JP2007044016A

JP2007044016A - 3-isopropylmalic acid dehydrogenase gene and its use

Info

Publication number: JP2007044016A
Application number: JP2005235012A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Nakao; 嘉宏中尾; Yukiko Kodama; 由紀子児玉; Tomoko Fujimura; 朋子藤村
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 2005-08-12
Filing date: 2005-08-12
Publication date: 2007-02-22

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide yeast with reduced production of vicinal diketones, especiall diacetyls, that induces off-flavor, and to provide a method for producing alcoholic beverages utilizing the yeast. <P>SOLUTION: The invention relates to the 3-isopropylmalic acid dehydrogenase gene and its application, especially brewery yeast producing alcoholic beverages excellent in flavor and the alcoholic beverages produced by utilizing the brewery yeast. The invention relates to the yeast with reduced production of the vicinal diketones which induce off-flavor of the products, especially with reduced amount of the diacetyl by enhancing expression of the ScLEU2 gene encoding the Leu2p which is the 3-isopropylmalic acid dehydrogenase or enhancing the expression of the nonScLEU2 gene which is characteristic for brewer's yeast, and the invention relates to the method for producing alcoholic beverages by utilizing the brewery yeast. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びその用途に関し、特に、香味に優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、酵母の3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼであるLeu2pをコードするScLEU2遺伝子あるいは特にビール酵母に特徴的なnonScLEU2遺伝子の発現量を高めることによって、製品のオフフレーバーとなるビシナルジケトン類、特にダイアセチル生産量を低減させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。 The present invention relates to a 3-isopropylmalate dehydrogenase gene and use thereof, and more particularly, to a brewing yeast that produces an alcoholic beverage with excellent flavor, an alcoholic beverage produced using the yeast, a production method thereof, and the like. More specifically, the present invention provides an off-flavor of a product by increasing the expression level of the ScLEU2 gene encoding Leu2p, which is yeast 3-isopropylmalate dehydrogenase, or the nonScLEU2 gene, which is particularly characteristic of brewer's yeast. The present invention relates to vicinal diketones, particularly yeast with reduced diacetyl production, and a method for producing alcoholic beverages using the yeast.

酒類の香気成分のうち、ダイアセチル（以下、「DA」ともいう）臭はビール、清酒及びワイン等の醸造酒における代表的オフフレーバーのひとつである。DA臭（ビールではムレ臭またはバター臭、清酒ではツワリ香とも表現される）はDAを主とするビシナルジケトン類（以下、「VDK」ともいう）が製品中にある閾値以上存在することによって発生する。ビールにおける閾値は0.1ppmといわれている（Journal of the Institute of Brewing、76、486（1970）：非特許文献1）。 Of the aroma components of alcoholic beverages, the diacetyl (hereinafter also referred to as “DA”) odor is one of the typical off-flavors in brewed liquors such as beer, sake and wine. DA odor (expressed as beer odor or butter odor in beer and scented in sake) is caused by the presence of DA-based vicinal diketones (hereinafter also referred to as “VDK”) above a certain threshold in the product. . The threshold in beer is said to be 0.1 ppm (Journal of the Institute of Brewing, 76, 486 (1970): Non-Patent Document 1).

酒類中のVDKはDA と2,3-ペンタンジオン（以下PD）に大別される。DA とPDは、それぞれバリン及びイソロイシン生合成系中間産物のα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸を前駆体として、酵母の関与しない非酵素的反応によって生成される。 VDKs in liquors are broadly divided into DA and 2,3-pentanedione (PD). DA and PD are produced by non-enzymatic reactions not involving yeast, using valine and isoleucine biosynthesis intermediate products α-acetolactic acid and α-acetohydroxybutyric acid as precursors, respectively.

以上のことから、VDK（DA及びPD）及びその前駆体α-アセトヒドロキシ酸類（α-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸）などが製品にDA臭をもたらし得る化合物として捉えられている。したがって、これらの化合物を安定的に低減させる酵母の育種は酒類の製造管理を容易にするばかりでなく、新商品開発の可能性を広げることになる。 From the above, VDK (DA and PD) and its precursor α-acetohydroxy acids (α-acetolactic acid and α-acetohydroxybutyric acid) are regarded as compounds that can bring DA odor to products. Therefore, the breeding of yeast that stably reduces these compounds not only facilitates the production management of alcoholic beverages, but also expands the possibility of developing new products.

