欠損マウス由来のＭＥＦ細胞は、文献記載の通り調製した（J Exp Med. 199, 1641-1650, 2004）。ポリ（Ｉ：Ｃ）（Amersham Bioscience社製）をFugene（Roche社製）と混合し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２）ビーズ及びＨＲＰ複合抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２）は、Sigma社より購入した。抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）アガロース及びＨＲＰ複合抗Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）は、Santa Cruz 社から購入した。ＶＳＶ及びＶＳＶ変異体は、Dr. T. Abe 、Dr. Y. Matsuura（大阪大学）より提供された。ＮＤＶは、Dr. T.Fujita（東京都臨床医学総合研究所）より提供された。 (Cells, viruses and reagents)
HEK293 cells, Hela cells and MEF cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FCS in a 5% CO ₂ incubator. MEF cells derived from TBK1 / IKKi double-deficient mice were prepared as described in the literature (J Exp Med. 199, 1641-1650, 2004). Poly (I: C) (Amersham Bioscience) was mixed with Fugene (Roche) and transfected into HEK293 cells. Anti-Flag antibody (M2) beads and HRP-conjugated anti-Flag antibody (M2) were purchased from Sigma. Anti-Myc antibody (9E10) agarose and HRP-conjugated anti-Myc antibody (9E10) were purchased from Santa Cruz. VSV and VSV mutants were provided by Dr. T. Abe and Dr. Y. Matsuura (Osaka University). NDV was provided by Dr. T. Fujita (Tokyo Metropolitan Institute of Clinical Medicine).

（レポーター分析）
２４ウェルプレート（１×１０^５細胞／ウェル）に播種したＨＥK２９３細胞、又は６
ウェルプレート（１×１０^５細胞／ウェル）に播種したＭＥＦ細胞に、１００ｎｇのルシフェラーゼレポータープラスミドと、所定の発現プラスミド又は空コントロールプラスミド合計１．０μｇとを、トランジェントにトランスフェクトした。３６〜４８時間後、全細胞可溶化液のルシフェラーゼ活性をデュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega社製）で測定した。５０ｎｇのウミシイタケ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、内部コントロールとして同時にトランスフェクトした。 (Reporter analysis)
HEK293 cells seeded in 24-well plates (1 × 10 ⁵ cells / well), or 6
MEF cells seeded in a well plate (1 × 10 ⁵ cells / well) were transiently transfected with 100 ng luciferase reporter plasmid and a total of 1.0 μg of a predetermined expression plasmid or empty control plasmid. After 36 to 48 hours, the luciferase activity of the whole cell lysate was measured with a dual-luciferase reporter assay system (Promega). 50 ng Renilla luciferase reporter gene was co-transfected as an internal control.

（ＥＬＩＳＡ）
ＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１又はＦＬＡＧ−ＩＲＦ７をトランジェントにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞、又はウイルスを感染した細胞を２４時間培養した。上清のサイトカインＩＦＮαを、製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ Bio Lab.社製）により測定した。ＩＬ−８のＥＬＩＳＡは、文献記載どおりに行った（J Immunol. 174, 2273-2279,2005）。 (ELISA)
HEK293 cells transiently transfected with FLAG-IPS-1 or FLAG-IRF7, or cells infected with virus were cultured for 24 hours. The supernatant cytokine IFNα was measured by ELISA (PBL Bio Lab.) According to the manufacturer's instructions. The ELISA for IL-8 was performed as described in the literature (J Immunol. 174, 2273-2279, 2005).

（プラークアッセイ）
ＶＳＶを感染させたＨＥＫ２９３細胞から回収した培養上清のウイルス収量を測定した。回収したウイルスの段階希釈液で感染されたＢＨＫ細胞を、１．０％の低融解アガロースを含むＤＭＥＭで覆った。２４時間のインキュベーション後にプラークを算定した。 (Plaque assay)
The virus yield of the culture supernatant collected from HEK293 cells infected with VSV was measured. BHK cells infected with serial dilutions of recovered virus were covered with DMEM containing 1.0% low melting agarose. Plaques were counted after 24 hours of incubation.

（ノーザンブロット分析及びＲＴ−ＰＣＲ）
ヒト多組織ノーザンブロット（CLONTECH社製）で³²Ｐ標識全長ヒトＩＰＳ−１プローブをハイブリダイズし、洗浄し、オートラジオグラフィーにより視覚化した。ＲＴ−ＰＣＲ分析用に、全ＲＮＡをTrizol試薬（Invitrogen 社製）を用いて単離し、SuperScript III逆転写酵素（Invitrogen 社製）を製造者の指示に従って用いて逆転写した。ＰＣＲは、以下のプライマーを用いて連続して行った。
Ｉｆｎｂ；５’−ＣＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＴＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＧＡＧＧＣＡＧＴＡＴ−３’ （配列番号４）、Ｃｘｃｌ１０；５’−ＴＧＡＣＴＣＴＡＡＧＴＧＧＣＡＴＴＣＡＡＧＧ−３’（配列番号５）及び５’−ＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＣＣＣ−３’（配列番号６）、Ｉｆｉｔ１；５’−ＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＡＡＴ−３’（配列番号７）及び５’−ＴＧＣＧＧＣＣＣＴＴＧＴＴＡＴＴＣＣ−３’（配列番号８），Ｇａｐｄｈ；５’−ＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号９）及び５’−ＣＣＡＧＣＧＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号１０）。 (Northern blot analysis and RT-PCR)
The ³² P-labeled full-length human IPS-1 probe was hybridized with a human multi-tissue northern blot (manufactured by CLONTECH), washed, and visualized by autoradiography. For RT-PCR analysis, total RNA was isolated using Trizol reagent (Invitrogen) and reverse transcribed using SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. PCR was performed continuously using the following primers.
Ifnb; 5'-CAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCT-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5'-TCATCCTGTCCTTGAGGCAGTAT-3' (SEQ ID NO: 4), Cxcl10; (SEQ ID NO: 6), If1; 5′-CCTGCTGGTGGGGACAAAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 7) and 5′-TGCGGCCCCTGTTTATTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 8), Gapdh; 5′-CTGGGCTACACTGAGCACCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 9) and 5 '-CCAGCGTCAAAGGTGGAG-3' (SEQ ID NO: 10).

