JP2007028985A - Fetal rna in amniotic fluid for determining gene expression in developing fetus - Google Patents
Fetal rna in amniotic fluid for determining gene expression in developing fetus Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007028985A JP2007028985A JP2005216565A JP2005216565A JP2007028985A JP 2007028985 A JP2007028985 A JP 2007028985A JP 2005216565 A JP2005216565 A JP 2005216565A JP 2005216565 A JP2005216565 A JP 2005216565A JP 2007028985 A JP2007028985 A JP 2007028985A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amniotic fluid
- fetal
- rna
- fetal rna
- gene expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
（政府の利益）
本明細書中に記載される研究は、米国国立衛生研究所によって資金提供された（助成番号ＮＩＨ ＨＤ４２０５３）。米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
(Government interests)
The study described herein was funded by the National Institutes of Health (Grant No. NIH HD42053). The US government may have certain rights in the invention.
（発明の背景）
遺伝障害および先天性異常（出生時欠損とも呼ばれる）は、全生児出生の約３〜５％に生じる（Ａ．ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＭ．Ｇ．Ｌｉｎｄｅｎ，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，１９９３，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。合わせて、遺伝障害および先天性異常は、小児入院の３０％を占め（Ｃ．Ｒ．Ｓｃｒｉｖｅｒら、Ｃａｎ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．，１９７３，１０８：１１１１−１１１５；Ｅ．Ｗ．Ｌｉｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｅｒｉｎａｔａｌ．，１９９１，８：１６４−１６９）、そして先進国におけるすべての小児期死亡の約半数の原因である（Ｒ．Ｊ．Ｂｅｒｒｙら、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ，１９８７，１０２：１７１−１８１；Ｒ．Ａ．ＨｏｅｋｅｌｍａｎおよびＩ．Ｂ．Ｐｌｅｓｓ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１９９８，８２：５８２−５９５）と見積もられている。米国では、出生時欠損は、乳児死亡の主要な原因である（Ｒ．Ｎ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｍｏｎｔｈ．Ｓｔａｔ．Ｒｅｐ．，１９９７，Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ １１，Ｓｕｐｐｌ．２，ｐ．５５）。さらに、遺伝障害および先天性異常は、実質的には、長期の障害の一因となり；それらは、多額な医療費に関連し（Ａ．Ｃｚｅｉｚｅｌら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，１９８４，１２８：７３−１０３；Ｃｅｎｔｅｒｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｍｏｒｂ．Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐ．，１９８９，３８：２６４−２６７；Ｓ．Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，１９９１，１８：３１９−３２０；Ｃ．Ｃｕｎｎｉｆｆら、Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９５，４８：１７−２２）、そして罹患した者および／またはその家族への重い心理的負担および感情的負担を生じる。これらの理由および他の理由によって、出生前診断が、妊娠自体の臨床管理の必須の一面として、ならびに遺伝障害の検出、予防、そして最終的には処置に対する重大な工程として、長い間認識されてきた。
(Background of the Invention)
Genetic disorders and birth defects (also called birth defects) occur in about 3-5% of all live births (A. Robinson and MG Linden, “Clinical Genetic Handbook”, 1993, Blackwell Scientific Publications: Boston, MA). Together, genetic disorders and congenital abnormalities account for 30% of pediatric hospitalizations (CR Scriver et al., Can. Med. Assoc. J., 1973, 108: 1111-1115; EW Ling et al., Am. J. Perinatal., 1991, 8: 164-169), and responsible for about half of all childhood deaths in developed countries (RJ Berry et al., Public Health Report, 1987, 102: 171-). 181; RA Hoekelman and IB Press, Pediatrics, 1998, 82: 582-595). In the United States, birth defects are a major cause of infant death (RN Anderson et al., Month. Stat. Rep., 1997, Vol. 45, No 11, Suppl. 2, p. 55). In addition, genetic disorders and congenital abnormalities substantially contribute to long-term disability; they are associated with significant medical costs (A. Czeizel et al., Mutat. Res., 1984, 128: 73- 103; Centers of Disease Control, Morb. Total. Weekly Rep., 1989, 38: 264-267; S. Kaplan, J. Am. Coll. Cardiol., 1991, 18: 319-320; Genet., 1995, 48: 17-22), and creates a heavy psychological and emotional burden on the affected person and / or their family. For these and other reasons, prenatal diagnosis has long been recognized as an essential aspect of clinical management of the pregnancy itself, and as a critical step in the detection, prevention, and ultimately treatment of genetic disorders. It was.
現在、最も正確な出生前診断は、胎児の核型の分析によって提供される。これらの核型分析法で使用するための胎児細胞は、従来、羊水（羊水穿刺によって得られる）、絨毛膜絨毛（絨毛膜絨毛サンプリングによって得られる）、または胎児血液（臍帯穿刺または経皮的臍帯血サンプリングによって得られる）のサンプルから単離される。そのような分析は、数的な染色体異常および／または構造的な染色体異常の存在を明らかにし得る。必要とする退屈で、時間のかかる労働集約的な工程（Ｂ．Ｅｉｂｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９０，４７：６５６−６６３）に加えて、これらの方法は、感度が限られており、その標準的な解像のレベルは、小さいかまたは微細な染色体異常の検出を可能とせず、多数の疾患および状態を検出されないままにする。 Currently, the most accurate prenatal diagnosis is provided by fetal karyotype analysis. Fetal cells for use in these karyotyping methods have traditionally been amniotic fluid (obtained by amniocentesis), chorionic villi (obtained by chorionic villi sampling), or fetal blood (umbilical puncture or percutaneous umbilical cord). Isolated from blood samples). Such an analysis may reveal the presence of numerical and / or structural chromosomal abnormalities. In addition to the tedious and time consuming labor intensive process required (B. Eiben et al., Am. J. Hum. Genet., 1990, 47: 656-663), these methods have limited sensitivity. Its standard resolution level does not allow for the detection of small or fine chromosomal abnormalities, leaving many diseases and conditions undetected.
過去１０年間に、従来の染色体分析に対する分子生物学的技術の適用が、出生前に診断され得る障害の範囲を広げた新たな臨床細胞遺伝学的手段を生み出してきた。これらの新たな技術に加えて、胎児遺伝物質の新たな供給源もまた探索されている。これらとしては、母体循環に存在する無傷胎児細胞（これらの分析は、胎児染色体異数性の出生前診断を可能にすることが示されている（Ｓ．Ｅｌｉａｓら、Ｌａｎｃｅｔ，１９９２，３４０：１０３３；Ｄ．Ｗ．Ｂｉａｎｃｈｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９２，９０：３６８−３７０；Ｄ．Ｇｅａｎｓｈｉｒｔ−Ａｈｌｅｒｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３，３０：１９３−２００；Ｊ．Ｌ．Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９３，２７０：２３５７−２３６１；Ｆ．ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚら、Ｆｅｔａｌ Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．，１９９８，１３：３８０；およびＤ．Ｗ．Ｂｉａｎｃｈｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９７，６１：８２２−８２９））、ならびに妊婦の血清および血漿中に存在する胎児ＤＮＡ配列（これは、胎児の性別の決定、胎児のＲｈＤ状態の同定、問題のある妊娠および種々の出生前状態の診断のために首尾よく使用されている（Ｙ．Ｍ．Ｄ．Ｌｏら、Ｌａｎｃｅｔ，１９９７，３５０：４８５−４８７；Ｂ．ＰｅｒｔｌおよびＤ．Ｗ．Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，２００１，９８：４８３−４９０；Ｙ．Ｍ．Ｄ．Ｌｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，４５：１７４７−１７５１））が挙げられる。 In the past decade, the application of molecular biology techniques to traditional chromosomal analysis has created new clinical cytogenetic tools that have expanded the range of disorders that can be diagnosed before birth. In addition to these new technologies, new sources of fetal genetic material are also being explored. These include intact fetal cells present in the maternal circulation (these analyzes have been shown to allow prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy (S. Elias et al., Lancet, 1992, 340: 1033). D. W. Bianchi et al., Hum. Genet., 1992, 90: 368-370; D. Geanshirt-Ahlert et al., Am. J. Reprod. J. Am. Med. Assoc., 1993, 270: 2357-2361; F. de la Cruz et al., Fetal Diagnostic. Ther., 1998, 13: 380; and D. W. Bianchi et al., Am. Hum. Genet., 1997, 61: 822-829)) Fetal DNA sequences present in the serum and plasma of pregnant women (which have been used successfully for fetal gender determination, fetal RhD status identification, problematic pregnancy and diagnosis of various prenatal conditions (YM D. Lo et al., Lancet, 1997, 350: 485-487; B. Pertl and DW Bianchi, Obstet. Gynecol., 2001, 98: 483-490; YM.D.Lo Et al., Clin. Chem., 1999, 45: 1747-1751)).
新たな技術の開発および胎児遺伝物質の新たな供給源の発見は、従来の出生前診断の方法の有意な改善をもたらしてきた。しかし、既存のストラテジーは、それらが提供し得る情報に関して限定される。例えば、それらは、インビボでのヒト胎児発生の研究を可能としない。特に、胎児発生中の遺伝子の発現パターン（これは、子宮内での正常な発生プロセスおよび異常な発生プロセスの原因である遺伝的機構のより良い理解を得るために価値のある情報の一部である）は、これらの方法を通して入手可能ではない。現在、胎児のモニタリングは、母体の子宮サイズの測定、胎児の心拍の検出、および／または超音波試験による胎児の解剖学的構造の評価を通して決定される非常に大ざっぱな非侵襲性のパラメーターに限られる。技術的進歩およびヒトゲノム計画に由来する情報が、何万もの遺伝子転写産物を同時に検出かつ定量することを可能にするマイクロアレイの開発を可能にしているが、胎児遺伝子発現分析は、ヒト流産子の組織試験を通してかまたは動物界にわたって保存される遺伝子および発生経路についての動物モデルを使用して実施されているのみである。従って、ヒトにおいて直接的に研究されたヒト初期発生において活性な遺伝子について公知なものはほとんどない。 The development of new technologies and the discovery of new sources of fetal genetic material has led to significant improvements in traditional prenatal diagnostic methods. However, existing strategies are limited with respect to the information they can provide. For example, they do not allow the study of human fetal development in vivo. In particular, gene expression patterns during fetal development (this is part of the valuable information to gain a better understanding of the genetic mechanisms responsible for normal and abnormal development processes in the womb. Are not available through these methods. Currently, fetal monitoring is limited to very sketchy non-invasive parameters determined through measurement of maternal uterine size, detection of fetal heartbeats, and / or assessment of fetal anatomy by ultrasonography. It is done. While technological advances and information derived from the Human Genome Project have enabled the development of microarrays that allow the simultaneous detection and quantification of tens of thousands of gene transcripts, fetal gene expression analysis is It has only been performed using animal models for genes and developmental pathways that are conserved throughout the study or across the animal kingdom. Thus, very little is known about genes active in early human development that have been studied directly in humans.
従って、生存胎児の福利、病状、および正常な発生 対 異常な発生についての情報を提供し得る出生前遺伝子発現モニタリングを可能にする方法論が、大変望ましい。 Therefore, a methodology that enables prenatal gene expression monitoring that can provide information about the well-being, disease state, and normal versus abnormal development of live fetuses is highly desirable.
（発明の要旨）
本発明は、以下を提供する：
（項目１）
単離された羊水胎児ＲＮＡ。
（項目２）
妊婦から得られた羊水サンプルを処理し、その結果、該羊水中に存在する胎児ＲＮＡが抽出されて、羊水胎児ＲＮＡが得られる工程
を包含するプロセスによって得られる、項目１に記載の胎児ＲＮＡ。
（項目３）
前記羊水サンプルを処理する前に、細胞集団が該サンプルから取り出される、項目２に記載の胎児ＲＮＡ。
（項目４）
前記羊水サンプルを処理する工程が、
前記羊水中に存在する細胞集団を単離する工程；
該単離された細胞を必要に応じて培養する工程；および
該単離された細胞から胎児ＲＮＡを抽出する工程
を包含する、項目２に記載の胎児ＲＮＡ。
（項目５）
前記羊水胎児ＲＮＡが、胎児メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、項目１に記載の胎児ＲＮＡ。
（項目６）
出生前診断の方法であって、以下：
羊水胎児ＲＮＡのサンプルを提供する工程；
該羊水胎児ＲＮＡを分析して、胎児ＲＮＡに関する情報を得る工程；および
該得られた情報に基づいて、出生前診断を提供する工程を包含する、方法。
（項目７）
前記羊水胎児ＲＮＡが、妊婦から得られた羊水サンプルを処理し、その結果、該羊水中に存在する胎児ＲＮＡが抽出されて分析に利用可能になり、羊水胎児ＲＮＡが得られることによって得られる、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記処理する工程の前に、該羊水サンプルから細胞集団を除去して、残りの羊水物質を得る工程をさらに包含する、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記羊水胎児ＲＮＡが、以下：
妊婦から得られた羊水サンプルから細胞集団を取り出して、単離された細胞を得る工程；
必要に応じて、該単離された細胞を培養する工程；および
該単離された細胞を処理し、その結果、該細胞中に存在する胎児ＲＮＡが抽出されて分析に利用可能になり、羊水胎児ＲＮＡが得られる工程
によって得られる、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記分析する工程の前に、以下：
（ａ）前記羊水胎児ＲＮＡを増幅して増幅された胎児ＲＮＡを得て、そして該増幅された胎児ＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、（ｂ）該羊水胎児ＲＮＡを断片化して、断片化した胎児ＲＮＡを得て、そして該断片化した胎児ＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、（ｃ）該羊水胎児ＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換して胎児ｃＤＮＡを得て、そして該胎児ｃＤＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、または（ｄ）該羊水胎児ＲＮＡを相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）に変換して胎児ｃＲＮＡを得て、そして該胎児ｃＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程
をさらに包含する、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記検出可能な薬剤が、蛍光標識、比色分析標識、化学発光標識、放射性核種、磁気標識、ハプテン、微粒子、酵素、検出可能な生物学的分子およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記羊水胎児ＲＮＡを分析する工程が、羊水胎児ＲＮＡの量を決定する工程、羊水胎児ＲＮＡの濃度を決定する工程、羊水胎児ＲＮＡの配列組成を決定する工程、該羊水胎児ＲＮＡを遺伝子分析に提出する工程、およびアレイを用いて該羊水胎児ＲＮＡを分析する工程のうちの１以上を包含する、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記羊水胎児ＲＮＡを分析する工程から得られた情報が、胎児ＲＮＡの量、胎児ＲＮＡの濃度、胎児ＲＮＡの配列組成、定性的胎児遺伝子発現、定量的胎児遺伝子発現、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目６に記載の方法。
（項目１４）
出生前診断を提供する工程が、胎児の性別を決定する工程、胎児の発生の進行を決定する工程、および該胎児が罹患している疾患または状態を同定する工程のうちの１以上を包含する、項目６に記載の方法。
（項目１５）
前記出生前診断が、疾患または状態を有する疑いのある胎児について実施される、項目６に記載の方法。
（項目１６）
胎児における遺伝子発現を確立するための方法であって、該方法は、以下の工程：
羊水胎児ＲＮＡの試験サンプルを提供する工程であって、該胎児ＲＮＡは、妊婦から得られた羊水のサンプルに由来し、該試験サンプルは、検出可能な薬剤を用いて標識された複数の核酸セグメントを含む、工程；
複数の遺伝子プローブを含む遺伝子発現アレイを提供する工程であって、各遺伝子プローブは、基板表面上の別々のスポットに固定されて、該アレイを形成する、工程；
該サンプル中の該核酸セグメントが該アレイ上の該遺伝子プローブに特異的にハイブリダイズする条件下で、該アレイを該試験サンプルと接触させる工程；
該アレイ上に固定された個々の遺伝子プローブに対する該試験サンプルの個々の核酸セグメントの結合を決定して、結合パターンを得る工程；および
該得られた結合パターンに基づいて、該胎児について遺伝子発現パターンを確立する工程
を包含する、方法。
（項目１７）
前記遺伝子発現パターンの１以上の特徴を、胎児の性別と相関付ける工程、または該遺伝子発現パターンの１以上の特徴を、在胎齢と相関付ける工程をさらに包含する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記胎児が、核型および発生に関して正常であるか、核型に関して異常であるか、発生に関して異常であるか、または臨床状態に罹患している、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
異なる在胎齢の核型および発生に関して正常な雄性胎児または雌性胎児由来の統計学的に有意な数の羊水胎児ＲＮＡサンプルに関して、前記工程の全てを繰り返す工程；ならびに
前記得られた遺伝子発現パターンに基づいて、核型および発生に関して正常な雄性胎児または雌性胎児における異なる在胎齢でのｍＲＮＡ発現のベースラインレベルを確立する工程
をさらに包含する、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記分析した羊水胎児ＲＮＡが雄性胎児に由来する場合、前記遺伝子発現パターンの１以上の特徴を、核型および発生に関して正常な雄性胎児の胎児発生の時間もしくは事象と相関させる工程、または
前記分析した羊水胎児ＲＮＡが雌性胎児に由来する場合、前記遺伝子発現パターンの１以上の特徴を、核型および発生に関して正常な雌性胎児の胎児発生の時間もしくは事象と相関させる工程、
をさらに包含する、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
異なる在胎齢の核型および発生に関して正常な雄性胎児または雌性胎児由来の統計学的に有意な数の羊水胎児ＲＮＡサンプルに関して、前記工程の全てを繰り返す工程；
該得られた遺伝子発現パターンの１以上の特徴を、核型および発生に関して正常な雄性胎児または雌性胎児の胎児発生の時間または事象と相関させる工程；ならびに
該相関に基づいて、核型および発生に関して正常な雄性胎児または雌性胎児についての、異なる在胎齢での発生遺伝子発現パターンを確立する工程
をさらに包含する、項目１６に記載の方法。
（項目２２）
同一の染色体異常を有する、核型に関して異常な胎児由来の統計学的に有意な数の羊水胎児ＲＮＡサンプルに関して、前記工程の全てを繰り返す工程；
各得られた遺伝子発現パターンを、類似の在胎齢および性別の核型および発生に関して正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルと比較する工程；
該比較に基づいて、該核型に関して異常な胎児において異常に発現され、該染色体異常と関連する１以上の遺伝子を同定する工程；ならびに
必要に応じて、染色体異常と相関するものとして同定された該１以上の遺伝子の目録を作る工程
をさらに包含する、項目１６に記載の方法。
（項目２３）
同一の発生疾患または発生状態を有する、発生に関して異常な胎児由来の統計学的に有意な数の羊水胎児ＲＮＡサンプルに関して、前記工程の全てを繰り返す工程；
各得られた遺伝子発現パターンを、類似の在胎齢および性別の核型および発生に関して正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルと比較する工程；
該比較に基づいて、該発生に関して異常な胎児において異常に発現され、該発生疾患または発生状態と関連する１以上の遺伝子を同定する工程；ならびに
必要に応じて、発生疾患または発生状態と相関するものとして同定された該１以上の遺伝子の目録を作る工程
をさらに包含する、項目１６に記載の方法。
（項目２４）
同一の臨床状態に罹患した罹病胎児由来の統計学的に有意な数の羊水胎児ＲＮＡサンプルに関して、前記工程の全てを繰り返す工程；
各得られた遺伝子発現パターンを、類似の在胎齢および性別の核型および発生に関して正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルと比較する工程；
該比較に基づいて、該罹病胎児において異常に発現され、該臨床状態と関連する１以上の遺伝子を同定する工程；ならびに
必要に応じて、臨床状態と相関するものとして同定された該１以上の遺伝子の目録を作る工程
をさらに包含する、項目１６に記載の方法。
（項目２５）
前記羊水胎児ＲＮＡが、妊婦から得られた羊水サンプルを処理し、その結果、該羊水中に存在する胎児ＲＮＡが抽出されて分析に利用可能になり、羊水胎児ＲＮＡが得られることによって得られる、項目１６に記載の方法。
（項目２６）
前記処理する工程の前に、前記羊水サンプルから細胞集団を除去して、残りの羊水物質を得る工程をさらに包含する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記羊水胎児ＲＮＡが、以下：
妊婦から得られた羊水サンプルから細胞集団を取り出して、単離された細胞を得る工程；
必要に応じて、該単離された細胞を培養する工程；および
該単離された細胞を処理し、その結果、該細胞中に存在する胎児ＲＮＡが抽出されて分析に利用可能になる工程
によって得られる、項目１６に記載の方法。
（項目２８）
前記接触させる工程の前に、以下：
（ａ）前記羊水胎児ＲＮＡを増幅して増幅された胎児ＲＮＡを得て、そして該増幅された胎児ＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、（ｂ）該羊水胎児ＲＮＡを断片化して、断片化した胎児ＲＮＡを得て、そして該断片化した胎児ＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、（ｃ）該羊水胎児ＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換して胎児ｃＤＮＡを得て、そして該胎児ｃＤＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、または（ｄ）該羊水胎児ＲＮＡを相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）に変換して胎児ｃＲＮＡを得て、そして該胎児ｃＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程
をさらに包含する、項目１６に記載の方法。
（項目２９）
前記検出可能な薬剤が、蛍光標識、比色分析標識、化学発光標識、放射性核種、磁気標識、ハプテン、微粒子、酵素、検出可能な生物学的分子およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記アレイ上に固定された個々の遺伝子プローブに対する前記試験サンプルの個々の核酸セグメントの結合を決定して、結合パターンを得る工程が、該アレイ上の各別個のスポットにおける前記検出可能な薬剤によって生成されたシグナルの強度を測定する工程を包含する、項目１６に記載の方法。
（項目３１）
前記アレイ上に固定された個々の遺伝子プローブに対する前記試験サンプルの個々の核酸セグメントの結合を決定して、結合パターンを得る工程が、以下の工程：
コンピュータ支援画像化システムを用いて、ハイブリダイゼーション後の該アレイの蛍光画像を得る工程；および
コンピュータ支援画像解析システムを用いて、該得られた蛍光画像を分析して、該アレイから画像化されたデータを解釈して、ゲノム遺伝子座に相関するものとして、蛍光強度として結果を表示する工程
を包含する、項目１６に記載の方法。
（項目３２）
アレイベースの遺伝子発現分析に羊水胎児ＲＮＡを提出することによって行われる出生前診断の方法であって、該方法は、以下の工程：
羊水胎児ＲＮＡの試験サンプルを提供する工程であって、該胎児ＲＮＡは、既知の性別および在胎齢の胎児を有する妊婦から得られた羊水サンプルに由来し、該試験サンプルは、検出可能な薬剤で標識された複数の核酸セグメントを含む、工程；
複数の遺伝子プローブを備える遺伝子発現アレイを提供する工程であって、各遺伝子プローブは、基板表面上の別々のスポットに固定されて、該アレイを形成する、工程；
該サンプル中の該核酸セグメントが該アレイ上の該遺伝子プローブに特異的にハイブリダイズする条件下で、該アレイを該試験サンプルと接触させる工程；
該アレイ上に固定された個々の遺伝子プローブに対する該試験サンプルの個々の核酸セグメントの結合を決定して、結合パターンを得る工程；
該得られた結合パターンに基づいて、該胎児について遺伝子発現パターンを確立する工程；
該遺伝子発現パターンを分析する工程；および
該分析に基づいて、出生前診断を提供する工程
を包含する、方法。
（項目３３）
前記遺伝子発現パターンを分析する工程が、以下：
前記胎児の該遺伝子発現パターンを、同一の性別および在胎齢の核型および発生に関して正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルに対して比較するか、または同一の性別および在胎齢の核型および発生に関して正常な胎児について確立された発生遺伝子発現パターンに対して比較する工程を包含する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記遺伝子発現パターンを分析する工程が、１以上の異常に発現される遺伝子を検出する工程を包含する、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記異常に発現される１以上の遺伝子が、染色体異常、発生異常および／または臨床状態と関連する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
出生前診断を提供する工程が、前記胎児の発生の進行を決定する工程および／または該胎児が罹患している疾患もしくは状態を同定する工程を包含する、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
前記胎児が、染色体異常に関連した疾患または状態、発生異常に関連した疾患または状態、臨床状態、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される疾患または状態を有する疑いがある、項目３２に記載の方法。
（項目３８）
前記羊水胎児ＲＮＡが、妊婦から得られた羊水サンプルを処理し、その結果、該羊水中に存在する胎児ＲＮＡが抽出されて分析に利用可能になり、羊水胎児ＲＮＡが得られることによって得られる、項目３２に記載の方法。
（項目３９）
前記を
処理する工程の前に、前記羊水サンプルから細胞集団が取り出されて、残りの羊水物質が得られる工程をさらに包含する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記羊水胎児ＲＮＡが、以下：
妊婦から得られた羊水サンプルから細胞集団を取り出して、単離された細胞を得る工程；
該単離された細胞を必要に応じて培養する工程；および
該単離された細胞を処理し、その結果、該細胞中に存在する胎児ＲＮＡが抽出されて分析に入手可能になる工程
によって得られる、項目３２に記載の方法。
（項目４１）
前記分析する工程の前に、以下：
（ａ）前記羊水胎児ＲＮＡを増幅して増幅された胎児ＲＮＡを得て、そして該増幅された胎児ＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、（ｂ）該羊水胎児ＲＮＡを断片化して、断片化した胎児ＲＮＡを得て、そして該断片化した胎児ＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、（ｃ）該羊水胎児ＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換して胎児ｃＤＮＡを得て、そして該胎児ｃＤＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、または（ｄ）該羊水胎児ＲＮＡを相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）に変換して胎児ｃＲＮＡを得て、そして該胎児ｃＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程
をさらに包含する、項目３２に記載の方法。
（項目４２）
前記検出可能な薬剤が、蛍光標識、比色分析標識、化学発光標識、放射性核種、磁気標識、ハプテン、微粒子、酵素、検出可能な生物学的分子およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記アレイ上に固定された個々の遺伝子プローブに対する前記試験サンプルの個々の核酸セグメントの結合を決定して、結合パターンを得る工程が、以下の工程：
コンピュータ支援画像化システムを用いて、ハイブリダイゼーション後の該アレイの蛍光画像を得る工程；および
コンピュータ支援画像解析システムを用いて、該得られた蛍光画像を分析して、該アレイから画像化されたデータを解釈して、ゲノム遺伝子座に相関するものとして、蛍光強度として結果を表示する工程
を包含する、項目３２に記載の方法。
（項目４４）
キットであって、以下の構成要素：
妊婦から得られた羊水サンプルから無細胞胎児ＲＮＡを抽出するための材料；
複数の遺伝子プローブを含む遺伝子発現アレイであって、各遺伝子プローブは、基板表面上の別個の点に固定化されて該アレイを形成している、アレイ；
異なる在胎齢での、核型および発生に関して正常な雄性胎児および正常な雌性胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルを含むデータベース；
異なる在胎齢での、核型および発生に関して正常な雄性胎児および正常な雌性胎児について確立された発生遺伝子発現パターンを含むデータベース；ならびに
該材料および項目３２に記載のアレイを使用することについての指示書
を備える、キット。
（項目４５）
検出可能な薬剤を用いて核酸サンプルを標識するための材料、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄緩衝液、ＲＮａｓｅインヒビター、キャリアＲＮＡ、およびヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡからなる群のうちの１以上の構成要素をさらに備える、項目４４に記載のキット。
(Summary of the Invention)
The present invention provides the following:
(Item 1)
Isolated amniotic fluid fetal RNA.
(Item 2)
2. Fetal RNA according to item 1, obtained by a process comprising a step of processing an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman, so that fetal RNA present in the amniotic fluid is extracted to obtain amniotic fluid fetal RNA.
(Item 3)
The fetal RNA of item 2, wherein a cell population is removed from the sample prior to processing the amniotic fluid sample.
(Item 4)
Processing the amniotic fluid sample comprises:
Isolating a cell population present in the amniotic fluid;
The fetal RNA according to item 2, comprising a step of culturing the isolated cell as necessary; and a step of extracting fetal RNA from the isolated cell.
(Item 5)
Item 2. The fetal RNA according to item 1, wherein the amniotic fluid fetal RNA is fetal messenger RNA (mRNA).
(Item 6)
A method of prenatal diagnosis, including:
Providing a sample of amniotic fluid fetal RNA;
Analyzing the amniotic fluid fetal RNA to obtain information about fetal RNA; and providing a prenatal diagnosis based on the obtained information.
(Item 7)
The amniotic fluid fetal RNA is obtained by processing an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman, so that fetal RNA present in the amniotic fluid is extracted and made available for analysis, and amniotic fluid fetal RNA is obtained. Item 7. The method according to Item6.
(Item 8)
8. The method of item 7, further comprising the step of removing a cell population from the amniotic fluid sample to obtain remaining amniotic fluid material prior to the treating step.
(Item 9)
The amniotic fluid fetal RNA is:
Removing a cell population from an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman to obtain isolated cells;
Optionally culturing the isolated cells; and processing the isolated cells so that fetal RNA present in the cells is extracted and made available for analysis; Item 7. The method according to Item 6, which is obtained by a step of obtaining fetal RNA.
(Item 10)
Before the analyzing step, the following:
(A) amplifying the amniotic fluid fetal RNA to obtain an amplified fetal RNA, and labeling the amplified fetal RNA as necessary with a detectable agent; (b) the amniotic fluid fetus Fragmenting the RNA to obtain a fragmented fetal RNA and optionally labeling the fragmented fetal RNA with a detectable agent; (c) the amniotic fluid fetal RNA complementary DNA Converting to (cDNA) to obtain fetal cDNA, and optionally labeling the fetal cDNA with a detectable agent, or (d) the amniotic fluid fetal RNA into complementary RNA (cRNA) 7. The method of item 6, further comprising converting to obtain fetal cRNA and optionally labeling the fetal cRNA with a detectable agent.
(Item 11)
The detectable agent is selected from the group consisting of a fluorescent label, a colorimetric label, a chemiluminescent label, a radionuclide, a magnetic label, a hapten, a microparticle, an enzyme, a detectable biological molecule, and any combination thereof. The method according to item 10.
(Item 12)
Analyzing the amniotic fluid fetal RNA includes determining the amount of amniotic fluid fetal RNA, determining the concentration of amniotic fluid fetal RNA, determining the sequence composition of amniotic fluid fetal RNA, and submitting the amniotic fluid fetal RNA to gene analysis 11. The method of item 10, comprising one or more of the steps of: and analyzing the amniotic fluid fetal RNA using an array.
(Item 13)
Information obtained from the step of analyzing the amniotic fluid fetal RNA is derived from the amount of fetal RNA, fetal RNA concentration, fetal RNA sequence composition, qualitative fetal gene expression, quantitative fetal gene expression, and any combination thereof. The method according to item 6, wherein the method is selected from the group consisting of:
(Item 14)
Providing a prenatal diagnosis includes one or more of determining the sex of the fetus, determining the progression of fetal development, and identifying the disease or condition that the fetus is affected by. The method according to item 6.
(Item 15)
Item 7. The method of item 6, wherein the prenatal diagnosis is performed on a fetus suspected of having a disease or condition.
(Item 16)
A method for establishing gene expression in a fetus comprising the following steps:
Providing a test sample of amniotic fluid fetal RNA, wherein the fetal RNA is derived from a sample of amniotic fluid obtained from a pregnant woman, the test sample comprising a plurality of nucleic acid segments labeled with a detectable agent; Comprising a step;
Providing a gene expression array comprising a plurality of gene probes, each gene probe being immobilized on a separate spot on a substrate surface to form the array;
Contacting the array with the test sample under conditions in which the nucleic acid segments in the sample specifically hybridize to the gene probes on the array;
Determining binding of individual nucleic acid segments of the test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern; and gene expression patterns for the fetus based on the resulting binding pattern; Establishing a method.
(Item 17)
17. The method of item 16, further comprising correlating one or more characteristics of the gene expression pattern with fetal gender, or correlating one or more characteristics of the gene expression pattern with gestational age.
(Item 18)
The method of item 16, wherein the fetus is normal with respect to karyotype and development, abnormal with respect to karyotype, abnormal with respect to development, or suffering from a clinical condition.
(Item 19)
Repeating all of the steps for a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from male or female fetuses normal for different gestational age karyotypes and development; and based on the resulting gene expression pattern 17. The method of item 16, further comprising establishing baseline levels of mRNA expression at different gestational ages in male or female fetuses normal for karyotype and development.
(Item 20)
Correlating one or more characteristics of the gene expression pattern with a normal male fetal fetal development time or event with respect to karyotype and development if the analyzed amniotic fluid fetal RNA is derived from a male fetus, or the analyzed Correlating one or more characteristics of said gene expression pattern with the time or event of fetal development of a normal female fetus with respect to karyotype and development, if the amniotic fluid fetal RNA is derived from a female fetus;
The method according to item 16, further comprising:
(Item 21)
Repeating all of the above steps for a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from male or female fetuses normal for different gestational age karyotypes and development;
Correlating one or more characteristics of the resulting gene expression pattern with a time or event of fetal development of a normal male or female fetus with respect to karyotype and development; and based on the correlation, with respect to karyotype and development 17. The method of item 16, further comprising establishing developmental gene expression patterns at different gestational ages for normal male or female fetuses.
(Item 22)
Repeating all of the above steps for a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from fetuses with the same chromosomal abnormality and abnormal karyotype;
Comparing each resulting gene expression pattern to baseline levels of mRNA expression established for normal fetuses for similar gestational age and gender karyotype and development;
Based on the comparison, identifying one or more genes that are abnormally expressed in an abnormal fetus with respect to the karyotype and associated with the chromosomal abnormality; and, if necessary, identified as correlating with a chromosomal abnormality The method of item 16, further comprising the step of creating an inventory of the one or more genes.
(Item 23)
Repeating all of the above steps for a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from developmentally abnormal fetuses having the same developmental disease or condition;
Comparing each resulting gene expression pattern to baseline levels of mRNA expression established for normal fetuses for similar gestational age and gender karyotype and development;
Based on the comparison, identifying one or more genes that are abnormally expressed in a fetus abnormal to the development and associated with the developmental disease or developmental condition; and optionally correlate with the developmental disease or developmental condition The method of item 16, further comprising the step of creating an inventory of the one or more genes identified as.
(Item 24)
Repeating all of the above steps for a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from diseased fetuses suffering from the same clinical condition;
Comparing each resulting gene expression pattern to baseline levels of mRNA expression established for normal fetuses for similar gestational age and gender karyotype and development;
Based on the comparison, identifying one or more genes that are abnormally expressed in the affected fetus and associated with the clinical condition; and optionally, the one or more genes identified as correlated with the clinical condition The method according to item 16, further comprising the step of creating an inventory of genes.
(Item 25)
The amniotic fluid fetal RNA is obtained by processing an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman, so that fetal RNA present in the amniotic fluid is extracted and made available for analysis, and amniotic fluid fetal RNA is obtained. Item 17. The method according to Item16.
(Item 26)
26. The method of item 25, further comprising the step of removing a cell population from the amniotic fluid sample to obtain remaining amniotic fluid material prior to the treating step.
(Item 27)
The amniotic fluid fetal RNA is:
Removing a cell population from an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman to obtain isolated cells;
Optionally culturing the isolated cells; and processing the isolated cells so that fetal RNA present in the cells is extracted and made available for analysis. The method according to item 16, wherein the method is obtained.
(Item 28)
Prior to the contacting step, the following:
(A) amplifying the amniotic fluid fetal RNA to obtain an amplified fetal RNA, and labeling the amplified fetal RNA as necessary with a detectable agent; (b) the amniotic fluid fetus Fragmenting the RNA to obtain a fragmented fetal RNA and optionally labeling the fragmented fetal RNA with a detectable agent; (c) the amniotic fluid fetal RNA complementary DNA Converting to (cDNA) to obtain fetal cDNA, and optionally labeling the fetal cDNA with a detectable agent, or (d) the amniotic fluid fetal RNA into complementary RNA (cRNA) The method of item 16, further comprising the step of converting to obtain fetal cRNA and optionally labeling the fetal cRNA with a detectable agent.
(Item 29)
The detectable agent is selected from the group consisting of a fluorescent label, a colorimetric label, a chemiluminescent label, a radionuclide, a magnetic label, a hapten, a microparticle, an enzyme, a detectable biological molecule, and any combination thereof. 29. The method according to item 28.
(Item 30)
Determining the binding of individual nucleic acid segments of the test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern is generated by the detectable agent in each separate spot on the array The method according to item 16, comprising the step of measuring the intensity of the generated signal.
(Item 31)
Determining the binding of individual nucleic acid segments of the test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern comprises the following steps:
Obtaining a fluorescent image of the array after hybridization using a computer-aided imaging system; and analyzing the obtained fluorescent image using a computer-aided image analysis system and imaging from the array Item 17. The method of item 16, comprising the step of interpreting the data and displaying the result as fluorescence intensity as being correlated to the genomic locus.
(Item 32)
A method of prenatal diagnosis performed by submitting amniotic fluid fetal RNA to an array-based gene expression analysis, the method comprising the following steps:
Providing a test sample of amniotic fluid fetal RNA, wherein the fetal RNA is derived from an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman having a fetus of known gender and gestational age, the test sample being a detectable agent; Comprising a plurality of labeled nucleic acid segments;
Providing a gene expression array comprising a plurality of gene probes, wherein each gene probe is immobilized on a separate spot on a substrate surface to form the array;
Contacting the array with the test sample under conditions in which the nucleic acid segments in the sample specifically hybridize to the gene probes on the array;
Determining the binding of individual nucleic acid segments of the test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern;
Establishing a gene expression pattern for the fetus based on the obtained binding pattern;
Analyzing the gene expression pattern; and providing a prenatal diagnosis based on the analysis.
(Item 33)
The step of analyzing the gene expression pattern includes the following:
Compare the gene expression pattern of the fetus against baseline levels of mRNA expression established for normal fetuses with the same gender and gestational age karyotype and development, or the same gender and gestational age nuclei 33. A method according to item 32 comprising comparing against a developmental gene expression pattern established for a normal fetus with respect to type and development.
(Item 34)
33. The method of item 32, wherein the step of analyzing the gene expression pattern includes a step of detecting one or more abnormally expressed genes.
(Item 35)
35. The method of item 34, wherein the one or more genes that are abnormally expressed are associated with chromosomal abnormalities, developmental abnormalities and / or clinical conditions.
(Item 36)
33. The method of item 32, wherein providing a prenatal diagnosis comprises determining progression of the development of the fetus and / or identifying a disease or condition that the fetus is afflicted with.
(Item 37)
Item 32. The fetus is suspected of having a disease or condition selected from the group consisting of a disease or condition associated with a chromosomal abnormality, a disease or condition associated with a developmental abnormality, a clinical condition, and any combination thereof. The method described.
(Item 38)
The amniotic fluid fetal RNA is obtained by processing an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman, so that fetal RNA present in the amniotic fluid is extracted and made available for analysis, and amniotic fluid fetal RNA is obtained. 33. A method according to item 32.
(Item 39)
40. The method of item 38, further comprising the step of removing a population of cells from the amniotic fluid sample to obtain the remaining amniotic fluid material prior to the step of processing.