清酒製造では、例えば特開2001-204457公報（特許文献1）においては、α-アセトヒドロキシ酸類の前駆体となるピルビン酸濃度の低い酒母を用いることでDAの生成を抑制する方法が報告されている。ビール製造についても、Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 94-99（1973）（非特許文献2）ではバリン・ロイシン・イソロイシン要求性酵母でVDK生成量が低減することが報告されている。しかし、栄養要求性株では増殖・発酵遅延が生じやすいことから、この酵母は未だ実用化には至っていない。特開2002-291465号公報（特許文献2）では、上記分岐アミノ酸のアナログに対して感受性となる変異株を取得し、それらの中からDA低蓄積株を選抜するという方法が開示されている。Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84（1987）（非特許文献3）では、実験室酵母に由来するILV5遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母が、また、European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560（1987）（非特許文献4）では同じくILV3遺伝子の発現量を調節した遺伝子操作酵母がそれぞれ報告されている。このときILV5遺伝子がコードする3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性は5-7倍増加し、VDK生成量は4割程度まで減少した。 In sake brewing, for example, in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-204457 (Patent Document 1), a method for suppressing the production of DA by using a liquor having a low pyruvic acid concentration as a precursor of α-acetohydroxy acids has been reported. Yes. Regarding beer production, Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 94-99 (1973) (Non-Patent Document 2) reports that the production amount of VDK is reduced in valine, leucine and isoleucine-requiring yeast. However, since auxotrophic strains are prone to growth / fermentation delay, this yeast has not yet been put to practical use. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-291465 (Patent Document 2) discloses a method of obtaining mutant strains that are sensitive to the above-mentioned branched amino acid analogs and selecting DA low-accumulation strains from them. In the Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84 (1987) (Non-patent Document 3), genetically engineered yeasts that regulate the expression level of ILV5 gene derived from laboratory yeasts are also known as European Brewery Convention, Proceedings. Of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560 (1987) (Non-Patent Document 4), genetically engineered yeasts that regulate the expression level of the ILV3 gene are also reported. At this time, the enzyme activity of 3-isopropylmalate dehydrogenase encoded by the ILV5 gene increased 5-7 times, and the amount of VDK produced decreased to about 40%.

また、ILV3遺伝子がコードする3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性は5-6倍増加したが、VDK生成量に有意な減少はみられなかった。ただし上記2報告とも合成培地を用いており、実際のビール醸造への影響は解析されていない。Dulieuらは、European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460（1997）（非特許文献5）においてα-アセト乳酸脱炭酸酵素を使用することでDAの前駆体となるα-アセト乳酸をアセトインに迅速に変換する方法を提案した。しかし、日本では税制上発酵中の醪に酵素を添加することはできない。特開平2-265488号公報（特許文献3）及び特開平7-171号公報（特許文献4）ではいずれもα-アセト乳酸脱炭酸酵素をコードするDNA鎖を用いた遺伝子操作酵母が報告されている。
特開2001-204457号公報特開2002-291465号公報特開平2-265488号公報特開平7-171号公報 Journal of the Institute of Brewing、76、486（1970） Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 94-99（1973） Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84（1987） European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560（1987） European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460（1997） In addition, the enzyme activity of 3-isopropylmalate dehydrogenase encoded by the ILV3 gene increased 5-6 times, but no significant decrease was observed in the amount of VDK produced. However, the above two reports use a synthetic medium, and the effect on actual beer brewing has not been analyzed. Dulieu et al. Described that α-acetolactic acid decarboxylase is used as the precursor of DA in the European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460 (1997) (Non-patent Document 5). A method for rapidly converting acetolactate to acetoin was proposed. However, in Japan, enzymes cannot be added to the fermented rice cake for tax purposes. JP-A-2-265488 (Patent Document 3) and JP-A-7-171 (Patent Document 4) both report genetically engineered yeasts using a DNA strand encoding α-acetolactic acid decarboxylase. Yes.
Japanese Patent Laid-Open No. 2001-204457 JP 2002-291465 JP JP-A-2-265488 Japanese Unexamined Patent Publication No. 7-171 Journal of the Institute of Brewing, 76, 486 (1970) Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 94-99 (1973) Journal of American Society of Brewing Chemists, Proceeding, 81-84 (1987) European Brewery Convention, Proceedings of the 21st EBC congress, Madrid, 553-560 (1987) European Brewery Convention, Proceedings of the 26th EBC congress, Maastricht, 455-460 (1997)

上記のような状況において、VDK（ビシナルジケトン類）、特にDA（ダイアセチル）の発生を低減させることのできる酒類の製造方法の開発が望まれていた。 Under the circumstances as described above, it has been desired to develop a method for producing alcoholic beverages that can reduce the generation of VDK (vicinal diketones), particularly DA (diacetyl).

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から既知のタンパク質より有利な効果を奏する3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、ビール中のVDK濃度、特にDA濃度が低減することを確認して、本発明を完成した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have succeeded in identifying and isolating a gene encoding 3-isopropylmalate dehydrogenase that has an advantageous effect over known proteins from brewer's yeast. did. In addition, a transformed yeast in which the obtained gene was introduced and expressed in yeast was produced, and it was confirmed that the VDK concentration in beer, particularly the DA concentration, was reduced, thereby completing the present invention.

すなわち本発明は、ビール酵母に特徴的に存在する新規な3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる製品中のVDK濃度、特にDA濃度の制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。 That is, the present invention provides a novel 3-isopropylmalate dehydrogenase gene that is characteristically present in brewer's yeast, a protein encoded by the gene, a transformed yeast in which the expression of the gene is regulated, and the expression of the gene is regulated. The present invention relates to a method for controlling a VDK concentration in a product, particularly a DA concentration, by using yeast. Specifically, the present invention provides the following polynucleotide, a vector containing the polynucleotide, a transformed yeast introduced with the vector, a method for producing alcoholic beverages using the transformed yeast, and the like.