（免疫共沈降及びイムノブロット分析）
ＨＥＫ２９３細胞１００万個を、１００ｍｍ皿に播種した。１２時間後、細胞に空プラスミド又は所定のプラスミド全量６．０μｇを、Lipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いてトランジェントにトランスフェクトした。免疫沈降及びイムノブロットは、文献記載のとおり行った（Nat Immunol. 5, 1061-1068, 2004)。 (Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis)
One million HEK293 cells were seeded in 100 mm dishes. After 12 hours, the cells were transiently transfected with an empty plasmid or a total amount of a predetermined plasmid of 6.0 μg using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Immunoprecipitation and immunoblotting were performed as described in the literature (Nat Immunol. 5, 1061-1068, 2004).

（ＲＮＡ干渉）
ｓｉＲＮＡ実験用に、２１ヌクレオチドを有するセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡデュプレックスを、ダーマコンリサーチ（Dharmacon research）により合成した。ヒトＩＰＳ−１を標的とするのに用いたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、次の通りである。Ｉｐｓ−１−１センス；５’−ＵＡＧＵＵＧＡＵＣＵＣＧＣＧＧＡＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１１）、Ｉｐｓ−１−１アンチセンス；５’−ＵＣＧＵＣＣＧＣＧＡＧＡＵＣＡＡＣＵＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１２）、Ｉｐｓ−１−２センス；ＣＣＧＵＵＵＧＣＵＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１３）、Ｉｐｓ−１−２アンチセンス；ＵＣＵＵＧＵＣＵＵＣＡＧＣＡＡＡＣＧＧｄＴｄＴ−３’（配列番号１４）。ＨＥＫ２９３細胞又はＨｅｌａ細胞を、６０ｍｍ皿（５×１０^５）に、トランスフェクションの１２時間前に播種した。１００ｎＭのｓｉＲＮＡを、Lipofectamine 2000又はOligofectamine（Invitrogen社製）を製造者の指示に従って用いて、それぞれＨＥＫ２９３細胞又はＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を新たな実験に使用した。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＩＰＳ−１ｍＲＮＡのノックダウンを５’−ＡＴＧＣＣＧＴＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号１５）及び５’−ＣＴＡＧＴＧＣＡＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧ−３’（配列番号１６）のプライマーで確認した。 (RNA interference)
For siRNA experiments, double-stranded RNA duplexes consisting of sense and antisense oligonucleotides with 21 nucleotides were synthesized by Dharmacon research. The RNA oligonucleotides used to target human IPS-1 are as follows. Ips-1-1 sense; 5'-UAGUUGAUCUCCGCGACGAdTdT-3 '(SEQ ID NO: 11), Ips-1-1 antisense; 5'-UCGUCCGCGAGAUCAACUAdTdT-3' (SEQ ID NO: 12), Ips-1-2 sense; CCGUUGUGCUGAGACAGAGAT 3 ′ (SEQ ID NO: 13), Ips-1-2 antisense; UCUUGUCUCAGCAAACGGGdTdT-3 ′ (SEQ ID NO: 14). HEK293 cells or Hela cells were seeded in 60 mm dishes (5 × 10 ⁵ ) 12 hours before transfection. 100 nM siRNA was transfected into HEK293 cells or Hela cells, respectively, using Lipofectamine 2000 or Oligofectamine (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Cells were used for new experiments 48 hours after transfection. By RT-PCR, knockdown of IPS-1 mRNA was confirmed with primers of 5′-ATGCCGTTTGCTGAAGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 15) and 5′-CTAGTGCAGACGCCGCCG-3 ′ (SEQ ID NO: 16).

（ＩＰＳ−１ノックアウトマウスの作製）
（１）キメラマウスの作製
ＩＰＳ−１の生理学的役割を検討するため、ジーンターゲティングによりＩＰＳ^-/-マウスを作製した。ＩＰＳ−１^-/-マウスを作製するためのターゲティングベクターは、ｐＭＣ１−ｎｅｏ（Stratagene社製）からのネオマイシン耐性遺伝子で、エクソン１及びエクソン２を置換し、負の選択マーカーとして単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を挿入することにより構築した（図８ａ参照）。次に、当業者に公知の方法に従い、エレクトロポーション法で、構築されたターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入した。Ｇ４１８とガンシクロビアに二重に耐性を持つコロニーを選択し、ＰＣＲにより相同組換えが起きた細胞を選択した後、相同組み換えの認められた陽性クローン（ＥＳ細胞）を胚盤胞に導入して仮親に移植することによりキメラマウスを作製した。
（２）ヘテロ欠損（ＩＰＳ−１^＋／−）マウスの作製
こうして得られたキメラマウスの交配によってＦ１マウスを作製した。Ｆ１マウスの遺伝型をＰＣＲ及びサザンブロット法で解析したところ生殖系列への変異の導入（ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ化）が確認され、ヘテロ欠損マウス（ＩＰＳ−１^＋／−マウス）が作製された。
（３）更に、ＩＰＳ−１^＋／−マウスどうしを交配させて、ＩＰＳ−１遺伝子ホモ欠損マウス（ＩＰＳ−１^−／−マウス）を作製した。 (Preparation of IPS-1 knockout mouse)
(1) Production of Chimeric Mouse In order to examine the physiological role of IPS-1, IPS ^{− / −} mice were produced by gene targeting. The targeting vector for generating IPS-1 ^{− / −} mice is a neomycin resistance gene from pMC1-neo (Stratagene), replacing exon 1 and exon 2, and herpes simplex virus thymidine kinase as a negative selectable marker. It was constructed by inserting (HSV-TK) (see FIG. 8a). Next, the constructed targeting vector was introduced into ES cells by electroporation according to a method known to those skilled in the art. After selecting colonies that are double resistant to G418 and ganciclovir and selecting cells that have undergone homologous recombination by PCR, a positive clone (ES cell) in which homologous recombination has been observed is introduced into the blastocyst and the parental parent. Chimeric mice were prepared by transplanting into
(2) Production of hetero-deficient (IPS-1 ^+/- ) mice F1 mice were produced by crossing chimeric mice thus obtained. Analysis of the F1 mouse genotype by PCR and Southern blotting confirmed the introduction of germline mutations (germ-line), and produced hetero-deficient mice (IPS-1 ^+/- mice).
(3) Furthermore, IPS-1 ^+/− mice were crossed to produce IPS-1 gene homo-deficient mice (IPS-1 ^{− / −} mice).