(Item 40)
The amniotic fluid fetal RNA is:
Removing a cell population from an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman to obtain isolated cells;
Culturing the isolated cells as required; and processing the isolated cells so that fetal RNA present in the cells is extracted and made available for analysis. The method according to item 32, wherein:
(Item 41)
Before the analyzing step, the following:
(A) amplifying the amniotic fluid fetal RNA to obtain an amplified fetal RNA, and labeling the amplified fetal RNA as necessary with a detectable agent; (b) the amniotic fluid fetus Fragmenting the RNA to obtain a fragmented fetal RNA and optionally labeling the fragmented fetal RNA with a detectable agent; (c) the amniotic fluid fetal RNA complementary DNA Converting to (cDNA) to obtain fetal cDNA, and optionally labeling the fetal cDNA with a detectable agent, or (d) the amniotic fluid fetal RNA into complementary RNA (cRNA) 33. The method of item 32, further comprising converting to obtain fetal cRNA and optionally labeling the fetal cRNA with a detectable agent.
(Item 42)
The detectable agent is selected from the group consisting of a fluorescent label, a colorimetric label, a chemiluminescent label, a radionuclide, a magnetic label, a hapten, a microparticle, an enzyme, a detectable biological molecule, and any combination thereof. 42. The method according to item 41.
(Item 43)
Determining the binding of individual nucleic acid segments of the test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern comprises the following steps:
Obtaining a fluorescent image of the array after hybridization using a computer-aided imaging system; and analyzing the obtained fluorescent image using a computer-aided image analysis system and imaging from the array 33. A method according to item 32 comprising the step of interpreting the data and displaying the result as fluorescence intensity as correlated with the genomic locus.
(Item 44)
Kit with the following components:
Materials for extracting cell-free fetal RNA from amniotic fluid samples obtained from pregnant women;
A gene expression array comprising a plurality of gene probes, wherein each gene probe is immobilized at a separate point on a substrate surface to form the array;
A database containing baseline levels of mRNA expression established for normal and normal female fetuses for karyotype and development at different gestational ages;
A database containing developmental gene expression patterns established for normal male fetuses and normal female fetuses for karyotype and development at different gestational ages; and instructions for using the material and the array of item 32 A kit comprising:
(Item 45)
One or more components of the group consisting of a material for labeling the nucleic acid sample with a detectable agent, a hybridization buffer, a wash buffer, an RNase inhibitor, a carrier RNA, and human Cot-1 DNA 45. A kit according to item 44.
本発明は、出生前の診断、モニタリング、スクリーニングおよび／または試験のための、改善された方法を提供する。本発明は、羊水が、無細胞胎児ＲＮＡの豊富な供給源であるという発見に、少なくとも部分的に基づく。胎児ＲＮＡの単離および分析の方法が記載され、これらの方法は、他の技術によっては利用可能ではない、胎児遺伝子発現に関する情報をもたらし得る。本発明のシステムは、生存ヒト胎児の健康、成長および発育のより包括的な決定、ならびに種々の疾患および状態の出生前の診断を可能にする。 The present invention provides improved methods for prenatal diagnosis, monitoring, screening and / or testing. The present invention is based at least in part on the discovery that amniotic fluid is a rich source of cell-free fetal RNA. Methods for isolation and analysis of fetal RNA are described, and these methods can provide information about fetal gene expression that is not available by other techniques. The system of the present invention allows for a more comprehensive determination of the health, growth and development of live human fetuses and prenatal diagnosis of various diseases and conditions.
本発明は、生存ヒト胎児における遺伝子発現を評価するためのシステムを提供する。このシステムは、発生事象と相関する遺伝子発現パターンを規定するために使用され得、そして胎児の健康、成長、および発生の評価、ならびに種々の疾患および状態の出生前診断を可能にする。他の技術は、生存ヒト胎児における遺伝子発現パターンを決定するのに利用可能ではない。 The present invention provides a system for assessing gene expression in a living human fetus. This system can be used to define gene expression patterns that correlate with developmental events and allow for assessment of fetal health, growth, and development, and prenatal diagnosis of various diseases and conditions. Other techniques are not available for determining gene expression patterns in living human fetuses.
一般に、本発明は、羊水のサンプルから胎児ＲＮＡを単離する工程、およびその得られた胎児ＲＮＡを分析する工程を包含する。好ましい実施形態において、その分析は、胎児遺伝子発現についての定性的情報または定量的情報を提供する。特定の実施形態において、胎児ＲＮＡは、妊娠期間中の複数の時点で単離される。本発明は、特定の遺伝子発現パターン、またはそのようなパターンの要素を発現事象と相関させることを可能にし、そしてさらに、観察された遺伝子発現パターンまたは成分を、そのような相関が確立されたパターンまたは成分と比較することを可能にする。 In general, the invention includes isolating fetal RNA from a sample of amniotic fluid and analyzing the resulting fetal RNA. In preferred embodiments, the analysis provides qualitative or quantitative information about fetal gene expression. In certain embodiments, fetal RNA is isolated at multiple time points during pregnancy. The present invention makes it possible to correlate a specific gene expression pattern, or an element of such a pattern, with an expression event, and further to observe the observed gene expression pattern or component in such a pattern of established correlation Or allow comparison with ingredients.
１つの局面において、本発明は、羊水のサンプルから単離された胎児ＲＮＡを提供する。好ましくは、単離された胎児ＲＮＡは、以下：
妊婦から得られた羊水のサンプルを処理し、その結果、その羊水のサンプル中に存在する胎児ＲＮＡを抽出し、羊水胎児ＲＮＡを生じる工程
によって得られる。
In one aspect, the present invention provides fetal RNA isolated from a sample of amniotic fluid. Preferably, the isolated fetal RNA is:
It is obtained by processing a sample of amniotic fluid obtained from a pregnant woman, so that fetal RNA present in the sample of amniotic fluid is extracted to produce amniotic fluid fetal RNA.
特定の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡは、羊水のサンプルから実質的にすべての細胞集団を除去した後に抽出され；そして本質的に、無細胞胎児ＲＮＡからなる。他の実施形態において、いくつかの細胞集団が、上記処理工程の前に羊水のサンプルから除去され、残存羊膜物質が生じる。残存羊膜物質のサンプルから抽出された場合、胎児ＲＮＡは、無細胞胎児ＲＮＡならびにその残存物質中に依然として存在する細胞に由来する胎児ＲＮＡを含む。さらに他の実施形態において、胎児ＲＮＡは、羊水のサンプルから単離された胎児細胞から抽出され；必要に応じて、その単離された細胞は、ＲＮＡ抽出の前に培養される。そのような場合において、羊水胎児ＲＮＡは、本質的に、その培養された細胞に由来する胎児ＲＮＡからなる。 In certain embodiments, amniotic fluid fetal RNA is extracted after removing substantially all cell populations from the amniotic fluid sample; and consists essentially of cell-free fetal RNA. In other embodiments, some cell populations are removed from the amniotic fluid sample prior to the treatment step, resulting in residual amniotic material. When extracted from a sample of residual amniotic material, fetal RNA includes cell-free fetal RNA as well as fetal RNA derived from cells still present in the residual material. In still other embodiments, fetal RNA is extracted from fetal cells isolated from a sample of amniotic fluid; optionally, the isolated cells are cultured prior to RNA extraction. In such cases, amniotic fluid fetal RNA consists essentially of fetal RNA derived from the cultured cells.
好ましくは、細胞集団は、羊水のサンプルを得る工程の２時間以内に取り出され；より好ましくは、細胞は、羊水のサンプルを得る工程の直後に取り出される。 Preferably, the cell population is removed within 2 hours of obtaining the amniotic fluid sample; more preferably, the cells are removed immediately after obtaining the amniotic fluid sample.
特定の実施形態において、ＲＮａｓｅインヒビターが、羊水のサンプルまたは残存羊膜物質に添加され、次いで、羊水または残存羊膜物質のサンプルは、凍結され、そしてある一定期間の間適切な保存条件下で（例えば、−８０℃で）保管される。好ましくは、羊水または残存羊膜物質のサンプルが凍結される場合、ＲＮａｓｅインヒビターがサンプルを得る工程の２時間以内に添加される。より好ましくは、ＲＮａｓｅインヒビターは、羊水のサンプルを得る工程の直後に添加される。 In certain embodiments, an RNase inhibitor is added to the amniotic fluid sample or residual amniotic material, and then the amniotic fluid or residual amniotic material sample is frozen and subjected to appropriate storage conditions for a period of time (eg, Stored at −80 ° C. Preferably, when a sample of amniotic fluid or residual amniotic material is frozen, an RNase inhibitor is added within 2 hours of the step of obtaining the sample. More preferably, the RNase inhibitor is added immediately after obtaining the amniotic fluid sample.
特定の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡは、例えば、１以上の胎児配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅され、増幅された胎児ＲＮＡを生じる。特定の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。他の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡは、逆転写酵素によって相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換され、胎児ｃＤＮＡを生じる。さらに他の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡは、ｃＤＮＡに転換され、これは、順に、転写によって相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）に転換され、胎児ｃＲＮＡを生じる。 In certain embodiments, amniotic fluid fetal RNA is amplified using, for example, one or more fetal sequence specific oligonucleotides, resulting in amplified fetal RNA. In certain embodiments, the amniotic fluid fetal RNA is messenger RNA (mRNA). In other embodiments, amniotic fluid fetal RNA is converted to complementary DNA (cDNA) by reverse transcriptase to produce fetal cDNA. In still other embodiments, amniotic fluid fetal RNA is converted to cDNA, which in turn is converted to complementary RNA (cRNA) by transcription, resulting in fetal cRNA.
別の局面において、本発明は、出生前診断の方法を提供し、これは、以下の工程：
羊水胎児ＲＮＡのサンプルを提供する工程；
その羊水ＲＮＡを分析して、そのＲＮＡに関する情報を得る工程；および
その得られた情報に基づいて、出生前診断を提供する工程
を包含する。好ましくは、羊水胎児ＲＮＡは、以下：
妊婦から得られた羊水のサンプルを処理し、その結果、その羊水中に存在する胎児ＲＮＡを抽出し、そして分析に利用可能にし、羊水胎児ＲＮＡを生じる工程
によって得られる。
In another aspect, the present invention provides a method of prenatal diagnosis, which comprises the following steps:
Providing a sample of amniotic fluid fetal RNA;
Analyzing the amniotic fluid RNA to obtain information about the RNA; and providing a prenatal diagnosis based on the obtained information. Preferably, the amniotic fluid fetal RNA is:
It is obtained by processing a sample of amniotic fluid obtained from a pregnant woman so that fetal RNA present in the amniotic fluid is extracted and made available for analysis, resulting in amniotic fluid fetal RNA.
特定の実施形態において、羊水のサンプルが処理される場合（凍結され保管される場合とは対照的に）、実質的にすべての細胞集団が、羊水のサンプルから除去され、そして抽出された羊水胎児ＲＮＡは、本質的に無細胞胎児ＲＮＡからなる。他の実施形態において、いくつかの細胞集団が、羊膜物質から除去されて、残存羊膜物質が得られる。そのような場合において、その残存物質は、依然としていくつかの細胞を含み、抽出された羊水胎児ＲＮＡは、無細胞胎児ＲＮＡならびに残存羊膜物質中に存在する細胞に由来するＲＮＡを含む。さらに他の実施形態において、胎児ＲＮＡは、羊水のサンプルから単離された細胞集団から抽出される。必要に応じて、その単離された細胞は、ＲＮＡ抽出前に培養される。好ましくは、細胞集団は、２時間以内に取り出される。より好ましくは、細胞集団は、羊水のサンプルを得る工程の直後に取り出される。 In certain embodiments, when the amniotic fluid sample is processed (as opposed to frozen and stored), substantially all cell populations are removed from the amniotic fluid sample and extracted amniotic fluid fetus RNA consists essentially of cell-free fetal RNA. In other embodiments, some cell populations are removed from the amniotic material to obtain residual amniotic material. In such a case, the residual material still contains some cells, and the extracted amniotic fluid fetal RNA includes cell-free fetal RNA as well as RNA derived from cells present in the residual amniotic material. In yet other embodiments, fetal RNA is extracted from a cell population isolated from a sample of amniotic fluid. If necessary, the isolated cells are cultured prior to RNA extraction. Preferably, the cell population is removed within 2 hours. More preferably, the cell population is removed immediately after obtaining the amniotic fluid sample.
特定の実施形態において、ＲＮａｓｅインヒビターが、羊水または残存羊膜物質のサンプルに添加され、次いで、そのサンプルは凍結され、ある一定期間の間、適切な保存条件下で（例えば、−８０℃で）保管される。分析時に、その凍結されたサンプルが解凍され、あらゆる残存細胞集団が、処理前に除去され得る。好ましくは、羊水または残存羊膜物質のサンプルが凍結される場合、ＲＮａｓｅインヒビターがサンプルを得る工程の２時間以内に添加され；より好ましくは、羊水サンプルを得る工程の直後に添加される。 In certain embodiments, an RNase inhibitor is added to a sample of amniotic fluid or residual amniotic material, and the sample is then frozen and stored under appropriate storage conditions (eg, at −80 ° C.) for a period of time. Is done. Upon analysis, the frozen sample is thawed and any remaining cell population can be removed prior to processing. Preferably, when a sample of amniotic fluid or residual amniotic material is frozen, an RNase inhibitor is added within 2 hours of obtaining the sample; more preferably, immediately after obtaining the amniotic fluid sample.
本発明の方法の特定の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡは、分析される前に、例えば、１以上の胎児配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅される。他の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。なお他の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡは、分析の前に、逆転写酵素によって相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換される。さらに他の実施形態において、分析の前に、抽出された羊水胎児ＲＮＡは、ｃＤＮＡに転換され、これは、順に、転写によって相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）に転換される。 In certain embodiments of the methods of the invention, amniotic fluid fetal RNA is amplified, for example, using one or more fetal sequence specific oligonucleotides before being analyzed. In other embodiments, the amniotic fluid fetal RNA is mRNA. In still other embodiments, amniotic fluid fetal RNA is converted to complementary DNA (cDNA) by reverse transcriptase prior to analysis. In yet other embodiments, prior to analysis, the extracted amniotic fluid fetal RNA is converted to cDNA, which in turn is converted to complementary RNA (cRNA) by transcription.
特定の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡは、（例えば、増幅または転写後に）分析する工程の前に検出可能な物質で標識される。検出可能な物質は、蛍光標識、比色標識、化学発光標識、放射性核種、磁気標識、ハプテン、微粒子、酵素、検出可能な生体分子、およびそれらの任意の組み合わせを含み得る。適切な蛍光標識は、蛍光色素（例えば、Ｃｙ−３ＴＭ、Ｃｙ−５ＴＭ、テキサスレッド、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、ローダミン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、ＢＯＤＩＰＹ色素）、ならびにこれらの化合物の等価物、アナログ、誘導体および組み合わせを含む。適切なハプテンとしては、例えば、ビオチンおよびジオキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）が挙げられる。 In certain embodiments, the amniotic fluid fetal RNA is labeled with a detectable substance prior to the analyzing step (eg, after amplification or transcription). The detectable substance can include fluorescent labels, colorimetric labels, chemiluminescent labels, radionuclides, magnetic labels, haptens, microparticles, enzymes, detectable biomolecules, and any combination thereof. Suitable fluorescent labels are fluorescent dyes (eg, Cy-3 ™ , Cy-5 ™ , Texas Red, FITC, phycoerythrin, rhodamine, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, carbocyanine, merocyanine, styryl dye, oxonol dye, BODIPY dye) And equivalents, analogs, derivatives and combinations of these compounds. Suitable haptens include, for example, biotin and dioxygenin.
本発明の出生前診断の方法の特定の実施形態において、抽出された羊水胎児ＲＮＡは、分析される前にフラグメント化される。 In certain embodiments of the prenatal diagnostic methods of the invention, the extracted amniotic fluid fetal RNA is fragmented before being analyzed.
特定の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡを分析する工程は、胎児ＲＮＡの量を決定することを包含する。他の実施形態において、抽出された羊水胎児ＲＮＡを分析する工程は、胎児ＲＮＡの濃度を決定することを包含する。さらに他の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡを分析する工程は、胎児ＲＮＡの配列組成を決定することを包含する。なお他の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡを分析する工程は、抽出された胎児ＲＮＡを遺伝子分析（例えば、遺伝子発現分析）に提供することを包含する。 In certain embodiments, the step of analyzing amniotic fluid fetal RNA comprises determining the amount of fetal RNA. In other embodiments, the step of analyzing the extracted amniotic fluid fetal RNA includes determining the concentration of fetal RNA. In still other embodiments, analyzing the amniotic fluid fetal RNA includes determining the sequence composition of the fetal RNA. In yet other embodiments, the step of analyzing amniotic fluid fetal RNA includes providing the extracted fetal RNA for gene analysis (eg, gene expression analysis).
特定の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡを分析する工程は、アレイ（例えば、ｃＤＮＡアレイ、オリゴヌクレオチドアレイ、ＳＮＰアレイまたは遺伝子発現アレイ）を用いることを包含する。 In certain embodiments, analyzing amniotic fluid fetal RNA includes using an array (eg, a cDNA array, an oligonucleotide array, a SNP array, or a gene expression array).
羊水胎児ＲＮＡの分析は、胎児ＲＮＡの量、濃度、または配列組成に関する情報、あるいは遺伝子発現についての定性的情報および／または定量的情報をもたらし得る。本発明の方法において、羊水胎児ＲＮＡの分析によって得られる情報は、出生前診断を提供するために使用される。特定の実施形態において、出生前診断を提供することは、胎児の性別を決定することを含む。他の実施形態において、出生前診断を提供することは、胎児の発生の進行を評価することを含む。さらに他の実施形態において、出生前診断を提供することは、胎児が罹患している疾患または状態を同定することを含む。 Analysis of amniotic fluid fetal RNA can provide information on the amount, concentration, or sequence composition of fetal RNA, or qualitative and / or quantitative information on gene expression. In the method of the present invention, information obtained by analysis of amniotic fluid fetal RNA is used to provide a prenatal diagnosis. In certain embodiments, providing a prenatal diagnosis includes determining the sex of the fetus. In other embodiments, providing a prenatal diagnosis includes assessing the progression of fetal development. In yet other embodiments, providing a prenatal diagnosis includes identifying a disease or condition that affects the fetus.
本発明の出生前診断の方法は、胎児が疾患または状態を有すると疑われる場合に実施され得る。本発明の方法は、任意の年齢の妊婦に対して行われ得る。特定の実施形態において、本発明の方法は、妊婦が３５歳であるかまたは３５歳よりも高齢である場合に行われる。 The method of prenatal diagnosis of the present invention can be performed when a fetus is suspected of having a disease or condition. The method of the present invention can be performed on pregnant women of any age. In certain embodiments, the methods of the invention are performed when the pregnant woman is 35 years of age or older than 35 years.
別の局面において、本発明は、胎児における遺伝子発現を確立するための方法を提供する。本発明の方法は、以下の工程：
羊水胎児ＲＮＡの試験サンプルを提供する工程であって、その試験サンプルは、検出可能な物質で標識された複数の核酸セグメントを含む、工程；
複数の遺伝子プローブを含む遺伝子発現アレイを提供する工程であって、各遺伝子プローブは、アレイを形成するための基板表面上の別個のスポットに固定化されている、工程；
そのアレイを、サンプル中の核酸セグメントがそのアレイ上の遺伝子プローブに特異的にハイブリダイズする条件下で、試験サンプルに接触させる工程；
そのアレイ上に固定化された個々の遺伝子プローブに対する、試験サンプルの個々の核酸セグメントの結合を決定して、結合パターンを得る工程；ならびに
その得られた結合パターンに基づいて、その胎児についての遺伝子発現パターンを確立する工程
を包含する。
In another aspect, the present invention provides a method for establishing gene expression in a fetus. The method of the present invention comprises the following steps:
Providing a test sample of amniotic fluid fetal RNA, the test sample comprising a plurality of nucleic acid segments labeled with a detectable substance;
Providing a gene expression array comprising a plurality of gene probes, each gene probe being immobilized in a separate spot on a substrate surface to form an array;
Contacting the array with a test sample under conditions such that nucleic acid segments in the sample specifically hybridize to gene probes on the array;
Determining the binding of individual nucleic acid segments of the test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern; as well as genes for the fetus based on the resulting binding pattern Including establishing an expression pattern.
特定の実施形態において、本発明の方法は、以下：
得られた遺伝子発現パターンのうちの１以上の特徴を、胎児の性別および／または在胎齢と相関させる工程
をさらに包含する。
In certain embodiments, the method of the invention comprises the following:
Further comprising correlating one or more characteristics of the resulting gene expression pattern with fetal sex and / or gestational age.
特定の実施形態において、胎児は、核型分析的かつ発生的に正常である。他の実施形態において、胎児は、核型分析的に異常である。なお他の実施形態において、胎児は、発生的に異常である。さらに他の実施形態において、胎児は、臨床的状態に罹患している。 In certain embodiments, the fetus is karyotypically and developmentally normal. In other embodiments, the fetus is karyotypically abnormal. In still other embodiments, the fetus is developmentally abnormal. In yet other embodiments, the fetus suffers from a clinical condition.
特定の実施形態において、本発明の方法は、以下：
様々な在胎齢の核型分析的かつ発生的に正常な男性（または女性）胎児に由来する統計学的に有意な数の羊水胎児ＲＮＡサンプルについて、すべての工程を繰り返す工程；および
その得られた遺伝子発現パターンに基づいて、核型分析的かつ発生的に正常な男性（または女性）胎児における様々な在胎齢でのｍＲＮＡ発現のベースラインレベルを確立する工程
をさらに包含する。
In certain embodiments, the method of the invention comprises the following:
Repeating all steps for a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from karyotypically and developmentally normal male (or female) fetuses of various gestational ages; and obtained Further comprising establishing baseline levels of mRNA expression at various gestational ages in karyotypically and developmentally normal male (or female) fetuses based on gene expression patterns.
他の実施形態において、本発明の方法は、以下：
遺伝子発現パターンのうちの１以上の特徴を、分析された羊水胎児ＲＮＡが男性胎児に由来する場合には核型分析的かつ発生的に正常な男性胎児の胎児発生における時間または事象と、あるいは分析された羊水胎児ＲＮＡが女性胎児に由来する場合には核型分析的かつ発生的に正常な女性胎児の胎児発生における時間または事象と相関させる工程
をさらに包含する。
In another embodiment, the method of the invention comprises the following:
Analyzing one or more characteristics of the gene expression pattern with time or event in fetal development of a karyotypically and developmentally normal male fetus if the analyzed amniotic fluid fetal RNA is derived from a male fetus, or If the amniotic fluid fetal RNA is derived from a female fetus, the method further includes correlating with a time or event in fetal development of a karyotypically and developmentally normal female fetus.
なお他の実施形態において、本発明の方法は、以下：
様々な在胎齢の核型分析的かつ発生的に正常な男性（または女性）胎児に由来する統計学的に有意な数の羊水胎児ＲＮＡサンプルについて、すべての工程を繰り返す工程；
得られた遺伝子発現パターンのうちの１以上の特徴を、核型分析的かつ発生的に正常な男性（または女性）胎児の胎児発生における時間または事象と相関させる工程；および
その相関に基づいて、様々な在胎齢における核型分析的かつ発生的に正常な男性（または女性）胎児についての発生遺伝子発現パターンを確立する工程
をさらに包含する。
In still other embodiments, the method of the invention comprises the following:
Repeating all steps on a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from karyotypically and developmentally normal male (or female) fetuses of various gestational ages;
Correlating one or more characteristics of the resulting gene expression pattern with time or events in fetal development of a karyotypically and developmentally normal male (or female) fetus; and based on the correlation, It further includes establishing developmental gene expression patterns for karyotypically and developmentally normal male (or female) fetuses at various gestational ages.
さらに他の実施形態において、本発明の方法は、以下：
同一の染色体異常を有する核型分析的に異常な胎児に由来する統計学的に有意な数の羊水胎児ＲＮＡサンプルについて、すべての工程を繰り返す工程；
得られた各遺伝子発現パターンを、類似の在胎齢および性別の核型分析的かつ発生的に正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルと比較する工程；および
その比較に基づいて、核型分析的に異常な胎児において異常に発現され、かつ染色体異常に関連する１以上の遺伝子を同定する工程
をさらに包含する。好ましくは、異常に発現された１以上の遺伝子は、次いで、染色体異常に応じてカタログに掲載される。
In yet another embodiment, the method of the invention comprises the following:
Repeating all steps on a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from karyotypically abnormal fetuses with identical chromosomal abnormalities;
Comparing each resulting gene expression pattern with a baseline level of mRNA expression established for a similar gestational age and gender karyotypically and developmentally normal fetus; and based on the comparison, The method further includes the step of identifying one or more genes that are abnormally expressed in a type-analytical fetus and that are associated with a chromosomal abnormality. Preferably, the one or more genes that are abnormally expressed are then listed in a catalog according to the chromosomal abnormality.
染色体異常は、個々の染色体の余剰、個々の染色体の不足、染色体の余剰部分、染色体の不足部分、切断、環、付加、欠失、転座、逆位、重複、およびこれらの任意の組み合わせであり得る。特定の実施形態において、染色体異常は、疾患または状態に関連する。その疾患または状態は、例えば、ダウン症候群、パトー症候群、エドワーズ症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群およびＸＹＹ病のような異数性であり得る。染色体異常に関連する疾患または状態は、Ｘ連鎖障害であり得る。あるいは、染色体異常に関連する疾患または状態は、微小欠失／微小重複症候群であり得る。 A chromosomal abnormality is an individual chromosome surplus, an individual chromosome deficiency, a chromosome extra portion, a chromosome deficiency, a break, a ring, an addition, a deletion, a translocation, an inversion, a duplication, and any combination thereof possible. In certain embodiments, the chromosomal abnormality is associated with a disease or condition. The disease or condition can be aneuploid, such as, for example, Down syndrome, Pateau syndrome, Edwards syndrome, Turner syndrome, Kleinfelter syndrome and XYY disease. The disease or condition associated with the chromosomal abnormality can be an X-linked disorder. Alternatively, the disease or condition associated with a chromosomal abnormality can be a microdeletion / microduplication syndrome.
特定の実施形態において、本発明の方法は、以下：
同一の発生疾患または状態を有する発生的に異常な胎児に由来する統計学的に有意な数の羊水胎児ＲＮＡサンプルについて、すべての工程を繰り返す工程；
得られた各遺伝子発現パターンを、類似の在胎齢および性別の核型分析的かつ発生的に正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルと比較する工程；ならびに
その比較に基づいて、発生的に異常な胎児において異常に発現され、かつ発生疾患または状態に関連する１以上の遺伝子を同定する工程
をさらに包含する。好ましくは、異常に発現された１以上の遺伝子は、次いで、発生疾患または状態に応じてカタログに掲載される。
In certain embodiments, the method of the invention comprises the following:
Repeating all steps on a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples derived from developmentally abnormal fetuses having the same developmental disease or condition;
Comparing each resulting gene expression pattern to a baseline level of mRNA expression established for a similar gestational age and gender karyotypically and developmentally normal fetus; and based on the comparison Further comprising the step of identifying one or more genes that are abnormally expressed in a genetically abnormal fetus and associated with a developmental disease or condition. Preferably, the one or more genes that are abnormally expressed are then listed in a catalog depending on the developing disease or condition.
そのＲＮＡが本発明の方法によって分析され得る胎児が罹患している発生疾患または状態は、子宮内成長制限、羊水過多、双胎間輸血（ＴＴＴ）症候群、肺の血液沈滞、羊水過少、糖尿病の母親の乳児（ｉｎｆａｎｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｏｔｈｅｒ）、内反足、羊膜帯、二分脊椎、先天性横隔膜ヘルニア、および腎形成異常であり得る。 Developmental diseases or conditions affecting fetuses whose RNA can be analyzed by the methods of the present invention include intrauterine growth restriction, hyperamniotic fluid, twin-to-twin transfusion (TTT) syndrome, pulmonary blood stagnation, amniotic fluid deficiency, diabetes It can be an infant of diabetic mother, clubfoot, amniotic band, spina bifida, congenital diaphragmatic hernia, and renal dysplasia.
他の実施形態において、本発明の方法は、以下の工程：
同一の臨床状態に罹患した罹患胎児に由来する統計学的に有意な数の羊水胎児ＲＮＡサンプルについて、すべての工程を繰り返す工程；
得られた各遺伝子発現パターンを、類似の在胎齢および性別の核型分析的かつ発生的に正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルと比較する工程；ならびに
その比較に基づいて、罹患胎児において異常に発現され、かつその臨床状態に関連する１以上の遺伝子を同定する工程
をさらに包含する。好ましくは、異常に発現された１以上の遺伝子は、次いで、臨床状態に応じてカタログに掲載される。
In another embodiment, the method of the present invention comprises the following steps:
Repeating all steps on a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from affected fetuses suffering from the same clinical condition;
Comparing each obtained gene expression pattern with a baseline level of mRNA expression established for a similar gestational age and gender karyotypically and developmentally normal fetus; and based on the comparison, The method further includes identifying one or more genes that are abnormally expressed in the fetus and associated with the clinical condition. Preferably, the one or more genes that are abnormally expressed are then listed in a catalog depending on the clinical condition.
罹患胎児が罹患している臨床状態は、ウイルス感染、細菌感染もしくは寄生虫感染、早産、または子癇前症であり得る。 The clinical condition in which the affected fetus is affected can be a viral infection, a bacterial or parasitic infection, preterm birth, or preeclampsia.
上記のように、本発明の方法において使用される羊水胎児ＲＮＡは、本質的に、無細胞胎児ＲＮＡからなり得；羊水のサンプル中に存在する細胞に由来する胎児ＲＮＡをさらに含んでも、本質的に、羊水のサンプルから単離された培養細胞に由来する胎児ＲＮＡからなってもよい。上記のように、羊水胎児ＲＮＡは、羊水または残存羊膜物質の凍結サンプルから抽出され得る。 As noted above, the amniotic fluid fetal RNA used in the methods of the present invention may consist essentially of cell-free fetal RNA; Or fetal RNA derived from cultured cells isolated from amniotic fluid samples. As described above, amniotic fluid fetal RNA can be extracted from a frozen sample of amniotic fluid or residual amniotic material.
胎児の遺伝子発現パターンを確立するための本発明の方法において使用される羊水胎児ＲＮＡは、上記のように増幅、転写、標識および／またはフラグメント化され得る。 Amniotic fluid fetal RNA used in the methods of the present invention for establishing fetal gene expression patterns can be amplified, transcribed, labeled and / or fragmented as described above.
特定の実施形態において、試験サンプルの核酸中に存在する高コピー数の反復配列のハイブリダイゼーション能が抑制される。例えば、反復配列のハイブリダイゼーション能は、接触工程の前に、試験サンプルに非標識ブロッキング核酸を添加することによって抑制される。好ましくは、過剰の非標識ブロッキング核酸が添加される。特定の実施形態において、非標識ブロッキング核酸は、ヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡである。 In certain embodiments, the hybridization capacity of high copy number repetitive sequences present in the nucleic acid of the test sample is suppressed. For example, the hybridization ability of repetitive sequences is suppressed by adding unlabeled blocking nucleic acid to the test sample prior to the contacting step. Preferably, excess unlabeled blocking nucleic acid is added. In certain embodiments, the unlabeled blocking nucleic acid is human Cot-1 DNA.
特定の実施形態において、アレイ上に固定化された個々の遺伝子プローブに対する試験サンプルの個々の核酸セグメントの結合を決定して結合パターンを得る工程は、アレイ上の各別個のスポットにおいて検出可能な物質によって生成されるシグナルの強度を測定することを包含する。 In certain embodiments, determining the binding of individual nucleic acid segments of a test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern comprises detecting substances in each separate spot on the array Measuring the intensity of the signal produced by.
他の好ましい実施形態において、アレイ上に固定化された個々の遺伝子プローブに対する試験サンプルの個々の核酸セグメントの結合を決定して結合パターンを得る工程は、以下のこと：
コンピュータ支援画像化システムを用いて、ハイブリダイゼーション後のアレイの蛍光画像を得ること；および
コンピュータ支援画像分析システムを用いて、得られた蛍光画像を分析し、アレイから画像化されたデータを解釈し、そして結果をゲノム遺伝子座に応じて蛍光強度で表示すること
を包含する。
In another preferred embodiment, determining the binding of individual nucleic acid segments of the test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern comprises the following:
Using a computer-aided imaging system to obtain a fluorescent image of the array after hybridization; and using a computer-aided image analysis system to analyze the resulting fluorescent image and interpret the imaged data from the array And displaying the results as fluorescence intensity depending on the genomic locus.
別の局面において、本発明は、羊水胎児ＲＮＡをアレイベースの遺伝子発現分析に提供することによって実施される、出生前診断の方法を提供する。本発明の方法は、以下の工程：
羊水胎児ＲＮＡの試験サンプルを提供する工程であって、ここで、その胎児ＲＮＡは、既知の性別および在胎齢の胎児を有する妊婦から得られた羊水のサンプルに由来し、その試験サンプルは、検出可能な物質で標識された複数の核酸セグメントを含む、工程；
複数の遺伝子プローブを含む遺伝子発現アレイを提供する工程であって、ここで、各遺伝子プローブは、アレイを形成するための基板表面上の別個のスポットに固定化されている、工程；
そのアレイを、そのサンプル中の核酸セグメントがそのアレイ上の遺伝子プローブに特異的にハイブリダイズする条件下で、羊水胎児ＲＮＡの試験サンプルと接触させる工程；
そのアレイ上に固定化された個々の遺伝子プローブに対する試験サンプルの個々の核酸セグメントの結合を決定して、結合パターンを得る工程；
その得られた結合パターンに基づいて、その胎児についての遺伝子発現パターンを確立する工程；
その遺伝子発現パターンを分析する工程；ならびに
その遺伝子発現パターンの分析に基づいて、出生前診断を提供する工程
を包含する。
In another aspect, the present invention provides a method of prenatal diagnosis performed by providing amniotic fluid fetal RNA for array-based gene expression analysis. The method of the present invention comprises the following steps:
Providing a test sample of amniotic fluid fetal RNA, wherein the fetal RNA is derived from a sample of amniotic fluid obtained from a pregnant woman with a known sex and gestational age fetus, the test sample being detected Comprising a plurality of nucleic acid segments labeled with possible substances;
Providing a gene expression array comprising a plurality of gene probes, wherein each gene probe is immobilized in a separate spot on a substrate surface to form an array;
Contacting the array with a test sample of amniotic fluid fetal RNA under conditions in which nucleic acid segments in the sample specifically hybridize to gene probes on the array;
Determining the binding of individual nucleic acid segments of the test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern;
Establishing a gene expression pattern for the fetus based on the resulting binding pattern;
Analyzing the gene expression pattern; and providing a prenatal diagnosis based on the analysis of the gene expression pattern.
特定の実施形態において、遺伝子発現パターンを分析する工程は、その胎児の遺伝子発現パターンを、同一の性別および在胎齢の核型分析的におよび発生的に正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルと比較することを包含する。他の実施形態において、遺伝子発現パターンを分析する工程は、その胎児の遺伝子発現パターンを、同一の性別および在胎齢の核型分析的におよび発生的に正常な胎児について確立された発生的遺伝子発現パターンと比較することを包含する。さらに他の実施形態において、遺伝子発現パターンを分析する工程は、異常に発現された１以上の遺伝子を検出および／または同定することを包含する。異常に発現された１以上の遺伝子は、染色体異常、発生状態または別の型の臨床状態もしくは疾患に関連し得る。 In certain embodiments, the step of analyzing the gene expression pattern comprises determining the fetal gene expression pattern based on the mRNA expression established for karyotypically and developmentally normal fetuses of the same gender and gestational age. Includes comparing to line level. In another embodiment, the step of analyzing the gene expression pattern comprises determining the fetal gene expression pattern from the same gender and gestational age karyotypically and developmental gene expression established for a developmentally normal fetus. Includes comparing with patterns. In still other embodiments, analyzing the gene expression pattern comprises detecting and / or identifying one or more genes that are abnormally expressed. The one or more genes that are abnormally expressed may be associated with a chromosomal abnormality, developmental condition, or another type of clinical condition or disease.
本発明の方法に従って出生前診断を提供することは、胎児の発生の進行を決定する工程、および／または胎児が罹患している疾患または状態を同定する工程を包含し得る。 Providing a prenatal diagnosis according to the methods of the present invention may include determining the progression of fetal development and / or identifying the disease or condition in which the fetus is affected.
本発明の方法は、任意の年齢の妊婦で行われ得る。特定の実施形態において、本発明の方法は、妊婦が３５歳であるかまたは３５歳よりも高齢である場合に行われる。他の実施形態において、本発明の方法は、胎児が疾患または状態（例えば、染色体異常、発生異常または別の臨床的障害に関連する疾患または状態）を有することが疑われる場合に行われる。 The method of the present invention can be performed on pregnant women of any age. In certain embodiments, the methods of the invention are performed when the pregnant woman is 35 years of age or older than 35 years. In other embodiments, the methods of the invention are performed when a fetus is suspected of having a disease or condition (eg, a disease or condition associated with a chromosomal abnormality, developmental abnormality or another clinical disorder).
特定の実施形態において、胎児の年齢は、Ｇバンド分析、中期比較ゲノムハイブリダイゼーション、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションまたはスペクトル核型分析によって確立された、胎児の核型の分析によって決定される。他の実施形態において、在胎齢は、超音波試験によって決定されている。 In certain embodiments, the age of the fetus is determined by analysis of fetal karyotype, established by G-band analysis, mid-term comparative genomic hybridization, fluorescence in situ hybridization or spectral karyotype analysis. In other embodiments, gestational age is determined by ultrasound testing.
本発明の方法の実施において、羊水胎児ＲＮＡは、上記のように単離、増幅、転写、標識、フラグメント化、保存および／またはハイブリダイズされ得る。同様に、アレイ上に固定化された遺伝子プローブに対する、羊水胎児ＲＮＡの試験サンプルの核酸セグメントの結合の検出が、上記のように決定され得る。 In practicing the methods of the present invention, amniotic fluid fetal RNA can be isolated, amplified, transcribed, labeled, fragmented, stored and / or hybridized as described above. Similarly, detection of binding of a nucleic acid segment of a test sample of amniotic fluid fetal RNA to a gene probe immobilized on an array can be determined as described above.
別の局面において、本発明は、以下の構成要素のうちのいくつかまたはすべてを含むキットを提供する：妊婦から得られた羊水のサンプルから無細胞胎児ＲＮＡを抽出するための物質；複数の遺伝子プローブを含む遺伝子発現アレイであって、ここで、各遺伝子プローブは、アレイを形成するための基板表面上の別個のスポットに固定化されている、遺伝子発現アレイ；様々な在胎齢での核型分析的および発生的に正常な男性胎児、および正常な女性胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルを含むデータベース；様々な在胎齢での核型分析的および発生的に正常な男性胎児、および正常な女性胎児について確立された発生遺伝子発現パターンを含むデータベースであって、ここで、その発生遺伝子発現パターンのうちの１以上の特徴が、胎児発生における時間または事象に関連する、データベース；ならびに本発明の方法に従ってその抽出物質、アレイおよびデータベースを使用するための指示書。 In another aspect, the present invention provides a kit comprising some or all of the following components: a substance for extracting cell-free fetal RNA from a sample of amniotic fluid obtained from a pregnant woman; a plurality of genes A gene expression array comprising probes, wherein each gene probe is immobilized in a separate spot on a substrate surface to form an array; a gene expression array; karyotypes at various gestational ages A database containing baseline levels of mRNA expression established for analytical and developmentally normal male fetuses and normal female fetuses; karyotypically and developmentally normal male fetuses at various gestational ages; and A database containing developmental gene expression patterns established for normal female fetuses, wherein one of the developmental gene expression patterns The above features are related to time or event in fetal development, database; instructions for using the extracted substances, arrays and database according to the method of and the present invention.