（１）以下の(a)〜(ｆ)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：2のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 (1) The polynucleotide according to any one of the following (a) to (f):
(a) a polynucleotide comprising a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(b) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(c) a polyprotein encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity A polynucleotide containing nucleotides;
(d) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity;
(e) containing a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity A polynucleotide; and
(f) 3-isopropylmalate dehydrogenase activity, hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having

（２）以下の(g)〜(i)のいずれかである上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：2のアミノ酸配列又は配列番号：2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（３）配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。 (2) The polynucleotide according to (1) above, which is any of the following (g) to (i):
(g) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and 3-isopropylmalate dehydrogenase A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having activity;
(h) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity; and
(i) hybridizes with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions, and 3-isopropyl apple A polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having acid dehydrogenase activity.
(3) The polynucleotide according to (1) above, comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
(4) The polynucleotide according to (1) above, which comprises a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(5) The polynucleotide according to any one of (1) to (4) above, which is DNA.
(6) A protein encoded by the polynucleotide according to any one of (1) to (5) above.

（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（８）
以下の(j)〜(l)のいずれかであるポリヌクレオチドを含有するベクター。
(j)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k) 配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（８b）以下の(a)〜(c)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。 (7) A vector containing the polynucleotide according to any one of (1) to (5) above.
(8)
A vector containing a polynucleotide that is any of the following (j) to (l).
(j) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and 3-isopropylmalate dehydrogenase A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having activity;
(k) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity; and
(l) Hybridizes with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under highly stringent conditions, and 3-isopropyl apple A polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having acid dehydrogenase activity.
(8b) The vector according to (7) above, comprising an expression cassette comprising the following components (a) to (c):
(a) Promoter capable of transcription in yeast cells
(b) the polynucleotide according to any one of (1) to (5), which is bound to the promoter in a sense direction or an antisense direction; and
(c) Signals that function in yeast for transcription termination and polyadenylation of RNA molecules.

（９）上記（７）に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
（１０）醸造時に全ビシナルジケトン（ビシナルジケトン類及びその前駆体であるα-アセトヒドロキシ酸類の総称）生産量を低減し得る上記（９）に記載の醸造用酵母。
（１１）醸造時に全ダイアセチル（ダイアセチル及びその前駆体であるα-アセト乳酸の総称）生産量を低減し得る上記（９）に記載の醸造用酵母。
（１２）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、醸造時に全ビシナルジケトン生産量を低減し得る上記（９）に記載の醸造用酵母。
（１３）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、醸造時に全ダイアセチル生産量を低減し得る上記（９）に記載の醸造用酵母。
（１４）上記（９）〜（１３）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１５）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１６）醸造する酒類がワインである上記（１４）に記載の酒類の製造方法。
（１７）上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
（１８）配列番号：1または配列番号：3の塩基配列を有する3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能について評価する方法。
（１８a）上記（１８）に記載の方法によって、全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能が低い酵母を選別する方法。
（１８b）上記（１８a）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（１９）
被検酵母を培養し、配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列を有する3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の亜硫酸生成能を評価する方法。
（２０）
基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列を有する3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、酵母の選択方法。 (9) A transformed yeast introduced with the vector according to (7) above.
(10) The yeast for brewing according to the above (9), which can reduce the production amount of all vicinal diketones (generic name of vicinal diketones and α-acetohydroxy acids which are precursors thereof) during brewing.
(11) The yeast for brewing according to (9), wherein the production amount of all diacetyl (a generic name of diacetyl and its precursor α-acetolactic acid) can be reduced during brewing.
(12) The brewery yeast according to (9), wherein the production amount of the total vicinal diketone can be reduced during brewing by increasing the expression level of the protein according to (6).
(13) The brewing yeast according to (9), wherein the total diacetyl production amount can be reduced during brewing by increasing the expression level of the protein according to (6).
(14) A method for producing an alcoholic beverage using the yeast according to any one of (9) to (13) above.
(15) The method for producing an alcoholic beverage according to the above (14), wherein the alcoholic beverage to be brewed is a malt beverage.
(16) The method for producing an alcoholic beverage according to the above (14), wherein the alcoholic beverage to be brewed is wine.
(17) Alcoholic beverages produced by the method according to any one of (14) to (16) above.
(18) Using the primer or probe designed based on the base sequence of the 3-isopropylmalate dehydrogenase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, A method for evaluating acetyl productivity.
(18a) A method for selecting a yeast having a low total vicinal diketone production ability or total diacetyl production ability by the method described in (18) above.
(18b) A method for producing an alcoholic beverage (for example, beer) using the yeast selected by the method described in (18a) above.
(19)
A method for evaluating the ability of a test yeast to produce sulfite by culturing a test yeast and measuring the expression level of a 3-isopropylmalate dehydrogenase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
(20)
Reference yeast and test yeast are cultured, and the expression level in each yeast of the 3-isopropylmalate dehydrogenase gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is measured, and the gene is expressed at a higher level than the reference yeast A method for selecting yeast, wherein the test yeast is selected.

本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、製品中でオフフレーバーとなるVDK、とくにDA生産量を低減させることができるため、香味に優れた酒類を容易に製造することが可能となる。 According to the method for producing alcoholic beverages using the transformed yeast of the present invention, it is possible to reduce the production amount of VDK, which is off-flavor in the product, in particular DA production. It becomes.