ＩＦＮβプロモーターのアクチベーターの同定結果を示す図である。（ａ）ヒト胎盤、脾臓、又はＰＢＬのｃＤＮＡ発現ライブラリーの一部を、１００個までのｃＤＮＡ複合体（complexity）のプールに細分した。各プールからのプラスミドＤＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞に、ＩＦＮβプロモーターのレポーターコンストラクトとトランスフェクトし、レポーター遺伝子アッセイで分析した。平均的な活性より、活性化が５倍以上のときに、プールを陽性とした。陽性プールの同定例を示す。（ｂ）ＩＦＮβ活性化に関与する単一のクローンを単離するために、（ａ）で示すプール３４のレプリカプレート由来のコロニーを選択し、プラスミドを回収した。かかるプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞にＩＦＮβプロモーターのレポーターコンストラクトとトランスフェクトし、レポーターアッセイでプロモーター活性化能を分析した。陽性クローン（クローン３）をシークエンシングし、ＢＬＡＳＴサーチにより特徴づけた。It is a figure which shows the identification result of the activator of an IFN (beta) promoter. (A) A portion of a human placenta, spleen, or PBL cDNA expression library was subdivided into a pool of up to 100 cDNA complexes. Plasmid DNA from each pool was transfected into HEK293 cells with a reporter construct of the IFNβ promoter and analyzed with a reporter gene assay. Pools were considered positive when activation was more than 5-fold over average activity. The identification example of a positive pool is shown. (B) In order to isolate a single clone involved in IFNβ activation, colonies derived from the replica plate of pool 34 shown in (a) were selected, and the plasmid was recovered. Such a plasmid was transfected into HEK293 cells with a reporter construct of IFNβ promoter, and the promoter activation ability was analyzed by a reporter assay. A positive clone (clone 3) was sequenced and characterized by BLAST search. ＩＰＳ−１の構造と発現に関する図である。（ａ）スクリーニングによって単離したクローンの概略図である。（ｂ）ヒトＩＰＳ−１の予測されるアミノ酸配列を示す図である。（ｃ）ヒトＩＰＳ−１の概略図である。ＩＰＳ−１のＮ末端ＣＡＲＤ様ドメインを、黒い四角で示した。（ｄ）ヒトＩＰＳ−１、ヒトＭｄａ５、マウスＭｄａ５、ヒトＲＩＧ−Ｉ及びマウスＲＩＧ−ＩのＣＡＲＤ様ドメインのアライメントを示す図である。少なくとも３つの分子で保存されたアミノ酸残基を赤で示した。（ｅ）各種ヒト組織におけるヒトＩＰＳ−１ＲＮＡの発現を示す図である。ラジオ標識したヒトＩＰＳ−１プローブを、多組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロットでハイブリダイズした。It is a figure regarding the structure and expression of IPS-1. (A) Schematic diagram of clones isolated by screening. (B) shows the predicted amino acid sequence of human IPS-1. (C) Schematic diagram of human IPS-1. The N-terminal CARD-like domain of IPS-1 is indicated by a black square. (D) alignment of CARD-like domains of human IPS-1, human Mda5, mouse Mda5, human RIG-I and mouse RIG-I. Amino acid residues conserved in at least three molecules are shown in red. (E) It is a figure which shows the expression of human IPS-1 RNA in various human tissues. Radiolabeled human IPS-1 probe was hybridized in a multi-tissue northern (MTN) blot. ＩＲＦ３の活性化、及びＩＰＳ−１によるＩＦＮ誘導性遺伝子の誘導を示す図である。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、１ｎｇ（レーン２）、１０ｎｇ（レーン３）、１００ｎｇ（レーン４）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をコードする発現プラスミドを、ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＳＲＥの各プロモーターをコードするレポーターコンストラクトとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイで分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、１ｎｇ（レーン２、７）、１０ｎｇ（レーン３、８）、１００ｎｇ（レーン４、９）、又は１μｇ（レーン５、１０）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１及びコントロール（レーン１〜５）、又は５ｎｇのＦｌａｇ−ＩＰＳ−７（レーン６〜１０）を、ＩＦＮα４（左）又はＩＦＮα６（右）プロモーターレポータープラスミドとトランジェントにコトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ標識ＩＰＳ−１及びＭｙｃ標識ＩＲＦ３（上）又はＭｙｃ標識ＩＲＦ７（下）を所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を、抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体（ＩＰ）で免疫沈降し、その後、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体（ＷＢ）で免疫ブロットした。（ｄ）野生型（ＷＴ）又はＴＢＫ１及びＩＫＫｉ二重欠損マウス（ＴＢＫ１／ＩＫＫｉＫＯ）由来のＭＥＦ細胞に、ＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１又はＦｌａｇ−ＴＢＫ１を、ＩＦＮβ又はＩＦＮαプロモータープラスミドと指示どおりにトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｅ）ＩＰＳ−１欠失変異体の概略図（上）。ＨＥＫ２９３細胞に、１０ｎｇ（レーン２）又は１００ｎｇ（レーン３、５、７）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１ＦＬ（レーン２、３）、ＩＰＳ−１Ｎ（レーン４、５）又はＩＰＳ−１Ｃ（レーン６、７）をコードする発現プラスミドを、ＩＦＮβプロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。It is a figure which shows activation of IRF3, and induction | guidance | derivation of an IFN inducible gene by IPS-1. (A) In HEK293 cells, 1 ng (lane 2), 10 ng (lane 3), 100 ng (lane 4) expression plasmid encoding Flag-IPS-1, and IFNβ, IP-10, RANTES, ISRE promoters It was transfected into the encoding reporter construct and transient. 36 hours after transfection, the promoter activity of the cells was analyzed with a reporter gene assay. Similar results were obtained in three independent experiments. (B) HEK293 cells were treated with 1 ng (lanes 2, 7), 10 ng (lanes 3, 8), 100 ng (lanes 4, 9), or 1 μg (lanes 5, 10) of Flag-IPS-1 and control (lane 1). -5), or 5 ng Flag-IPS-7 (lanes 6-10) were co-transfected transiently with IFNα4 (left) or IFNα6 (right) promoter reporter plasmids. 