本発明のキットはまた、核酸のサンプルを検出可能な物質で（例えば、Ｃｙ−３ＴＭ、Ｃｙ−５ＴＭ、テキサスレッド、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、ローダミン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素（ｓｔｙｒｙｌ ｄｙｅ）、オキソノール色素、ＢＯＤＩＰＹ色素のような蛍光色素、これらの化合物の等価物、アナログ、誘導体および組み合わせでか、あるいは例えば、ビオチン／アビジン系のようなハプテンで）標識するための物質を含み得る。 The kit of the present invention is also capable of detecting a sample of nucleic acid (eg, Cy-3 ™ , Cy-5 ™ , Texas Red, FITC, phycoerythrin, rhodamine, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, carbocyanine, merocyanine, styryl. Substances for labeling with dyes such as steryl dyes, oxonol dyes, fluorescent dyes such as BODIPY dyes, equivalents, analogs, derivatives and combinations of these compounds or with haptens such as, for example, biotin / avidin systems Can be included.
本発明のキットはまた、個々の容器中に、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液、ＲＮａｓｅインヒビター、キャリアＲＮＡおよび／またはヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡを含み得る。 The kits of the invention can also include hybridization and wash buffers, RNase inhibitors, carrier RNA and / or human Cot-1 DNA in individual containers.
本発明の他の局面、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および特定の実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示のみのために示されることが理解されるべきである。 Other aspects, features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description. However, it should be understood that the detailed description and specific examples, while indicating preferred embodiments of the invention, are given for purposes of illustration only.
（定義）
他のように述べられない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の用語は、他のように特定されない限りは、それらの用語に帰する意味を有する。
(Definition)
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by a person skilled in the art to which this invention belongs. The following terms have the meaning ascribed to them unless specified otherwise.
本明細書中で使用される場合、用語「出生前診断」とは、胎児の健康および状態の決定（欠損または異常の検出、ならびに疾患の診断を包含する）を指す。種々の非侵襲性技術および侵襲性技術が、出生前診断のために利用可能である。それらの技術の各々は、最高の利用性のために、妊娠の特定の期間の間にのみ使用され得る。これらの技術としては、例えば、超音波検査法、母系血清スクリーニング、羊水穿刺、および慢性絨毛サンプリング（すなわちＣＶＳ）が挙げられる。本発明の出生前診断方法は、羊水から単離した胎児ＲＮＡの分析を包含する。 As used herein, the term “prenatal diagnosis” refers to the determination of fetal health and condition, including detection of defects or abnormalities, and diagnosis of disease. A variety of non-invasive and invasive techniques are available for prenatal diagnosis. Each of these techniques can only be used during a specific period of pregnancy for maximum availability. These techniques include, for example, ultrasonography, maternal serum screening, amniocentesis, and chronic villus sampling (ie, CVS). The prenatal diagnostic method of the present invention involves the analysis of fetal RNA isolated from amniotic fluid.
用語「音波検査」、「超音波（ｕｌｔｒａｓｏｎｏｇｒａｐｈｉｃ）検査」、および「超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）検査」は、本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、高周波数の音波を使用して、胎児の種々の組織および器官により生成されるエコーパターンから可視画像を作製する、臨床的非侵襲性手順を指す。超音波検査は、胎児の大きさおよび／または位置、胎盤の大きさおよび／または位置、羊水の量、胎児の解剖学的構造の状況、および／または胎児の年齢（すなわち、在胎齢）を決定するために使用され得る。超音波検査はまた、先天的異常（すなわち、出生時に存在する解剖学的異常または構造的異常）の存在または発生的異常の存在を明らかにし得る。 The terms “sonic examination”, “ultrasonic examination”, and “ultrasonic examination” are used interchangeably herein. These terms refer to clinical non-invasive procedures that use high frequency sound waves to create visible images from echo patterns generated by various tissues and organs of the fetus. Ultrasound determines the size and / or location of the fetus, the size and / or location of the placenta, the amount of amniotic fluid, the status of the fetal anatomy, and / or the age of the fetus (ie, gestational age) Can be used to Ultrasonography can also reveal the presence of congenital abnormalities (ie, anatomical or structural abnormalities present at birth) or the presence of developmental abnormalities.
用語「羊水穿刺」とは、本明細書中で使用される場合、針を誘導するために超音波を使用して母体の下腹部を通して子宮の内側の羊水腔中へと長い針を挿入すること、そして診断目的のために羊水穿刺を実施する場合には少量の羊水を回収すること、または治療目的のために羊水穿刺を実施する場合には大量の羊水を回収することによって実施される、出生前試験を指す。羊水は、胎児に由来する皮膚、腎臓、および肺の細胞を含み得る。従来の羊水穿刺において、これらの細胞は、培養中で増殖され、そしてその核型の決定および分析によって染色体異常について試験され、その羊水自体は、生化学的異常について試験され得る。本出願人により発見されたように（下記参照）、羊水はまた、無細胞胎児核酸を含む。 The term “amniotic puncture” as used herein refers to the insertion of a long needle through the maternal lower abdomen into the amniotic fluid space inside the uterus using ultrasound to guide the needle. And by collecting a small amount of amniotic fluid when performing amniocentesis for diagnostic purposes, or by collecting a large amount of amniotic fluid when performing amniocentesis for therapeutic purposes. Refers to pretest. Amniotic fluid may contain skin, kidney, and lung cells from the fetus. In conventional amniocentesis, these cells are grown in culture and tested for chromosomal abnormalities by determination and analysis of their karyotype, and the amniotic fluid itself can be tested for biochemical abnormalities. As discovered by the applicant (see below), amniotic fluid also contains acellular fetal nucleic acid.
用語「核酸」および「核酸分子」は、本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかであるデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、他のように言及されない限りは、天然に存在するヌクレオチドと類似する様式で機能し得る天然ヌクレオチドの公知アナログを包含する。これらの用語は、合成骨格を有する核酸様構造物および人工生成物を包含する。 The terms “nucleic acid” and “nucleic acid molecule” are used interchangeably herein. These terms refer to deoxyribonucleotide polymers or ribonucleotide polymers that are in either single-stranded or double-stranded form and function in a manner similar to naturally occurring nucleotides unless otherwise stated. To obtain known analogs of natural nucleotides. These terms include nucleic acid-like structures and artificial products that have a synthetic backbone.
用語「単離された」とは、胎児ＲＮＡに適用される場合には、その起源もしくは操作によって天然で関連する成分のうちの少なくともいくつかから分離している、ＲＮＡの分子またはその一部を意味する。あるいは、またはさらに、「単離された」によって、目的のＲＮＡ分子が人工的に生成または合成されていることが意味される。 The term “isolated” when applied to fetal RNA refers to a molecule of RNA or a portion thereof that has been separated from at least some of its naturally associated components by its origin or manipulation. means. Alternatively or additionally, by “isolated” is meant that the RNA molecule of interest has been artificially produced or synthesized.
用語「分析のために利用可能になった」とは、本明細書中では、羊水の胎児ＲＮＡが操作（例えば、増幅、転写、標識、断片化、精製、および／または濃縮され、可溶性水溶液中に再懸濁）されて、そのＲＮＡが分析のために適切な形態になることを特定するために使用される。 The term “made available for analysis” as used herein refers to amniotic fluid fetal RNA that has been manipulated (eg, amplified, transcribed, labeled, fragmented, purified, and / or concentrated in a soluble aqueous solution). And is used to identify that the RNA is in a suitable form for analysis.
本明細書中で使用される場合、用語「羊水の胎児ＲＮＡ」とは、羊水サンプル中において見出されるＲＮＡの配列と同一であるかまたは相補的である配列を有する、胎児起源のＲＮＡ分子を指す。この用語は、羊水から抽出されたＲＮＡに由来する、胎児の全ＲＮＡ，ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡを包含する。 As used herein, the term “amniotic fluid fetal RNA” refers to an RNA molecule of fetal origin having a sequence that is identical or complementary to the sequence of RNA found in an amniotic fluid sample. . The term encompasses fetal total RNA, mRNA, cDNA and cRNA derived from RNA extracted from amniotic fluid.
用語「メッセンジャーＲＮＡまたはｍＲＮＡ」とは、タンパク質性合成を指示するためのテンプレートとして役立つ形態のＲＮＡを指す。代表的には、任意の特定の型のｍＲＮＡ（すなわち、同じ配列を有し、同じ遺伝子に由来する）の量は、遺伝子が「発現された」程度を反映する。 The term “messenger RNA or mRNA” refers to a form of RNA that serves as a template for directing proteinaceous synthesis. Typically, the amount of any particular type of mRNA (ie, having the same sequence and derived from the same gene) reflects the degree to which the gene has been “expressed”.
用語「遺伝子発現」とは、遺伝子中にコードされる指示からＲＮＡおよびタンパク質が生成されるプロセスを指す。遺伝子発現の変化は、細胞、組織、器官、または生物全体の機能を変化させ得、時には、特定の遺伝子に関連する観察可能な特徴を生じ得る。遺伝子発現のモニタリングは、個々の遺伝子、関連する遺伝子の群、相互関連する生化学経路、および全体としての生物学的ネットワークを試験するために、使用され得る。 The term “gene expression” refers to the process by which RNA and proteins are generated from instructions encoded in a gene. Changes in gene expression can change the function of cells, tissues, organs, or entire organisms, and sometimes can produce observable characteristics associated with a particular gene. Gene expression monitoring can be used to test individual genes, groups of related genes, interrelated biochemical pathways, and biological networks as a whole.
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」とは、高分子生成物（これは、ＲＮＡまたはタンパク質であり得る）を特定するゲノムの一部を指し、そしてコード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）およびコード配列の後にある調節配列（３’非コード配列）を含み得る。 As used herein, the term “gene” refers to a portion of the genome that identifies a macromolecular product, which can be RNA or protein, and a regulatory sequence preceding the coding sequence. (5 ′ non-coding sequence) and regulatory sequences after the coding sequence (3 ′ non-coding sequence).
用語「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列の転写から生じる生成物を指す。そのＲＮＡ転写物が、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒される転写の本来の非改変生成物である場合には、そのＲＮＡ転写物は、一次転写物と呼ばれる。プロセシング（例えば、スプライシングなど）されたＲＮＡ転写物は、その一次転写物とは配列が異なる。完全にプロセシングされた転写物は、「成熟」ＲＮＡと呼ばれる。用語「転写」とは、遺伝子のＤＮＡ配列をＲＮＡ生成物へとコピーするプロセスを指し、このプロセスは、一般的には、そのＤＮＡをテンプレートとしてＤＮＡ特異的ＲＮＡポリメラーゼによって実行される。タンパク質へと翻訳されるプロセシング後のＲＮＡ転写物は、しばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる。 The term “RNA transcript” refers to the product resulting from transcription of a DNA sequence. If the RNA transcript is the original unmodified product of transcription catalyzed by RNA polymerase, the RNA transcript is referred to as the primary transcript. Processed (eg, spliced) RNA transcripts differ in sequence from their primary transcripts. A fully processed transcript is referred to as “mature” RNA. The term “transcription” refers to the process of copying the DNA sequence of a gene into an RNA product, which is generally performed by a DNA-specific RNA polymerase using the DNA as a template. The processed RNA transcript that is translated into protein is often referred to as messenger RNA (mRNA).
用語「相補的ＤＮＡまたはｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補的であるＤＮＡ分子を指す。ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）によってか、または指向的化学合成によって、生成され得る。用語「相補的」とは、標準的ワトソン−クリック相補規則に従って塩基対形成するか、または比較的ストリンジェントな条件下で特定の核酸セグメントにハイブリダイズ可能である、核酸配列を指す。核酸ポリマーは、その配列全体のほんの一部だけにわたって、必要に応じて相補的である。 The term “complementary DNA or cDNA” refers to a DNA molecule that is complementary to mRNA. cDNA can be produced by DNA polymerase (eg, reverse transcriptase) or by directed chemical synthesis. The term “complementary” refers to a nucleic acid sequence that is base-paired according to standard Watson-Crick complementarity rules or that is capable of hybridizing to a particular nucleic acid segment under relatively stringent conditions. The nucleic acid polymer is optionally complementary over only a fraction of its entire sequence.
用語「アレイ」、「マイクロアレイ」、および「バイオチップ」は、本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、既知配列の複数の核酸分子を、基材表面上に配列することを指す。各核酸分子は、その基材表面上に「別個のスポット」（すなわち、規定された位置または割り当てられた位置）に固定される。用語「マイクロアレイ」は、より具体的には、視覚的評価のために顕微鏡試験を必要とするように小型化されているアレイを指す。本発明の方法において使用されるアレイは、好ましくは、マイクロアレイである。 The terms “array”, “microarray”, and “biochip” are used interchangeably herein. These terms refer to arranging a plurality of nucleic acid molecules of known sequence on a substrate surface. Each nucleic acid molecule is immobilized on a “discrete spot” (ie, a defined or assigned position) on its substrate surface. The term “microarray” more specifically refers to an array that is miniaturized to require microscopic examination for visual evaluation. The array used in the method of the present invention is preferably a microarray.
用語「遺伝子発現アレイ」とは、ｍＲＮＡ発現レベルの定量のために使用され得る基材表面上に固定された複数の遺伝子プローブを含むアレイを指す。本発明の文脈において、用語「アレイベースの遺伝子発現分析」は、遺伝子発現アレイを使用する遺伝子発現分析の方法を指すために使用される。用語「遺伝子プローブ」とは、本明細書中で使用される場合、そのゲノムの規定された領域中にその起源を有し、短いＤＮＡ配列（もしくはオリゴヌクレオチド）でも、ＰＣＲ生成物でも、またはｍＲＮＡ単離物でもあり得る、既知配列の核酸分子を指す。遺伝子プローブは、羊水の胎児ＲＮＡの試験サンプルに由来する核酸フラグメントがハイブリダイズされる、遺伝子特異的ＤＮＡ配列である。遺伝子プローブは、１種以上の型の化学結合（通常は、水素結合形成）を介して、相補的配列または実質的に相補的な配列の核酸に、特異的に結合（または特異的にハイブリダイズ）する。 The term “gene expression array” refers to an array comprising a plurality of gene probes immobilized on a substrate surface that can be used for quantification of mRNA expression levels. In the context of the present invention, the term “array-based gene expression analysis” is used to refer to a method of gene expression analysis using a gene expression array. The term “gene probe” as used herein has its origin in a defined region of its genome and is either a short DNA sequence (or oligonucleotide), a PCR product, or mRNA. Refers to a nucleic acid molecule of known sequence that can also be an isolate. A gene probe is a gene-specific DNA sequence to which a nucleic acid fragment derived from a test sample of amniotic fluid fetal RNA is hybridized. A gene probe specifically binds (or specifically hybridizes) to a complementary or substantially complementary nucleic acid through one or more types of chemical bonds (usually hydrogen bond formation). )
用語「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書中で使用される場合、ハイブリダイズプローブまたは核酸分子アレイのエレメントとして使用される、通常は短いＤＮＡ列またはＲＮＡ列を指す。これらの短い配列の連なりは、しばしば化学合成される。そのオリゴヌクレオチドの大きさは、そのオリゴヌクレオチドの機能または用途に依存する。ハイブリダイゼーションのためのマイクロアレイにおいて使用される場合、オリゴヌクレオチドは、天然核酸分子または合成核酸分子を包含し得、そしてｍＲＮＡに対して相補的な、約５個と約１５０個との間、好ましくは約１５個と約１００個との間、より好ましくは約１５個と約３０個との間、最も好ましくは約１８個と約２５個との間のヌクレオチドを含み得る。 The term “oligonucleotide” as used herein refers to a normally short DNA or RNA sequence used as an element of a hybridizing probe or nucleic acid molecule array. These short sequences of sequences are often chemically synthesized. The size of the oligonucleotide depends on the function or use of the oligonucleotide. When used in microarrays for hybridization, oligonucleotides can include natural or synthetic nucleic acid molecules and are complementary to mRNA, preferably between about 5 and about 150, preferably It may comprise between about 15 and about 100, more preferably between about 15 and about 30, most preferably between about 18 and about 25 nucleotides.
用語「遺伝子部位」、「遺伝子座」および「ゲノム座」は、本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、ゲノムの特定の領域を指す。本発明の方法において、アレイ上の別個のスポットに固定された各遺伝子プローブは、特定のゲノム座に対して特異的（または特徴的）である配列を有する。 The terms “gene site”, “locus” and “genomic locus” are used interchangeably herein. These terms refer to specific regions of the genome. In the methods of the invention, each gene probe immobilized on a separate spot on the array has a sequence that is specific (or characteristic) for a particular genomic locus.
用語「ハイブリダイゼーション」とは、相補的塩基対形成を介する２つの一本鎖核酸の結合を指す。用語「特異的ハイブリダイゼーション」（または「特異的にハイブリダイズする）および「特異的結合」（または「特異的に結合する）は、本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、核酸分子が、ストリンジェントな条件下（例えば、ハイブリダイズする鎖に対する相補性の程度がより低い、競合核酸の存在下）で特定の核酸配列に優先的に結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズするプロセスを指す。本発明の特定の実施形態において、これらの用語は、より具体的には、試験サンプルに由来する核酸フラグメント（またはセグメント）が、アレイ上に固定された特定の遺伝子プローブに優先的に結合し、そして他のアレイ状遺伝子プローブにはより低い程度でしか結合しないかまたは全く結合しない、プロセスを指す。 The term “hybridization” refers to the binding of two single stranded nucleic acids via complementary base pairing. The terms “specific hybridization” (or “specifically hybridizes”) and “specific binding” (or “specifically binds”) are used interchangeably herein. A nucleic acid molecule that preferentially binds, duplexes, or hybridizes to a specific nucleic acid sequence under stringent conditions (eg, less complementary to the hybridizing strand, in the presence of a competing nucleic acid). In certain embodiments of the present invention, these terms more specifically refer to nucleic acid fragments (or segments) derived from a test sample to specific gene probes immobilized on the array. Refers to processes that bind preferentially and bind to other arrayed gene probes to a lesser extent or not at all.
用語「遺伝子発現パターン」および「遺伝子発現プロフィール」は、本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、個々の遺伝子の発現または個々の遺伝子の組の発現を指す。遺伝子発現パターンは、サンプル中の標的転写物の存在および標的転写物の相対量レベルまたは絶対量レベルに関する情報を包含し得る。さらに、またはあるいは、遺伝子発現パターンは、出生前処理が特定の遺伝子発現を誘導する能力に関する情報、または出生前処置が特定の遺伝子群の発現を異なるレベルに変化させる能力に関する情報を包含し得る。 The terms “gene expression pattern” and “gene expression profile” are used interchangeably herein. These terms refer to the expression of individual genes or the expression of individual gene sets. The gene expression pattern can include information regarding the presence of the target transcript in the sample and the relative or absolute amount level of the target transcript. Additionally or alternatively, the gene expression pattern may include information regarding the ability of prenatal treatment to induce specific gene expression, or information regarding the ability of prenatal treatment to alter the expression of specific gene groups to different levels.
用語「核型的および発生的に正常な胎児」は、その核型が正常であると決定され（すなわち、染色体異常を含まない核型）、その発生が在胎齢について適切であることが（例えば、超音波検査によって）決定されている、胎児を示すために本明細書中で使用される。 The term “karyotypically and developmentally normal fetus” is determined that the karyotype is normal (ie, a karyotype that does not contain chromosomal abnormalities) and that the development is appropriate for gestational age (eg, Used herein to indicate a fetus that has been determined (by ultrasonography).
本明細書中で使用される場合、用語「核型」とは、通常は有糸***中期における染色体の数および形態によって規定される、個体の特定の染色体の相補体を指す。より具体的には、核型は、全染色体数、個々の染色体型のコピー数（例えば、染色体Ｙのコピー数）、および染色体の形態（例えば、長さ、セントロメア指標、連結性など）のような情報を含む。核型の検査によって、染色体の異常（例えば、余剰な染色体、欠失している染色体、または破壊されている染色体）の検出および同定が可能である。特定の疾患および状態は、特徴的染色体異常に関連するので、核型の分析は、通常は、いくつかの疾患および状態の診断を可能にする。 As used herein, the term “karyotype” refers to the complement of a particular chromosome of an individual, usually defined by the number and morphology of the chromosomes in metaphase. More specifically, the karyotype is such as the total number of chromosomes, the copy number of each individual chromosome type (eg, the copy number of chromosome Y), and the morphology of the chromosome (eg, length, centromere index, connectivity, etc.) Information. A karyotype test can detect and identify chromosomal abnormalities (eg, extra chromosomes, missing chromosomes, or destroyed chromosomes). Because certain diseases and conditions are associated with characteristic chromosomal abnormalities, karyotype analysis usually allows diagnosis of several diseases and conditions.
用語「染色体」は、本明細書中では、その分野で理解される意味を有する。この用語は、生物の遺伝情報のほとんどを保有する非常に長いＤＮＡ分子（および関連するタンパク質）から構成される構造物を指す。染色体は、「遺伝子」と呼ばれる機能的単位に分割される。その遺伝子の各々は、特定のタンパク質またはＲＮＡ分子を生成するための遺伝子コード（すなわち、指示）を含む。ヒトにおいて、正常な体細胞は、４６個の染色体を含み、正常な生殖細胞は、２３個の染色体を含む。 The term “chromosome” has the meaning understood in the art herein. The term refers to a structure composed of very long DNA molecules (and related proteins) that carry most of the genetic information of an organism. Chromosomes are divided into functional units called “genes”. Each of the genes includes a genetic code (ie, instructions) for generating a particular protein or RNA molecule. In humans, normal somatic cells contain 46 chromosomes and normal germ cells contain 23 chromosomes.
用語「染色体異常（ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ）」、「染色体異常（ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）」および「染色体変化」は、本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、核型的に正常な個体における染色体数および構造的組成と比較した、染色体数の差異（すなわち、変動）、または１つ以上の染色体の構造組成の差異（すなわち、改変）を指す。本明細書中で使用される場合、これらの用語はまた、遺伝子レベルで生じる異常を包含する。異常な数の（すなわち、多すぎるかまたは少なすぎる）染色体の存在は、「異数性」と呼ばれる。異数性の齢は、２１トリソミーおよび１３トリソミーである。構造的染色体異常としては、欠失（例えば、遺伝子配列中に通常は存在する１つ以上のヌクレオチドが存在しないこと、遺伝子全体が存在しないこと、または染色体の部分が失われること）、付加（例えば、遺伝子配列中に通常は存在しない１つ以上のヌクレオチドが存在すること、余分なコピーの遺伝子が存在すること（これは重複とも呼ばれる）、または染色体の余分な部分が存在すること）、環、切断、および染色体再配列が挙げられる。染色体再配列は、転位または逆位であり得る。転位は、遺伝物質がある遺伝子から別の遺伝子へと伝達されるプロセスから生じる。転位は、２つの染色体が遺伝物質を損失することなく片を交換する場合に平衡するが、平衡していない転位は、染色体が遺伝物質を獲得または喪失する場合に生じる。転位は、２つの染色体または１つだけの染色体に関与し得る。逆位は、染色体中で２つの破損が生じて破損したセグメントが１８０°回転するプロセスによって生成され、それらの遺伝子が逆の順番で再配置される。 The terms “chromosomal abnormality”, “chromosomal aberration” and “chromosomal alteration” are used interchangeably herein. These terms refer to differences in the number of chromosomes (ie, variation) or differences in the structural composition of one or more chromosomes (ie, alterations) compared to the number and structural composition of chromosomes in a karyotypically normal individual. Point to. As used herein, these terms also encompass abnormalities that occur at the genetic level. The presence of an abnormal number of chromosomes (ie, too many or too few) is called “aneuploidy”. Aneuploid ages are trisomy 21 and trisomy 13. Structural chromosomal abnormalities include deletions (eg, the absence of one or more nucleotides normally present in a gene sequence, the absence of the entire gene, or the loss of part of a chromosome), additions (eg, The presence of one or more nucleotides that are not normally present in the gene sequence, the presence of an extra copy of the gene (this is also referred to as duplication), or the presence of an extra portion of the chromosome), the ring, Cutting, and chromosomal rearrangements. Chromosomal rearrangements can be transpositions or inversions. A translocation results from a process in which genetic material is transferred from one gene to another. A translocation is balanced when two chromosomes exchange pieces without loss of genetic material, but an unbalanced translocation occurs when a chromosome gains or loses genetic material. A translocation may involve two chromosomes or only one chromosome. The inversion is generated by a process in which two breaks occur in the chromosome and the broken segment rotates 180 °, and the genes are rearranged in the reverse order.
本明細書中で使用される場合、用語「微小欠失」および「微小重複」とは、検出され得ないかまたは標準的細胞遺伝学的方法（例えば、従来のＧバンディング分析または中期比較ゲノムハイブリダイゼーション）によって容易には検出されない、微妙な、隠れている、または小さい、染色体異常（例えば、遺伝子配列中の１つ以上のヌクレオチドに関与するか、または一遺伝子コピーの喪失もしくは獲得に関与する）を指す。 As used herein, the terms “microdeletion” and “microduplication” refer to undetectable or standard cytogenetic methods (eg, conventional G-banding analysis or mid-term comparative genomic highs). Subtle, hidden, or small chromosomal abnormalities that are not easily detected by hybridization (eg, involved in one or more nucleotides in a gene sequence, or involved in the loss or gain of a gene copy) Point to.
本明細書中で使用される場合、用語「染色体異常に関連する疾患または状態」とは、染色体異常によって引き起こされることが公知であるかまたはそのように予期される、任意の疾患、障害、状態、または欠損を指す。染色体異常に関連する例示的な疾患または状態としては、トリソミー（ダウン症候群、エドワーズ症候群、パトー症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、およびＸＹＹ症候群）、Ｘ連鎖障害（例えば、デュシェーヌ筋ジストロフィー、血友病Ａ、特定の形態の重症複合型免疫不全、レッシュ−ナイハン症候群、および脆弱Ｘ染色体）、ならびに微小欠失／微小重複症候群（例えば、プラーダー−ヴィリ症候群、アンジェルマン（Ａｎｇｅｌｍａｎ）症候群、ディ・ジョージ症候群、スミス−マジェニス（Ｍａｇｅｎｉｓ）症候群、ルビンスタイン−テービ症候群、ミラー−ディーカー（Ｄｉｅｋｅｒ）症候群、ウィリアムズ症候群、およびシャルコー−マリー−ツース症候群）が挙げられるが、これらに限定されない。染色体異常に関連する疾患または状態のさらなる例は、「Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」Ｗｉｌｓｏｎら編，１９９１（第１２版）Ｍｃ Ｇｒａｗ Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．２４〜４６において見出され得る。 As used herein, the term “disease or condition associated with a chromosomal abnormality” is any disease, disorder, condition known or expected to be caused by a chromosomal abnormality. Or refers to a defect. Exemplary diseases or conditions associated with chromosomal abnormalities include trisomy (Down syndrome, Edwards syndrome, Patau syndrome, Turner syndrome, Klinefelter syndrome, and XYY syndrome), X-linked disorders (eg, Duchenne muscular dystrophy, hemophilia A , Certain forms of severe combined immunodeficiency, Lesch-Nyhan syndrome, and fragile X chromosome), and microdeletion / microduplication syndromes (eg, Prader-Villi syndrome, Angelman syndrome, Di George syndrome, Smith-Magenis syndrome, Rubinstein-Thebi syndrome, Miller-Dieker syndrome, Williams syndrome, and Charcot-Marie-Tooth syndrome). Additional examples of diseases or conditions associated with chromosomal abnormalities can be found in “Harrison's Principles of Internal Medicine”, edited by Wilson et al., 1991 (12th edition) Mc Graw Hill: New York, NY, pp. 199 Can be found in 24-46.
本明細書中で使用される場合、用語「Ｇバンディングまたはギームザバンディング」とは、核型決定するための標準的な染色技術を指す。Ｇバンディング（Ｇ−Ｔ−Ｇバンディングとしても公知）は、染色体に関連するタンパク質のうちのいくらかを分解する酵素（プロテアーゼであるトリプシン）の使用、およびグアニンおよびシトシンが豊富なＤＮＡ領域に選択的に結合する染色色素（ギームザ）の使用を含む。この選択的染色は、染色体の長さに沿って交互に暗いバンドと明るいバンドという明瞭なパターンの形成をもたらす。これは、個々の染色体の特徴である（明るいバンドは、グアニンおよびシトシンが豊富な活性ＤＮＡであるユークロマチンに対応する。暗いバンドは、アデニンおよびチミンが豊富な非発現ＤＮＡであるヘテロクロマチンに対応する）。この染色によって、余分な染色体および欠失している染色体、大きな欠失および重複、ならびにセントロメア（染色体中の主要な狭窄部）の位置が明らかになる。しかし、遺伝物質のより広汎ではない再配列もしくはより複雑な再配列、マーカーの染色体起点、および微妙な転位は、検出されないか、または標準的Ｇバンディング（ギムーザ、リーシュマン、または改変形）を使用して確実に同定するのが困難である。Ｇバンディング分析を実施する方法に関するより詳細については、例えば、Ｊ．Ｍ．Ｓｃｈｅｒｅら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９８２，６１：８〜１１；およびＫ．Ｗａｋｕｉら、Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９９９，４４：８５〜９０を参照のこと。 As used herein, the term “G banding or Geem the banding” refers to standard staining techniques for karyotyping. G-banding (also known as G-T-G banding) is selective for the use of enzymes that break down some of the proteins associated with the chromosome (trypsin, a protease), and DNA regions rich in guanine and cytosine. Including the use of binding dyes (Giemsa). This selective staining results in the formation of a distinct pattern of alternating dark and light bands along the length of the chromosome. This is characteristic of individual chromosomes (bright bands correspond to euchromatin, an active DNA rich in guanine and cytosine. Dark bands correspond to heterochromatin, a non-expressed DNA rich in adenine and thymine. To do). This staining reveals extra and missing chromosomes, large deletions and duplications, and the location of the centromere (major constriction in the chromosome). However, less extensive or more complex rearrangements of genetic material, chromosomal origins of markers, and subtle transpositions are not detected or use standard G-banding (Gimuza, Leishman, or modified) Thus, it is difficult to reliably identify. For more details on how to perform G-banding analysis, see, for example, J. Org. M.M. Schere et al., Hum. Genet. 1982, 61: 8-11; Wakui et al. Hum. Genet. 1999, 44: 85-90.
本明細書中で使用される場合、「蛍光インサイチュハイブリダイゼーションまたはＦＩＳＨ」とは、核型を生成するために使用され得る分子細胞遺伝学技術を指す。ＦＩＳＨ実験において、特別に設計された蛍光分子が、蛍光顕微鏡により特定の遺伝子または染色体部分を可視化するために使用され、それにより染色体異常の検出を可能にする（例えば、Ｔ．Ｂｒｙｎｄｏｒｆら、Ａｃｔａ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，２０００，７９：８〜１４；Ｗ．Ｃｈｅｏｎｇ Ｌｅｕｎｇら、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．２００１，２１：３２７〜３３２；Ｊ．Ｐｅｐｐｅｒｂｅｒｇら、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．２００１，２１：２９３〜３０１；Ｓ．Ｗｅｒｅｍｏｗｉｃｚら、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．，２００１，２１：２６２〜２６９；およびＲ．ｓａｗａら、Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．Ｒｅｓ．２００１，２７：４１〜４７を参照のこと）。 As used herein, “fluorescence in situ hybridization or FISH” refers to molecular cytogenetic techniques that can be used to generate karyotypes. In FISH experiments, specially designed fluorescent molecules are used to visualize specific genes or chromosomal parts by fluorescence microscopy, thereby allowing detection of chromosomal abnormalities (see, for example, T. Bryndorf et al. Acta. Obstet.Gynecol.Scan., 2000, 79: 8-14; W. Cheong Leung et al., Prenat. Diagnostic. 2001, 21: 327-332; J. Pepperberg et al., Prenat. S. Weremowicz et al., Prenat. Diagn., 2001, 21: 262-269; and R. sawa et al., J. Obstet. Gyneecol. Res. 2001, 27: 41-47).
本明細書中で使用される場合、用語「スペクトル核型決定またはＳＫＹ」とは、異なる色ですべての染色体の同時可視化を可能にする分子細胞遺伝学技術であり、核型分析をかなり容易にする。ＳＫＹは、スペクトル的に区別可能な蛍光色素で標識された短い一本鎖ＤＮＡ配列のライブラリーの調製を含む。このＤＮＡライブラリー中の個々のプローブ各々は、染色体の独特の領域に対して相補的であり、そのプローブすべては、ゲノム中の染色体すべてに対して相補的なＤＮＡの集合体から構成されている。インサイチュハイブリダイゼーションの後、スペクトル画像化による規定の発光スペクトルの測定によって、異なる色でヒト染色体すべてを明瞭に識別し、染色体異常（例えば、転位、染色体破砕点、および再配列）を検出することが可能になる。ＳＫＹ技術および核型を確立する際のその使用についてのさらなる詳細については、例えば、Ｅ．Ｓｈｒｏｃｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７，１０１：２５５〜２６２；Ｉ．Ｂ．Ｖａｎ ｄｅｎ ＶｅｙｖｅｒおよびＢ．Ｂ．Ｒｏａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９９８，１０：９７〜１０３；Ｍ．Ｃ．Ｐｈｅｌａｎら、Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎ，１９９８，１８：１１７４〜１１８０；Ｂ．Ｒ．Ｈａｄｄａｄら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８，１０３：６１９〜６２５；ならびにＢ．Ｐｅｓｃｈｋａら、Ｐｒｅｎａｔａｌ．Ｄｉａｇｎ．１９９９，１９：１１４３〜１１４９を参照のこと。 As used herein, the term “spectral karyotyping or SKY” is a molecular cytogenetic technique that allows the simultaneous visualization of all chromosomes in different colors, making karyotyping analysis much easier. To do. SKY involves the preparation of a library of short single-stranded DNA sequences labeled with a spectrally distinguishable fluorescent dye. Each individual probe in the DNA library is complementary to a unique region of the chromosome, and all of the probes are composed of a collection of DNA complementary to all the chromosomes in the genome. . After in situ hybridization, the measurement of a defined emission spectrum by spectral imaging can clearly identify all human chromosomes in different colors and detect chromosomal abnormalities (eg, translocations, chromosome breakpoints, and rearrangements) It becomes possible. For further details on SKY technology and its use in establishing karyotypes, see, for example, E.I. Shrock et al., Hum. Genet. 1997, 101: 255-262; B. Van den Veyver and B.W. B. Roa, Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 1998, 10: 97-103; C. Phelan et al., Prenatal Diagnosis, 1998, 18: 1174-1180; R. Haddad et al., Hum. Genet. 1998, 103: 619-625; Peschka et al., Prenatal. Diagn. 1999, 19: 1143-1149.
用語「比較ゲノムハイブリダイゼーションまたはＣＧＨ」および「中期比較ゲノムハイブリダイゼーションまたは中期ＣＧＨ」は、本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、蛍光色素により試験ＤＮＡおよび正常参照ＤＮＡを差次的に標識すること、その標識した２つのＤＮＡサンプルを正常な中期染色体スプレッドに対して同時ハイブリダイズすること、そして傾向によってそのハイブリダイズした２つのＤＮＡを可視化することを含む、分子細胞遺伝学技術を指す。特定の染色体または染色体領域に沿ったその２つの蛍光色素強度の比は、その２つのサンプル中の個々の核酸配列の相対的コピー数（すなわち、量）を反映する。ＣＧＨ分析は、ゲノム全体にわたる遺伝物質の獲得および喪失についての全体的外観を提供する。 The terms “comparative genomic hybridization or CGH” and “intermediate comparative genomic hybridization or CGH” are used interchangeably herein. These terms refer to differentially labeling test and normal reference DNA with fluorescent dyes, co-hybridizing the two labeled DNA samples to a normal metaphase chromosome spread, and the tendency to Refers to molecular cytogenetic techniques involving visualization of two soy DNAs. The ratio of the two fluorescent dye intensities along a particular chromosome or chromosomal region reflects the relative copy number (ie quantity) of the individual nucleic acid sequences in the two samples. CGH analysis provides an overall look at the gain and loss of genetic material throughout the genome.
本明細書中で使用される場合、用語「統計学的に有意な数」とは、信頼できるデータを提供するために充分に大きな（分析されたかまたは分析されるべき）サンプル数を指す。 As used herein, the term “statistically significant number” refers to the number of samples large enough (analyzed or to be analyzed) to provide reliable data.
用語「標識された」、「検出可能な因子で標識された」、および「検出可能な部分で標識された」は、本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、サンプル由来の核酸分子または個々の核酸セグメントが、例えば、遺伝子プローブへの結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）の後に可視化され得ることを特定するために、使用される。ハイブリダイゼーション方法において、核酸セグメントのサンプルは、ハイブリダイゼーション反応の前に検出可能に標識され得るか、またはそのハイブリダイゼーション生成物に結合する検出可能な標識が、選択され得る。好ましくは、その検出可能な因子または部分は、測定され得るシグナルを生じるように、そしてハイブリダイズされた核酸の量にその強度が関連するように、選択される。アレイベースの方法において、その検出可能な因子または部分はまた、好ましくは、局在化シグナルを生成することによってそのアレイ上の各スポットからのシグナルを空間的に分解することが可能であるように、選択される。核酸分子を標識するための方法は、当該分野で周知である（そのような方法のより詳細な説明について、下記を参照のこと）。標識された核酸フラグメントは、標識の組み込みまたは標識への結合体化によって調製され得、その標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電子的手段、光学的手段、または化学的手段によって、直接的または間接的に検出可能である。適切な検出可能な因子としては、種々のリガンド、放射性核種、蛍光色素、化学発光因子、微粒子、酵素、発色標識、磁気標識、およびハプテンが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な部分はまた、生物学的分子（例えば、分子ビーコンおよびアプタマービーコン）であり得る。 The terms “labeled”, “labeled with a detectable agent”, and “labeled with a detectable moiety” are used interchangeably herein. These terms are used to specify that nucleic acid molecules or individual nucleic acid segments from a sample can be visualized, for example, after binding (ie, hybridization) to a gene probe. In hybridization methods, the sample of nucleic acid segments can be detectably labeled prior to the hybridization reaction, or a detectable label that binds to the hybridization product can be selected. Preferably, the detectable factor or moiety is selected so as to produce a signal that can be measured and so that its intensity is related to the amount of hybridized nucleic acid. In an array-based method, the detectable agent or portion is also preferably capable of spatially resolving the signal from each spot on the array by generating a localization signal. Selected. Methods for labeling nucleic acid molecules are well known in the art (see below for a more detailed description of such methods). Labeled nucleic acid fragments can be prepared by incorporation of a label or conjugation to a label, the label comprising spectroscopic means, photochemical means, biochemical means, immunochemical means, electronic means, optical It can be detected directly or indirectly by mechanical or chemical means. Suitable detectable factors include, but are not limited to, various ligands, radionuclides, fluorescent dyes, chemiluminescent agents, microparticles, enzymes, chromogenic labels, magnetic labels, and haptens. The detectable moiety can also be a biological molecule (eg, molecular beacon and aptamer beacon).