本発明者らは、特開2004-283169に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母が有する3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする2つの遺伝子、nonScLEU2およびScLEU2遺伝子を単離・同定した。nonScLEU2およびScLEU2遺伝子の塩基配列およびそれにコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：1と2、配列番号：3と4に示す。 Based on the brewer's yeast genome information decoded by the method disclosed in JP-A-2004-283169, the present inventors isolated two genes encoding 3-isopropylmalate dehydrogenase possessed by brewer's yeast, nonScLEU2 and ScLEU2 genes.・ Identified. The nucleotide sequences of the nonScLEU2 and ScLEU2 genes and the amino acid sequences of the proteins encoded thereby are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, and SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.

１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（具体的には、DNA、以下、これらを単に「DNA」とも称する）；及び(b)配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするDNAは、上記のビール酵母由来の3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするDNAに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のDNAを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列において、例えば、１〜100個、１〜90個、１〜80個、１〜70個、１〜60個、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上99.2％以上99.3％以上99.4％以上99.5％以上99.6％以上99.7％以上99.8％以上99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えばY.P.Hsuらの方法（J. Biol. Chem., 257: 39-41（1982））などによって測定することができる。 1. First, the present invention relates to (a) a polynucleotide containing a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 (specifically, DNA, hereinafter referred to as “DNA”). And (b) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. The DNA targeted in the present invention is not limited to the DNA encoding 3-isopropylmalate dehydrogenase derived from the above-mentioned brewer's yeast, but includes other DNAs encoding proteins functionally equivalent to this protein. . Examples of functionally equivalent proteins include (c) an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. And a protein having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity. As such a protein, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, for example, 1 to 100, 1 to 90, 1 to 80, 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1-40, 1-39, 1-38, 1-37, 1-36, 1-35, 1-34, 1-33, 1-32, 1-3 31, 1-30, 1-29, 1-28, 1-27, 1-26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-2 21, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1 11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6 (1 to several), 1-5, 1-4, 1-3, 1 A protein having an amino acid sequence in which ˜2, one amino acid residue is deleted, substituted, inserted and / or added, and having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity It is. In general, the smaller the number of amino acid residue deletions, substitutions, insertions and / or additions, the better. In addition, as such a protein, (d) about 60% or more, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87 % Or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more A protein having an amino acid sequence having an identity of 99.1% or more 99.2% or more 99.3% or more 99.4% or more 99.5% or more 99.6% or more 99.7% or more 99.8% or more 99.9% or more and having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity Is mentioned. In general, the larger the homology value, the better. The 3-isopropylmalate dehydrogenase activity can be measured, for example, by the method of YPHsu et al. (J. Biol. Chem., 257: 39-41 (1982)).

また、本発明は、(e)配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。 The present invention also relates to (e) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 under stringent conditions and having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity. A polynucleotide comprising a polynucleotide that encodes a protein having a nucleotide sequence; and (f) a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. Also included are polynucleotides that contain a polynucleotide that hybridizes with the nucleotide under stringent conditions and encodes a protein having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity.

ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA）」とは、配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNA又は配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列をコードするDNAの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるDNAをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。 Here, “polynucleotide (DNA) that hybridizes under stringent conditions” means DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 2 or sequence A DNA obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like using all or part of the DNA encoding the amino acid sequence of No. 4 as a probe. As a hybridization method, for example, a method described in Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 can be used.

本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。 As used herein, the “stringent conditions” may be any of low stringency conditions, moderate stringency conditions, and high stringency conditions. “Low stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C. The “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNA having higher homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.

なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。 In addition, when using a commercially available kit for hybridization, Alkphos Direct Labeling Reagents (made by Amersham Pharmacia) can be used, for example. In this case, follow the protocol supplied with the kit, incubate with the labeled probe overnight, and then wash the membrane with a primary wash buffer containing 0.1% (w / v) SDS at 55 ° C. , Hybridized DNA can be detected.

これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列をコードするDNAと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上99.2％以上99.3％以上99.4％以上99.5％以上99.6％以上99.7％以上99.8％以上99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（proc. Natl． Acad． Sci． USA 872264-2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J Mol Biol 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。 Other than this, as DNA that can be hybridized, DNA that encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 when calculated using homology search software such as FASTA and BLAST using default parameters About 60% or more, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% More than 94%, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more 99.2% or more 99.3% or more 99.4% or more 99.5% or more 99.6% or more 99.7% or more 99.8% or more A DNA having 99.9% or more identity can be mentioned.
The identity of amino acid sequences and nucleotide sequences is determined using the algorithm BLAST (proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) by Carlin and Arthur. it can. Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990). When analyzing a base sequence using BLASTN, parameters are set to, for example, score = 100 and wordlength = 12. When analyzing an amino acid sequence using BLASTX, parameters are set to score = 50 and wordlength = 3, for example. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used.

２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(e)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：2又は配列番号：4のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。 2. Protein of the present invention The present invention also provides a protein encoded by any of the polynucleotides (a) to (e). A preferred protein of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and 3-isopropylmalic acid It is a protein having dehydrogenase activity. Such a protein comprises an amino acid sequence in which the number of amino acid residues as described above is deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and 3 -Proteins having isopropylmalate dehydrogenase activity. Examples of such a protein include a protein having the amino acid sequence having the homology as described above with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity. . Such proteins are described in “Molecular Cloning 3rd Edition”, “Current Protocols in Molecular Biology”, “Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”, “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) ”,“ Gene, 34, 315 (1985) ”,“ Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) ”,“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 82, 488 (1985) ”and the like.