36 hours after transfection, the promoter activity of the cells was analyzed by reporter gene assay. Similar results were obtained in three independent experiments. (C) HEK293 cells were transiently transfected with FLAG-labeled IPS-1 and Myc-labeled IRF3 (top) or Myc-labeled IRF7 (bottom) in a predetermined combination. After 36 hours, the cell lysate was immunoprecipitated with anti-Myc antibody or anti-FLAG antibody (IP), and then immunoblotted with anti-FLAG antibody or anti-Myc antibody (WB). (D) Transient wild-type (WT) or TBK1 and IKKi double-deficient mice (TBK1 / IKKi KO) -derived MEF cells with FLAG-IPS-1 or Flag-TBK1 transiently as indicated with IFNβ or IFNα promoter plasmid Transfected. 36 hours after transfection, the promoter activity of the cells was analyzed by reporter gene assay. Similar results were obtained in three independent experiments. (E) Schematic diagram of IPS-1 deletion mutant (top). HEK293 cells were treated with 10 ng (lane 2) or 100 ng (lanes 3, 5, 7) of Flag-IPS-1FL (lanes 2, 3), IPS-1N (lanes 4, 5) or IPS-1C (lanes 6, 7). The expression plasmid encoding) was transiently transfected with the IFNβ promoter plasmid. 36 hours after transfection, the promoter activity of the cells was analyzed by reporter gene assay. Similar results were obtained in three independent experiments. ＩＰＳ−１が、抗ウイルス応答を誘導することを示す図である。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、コントロール又はＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をトランジェントにトランスフェクトした。全ＲＮＡを、トランスフェクションの２４時間後に調製し、ＩＦＮβ（Ifnb）、ＩＰ−１０（Cxcl10）、ＧＡＲＧ１６（Ifit1）又はＧＡＰＤＨ（Gapdh）の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、１００ｎｇのＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１と１００ｎｇのＭｙｃ−ＩＲＦ７を所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。２４時間後、細胞上清のＩＦＮα濃度をＥＬＩＳＡで測定した。Ｎ．Ｄ．は、検出されず、を表す。データは、独立した３度の実験のうち、代表的な実験の３個のサンプル平均値±標準偏差として表す。（ｃ）コントロール又はＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に、ＶＳＶ（ｍｏｉ＝１．０、０．１）を感染した。２４時間後、ウイルス力価を測定した。FIG. 3 shows that IPS-1 induces an antiviral response. (A) HEK293 cells were transiently transfected with control or Flag-IPS-1. Total RNA was prepared 24 hours after transfection and the expression of IFNβ (Ifnb), IP-10 (Cxcl10), GARG16 (Ifit1) or GAPDH (Gapdh) was analyzed by RT-PCR. (B) HEK293 cells were transiently transfected with 100 ng FLAG-IPS-1 and 100 ng Myc-IRF7 in a predetermined combination. After 24 hours, the IFNα concentration of the cell supernatant was measured by ELISA. N. D. Represents not detected. Data are expressed as the average of three samples ± standard deviation of a representative experiment out of 3 independent experiments. (C) HEV293 cells transfected with control or Flag-IPS-1 were infected with VSV (moi = 1.0, 0.1). After 24 hours, the virus titer was measured. ＩＰＳ−１によるＮＦ−κＢ活性化及びＩＬ−８誘導を示す図である。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、１ｎｇ（レーン２）、１０ｎｇ（レーン３）、１００ｎｇ（レーン４）又は１μｇ（レーン５）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をコードするプラスミドを、ＥＬＡＭ１プロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、１００ｎｇのＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をコードするプラスミドと、１００ｎｇのＩＫＫβＫＮをコードするプラスミドとを所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞を、１００ｎｇのＦｌａｇ−ＩＰＳ−１ＦＬ、ＩＰＳ−１Ｎ又はＩＰＳ−１Ｃをコードするプラスミドを、ＥＬＡＭ１プロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞に、５００ｎｇのＩＰＳ−１の発現プラスミドをトランジェントにトランスフェクトした。２４時間後、培養上清のＩＬ−８濃度を、ＥＬＩＳＡで測定した。データは、独立した３度の実験のうち、代表的な実験の３個のサンプル平均値±標準偏差として表す。（ｅ）野生型（ＷＴ）又はＴＢＫ１及びＩＫＫｉ二重欠損マウス（ＴＢＫ１／ＩＫＫｉＫＯ）由来のＭＥＦ細胞に、Ｆｌａｇ−ＩＰＳ−１を、ＥＬＡＭ１プロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。It is a figure which shows NF-κB activation and IL-8 induction by IPS-1. (A) HEK293 cells were transiently transfected with 1 ng (lane 2), 10 ng (lane 3), 100 ng (lane 4) or 1 μg (lane 5) plasmid encoding Flag-IPS-1 and ELAM1 promoter plasmid. did. 36 hours after transfection, the promoter activity of the cells was analyzed by reporter gene assay. Similar results were obtained in three independent experiments. (B) HEK293 cells were transiently transfected with a predetermined combination of a plasmid encoding 100 ng Flag-IPS-1 and a plasmid encoding 100 ng IKKβKN. 36 hours after transfection, the promoter activity of the cells was analyzed by reporter gene assay. Similar results were obtained in three independent experiments. (C) HEK293 cells were transiently transfected with a plasmid encoding 100 ng Flag-IPS-1FL, IPS-1N or IPS-1C with the ELAM1 promoter plasmid. 