用語「フルオロフォア」、「蛍光部分」、「蛍光標識」、「蛍光色素」および「蛍光標識部分」は、本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、溶液中にて適切な波長の光で励起された場合に、光を発光する分子を指す。広汎な種類の構造および特徴の多数の蛍光色素が、本発明の実施において使用するために適切である。同様に、核酸を蛍光標識するための方法および材料は、公知である（例えば、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ １９９２〜１９９４」第５版，１９９４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．参照）。フルオロフォアを選択する際には、その蛍光分子は、高効率で光を吸収して発光し（すなわち、それぞれ、高いモル吸収係数および蛍光量子収率）、光安定性である（すなわち、その分子は、分析を実施するために必要な時間内では光励起した際に有意には分解しない）ことが、好ましい。 The terms “fluorophore”, “fluorescent moiety”, “fluorescent label”, “fluorescent dye” and “fluorescent label moiety” are used interchangeably herein. These terms refer to molecules that emit light when excited with light of an appropriate wavelength in solution. A large number of fluorescent dyes of a wide variety of structures and features are suitable for use in the practice of the present invention. Similarly, methods and materials for fluorescent labeling of nucleic acids are known (eg, RP Haugland, “Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 1999-1994,” 5th edition, 1994, Molecular Prob. Inc.). In selecting a fluorophore, the fluorescent molecule absorbs light with high efficiency and emits light (ie, high molar absorption coefficient and fluorescence quantum yield, respectively) and is photostable (ie, the molecule Preferably does not degrade significantly upon photoexcitation within the time required to perform the analysis).
本明細書中で使用される場合、用語「コンピュータ支援画像化システム」とは、ハイブリダイゼーション後にアレイを分析するため、そしてハイブリダイゼーション後にそのアレイの蛍光画像を得るために使用され得る、蛍光画像を取得可能なシステムを指す。コンピュータ支援画像化システムは、ハードウェア（照射源（例えば、レーザー）、ＣＣＤ（すなわち、電荷素子デバイス）カメラ、一組のフィルター、およびコンピュータを含み得る）から構成される。 As used herein, the term “computer-aided imaging system” refers to a fluorescent image that can be used to analyze an array after hybridization and to obtain a fluorescent image of the array after hybridization. Refers to an obtainable system. A computer-aided imaging system is comprised of hardware (which may include an illumination source (eg, a laser), a CCD (ie, charge device device) camera, a set of filters, and a computer).
本明細書中で使用される場合、「コンピュータ支援画像分析システム」とは、ハイブリダイゼーション後にアレイの蛍光画像を分析するため、そのアレイから画像化したデータを解釈するため、そして蛍光強度としての結果をゲノム座の関数としてディスプレイするために使用され得る、システムを指す。コンピュータ支援画像分析システムは、アレイ上の別個のスポットにおける蛍光定量および蛍光比決定のためのソフトウェアを伴う、コンピュータを含み得る。 As used herein, a “computer-aided image analysis system” refers to analyzing a fluorescent image of an array after hybridization, interpreting data imaged from the array, and results as fluorescence intensity. Refers to a system that can be used to display as a function of genomic locus. The computer-aided image analysis system can include a computer with software for fluorescence quantification and fluorescence ratio determination at separate spots on the array.
用語「コンピュータ」とは、本明細書中では、その最も広い一般的文脈で使用される。本発明の方法は、任意のコンピュータを使用して、任意の公知のソフトウェアまたは方法論と組み合わせて、実施され得る。そのコンピュータは、任意の形態の記憶エレメント（例えば、動的ランダムアクセス記憶装置、フラッシュメモリなど）または大容量記憶装置（例えば、磁気ディスク選択的記憶装置（ｏｐｔｉｏｎａｌ ｓｔｏｒａｇｅ））をさらに含み得る。 The term “computer” is used herein in its broadest general context. The methods of the present invention may be implemented using any computer and in combination with any known software or methodology. The computer may further include any form of storage element (eg, dynamic random access storage, flash memory, etc.) or mass storage (eg, magnetic disk selective storage).
（特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、生きているヒト胎児における遺伝子発現を評価するためのシステムを提供する。とりわけ、本発明のシステムは、（１）種々の在胎齢での核型的および発生的に正常な胎児におけるｍＲＮＡ発現の基礎レベルを確立すること、（２）核型的および発生的に正常な胎児についての発生遺伝子発現パターンを確立すること、そして（３）染色体異常もしくは発生異常を有する胎児または他の型の臨床状態に罹患している胎児において異常に発現される新規な遺伝子を同定することを、可能にする。
Detailed Description of Certain Preferred Embodiments
The present invention provides a system for assessing gene expression in a living human fetus. In particular, the system of the present invention (1) establishes basal levels of mRNA expression in karyotypically and developmentally normal fetuses at various gestational ages, (2) karyotypically and developmentally normal Establishing developmental gene expression patterns for the fetus, and (3) identifying novel genes that are abnormally expressed in fetuses with chromosomal or developmental abnormalities or in other types of clinical conditions. Make it possible.
本発明は、羊水が、胎児ＲＮＡの豊富な供給源であるという発見を包含し、羊水の胎児ＲＮＡの単離および分析のための方法に関する。特に、胎児の健康、成長および発生の決定を可能にし、種々の疾患および状態の出生前診断を可能にする、システムが記載される。 The present invention encompasses the discovery that amniotic fluid is a rich source of fetal RNA and relates to a method for the isolation and analysis of amniotic fluid fetal RNA. In particular, a system is described that allows determination of fetal health, growth and development, and enables prenatal diagnosis of various diseases and conditions.
（Ｉ．羊水由来の胎児ＲＮＡ）
一局面において、本発明は、単離された羊水の胎児ＲＮＡを提供する。上記のように、本発明は、ＲＮＡの周知の不安定性にも関わらず、胎児ＲＮＡは、分析のために適切な量および状態で羊水において生存するという、本発明者らによる認識を包含する。
(I. Fetal RNA derived from amniotic fluid)
In one aspect, the present invention provides isolated amniotic fluid fetal RNA. As noted above, the present invention encompasses our recognition that, despite the well-known instability of RNA, fetal RNA survives in amniotic fluid in an amount and condition appropriate for analysis.
（羊水サンプル）
本発明の方法を実施することは、妊娠中の女性から得た羊水サンプルを提供することを含む。用水は、一般的には、羊水穿刺によって収集され、羊水穿刺において、長い針が、その母体の下腹部中に子宮内部の羊水腔まで挿入されて、一定量の羊水が回収される。
(Amniotic fluid sample)
Implementing the method of the present invention includes providing an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman. The irrigation water is generally collected by amniocentesis, in which a long needle is inserted into the maternal lower abdomen to the amniotic fluid cavity inside the uterus to recover a certain amount of amniotic fluid.
出生前診断のために、ほとんどの羊水穿刺は、妊娠第１４週目〜第２０週目に実施され、回収される羊水の容積は、約１０ｍＬ〜３０ｍＬである。伝統的に、羊水穿刺のための最も一般的な適応症は、高い母体年齢（代表的には、米国においては、推定出産時に３５歳以上であると設定）；以前に出生時欠損もしくは遺伝的障害の子供を有する；出生前染色体再配列、遺伝子成分が関連する後期発症障害の家族歴、再発性流産、胎児神経管欠損および／もしくは胎児染色体異常の危険が増加していることを示す母体血清スクリーニング検査（多マーカースクリーニング）陽性、ならびに異常な胎児超音波検査（例えば、胎児の異数性に関連することが既知である徴候を示す）が挙げられる。しかし、本発明による羊水サンプルから得られ得る情報の量および型は、標準的な手術手順の変化を支持し得、その結果、羊水穿刺は、あらゆる妊娠において考慮または実施される。 For prenatal diagnosis, most amniocentesis is performed from the 14th to the 20th week of pregnancy, and the volume of amniotic fluid collected is approximately 10 mL to 30 mL. Traditionally, the most common indication for amniocentesis is the high maternal age (typically set in the United States to be at least 35 years of age at the time of birth); previously a birth defect or genetic Has a child with disability; maternal serum indicating increased risk of prenatal chromosome rearrangement, family history of late-onset disorders associated with genetic components, recurrent miscarriage, fetal neural tube defects and / or fetal chromosomal abnormalities Positive screening tests (multi-marker screening), as well as abnormal fetal ultrasonography (eg, showing signs known to be associated with fetal aneuploidy). However, the amount and type of information that can be obtained from an amniotic fluid sample according to the present invention can support changes in standard surgical procedures, so that amniocentesis is considered or performed in every pregnancy.
羊水穿刺はまた、治療目的のために実施される。このような場合、羊水過剰（すなわち、胎児を取り囲む羊水の過剰）を矯正するために、大量の羊水（＞１Ｌ）が除去される（羊水減少（ａｍｎｉｏｒｅｄｕｃｔｉｏｎ））。羊水過剰は、膜の未熟な破裂のリスクの増加による危険を示し得、また、妊娠糖尿病または胎児水腫のような出生異常または他の医学的な問題の徴候であり得る。羊水過剰はまた、多胎妊娠においても観察される。双生児間輸血（ＴＴＴ）症候群は、一方の嚢内の過剰の羊水ともう一方の嚢内の羊水の不足の共存として断層撮影的に規定される。ＴＴＴ症候群において、羊水減少の目的は、レシピエントである双生児の嚢内の羊水の体積を減少することによって、流産または早期分娩の可能性を減少する試みである。 Amniocentesis is also performed for therapeutic purposes. In such cases, a large amount of amniotic fluid (> 1 L) is removed (amniotic reduction) to correct the excess of amniotic fluid (ie, the excess of amniotic fluid surrounding the fetus). Amniotic fluid excess can be dangerous due to an increased risk of premature rupture of the membrane and can be a sign of birth defects such as gestational diabetes or fetal edema or other medical problems. Amniotic fluid excess is also observed in multiple pregnancy. Twin-to-twin transfusion (TTT) syndrome is tomographically defined as the coexistence of excess amniotic fluid in one sac and a lack of amniotic fluid in the other sac. In TTT syndrome, the purpose of amniotic fluid reduction is an attempt to reduce the possibility of miscarriage or premature delivery by reducing the volume of amniotic fluid in the sac of the recipient twin.
本発明の文脈において、羊水のサンプルは、標準的な羊水穿刺または治療的な羊水穿刺の後に得られ得る。従来の羊水穿刺手順において、羊水中に存在する胎児細胞は、遠心分離により単離され、そして、染色体分析、生化学分析および／または分子生物学的分析のために培養において増殖される。遠心分離はまた、上清サンプル（本明細書中では、「残りの羊膜物質」と呼ぶ）も生じ、これは通常、アッセイの失敗の場合のバックアップとして−２０℃にて保存される。この上清のアリコートはまた、α−フェトプロテインおよびアセチルコリンエステラーゼのレベルの決定のような、さらなるアッセイに使用され得る。一定時間の後、凍結した上清サンプルは代表的に破棄される。羊水減少では、回収された羊水の全サンプルが破棄される。Ｔｕｆｔｓ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）におけるＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによる標準的なプロトコールは、実施例の節に詳細に記載され、この実験室は、出願人らに、羊水の新鮮なサンプルおよび凍結サンプル（治療的な羊水穿刺に由来する）ならびに残りの羊膜物質の新鮮なサンプル（診断的な羊水穿刺に由来する）を提供する。 In the context of the present invention, a sample of amniotic fluid can be obtained after a standard amniocentesis or therapeutic amniocentesis. In conventional amniocentesis procedures, fetal cells present in amniotic fluid are isolated by centrifugation and grown in culture for chromosomal, biochemical and / or molecular biological analysis. Centrifugation also yields a supernatant sample (referred to herein as “residual amniotic material”), which is usually stored at −20 ° C. as a backup in case of assay failure. An aliquot of this supernatant can also be used for further assays, such as determination of alpha-fetoprotein and acetylcholinesterase levels. After a certain time, the frozen supernatant sample is typically discarded. In amniotic fluid reduction, all collected amniotic fluid samples are discarded. The standard protocol by Cytogenetics Laboratories at Tufts-New England Medical Center (Boston, MA) is described in detail in the Examples section, and the laboratory is responsible for fresh and frozen samples of amniotic fluid ( As well as a fresh sample of the remaining amniotic material (derived from a diagnostic amniocentesis).
（胎児ＲＮＡの単離）
本発明の方法における使用のための胎児ＲＮＡは、妊婦から得られた羊水のサンプルから単離される。この単離は、ＲＮＡの単離または抽出の任意の適切な方法により実施され得る。
(Isolation of fetal RNA)
Fetal RNA for use in the method of the invention is isolated from a sample of amniotic fluid obtained from a pregnant woman. This isolation can be performed by any suitable method of RNA isolation or extraction.
好ましい実施形態において、胎児ＲＮＡは、羊水サンプル中に存在する胎児ＲＮＡが抽出されるように、羊水サンプルを処理することにより得られる。特定の実施形態において、胎児ＲＮＡは、羊水サンプル中に存在する細胞集団の実質的に全てまたはいくらかを除去した後に抽出される。この細胞集団は、任意の適切な方法（例えば、遠心分離）により羊水から除去され得る。１回より多くの遠心分離工程が実施され、実質的に全ての細胞集団が取り除かれたことを補償し得る。好ましくは、細胞集団は、羊水サンプルを得てから２時間以内に取り除かれる。より好ましくは、細胞集団は、羊水サンプルを得た直後に取り除かれる。 In a preferred embodiment, fetal RNA is obtained by treating the amniotic fluid sample such that fetal RNA present in the amniotic fluid sample is extracted. In certain embodiments, fetal RNA is extracted after removing substantially all or some of the cell population present in the amniotic fluid sample. This cell population can be removed from the amniotic fluid by any suitable method (eg, centrifugation). More than one centrifugation step may be performed to compensate that substantially all of the cell population has been removed. Preferably, the cell population is removed within 2 hours of obtaining the amniotic fluid sample. More preferably, the cell population is removed immediately after obtaining the amniotic fluid sample.
実質的に全ての細胞集団が羊水サンプルから取り除かれる場合、羊水の胎児ＲＮＡは、本質的に無細胞の胎児ＲＮＡからなる。遠心分離により得られる残りの羊膜物質のサンプルから抽出される場合、胎児ＲＮＡは、無細胞の胎児ＲＮＡ、ならびに残りの物質中になお存在する細胞に由来する胎児ＲＮＡを含む。 Amniotic fluid fetal RNA consists essentially of cell-free fetal RNA when substantially all cell populations are removed from the amniotic fluid sample. When extracted from a sample of remaining amniotic material obtained by centrifugation, fetal RNA includes cell-free fetal RNA as well as fetal RNA derived from cells still present in the remaining material.
胎児ＲＮＡはまた、羊水サンプルから細胞を単離し、必要に応じてこれらの単離した細胞を培養し、そしてこれらの細胞からＲＮＡを抽出することによって得られ得る。このような場合、羊水の胎児ＲＮＡは、本質的に培養細胞に由来する胎児ＲＮＡからなる。 Fetal RNA can also be obtained by isolating cells from amniotic fluid samples, optionally culturing these isolated cells, and extracting RNA from these cells. In such a case, amniotic fluid fetal RNA consists essentially of fetal RNA derived from cultured cells.
上記のように、胎児ＲＮＡの単離または抽出の前に、残りの羊膜物質のサンプルを、適切な保存条件下（例えば、−８０℃において）で、一定の期間、凍結保存され得る。凍結前に、ＲＮａｓｅ（すなわち、リボヌクレアーゼ）による胎児ＲＮＡの分解を防止するＲＮａｓｅインヒビターがサンプルに添加され得る。好ましくは、ＲＮａｓｅインヒビターは、残りの羊水物質サンプルを得てから２時間以内に添加される。より好ましくは、ＲＮａｓｅインヒビターは、残りの羊膜物質のサンプルを得た直後に添加される。ＲＮＡ抽出の前に、凍結サンプルを３７℃にて溶かし、ボルテックスを用いて混合する。この時点でさらに遠心分離を実施して、羊水中になお存在する任意の細胞集団を取り除き、抽出されたＲＮＡが本当に細胞外にあることを確実にし得る。 As described above, prior to fetal RNA isolation or extraction, the remaining sample of amniotic material can be stored frozen for a period of time under suitable storage conditions (eg, at −80 ° C.). Prior to freezing, an RNase inhibitor that prevents degradation of fetal RNA by RNase (ie, ribonuclease) can be added to the sample. Preferably, the RNase inhibitor is added within 2 hours of obtaining the remaining amniotic fluid material sample. More preferably, the RNase inhibitor is added immediately after obtaining a sample of the remaining amniotic material. Prior to RNA extraction, the frozen sample is thawed at 37 ° C. and mixed using a vortex. At this point, further centrifugation can be performed to remove any cell population still present in the amniotic fluid and ensure that the extracted RNA is indeed extracellular.
最も一般に使用されるＲＮａｓｅインヒビターは、特異的（かつ可逆的に）ＲＮａｓｅに結合するヒト胎盤に由来する天然のタンパク質（Ｐ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７７，２５２：５９０４−５９１０）である。ＲＮａｓｅインヒビターは、例えば、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；ＳＵＰＥＲａｓｅ・ＩｎＴＭとして）、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；ｒＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼインヒビターとして）、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）から市販されている。一般に、ＲＮＡサンプル中へのＲＮａｓｅの混入を防止するための予防策は、当該分野で周知であり、手袋の使用、ＲＮａｓｅフリーであることが保証された試薬および商品の使用、特別に処理された水の使用、ならびに、低温の使用、ならびに、慣用的な汚染除去法の使用などが挙げられ、これらは、本発明の方法の実施において使用される。 The most commonly used RNase inhibitor is a natural protein derived from human placenta that binds specific (and reversibly) RNase (P. Blackburn et al., J. Biol. Chem., 1977, 252: 5904-5910). It is. RNase inhibitors are described in, for example, Ambion (Austin, TX; as SUPERase In ™ ), Promega, Inc. (Madison, WI; as an rRNasin® ribonuclease inhibitor), and Applied Biosystems (Framingham, Mass.). In general, precautions to prevent RNase contamination in RNA samples are well known in the art and include the use of gloves, the use of reagents and goods guaranteed to be RNase free, and specially processed These include the use of water, as well as the use of low temperatures, and the use of conventional decontamination methods, which are used in the practice of the method of the present invention.
胎児ＲＮＡの単離は、残りの羊膜物質中に存在する胎児ＲＮＡを抽出し、分析用に利用可能にするように、残りの羊水物質を処理する工程を包含し得る。抽出された羊水胎児ＲＮＡを生じる任意の適切な単離方法が、本発明の実施において使用され得る。胎児の最も正確な評価を得るために、操作プロセスからのアーチファクトを最小限にすることが望ましい。従って、抽出および修飾の工程の数は、好ましくは、可能な限り少なく維持される。 Isolation of fetal RNA can include processing the remaining amniotic fluid material to extract fetal RNA present in the remaining amniotic material and make it available for analysis. Any suitable isolation method that yields extracted amniotic fluid fetal RNA can be used in the practice of the invention. In order to obtain the most accurate assessment of the fetus, it is desirable to minimize artifacts from the manipulation process. Therefore, the number of extraction and modification steps is preferably kept as low as possible.
ＲＮＡの抽出方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，１９８９，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。体液または身体組織からＲＮＡを単離するほとんどの方法は、ＲＮａｓｅを迅速かつ効率的に不活性化するための、タンパク質変性剤の存在下での組織の破壊に基づく。一般に、ＲＮＡ単離試薬は、他の成分の中でもとりわけ、グアニジウムチオシアネートおよび／またはβ−メルカプトエタノールを含み、これらは、ＲＮａｓｅインヒビターとして機能することが公知である（Ｊ．Ｍ．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７９，１８：５２９４−５２９９）。次いで、単離された総ＲＮＡは、タンパク質汚染物からさらに精製され、選択的なエタノール沈殿、フェノール／クロロホルム抽出、およびその後のイソプロパノール沈殿（例えば、Ｐ．ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＮ．Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７，１６２：１５６−１５９を参照のこと）、または、塩化セシウム、塩化リチウムもしくはトリフルオロ酢酸セシウム勾配遠心分離（例えば、Ｖ．Ｇｌｉｓｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７４，１３：２６３３−２６３７；Ｄ．Ｂ．ＳｔｅｒｎおよびＪ．Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８６，１１８：４８８を参照のこと）により濃縮される。 RNA extraction methods are well known in the art (see, for example, J. Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 1989, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press: New York). Most methods of isolating RNA from bodily fluids or body tissues are based on tissue destruction in the presence of protein denaturants to inactivate RNase quickly and efficiently. In general, RNA isolation reagents include guanidinium thiocyanate and / or β-mercaptoethanol, among other components, which are known to function as RNase inhibitors (JM Chirgwin et al., Biochem., 1979, 18: 5294-5299). The isolated total RNA is then further purified from protein contaminants, selective ethanol precipitation, phenol / chloroform extraction, and subsequent isopropanol precipitation (eg, P. Chomczynski and N. Sacchi, Anal. Biochem., 1987, 162: 156-159), or cesium chloride, lithium chloride or cesium trifluoroacetate gradient centrifugation (eg, V. Glisin et al., Biochem., 1974, 13: 2633-2637; DB) Stern and J. Newton, Meth. Enzymol., 1986, 118: 488).
本発明の特定の方法（例えば、羊水の胎児ＲＮＡが遺伝子発現分析に供される方法）において、低レベルのメッセージでも検出可能にするために、総ＲＮＡからｍＲＮＡを単離することが望ましくあり得る（Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ」，１９９４（第３版），Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。 In certain methods of the invention (eg, methods wherein amniotic fluid fetal RNA is subjected to gene expression analysis), it may be desirable to isolate mRNA from total RNA in order to be detectable even at low levels of message. (B. Alberts et al., “Molecular Biology of the Cell”, 1994 (3rd edition), Garland Publishing, Inc .: New York, NY).
総ＲＮＡからのｍＲＮＡの精製は、代表的に、大半の成熟した真核生物ｍＲＮＡ種に存在するポリ（Ａ）テイルに頼る。単離方法のいくつかのバリエーションは、同じ原理に基づいて開発されている。第１のアプローチにおいて、総ＲＮＡの溶液を、高濃度の塩の存在下で固体セルロースマトリクスに結合されたオリゴ（ｄＴ）もしくはｄ（Ｕ）を含有するカラムに通過させ、ポリ（Ａ）テイルのオリゴ（ｄＴ）もしくはｄ（Ｕ）へのアニーリングを可能にする。次いで、カラムを低塩の緩衝液で洗浄して、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡを取り除き、放出させる。第２のアプローチにおいて、ビオチン化オリゴ（ｄＴ）プライマーを総ＲＮＡの溶液に添加して、これを用いてｍＲＮＡの３’ポリ（Ａ）領域にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション生成物は、常磁性粒子に結合したストレプトアビジンおよび磁性分離スタンドを使用して捕捉され、そして高ストリンジェンシー下で洗浄される。ｍＲＮＡは、リボヌクレアーゼフリーの脱イオン水を単純に添加することによって、固相から溶出される。他のアプローチは、総ＲＮＡの事前単離を必要としない。例えば、表面にオリゴ（ｄＴ）配列が共有結合された均質な、超常磁性のポリスチレンビーズは、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）残基とビーズ上のオリゴ（ｄＴ）配列との間の特異的塩基対形成により、直接ｍＲＮＡを単離するために使用され得る。さらに、ビーズ上のオリゴ（ｄＴ）配列はまた、逆転写酵素のためのプライマーとして使用され、その後、ｃＤＮＡの第１鎖を合成し得る。あるいは、総ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの単離、調製および／または精製のための新しい方法または既存の方法の改善が、当業者により考案され得、そして、本発明の実施において使用され得る。 Purification of mRNA from total RNA typically relies on the poly (A) tail present in most mature eukaryotic mRNA species. Several variations of the isolation method have been developed based on the same principle. In the first approach, a solution of total RNA is passed through a column containing oligo (dT) or d (U) bound to a solid cellulose matrix in the presence of a high concentration of salt and the poly (A) tail Allows annealing to oligo (dT) or d (U). The column is then washed with a low salt buffer to remove and release the poly (A) mRNA. In the second approach, a biotinylated oligo (dT) primer is added to a solution of total RNA and used to hybridize to the 3 'poly (A) region of the mRNA. The hybridization product is captured using streptavidin and a magnetic separation stand coupled to paramagnetic particles and washed under high stringency. The mRNA is eluted from the solid phase by simply adding ribonuclease-free deionized water. Other approaches do not require prior isolation of total RNA. For example, homogeneous, superparamagnetic polystyrene beads with oligo (dT) sequences covalently attached to the surface can generate specific base pairing between the poly (A) residues of the mRNA and the oligo (dT) sequences on the beads. Can be used to directly isolate mRNA. In addition, the oligo (dT) sequence on the beads can also be used as a primer for reverse transcriptase, which can then synthesize the first strand of the cDNA. Alternatively, new or improved existing methods for isolation, preparation and / or purification of total RNA or mRNA can be devised by those skilled in the art and used in the practice of the present invention.
多数の種々かつ汎用のキットが、体液からＲＮＡ（すなわち、総ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を抽出するために使用され得、そして、例えば、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅ Ｃｏｒｐ．（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＱｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から市販されている。通常、使用するプロトコールをより詳細に記載するユーザーガイドが、これらのキット全てに含まれる。感度、処理時間および費用は、キット毎に異なり得る。当業者は、特定の状況に最も適切なキットを容易に選択し得る。 A number of different and universal kits can be used to extract RNA (ie, total RNA or mRNA) from body fluids and are described, for example, in Ambion, Inc. (Austin, TX), Amersham Biosciences (Piscataway, NJ), BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA), BioRad Laboratories (Hercules, California), Dynal Biotech. (Lake Success, NY), Epicentre Technologies (Madison, Wis.), Gentra Systems, Inc. (Minneapolis, MN), GIBCO BRL (Gaithersburg, MD), Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA), MicroProbe Corp. (Bothell, WA), Organon Teknika (Durham, NC), Promega, Inc. (Madison, WI) and Qiagen Inc. (Valencia, CA). A user guide that usually describes the protocol to be used in more detail is included in all of these kits. Sensitivity, processing time and cost may vary from kit to kit. One skilled in the art can readily select the kit most appropriate for a particular situation.
実施例の節に記載されるように、出願人らは、Ｑｉａｇｅｎ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡミニキットおよび真空プロトコールを使用して、キャリアとしての合成ポリ−Ａ−ＲＮＡの存在下で、残りの羊膜物質からＲＮＡを抽出および精製した。これらの実験において使用された残りの羊水の最低容量は、４２０μＬであり；最高容量は３０ｍＬであった。抽出実験において使用された低容量の２つのサンプルは、５００〜１０００ｐｇ／ｍＬの精製ｍＲＮＡを生じ、一方で、高容量の２つのサンプルは、２４０〜４２０ｐｇ／ｍＬの精製ｍＲＮＡを生じた（すなわち、それぞれ７．２ｎｇおよび１２．７ｎｇ）。 As described in the Examples section, Applicants used Qiagen Viral RNA mini kit and vacuum protocol to extract RNA from the remaining amniotic material in the presence of synthetic poly-A-RNA as a carrier. Extracted and purified. The minimum volume of remaining amniotic fluid used in these experiments was 420 μL; the maximum volume was 30 mL. The two low volume samples used in the extraction experiments yielded 500-1000 pg / mL purified mRNA, while the two high volume samples yielded 240-420 pg / mL purified mRNA (ie, 7.2 ng and 12.7 ng, respectively).
（抽出された羊水の胎児ＲＮＡの増幅）
特定の実施形態において、羊水の胎児ＲＮＡは、分析前に増幅される。他の実施形態において、分析前に、羊水の胎児ＲＮＡが、逆転写酵素により、相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと変換され、これは、次に、必要に応じて、転写により相補鎖ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）へと変換され得る。
(Amplification of extracted amniotic fluid fetal RNA)
In certain embodiments, amniotic fluid fetal RNA is amplified prior to analysis. In other embodiments, amniotic fluid fetal RNA is converted to complementary strand DNA (cDNA) by reverse transcriptase prior to analysis, which is then optionally transcribed to complementary strand RNA (cRNA). ).
増幅方法は、当該分野で周知である（例えば、Ａ．Ｒ．ＫｉｍｍｅｌおよびＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７，１５２：３０７−３１６；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，１９８９，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），２００２，第５版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号を参照のこと）。標準的な核酸増幅方法としては以下が挙げられる：ポリメラーゼ連鎖反応（すなわち、ＰＣＲ、例えば、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０；および「ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５を参照のこと）、およびリガーゼ連鎖反応（すなわち、ＬＣＲ、例えば、Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４１：１０７７−１０８０；およびＤ．Ｌ．Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅ，１９９０，８９：１１７−１２２を参照のこと）。 Amplification methods are well known in the art (eg, AR Kimmel and SL Berger, Methods Enzymol., 1987, 152: 307-316; J. Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”). , 1989, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York; “Short Protocols in Molecular Biology”, FM Ausubel (ed.), 2002, 5th edition, John Wiley 68; 195; see U.S. Pat. Nos. 4,683,202 and 4,800,159). Standard nucleic acid amplification methods include the following: polymerase chain reaction (ie, PCR, eg, “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”, MA Innis (ed.), Academic Press: New York, 1990; and “PCR Strategies”, MA Innis (ed.), Academic Press: New York, 1995), and ligase chain reaction (ie, LCR, eg, U. Landegren et al., Science, 1988, 241: 1077-1080; and DL Barringer et al., Gene, 1990, 89: 117-122).
ＲＮＡをｃＤＮＡへと転写するための方法がまた、当該分野で周知である。逆転写反応は、係留されたオリゴｄＴプライマー、もしくはランダム配列プライマーのような非特異的なプライマーを使用するか、または、モニタリングされる各遺伝的プローブについてのＲＮＡに相補的な標的特異的なプライマーを使用するか、または、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、鳥類骨髄芽細胞症ウイルス逆転写酵素またはＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素）を使用することによって実施され得る。他の方法としては、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）（例えば、Ｄ．Ｙ．Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８９，８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、自律性配列複製（３ＳＲ）のような等温性転写ベースの系（例えば、Ｊ．Ｃ．Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９０，８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、およびＱ−βレプリカーゼ増幅（例えば、Ｊ．Ｈ．Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９７，３５：１４７７−１４９１；およびＪ．Ｌ．Ｂｕｒｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１９９６，１０：２５７−２７１を参照のこと）が挙げられる。 Methods for transcribing RNA into cDNA are also well known in the art. The reverse transcription reaction uses a non-specific primer such as a tethered oligo dT primer, or a random sequence primer, or a target specific primer complementary to the RNA for each genetic probe monitored. Or a thermostable DNA polymerase such as avian myeloblastosis virus reverse transcriptase or Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase. Other methods include transcription-based amplification systems (TAS) (see, for example, DY Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1989, 86: 1173-1177), autonomous sequence replication. Isothermal transcription-based systems such as (3SR) (see, eg, J. C. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1990, 87: 1874-1878), and Q-β replicase amplification (See, for example, JH Smith et al., J. Clin. Microbiol., 1997, 35: 1477-1491; and JL Burg et al., Mol. Cell. Probes, 1996, 10: 257-271. ).
これらの逆転写酵素から生じるｃＤＮＡ生成物は、適切なＲＮＡポリメラーゼによる複数ラウンドの転写のためのテンプレートとして機能し得る（例えば、核酸配列ベースの増幅すなわちＮＡＳＢＡによる、例えば、Ｔ．Ｋｉｅｖｉｔｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９１，３５：２７３−２８６；およびＡ．Ｅ．Ｇｒｅｉｊｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，９６：１３３〜１４７を参照のこと）。ｃＤＮＡテンプレートの転写は、元々の標的ｍＲＮＡからのシグナルを迅速に増幅する。 The cDNA product resulting from these reverse transcriptases can serve as a template for multiple rounds of transcription with an appropriate RNA polymerase (eg, by nucleic acid sequence-based amplification or NASBA, eg, T. Kievits et al., J. Biol. Virol. Methods, 1991, 35: 273-286; and AE Greijer et al., J. Virol. Methods, 2001, 96: 133-147). Transcription of the cDNA template rapidly amplifies the signal from the original target mRNA.
これらの方法ならびに他の方法（当業者に公知であるか、または当業者により新たに考案されたもののいずれか）が、本発明の実施において使用され得る。 These methods as well as other methods, either known to those skilled in the art or newly devised by those skilled in the art, can be used in the practice of the present invention.
Ｔ７−オリゴｄＴプライマーを使用する抽出された総ＲＮＡのｃＤＮＡへの変換、ｃＤＮＡの第２鎖の合成、得られた二本鎖ｃＤＮＡの精製、インビトロ転写による二本鎖ｃＤＮＡのｃＲＮＡへの変換、その後のＡｍｂｉｏｎ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔプロトコールおよびＱｉａｇｅｎ製のＲＮＡｅａｓｙカラムを使用する転写物の精製による、羊水の胎児ＲＮＡのｃＲＮＡへの変換の詳細な説明は、実施例の節において見出され得る。 Conversion of extracted total RNA to cDNA using T7-oligo dT primer, synthesis of second strand of cDNA, purification of the resulting double stranded cDNA, conversion of double stranded cDNA to cRNA by in vitro transcription, A detailed description of the conversion of amniotic fluid fetal RNA to cRNA by subsequent purification of transcripts using the Ambion MEGAscript protocol and RNAeasy column from Qiagen can be found in the Examples section.
増幅はまた、抽出された胎児ＲＮＡの量を定量するために使用され得る（例えば、米国特許第６，２９４，３３８号を参照のこと）。あるいは、またはさらに、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する増幅は、分析前に無細胞胎児ＲＮＡを標識するために使用され得る（以下を参照のこと）。適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーは、当業者により容易に選択および設計され得る。 Amplification can also be used to quantify the amount of fetal RNA extracted (see, eg, US Pat. No. 6,294,338). Alternatively or additionally, amplification using appropriate oligonucleotide primers can be used to label cell-free fetal RNA prior to analysis (see below). Appropriate oligonucleotide amplification primers can be readily selected and designed by those skilled in the art.
（羊水の胎児ＲＮＡの標識）
特定の好ましい実施形態において、羊水の胎児ＲＮＡ（例えば、増幅後、またはｃＤＮＡもしくはｃＲＮＡへの変換後）は、分析される前に、検出可能な試薬もしくは部分で標識される。検出可能な試薬の役割は、胎児ＲＮＡの検出を容易にすること、または、ハイブリダイズした核酸フラグメント（例えば、遺伝的プローブに結合した核酸フラグメント）の可視化を可能にすることである。好ましくは、検出可能な試薬は、測定され得るシグナルを生じ、その強度が、分析されるサンプル中に存在する標識された核酸の量に相関するように選択される。アレイベースの分析方法において、検出可能な試薬はまた、好ましくは、局在化したシグナルを生じ、それにより、アレイ上の各スポットからのシグナルの空間的な分解を可能にするように選択される。
(Labeling of amniotic fluid fetal RNA)
In certain preferred embodiments, amniotic fluid fetal RNA (eg, after amplification or after conversion to cDNA or cRNA) is labeled with a detectable reagent or moiety prior to analysis. The role of the detectable reagent is to facilitate the detection of fetal RNA or to allow visualization of hybridized nucleic acid fragments (eg, nucleic acid fragments bound to genetic probes). Preferably, the detectable reagent produces a signal that can be measured and its intensity is selected to correlate with the amount of labeled nucleic acid present in the sample being analyzed. In array-based analytical methods, the detectable reagent is also preferably selected to produce a localized signal, thereby allowing spatial resolution of the signal from each spot on the array. .
核酸分子と検出可能な試薬との間の会合は、共有的であっても非共有的であってもよい。標識された核酸フラグメントは、検出可能な部分の取り込み、または検出可能な部分への結合体化により調製され得る。標識は、核酸フラグメントに直接結合され得るか、または、リンカーを介して間接的に結合され得る。種々の長さのリンカーまたはスペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ）が当該分野で公知であり、かつ市販されており、そして、立体障害を減少するように、または、結果として生じる標識された分子に他の有用もしくは所望の特性を与えるように、選択され得る（例えば、Ｅ．Ｓ．Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１９９５，９：１４５−１５６を参照のこと）。 The association between the nucleic acid molecule and the detectable reagent may be covalent or non-covalent. Labeled nucleic acid fragments can be prepared by incorporation of a detectable moiety or conjugation to a detectable moiety. The label can be attached directly to the nucleic acid fragment or indirectly through a linker. Various lengths of linkers or spacer arms are known in the art and are commercially available, and other useful for reducing steric hindrance or resulting labeled molecules Alternatively, it can be selected to give the desired properties (see, eg, ES Mansfield et al., Mol. Cell. Probes, 1995, 9: 145-156).
核酸分子を標識するための方法は当該分野で周知である。標識プロトコール、標識検出技術およびこの分野における近年の開発の総説については、例えば、Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００２，３９：１１４−１２９；Ｒ．Ｐ．ｖａｎ Ｇｉｊｌｓｗｉｊｋら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，２００１，１：８１−９１；およびＳ．Ｊｏｏｓら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，３５：１３５−１５３を参照のこと。標準的な核酸標識法としては以下が挙げられる：放射活性試薬の取り込み、蛍光色素の直接結合（例えば、Ｌ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８５，１３：２３９９−２４１２を参照のこと）、または酵素の直接結合（例えば、Ｂ．Ａ．ＣｏｎｎｏｌｙおよびＰ．Ｒｉｄｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９８５，１３：４４８５−４５０２を参照のこと）；免疫化学的に検出可能にするか、または他の親和性反応による、核酸フラグメントの化学的修飾（例えば、Ｔ．Ｒ．Ｂｒｏｋｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９７８，５：３６３−３８４；Ｅ．Ａ．Ｂａｙｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９８０，２６：１−４５；Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８１，７８：６６３３−６６３７；Ｒ．Ｗ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８３，１１：６１６７−６１８４；Ｄ．Ｊ．Ｂｒｉｇａｔｉら，Ｖｉｒｏｌ．，１９８３，１２６：３２−５０；Ｐ．Ｔｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８４，８１：３４６６−３４７０；Ｊ．Ｅ．Ｌａｎｄｅｇｅｎｔら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１９８４，１５：６１−７２；およびＡ．Ｈ．Ｈｏｐｍａｎら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１９８７，１６９：３５７−３６８を参照のこと）；ならびに、酵素媒介性の標識法（例えば、ランダムプライミング、ニックトランスレーション、ＰＣＲおよびターミナルトランスフェラーゼによるテイリング（ｔａｉｌｉｎｇ）（酵素的標識に関する総説については、例えば、Ｊ．ＴｅｍｓａｍａｎｉおよびＳ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，５：２２３−２３２を参照のこと））。より最近開発された核酸標識系としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＵＬＳ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｓｙｓｔｅｍ；例えば、Ｒ．Ｊ．Ｈｅｅｔｅｂｒｉｊら，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９９，８７：４７−５２を参照のこと）、光反応性アジド誘導体（例えば、Ｃ．Ｎｅｖｅｓら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０００，１１：５１−５５を参照のこと）、ならびにアルキル化剤（例えば、Ｍ．Ｇ．Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８，１６：５６８−５７６を参照のこと）。 Methods for labeling nucleic acid molecules are well known in the art. For a review of labeling protocols, label detection techniques and recent developments in this field, see, for example, L.C. J. et al. Kricka, Ann. Clin. Biochem. 2002, 39: 114-129; P. van Gijlswijk et al., Expert Rev. Mol. Diagn. 2001, 1: 81-91; Joos et al. Biotechnol. 1994, 35: 135-153. Standard nucleic acid labeling methods include: incorporation of radioactive reagents, direct binding of fluorescent dyes (see, eg, LM Smith et al., Nucl. Acids Res., 1985, 13: 2399-2412). Or direct binding of the enzyme (see, eg, BA Connoly and P. Rider, Nucl. Acids. Res., 1985, 13: 4485-4502); Or chemical modification of nucleic acid fragments by other affinity reactions (see, eg, TR Broker et al., Nucl. Acids Res., 1978, 5: 363-384; EA Bayer et al., Methods of Biochem. Analysis, 1980, 26: 1-45; R. Langer et al., Pro Natl.Acad.Sci.USA, 1981, 78: 6633-6737; RW Richardson et al., Nucl.Acids Res., 1983, 11: 6167-6184; 126: 32-50; P. Tchen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1984, 81: 3466-3470; J. E. Landgent et al., Exp. Cell Res., 1984, 15: 61-72; AH Hopman et al., Exp. Cell Res., 1987, 169: 357-368); and enzyme-mediated labeling methods (eg, by random priming, nick translation, PCR and terminal transferase) Iringu (tailing) (For a review on enzymatic labeling, for example, J.Temsamani and S.Agrawal, Mol.Biotechnol, 1996,5:. 223-232 see)). More recently developed nucleic acid labeling systems include, but are not limited to, the ULS (Universal Linkage System; eg, RJ Heetebrij et al., Cytogenet. Cell. Genet., 1999, 87: 47-52. ), Photoreactive azide derivatives (see, for example, C. Neves et al., Bioconjugate Chem., 2000, 11: 51-55), and alkylating agents (see, for example, MG Sebestien et al., Nat. Biotechnol., 1998, 16: 568-576).