本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。 The deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the protein of the present invention means that one or more amino acid residues in one and a plurality of amino acid sequences in the same sequence It means that there are amino acid residue deletion, substitution, insertion and / or addition, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously.
Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other. Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine; Group B: aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid; group C: asparagine, glutamine; group D: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid; group E : Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline; Group F: serine, threonine, homoserine; Group G: phenylalanine, tyrosine.

また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法のよっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。 The protein of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). It can also be chemically synthesized using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthesel Vega, Perceptive, Shimadzu, etc. .

３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有するベクターに関する。また、本発明のベクターは、通常、(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。 3. Next, the present invention provides a vector containing the polynucleotide described above. The vector of the present invention relates to a vector containing the polynucleotide (DNA) according to any one of (a) to (i) above. In addition, the vector of the present invention usually contains (a) a promoter capable of being transcribed in yeast cells; (b) any one of the above (a) to (i) bound to the promoter in a sense direction or an antisense direction. The described polynucleotide (DNA); and (c) with respect to transcription termination and polyadenylation of RNA molecules, configured to include an expression cassette comprising as a component a signal that functions in yeast.

酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中のVDK濃度に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。 As a vector used for introduction into yeast, any of a multicopy type (YEp type), a single copy type (YCp type), and a chromosome integration type (YIp type) can be used. For example, the YEp type vector is YEp24 (JR Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983), and the YCp type vector is YCp50 (MD Rose et al., Gene, 60, 237 YIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) is known as a YIp type vector and can be easily obtained.
The promoter / terminator for regulating gene expression in yeast may be any combination as long as it functions in brewing yeast and is not affected by the VDK concentration in the mash. For example, a promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene (TDH3), a promoter of 3-phosphoglycerate kinase gene (PGK1), and the like can be used. These genes have already been cloned and are described in detail, for example, in MF Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) and can be easily obtained by known methods.

形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセスカールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセスセレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌスが好ましく用いられる。 As a selection marker used for transformation, an auxotrophic marker cannot be used in the case of yeast for brewing, so geneticin resistance gene (G418r), copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81, 337 1984), cerulenin-resistance gene (fas2m, PDR4) (Hyogo, et al., Biochemistry, 64, 660, 1992; Hussain et et al., Gene, 101, 149, 1991), etc. Is available. The vector constructed as described above is introduced into the host yeast. Examples of the host yeast include any yeast that can be used for brewing, for example, brewery yeast for beer, wine, sake and the like. Specific examples include yeasts of the genus Saccharomyces. In the present invention, beer yeasts such as Saccharomyces pastorianus W34 / 70, Saccharomyces carlsbergensis NCYC453, NCYC456, etc. Saccharomyces cerevisiae NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954, etc. can be used. Furthermore, whiskey yeasts such as Saccharomyces cerevisiae NCYC90, wine yeasts such as association wines No. 1, 3, 4 etc., sake yeasts such as association yeast sake nos. 7, 9 etc. can also be used. However, the present invention is not limited to this. In the present invention, beer yeast such as Saccharomyces pastorianus is preferably used.

酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリイオン金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genitics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。 As a yeast transformation method, a publicly known method can be used. For example, for example, electroporation method “Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”, spheroplast method “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)”, lithium acetate method “J. Bacteriology, 153, p163 (1983) ”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual There is, but is not limited to this.
More specifically, the host yeast is a standard yeast nutrient medium (for example, YEPD medium “Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117 (1979)” etc.), and the value of OD600nm is 1-6. Incubate to. The cultured yeast is collected by centrifugation, washed, and pretreated with alkali ion metal ions, preferably lithium ions, at a concentration of about 1-2 M. The cells are allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes, and then left at about 30 ° C. for about 60 minutes together with the DNA to be introduced (about 1 to 20 μg). Polyethylene glycol, preferably about 4,000 daltons of polyethylene glycol, is added to a final concentration of about 20% to 50%. After standing at about 30 ° C. for about 30 minutes, the cells are heated at about 42 ° C. for about 5 minutes. Preferably, the cell suspension is washed with a standard yeast nutrient medium, placed in a predetermined amount of fresh standard yeast nutrient medium, and allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes. Thereafter, the transformant is obtained by planting on a standard agar medium containing an antibiotic or the like used as a selection marker. For other general cloning techniques, “Molecular Cloning 3rd Edition”, “Methods in Yeast Genitics, A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)” and the like can be referred to.

４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって所望の酒類でVDK、特にDA濃度を低く抑えることができ、香味を増した酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、ビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、VDK、特にDA濃度を低く抑えた酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、香味安定性等に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。 4). Process for producing liquor of the present invention and liquor obtained by the process The vector of the present invention described above is introduced into a yeast suitable for brewing the liquor to be produced, and the yeast is used to obtain VDK, particularly DA concentration in the desired liquor. Can be kept low, and alcoholic beverages with increased flavor can be produced. Examples of alcoholic beverages to be used include, but are not limited to, beer, beer-taste drinks, wine, whiskey, and sake.
In producing these alcoholic beverages, a known method can be used except that the brewer's yeast obtained in the present invention is used instead of the parent strain. Therefore, the raw materials, production equipment, production management, etc. may be exactly the same as the conventional method, and it does not increase the cost for producing VDK, especially alcoholic beverages with a low DA concentration. That is, according to the present invention, alcoholic beverages excellent in flavor stability and the like can be produced using existing facilities without increasing costs.