36 hours after transfection, the promoter activity of the cells was analyzed by reporter gene assay. Similar results were obtained in three independent experiments. (D) HEK293 cells were transiently transfected with 500 ng of IPS-1 expression plasmid. After 24 hours, the IL-8 concentration of the culture supernatant was measured by ELISA. Data are expressed as the average of three samples ± standard deviation of a representative experiment out of 3 independent experiments. (E) Flag-IPS-1 was transiently transfected with ELAM1 promoter plasmid into MEF cells derived from wild type (WT) or TBK1 and IKKi double-deficient mice (TBK1 / IKKiKO). 36 hours after transfection, the promoter activity of the cells was analyzed by reporter gene assay. Similar results were obtained in three independent experiments. ＩＰＳ−１がＲＩＧ−Ｉ、ＦＡＤＤ及びＲＩＰ１と会合することを示す図である。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞１００万個に、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１、Ｆｌａｇ−Ｍｄａ５全長（ＦＬ）、Ｆｌａｇ−Ｍｄａ５△Ｃ、Ｆｌａｇ−ＲＩＧ−ＩＧＦＬ又はＦｌａｇ−ＲＩＧ−Ｉ△Ｃをコードするプラスミドを所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を抗Ｍｙｃ抗体又は抗Ｆｌａｇ抗体で免疫共沈降（ＩＰ）し、その後、抗Ｆｌａｇ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロット（ＩＢ）した。（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１、Ｆｌａｇ−ＦＡＤＤ、Ｆｌａｇ−ＲＩＰ１又はＦｌａｇ−ＴＢＫ１を所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を抗Ｍｙｃ抗体又は抗Ｆｌａｇ抗体で免疫共沈降（ＩＰ）し、その後、抗Ｆｌａｇ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロット（ＩＢ）した。米印は、Ｆｌａｇ−ＲＩＰ１タンパク質を示す。（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞に、Ｆｌａｇ−ＦＡＤＤ、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１ＦＬ、Ｍｙｃ−ＩＰＳ−１Ｎ又はＭｙｃ−ＩＰＳ−１Ｃを所定の組合せでトランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を抗Ｍｙｃ抗体又は抗Ｆｌａｇ抗体で共免疫沈降（ＩＰ）し、その後、抗Ｆｌａｇ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体で免疫ブロット（ＩＢ）した。（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞は、５０ｎｇ（レーン２、３、４）のＦｌａｇ−ＩＰＳ−１をコードする発現プラスミド及び、５０ｎｇ（レーン３）又は１００ｎｇ（レーン４）のＦｌａｇ−ＦＡＤＤＤＥＤを、ＩＦＮβプロモータープラスミドとトランジェントにトランスフェクトした。ＤＮＡの全量を、空ベクターの補充により一定に維持した。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。FIG. 3 shows that IPS-1 associates with RIG-I, FADD and RIP1. (A) A plasmid encoding Myc-IPS-1, Flag-Mda5 full length (FL), Flag-Mda5ΔC, Flag-RIG-IGFL or Flag-RIG-IΔC is added to 1 million HEK293 cells. Transiently transfected in combination. After 36 hours, the cell lysate was co-immunoprecipitated (IP) with anti-Myc antibody or anti-Flag antibody, and then immunoblotted (IB) with anti-Flag antibody or anti-Myc antibody. (B) HEK293 cells were transiently transfected with Myc-IPS-1, Flag-FADD, Flag-RIP1, or Flag-TBK1 in a predetermined combination. After 36 hours, the cell lysate was co-immunoprecipitated (IP) with anti-Myc antibody or anti-Flag antibody, and then immunoblotted (IB) with anti-Flag antibody or anti-Myc antibody. The rice symbol indicates Flag-RIP1 protein. (C) HEK293 cells were transiently transfected with Flag-FADD, Myc-IPS-1FL, Myc-IPS-1N or Myc-IPS-1C in a predetermined combination. After 36 hours, the cell lysate was co-immunoprecipitated (IP) with anti-Myc antibody or anti-Flag antibody, and then immunoblotted (IB) with anti-Flag antibody or anti-Myc antibody. (D) HEK293 cells consist of an expression plasmid encoding 50 ng (lanes 2, 3, 4) of Flag-IPS-1, and 50 ng (lane 3) or 100 ng (lane 4) of Flag-FADD DED, IFNβ promoter plasmid. And transiently transfected. The total amount of DNA was kept constant by empty vector supplementation. 36 hours after transfection, the promoter activity of the cells was analyzed by reporter gene assay. ｓｉＲＮＡによるＩＰＳ−１発現のノックダウンを示す図である。（ａ）ＨｅLａ細胞又はＨＥＫ２９３細胞に、ｓｉＲＮＡをターゲットするＩＰＳ−１（Ｉｐｓ−１−１、Ｉｐｓ−１−２）をトランスフェクトし、２日後に細胞を、Ｉｐｓ−１又はＧａｐｄｈの特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲで分析し、ｓｉＲＮＡが媒介する内因性Ｉｐｓ−１ｍＲＮＡの減少を確認した。（ｂ）ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＩＦＮβプロモータープラスミドをトランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を５μｇ／ｍｌ（レーン２、６、１０）、１０μｇ／ｍｌ（レーン３、７、１１）、又は２０μｇ／ｍｌ（レーン４、８、１２）のポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激した。１８時間後、細胞可溶化液のルシフェラーゼ活性を測定した。データは、独立した３度の実験のうち、代表的な実験の３個のサンプル平均値±標準偏差として表す。（ｃ）ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＲＩＧ−Ｉ△Ｃ又はＴｒｉｆ及びＩＦＮβプロモータープラスミドをトランジェントにコトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液のルシフェラーゼ活性を分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。（ｄ）ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞を、１０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で３時間刺激し、細胞におけるIfnb、Cxcl10又はGapdhの発現をＲＴ−ＰＣＲにより分析した。（ｅ）ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＶＳＶｍｔ又はＮＤＶを感染した。２４時間後、培養上清のＩＦＮα産生をＥＬＩＳＡで分析した。独立した３度の実験で、同様の結果を得た。