任意の広範種々の検出可能な試薬が、本発明の実施において使用され得る。適切な検出可能な試薬としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：種々のリガンド、放射性核種（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど）；蛍光色素（特定の例示的な蛍光色素については、以下を参照のこと）；化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル、安定化ジオキセタンなど）；微粒子（例えば、量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）、ナノクリスタル、リン光体など）；酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて使用されるもの、すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；比色標識（例えば、色素、金コロイド（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ）など）；磁気標識（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）；ならびに、ビオチン、ジオキシゲニンまたは他のハプテン、および抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質。 Any of a wide variety of detectable reagents can be used in the practice of the present invention. Suitable detectable reagents include, but are not limited to: various ligands, radionuclides (eg, 32 P, 35 S, 3 H, 14 C, 125 I, 131 I, etc.); fluorescent dyes ( See below for certain exemplary fluorescent dyes); chemiluminescent reagents (eg, acridinium esters, stabilized dioxetanes, etc.); microparticles (eg, quantum dots, nanocrystals, phosphorescence) Body; etc .; enzymes (eg those used in ELISA, ie horseradish peroxidase, β-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase); colorimetric labels (eg dyes, colloidal gold etc.); magnetic labels (e.g., Dynabeads TM); and, Ochin, digoxigenin or other haptens and antisera or monoclonal antibodies are available proteins.
特定の実施形態において、羊水の胎児ＲＮＡ（増幅後、またはｃＤＮＡもしくはｃＲＮＡへの変換後）は蛍光標識される。広範種々の化学構造および物理的特徴を有する多数の公知の蛍光標識部分が本発明の実施における用途に適切である。適切な蛍光色素としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｃｙ−３ＴＭ、Ｃｙ−５ＴＭ、Ｔｅｘａｓレッド、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、ローダミン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアニン、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素（ｓｔｙｒｙｌ ｄｙｅ）、オキソノール色素（ｏｘｏｎｏｌ ｄｙｅ）、ＢＯＤＩＰＹ色素（すなわち、二フッ化ホウ素ジピロメタン発蛍光団、例えば、Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０００，６５：２９００−２９０６；Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０００，４２：１３７−１５１；米国特許第４，７７４，３３９号；同第５，１８７，２８８号；同第５，２２７，４８７号；同第５，２４８，７８２号；同第５，６１４，３８６号；同第５，９９４，０６３号；および同第６，０６０，３２４号を参照のこと）、ならびに、これらの分子の等価物、アナログ、誘導体もしくは組み合わせ。同様に、蛍光色素を、核酸のような生体分子に連結もしくは組み込むための方法および物質は公知である（例えば、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ １９９２−１９９４」，第５版，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。蛍光標識色素ならびに標識キットは、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｒｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から市販されている。 In certain embodiments, amniotic fluid fetal RNA (after amplification or conversion to cDNA or cRNA) is fluorescently labeled. A number of known fluorescent labeling moieties having a wide variety of chemical structures and physical characteristics are suitable for use in the practice of the present invention. Suitable fluorescent dyes include, but are not limited to: Cy-3 ™ , Cy-5 ™ , Texas Red, FITC, phycoerythrin, rhodamine, fluorescein, fluorescein isothiocyanine, carbocyanine, merocyanine, styryl dye. (Style dye), oxonol dye, BODIPY dye (ie, boron difluoride dipyrromethane fluorophore, such as CS Chen et al., J. Org. Chem., 2000, 65: 2900-2906; C. S. Chen et al., J. Biochem. Biophys. Methods, 2000, 42: 137-151; U.S. Pat. Nos. 4,774,339; 5,187,288; 5,227,487. ; No. 5,248,7 2; No. 5,614,386; No. 5,994,063; and No. 6,060,324), and equivalents, analogs, derivatives or combinations of these molecules . Similarly, methods and materials for linking or incorporating fluorescent dyes into biomolecules such as nucleic acids are known (eg, RP Haugland, “Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992-1994”). , 5th edition, 1994, Molecular Probes, Inc.). Fluorescent labeling dyes and labeling kits are described, for example, in Amersham Biosciences, Inc. (Piscataway, NJ), Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) and New England Biolabs, Inc. (Berly, MA).
本発明の実施において使用される蛍光標識試薬の好ましい特性としては、高いモル吸光係数、高い蛍光量子収量、および光安定性が挙げられる。好ましい標識発蛍光団は、スペクトルの紫外範囲（すなわち、４００ｎｍ未満）ではなく、可視範囲（すなわち、４００ｎｍと７５０ｎｍとの間）における吸収および発光波長を示す。 Preferred properties of fluorescent labeling reagents used in the practice of the present invention include high molar extinction coefficient, high fluorescent quantum yield, and photostability. Preferred labeled fluorophores exhibit absorption and emission wavelengths in the visible range (ie, between 400 and 750 nm) rather than in the ultraviolet range of the spectrum (ie, less than 400 nm).
他の実施形態において、羊水の胎児ＲＮＡ（例えば、増幅後、またはｃＤＮＡもしくはｃＲＮＡへの変換後）は、当該分野で周知の、ビオチン−アビジン系の多くのバリエーションのうちの１つにより検出可能にされる。ビオチンＲＮＡ標識キットは、例えば、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）およびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から市販されている。 In other embodiments, amniotic fluid fetal RNA (eg, after amplification or after conversion to cDNA or cRNA) is detectable by one of many variations of the biotin-avidin system well known in the art. Is done. Biotin RNA labeling kits are commercially available from, for example, Roche Applied Science (Indianapolis, IN) and Perkin Elmer (Boston, Mass.).
検出可能な部分はまた、分子ビーコンおよびアプタマービーコンのような生物学的分子であり得る。分子ビーコンは、その５’末端および３’末端に発蛍光団および非蛍光性のクエンチャーを保有する核酸分子である。相補的な核酸鎖の非存在下で、分子ビーコンは、ステム−ループ（すなわちヘアピン）立体配座を採り、この立体配座において、発蛍光団およびクエンチャーは、互いに近接しており、発蛍光団の蛍光を、ＦＲＥＴ（すなわち、蛍光共鳴エネルギー転移）により効率的にクエンチさせる。分子ビーコンへの相補配列の結合は、ステム−ループ構造の開放を生じ、これは、発蛍光団とクエンチャーとの間の物理的距離を増加させ、それによって、ＦＲＥＴ効率を減少させ、蛍光シグナルを放出させる。検出可能な部分としての分子ビーコンの使用は、当該分野で周知である（例えば、Ｄ．Ｌ．Ｓｏｋｏｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５：１１５３８−１１５４３；ならびに米国特許第６，２７７，５８１号および同第６，２３５，５０４号を参照のこと）。アプタマービーコンは、２つ以上の立体配座を採り得るという点を除いて、分子ビーコンと同じである（例えば、Ｏ．Ｋ．Ｋａｂｏｅｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０００，２８：Ｅ９４；Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，２０００，５：３８９−３９６；Ｎ．Ｈａｍａｇｕｃｈｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，２９４：１２６−１３１；Ｓ．Ｋ．ＰｏｄｄａｒおよびＣ．Ｔ．Ｌｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，２００１，１５：１６１−１６７を参照のこと）。 The detectable moiety can also be a biological molecule such as a molecular beacon and an aptamer beacon. Molecular beacons are nucleic acid molecules that possess a fluorophore and a non-fluorescent quencher at their 5 'and 3' ends. In the absence of complementary nucleic acid strands, molecular beacons adopt a stem-loop (ie hairpin) conformation, in which the fluorophore and quencher are in close proximity to each other, and the fluorescence The group fluorescence is efficiently quenched by FRET (ie, fluorescence resonance energy transfer). Binding of the complementary sequence to the molecular beacon results in the opening of the stem-loop structure, which increases the physical distance between the fluorophore and the quencher, thereby decreasing the FRET efficiency and the fluorescent signal. To release. The use of molecular beacons as detectable moieties is well known in the art (see, eg, D. Sokol et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95: 11538-11543; and US Pat. 6,277,581 and 6,235,504). Aptamer beacons are the same as molecular beacons except that they can adopt more than one conformation (see, for example, OK Kaboev et al., Nucleic Acids Res., 2000, 28: E94; R. Yamamoto). Genes Cells, 2000, 5: 389-396; N. Hamaguchi et al., Anal. Biochem., 2001, 294: 126-131; SK Poddar and CT Le, Mol. Cell. Probes, 2001. 15: 161-167).
正常もしくは改変されたヌクレオチドの「テイル」は、検出性の目的のために、核酸フラグメントに追加され得る。テイルに相補的であり、かつ、検出可能な標識（例えば、発蛍光団、酵素または放射標識された塩基）を含む核酸との第２のハイブリダイゼーションは、アレイに結合した核酸フラグメントの可視化を可能にする（例えば、Ｅｎｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹから市販されている系）。 A “tail” of normal or modified nucleotides can be added to the nucleic acid fragment for detection purposes. Second hybridization with nucleic acids that are complementary to the tail and contain a detectable label (eg, fluorophore, enzyme or radiolabeled base) allows visualization of nucleic acid fragments bound to the array (For example, a system commercially available from Enzo Biochem Inc., New York, NY).
特定の核酸標識技術の選択は、状況に依存し、そして、いくつかの因子（例えば、標識法の容易さおよび費用、所望されるサンプル標識の質、ハイブリダイゼーション反応に対する検出可能な部分の効果（例えば、ハイブリダイゼーションプロセスの速度および／または効率）、使用される検出系の性質、検出可能な標識により生じるシグナルの性質および強度など）により支配される。 The choice of a particular nucleic acid labeling technique depends on the situation and there are several factors such as the ease and cost of the labeling method, the quality of the desired sample label, the effect of the detectable moiety on the hybridization reaction ( For example, the speed and / or efficiency of the hybridization process), the nature of the detection system used, the nature and intensity of the signal produced by the detectable label, etc.).
（ＩＩ．羊水に由来する胎児ＲＮＡの分析）
本発明の方法の実施は、胎児ＲＮＡに関する情報を得るための、羊水の胎児ＲＮＡを分析する工程を包含する。特定の実施形態において、羊水の胎児ＲＮＡを分析する工程は、胎児ＲＮＡの量、濃度または配列組成を決定する工程を包含する。
(II. Analysis of fetal RNA derived from amniotic fluid)
Implementation of the method of the present invention involves analyzing amniotic fluid fetal RNA to obtain information about fetal RNA. In certain embodiments, analyzing the amniotic fluid fetal RNA comprises determining the amount, concentration or sequence composition of fetal RNA.
羊水の胎児ＲＮＡは、任意の種々の方法によって分析され得る。ＲＮＡの分析方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，１９８９，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；および「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，２００２，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），第５版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓを参照のこと）。 Amniotic fluid fetal RNA can be analyzed by any of a variety of methods. Methods for analyzing RNA are well known in the art (see, for example, J. Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 1989, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York, NY; in Molecular Biology ", 2002, FM Ausubel (ed.), 5th edition, John Wiley & Sons).
例えば、羊水から抽出された胎児ＲＮＡの量および濃度は、ＵＶ分光法により評価され得、この方法において、希釈されたＲＮＡサンプルの吸光度が、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおいて測定される（Ｗ．Ｗ．Ｗｉｌｆｉｎｇｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７，２２：４７４−４８１）。定量的測定はまた、例えば、核酸に結合すると大きな蛍光増強を示す、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから市販されている）のような特定の蛍光色素を使用して実施され得る。これらの蛍光色素で標識されたＲＮＡは、標準的な蛍光光度計、蛍光マイクロプレートリーダーまたはフィルター蛍光光度計を使用して検出され得る。 For example, the amount and concentration of fetal RNA extracted from amniotic fluid can be assessed by UV spectroscopy, in which the absorbance of diluted RNA samples is measured at 260 nm and 280 nm (WW Wilinger et al. , Biotechniques, 1997, 22: 474-481). Quantitative measurements can also be performed using specific fluorescent dyes, such as, for example, RiboGreen® (commercially available from Molecular Probes, Eugene, OR) that exhibits significant fluorescence enhancement when bound to nucleic acids. . RNA labeled with these fluorochromes can be detected using a standard fluorometer, a fluorescent microplate reader or a filter fluorometer.
羊水の胎児ＲＮＡはまた、配列決定により分析され得る。例えば、ＲＮａｓｅ Ｔ１（２段階機構においてグアノシン残基の３’側で一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する）が、変性したＲＮＡを消化するために使用され得る。従って、３’もしくは５’が標識されたＲＮＡの、この酵素による部分的な消化は、Ｇ残基のラダーを生じる。切断は、放射活性の検出系（Ｍ．Ｉｋｅｈａｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６，８３：４６９５−４６９９）、もしくは光度計測の検出系（Ｈ．Ｐ．Ｇｒｕｎｅｒｔら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１９９３，６：７３９−７４４）によってか、ザイモグラムアッセイ（Ｊ．Ｂｒａｖｏら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９４，２１９：８２−８６）、寒天拡散法（Ｒ．Ｑｕａａｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８９，１７：３３１８）、ランタンアッセイ（ｌａｎｔｈａｎ ａｓｓａｙ）（Ｃ．Ｂ．Ａｎｆｉｎｓｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５４，２０７：２０１−２１０）、またはメチレンブルー試験（Ｔ．Ｇｒｅｉｎｅｒ−Ｓｔｏｅｆｆｅｌｅら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，２４０：２４−２８）によってか、あるいは、蛍光相関分光法（Ｋ．Ｋｏｒｎら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，３８１：２５９−２６３）によってモニタリングされ得る。 Amniotic fluid fetal RNA can also be analyzed by sequencing. For example, RNase T1 (which specifically cleaves single-stranded RNA on the 3 'side of a guanosine residue in a two-step mechanism) can be used to digest denatured RNA. Thus, partial digestion of 3 'or 5' labeled RNA by this enzyme results in a ladder of G residues. Cleavage can be performed using a radioactive detection system (M. Ikehara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83: 4695-4699) or a photometric detection system (HP Grunert et al., Protein Eng. , 1993, 6: 739-744) or by zymogram assay (J. Bravo et al., Anal. Biochem., 1994, 219: 82-86), agar diffusion method (R. Quaas et al., Nucl. Acids Res., 1989). 17: 3318), lanthanum assay (CB Anfinsen et al., J. Biol. Chem., 1954, 207: 201-210), or methylene blue test (T. Greiner-Steffele et al., Anal. Bioch). m, 1996,240:. 24-28) or by or fluorescence correlation spectroscopy (K.Korn et al, Biol.Chem, 2000,381:. 259-263) can be monitored by.
ＲＮＡ分子の特性および生化学的な役割は、ＲＮＡの配列によってだけではなく、その折り畳まれた構造によっても決定されるので、羊水の胎児ＲＮＡの分析はまた、ＲＮＡ構造の決定も含み得る。ＲＮＡの構造分析の方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｊ．Ｎ．Ｖｏｕｒｎａｋｉｓら，Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆ．Ａｎａｌ．，１９８１，２：２６７−２９８；Ｇ．Ｋｎａｐｐ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８９，１８０：１９２−２１２；Ａ．Ｅ．Ｗａｌｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１：９２１８−９２２２を参照のこと）。このような分析は、配列選択的なリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ａ（一本鎖Ｃ残基およびＵ残基の３’を切断する）、ＲＮａｓｅ Ｖ１（ＲＮＡの二本鎖領域内のヌクレオチド間を優先的に切断する）、およびＲＮａｓｅ Ｔ１を使用して実施され得る。 Since the properties and biochemical roles of RNA molecules are determined not only by the sequence of the RNA, but also by its folded structure, analysis of amniotic fluid fetal RNA can also include determination of RNA structure. Methods for structural analysis of RNA are known in the art (eg, JN Vournakis et al., Gene Amplif. Anal., 1981, 2: 267-298; G. Knapp, Methods Enzymol., 1989, 180: 192-212; AE Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 9218-9222). Such analysis is based on sequence-selective ribonucleases (eg, RNase A (which cleaves 3 ′ of single-stranded C and U residues), RNase V1 (preferably between nucleotides in the double-stranded region of RNA). And can be performed using RNase T1.
羊水の胎児ＲＮＡを分析するための他の方法としては、ノーザンブロット（この方法において、分析されるＲＮＡサンプルの成分は、検出前にサイズにより分離され、それによって、１つ以上の種を同時に同定することを可能にする）、およびスロット／ドットブロット（ｓｌｏｔ／ｄｏｔ ｂｌｏｔｓ）（この方法において、分離されていない混合物が使用される）が挙げられる。 Other methods for analyzing amniotic fluid fetal RNA include Northern blots (in which the components of the RNA sample to be analyzed are separated by size prior to detection, thereby simultaneously identifying one or more species). And slot / dot blots (in this method an unseparated mixture is used).
特定の実施形態において、羊水の胎児ＲＮＡを分析する工程は、遺伝子発現分析に抽出されたＲＮＡを供する工程を包含する。好ましくは、これは、複数の遺伝子の同時分析を含む。 In certain embodiments, analyzing amniotic fluid fetal RNA comprises providing the extracted RNA for gene expression analysis. Preferably this involves simultaneous analysis of multiple genes.
例えば、羊水の胎児ＲＮＡ分析は、Ｙ染色体から転写される胎児ＲＮＡの存在、父親もしくは母親のいずれかから遺伝される、遺伝子もしくは他のＤＮＡ配列から転写される、胎児ＲＮＡの存在、または、臨床状態に関連することが公知の遺伝子から転写される胎児ＲＮＡの存在の検出を含み得る。 For example, amniotic fluid fetal RNA analysis may include the presence of fetal RNA transcribed from the Y chromosome, the presence of fetal RNA transcribed from genes or other DNA sequences inherited from either the father or mother, or clinical It may include detection of the presence of fetal RNA transcribed from a gene known to be associated with the condition.
例えば、羊水の胎児ＲＮＡ分析は、Ｙ染色体特異的なジンクフィンガータンパク質（ＺＦＹ）ｍＲＮＡの検出を含み得る（例えば、Ｄ．Ｃ．Ｐａｇｅら，Ｃｅｌｌ，１９８７，５１：１０９１−１１０４；およびＭ．Ｓ．Ｐａｌｍｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：１６８１−１６８５を参照のこと）。このような分析の結果は、胎児の性別の識別をもたらす。 For example, amniotic fluid fetal RNA analysis may involve detection of Y chromosome specific zinc finger protein (ZFY) mRNA (eg, DC Page et al., Cell, 1987, 51: 1091-1104; and MS Palmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 1681-1685). The results of such an analysis result in fetal gender identification.
羊水の胎児ＲＮＡ分析は、第６染色体上の遺伝子から転写されるＲＮＡの存在の検出を含み得る。ヒト第６染色体は、免疫応答に必須の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）をコードすることが知られている。特に、この分析は、母性−胎児界面において、胎児組織で主に発現する非古典的なヒト白血病抗原である、ＨＬＡ−Ｇから転写されるＲＮＡの存在の検出を含み得る（Ａ．ＩｓｈｉｔａｎｉおよびＤ．Ｅ．Ｇｅｒａｇｈｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９：３９４７−３９５１；Ｓ．Ｅ．Ｈｉｂｙら，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１９９９，５３：１−１３）。いくつかの研究は、ＨＬＡ−Ｇが妊娠の確立および／または維持において決定的な相互作用に関与し得ることを示唆している。（Ｎ．Ｈａｒａら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，３６：３４９−３５８；Ｋ．Ｈ．Ｌｉｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９９７，１５１：１８０９−１８１８；Ｋ．Ａ．Ｐｆｅｉｆｆｅｒら，Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２００１，７：３７３−３７８）。ＨＬＡ−Ｇから転写されるＲＮＡの存在の検出は、例えば、保健提供者に流産に対する予防を進言させ得る。 Amniotic fluid fetal RNA analysis can include detection of the presence of RNA transcribed from a gene on chromosome 6. Human chromosome 6 is known to encode a major histocompatibility complex (MHC) essential for the immune response. In particular, this analysis may involve the detection of the presence of RNA transcribed from HLA-G, a non-classical human leukemia antigen that is predominantly expressed in fetal tissue at the maternal-fetal interface (A. Ishitani and D E. Geragty, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 3947-3951; SE Hiby et al., Tissue Antigens, 1999, 53: 1-13). Some studies suggest that HLA-G may be involved in critical interactions in the establishment and / or maintenance of pregnancy. (N. Hara et al., Am. J. Reprod. Immunol., 1996, 36: 349-358; K. H. Lim et al., Am. J. Pathol., 1997, 151: 1809-1818; KA Pfeiffer. Et al., Mol.Hum.Reprod., 2001, 7: 373-378). Detection of the presence of RNA transcribed from HLA-G can, for example, encourage health providers to prevent miscarriage.
羊水の胎児ＲＮＡ分析は、胎児肺発生のモニタリング様式としての界面活性剤遺伝子の発現レベルの検出および決定を包含し得る。 Amniotic fluid fetal RNA analysis may include detection and determination of surfactant gene expression levels as a monitoring modality of fetal lung development.
疾患または状態と関連することが公知の遺伝子から転写されるＲＮＡの存在の検出は、出生前診断を提供するために使用され得る。 Detection of the presence of RNA transcribed from a gene known to be associated with a disease or condition can be used to provide a prenatal diagnosis.
特定の遺伝子から転写されるＲＮＡの存在または非存在を検出するために行われる分析において、その検出は、種々の物理的方法、免疫学的方法および生化学的方法のいずれかにより行われ得る。このような方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｓ１分析およびＲＮａｓｅ保護アッセイのような酵素分解からの保護が挙げられ、これらの方法において、標識核酸プローブに対するハイブリダイゼーションの次に、プローブの一本鎖領域の酵素的分解、ならびに分解から保護されるプローブの量および長さの分析が行われる。ＴａｑＭａｎアッセイ（クエンチされる蛍光色素系）はまた、標的化ｍＲＮＡレベルを定量するために使用され得る（例えば、Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．，１９９５，４：３５７−３６２を参照のこと）。 In an analysis performed to detect the presence or absence of RNA transcribed from a particular gene, the detection can be performed by any of a variety of physical, immunological and biochemical methods. Such methods are well known in the art and include, for example, protection from enzymatic degradation, such as S1 analysis and RNase protection assays, in these methods, following hybridization to a labeled nucleic acid probe, An enzymatic degradation of the single stranded region and an analysis of the amount and length of the probe protected from degradation are performed. The TaqMan assay (quenched fluorochrome system) can also be used to quantify targeted mRNA levels (see, eg, KJ Livak et al., PCR Methods Appl., 1995, 4: 357-362). thing).
他の方法は、ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの分析に基づき、その方法は、ＲＮＡ以外の分解に対して高感度でなく、従って、取り扱いやすい。これらの方法は、発現された配列タグ（ＥＳＴ）クローンライブラリーのｃＤＮＡ挿入物の配列決定（例えば、Ｍ．Ｄ．Ａｄａｍｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５２：１６５１−１６５６を参照のこと）および遺伝子発現の連続分析（ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（またはＳＡＧＥ）（この分析は、多量の転写物の定量かつ同時の分析を可能にする）（例えば、米国特許第５，８６６，３３０号；Ｖ．Ｅ．Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０：４８４−４８７；およびＺｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７６：１２６８−１２７２を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。これら２つの方法は、所定のセットに焦点を当てるというよりも、むしろサンプル中のｍＲＮＡの全範囲を精査する。 The other method is based on the analysis of cDNA derived from mRNA, which is not sensitive to degradation other than RNA and is therefore easy to handle. These methods include sequencing of cDNA inserts of expressed sequence tag (EST) clone libraries (see, eg, MD Adams et al., Science, 1991,252: 1651-1656) and gene expression. Serial analysis of gene expression (or SAGE) (this analysis allows quantitative and simultaneous analysis of large amounts of transcripts) (eg, US Pat. No. 5,866,330; VE Velculescu et al., Science, 1995, 270: 484-487; and Zhang et al., Science, 1997, 276: 1268-1272), but are not limited to these. These two methods examine the entire range of mRNA in the sample rather than focusing on a given set.
ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの分析の他の方法としては、逆転写酵素媒介ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）遺伝子発現アッセイが挙げられる。これらの方法は、特定の標的遺伝子生成物に指向され、非常に少量の転写物の定性的（非定量的）検出を可能にする（例えば、Ｓ．Ｓｕら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７，２２：１１０７−１１１３を参照のこと）。これらの方法の変形例（競合的ＲＴ−ＰＣＲといわれ、この方法において、既知量の外因テンプレートが内部コントロールとして添加される）は、定量的測定を可能にするように開発された（例えば、Ｍ．Ｂｅｋｅｒ−ＡｎｄｒｅおよびＫ．Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８９，１７：９４３７−９３４６；Ａ．Ｍ．Ｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：９７１７−９７２１；Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：２７２５−２７２９を参照のこと）。 Other methods of analyzing cDNA derived from mRNA include reverse transcriptase mediated PCR (RT-PCR) gene expression assays. These methods are directed to specific target gene products and allow qualitative (non-quantitative) detection of very small amounts of transcripts (eg, S. Su et al., BioTechniques, 1997, 22: 1107- 1113). A variation of these methods (referred to as competitive RT-PCR, in which a known amount of exogenous template is added as an internal control) was developed to allow quantitative measurements (eg, M Beker-Andre and K. Hahlblock, Nucl. Acids Res., 1989, 17: 9437-9346; See Gillian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 2725-2729).
ｍＲＮＡ分析はまた、ディファレンシャルディスプレイ逆転写酵素ＰＣＲ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ；例えば、Ｐ．ＬｉａｎｇおよびＡ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５７：９６７−９７１を参照のこと）またはＲＮＡ任意プライムＰＣＲ（ＲＮＡ ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）（ＲＡＰ−ＣＰＲ；例えば、Ｊ．Ｗｅｌｓｈら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：４９６５−４９７０を参照のこと）により行われ得る。これらの方法において、転写物のＲＴ−ＰＣＲフィンガープリントプロフィールは、ランダムプライミングによって生成され、差次的に発現される遺伝子は、２つのサンプル間のフィンガープリントプロフィールにおける変化として現れる。差次的に発現される遺伝子の同定は、さらなる操作を要する（すなわち、ゲルの適切なバンドを切り出し、サブクローニングし、配列決定し、配列データベース中の遺伝子に適合させなければならない）。 mRNA analysis also includes differential display reverse transcriptase PCR (DDRT-PCR; see, for example, P. Liang and AB Pardee, Science, 1992, 257: 967-971) or RNA random prime PCR (RNA arbitrary primed PCR) (RAP-CPR; see, for example, J. Welsh et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 4965-4970). In these methods, the RT-PCR fingerprint profile of the transcript is generated by random priming and the differentially expressed gene appears as a change in the fingerprint profile between the two samples. Identification of differentially expressed genes requires further manipulation (ie, the appropriate band on the gel must be excised, subcloned, sequenced, and matched to the genes in the sequence database).
（ＩＩＩ．羊水の胎児ＲＮＡのアレイベースの遺伝子発現分析）
特定の実施形態において、本発明の方法は、羊水の胎児ＲＮＡをアレイベースの遺伝子発現分析に供する工程を包含する。
(III. Array-based gene expression analysis of amniotic fluid fetal RNA)
In certain embodiments, the methods of the invention include subjecting amniotic fluid fetal RNA to array-based gene expression analysis.
（アレイベースの遺伝子発現分析）
伝統的な分子生物学法（例えば、上記の方法の大部分）は、代表的には、１回の実験あたり１つの遺伝子を評価し、これらの実験により、全体のスループットが有意に制限され、遺伝子機能の広いイメージを得ることが妨げられる。ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ（遺伝子発現マイクロアレイともいわれる）に基づく技術（これは、より最近になって開発された）は、配列（遺伝子／遺伝子変異）の同定および遺伝子の遺伝子発現レベル（量）の決定を介して、数千もの遺伝子を同時にモニターすることが可能になるという利点を提供する（例えば、Ａ．ＭａｒｓｈａｌｌおよびＪ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９８，１６：２７−３１；Ｇ．Ｒａｍｓａｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９８，１６：４０−４４；Ｒ．ＥｋｉｎｓおよびＲ．Ｗ．Ｃｈｕ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９９，１７：２１７−２１８；ならびにＤ．Ｊ．ＬｏｃｋｈａｒｔおよびＥ．Ａ．Ｗｉｎｚｅｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０５：８２７〜８３６を参照のこと）。
(Array-based gene expression analysis)
Traditional molecular biology methods (eg, most of the methods described above) typically evaluate one gene per experiment, and these experiments significantly limit overall throughput, Obtaining a broad image of gene function is hindered. Technology based on DNA arrays or microarrays (also called gene expression microarrays), which was developed more recently, identifies sequences (genes / gene mutations) and determines gene expression levels (amounts) of genes Provides the advantage that thousands of genes can be monitored simultaneously (eg A. Marshall and J. Hodgson, Nature Biotech., 1998, 16: 27-31; G. Ramsay, Nature Biotech). , 1998, 16: 40-44; R. Ekins and RW Chu, Trends in Biotech., 1999, 17: 217-218; and DJ Lockhart and EA Winzeler, Nature, 2000, 40 5: 827-836).
遺伝子発現実験の原理は、単純である：実験サンプルのｍＲＮＡに由来する標識ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡの標的を、固体支持体に固定化された核酸にハイブリダイズさせる。各ＤＮＡ位置と関連づけられた標識の量をモニターすることによって、示される各ｍＲＮＡ種の量を推論することが可能である。 The principle of gene expression experiments is simple: a labeled cDNA or cRNA target derived from the mRNA of an experimental sample is hybridized to nucleic acid immobilized on a solid support. By monitoring the amount of label associated with each DNA location, it is possible to infer the amount of each mRNA species shown.
アレイにされたＤＮＡ配列の性質に関して、ＤＮＡマイクロアレイ技術の２つの標準的な型が存在する。第１の形式において、プローブｃＤＮＡ配列（代表的には、５００〜５，０００塩基長）は、固体表面に固定化され、別個にまたは混合物中で複数の標的に曝される。第２の形式においては、オリゴヌクレオチド（代表的には、２０〜８０マーのオリゴ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブが、インサイチュで（すなわち、チップ上で直接）または従来の合成後に、チップへの結合されるかのいずれかで合成され、次いで、核酸の標識サンプルに曝される。 With respect to the nature of the arrayed DNA sequences, there are two standard types of DNA microarray technology. In the first format, probe cDNA sequences (typically 500-5,000 bases long) are immobilized on a solid surface and exposed to multiple targets separately or in a mixture. In the second format, oligonucleotides (typically 20-80 mer oligos) or peptide nucleic acid (PNA) probes are transferred to the chip either in situ (ie directly on the chip) or after conventional synthesis. It is synthesized either bound, and then exposed to a labeled sample of nucleic acid.
本発明の方法における分析工程は、アレイベースの遺伝子発現分析を行うために、種々の方法、手段およびこれらの変形例のいずれかを使用して行われ得る。アレイベースの遺伝子発現方法は、当該分野で公知であり、多くの科学刊行物ならびに特許において記載されてきた（例えば、Ｍ．Ｓｃｈｅｎａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０：４６７−４７０；Ｍ．Ｓｃｈｅｎａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３：１０６１４−１０６１９；Ｊ．Ｊ．Ｃｈｅｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９８，５１：３１３−３２４；米国特許第５，１４３，８５４号；同第５，４４５，９３４号；同第５，８０７，５２２号；同第５，８３７，８３２号；同第６，０４０，１３８号；同第６，０４５，９９６号；同第６，２８４，４６０号；および同第６，６０７，８８５号を参照のこと）。 The analysis step in the methods of the present invention can be performed using any of a variety of methods, means and variations thereof to perform array-based gene expression analysis. Array-based gene expression methods are known in the art and have been described in many scientific publications as well as patents (eg, M. Schena et al., Science, 1995, 270: 467-470; M. Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 10614-10619; JJ Chen et al., Genomics, 1998, 51: 313-324; No. 5,807,522; No. 5,837,832; No. 6,040,138; No. 6,045,996; No. 6,284,460; No. 6,607,885).
アレイベースの遺伝子発現方法が開発され、医学研究および臨床研究において使用されてきた（例えば、癌において（例えば、Ｊ．ＤｅＲｉｓｉら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９６，１４：４５７−４６０；Ｓ．Ｍｏｈｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００２，２０：３１６５−３１７５を参照のこと）；乳癌研究において（例えば、Ｃ．Ｓ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，３：１５８−１７５による総説を参照のこと）；脳腫瘍において（例えば、Ｓ．Ｂ．ＨｕｎｔｅｒおよびＣ．Ｓ．Ｍｏｒｅｎｏ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．，２００２，７：ｃ７４−ｃ８２を参照のこと）；口部癌において（例えば、Ｒ．ＴｏｄｄおよびＤ．Ｔ．Ｗｏｎｇ，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，２００２，８１：８９−９７を参照のこと）；島の生物学および糖尿病研究において（例えば、Ｅ．Ｂｅｒｎａｌ−Ｍｉｚｒａｃｈｉら，Ｄａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，２００３，１９：３２−４２を参照のこと）；肺線維症、喘息、急性肺傷害および肺気腫の研究において（例えば、Ｍ．Ｗ．Ｇｅｒａｃｉら，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．，２００１，２：２１０−２１５；およびＤ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｃｈｅｓｔ，２００２，１２１：２１Ｓ−２５Ｓを参照のこと）；耳鼻咽喉−頭部および頸部の外科手術において（例えば、Ｍ．Ｅ．ＷｈｉｐｐｌｅおよびＷ．Ｐ．Ｋｕｏ，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．，２００２，１２７：１９６−２０４を参照のこと）；脳障害において（例えば、Ｐ．Ｄ．ＳｈｉｌｌｉｎｇおよびＪ．Ｒ．Ｋｅｌｓｏｅ，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００２，３：３１−４５を参照のこと）；腎臓生物学および医療において（例えば、Ｍ．Ｅｉｋｍａｎｓら，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，２００２，６２：１１２５−１１３５；Ｃ．Ｄ．ＣｏｈｅｎおよびＭ．Ｋｒｅｔｚｌｅｒ，Ｎｅｐｈｒｏｎ．，２００２，９２：５２２−５２８；ならびにＥ．Ｐ．Ｂｏｔｔｉｎｇｅｒら，Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２００２，１０：９３−１０１を参照のこと）；血液病学において（例えば、Ｊ．Ｗａｌｋｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２００２，９：２３−２９を参照のこと）；薬理ゲノム学的研究において（例えば、Ｍ．Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９９，５：７５３−７６７；およびＰ．Ｅ．Ｂｌｏｗｅｒら，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎ．Ｊ．，２００２，２：２５９−２７１を参照のこと）；創薬において（例えば、Ｃ．ＤｅｂｏｕｋおよびＰ．Ｎ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９９，２１：４８−５０；ならびにＡ．Ｂｕｔｔｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，２００２，１：９５１−９６０を参照のこと）；精神障害に関与する新規遺伝子発見のためのツールとして（例えば、Ａ．Ｂ．ＮｉｃｕｌｅｓｃｕおよびＪ．Ｒ．Ｋｅｌｓｏｅ，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．，２００１，３３：２６３−２７１を参照のこと）；ウイルスに感染した宿主細胞における遺伝子発現を研究するため（例えば、Ｊ．Ｈ．Ｎａｍら，Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．，２００２，４６：１４１−１４６を参照のこと）；神経系における遺伝子発現を研究するため（例えば、Ｔ．Ｊ．Ｓｅｎｄｅｒａら，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００２，２７：１００５−１０２６；Ｒ．Ｓ．Ｇｒｉｆｆｉｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，２００３，４：１０５を参照のこと）、ならびに感染性疾患の病因における遺伝子の機構的役割を解明および解釈するため（例えば、Ｍ．Ｋａｔｏ−Ｍａｅｄａら，Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００１，３：７１３〜７１９を参照のこと）。 Array-based gene expression methods have been developed and used in medical and clinical research (eg, in cancer (eg, J. DeRisi et al., Nat. Genet., 1996, 14: 457-460; S. Mohr et al. , J. Clin. Oncol., 2002, 20: 3165-3175); in breast cancer research (see, eg, review by CS Cooper, Breast Cancer Res., 2001, 3: 158-175). In brain tumors (see, eg, SB Hunter and CS Moreno, Front Biosci., 2002, 7: c74-c82); in oral cancer (eg, R. Todd and D. C. T. Wong, J. Dent. Res., 2002, 81: 8 -97); in islet biology and diabetes studies (see, eg, E. Bernal-Mizrachi et al., Dabetes Metab. Res. Rev., 2003, 19: 32-42); In studies of asthma, acute lung injury and emphysema (see, eg, MW Gerachi et al., Respir. Res., 2001, 2: 210-215; and D. Sheppard, Chest, 2002, 121: 21S-25S. In otolaryngology-head and neck surgery (see, for example, ME Whipple and WP Kuo, Otalyarynol. Head Neck Surg., 2002, 127: 196-204). In brain disorders (eg PD Shillin And JR Kelsoe, Pharmacogenomics, 2002, 3: 31-45); in kidney biology and medicine (eg, M. Eikmans et al., Kidney Int., 2002, 62: 1125-1135; C.I. (See D. Cohen and M. Kretzler, Nephron., 2002, 92: 522-528; and EP Bottinger et al., Exp. Nephrol., 2002, 10: 93-101); See, for example, J. Walker et al., Curr. Opin. Hematol., 2002, 9: 23-29); in pharmacogenomic studies (eg, M. Srivastava et al., Mol. Med., 1999, 5: 753-767; and P. E. Blower et al., Pharmacogen. J. et al. , 2002, 2: 259-271); in drug discovery (e.g., C. Debouk and PN Goodfellow, Nat. Genet., 1999, 21: 48-50; and A. Butte, Nat. Rev. Drug Discov., 2002, 1: 951-960); as a tool for discovery of new genes involved in mental disorders (eg, AB Niculescu and JR Kelsoe, Ann. Med) , 2001, 33: 263-271); to study gene expression in virus-infected host cells (see, eg, JH Nam et al., Acta Virol., 2002, 46: 141-146). See); to study gene expression in the nervous system (see, eg, T. et al. J. Sendera et al., Neurochem. Res., 2002, 27: 1005-1026; R. G. Griffin et al., Genome Biol., 2003, 4: 105), and the mechanism of genes in the pathogenesis of infectious diseases. To elucidate and interpret the general role (see, for example, M. Kato-Maeda et al., Cell Microbiol., 2001, 3: 713-719).