５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：1または配列番号：3の塩基配列を有する3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母の全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。 5. Method for Evaluating Yeast of the Present Invention The present invention provides a test yeast using a primer or probe designed based on the base sequence of 3-isopropylmalate dehydrogenase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. The present invention relates to a method for evaluating the total vicinal diketone producing ability or the total diacetyl producing ability. A general method of such an evaluation method is known, and is described in, for example, WO01 / 040514, JP-A-8-205900, and the like. Hereinafter, this evaluation method will be briefly described.
First, the genome of the test yeast is prepared. As the preparation method, any known method such as Hereford method or potassium acetate method can be used (for example, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)). Using the obtained genome as a target, using the primer or probe designed based on the base sequence (preferably the ORF sequence) of the 3-isopropylmalate dehydrogenase gene, the gene or the gene Check whether a specific sequence exists. The primer or probe can be designed using a known method.
Detection of a gene or a specific sequence can be performed using a known technique. For example, a polynucleotide containing a part or all of a specific sequence or a polynucleotide containing a base sequence complementary to the base sequence is used as one primer, and the upstream or downstream of this sequence is used as the other primer. A polynucleotide containing a part or all of the sequence or a polynucleotide containing a base sequence complementary to the base sequence is used to amplify a yeast nucleic acid by PCR, and the presence or absence of the amplified product and the molecular weight of the amplified product are determined. Measure the size. The number of bases of the polynucleotide used for the primer is usually 10 bp or more, preferably 15 to 25 bp.
The reaction conditions for the PCR method are not particularly limited. For example, conditions such as denaturation temperature: 90 to 95 ° C., annealing temperature: 40 to 60 ° C., extension temperature: 60 to 75 ° C., cycle number: 10 times or more should be used. Can do. The obtained reaction product is separated by electrophoresis using an agarose gel or the like, and the molecular weight of the amplified product can be measured. This method predicts and evaluates the total vicinal diketone-producing ability or total diacetyl-producing ability of the yeast depending on whether the molecular weight of the amplified product is large enough to include a specific portion of the DNA molecule. Further, by analyzing the base sequence of the amplified product, it is possible to predict and evaluate the above performance more accurately.

また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号1の塩基配列を有する3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の亜硫酸生成能を評価することもできる。この場合は、被検酵母を培養し、3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の産物であるmRNA又はたんぱく質を定量することによって可能である。mRNA又はたんぱく質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、たんぱく質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。 In the present invention, the test yeast is cultured, and the expression level of the 3-isopropylmalate dehydrogenase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is measured to evaluate the ability of the test yeast to produce sulfite. it can. In this case, it is possible by culturing the test yeast and quantifying mRNA or protein which is the product of the 3-isopropylmalate dehydrogenase gene. Quantification of mRNA or protein can be performed using a known technique. For example, mRNA can be quantified by, for example, Northern hybridization or quantitative RT-PCR, and protein can be quantified by, for example, Western blotting (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003).

以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates the detail of this invention, this invention is not limited to a following example.

実施例１：3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ScLEU2、nonScLEU2）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母ゲノム中に2つの3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、nonScLEU2およびScLEU2を見出した。それぞれの塩基配列を配列番号：1、配列番号：3に示す。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScLEU2_F（配列番号：5）／nonScLEU2_R（配列番号：6）、ScLEU2_F（配列番号：7）／ScLEU2_R（配列番号：8）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセスパストリアヌス W34/70株の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScLEU2およびScLEU2の全長遺伝子を含むDNA断片を取得した。 Example 1: Cloning of 3-isopropylmalate dehydrogenase gene (ScLEU2, nonScLEU2) As a result of searching using a comparative database described in JP-A-2004-283169, two 3-isopropylmalate dehydrogenase genes in the beer yeast genome, NonScLEU2 and ScLEU2 were found. The respective base sequences are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3. Based on the obtained base sequence information, primers nonScLEU2_F (SEQ ID NO: 5) / nonScLEU2_R (SEQ ID NO: 6), ScLEU2_F (SEQ ID NO: 7) / ScLEU2_R (SEQ ID NO: 8) for amplifying full-length genes, respectively. A DNA fragment containing the full length genes of nonScLEU2 and ScLEU2 was obtained by PCR using the chromosomal DNA of the genome decoding strain Saccharomyces pastorianus W34 / 70 as a template.

上記のようにして得られたnonScLEU2あるいはScLEU2遺伝子断片をTAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入し、サンガーの方法（Sanger, Science, 214, 1215（1981））によって塩基配列を確認した。 The nonScLEU2 or ScLEU2 gene fragment obtained as described above is inserted into the pCR2.1-TOPO vector (manufactured by Invitrogen) by TA cloning, and the nucleotide sequence is obtained by the Sanger method (Sanger, Science, 214, 1215 (1981)) It was confirmed.