It is a figure which shows knockdown of IPS-1 expression by siRNA. (A) HeLa cells or HEK293 cells were transfected with IPS-1 (Ips-1-1, Ips-1-2) targeting siRNA, and after 2 days, the cells were treated with specific primers for Ips-1 or Gapdh. Was used for analysis by RT-PCR to confirm siRNA-mediated reduction of endogenous Ips-1 mRNA. (B) HEK293 cells treated with siRNA were transiently transfected with the IFNβ promoter plasmid. Twenty-four hours after transfection, cells were treated with 5 μg / ml (lanes 2, 6, 10), 10 μg / ml (lanes 3, 7, 11), or 20 μg / ml (lanes 4, 8, 12) of poly (I: Stimulated with C). After 18 hours, the luciferase activity of the cell lysate was measured. Data are expressed as the average of three samples ± standard deviation of a representative experiment out of 3 independent experiments. (C) HEK293 cells treated with siRNA were transiently co-transfected with RIG-IΔC or Trif and IFNβ promoter plasmid. After 36 hours, the cell lysate was analyzed for luciferase activity. Similar results were obtained in three independent experiments. (D) HEK293 cells treated with siRNA were stimulated with 10 μg / ml poly (I: C) for 3 hours, and expression of Ifnb, Cxcl10 or Gapdh in the cells was analyzed by RT-PCR. (E) HEK293 cells treated with siRNA were infected with VSVmt or NDV. After 24 hours, IFNα production in the culture supernatant was analyzed by ELISA. Similar results were obtained in three independent experiments. 図８のａはマウスＩＰＳ−１ゲノムの構造（黒：コーディング領域、白：ノンコーディング領域）を示す図であり、図８のｂは、目的遺伝子が欠損していることを確認するためにサザンブロット法に供試した結果を示す図である。サザンブロットは、ＥｃｏＲＩで消化したマウステール由来のゲノムＤＮＡを電気泳動後、フィルターに転写し、図８のａで示したプローブを用いてハイブリダイズすることにより行った。図８のｃは、ＩＰＳ−１遺伝子の不活性化が生起していることを確認するためのノーザンブロット分析の結果を示す図である。ノーザンブロットは、野生型（＋／＋）及びＩＰＳ欠損型（−／−）のマウス胎児由来線維芽細胞（ＭＥＦ）から、ＲＮＡを抽出後、電気泳動にて展開し、フィルターに転写し、フィルターを全長ＩＰＳ−１プローブ及びβ−ａｃｔｉｎプローブを用いてハイブリダイズすることにより行った。図８のｄは、ＩＰＳ−１の発現がタンパクレベルでも消失していることを確認するためのウェスタンブロットの結果を示す図である。ウェスタンブロットは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦからライセートを調整し、抗ＩＰＳ−１抗体で免疫沈降を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開させ、フィルターに転写後、抗ＩＰＳ−１抗体でブロットすることにより行った（図８のｄ上図）。また、図下はどのサンプルでも同じ量のタンパク質を用いていることを示すコントロール実験であり、この実験では全可溶化物（Ｗｈｏｌｅｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｓ：ＷＣＬ）を抗ＥＲＫ１／２抗体でブロットすることにより行った（ＩＢ）。FIG. 8a is a view showing the structure of the mouse IPS-1 genome (black: coding region, white: non-coding region), and FIG. 8b is a Southern view for confirming that the target gene is deleted. It is a figure which shows the result used for the blot method. Southern blotting was performed by electrophoresis of genomic DNA derived from mouse tail digested with EcoRI, transferred to a filter, and hybridized with the probe shown in FIG. FIG. 8c is a diagram showing the results of Northern blot analysis for confirming that inactivation of the IPS-1 gene has occurred. Northern blots were extracted from RNA from wild-type (+ / +) and IPS-deficient (-/-) mouse fetal fibroblasts (MEF), developed by electrophoresis, transferred to a filter, Was performed by hybridizing using a full-length IPS-1 probe and a β-actin probe. FIG. 8d is a view showing the results of Western blotting for confirming that the expression of IPS-1 is lost even at the protein level. Western blots were prepared from wild-type (+ / +) and IPS-1-deficient (-/-) MEFs, lysates were prepared, immunoprecipitated with anti-IPS-1 antibody, developed with SDS-PAGE, and filtered. After the transcription, it was performed by blotting with an anti-IPS-1 antibody (the upper diagram in FIG. 8d). Also, the lower figure is a control experiment showing that the same amount of protein is used in all samples. In this experiment, all lysates (WCL) were blotted with anti-ERK1 / 2 antibody. (IB). ＩＰＳ−１欠損マウスにおける各ＲＮＡウイルスに対する反応性に関する実験結果を示す図であり、図９のａは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦに１本鎖ＲＮＡウイルスであるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）を感染させ、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα，ＩＦＮβ，ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した結果を示す図である。なお、アスタリスクは検出感度以下を示す。図９のｂは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶ、ＶＳＶ、ＳｅＶを感染させ、図に示した時間後に細胞からＲＮＡを回収し、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６の各ｍＲＮＡに相補的なプローブ（配列番号２８〜３２）を用いて遺伝子発現をノーザンブロット法にて検討した結果を示す図である。図９のｃは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスの腹腔マクロファージに脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を感染させ、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した結果を示す図である。図９のｄは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスの腹腔マクロファージにＥＭＣＶを感染させ、図で示した時間後、細胞よりＲＮＡを回収し、図で示した遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により検討した結果を示す図である。