本発明の実施において、これらの方法ならびにアレイベースの遺伝子発現分析を行うために当該分野で公知の他の方法は、これらの方法が、遺伝子発現の胎児ｍＲＮＡレベルを評価することを可能にするように、記載されるように使用されるか、または改変され得る。 In the practice of the present invention, these methods as well as other methods known in the art for performing array-based gene expression analysis allow these methods to assess fetal mRNA levels of gene expression. Can be used or modified as described.
胎児において遺伝子発現を確立するための本発明の他の方法は、以下の工程を包含する：羊水の胎児ＲＮＡの試験サンプルを提供する工程であって、ここでその胎児ＲＮＡは、妊婦から得られた羊水のサンプルに由来し、その試験サンプルは、検出可能な薬剤で標識された複数の核酸セグメントを含む、工程；複数の遺伝子プローブを含む遺伝子発現アレイを提供する工程であって、ここで各遺伝子プローブは、基材表面上の別個のスポットに固定化されて、アレイを形成する、工程；そのアレイと、その試験サンプルとを、そのサンプル中の核酸セグメントがそのアレイ上の遺伝子プローブに特異的にハイブリダイズする条件下で接触させる工程；その試験サンプルの個々の核酸セグメントが、そのアレイ上に固定化された個々の遺伝子プローブに結合したことを決定して、結合パターンを得る工程；ならびにその得られた結合パターンに基づいて、その胎児についての遺伝子発現パターンを確立する工程。 Another method of the invention for establishing gene expression in a fetus includes the following steps: providing a test sample of amniotic fluid fetal RNA, wherein the fetal RNA is obtained from a pregnant woman. A test sample comprising a plurality of nucleic acid segments labeled with a detectable agent; providing a gene expression array comprising a plurality of gene probes, wherein each The gene probes are immobilized in separate spots on the substrate surface to form an array; the array and the test sample, the nucleic acid segments in the sample being specific for the gene probes on the array Contacting under conditions of selective hybridization; the individual nucleic acid segments of the test sample are immobilized on the individual gene sequences immobilized on the array. Determine that bound to over blanking, obtaining a binding pattern; and based on the resulting bond pattern, establishing a gene expression pattern for that fetus.
（試験サンプル）
好ましくは、アレイベースの遺伝子分析方法によって分析される羊水の胎児ＲＮＡは、上記のように、羊水のサンプルから単離される。本発明の方法において使用される、羊水の胎児ＲＮＡの試験サンプルは、検出可能な薬剤で標識された複数の核酸フラグメントを含む。
(Test sample)
Preferably, amniotic fluid fetal RNA analyzed by an array-based genetic analysis method is isolated from a sample of amniotic fluid as described above. The test sample of amniotic fluid fetal RNA used in the methods of the present invention comprises a plurality of nucleic acid fragments labeled with a detectable agent.
抽出された胎児ＲＮＡは、増幅され得、逆転写され得、標識され得、フラグメント化され得、精製され得、濃縮され得、そして／または遺伝子発現分析の前に、別な方法で改変され得る。核酸の操作のための技術は、当該分野で周知であり、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，１９８９，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，１９９０，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ）」，１９９３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ；「ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」，１９９５，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ならびに「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，２００２，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），第５版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓを参照のこと。 The extracted fetal RNA can be amplified, reverse transcribed, labeled, fragmented, purified, concentrated, and / or otherwise modified prior to gene expression analysis. . Techniques for manipulation of nucleic acids are well known in the art, see, for example, J. Org. Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 1989, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York, NY; A. Innis (ed.), Academic Press: New York, NY; Tijsssen “Hybridization with Nucleic Acid Probes—Laboratory Technologies in Biochemistry and Molecular Biology (Parts I and II)”, 1993, ElsevierSci. A. Innis (ed.), Academic Press: New York, NY; and “Short Protocols in Molecular Biology”, 2002, F.A. M.M. See Ausubel (ed.), 5th edition, John Wiley & Sons.
特定の好ましい実施形態において、アレイベースの遺伝子発現分析の分離能を改善するために、その試験サンプルの核酸フラグメントは、約５００塩基長未満、好ましくは、約２００塩基長未満である。小さなフラグメントを使用することによって、小さな差異の検出または独特の配列の検出の信頼性が有意に増す。 In certain preferred embodiments, in order to improve the resolution of array-based gene expression analysis, the nucleic acid fragment of the test sample is less than about 500 bases in length, preferably less than about 200 bases in length. By using small fragments, the reliability of detecting small differences or detecting unique sequences is significantly increased.
ＲＮＡフラグメント化の方法は、当該分野で公知であり、以下が挙げられる：リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｖ１およびＲＮａｓｅ Ａ）での処理、超音波処理（例えば、Ｐ．Ｌ．Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８３，１２９：２１６−２２３を参照のこと）、機械的剪断など（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，１９８９，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｐａｒｔｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ）」，１９９３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃ．Ｐ．Ｏｒｄａｈｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９７６，３：２９８５−２９９９；Ｐ．Ｊ．Ｏｅｆｎｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９６，２４：３８７９−３８８６；Ｙ．Ｒ．Ｔｈｏｒｓｔｅｎｓｏｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９８，８：８４８−８５５を参照のこと）が挙げられる。そのＲＮＡのランダム酵素消化により、２５〜３０塩基低五の長さを含むフラグメントがもたらされる。 Methods of RNA fragmentation are known in the art and include the following: treatment with ribonucleases (eg RNase T1, RNase V1 and RNase A), sonication (eg PL Deininger, Anal. Biochem., 1983, 129: 216-223), mechanical shearing, etc. (eg, J. Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 1989, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory: York; P. Tijssen “Hybridization with Nucleic Acid Probes—Laboratory Technologies in Bio hemistry and Molecular Biology (Parts I and II) ", 1993, Elsevier Science; CP Ordahl et al., Nucleic Acids Res. 24: 3879-3886; see Y. R. Horstenson et al., Genome Res., 1998, 8: 848-855). Random enzymatic digestion of the RNA results in a fragment containing 25-30 bases low length.
その試験サンプル中の核酸セグメントのフラグメントサイズは、種々の技術（例えば、電気泳動（例えば、Ｂ．Ａ．ＳｉｌｅｓおよびＧ．Ｂ．Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１９９７，７７１：３１９−３２９を参照のこと）またはマトリクス補助レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（例えば、Ｎ．Ｈ．Ｃｈｉｕら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ，Ｒｅｓ．，２０００，２８：Ｅ３１を参照のこと））のいずれかにより評価され得る。 The fragment size of the nucleic acid segment in the test sample can be determined by various techniques (eg, electrophoresis (see, eg, BA Siles and GB Collier, J. Chromatogr. A, 1997, 771: 319-329). Or matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (see, eg, NH Chiu et al., Nucl. Acids, Res., 2000, 28: E31)). .
本発明の方法の実施において、羊水の胎児ＲＮＡの試験サンプルは、分析前に標識される。検出可能な薬剤で核酸を標識する適切な方法は、上記で詳細に記載されている。 In practicing the method of the present invention, a test sample of amniotic fluid fetal RNA is labeled prior to analysis. Suitable methods for labeling nucleic acids with detectable agents are described in detail above.
ハイブリダイゼーション前に、その試験サンプルの標識核酸フラグメントは、ハイブリダイゼーション緩衝液中で再懸濁する前に、精製かつ濃縮され得る。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ３０カラムを使用して、一工程でサンプルを精製かつ濃縮し得る。あるいは、核酸は、膜カラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎカラム）またはセファデックスＧ５０を使用して精製され得、エタノールの存在下で沈殿され得る。 Prior to hybridization, the labeled nucleic acid fragment of the test sample can be purified and concentrated prior to resuspension in hybridization buffer. A Microcon 30 column can be used to purify and concentrate the sample in one step. Alternatively, the nucleic acid can be purified using a membrane column (eg, Qiagen column) or Sephadex G50 and precipitated in the presence of ethanol.
遺伝子発現アレイハイブリダイゼーション実験のための核酸サンプルの調製方法は、当業者によって容易に実行および／または改変され得る。 Methods for preparing nucleic acid samples for gene expression array hybridization experiments can be readily implemented and / or modified by those skilled in the art.
（遺伝子発現ハイブリダイゼーションアレイ）
種々のアレイのうちのいずれかが、本発明の実施において使用され得る。研究者らは、市販のアレイに頼るかまたは彼ら自身で作製するかのいずれかであり得る。アレイを作製および使用する方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓ．ＫｅｒｎおよびＧ．Ｍ．Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７，２３：１２０−１２４；Ｍ．Ｓｃｈｕｍｍｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７，２３：１０８７−１０９２；Ｓ．Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏら，Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ＆Ｃａｎｃｅｒ，１９９７，２０：３９９−４０７；Ｍ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，８：Ｒ１７１−Ｒ１７４；Ｄ．Ｄ．Ｂｏｗｔｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．，１９９９，Ｓｕｐｐ．２１：２５−３２；Ｓ．Ｊ．ＷａｔｓｏｎおよびＨ．Ａｋｉｌ，Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．，１９９９，４５：５３３−５４３；Ｗ．Ｍ．Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０００，２９：１０４２−１０４６および１０４８−１０５５；Ｄ．Ｊ．ＬｏｃｋｈａｒｔおよびＥ．Ａ．Ｗｉｎｚｅｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０５：８２７−８３６；Ｍ．Ｃｕｚｉｎ，Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８：２９１−２９６；Ｐ．Ｐ．Ｚａｒｒｉｎｋａｒら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００１，１１：１２５６−１２６１；Ｍ．ＧａｂｉｇおよびＧ．Ｗｅｇｒｚｙｎ，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．，２００１，４８：６１５−６２２；ならびにＶ．Ｇ．Ｃｈｅｕｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４０：９５３−９５８を参照のこと；例えば、米国特許第５，１４３，８５４号；同第５，４３４，０４９号；同第５，５５６，７５２号；同第５，６３２，９５７号；同第５，７００，６３７号；同第５，７４４，３０５号；同第５，７７０，４５６号；同第５，８００，９９２号；同第５，８０７，５２２号；同第５，８３０，６４５号；同第５，８５６，１７４号；同第５，９５９，０９８号；同第５，９６５，４５２号；同第６，０１３，４４０号；同第６，０２２，９６３号；同第６，０４５，９９６号；同第６，０４８，６９５号；同第６，０５４，２７０号；同第６，２５８，６０６号；同第６，２６１，７７６号；同第６，２７７，４８９号；同第６，２７７，６２８号；同第６，３６５，３４９号；同第６，３８７，６２６号；同第６，４５８，５８４号；同第６，５０３，７１１号；同第６，５１６，２７６号；同第６，５２１，４６５号；同第６，５５８，９０７号；同第６，５６２，５６５号；同第６，５７６，４２４号；同第６，５８７，５７９号；同第６，５８９，７２６号；同第６，５９４，４３２号；同第６，５９９，６９３号；同第６，６００，０３１号；および同第６，６１３，８９３号もまた参照のこと）。
(Gene expression hybridization array)
Any of a variety of arrays can be used in the practice of the present invention. Researchers can either rely on commercially available arrays or make them themselves. Methods for making and using arrays are well known in the art (eg, S. Kern and GM Hampton, Biotechniques, 1997, 23: 120-124; M. Schummer et al., Biotechniques, 1997, 23: 1087). S. Solinas-Toldo et al., Genes, Chromosomes & Cancer, 1997, 20: 399-407; M. Johnston, Curr. Biol., 1998, 8: R171-R174; D.D. Bowtell, Nature Gen., 1999. , Supp.21: 25-32; SJ Watson and H.Akil, Biol Psychiatry., 1999, 45: 533-543; WM Freeman et al., B otechniques, 2000, 29: 1042-1046 and 1048-1055; DJ Lockhart and EA Winzeler, Nature, 2000, 405: 827-836; M. Cuzin, Transfus. Clin. Biol., 2001, 8 291-296; PP Zarrinkar et al., Genome Res., 2001, 11: 1256-1261; M. Gabig and G. Wegrzyn, Acta Biochim. Pol., 2001, 48: 615-622; See Cheung et al., Nature, 2001, 40: 953-958; see, for example, US Patent Nos. 5,143,854, 5,434,049, 5,556,752; 5,632 No. 957; No. 5,700,637; No. 5,744,305; No. 5,770,456; No. 5,800,992; No. 5,807,522; No. 5,830,645; No. 5,856,174; No. 5,959,098; No. 5,965,452; No. 6,013,440; No. 6,022,963 No. 6,045,996; No. 6,048,695; No. 6,054,270; No. 6,258,606; No. 6,261,776; No. 6 No. 6,277,628; No. 6,365,349; No. 6,387,626; No. 6,458,584; No. 6,503,711 No. 6,516,276; No. 6,521,465; No. 6,558,907; 562,565; 6,576,424; 6,587,579; 6,589,726; 6,594,432; 6,599,693. See also 6,600,031; and 6,613,893).
アレイは、基材表面上の個々のスポット（すなわち、規定された位置または割り当てられた位置）に固定化された複数の遺伝子プローブを含む。本発明において使用するための基材表面は、基材表面への遺伝子プローブの直接的または間接的結合（すなわち、固定化）を可能にする、種々の剛性、半剛性、または可撓性の材料のいずれかから作製され得る。適切な材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：セルロース（例えば、米国特許第５，０６８，２６９号を参照のこと）、セルロースアセテート（例えば、米国特許第６，０４８，４５７号を参照のこと）、ニトロセルロース、ガラス（例えば、米国特許第５，８４３，７６７号を参照のこと）、石英または他の結晶性基材（例えば、砒化ガリウム、シリコーン（例えば、米国特許第６，０９６，８１７号を参照のこと））、種々のプラスチックおよびプラスチックコポリマー（例えば、米国特許第４，３５５，１５３号；同第４，６５２，６１３号；同第６，０２４，８７２号を参照のこと）、種々の膜およびゲル（例えば、米国特許第５，７９５，５５７号を参照のこと）、ならびに常磁性微粒子もしくは超磁性微粒子（例えば、米国特許第５，９３９，２６１号を参照のこと）。蛍光が検出されるべき場合、シクロ−オレフィンポリマーを含むアレイが、好ましくは使用され得る（例えば、米国特許第６，０６３，３３８号を参照のこと）。 The array includes a plurality of gene probes immobilized at individual spots (ie, defined or assigned positions) on the substrate surface. The substrate surface for use in the present invention can be a variety of rigid, semi-rigid, or flexible materials that allow direct or indirect binding (ie, immobilization) of the gene probe to the substrate surface. Can be made from either of these. Suitable materials include, but are not limited to: cellulose (see, eg, US Pat. No. 5,068,269), cellulose acetate (eg, US Pat. No. 6,048,457). ), Nitrocellulose, glass (see, eg, US Pat. No. 5,843,767), quartz or other crystalline substrate (eg, gallium arsenide, silicone (eg, US Pat. , 096,817)), various plastics and plastic copolymers (see, eg, US Pat. Nos. 4,355,153; 4,652,613; 6,024,872). ), Various films and gels (see, for example, US Pat. No. 5,795,557), and paramagnetic or supermagnetic particles. (See, e.g., U.S. Pat. No. 5,939,261). If fluorescence is to be detected, an array comprising cyclo-olefin polymers can preferably be used (see, eg, US Pat. No. 6,063,338).
その材料上の反応性官能性化学基（例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基など）の存在は、その基材表面に遺伝子プローブを直接的または間接的に結合するために利用され得る。基材表面に遺伝子プローブを固定化してアレイを形成するための方法は、当該分野で周知である。 The presence of reactive functional chemical groups (eg, hydroxyl groups, carboxyl groups, amino groups, etc.) on the material can be utilized to attach the gene probe directly or indirectly to the substrate surface. Methods for immobilizing gene probes on a substrate surface to form an array are well known in the art.
各遺伝子プローブの１つより多くのコピーが、そのアレイ上にスポットされ得る（例えば、二連または三連で）。この配置は、例えば、得られる結果の再現性の評価を可能にし得る。関連した遺伝子プローブはまた、アレイ上のプローブエレメントに分類され得る。例えば、プローブエレメントは、異なる長さであるが、実質的に同じ配列を含む複数の関連した遺伝子プローブを含み得る。あるいは、プローブエレメントは、クローニングされた一片のＤＮＡの１つを超えるコピーを消化することで得られた、異なる長さのフラグメントである複数の関連した遺伝子プローブを含み得る。プローブエレメントはまた、一塩基対ミスマッチの存在を除いて、同一のフラグメントである、複数の関連した遺伝子プローブを含み得る。アレイは、複数のプローブエレメントを含み得る。アレイ上のプローブエレメントは、異なる密度でその基材表面上に配置され得る。 More than one copy of each gene probe can be spotted on the array (eg, in duplicate or triplicate). This arrangement may allow, for example, evaluation of the reproducibility of the results obtained. Related gene probes can also be grouped into probe elements on the array. For example, a probe element can include a plurality of related gene probes that are of different lengths but include substantially the same sequence. Alternatively, the probe element may comprise a plurality of related gene probes that are fragments of different lengths obtained by digesting more than one copy of a cloned piece of DNA. A probe element may also include multiple related gene probes that are the same fragment except for the presence of a single base pair mismatch. The array can include a plurality of probe elements. The probe elements on the array can be arranged on the substrate surface at different densities.
アレイに固定化された遺伝子プローブは、例えば、実質的に完全なゲノムまたはゲノムサブセットをまとめて網羅する配列を含む、遺伝子（例えば、ゲノムライブラリー由来）由来の配列を含む核酸であり得る（例えば、そのアレイは、開発全体を通して発現されるヒト遺伝子のみを含み得る）。遺伝子プローブは、長いｃＤＮＡ配列（５００〜５，０００塩基長）であってもよいし、より短い配列（例えば、２０〜８０マーオリゴヌクレオチド）であってもよい。その遺伝子プローブの配列は、遺伝子発現レベル情報が望まれるものである。さらにまたは代わりに、そのアレイは、未知の意味または位置の核酸配列を含み得る。遺伝子プローブは、ポジティブコントロールまたはネガティブコントロールとして使用され得る（例えば、その核酸配列は、核型として通常のゲノムに由来してもよいし、１以上の染色体異常を含むゲノムに由来してもよい；代わりにまたはさらに、そのアレイは、非特異的ハイブリダイゼーションを調節するために、完全にマッチする配列および一塩基対ミスマッチの配列を含み得る）。 A gene probe immobilized on an array can be, for example, a nucleic acid comprising a sequence derived from a gene (eg, from a genomic library), including sequences that collectively cover a substantially complete genome or genome subset (eg, The array may contain only human genes that are expressed throughout development). The gene probe may be a long cDNA sequence (500 to 5,000 bases long) or a shorter sequence (eg 20 to 80 mer oligonucleotide). For the gene probe sequence, gene expression level information is desired. Additionally or alternatively, the array can include nucleic acid sequences of unknown meaning or location. The gene probe can be used as a positive or negative control (eg, the nucleic acid sequence may be derived from a normal genome as a karyotype or from a genome containing one or more chromosomal abnormalities; Alternatively or additionally, the array may include perfectly matched sequences and single base pair mismatched sequences to regulate non-specific hybridization).
遺伝子プローブの調製および操作のための技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，１９８９，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，１９９０，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ）」，１９９３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ；「ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」，１９９５，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ならびに「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，２００２，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），第５版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）。 Techniques for the preparation and manipulation of gene probes are well known in the art (eg, J. Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 1989, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York, NY; “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”, 1990, M.A. Innis (ed.), Academic Press: New York, NY; P. Tijssen “Hybridization with Lice tide. lar Biology (Parts I and II) ”, 1993, Elsevier Science;“ PCR Strategies ”, 1995, MA Innis (ed.), Academic Press: New York, NY; and“ Short Protocol 200 ”. FM Ausubel (ed.), 5th edition, John Wiley & Sons).
長いｃＤＮＡ配列は、種々のビヒクルにクローニングすることによって得られ、操作され得る。それらは、スクリーニングされ得、ゲノムＤＮＡの任意の供給源から再クローニングまたは増幅され得る。遺伝子プローブは、ゲノムクローンから得られ得、これらのクローンとしては、哺乳動物およびヒトの人工染色体（それぞれ、ＭＡＣおよびＨＡＣであり、これらは、約５〜約４００キロベース（ｋｂ）の挿入物を含み得る）、サテライト人工染色体またはサテライトＤＮＡベースの人工染色体（ＳＡＴＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ；０．２〜１Ｍｂサイズ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ；３００ｋｂまで）；Ｐ１人工染色体（ＰＡＣ；約７０〜１００ｋｂ）などが挙げられる。 Long cDNA sequences can be obtained and manipulated by cloning into various vehicles. They can be screened and recloned or amplified from any source of genomic DNA. Gene probes can be obtained from genomic clones, which include mammalian and human artificial chromosomes (MAC and HAC, respectively), which contain about 5 to about 400 kilobases (kb) of inserts. Satellite artificial chromosome or satellite DNA-based artificial chromosome (SATAC), yeast artificial chromosome (YAC; 0.2-1 Mb size), bacterial artificial chromosome (BAC; up to 300 kb); P1 artificial chromosome (PAC; about 70 ˜100 kb).
遺伝子プローブはまた、他のクローニングビヒクル（例えば、組換えウイルス、コスミド、またはプラスミド（例えば、米国特許第５，２６６，４８９号；同第５，２８８，６４１号および同第５，５０１，９７９号を参照のこと））にクローニングすることによって、得られ、操作され得る。 Gene probes can also be used in other cloning vehicles (eg, recombinant viruses, cosmids, or plasmids (eg, US Pat. Nos. 5,266,489; 5,288,641 and 5,501,979). See)))) and can be obtained and manipulated.
あるいは、遺伝子プローブ（特に、オリゴヌクレオチドのような短い配列を含むもの）は、当該分野で周知の化学技術によってインビトロで合成され、次いで、アレイに固定化され得る。このような方法は、科学文献および特許において記載されている（例えば、Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９７９，６８：９０−９８；Ｅ．Ｌ．Ｂｒｏｗｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９７９，６８：１０９−１５１；Ｅ．Ｓ．Ｂｅｌｏｕｓｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９７，２５：３４４０−３４４４；Ｄ．Ｇｕｓｃｈｉｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，２５０：２０３−２１１；Ｍ．Ｊ．Ｂｌｏｍｍｅｒｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３：７８８６−７８９６；ならびにＫ．Ｆｒｅｎｋｅｌら，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９５，１９：３７３−３８０を参照のこと；例えば、米国特許第４，４５８，０６６号もまた参照のこと）。 Alternatively, gene probes (especially those containing short sequences such as oligonucleotides) can be synthesized in vitro by chemical techniques well known in the art and then immobilized on the array. Such methods are described in the scientific literature and in patents (eg, SA Narang et al., Meth. Enzymol., 1979, 68: 90-98; EL Brown et al., Meth. Enzymol., 1979, 68: 109-151; ES Belousov et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25: 3440-3444; D. Guschin et al., Anal. Biochem., 1997, 250: 203-211; See Blommers et al., Biochemistry, 1994, 33: 7886-7896; and K. Frenkel et al., Free Radic. Biol. Med., 1995, 19: 373-380; for example, U.S. Patent No. 4,458,066. See also Of it).
例えば、オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイトアプローチに基づいた自動化固相手順を使用して調製され得る。このような方法において、各ヌクレオチドは、伸長しているオリゴヌクレオチド鎖の５’末端に個々に付加され、次いで、これは、固体支持体に対して３’末端で結合される。その付加されたヌクレオチドは、ジメトキシトリチル（またはＤＭＴ）基によって、５位で重合から保護される３価の３’−ホスホルアミダイトの形態で存在する。塩基誘導性ホスホルアミダイトカップリングの後、穏和な酸化によって、５価のホスホトリエステル中間体が得られ、ＤＭＴが除去されて、オリゴヌクレオチド伸長のための新たな部位が提供される。そのオリゴヌクレオチドは、次いで、固体支持体から切断され、そのホスホジエステルおよび環外アミノ基は、水酸化アンモニウムで脱保護される。これらの合成は、市販のオリゴ合成器（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ＤＮＡ合成器）で行われ得る。 For example, oligonucleotides can be prepared using an automated solid phase procedure based on the phosphoramidite approach. In such a method, each nucleotide is individually added to the 5 'end of the extending oligonucleotide chain, which is then attached at the 3' end to a solid support. The added nucleotide exists in the form of a trivalent 3'-phosphoramidite that is protected from polymerization at the 5-position by a dimethoxytrityl (or DMT) group. After base-induced phosphoramidite coupling, mild oxidation yields the pentavalent phosphotriester intermediate and DMT is removed to provide a new site for oligonucleotide extension. The oligonucleotide is then cleaved from the solid support and the phosphodiester and exocyclic amino group are deprotected with ammonium hydroxide. These syntheses can be performed on commercially available oligo synthesizers (eg, Perkin Elmer / Applied Biosystems Division DNA synthesizer).
基材支持体に対するオリゴヌクレオチドの結合方法（または固定化方法）が、記載されている（例えば、Ｕ．ＭａｓｋｏｓおよびＥ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：１６７９−１６８４；Ｒ．Ｓ．Ｍａｔｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９５，２２４；１１０−１１６；Ｒ．Ｊ．Ｌｉｐｓｈｕｔｚら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９９，２１：２０−２４；Ｙ．Ｈ．Ｒｏｇｅｒｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９，２６６：２３−３０；Ｍ．Ａ．Ｐｏｄｙｍｉｎｏｇｉｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１，２９：５０９０−５０９８；Ｙ．Ｂｅｌｏｓｌｕｄｔｓｅｖら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，２９２：２５０−２５６を参照のこと）。 Methods for binding (or immobilizing) oligonucleotides to a substrate support have been described (eg, U. Maskos and EM Southern, Nucleic Acids Res., 1992, 20: 1679-1684; S. Matson et al., Anal. Biochem., 1995, 224; 110-116; RJ Lipshutz et al., Nat. Genet., 1999, 21: 20-24; YH Rogers et al., Anal.Biochem., 1999, 266: 23-30; see MA Podyminogin et al., Nucleic Acids Res., 2001, 29: 5090-5098; Y. Belosludtsev et al., Anal. Biochem., 2001, 292: 250-256. It).
オリゴヌクレオチドベースのアレイはまた、光リソグラフィーおよびオリゴヌクレオチド化学の組み合わせを用いて、インサイチュ合成によって調製されている（例えば、Ａ．Ｃ．Ｐｅａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１：５０２２−５０２６；Ｄ．Ｊ．Ｌｏｃｋｈａｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９６，１４：１６７５−１６８０；Ｓ．Ｓｉｎｇｈ−Ｇａｓｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．，１９９９，１７：９７４−９７８；Ｍ．Ｃ．Ｐｉｒｒｕｎｇら，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００１，３：１１０５−１１０８；Ｇ．Ｈ．ＭｃＧａｌｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，１７０；７１−１０１；Ａ．Ｄ．Ｂａｒｏｎｅら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２００１，２０：５２５−５３１；Ｊ．Ｈ．Ｂｕｔｌｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００１，１２３：８８８７−８８９４；Ｅ．Ｆ．Ｎｕｗａｙｓｉｒら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００２，１２：１７４９〜１７５５を参照のこと）。感光性の保護された２’−デオキシヌクレオシドホスホラミト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｔｅ）を使用する光指向性オリゴヌクレオチド合成のための化学は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により開発されており、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，４２４，１８６号および同第６，５８２，９０８号を参照のこと）。 Oligonucleotide-based arrays have also been prepared by in situ synthesis using a combination of photolithography and oligonucleotide chemistry (eg, AC Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91). D. J. Lockhart et al., Nature Biotech., 1996, 14: 1675-1680; S. Singh-Gasson et al., Nat. Biotechn., 1999, 17: 974-978; , Org.Lett., 2001, 3: 1105-1108; GH McGall et al., Methods Mol.Biol., 2001,170; 71-101; AD Barone et al., Nucleosides N. cleotides Nucleic Acids, 2001, 20: 525-531; JH Butler et al., J. Am.Chem.Soc., 2001, 123: 8887-8894; EF Nuwaysir et al., Genome Res., 2002, 12 : 1749-1755). Chemistry for the synthesis of light-directed oligonucleotides using photosensitive protected 2'-deoxynucleoside phosphoramites is described in Affymetrix Inc. (Santa Clara, CA) and are well known in the art (see, eg, US Pat. Nos. 5,424,186 and 6,582,908).
遺伝子プローブの特注アレイ形成の代替方法は、市販のアレイおよびマイクロアレイに頼ることである。このようなアレイは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、およびＶｙｓｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）によって開発されている。 An alternative to forming custom arrays of gene probes is to rely on commercially available arrays and microarrays. Such arrays are available, for example, from Affymetrix Inc. (Santa Clara, CA), Illumina, Inc. (San Diego, CA), Spectral Genomics, Inc. (Houston, TX), and Vysis Corporation (Downers Grove, IL).
実施例の節において記載されるように、出願人らは、２つの異なる遺伝子発現アレイを使用した。第１のものは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｔｅｓｔ３アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより開発され、市販されている）であり、これは、発生中ずっと発現される２４個のヒト遺伝子のサブセットを含む。このアレイは、ヒト遺伝子の大きなセットをマイクロアレイへ後で適用するために、ｃＲＮＡの性質および量を評価するために使用される。第２のアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現マイクロアレイＨＧ−Ｕ１３３Ａであり、これは、１４，２３９個の特有の遺伝子を示す２２，２８３個のプローブエレメントを含む。ここでいくつかの場合、１つを超えるプローブエレメントは、１つのｍＲＮＡ転写物を示す。これらのプローブセットが由来した配列を、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ｄｂＥＳＴ、およびＲｅｆＳｅｑから選択した。各プローブエレメントは、少なくとも２２個の２５マーオリゴヌクレオチド配列からなり；非特異的ハイブリダイゼーションを調節するために、これらの半分は、完全マッチ配列であり、他方の半分は、一塩基対ミスマッチ配列である。このアレイにおいて、そのｃＲＮＡ 対 その完全配列／ミスマッチ配列のハイブリダイゼーション比により、各特有の遺伝子の存在または非存在に関する定量的データが得られる。 Applicants used two different gene expression arrays as described in the Examples section. The first is the GeneChip Test3 array (developed and marketed by Affymetrix), which contains a subset of 24 human genes that are expressed throughout development. This array is used to assess the nature and quantity of cRNA for later application of a large set of human genes to a microarray. The second array is the Affymetrix gene expression microarray HG-U133A, which contains 22,283 probe elements representing 14,239 unique genes. Here, in some cases, more than one probe element represents one mRNA transcript. The sequences from which these probe sets were derived were selected from GenBank®, dbEST, and RefSeq. Each probe element consists of at least 22 25-mer oligonucleotide sequences; in order to control non-specific hybridization, these halves are perfect match sequences and the other half is a single base pair mismatch sequence. is there. In this array, the hybridization ratio of the cRNA to the complete / mismatch sequence provides quantitative data regarding the presence or absence of each unique gene.
（ハイブリダイゼーション）
本発明の方法において、遺伝子発現アレイは、その試験サンプルと、そのサンプル中の核酸フラグメントがそのアレイに固定化された遺伝子プローブに特異的にハイブリダイズする条件下で接触される。
(Hybridization)
In the method of the present invention, the gene expression array is contacted with the test sample under conditions that specifically hybridize the nucleic acid fragments in the sample to the gene probes immobilized on the array.
ハイブリダイゼーション反応および洗浄工程は、あるとすれば、種々の実験条件のいずれかの下で行われ得る。多くのハイブリダイゼーションプロトコルおよび洗浄プロトコルが記載されてきており、当該分野で周知である（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，１９８９，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ ＩＩ）」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３；ならびに「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」，Ｍ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ（編），１９９９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと）。本発明の方法は、公知のハイブリダイゼーションプロトコルに従うことによって、改変されたかもしくは最適な変形例の公知のハイブリダイゼーションプロトコルまたは新たに開発されたハイブリダイゼーションプロトコルを使用することによって、これらのプロトコルが特異的ハイブリダイゼーションが起こることを可能にする限りにおいて、行われ得る。 Hybridization reactions and washing steps, if any, can be performed under any of a variety of experimental conditions. A number of hybridization and washing protocols have been described and are well known in the art (eg, J. Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 1989, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York; P. Tijssen “Hybridization with Nucleic Acid Probes—Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (Part II)”, Elsevi. .Anderson (eds.), 1999, Springer Verlag: New York, see NY). The methods of the present invention make these protocols specific by following known hybridization protocols, using modified or optimally modified known hybridization protocols or newly developed hybridization protocols. It can be done as long as it allows hybridization to occur.
用語「特異的ハイブリダイゼーション」とは、核酸分子が、特定の核酸配列にストリンジェントな条件下で、優先的に結合するか、二重鎖を形成するかまたはハイブリダイズするプロセスをいう。本発明の文脈において、この用語は、より具体的には、試験サンプル由来の核酸フラグメントが、そのアレイ上に固定化された特定の遺伝子プローブに優先的に結合し（すなわち、ハイブリダイズし）、かつそのアレイの他の固定化遺伝子プローブには、より少ない程度または全くハイブリダイズしないプロセスをいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、配列依存性である。ハイブリダイゼーションの特異性は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーとともに増大する；ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが減少すると、より高いミスマッチが許容される結果になる。 The term “specific hybridization” refers to the process by which a nucleic acid molecule binds preferentially, forms a duplex, or hybridizes under stringent conditions to a specific nucleic acid sequence. In the context of the present invention, the term more specifically, nucleic acid fragments from a test sample preferentially bind (ie, hybridize) to a particular gene probe immobilized on the array; And refers to a process that hybridizes to a lesser extent or not to other immobilized gene probes of the array. Stringent hybridization conditions are sequence dependent. The specificity of hybridization increases with the stringency of the hybridization conditions; decreasing the stringency of the hybridization conditions results in a higher mismatch being tolerated.
ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件は、異なる要因（例えば、ハイブリダイゼーション反応時間、洗浄工程の時間、ハイブリダイゼーション反応および／または洗浄プロセスの温度、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または洗浄緩衝液の成分、これらの成分の濃度、ならびにそのハイブリダイゼーション緩衝液および／または洗浄緩衝液のｐＨおよびイオン強度）を変化させることによって調節され得る。 Hybridization conditions and / or wash conditions may vary depending on different factors (eg, hybridization reaction time, wash step time, hybridization reaction and / or wash process temperature, hybridization buffer and / or wash buffer components, these And the hybridization buffer and / or wash buffer pH and ionic strength).
特定の実施形態において、そのハイブリダイゼーション工程および／または洗浄工程は、非常にストリンジェントな条件下で行われる。他の実施形態において、そのハイブリダイゼーション工程および／または洗浄工程は、中程度からストリンジェントな条件下で行われる。なお他の実施形態においては、１回より多くの洗浄工程が好ましい。例えば、バックグラウンドシグナルを減少させるために、中程度から低いストリンジェンシー洗浄の次に、非常にストリンジェントな条件下での洗浄が行われる。 In certain embodiments, the hybridization and / or washing steps are performed under very stringent conditions. In other embodiments, the hybridization and / or washing steps are performed under moderate to stringent conditions. In still other embodiments, more than one cleaning step is preferred. For example, to reduce background signal, a moderate to low stringency wash is followed by a wash under very stringent conditions.
当該分野で周知のように、そのハイブリダイゼーションプロセスは、他の反応条件を改変することにより増強され得る。例えば、ハイブリダイゼーション効率（すなわち、平衡に達するまでの時間）は、温度変動（すなわち、２℃より高い温度差）を含む反応条件を使用することで高められ得る。温度変化をもたらし得るオーブンまたは他のデバイスは、ハイブリダイゼーションプロセスの間に温度変動条件を得るために、本発明の方法の実施において使用され得る。 As is well known in the art, the hybridization process can be enhanced by modifying other reaction conditions. For example, hybridization efficiency (ie, time to reach equilibrium) can be increased by using reaction conditions that include temperature fluctuations (ie, temperature differences greater than 2 ° C.). An oven or other device that can provide a temperature change can be used in the practice of the methods of the invention to obtain temperature variation conditions during the hybridization process.
ハイブリダイゼーション効率は、その反応が、その水分が飽和されない環境下で起こる場合に有意に改善されることが、当該分野で公知である。ハイブリダイゼーションプロセスの間の水分の制御は、ハイブリダイゼーション感度を増すために別の手段を提供する。アレイベースの機器は、通常、実験の異なる段階全ての間に（すなわち、プレハイブリダイゼーション工程、ハイブリダイゼーション工程、洗浄工程および検出工程）水分の制御を可能にするハウジングを備える。 It is known in the art that hybridization efficiency is significantly improved when the reaction occurs in an environment where the water is not saturated. Control of moisture during the hybridization process provides another means to increase hybridization sensitivity. Array-based instruments typically include a housing that allows moisture control during all different stages of the experiment (ie, prehybridization process, hybridization process, washing process and detection process).
さらに、または代替的に、浸透圧の揺らぎを含むハイブリダイゼーション環境を使用して、ハイブリダイゼーション効率を増加し得る。ハイブリダイゼーション反応混合物の高張性／低張性が変動するこのような環境は、ハイブリダイゼーションチャンバにおいて溶質勾配を作り出すことによって（例えば、チャンバの１つの側に低塩濃度を含むハイブリダイゼーション緩衝液を配置し、そしてチャンバの他の側に高塩濃度を含むハイブリダイゼーション緩衝液を配置することによって）得られ得る。 Additionally or alternatively, a hybridization environment that includes osmotic fluctuations may be used to increase hybridization efficiency. Such an environment in which the hypertonicity / hypotonicity of the hybridization reaction mixture varies can be achieved by creating a solute gradient in the hybridization chamber (eg, placing a hybridization buffer containing a low salt concentration on one side of the chamber). And by placing a hybridization buffer containing a high salt concentration on the other side of the chamber).
（高度に反復した配列）
本発明の方法の実施において、アレイを、試験サンプルと、サンプル中の核酸セグメントがアレイの遺伝子プローブに特異的にハイブリダイズする条件下で接触させる。上記のように、適切なハイブリダイゼーション条件の選択によって、特異的なハイブリダイゼーションが行われ得る。特定の場合において、ハイブリダイゼーションの特異性は、反復配列を阻害することによってさらに増強され得る。
(Highly repetitive sequence)
In practicing the method of the invention, the array is contacted with the test sample under conditions that allow the nucleic acid segments in the sample to specifically hybridize to the gene probes of the array. As described above, specific hybridization can be performed by selection of appropriate hybridization conditions. In certain cases, the specificity of hybridization can be further enhanced by inhibiting repetitive sequences.