実施例２：ビール試醸中のnonScLEU2およびScLEU2遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセスパストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行った。

麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×10⁶cells/mL

発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、特開2004-283169に記載のビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScLEU2およびScLEU2遺伝子の発現パターンを（図３）に示す。この結果より、通常のビール発酵条件下において両遺伝子が発現していることが確認できた。 Example 2: Analysis of nonScLEU2 and ScLEU2 gene expression during beer brewing Beer brewing was performed using the brewer's yeast Saccharomyces pastorianus strain W34 / 70.

Wort extract concentration 12.69%
Wort capacity 70L
Wort dissolved oxygen concentration 8.6ppm
Fermentation temperature 15 ℃
Yeast input 12.8 × 10 ⁶ cells / mL

The fermentation broth was sampled over time, and changes in the yeast growth amount (FIG. 1) and appearance extract concentration (FIG. 2) over time were observed. At the same time, the yeast cells were sampled, and the prepared mRNA was labeled with biotin and hybridized to the brewer's yeast DNA microarray described in JP-A-2004-283169. Signal detection was performed using GeneChip Operating System (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0, manufactured by Affymetrix). The expression pattern of the nonScLEU2 and ScLEU2 genes is shown in FIG. From this result, it was confirmed that both genes were expressed under normal beer fermentation conditions.

実施例３：nonScLEU2およびScLEU2遺伝子の構成的発現
実施例1に記載のnonScLEU2/pCR2.1-TOPOおよびScLEU2/pCR2.1-TOPOをそれぞれ制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含む約1.1kbのDNA断片を調製する。それぞれの断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、nonScLEU2構成的発現ベクターnonScLEU2/pYCGPYNotを構築する。これと同様の手順でScLEU2構成的発現ベクターScLEU2/pYCGPYNotを構築する。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって構成的に発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418^rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amp^rを含んでいる。 Example 3 Constitutive Expression of nonScLEU2 and ScLEU2 Genes NonScLEU2 / pCR2.1-TOPO and ScLEU2 / pCR2.1-TOPO described in Example 1 were digested with restriction enzymes SacI and NotI, respectively, and contained about the entire protein coding region. Prepare a 1.1 kb DNA fragment. Each fragment is ligated to pYCGPYNot treated with restriction enzymes SacI and NotI to construct a nonScLEU2 constitutive expression vector nonScLEU2 / pYCGPYNot. The ScLEU2 constitutive expression vector ScLEU2 / pYCGPYNot is constructed in the same procedure as this. pYCGPYNot is a YCp type yeast expression vector, and the introduced gene is constitutively expressed by the promoter of the pyruvate kinase gene PYK1. The geneticin-resistant gene G418 ^r is as the selection marker in the yeast, and the ampicillin-resistant gene Amp ^r as a selective marker in Escherichia coli.

上述の方法で作製した構成的発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセスパストリアヌスバイヘンステファン34/70株を形質転換する。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択する。 Using the constitutive expression vector prepared by the above-mentioned method, Saccharomyces pastorianus bihenstephane 34/70 strain is transformed by the method described in JP-A-07-303475. Transformants are selected on YPD plate medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose, 2% agar) containing geneticin 300 mg / L.

実施例４：ビール試験醸造におけるVDK生成量の解析
親株ならびに実施例3で得られたnonScLEU2高発現株、ScLEU2高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行う。

麦汁エキス濃度 12%
麦汁容量 1L
麦汁溶存酸素濃度約 8ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁

発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）、エキス消費量の経時変化を調べる。醪中の全VDKの定量は、VDK（DA及びPD）をヒドロキシルアミンと反応させ、生成したグリオキシム誘導体と2価鉄イオンが反応して生じる錯体の吸光度を測定することによって行う（Drews et al., Mon. fur Brau., 34, 1966）。この時、前駆体であるα-アセト乳酸及びα-アセトヒドロキシ酪酸をあらかじめガス洗い法（酸化的脱炭酸反応）によってそれぞれDA、PDに変換しておくことにより、これらを含めた全VDK量を求めることができる。また、ＤＡの定量は、ＤＡを含むα-ジケトンが、１，２-ジアミノベンゼンと反応して生じる誘導体の紫外部における吸光度をＨＰＬＣで測定することにより行う。 Example 4: Analysis of VDK production amount in beer test brewing A fermentation test using the parent strain and the non-ScLEU2 high expression strain and the ScLEU2 high expression strain obtained in Example 3 is performed under the following conditions.

Wort extract concentration 12%
Wort capacity 1L
Wort dissolved oxygen concentration about 8ppm
Fermentation temperature 15 ℃ constant Yeast input 5g Wet yeast cells / L wort

Sampling fermented koji over time and examining changes in yeast growth (OD660) and extract consumption over time. Quantification of total VDK in soot is carried out by reacting VDK (DA and PD) with hydroxylamine and measuring the absorbance of the complex formed by the reaction of the glyoxime derivative and divalent iron ions (Drews et al. , Mon. fur Brau., 34, 1966). At this time, α-acetolactic acid and α-acetohydroxybutyric acid precursors are converted into DA and PD by gas washing method (oxidative decarboxylation reaction) in advance, respectively, so that the total amount of VDK including them can be calculated. Can be sought. Further, DA is quantified by measuring the absorbance in the ultraviolet part of a derivative produced by reacting an α-diketone containing DA with 1,2-diaminobenzene by HPLC.