It is a figure which shows the experimental result regarding the reactivity with respect to each RNA virus in an IPS-1-deficient mouse, and a of FIG. 9 is a single strand to wild type (+ / +) and IPS-1-deficient type (-/-) MEF. Infected with RNA viruses such as Newcastle disease virus (NDV), vesicular stomatitis virus (VSV), and Sendai virus (SeV), the cytokine (IFNα, IFNβ, IL-6) concentration in the culture supernatant after 24 hours was determined. It is a figure which shows the result measured by the Eliza method. In addition, an asterisk shows below detection sensitivity. FIG. 9b shows that wild type (+ / +), IPS-1 deficient (− / −) MEFs were infected with NDV, VSV, SeV, and RNA was recovered from the cells after the time shown in the figure, It is a figure which shows the result of having examined the gene expression by the Northern blot method using a probe (sequence number 28-32) complementary to each mRNA of IFN (alpha), IP-10, RANTES, and IL-6. FIG. 9c shows the infection of celiac myocarditis virus (EMCV) in peritoneal macrophages of wild type (+ / +) and IPS-1 deficient (− / −) mice, and cytokines in the culture supernatant after 24 hours. It is a figure which shows the result of having measured the (IFN (alpha), IFN (beta), IL-6) density | concentration by the Eliza method. In FIG. 9d, EMCV was infected to peritoneal macrophages of wild type (+ / +) and IPS-1 deficient (− / −) mice, and RNA was recovered from the cells after the time indicated in the figure. It is a figure which shows the result of having examined the expression of the shown gene by RT-PCR method. ＩＰＳ−１欠損マウスにおけるポリＩ：Ｃに対する反応性に関する実験結果を示す図であり、図１０のａは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦを図で示した濃度のポリＩ：Ｃで刺激し、２４時間後の培養上清中のサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した結果を示す図である。なお、アスタリスクは検出感度以下を示す。図１０のｂは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦをポリＩＣで刺激した、図に示した時間後に細胞からＲＮＡを回収し、ＩＦＮβ、ＩＦＮα、ＩＰ−１０、ＩＬ−６の各ｍＲＮＡに相補的なプローブ（配列番号３３〜３６）を用いて遺伝子発現をノーザンブロット法にて検討した結果を示す図である。図１０のｃは、ヘテロ型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）マウスにポリＩＣを静脈内注射し、計時的に採取した血清中におけるサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＬ−６）濃度をエライザ法により測定した結果を示す図である。It is a figure which shows the experimental result regarding the reactivity with respect to poly I: C in an IPS-1-deficient mouse, and a of FIG. 10 is a figure with a wild type (+ / +) and IPS-1 deficient type (-/-) MEF. It is a figure which shows the result of having stimulated with poly I: C of the density | concentration shown, and having measured the cytokine (IFN (alpha), IFN (beta), IL-6) density | concentration in the culture supernatant 24 hours later by the Eliza method. In addition, an asterisk shows below detection sensitivity. In FIG. 10b, wild type (+ / +), IPS-1-deficient (− / −) MEFs were stimulated with poly IC, RNA was recovered from the cells after the time shown in the figure, and IFNβ, IFNα, IP It is a figure which shows the result of having examined the gene expression by the Northern blot method using a probe (sequence number 33-36) complementary to each mRNA of -10 and IL-6. FIG. 10c shows the results of cytokines (IFNα, IFNβ, IL−) in serum obtained by intravenously injecting poly IC into heterozygous (+ / +) and IPS-1-deficient (− / −) mice. 6) It is a figure which shows the result of having measured the density | concentration by the ELISA method. ＩＰＳ−１欠損マウスにおけるＮＤＶ感染応答性シグナル伝達経路の解析に関する実験結果を示す図であり、図１１のａは、野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶを感染させ、図で示した時間後に核タンパク質を抽出し、ＮＦ−ｋＢの活性化をＥＭＳＡ法により検討した結果を示す図である。図１１のｂは、ＩＲＦ３の活性化の指標であるダイマー（二量体）形成を検討した結果を示す図である。野生型（＋／＋）、ＩＰＳ−１欠損型（−／−）ＭＥＦにＮＤＶを感染させ、図で示した時間後にライセートを調整した。調整したライセートをＮａｔｉｖｅＰＡＧＥで展開後、フィルターに転写し、フィルターを抗ＩＲＦ３抗体でブロットし、ダイマー（二量体）形成を検討した。It is a figure which shows the experimental result regarding the analysis of the NDV infection responsive signal transduction pathway in an IPS-1-deficient mouse, and a in FIG. 11 shows wild type (+ / +), IPS-1-deficient type (− / −) MEF. It is a figure which shows the result of having infected NDV, extracting the nuclear protein after the time shown in the figure, and examining the activation of NF-kB by the EMSA method. B of FIG. 11 is a figure which shows the result of having examined dimer (dimer) formation which is the parameter | index of activation of IRF3. Wild type (+ / +) and IPS-1 deficient (-/-) MEFs were infected with NDV, and lysates were prepared after the time indicated in the figure. The prepared lysate was developed with NativePAGE, transferred to a filter, and the filter was blotted with an anti-IRF3 antibody to examine dimer (dimer) formation.