特定の好ましい実施形態において、核酸フラグメントに存在する反復配列は、除去されるかまたはそれらのハイブリダイゼーション能力が不可能にされる。ハイブリダイゼーション反応から反復配列を除くことまたはそれらのハイブリダイゼーション能力を抑制することによって、ハイブリダイズされる核酸からのシグナルが、これらの反復型配列に由来するシグナルによって支配されることを妨げる（これらの反復型配列は、統計的に、よりハイブリダイゼーションを受けそうである）。ハイブリダイゼーションから反復配列を除けないことまたはそれらのハイブリダイゼーション能力を抑制しないことによって、非特異的ハイブリダイゼーションが生じ、バックグラウンドノイズからシグナルを区別することが困難になる。 In certain preferred embodiments, repetitive sequences present in the nucleic acid fragments are removed or their hybridization ability is disabled. By removing repetitive sequences from the hybridization reaction or suppressing their hybridization ability, signals from the nucleic acids to be hybridized are prevented from being dominated by signals derived from these repetitive sequences (these Repeated sequences are statistically more likely to undergo hybridization). By not removing repetitive sequences from hybridization or not suppressing their hybridization ability, non-specific hybridization occurs, making it difficult to distinguish signals from background noise.
混合物から反復配列を除くかまたはそれらのハイブリダイゼーション能力を不可能にすることは、当業者に周知の種々の方法のいずれかを使用して達成され得る。これらの方法としては、固体支持体に固定された特異的核酸配列へのハイブリダイゼーションによって反復配列を除くこと（例えば、Ｏ．Ｂｒｉｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８２，２：５７８−５８７を参照のこと）；適切なＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅によって反復配列の産生を抑制すること；または自己再会合によって高度に反復した配列のハイブリダイゼーション能力を阻害すること（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｂｒｉｔｔｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９７４，２９：３６３−４１８を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。 Removing repetitive sequences from a mixture or disabling their hybridization ability can be accomplished using any of a variety of methods well known to those skilled in the art. These methods include removing repetitive sequences by hybridization to specific nucleic acid sequences immobilized on a solid support (see, for example, O. Brison et al., Mol. Cell. Biol., 1982, 2: 578-587). See); suppressing the production of repetitive sequences by PCR amplification using appropriate PCR primers; or inhibiting the ability of highly repetitive sequences to hybridize by self-reassociation (see, eg, RJ. Britten et al., Methods of Enzymol., 1974, 29: 363-418), but is not limited thereto.
好ましくは、高度に反復した配列のハイブリダイゼーション能力は、ハイブリダイゼーション混合物中に、非標識遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）核酸を含むことによって競合的に阻害される。非標識遮断核酸（これは、接触工程の前に試験サンプルに混合される）は、競合因子として作用し、そして標識された反復配列が遺伝子プローブの高度に反復した配列に結合することを妨げ、従って、ハイブリダイゼーションバックグラウンドを減少させる。特定の実施形態（例えば、胎児ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡが分析される場合）において、非標識遮断核酸は、ヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡである。ヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡは、例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から市販されている。 Preferably, the hybridization capacity of highly repetitive sequences is competitively inhibited by including unlabeled blocking nucleic acids in the hybridization mixture. Unlabeled blocking nucleic acid, which is mixed into the test sample prior to the contacting step, acts as a competitor and prevents the labeled repetitive sequence from binding to the highly repetitive sequence of the gene probe, Accordingly, the hybridization background is reduced. In certain embodiments (eg, when cDNA from fetal mRNA is analyzed), the unlabeled blocking nucleic acid is human Cot-1 DNA. Human Cot-1 DNA is commercially available from, for example, Gibco / BRL Life Technologies (Gaithersburg, MD).
（結合検出およびデータ分析）
本発明の方法は、結合パターンを得るために、試験サンプルの個々の核酸フラグメントの、アレイ上に固定された個々の遺伝子プローブへの結合を決定することを包含する。アレイベースの遺伝子発現において、結合パターンの決定を、固定された遺伝子プローブへの標識核酸セグメントのハイブリダイゼーションから生じる標識アレイを分析することによって実施される。
(Join detection and data analysis)
The method of the invention involves determining the binding of individual nucleic acid fragments of a test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern. In array-based gene expression, the determination of the binding pattern is performed by analyzing the labeled array resulting from the hybridization of the labeled nucleic acid segment to the immobilized gene probe.
特定の実施形態において、結合の決定は、アレイ上の各個々のスポットにおいて、検出可能な薬剤によって生成されるシグナルの強度を測定することを包含する。 In certain embodiments, the binding determination involves measuring the intensity of the signal produced by the detectable agent at each individual spot on the array.
標識されたアレイの分析は、種々の手段および方法のいずれかを使用して実施され得、その選択は、検出可能な薬剤の性質および使用されるアレイベースの機器の検出システムに依存する。 Analysis of the labeled array can be performed using any of a variety of means and methods, the choice of which depends on the nature of the detectable agent and the detection system of the array-based instrument used.
特定の実施形態において、検出可能な薬剤は、蛍光色素を含み、そしてその結合は、蛍光によって検出される。他の実施形態において、羊水胎児ＲＮＡのサンプルはビオチン標識され、固定された遺伝子プローブへのハイブリダイゼーションの後に、ハイブリダイゼーション産物は、ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体で染色され、蛍光によって可視化される。蛍光標識されたアレイの分析は、通常、以下を含む：アレイ全体の蛍光の検出、画像獲得、画像化アレイからの蛍光強度の定量、およびデータ分析。 In certain embodiments, the detectable agent comprises a fluorescent dye and the binding is detected by fluorescence. In other embodiments, a sample of amniotic fluid fetal RNA is biotinylated and, after hybridization to the immobilized gene probe, the hybridization product is stained with a streptavidin-phycoerythrin conjugate and visualized by fluorescence. Analysis of fluorescently labeled arrays typically includes: detection of fluorescence across the array, image acquisition, quantification of fluorescence intensity from the imaging array, and data analysis.
蛍光標識の検出および蛍光画像の作成のための方法は、当該分野において周知であり、電荷結合素子（すなわち、ＣＣＤ）のような「アレイ読み取り」または「走査」システムの使用を含む。任意の公知のデバイスもしくは方法、またはそれらの改変が、本発明の方法を実施するために使用され得るか適合され得る（例えば、Ｙ．Ｈｉｒａｏｋａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３８：３６−４１；Ｒ．Ｓ．Ａｉｋｅｎｓら，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９８９，２９：２９１−３１３；Ａ．Ｄｉｖａｎｅら，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．，１９９４，１４：１０６１−１０６９；Ｓ．Ｍ．Ｊａｌａｌら，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．，１９９８，７３：１３２−１３７；Ｖ．Ｇ．Ｃｈｅｕｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，１９９９，２１：１５−１９を参照のこと；例えば、米国特許第５，５３９，５１７号；同第５，７９０，７２７号；同第５，８４６，７０８号；同第５，８８０，４７３号；同第５，９２２，６１７号；同第５，９４３，１２９号；同第６，０４９，３８０号；同第６，０５４，２７９号；同第６，０５５，３２５号；同第６，０６６，４５９号；同第６，１４０，０４４号；同第６，１４３，４９５号；同第６，１９１，４２５号；同第６，２５２，６６４号；同第６，２６１，７７６号；および同第６，２９４，３３１号もまた参照のこと）。 Methods for detection of fluorescent labels and creation of fluorescent images are well known in the art and include the use of “array reading” or “scanning” systems such as charge coupled devices (ie, CCDs). Any known device or method, or modification thereof, can be used or adapted to carry out the method of the invention (see, eg, Y. Hiraoka et al., Science, 1987, 238: 36-41; S. Aikens et al., Meth. Cell Biol., 1989, 29: 291-313; A. Divane et al., Prenat. Diagn., 1994, 14: 1061-1069; S.M. Jalal et al., Mayo Clin. 1998, 73: 132-137; V.G. Cheung et al., Nature Genet., 1999, 21: 15-19; see, for example, U.S. Patent Nos. 5,539,517; 5,790,727. No. 5,846,708; No. 5,880,473; No. 5,92 No. 5,943,129; No. 6,049,380; No. 6,054,279; No. 6,055,325; No. 6,066,459; 6,140,044; 6,143,495; 6,191,425; 6,252,664; 6,261,776; and 6,294 331).
市販のマイクロアレイスキャナは、代表的に、１つ（またはそれ以上）の蛍光画像を獲得し得るレーザーベースの走査システムである（例えば、この機器は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｉｎｃ．，（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、Ｖｉｒｔｅｋ Ｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）およびＡｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から市販される）。アレイは、弱い蛍光シグナルの検出およびアレイ上の各スポットにおけるシグナル応答の線形性を確実にするために、異なるレーザー強度を使用して走査され得る。蛍光色素特異的光学フィルターは、蛍光画像の獲得の間、使用され得る。最初のセットは、例えば、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．（Ｒｏｃｋｉｎｇｈａｍ，ＶＴ）から市販される。 Commercially available microarray scanners are typically laser-based scanning systems that can acquire one (or more) fluorescent images (eg, this instrument is PerkinElmer Life and Analytical Sciences. Inc., (Boston, MA), Virtek Vision, Inc. (Ontario, Canada) and Axon Instruments, Inc. (Union City, CA)). The array can be scanned using different laser intensities to ensure the detection of weak fluorescent signals and the linearity of the signal response at each spot on the array. Fluorescent dye specific optical filters can be used during the acquisition of fluorescent images. The first set is, for example, Chroma Technology Corp. (Rockingham, VT).
好ましくは、上記のようなアレイから蛍光画像を生成しそして獲得し得るコンピューター支援画像化システムは、本発明の方法の実施において使用される。ハイブリダイゼーション後に標識アレイの１つ以上の蛍光画像を獲得し、そして保存し得る。 Preferably, a computer assisted imaging system that can generate and acquire fluorescent images from an array as described above is used in the practice of the method of the present invention. One or more fluorescent images of the labeled array can be acquired and stored after hybridization.
好ましくは、コンピューター支援画像システムは、獲得された蛍光画像を分析するために使用される。このようなシステムは、強度の差異の正確な定量化および結果のより容易な解釈を可能にする。アレイ上の異なるスポットでの蛍光の定量および蛍光比の決定のためのソフトウェアは、通常、スキャナハードウェアに含まれる。ソフトウェアおよび／またはハードウェアは、市販され、例えば、ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｅｌ Ｓｅｇｕｎｄｏ，ＣＡ），Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ），Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，（Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ，ＩＬ）；およびＶｙｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）から得られ得る。他のソフトウェアは、公に入手可能である（例えば、ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄａｔａ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｒａｎａ．ｌｂｌ．ｇｏｖ）；Ｄ．Ｙ．Ｃｈｉａｎｇら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００１，１７：４９−５５；Ｒで書かれ、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒプロジェクトから入手可能なシステム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能なＪａｖａ（登録商標）ベースのＴＭ４ソフトウェアシステム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ）；およびＬｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで開発されたウェブベースのシステム（ｈｔｔｐ：／／ｂａｓｅ．ｔｈｅｐ．ｌｕ．ｓｅ））である。 Preferably, a computer assisted imaging system is used to analyze the acquired fluorescence image. Such a system allows for accurate quantification of intensity differences and easier interpretation of results. Software for quantification of fluorescence at different spots on the array and determination of fluorescence ratio is usually included in the scanner hardware. Software and / or hardware are commercially available, e.g., BioDiscovery (El Segundo, CA), Imaging Research (Ontario, Canada), Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA), Applied Spectral Imaging Inc. (Carlsbad, CA); Chroma Technology Corp. (Brattleboro, VT); Leica Microsystems, (Bannockburn, Ill.); And Vysys Inc. (Downers Grove, IL). Other software is publicly available (eg, MicroArray Image Analysis, and Combined Expression Data and Sequence Analysis (http://rana.lbl.gov); 49-55; a system written in R and available from the Bioconductor project (http://www.bioconductor.org); a Java®-based TM4 software system available from the Institute for Genomic Research (http://www.biofortortor.org) /Www.tigr.org/software); and Lund Univer It is a web-based system that has been developed (http://base.thep.lu.se)) in ity.
実施例のセクションに記載されるように、本出願人は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイを分析するために必要なソフトウェアを使用した。 As described in the Examples section, Applicants used the software necessary to analyze Affymetrix microarrays.
蛍光強度の正確な決定は、蛍光比ベースラインの正規化および決定を必要とする（Ａ．ＢｒａｚｍａおよびＪ．Ｖｉｌｏ，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．，２０００，４８０：１７−２４）。遺伝子プローブが二連でまたは三連でスポットされたアレイを使用することによって、データ再現性が評価され得る。ベースライン閾値はまた、全体的な正規化アプローチを使用して決定され得る（Ｍ．Ｋ．Ｋｅｒｒら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．，２０００，７：８１９−８３７）。他のアレイは、幅広い種々の組織にわたって一定レベルの発現を示し、そしてアレイ実験の正規化およびスケーリングを可能にする一組の維持遺伝子を含む。 Accurate determination of fluorescence intensity requires normalization and determination of the fluorescence ratio baseline (A. Brazma and J. Vilo, FEBS lett., 2000, 480: 17-24). Data reproducibility can be assessed by using arrays in which gene probes are spotted in duplicate or triplicate. Baseline thresholds can also be determined using an overall normalization approach (MK Kerr et al., J. Comput. Biol., 2000, 7: 819-837). Other arrays show a constant level of expression across a wide variety of tissues and contain a set of maintenance genes that allow normalization and scaling of array experiments.
本発明の方法の実施において、任意の多くの種々のバイオインフォマティクスおよび統計的方法が、アレイベースの遺伝子発現分析によって得られるデータを分析するために使用され得る。このような方法は、当該分野において周知である（データ獲得、データ処理、データ分析、データマイニング（ｄａｔａ ｍｉｎｉｎｇ）、ならびに異なるバイオインフォマティクスおよび統計的方法によって抽出される情報の品質、関連性および確認の必須の要素についての総説について、例えば、Ａ．Ｗａｔｓｏｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８，９：６０９−６１４；Ｄ．Ｊ．Ｄｕｇｇａｎら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９９，２１：１０−１４；Ｄ．Ｅ．Ｂａｓｓｅｔｔら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９９，２１：５１−５５；Ｋ．Ｒ．Ｈｅｓｓら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，１９：４６３−４６８；Ｅ．Ｍａｒｃｏｔｔｅ ａｎｄ Ｓ．Ｄａｔｅ，Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．，２００１，２：３６３−３７４；Ｊ．Ｎ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２００２，４７：４６−４９；Ｔ．Ｇ．Ｄｅｗｅｙ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，２００２，７：Ｓ１７０−Ｓ１７５；Ａ Ｂｕｔｔｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，２００２，１：９５１−９６０；Ｊ．Ｔａｍａｍｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，９８：２６９−２８３；Ｚ Ｘｉａｎｇら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．，２００３，６：３８４−３９５を参照のこと）。 In practicing the methods of the invention, any of a number of different bioinformatics and statistical methods can be used to analyze the data obtained by array-based gene expression analysis. Such methods are well known in the art (data acquisition, data processing, data analysis, data mining, and the quality, relevance and confirmation of information extracted by different bioinformatics and statistical methods. For reviews on essential elements, see, for example, A. Watson et al., Curr. Opin.Biotechnol., 1998, 9: 609-614; DJ Duggan et al., Nat. Genet., 1999, 21: 10-14; D. E. Bassett et al., Nat. Genet., 1999, 21: 51-55; KR Hess et al., Trends Biotechnol., 2001, 19: 463-468; E. Markotte and S. Date, Brief Bioin form., 2001, 2: 363-374; JN Weinstein et al., Cytometry, 2002, 47: 46-49; TG Deway, Drug Discov. Today, 2002, 7: S170-S175; Nat. Rev. Drug Disc., 2002, 1: 951-960; J. Tames et al., J. Biotechnol., 2002, 98: 269-283; Z Xiang et al., Curr. Opin. Drug Disc. Devel., 2003. 6: 384-395).
ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウェアＤａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ ＴｏｏｌおよびインターネットベースのプログラムＮｅｔＡｆｆｘＴＭを使用することを含む、得られたデータから遺伝子発現情報を抽出するために本出願人が従った手順は、実施例のセクションに記載される。 The procedure that Applicants followed to extract gene expression information from the obtained data, including using the Affymetrix software Data Mining Tool and the internet-based program NetAffx ™ is described in the Examples section.
（ＩＶ．遺伝子発現パターンおよび胎児期診断）
上記本発明の方法は、胎児の遺伝子発現パターンを確立するために使用され得、それによって、胎児期診断の従来通りの方法を使用しては入手できない情報を提供し得る。
(IV. Gene expression pattern and fetal diagnosis)
The above-described methods of the present invention can be used to establish fetal gene expression patterns, thereby providing information that is not available using conventional methods of fetal stage diagnosis.
異なる在胎齢の胎児における遺伝子発現プロフィールの知識は、子宮内での正常な発生プロセスおよび異常な発生プロセスのもとにある基礎的な遺伝子機構のより良い理解を提供し、そして特定の出産時欠損、発生異常、および他の臨床的状態を担う遺伝子の同定およびマッピングを可能にする（Ｇ．Ｃ．Ｗｅｓｔｏｎら、Ａｕｓｔｒ．ａｎｄ Ｎｅｗ Ｚｅａｌ．Ｊ．Ｏｂｓｔ．Ｇｙｎ．，２００３，４３；２６４−２７２）。さらに、このような知識は、より正確な胎児期診断を提供するために使用され得、そして胎児期の生理学的状態および病理学的状態の予防および／または処置のための新規な戦略の開発を可能にし得る。 Knowledge of gene expression profiles in fetuses of different gestational ages provides a better understanding of the underlying genetic mechanisms underlying normal and abnormal development processes in the uterus, and specific birth defects Allows identification and mapping of genes responsible for developmental abnormalities and other clinical conditions (GC Weston et al., Austr. And New Zeal. J. Obst. Gyn., 2003, 43; 264-272). . Furthermore, such knowledge can be used to provide a more accurate fetal diagnosis and develop new strategies for the prevention and / or treatment of fetal physiological and pathological conditions. Can be possible.
ヒトの胚についての研究に固有の困難性に起因して、ヒトについて直接的に研究されたヒト初期発生において活性な遺伝子についてほとんど知られていない。伝統的に、異なるヒトの胚段階および胎児段階における発生遺伝子発現パターンに深い洞察を得るための研究は、モデル系の使用に依存している。このアプローチは、動物界にわたる遺伝子、遺伝子ネットワークおよび発生経路の保存によって正当化される。多くの研究（下等生物（特に、ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ）に焦点が当てられている）は、多用な範囲の多細胞生物における初期発生事象を制御する遺伝子のファミリーを同定している。これらの遺伝子は、正常な哺乳動物の発生に重要であることが見出されており、いくつかは、ヒトの出産時欠損を担うことが公知である。他の研究は、ゼブラフィッシュ、ツメガエル、およびマウスの発生において遺伝子発現パターンを確立した（Ｔ．Ｓ．Ｔａｎａｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７：９１２７−９１３２）。発生生物学において使用される主要なモデルの胚についての多くの量の遺伝子発現データは、ここで、データベース以外の任意の形式で保存するには広範すぎる（例えば、Ｊ．Ｂ．Ｌ．Ｂａｒｄ，Ｓｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，８：４５５−４５８；Ｒ．Ａ．Ｂａｌｄｏｃｋら，Ｓｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，８：４９９−５０７；Ｄ．Ｄａｖｉｄｓｏｎら，Ｓｅｍ．Ｃｅｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，８：５０９−５１１；Ｊ．Ｂ．Ｂａｒｄら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９８，８：８５９−８６３；Ｆ．Ｊ．Ｖｅｒｂｅｅｋら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９９９，４３：７６１−７７１；Ｊ．Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２５：１４７−１５２；Ｄ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｂａｌｄｏｃｋ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００１，２：４０９−４１８；Ｊ．Ｓｈａｒｐｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９６：５４１−５４５）。 Due to the inherent difficulties in research on human embryos, little is known about genes active in early human development that have been studied directly on humans. Traditionally, research to gain deep insight into developmental gene expression patterns at different human embryonic and fetal stages relies on the use of model systems. This approach is justified by the conservation of genes, gene networks and developmental pathways across the animal kingdom. Many studies (focused on lower organisms, especially Drosophila) have identified a family of genes that control early developmental events in a diverse range of multicellular organisms. These genes have been found to be important for normal mammalian development, and some are known to be responsible for human birth defects. Other studies have established gene expression patterns in the development of zebrafish, Xenopus, and mice (TS Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 9127-9132). Large amounts of gene expression data for major model embryos used in developmental biology are now too broad to be stored in any format other than a database (eg, JB L. Bard, Sem.Cell.Develop.Biol., 1997,8: 455-458; RA Baldock et al., Sem.Cell.Develop.Biol., 1997, 8: 499-507; D.Davidson et al., Sem.Cel. Develop.Biol., 1997,8: 509-511; JB Bard et al., Genome Res., 1998,8: 859-863; FJ Verveek et al., Int.J.Dev.Biol., 1999, 43: 761-771; J. Streicher et al., Nat. Genet., 2 00,25: 147-152; D.Davidson and R.Baldock, Nat.Rev.Genet, 2001,2:. 409-418; J.Sharpe et al., Science, 2002,296: 541-545).
胚遺伝子の発現についての情報はまた、着床前発生の異なる段階でヒトの個々の着床前の胚を使用して得られた（例えば、Ｙ．Ｖｅｒｌｉｎｓｋｙら、Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１９９８，４；５７１−５７５；Ｄ．Ｍ．Ｇｏｕら、Ｇｅｎｅ，２００１，２７８：１４１−１４７を参照のこと）。この戦略は、未受精の卵母細胞から胚盤胞段階へのヒト着床前発生の異なる段階で特異的に発現されるヒト遺伝子の同定および単離を可能にした（Ｊ．Ａｄｊａｙｅら、Ｊ．Ａｓｓｉｓｔ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９８，１５：３４４−３４８；Ｃ．Ｈｏｌｄｉｎｇら、Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２０００，６：８０１−８０９；Ｍ．Ｍｏｎｋら、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，２００１，１３：５１−５７）。 Information about embryonic gene expression was also obtained using individual human preimplantation embryos at different stages of preimplantation development (eg, Y. Verlinsky et al., Mol. Hum. Reprod., 1998). 4; 571-575; DM Gou et al., Gene, 2001, 278: 141-147). This strategy allowed the identification and isolation of human genes that were specifically expressed at different stages of human preimplantation development from the unfertilized oocyte to the blastocyst stage (J. Adjaye et al., J Assist.Reprod.Genet., 1998,15: 344-348; C.Holding et al., Mol.Hum.Reprod.2000,6: 801-809; M.Monk et al., Reprod.Fertil.Dev., 2001,13. : 51-57).
本発明の方法は、生きたヒトの胎児からのＲＮＡの直接的分析に基づくという利点を有する。特に、本発明の方法は、異なる在胎齢の核型的および発生的に正常な男の胎児および正常な女の胎児におけるｍＲＮＡ遺伝子発現のベースラインレベルを確立するために使用され得る。本発明において使用される胎児ＲＮＡが羊水から抽出されるので、遺伝子発現パターンが確立され得る妊娠期間は、羊水穿刺が「安全」であることが決定されている期間に対応する。 The method of the present invention has the advantage of being based on direct analysis of RNA from a live human fetus. In particular, the methods of the invention can be used to establish baseline levels of mRNA gene expression in karyotypically and developmentally normal male and normal female fetuses of different gestational age. Since fetal RNA used in the present invention is extracted from amniotic fluid, the gestational period during which a gene expression pattern can be established corresponds to the period during which it is determined that amniocentesis is “safe”.
本発明の方法はまた、異なる在胎齢（ここで、遺伝子発現パターンの一つ以上の特徴が、胎児の発生における時間または事象と相関する）の核型的および発生的に正常な男の胎児および正常な女の胎児について発生遺伝子発現パターンを確立するために使用され得る。 The methods of the present invention also include karyotypically and developmentally normal male fetuses of different gestational ages (where one or more characteristics of gene expression patterns correlate with time or events in fetal development) and It can be used to establish developmental gene expression patterns for normal female fetuses.
異なる在胎齢の胎児の遺伝子発現パターンについての知識は、子宮内の正常な発生プロセスのもとにある基礎的な遺伝子機構のより良い理解を提供するはずである。一旦この知識が本発明に従って得られると、特定の出産時欠損、発生異常、および他の臨床的状態を担う遺伝子が同定されそしてマッピングされ得、これは次いで、子宮内での異常な発生プロセスのもとにある基礎的な遺伝子機構のより良い理解を導く。 Knowledge of gene expression patterns in fetuses of different gestational ages should provide a better understanding of the basic genetic mechanisms underlying normal developmental processes in the uterus. Once this knowledge is obtained in accordance with the present invention, genes responsible for specific birth defects, developmental abnormalities, and other clinical conditions can be identified and mapped, which in turn can be used to identify abnormal developmental processes in the uterus. Guide a better understanding of the underlying basic genetic mechanisms.
例えば、ヒト腎臓炎の間、本発明の方法を使用して得られる遺伝子発現プロフィールは、正常な腎臓の発生、ならびに腎異形成または小児腎臓悪性疾患（ウィルムス腫瘍）を生じ得る、この正常なプロセスの異常への洞察を提供し得る。 For example, during human nephritis, the gene expression profile obtained using the methods of the present invention can result in normal kidney development, as well as renal dysplasia or childhood renal malignancy (Wilms tumor). Can provide insight into the anomalies.
同様に、在胎齢が小さい（ＳＧＡ）胎児および在胎齢が適切な（ＡＧＡ）胎児の遺伝子発現パターンは、本発明の方法を使用して比較され得る。在胎齢が小さい赤ん坊は、通常、同じ在胎齢の赤ん坊に対して、１００分位数の１０番目未満の出産時の体重を有する。ＳＧＡはまた、低血糖症、低体温症、および赤血球増加症を含む特定の代謝異常を包含し得る。出産時低体重の赤ん坊は、周産期の罹患率および死亡率に対する不均衡な寄与をもたらす。さらに、乏しい認知発達、神経学的欠陥、心血管疾患の発生、高血圧、閉塞性肺疾患、糖尿病、高コレステロール濃度および腎臓損傷のような出生後および後の人生において生じる問題は、出産時低体重と関連していることが報告されている（Ｃ．Ｈ．Ｄ．Ｆａｌｌら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．，２００３，１３３，１７４７Ｓ−１７５６Ｓ）。 Similarly, gene expression patterns of small gestational age (SGA) fetuses and appropriate gestational age (AGA) fetuses can be compared using the methods of the invention. A baby with a small gestational age usually has a birth weight less than the tenth percentile of the centile relative to a baby of the same gestational age. SGA may also include certain metabolic abnormalities including hypoglycemia, hypothermia, and erythrocytosis. Low birth weight babies provide an unbalanced contribution to perinatal morbidity and mortality. In addition, problems arising in postnatal and later life such as poor cognitive development, neurological deficits, occurrence of cardiovascular disease, hypertension, obstructive pulmonary disease, diabetes, high cholesterol levels and kidney damage are low birth weight (CHD Fall et al., J. Nutr., 2003, 133, 1747S-1756S).
同様に、本発明の方法は、正常な肺遺伝子発現または遅延した肺遺伝子発現のプロフィールが確立され得るか否かを決定するために、肺成熟試験を受ける胎児からの羊水から抽出された胎児ＲＮＡを分析するために使用され得る。 Similarly, the method of the present invention can be used to determine whether normal or delayed lung gene expression profiles can be established, fetal RNA extracted from amniotic fluid from fetuses undergoing lung maturation testing Can be used to analyze.
次いで、本発明の方法によって得られる情報は、胎児期診断を提供するために使用され得る。より詳細には、胎児の遺伝子発現パターンと、異なる在胎齢の核型的および発生的に正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ遺伝子の発現のベースラインレベルとの比較は、胎児において異常に発現される遺伝子の検出および同定を可能にする。従って、羊水穿刺と対にされる場合、本発明の胎児期診断の方法は、標準的技術を使用して現在利用可能でない胎児についての多くの情報を導く。 The information obtained by the method of the present invention can then be used to provide a fetal diagnosis. More specifically, comparison of fetal gene expression patterns with baseline levels of mRNA gene expression established for karyotypically and developmentally normal fetuses of different gestational age is abnormally expressed in the fetus Allows detection and identification of genes. Thus, when paired with amniocentesis, the method of fetal diagnosis of the present invention leads to a lot of information about fetuses that are not currently available using standard techniques.
さらに、特定の出産時欠損、発生異常、または他の臨床状態において異常に発現されることが本発明の方法によって示される新規遺伝子はまた、母の血液中の増幅に対する将来の標的として潜在的に役立つ（それによって、妊娠した女性が羊水穿刺を受ける必要性を排除する）。 In addition, novel genes that are shown by the methods of the invention to be abnormally expressed in certain birth defects, developmental abnormalities, or other clinical conditions are also potentially as future targets for amplification in maternal blood. Useful (thus eliminating the need for pregnant women to have amniocentesis).
（Ｖ−キット）
別の局面において、本発明は、本発明の方法を実行するために有用な材料を含むキットを提供する。
(V-kit)
In another aspect, the present invention provides kits comprising materials useful for performing the methods of the present invention.
本発明のキットは、以下の成分のうちのいくらかまたは全てを含む：妊娠した女性から得られた羊水のサンプルから無細胞胎児ＲＮＡを抽出するための材料；複数の遺伝子プローブを含む遺伝子発現アレイであって、ここで、各遺伝子プローブがアレイを形成するために基材表面に異なるスポットに固定される、遺伝子発現アレイ；異なる在胎齢の核型的および発生的に正常な男の胎児および正常な女の胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルを含むデータベース；異なる在胎齢の核型的および発生的に正常な男の胎児および正常な女の胎児について確立された発生遺伝子発現パターンを含むデータベース；ならびに本発明の方法に従って材料、データベースおよび遺伝子発現アレイを使用するための説明書。 The kit of the invention comprises some or all of the following components: a material for extracting cell-free fetal RNA from a sample of amniotic fluid obtained from a pregnant woman; a gene expression array comprising a plurality of gene probes Wherein each gene probe is immobilized at a different spot on the substrate surface to form an array; a gene expression array; karyotypically and developmentally normal male fetuses of different gestational age and normal Database containing baseline levels of mRNA expression established for female fetuses; Database containing developmental gene expression patterns established for karyotypically and developmentally normal male fetuses and normal female fetuses of different gestational ages And instructions for using materials, databases and gene expression arrays in accordance with the methods of the invention.
本発明のキットはまた、検出可能剤を用いて核酸のサンプルを標識するための材料を含み得る。検出可能剤は、蛍光標識、例えば、蛍光色素（例えば、Ｃｙ−３ＴＭ、Ｃｙ−５ＴＭ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、ローダミン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、ならびにこれらの化合物の等価物、アナログ、誘導体、および組み合わせ）を含み得る。あるいは、検出可能剤は、ハプテン、例えば、ビオチン／アビジン系を含み得る。 The kits of the invention can also include materials for labeling a sample of nucleic acid with a detectable agent. The detectable agent is a fluorescent label, such as a fluorescent dye (eg, Cy-3 ™ , Cy-5 ™ , Texas Red, FITC, phycoerythrin, rhodamine, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, carbocyanine, merocyanine, styryl dye, oxonol dye. , BODIPY dyes, and equivalents, analogs, derivatives, and combinations of these compounds). Alternatively, the detectable agent can comprise a hapten, such as a biotin / avidin system.
本発明のキットはまた、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液、ＲＮａｓｅインヒビター、キャリアＲＮＡおよび／またはＨｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを含み得る。 The kits of the invention can also include hybridization and wash buffers, RNase inhibitors, carrier RNA and / or Human Cot-1 DNA.
本発明のキットは、必要に応じて、各個々の試薬のための異なる容器を含む。各成分は、そのそれぞれの容器においてアリコートにされることが適切である。キットの容器は、必要に応じて、少なくとも１つのバイアル、アンプル、試験管、フラスコ、またはボトルを含む。キットの個々の容器は、好ましくは、商業的な販売のためにしっかり拘束して保持される。 The kits of the invention optionally include different containers for each individual reagent. Suitably each component is aliquoted in its respective container. The kit containers optionally include at least one vial, ampoule, test tube, flask, or bottle. The individual containers of the kit are preferably held tightly for commercial sale.
以下の実施例は、本発明を作製しそして実施する様式を記載する。しかし、これらの実施例が説明の目的だけであり、本発明の範囲を制限することを意図しないことが理解されるべきである。さらに、実施例の記載が過去時制で提示されない場合、明細書の残りと同様に、テキストは、実験が実際に実行されたかまたはデータが実際に得られたことを示唆することを意図しない。 The following examples describe the manner in which the present invention is made and practiced. However, it should be understood that these examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention. Further, if the example description is not presented in a past tense, as with the rest of the specification, the text is not intended to suggest that the experiment was actually performed or that the data was actually obtained.
このセクションで提示される結果の大部分は、最近の科学的刊行物（Ｐ．Ｂ．Ｌａｒｒａｂｂｅｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｆｅｂ．２００５、刊行中）（これは、その全体が、本明細書中において参考として援用される）において本出願人によって記載されている。 Most of the results presented in this section are based on recent scientific publications (P.B.Larlabbee et al., J.Am.Med.Assoc., Feb. 2005, published). Which is incorporated herein by reference).
（材料および方法）
（羊水収集物）
本明細書中に報告される研究についての羊水上清サンプルを得るために、Ｔｕｆｔｓ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）およびＷｏｍｅｎ ａｎｄ Ｉｎｆａｎｔｓ’Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓから許可を得た。
(Materials and methods)
(Amniotic fluid collection)
Permission was obtained from Tufts-New England Medical Center (Boston, MA) and Women and Infants' Hospital (Providence, RI) Institutional Review Boards to obtain amniotic fluid supernatant samples for the studies reported herein. .
（症例）健常な妊娠において、１０ｍＬと３０ｍＬとの間の羊水を、胎嚢から安全に取り出すが、臨床試験（核型分析およびα−フェトプロテイン測定を含む）に続いて、約８〜１５ｍＬのみの上清を残す。予備的実験は、正常な単生児由来のこの残りの容量の羊水が、マイクロアレイ分析のための十分な量のｍＲＮＡを含まないかもしれないことを示した。従って、５個の大容量の羊水サンプルを、羊水過多症に対する治療的羊水減少を受ける４人の女性から得た。これらの女性の内の二人が、水症を有する胎児（２９ ４／７週の在胎齢（水症１）および３２週（水症２））を有し、一人が、双胎児輸血（ＴＴＴ）症候群を有する胎児（２０週の在胎齢（ＴＴＴ２））を有し、そして別の女性が、２つの異なる妊娠期間で羊水減少を受けた胎児ＴＴＴ（２１ ６／７週（ＴＴＴ３）および２４ ３／７週（ＴＴＴ１））を有し、従って、２つのサンプルを提供した。無細胞上清を、１０分間、少なくとも３５０×ｇの遠心分離によって得た。 (Case) In a healthy pregnancy, between 10 and 30 mL of amniotic fluid is safely removed from the fetal sac, but only about 8-15 mL following clinical trials (including karyotype analysis and α-fetoprotein measurement) Leave Qing. Preliminary experiments have shown that this remaining volume of amniotic fluid from normal single babies may not contain sufficient amounts of mRNA for microarray analysis. Thus, 5 large volume amniotic fluid samples were obtained from 4 women undergoing therapeutic amniotic fluid reduction for hyperamniotic fluid. Two of these women have fetuses with hydrosis (29 4/7 weeks gestational age (hydrosis 1) and 32 weeks (hydrosis 2)), and one with twin fetal blood transfusion (TTT). ) Fetus TTT (21 6/7 weeks (TTT3) and 24 3) having a fetus with syndrome (20 weeks gestational age (TTT2)) and another woman undergoing amniotic fluid reduction in two different gestational periods / 7 weeks (TTT1)) and therefore provided two samples. Cell-free supernatant was obtained by centrifugation at least 350 × g for 10 minutes.
（コントロール）比較のための健常な胎児から十分なＲＮＡを得るために、凍結され保管された羊水上清の複数の１０ｍＬサンプルを、大きなプールを形成するために組み合わせた。これらのサンプルは、母が高齢のため慣用的な遺伝子羊水穿刺を受けた１７週と１８週との間の在胎齢の妊娠女性から得た。男の胎児由来の６個のサンプルおよび女の胎児由来の６個のサンプルを、公知の正常な核型および類似の在胎齢に基づいて選択した。これらのコントロールサンプルを、性別によって組み合わせ、各６０ｍＬのプールは、平均１７週の胎児の羊水上清を表す。無細胞上清を、１０分間、３５０×ｇの遠心分離によって得た。 (Control) To obtain sufficient RNA from healthy fetuses for comparison, multiple 10 mL samples of frozen and stored amniotic fluid supernatants were combined to form a large pool. These samples were obtained from pregnant women of gestational age between 17 and 18 weeks when the mother was aged and received routine gene amniocentesis. Six samples from male fetuses and six samples from female fetuses were selected based on known normal karyotype and similar gestational age. These control samples were combined by gender, with each 60 mL pool representing an average of 17 weeks of fetal amniotic fluid supernatant. Cell free supernatant was obtained by centrifugation at 350 × g for 10 minutes.
（オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション）
遠心分離後、全ＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｖａｃｕｕｍ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｌａｒｇｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｖｏｌｕｍｅｓ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を、改変して使用して、全てのサンプルから抽出した。このプロトコルの改変は、以下を含んだ：（１）カラム当たりの各５ｍＬの羊水について２０ｍＬへの、緩衝液ウイルス溶解緩衝液（ＡＶＬ）およびエタノールの量の増加、ならびに（２）６０ｍＬシリンジ（これは、大きなサンプル容量に適合するためにカラムを回転させるために装着される）の使用。簡単に述べると、５ｍＬの羊水上清を２０ｍＬのＱｉａｇｅｎ緩衝液ＡＶＬと組み合わせ、そして徹底的に混合した。この混合物に、２０ｍＬの１００％エタノールを添加し、そしてサンプルを再び徹底的に混合した。次いで、この溶液を減圧マニホルドおよびシリンジアタッチメントによって、複数のＱｉａＡｍｐに適用した。結合した核酸を、緩衝液ＡＷ１を用いて洗浄し、次いで、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｓｅインヒビターを含まないＤＮａｓｅキットとともにカラムで消化し、続いて、緩衝液ＡＷ１およびＡＷ２を用いてさらなる洗浄を行った。ＲＮＡを、カラム当たり、５０μＬのＲＮＡｓｅインヒビターを含まない水を用いて溶出した。溶出剤をプールし、そして３μｌのアリコートを１２倍に希釈し、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）転写物のＲＴ−ＰＣＲ定量のために使用した以外、エタノール沈殿（２．５容量の１００％ＥｔＯＨ、３Ｍ ＮａＡｃ、グリコーゲン）に供した。
(Oligonucleotide hybridization)
After centrifugation, total RNA was extracted from all samples using a modified QIAamp Virtual RNA Vacuum Protocol for Large Sample Volumes (Qiagen, Inc., Valencia, Calif.). Modifications to this protocol included: (1) increasing the volume of buffer virus lysis buffer (AVL) and ethanol to 20 mL for each 5 mL of amniotic fluid per column, and (2) 60 mL syringe (this Use to rotate the column to fit a large sample volume). Briefly, 5 mL of amniotic fluid supernatant was combined with 20 mL of Qiagen buffer AVL and mixed thoroughly. To this mixture was added 20 mL of 100% ethanol and the sample was thoroughly mixed again. This solution was then applied to multiple QiaAmps by vacuum manifold and syringe attachment. The bound nucleic acid was washed with buffer AW1, then digested on the column with DNase kit without Qiagen RNAse inhibitor, followed by further washing with buffers AW1 and AW2. RNA was eluted using 50 μL of RNAse inhibitor free water per column. The eluent was pooled and 3 μl aliquots diluted 12-fold and used for RT-PCR quantification of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) transcripts, ethanol precipitation (2.5 vol. 100% EtOH, 3M NaAc, glycogen).