本発明の酒類製造法によれば、製品中でオフフレーバーとなるVDK、とくにDA生産量が低減され、香味に優れた酒類を容易に製造することが可能となる。 According to the method for producing an alcoholic beverage of the present invention, the production amount of VDK, which is an off-flavor in the product, in particular, DA production is reduced, and it becomes possible to easily produce an alcoholic beverage with excellent flavor.

ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。It is a figure which shows the time-dependent change of the yeast growth amount in beer test brewing. The horizontal axis represents the fermentation time, and the vertical axis represents the value of OD660. ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。It is a figure which shows the time-dependent change of the extract consumption in beer test brewing. The horizontal axis represents the fermentation time, and the vertical axis represents the appearance extract concentration (w / w%). ビール試験醸造中の酵母におけるnonScLEU2およびScLEU2遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。It is a figure which shows the expression behavior of the nonScLEU2 and ScLEU2 gene in the yeast in beer test brewing. The horizontal axis indicates the fermentation time, and the vertical axis indicates the detected signal luminance.

［配列番号：５］プライマー
［配列番号：６］プライマー
［配列番号：７］プライマー
［配列番号：８］プライマー [SEQ ID NO: 5] Primer [SEQ ID NO: 6] Primer [SEQ ID NO: 7] Primer [SEQ ID NO: 8] Primer

Claims

以下の(a)〜(f)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：2のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 The polynucleotide according to any one of the following (a) to (f):
(a) a polynucleotide comprising a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(b) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(c) a polyprotein encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity A polynucleotide containing nucleotides;
(d) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity;
(e) containing a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under a stringent condition and encodes a protein having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity A polynucleotide; and
(f) 3-isopropylmalate dehydrogenase activity, hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having

以下の(g)〜(i)のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：2のアミノ酸配列又は配列番号：2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 The polynucleotide of any one of the following (g) to (i):
(g) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and 3-isopropylmalate dehydrogenase A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having activity;
(h) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity; and
(i) hybridizes with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions, and 3-isopropyl apple A polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having acid dehydrogenase activity.

配列番号：1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。 The polynucleotide according to claim 1, comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。 2. The polynucleotide of claim 1, comprising a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。 The polynucleotide according to any one of claims 1 to 4, which is DNA.

請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。 A protein encoded by the polynucleotide according to any one of claims 1 to 5.

請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。 A vector containing the polynucleotide according to any one of claims 1 to 5.

以下の(j)〜(l)のいずれかであるポリヌクレオチドを含有するベクター。
(j)配列番号：4のアミノ酸配列又は配列番号：4のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k) 配列番号：4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：3の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 A vector containing a polynucleotide that is any of the following (j) to (l).
(j) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and 3-isopropylmalate dehydrogenase A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having activity;
(k) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having 3-isopropylmalate dehydrogenase activity; and
(l) Hybridizes with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under highly stringent conditions, and 3-isopropyl apple A polynucleotide comprising a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having acid dehydrogenase activity.

請求項７又は８に記載のベクターが導入された形質転換酵母。 A transformed yeast into which the vector according to claim 7 or 8 has been introduced.

醸造時に全ビシナルジケトン生産量を低減し得る請求項９に記載の醸造用酵母。 The brewing yeast according to claim 9, which can reduce the total amount of vicinal diketone produced during brewing.

醸造時に全ダイアセチル生産量を低減し得る請求項９に記載の醸造用酵母。 The yeast for brewing according to claim 9, which can reduce the total production amount of diacetyl during brewing.

請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、醸造時に全ビシナルジケトン生産量を低減し得る請求項９に記載の醸造用酵母。 The brewery yeast according to claim 9, wherein the total vicinal diketone production amount can be reduced during brewing by increasing the expression level of the protein according to claim 6.

請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって、醸造時に全ダイアセチル生産量を低減し得る請求項９に記載の醸造用酵母。 The brewing yeast according to claim 9, wherein the total amount of diacetyl produced can be reduced during brewing by increasing the expression level of the protein according to claim 6.

請求項９から１３のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。 A method for producing an alcoholic beverage using the yeast according to any one of claims 9 to 13.

醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１４に記載の酒類の製造方法。 The method for producing an alcoholic beverage according to claim 14, wherein the alcoholic beverage to be brewed is a malt beverage.

醸造する酒類がワインである請求項１４に記載の酒類の製造方法。 The method for producing an alcoholic beverage according to claim 14, wherein the alcoholic beverage to be brewed is wine.

請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法で製造された酒類。 The liquor manufactured by the method in any one of Claims 14-16.

配列番号：1または配列番号：3の塩基配列を有する3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生産能または全ダイアセチル生産能について評価する方法。 Using a primer or probe designed based on the base sequence of the 3-isopropylmalate dehydrogenase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, the ability to produce total vicinal diketone or total diacetyl in the test yeast How to evaluate about.

被検酵母を培養し、配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列を有する3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の亜硫酸生成能を評価する方法。 A method for evaluating the ability of a test yeast to produce sulfite by culturing a test yeast and measuring the expression level of a 3-isopropylmalate dehydrogenase gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.

基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：1又は配列番号：3の塩基配列を有する3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、酵母の選択方法。 Reference yeast and test yeast are cultured, and the expression level in each yeast of the 3-isopropylmalate dehydrogenase gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is measured, and the gene is expressed at a higher level than the reference yeast A method for selecting yeast, wherein the test yeast is selected.