Claims

以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質 DNA encoding the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(b) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having IPS-1 activity

配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 A DNA comprising an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having IPS-1 activity.

配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ。 DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence.

配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 A DNA encoding a protein consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having IPS-1 activity.

請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 A DNA that hybridizes with the DNA according to claim 2 under stringent conditions and encodes a protein having IPS-1 activity.

配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。 A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質。 A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having IPS-1 activity.

配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質。 A protein comprising an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having IPS-1 activity.

組換えタンパク質であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載のタンパク質。 The protein according to any one of claims 6 to 8, which is a recombinant protein.

請求項６〜９のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド。 A fusion protein or fusion peptide comprising the protein according to any one of claims 6 to 9, and a marker protein and / or a peptide tag.

請求項１〜５のいずれか記載のＤＮＡを含み、かつＩＰＳ−１を発現することができる組換えベクター。 A recombinant vector comprising the DNA according to any one of claims 1 to 5 and capable of expressing IPS-1.

組換えプラスミドベクターである請求項１１記載の組換えベクター。 The recombinant vector according to claim 11, which is a recombinant plasmid vector.

さらに、レポーター遺伝子を発現することができることを特徴とする請求項１１又は１２記載の組換えベクター。 Furthermore, the recombinant vector according to claim 11 or 12, which can express a reporter gene.

レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の組換えベクター。 The recombinant vector according to claim 11 or 12, wherein the reporter gene is a firefly luciferase gene.

請求項１１〜１４のいずれか記載の組換えベクターが導入され、かつＩＰＳ−１を発現する形質転換体。 A transformant into which the recombinant vector according to any one of claims 11 to 14 is introduced and expresses IPS-1.

ＩＰＳ−１遺伝子を有する組換えベクターによって形質転換された形質転換体。 A transformant transformed with a recombinant vector having the IPS-1 gene.

形質転換体が、哺乳類細胞由来であることを特徴とする請求項１５又は１６記
載の形質転換体。 The transformant according to claim 15 or 16, wherein the transformant is derived from a mammalian cell.

哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞又はＭＥＦ細胞である請求項１７に記載の形質転換体。 The transformant according to claim 17, wherein the mammalian cell is a HEK293 cell, a Hela cell or a MEF cell.

請求項６〜９のいずれか記載のタンパク質又はその部分ポリペプチドを認識する抗体。 The antibody which recognizes the protein in any one of Claims 6-9, or its partial polypeptide.

モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１９記載の抗体。 20. The antibody according to claim 19, which is a monoclonal antibody.

ＩＰＳ−１遺伝子の機能が染色体上で欠損し、野生型において発現されるＩＰＳ−１を発現する機能が失われていることを特徴とするＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物。 An IPS-1 knockout non-human animal, wherein the function of IPS-1 gene is deficient on the chromosome and the function of expressing IPS-1 expressed in the wild type is lost.

げっ歯類動物であることを特徴とする請求項２１記載のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物。 The IPS-1 knockout non-human animal according to claim 21, which is a rodent animal.

げっ歯類動物が、マウスであることを特徴とする請求項２２記載のＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物。 The IPS-1 knockout non-human animal according to claim 22, wherein the rodent animal is a mouse.

以下の(ａ)〜(ｆ)のいずれか記載ＤＮＡを、ＩＰＳ−１活性を有するタンパク質の製造に使用する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ A method of using the DNA according to any one of the following (a) to (f) for production of a protein having IPS-1 activity.
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(B) a DNA that comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encodes a protein having IPS-1 activity
(C) DNA consisting of an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having IPS-1 activity
(D) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
(E) a DNA comprising a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encoding a protein having IPS-1 activity
(F) a DNA that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having IPS-1 activity

以下の(ａ)〜(ｃ)のいずれか記載のタンパク質を用いて、Ｉ型ＩＦＮプロモーターを活性化する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質 A method for activating a type I IFN promoter using the protein according to any one of the following (a) to (c).
(A) A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having IPS-1 activity.
(C) a protein comprising an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having IPS-1 activity

タンパク質が、以下の(ａ)〜(ｆ)のいずれか記載ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする請求項２５記載のＩＦＮβプロモーターを活性化する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ The method for activating the IFNβ promoter according to claim 25, wherein the protein is a recombinant protein expressed in a host cell transformed with the DNA according to any one of the following (a) to (f):
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(B) a DNA that comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encodes a protein having IPS-1 activity
(C) DNA consisting of an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having IPS-1 activity
(D) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
(E) a DNA comprising a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encoding a protein having IPS-1 activity
(F) a DNA that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having IPS-1 activity

以下の(ａ)〜(ｃ)のいずれか記載のタンパク質を、Ｉ型ＩＦＮの製造に使用する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質 A method of using the protein according to any one of the following (a) to (c) for production of type I IFN.
(A) A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having IPS-1 activity.
(C) a protein comprising an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having IPS-1 activity

タンパク質が、以下の(ａ)〜(ｆ)のいずれか記載ＤＮＡで形質転換した宿主細胞で発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする請求項２７記載の使用する方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩＰＳ−１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ 28. The method according to claim 27, wherein the protein is a recombinant protein expressed in a host cell transformed with the DNA according to any one of the following (a) to (f).
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(B) a DNA that comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encodes a protein having IPS-1 activity
(C) DNA consisting of an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having IPS-1 activity
(D) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
(E) a DNA comprising a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encoding a protein having IPS-1 activity
(F) a DNA that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having IPS-1 activity

ＩＰＳ−１遺伝子の機能を染色体上で欠損させたＩＰＳ−１ノックアウト非ヒト動物を、Ｉ型ＩＦＮプロモーターの活性化による抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物として使用する方法。 A method of using an IPS-1 knockout non-human animal in which the function of the IPS-1 gene is deleted on the chromosome as a model animal in which an antiviral response function is lost due to activation of a type I IFN promoter.

非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項２９記載の抗ウイルス応答機能が喪失したモデル動物としての使用方法。 The method for use as a model animal having lost antiviral response function according to claim 29, wherein the non-human animal is a mouse.