ｍＲＮＡを２回増幅し、ＧｅｎＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓｍａｌｌ Ｓａｍｐｌｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｉｃａｌ Ｎｏｔｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に記載されるように、ビオチン化ヌクレオシドトリホスフェートの存在下でインビトロ転写によってｃＲＮＡに変換した。このプロトコルは、ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ．に詳細に記載される。簡単に述べると、Ｔ７−オリゴｄＴプライマーを使用して、全ＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、ポリＡ ｍＲＮＡのみが標的化されることを確実にした。次いで、ｃＤＮＡの第２の鎖を最初の鎖から合成した。二本鎖ｃＤＮＡを、相ロック（ｐｈａｓｅ ｌｏｃｋ）ゲル−フェノール／クロロホルム抽出を使用して精製した。二本鎖ｃＤＮＡから、インビトロ転写を、Ａｍｂｉｏｎ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔプロトコルを用いて実施した。インビトロ転写物を、製造業者のプロトコルに従って、ＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。次いで、ｃＲＮＡをランダムヘキサマーを使用して、別の回のｃＤＮＡ合成に供した。このプロトコルからの二本鎖ｃＤＮＡを、第２のインビトロ転写反応に使用し、この回は、ビオチン化リボヌクレオチドを使用して、Ｅｎｚｏ ＢｉｏＡｒｒａｙ転写標識キットを用いた。サンプルを、Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌｓ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてフェノール−クロロホルム抽出によってさらに精製した。ビオチン化ｃＲＮＡの量および質を確認するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（ｒ３）に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｔｅｓｔ３オリゴヌクレオチドアレイへハイブリダイゼーションする前に、ゲル電気泳動を使用して分析し、そしてフラグメント化した。 The mRNA is amplified twice and the presence of a biotinylated nucleoside triphosphate in the presence of a biotinylated nucleoside triphosphate as described by GenChip® Eukaryotic Small Sample Labeling Technical Note (Affymetrix, Inc., Santa Clara, Calif.). Converted to. This protocol is based on www. affymetrix. com. Are described in detail. Briefly, T7-oligo dT primers were used to transcribe total RNA into cDNA to ensure that only poly A mRNA was targeted. The second strand of cDNA was then synthesized from the first strand. Double stranded cDNA was purified using a phase lock gel-phenol / chloroform extraction. From double stranded cDNA, in vitro transcription was performed using the Ambion MEGAscript protocol. In vitro transcripts were purified using RNAeasy columns (Qiagen) according to the manufacturer's protocol. The cRNA was then subjected to another round of cDNA synthesis using random hexamers. Double stranded cDNA from this protocol was used for a second in vitro transcription reaction, this time using an Enzo BioArray transcription labeling kit using biotinylated ribonucleotides. Samples were further purified by phenol-chloroform extraction using Phase Lock Gels (Eppendorf AG, Hamburg, Germany). To confirm the quantity and quality of biotinylated cRNA, analyze using gel electrophoresis prior to hybridization to Affymetrix Test3 oligonucleotide array according to Affymetrix GeneChip® Expression Analysis Technical Manual (r3), And it was fragmented.
引き続いて、１５〜７５μｇのビオチン化ｃＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイにハイブリダイズした。上で既に述べたように、これらのアレイは、２２，２８３個のプローブセットおよび５００，０００を超える異なるオリゴヌクレオチド特徴から構成され、１４，２３９個の最も良く特徴付けられたヒト遺伝子（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）を表す。 Subsequently, 15-75 μg of biotinylated cRNA was hybridized to the Affymetrix HG-U133A array. As already mentioned above, these arrays are composed of 22,283 probe sets and over 500,000 different oligonucleotide features, with 14,239 best-characterized human genes (Affymetrix, Inc.).
（マイクロアレイデータ分析および統計的分析）
各アレイを、３μｍ／画素の解像度を有する共焦点スキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、５７０ｎｍで走査した。画素強度を測定し、そしてＭｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｕｉｔｅ ５．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して発現シグナルを抽出および分析した。全てのマイクロアレイを、全ての実験からの発現を直接比較し得るように、「Ａｌｌ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔｓ」スケーリング選択肢を使用して、５０の同じ標的シグナルにスケールを合わせた。
(Microarray data analysis and statistical analysis)
Each array was scanned at 570 nm using a confocal scanner (Agilent, Palo Alto, CA) with a resolution of 3 μm / pixel. Pixel intensity was measured and expression signals extracted and analyzed using Microarray suite 5.0 (Affymetrix). All microarrays were scaled to 50 identical target signals using the “All Probe Sets” scaling option so that expression from all experiments could be directly compared.
ＴＴＴまたは水症の症例のそれぞれとプールされた男性のコントロールとの間で、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ５．０ ソフトウェアによって、Ｗｉｌｃｏｘｏｎサインランク検定を使用して、比較分析を行った。２１ ６／７週のＴＴＴ３サンプルおよびプールされた女性サンプルからのデータは、ノイズの多いデータ（以下を参照のこと）に起因して使用しなかった。データをＥｘｃｅｌフィールド（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，ｖ．９７ ＳＲ−２）にコピーし、そして症例またはコントロールのいずれかにおいて「存在する」と呼ばれるプローブセットから選別した。各症例についてのデータは、プールした男性コントロールと比較して、二倍またはそれ以上の差異で、増加するかまたは減少した転写物に狭められた。次いで、２つの残りのＴＴＴデータセットを、互いに比較して（２つの水症データセットも同様にした）、プールされたコントロールと比較して同じ疾患を有する両方の症例において一貫して増加または減少した遺伝子を検出した。最後に、目的の選択した遺伝子（例えば、Ｙ染色体遺伝子、界面活性因子、ムチン、ケラチン、アクアポリン、および胎盤遺伝子）の発現レベルを、プールされた男性コントロールと比較して、全ての症例において再調査した。 A comparative analysis was performed between each TTT or hydrocephalus case and the pooled male controls using the Microarray Suite 5.0 software using the Wilcoxon sign rank test. Data from 21 6/7 week TTT3 samples and pooled female samples were not used due to noisy data (see below). Data was copied into the Excel field (Microsoft, v. 97 SR-2) and screened from a probe set called “present” in either case or control. Data for each case was narrowed to transcripts that increased or decreased by a factor of 2 or more compared to pooled male controls. The two remaining TTT datasets were then compared to each other (and the two hydrosis datasets were similar) and consistently increased or decreased in both cases with the same disease compared to the pooled control Detected genes. Finally, review the expression levels of the selected genes of interest (eg, Y chromosome genes, surfactants, mucins, keratins, aquaporins, and placental genes) in all cases compared to pooled male controls did.
（実施例１：予備的試験−羊水からの胎児ｍＲＮＡ抽出）
無細胞胎児ｍＲＮＡを、新鮮な残留羊水サンプルおよび凍結された残留羊水サンプルの両方から首尾良く抽出および増幅させた。羊水サンプルを、最初に、慣用的な診断目的で収集した；上清は、通常、核型分析後に捨てられるが、治療的羊水穿刺において、全サンプルを捨てる。細胞遺伝学実験室において、サンプルを１０分間、３５０×ｇで遠心分離して、培養のための細胞を取り出した。サンプルを、新鮮なサンプルの場合は受け取ったときに、または凍結したサンプルの場合は解凍直後にのいずれかで、１３，０００×ｇで再び遠心分離した。これは、抽出されたＲＮＡが本当に細胞外であったことを確実にした。
(Example 1: Preliminary test-fetal mRNA extraction from amniotic fluid)
Cell-free fetal mRNA was successfully extracted and amplified from both fresh and frozen residual amniotic fluid samples. Amniotic fluid samples were first collected for routine diagnostic purposes; supernatants are usually discarded after karyotype analysis, but in therapeutic amniotic punctures, all samples are discarded. In the cytogenetics laboratory, samples were centrifuged at 350 × g for 10 minutes to remove cells for culture. Samples were centrifuged again at 13,000 xg, either as received for fresh samples or immediately after thawing for frozen samples. This ensured that the extracted RNA was truly extracellular.
ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡミニキットを使用して、上記のような減圧プロトコルに従って、抽出した。サンプルの開始体積は、代表的に、４２０μＬであった。合成ポリＡ ＲＮＡ（１５〜２５μｇ）を、キャリアとして、抽出の間、このサンプルに添加した。ＲＮＡを、６０μＬの最終体積まで濃縮した。 RNA was extracted using the Qiagen Viral RNA mini kit according to the vacuum protocol as described above. The starting volume of the sample was typically 420 μL. Synthetic poly A RNA (15-25 μg) was added as a carrier to this sample during extraction. RNA was concentrated to a final volume of 60 μL.
最初に、ｍＲＮＡを、凍結したサンプルから抽出し、そしてこのｍＲＮＡは、５００ｐｇ／ｍＬと１０００ｐｇ／ｍＬとの間の濃度で存在した。ＲＮＡが凍結／解凍プロセスおよび／またはサンプルの取り出しと凍結との間の時間経過によって分解するか否かを試験するために、凍結したサンプルを解凍し、そして４２０μＬの２つのアリコートを取り出した；一方のアリコートは、即時のプロセシングのためであり、そして一方は、４℃で３時間保持し、その後、ＲＮＡ抽出に供したものであった。全ての場合において、３時間の期間にわたる増幅可能なＲＮＡが、かなり損失された。しかし、羊水が入手の直後に凍結される場合、新鮮なサンプルと比較して、より多くのＲＮＡが、凍結したサンプルから回収された。 Initially, mRNA was extracted from frozen samples and this mRNA was present at a concentration between 500 pg / mL and 1000 pg / mL. To test whether the RNA is degraded by the freeze / thaw process and / or the time course between sample removal and freezing, the frozen sample was thawed and two 420 μL aliquots were removed; Aliquots were for immediate processing, and one was held at 4 ° C. for 3 hours before being subjected to RNA extraction. In all cases, amplifiable RNA over a 3 hour period was significantly lost. However, if the amniotic fluid was frozen immediately after acquisition, more RNA was recovered from the frozen sample compared to the fresh sample.
これらの予備的な実験から、サンプル獲得の時点で羊水中に存在する細胞外ＲＮＡが、経時的に分解することが明らかである。しかし、羊膜細胞の溶解および分解から生じる細胞外ＲＮＡもまた、経時的にか、またはサンプルの凍結および解凍からのいずれかで、増加する。細胞外ＲＮＡの最も正確な評価を得るために、サンプルは、取り出された後に、可能な限り早く、すべての細胞を除去される必要がある。次いで、サンプルは、即座にプロセシングされるか、またはＲＮＡｓｅインヒビターの添加に供され、そして−８０℃で凍結される必要がある。 From these preliminary experiments, it is clear that extracellular RNA present in amniotic fluid at the time of sample acquisition degrades over time. However, extracellular RNA resulting from lysis and degradation of amniotic cells also increases, either over time or from freezing and thawing of the sample. In order to obtain the most accurate assessment of extracellular RNA, the sample should be cleared of all cells as soon as possible after removal. The sample must then be processed immediately or subjected to the addition of RNAse inhibitor and frozen at -80 ° C.
（実施例２：大きい体積の羊水サンプル−プロセシングおよび貯蔵）
いくつかの例において、大きい体積（１Ｌより大きい）の羊水が、治療の理由（すなわち、羊水過多症）により取り出される。これらのサンプル（これらは、通常、処分される）は、大きい開始量の胎児無細胞ＲＮＡを提供する。このような高体積のサンプルのうち、９個が現在までに収集され、そして現在貯蔵されている。代表的に、羊水を、１Ｌの減圧シールされた容器内に、滅菌様式で取り出した。受容の際に、この流体を５０ｍＬのアリコートに分割し、そして８００×ｇで１５分間遠心分離し、あらゆる細胞物質を除去した。これらのサンプルからの上清（４５ｍＬ）を、−８０℃での貯蔵のために、２２５ｍＬの容器内にプールした。
Example 2: Large volume amniotic fluid sample-processing and storage
In some instances, a large volume (greater than 1 L) of amniotic fluid is removed for treatment reasons (ie, hyperamniotic fluid). These samples (which are usually disposed of) provide a large starting amount of fetal cell-free RNA. Of such high volume samples, nine have been collected to date and are currently stored. Typically, amniotic fluid was removed in a sterile manner into a 1 L vacuum sealed container. Upon receipt, the fluid was divided into 50 mL aliquots and centrifuged at 800 × g for 15 minutes to remove any cellular material. Supernatants (45 mL) from these samples were pooled in 225 mL containers for storage at -80 ° C.
（実施例３：大きい体積の羊水サンプル−マイクロアレイのためのＲＮＡの抽出および調製）
２つの大きい体積の羊水サンプルを得、そして上記のようにプロセシングした。一方は、妊娠２４と３／７週間の双子の女性胎児を保有する妊婦由来であった（ＴＴＴ１で示される）。他方のサンプルを、男性胎児が未知の病因のハイドロープ（ｈｙｄｒｏｐ）を有する、妊娠２９と４／７週間の妊婦から採取した（Ｈｙｄｒｏｐｓ１で示される）。さらに、３０ｍＬの各サンプルを（５ｍＬのアリコートで）採取し、そして上記のようなＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｖａｃｕｕｍ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅｓ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の改変を使用してアリコートを凍結させる代わりに、ＲＮＡを抽出した。２つの３０ｍＬのサンプルは、それぞれ７．２ｎｇおよび１２．７ｎｇを与えた。より多量のＲＮＡを得る目的で、上記サンプル由来の予め凍結させた６０ｍＬの羊水上清を、さらなる抽出のために使用した。これらのサンプルをプールし、沈殿させ、そしてＲＮＡｓｅインヒビターを含まない水１０μＬに再懸濁させ、１７ｎｇ（サンプルＴＴＴ１）および３６ｎｇ（サンプルＨｙｄｒｏｐｓ１）の最終的な全収量を得た（表１を参照のこと）。
Example 3: Large volume amniotic fluid sample-RNA extraction and preparation for microarrays
Two large volume amniotic fluid samples were obtained and processed as described above. One was from a pregnant woman carrying twin female fetuses at 24 and 3/7 weeks of pregnancy (denoted TTT1). The other sample was taken from a pregnant woman at 29 and 4/7 weeks of pregnancy (denoted as Hydrops1) where the male fetus has a hydrop of unknown etiology. Further, instead of taking 30 mL of each sample (in 5 mL aliquots) and freezing the aliquots using a modification of QIAamp Virtual RNA Vacuum Protocol for Large Volumes (Qiagen, Inc., Valencia, Calif.) As described above In addition, RNA was extracted. Two 30 mL samples gave 7.2 ng and 12.7 ng, respectively. In order to obtain larger amounts of RNA, 60 mL of pre-frozen amniotic fluid supernatant from the above sample was used for further extraction. These samples were pooled, precipitated, and resuspended in 10 μL of RNAse inhibitor-free water to give a final total yield of 17 ng (sample TTT1) and 36 ng (sample Hydrops1) (see Table 1) thing).
サンプルを、上記のように、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘウェブサイトから入手可能なＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標） Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓｍａｌｌ Ｓａｍｐｌｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅからの方法を使用して、転写および標識した。標識されたｃＲＮＡを、ハイブリダイゼーションのための調製における化学的断片化に供した（図１を参照のこと）。増幅に続いて、ＵＶ分光光度計分析は、標識されたｃＲＮＡの６１．３μｇ（サンプルＴＴＴ１）および２４．９μｇ（サンプルＨｙｄｒｏｐｓ１）の収量を示した。これは、マイクロアレイへのハイブリダイゼーションのために充分であるよりも多かった。 Samples were transcribed and labeled as described above using the method from GeneChip® Eukaryotic Small Sample Labeling Technical Note available from the Affymetrix website. Labeled cRNA was subjected to chemical fragmentation in preparation for hybridization (see FIG. 1). Following amplification, UV spectrophotometric analysis showed a yield of 61.3 μg (sample TTT1) and 24.9 μg (sample Hydrops1) of labeled cRNA. This was more than sufficient for hybridization to a microarray.
（実施例４：遺伝子発現マイクロアレイへのハイブリダイゼーション）
最初に、５μｇの各サンプルを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標） Ｔｅｓｔ３アレイにハイブリダイズさせ、続いてシグナルの抗体増幅を行った。このＴｅｓｔ３アレイは、発育の間中発現される２４のヒト遺伝子のサブセットを含む。得られたデータの分析により、ｃＲＮＡは、より大きいセットのヒト遺伝子を含むマイクロアレイへの引き続く増幅のために充分な質および量であることが示唆された。
(Example 4: Hybridization to gene expression microarray)
First, 5 μg of each sample was hybridized to a GeneChip® Test3 array followed by antibody amplification of the signal. This Test3 array contains a subset of 24 human genes that are expressed throughout development. Analysis of the data obtained suggested that the cRNA was of sufficient quality and quantity for subsequent amplification into a microarray containing a larger set of human genes.
次いで、ハイブリダイゼーションプロセスを、１５μｇの標識されたｃＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現マイクロアレイＨＧ−Ｕ１３３Ａ上に上記のようにロードすることによって、繰り返した。女性サンプルにおいて、マイクロアレイ上の２２，２８３のプローブセットのうちの８，０９７（３６．３％）が存在し、１３，７６２（６１．８％）が存在せず、そして４２４（１．９％）がわずかに発現された。男性サンプルにおいて、９，８６４（４４．１％）が存在し、１１，９９２（５３．８％）が存在せず、そして４５７（２．１％）がわずかに発現された。両方のサンプルにおける発現の最も高いレベルは、多くのリボソームタンパク質転写産物について見出されたが、これらの２つのサンプルの間で、これらの遺伝子の大部分の発現において、有意な差はなかった。各プローブセットについての２つのサンプル、またはサンプルの群の間での発現の増加または減少もまた、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号つき順位検定（定量的な確率値）およびＴｕｋｅｙのＢｉｗｅｉｇｈｔ法（底が２の対数での定量的な変化の程度）によって決定した。 The hybridization process was then repeated by loading 15 μg of labeled cRNA onto the Affymetrix gene expression microarray HG-U133A as described above. In female samples, 8,097 (36.3%) of 22,283 probe sets on the microarray are present, 13,762 (61.8%) are absent, and 424 (1.9%) ) Was slightly expressed. In the male sample, 9,864 (44.1%) was present, 11,992 (53.8%) was absent, and 457 (2.1%) was slightly expressed. The highest level of expression in both samples was found for many ribosomal protein transcripts, but there was no significant difference in the expression of most of these genes between these two samples. Increases or decreases in expression between two samples, or groups of samples, for each probe set are also shown in Wilcoxon's signed rank test (quantitative probability value) and Tukey's Biweight method (logarithm with base 2). Degree of quantitative change).
次いで、これらの２つのサンプルのハイブリダイゼーション結果を、互いに比較した。２２，２８３のプローブセットのうちで、これらのうちの１８，２６６（８２％）の発現のレベルにおいて、２つのサンプル間で差はなかった。重要なことに、遺伝子の数は、２つのサンプル間で有意に異なるレベルで表現された。これには、女性サンプルと比較した男性羊水サンプルにおいて、それぞれ有意に減少した１，４８０のプローブセット、または有意に増加した２，２５８のプローブセットが含まれた。さらに、これらの２つのサンプルの間で、それぞれ１２１のプローブセットがわずかに減少し、そして１５８のプローブセットがわずかに増加した。 The hybridization results of these two samples were then compared to each other. Of the 22,283 probe sets, there was no difference between the two samples at the level of expression of 18,266 (82%) of these. Importantly, the number of genes was expressed at significantly different levels between the two samples. This included 1,480 probe sets that were significantly reduced or 2,258 probe sets that were significantly increased, respectively, in male amniotic fluid samples compared to female samples. In addition, between these two samples, 121 probe sets each decreased slightly and 158 probe sets increased slightly.
異なるレベルで発現される遺伝子のサブセットが、図２に与えられる表に示される。これらの羊水サンプルは、男性胎児および女性胎児由来であるので、このことは、Ｙ染色体特異的転写産物の存在または非存在に基づく、マイクロアレイの成功の確認を可能にした。Ｙ染色体上に見出される遺伝子のうちの２つが、この表に示されており、これらの両方が、予測されるように、男性サンプルにおいて発現され、そして女性サンプルにおいては発現されなかった。また、図２の表に示されるように、２つのサンプルの間で異なるレベルで発現される遺伝子のいくつかは、分化プロセスおよび発育プロセスに関与する遺伝子を表す。これらの発現の差はまた、多くの組織特異的遺伝子、および遺伝子のファミリー（例えば、コラーゲン）において観察された。これらの予備的な結果は、ＴＴＴ症候群およびハイドロープの基底にある生物学についての、興味深い手がかりを提供する。さらなる実験のために、異なる在胎齢におけるｍＲＮＡ発現のベースラインレベルを確立する。 Subsets of genes that are expressed at different levels are shown in the table given in FIG. Since these amniotic fluid samples were derived from male and female fetuses, this allowed confirmation of microarray success based on the presence or absence of Y chromosome specific transcripts. Two of the genes found on the Y chromosome are shown in this table, both of which were expressed in male samples and not in female samples, as expected. Also, as shown in the table of FIG. 2, some of the genes that are expressed at different levels between the two samples represent genes involved in the differentiation and development processes. These differences in expression were also observed in many tissue-specific genes and gene families (eg, collagen). These preliminary results provide interesting clues about the biology underlying TTT syndrome and hydrops. For further experiments, establish baseline levels of mRNA expression at different gestational ages.
全体的に、これらのデータは、ｍＲＮＡが、羊水から首尾よく抽出され得、増幅され得、そしてヒト遺伝子発現マイクロアレイにハイブリダイズされ得ることを示唆する。このことは、羊水中の裸のｍＲＮＡが、全て分解するわけではないことを示唆する。さらに、使用される分析方法は、効果的であり、そして多量のデータの収集が可能である。得られた結果は、男性および女性の胎児における遺伝子発現の明確な差を示した。男性胎児におけるＹ染色体遺伝子のアップレギュレーションは、非常に確実である。他方で、ハイドロープを有する胎児における、サーファクタントに関連する遺伝子のアップレギュレーションは、魅力的であり、そしてさらなる調査の価値がある。得られた予備的データは、このアプローチが、有意かつ新たな知見を非常に導きやすいことを示す。 Overall, these data suggest that mRNA can be successfully extracted from amniotic fluid, amplified, and hybridized to a human gene expression microarray. This suggests that not all naked mRNA in amniotic fluid is degraded. In addition, the analytical method used is effective and a large amount of data can be collected. The results obtained showed a clear difference in gene expression in male and female fetuses. Up-regulation of the Y chromosome gene in male fetuses is very certain. On the other hand, the up-regulation of surfactant-related genes in fetuses with hydrops is attractive and worth further investigation. The preliminary data obtained show that this approach is very easy to guide significant and new findings.
（実施例５：遺伝子発現実験およびデータの分析）
実施例３および実施例４に記載される２つに加えて、サンプルからデータを得るために、３つの多量の羊水サンプルを、羊水過多症のための治療的羊水減少を受けている妊婦から、第二トリメスターまたは第三トリメスターのいずれかの間に得た。１人の女性は、ハイドロープを有する胎児を有し、そして２人の女性は、双胎児輸血（ＴＴＴ）症候群を有する胎児を有した。１人の女性は、胎児ＴＴＴを有し、この女性は、先にサンプルＴＴＴ１を与えられ、２つの異なる在胎齢において羊水減少を受け、そして２つのサンプルを提供した。
(Example 5: Gene expression experiment and data analysis)
In addition to the two described in Example 3 and Example 4, to obtain data from the samples, three large amniotic fluid samples were obtained from pregnant women undergoing therapeutic amniotic fluid reduction due to hyperamniotic fluid: Obtained during either the second or third trimester. One woman had a fetus with a hydrope and two women had a fetus with twin fetal blood transfusion (TTT) syndrome. One woman had fetal TTT, who had previously received sample TTT1, had amniotic fluid reduction at two different gestational ages, and provided two samples.
正常な胎児由来の羊水サンプルもまた、上記のように、比較の目的で使用した。 Normal fetal amniotic fluid samples were also used for comparison purposes as described above.
羊水サンプルを、−８０℃で凍結させた。８００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離することによって、細胞を除去し、その後、抽出または凍結させた。ＲＮＡを、上記のように抽出した。合計９０〜１８０ｍＬの羊水を、ＴＴＴまたはハイドロープを有する患者から抽出し、そして５７〜６２ｍＬを、正常な妊婦由来の２つのプールされたサンプル（１つの男性、１つの女性）について抽出した。次に、ＲＮＡを２倍に増幅させ、そして上記のように、ｃＲＮＡに転換した。これによって、抽出されたＲＮＡの８０００倍までの増幅を得、このことは、より少ない出発体積の羊水材料が使用され得ることを示唆する。これらのサンプルを、フェノール−クロロホルム抽出によってさらに精製し、そして上記のように、ｃＲＮＡサンプルを断片化し（図３を参照のこと）、ハイブリダイズし、染色し、そして走査した。 Amniotic fluid samples were frozen at -80 ° C. Cells were removed by centrifugation at 800 × g for 10 minutes at 4 ° C. and then extracted or frozen. RNA was extracted as described above. A total of 90-180 mL of amniotic fluid was extracted from patients with TTT or hydrops, and 57-62 mL was extracted for two pooled samples (one male, one female) from normal pregnant women. The RNA was then amplified by a factor of 2 and converted to cRNA as described above. This resulted in amplification of the extracted RNA up to 8000 times, suggesting that a smaller starting volume of amniotic fluid material could be used. These samples were further purified by phenol-chloroform extraction and cRNA samples were fragmented (see FIG. 3), hybridized, stained and scanned as described above.
アレイの走査を、上記のように実施し、そして比較分析を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号つき順位検定を使用して、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ５．０ソフトウェアによって、「症例」としてＴＴＴサンプルまたはハイドロープサンプルの各々について実施し、そして正常な核型男性サンプルを、「コントロール」としてプールした。 Array scans are performed as described above, and comparative analysis is performed on each of the TTT or hydrope samples as “cases” by the Microarray Suite 5.0 software using the Wilcoxon signed rank test. And normal karyotype male samples were pooled as “control”.
マイクロアレイへのハイブリダイゼーション。試験したサンプルのうちの５つ（実施例３および実施例４において先に記載された２つ、ならびに３つのさらなるサンプルＴＴＴ２、Ｈｙｄｒｏｐｓ２、およびプールされた男性コントロール）は、尺度因子によって測定される場合に、アレイに良好にハイブリダイズした。この尺度因子は、製造業者による推奨どおりに、互いの２倍以内であった。これらのアレイのうちの２つ（サンプルＴＴＴ３およびプールされた女性コントロールを用いて得られた）を、分析から排除した。これは、高い尺度因子および「存在」と称される少ない転写産物（サンプルの分解を示唆する）に起因する。残りの５つのサンプル（２つのＴＴＴサンプル、２つのハイドロープ、およびプールされた男性コントロール）については、画像の全体の平均バックグラウンド（５５．３７単位、範囲４９．６４〜６１．５０）は、全てのアレイにわたって非常に類似していた（代表的な値は、１つのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘあたり２０〜１００の範囲）。雑音（Ｑ）（サンプルの質およびＧｅｎｅＡｒｒａｙＴＭスキャナの電気的雑音の尺度）もまた、アレイにわたって匹敵していた（中央値２．２１単位、範囲２．０６〜２．３７）。アレイの変動性を最小にするために、目標値を５０に設定した。 Hybridization to microarray. Five of the samples tested (two previously described in Examples 3 and 4 and three additional samples TTT2, Hydrops2, and pooled male controls) are measured by a scale factor Hybridized well to the array. This scale factor was within twice of each other as recommended by the manufacturer. Two of these arrays (obtained using sample TTT3 and pooled female controls) were excluded from the analysis. This is due to high scale factors and a small transcript called “presence” (indicating sample degradation). For the remaining 5 samples (2 TTT samples, 2 hydrops, and pooled male controls), the overall average background of the image (55.37 units, range 49.64-61.50) is It was very similar across all arrays (typical values range from 20-100 per Affymetrix). Noise (Q) (sample quality and electrical array TM electrical noise measure) was also comparable across the array (median 2.21 units, range 2.06 to 2.37). The target value was set at 50 to minimize array variability.
ＲＮＡ一体性。分析された５つのサンプルについて、マイクロアレイ上に現れる転写産物の３６％の中央値（範囲１１〜４４％）を、「存在する」として検出し、６２％（範囲５４〜８８％）は、検出不可能（すなわち、「非存在」）であり、そして２％（範囲１〜２％）は、「わずか」であった。ランダムに分布する転写産物の存在に基づく、低レベルの偽ハイブリダイゼーションまたは相互ハイブリダイゼーションの証拠が存在した；これらの結果は、統計学的に有意ではなく、従って、分析に含めなかった。３つのサンプル（Ｈｙｄｒｏｐｓ１、ＴＴＴ１およびプールされた男性コントロール）は、アレイシグナルの輝度、尺度因子、およびいくつかのハウスキーピング遺伝子転写産物のレベルに基づいて、これらのアレイに非常に良好にハイブリダイズし、組織供給源から抽出されたｍＲＮＡに匹敵するデータを提供した。これらの３つのサンプルのうちの２つは、新鮮な羊水から即座に抽出されたｍＲＮＡの少なくとも一部分を含有した。プールされた男性コントロールは、凍結された、アーカイブされた羊水材料全体から構成された。 RNA integrity. For the five samples analyzed, the median of 36% of transcripts appearing on the microarray (range 11-44%) was detected as “present” and 62% (range 54-88%) were not detected. Possible (ie “absent”) and 2% (range 1-2%) was “slight”. There was evidence of low levels of pseudohybridization or reciprocal hybridization based on the presence of randomly distributed transcripts; these results were not statistically significant and were therefore not included in the analysis. Three samples (Hydrops1, TTT1 and pooled male control) hybridize very well to these arrays based on the intensity of the array signal, the scale factor, and the level of several housekeeping gene transcripts. Provided data comparable to mRNA extracted from tissue sources. Two of these three samples contained at least a portion of mRNA that was immediately extracted from fresh amniotic fluid. The pooled male controls consisted of the entire frozen, archived amniotic fluid material.
個々のサンプル中で、内部コントロール遺伝子（ＧＡＰＤＨおよびアクチン）の３’／５’比がいくらか変動しており、これを使用して、ＲＮＡサンプルおよびアッセイの質を評価した。これらのコントロール遺伝子が全てのサンプルにわたって比較される場合、特定のコントロール遺伝子は、全てのサンプルにおいて正常な（すなわち、３未満の）３’／５’比を一貫して有し、一方で、他のコントロール遺伝子は、常に、高い３’／５’比（１０〜１００）を有した。 There was some variation in the 3 '/ 5' ratio of internal control genes (GAPDH and actin) in individual samples, which was used to assess RNA sample and assay quality. When these control genes are compared across all samples, the particular control gene consistently has a normal (ie, less than 3) 3 ′ / 5 ′ ratio in all samples, while others The control genes always had a high 3 ′ / 5 ′ ratio (10-100).
ハイブリダイゼーションが、試験された７つのサンプルのうちの５つにおいて十分に良好に働くことを決定した後に、これらのアレイに含まれる遺伝子転写産物のレベルを試験して、観察されたパターンが、症例とコントロールとの間の既知の変数（性、在胎齢および疾患状態）と相関するか否かを調査した。 After determining that hybridization worked sufficiently well in 5 out of 7 samples tested, the levels of gene transcripts contained in these arrays were tested and the observed pattern was Whether it correlates with known variables (sex, gestational age and disease state) between control and control.
サンプル間での遺伝子発現の差。マイクロアレイ上に存在する２２，２８３の転写産物のうちの、２０％の中央値（範囲１５〜２９％）が、症例とプールされた男性コントロールとを比較する場合に、それらの発現レベルに有意な差を有した。図４および図５に提供される表は、それぞれ、両方のＴＴＴ胎児および両方のハイドロープ胎児における、プールされたコントロールと比較して統計学的に最も有意に異なる発現レベル（４倍より大きい）を有する遺伝子の選択を示す。 Difference in gene expression between samples. Of the 22,283 transcripts present on the microarray, a median of 20% (range 15-29%) is significant in their expression levels when comparing cases with pooled male controls Had a difference. The tables provided in FIGS. 4 and 5 show the statistically most significantly different expression levels (greater than 4-fold) in both TTT fetuses and in both hydrop fetuses compared to the pooled control, respectively. The selection of genes with
Ｙ染色体遺伝子：１つのＹ染色体転写産物（リボソームタンパク質Ｓ４、登録番号ＮＭ＿００１００８）は、男性胎児由来の４つ全てのサンプル（プールされたコントロールを含む）によって発現されたが、女性胎児由来のサンプルによっては発現されなかった。さらなるＹ染色体転写産物は、２つの最も成功した男性サンプル（プールされた男性コントロールおよびＨｙｄｒｏｐｓ１。以下の表２を参照のこと）に存在した。Ｙ染色体転写産物が、４つ全ての男性サンプルに存在するが女性サンプルには存在しないことは、マイクロアレイデータについての確証を提供した。 Y chromosome gene: One Y chromosome transcript (ribosomal protein S4, accession number NM_001008) was expressed by all four samples from male fetus (including pooled controls), but by sample from female fetus Was not expressed. Additional Y chromosome transcripts were present in the two most successful male samples (pooled male controls and Hydrops1, see Table 2 below). The presence of the Y chromosome transcript in all four male samples but not in the female sample provided confirmation for the microarray data.
サーファクタント：サーファクタント遺伝子（表３を参照のこと）（これらは、胎児の肺の発育のために重要である）は、在胎齢とともに増加することが見出された。プールされた１７週のコントロール（この一連の実験において試験された、最も未熟な胎児サンプル）は、サーファクタントタンパク質Ｂについての３つのみの転写産物、およびサーファクタントタンパク質Ｃについての５つの転写産物のうちの１つのみを示した。それと比較して、Ｈｙｄｒｏｐｓ１の患者（在胎齢２９と４／７週）は、全てのサーファクタント遺伝子Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ（合計９の転写産物）を発現した。これらの知見は、公開されたデータと一致した。ヒト胎児肺において発現されるサーファクタント遺伝子の型および量は、発育の間に増加することが周知である。サーファクタントタンパク質ＢおよびＣに対するｍＲＮＡは、１３週齢まで早期に検出可能であり、そして２４週齢まで、そのレベルは、それぞれ、成人レベルの５０％および１５％である；サーファクタントタンパク質Ａの発現は、約３０週間後のみに開始し、そして期間の近くに最大に達する；そしてサーファクタントタンパク質Ｄ ｍＲＮＡは、第二トリメスターにおいて最初に検出可能であり、発現は、胎児の間および生後の発育の間中増加する（Ｃ．Ｒ．Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２０００，６２：８７５−９１５）。本研究の知見は、公開されたデータと一致する。２４週齢より古い胎児の全ては、１７週齢のコントロールと比較して、サーファクタントタンパク質ＢおよびＣの増加した量を産生し、そしてサーファクタントタンパク質ＡおよびＤは、２９週間後のみに観察された。２０週齢の胎児および３２週齢の胎児が、より未熟な胎児のいくらかよりも少ないサーファクタント転写産物を産生したという事実は、それらの重篤な疾病によって説明され得るか、またはこれらの２つのマイクロアレイが、他のものと同様にハイブリダイズしなかったことに起因し得る。
Surfactants: Surfactant genes (see Table 3), which are important for fetal lung development, were found to increase with gestational age. The pooled 17-week control (the most immature fetal sample tested in this series of experiments) had only 3 transcripts for surfactant protein B and 5 transcripts for surfactant protein C. Only one was shown. In comparison, Hydrops1 patients (gestational age 29 and 4/7 weeks) expressed all the surfactant genes A, B, C and D (9 transcripts in total). These findings were consistent with published data. It is well known that the type and amount of surfactant gene expressed in the human fetal lung increases during development. MRNA for surfactant proteins B and C is detectable early up to 13 weeks of age, and up to 24 weeks of age, the levels are 50% and 15% of adult levels, respectively; Begins only after about 30 weeks and reaches a maximum near the period; and surfactant protein D mRNA is initially detectable in the second trimester, and expression increases during fetus and throughout postnatal development. (CR Mendelson, Ann. Rev. Physiol., 2000, 62: 875-915). The findings of this study are consistent with the published data. All fetuses older than 24 weeks produced increased amounts of surfactant proteins B and C compared to 17 week old controls, and surfactant proteins A and D were only observed after 29 weeks. The fact that 20-week-old and 32-week-old fetuses produced less surfactant transcripts than some of the immature fetuses could be explained by their severe disease, or these two microarrays Can be attributed to the fact that it did not hybridize like others.
ケラチン発現の、在胎齢に関連する観察された減少の理由は、胎児の皮膚が成熟するにつれて、より少ないケラチン産生細胞が羊水に直接接触し、そしてそれらのｍＲＮＡを無細胞画分に放出しないかもしれないことであり得る。むしろ、硬い架橋したケラチンの層自体は、隠れたケラチン産生細胞を、それらのｍＲＮＡを羊水中に放出することから保護し得る。 The reason for the observed decrease in keratin expression related to gestational age is that as fetal skin matures, fewer keratinocytes may come into direct contact with amniotic fluid and not release their mRNA into the cell-free fraction. It can be impossible. Rather, the hard cross-linked keratin layer itself can protect hidden keratinocytes from releasing their mRNA into the amniotic fluid.
他の遺伝子が、胎児の病理学または母体−胎盤−胎児の無細胞核酸の伝達の文脈で、概説された。これらとしては、以下が挙げられる：
アクアポリン：アクアポリン遺伝子は、水輸送体であり、したがって、羊水過多症において役割を果たすと予測され得る。実際に、アクアポリン１の１６倍の上昇が、コントロールと比較して、２人のＴＴＴ胎児由来の転写産物において観察された（表６を参照のこと）。アクアポリン１は、以前の研究において、胚膜において発現されることが示された。ハイドロープの胎児は、この同じ増加を示さなかった。ここで試験された胎児において、アクアポリン３についての３つの転写産物のうちの１つ（アクアポリン１と同じ研究においては胚膜において見出されなかった遺伝子）のみの低レベルの発現。コントロールと比較して、症例のいずれか（ＴＴＴまたはハイドロープ）のうちのいずれかの間で、アクアポリン３の発現の最小の差が存在した。
Other genes have been reviewed in the context of fetal pathology or maternal-placenta-fetal cell-free nucleic acid transmission. These include the following:
Aquaporin: The aquaporin gene is a water transporter and can therefore be predicted to play a role in hyperamniotic fluid. In fact, a 16-fold increase in aquaporin 1 was observed in transcripts from two TTT fetuses compared to controls (see Table 6). Aquaporin 1 has been shown in previous studies to be expressed in the embryonic membrane. Hydrope fetuses did not show this same increase. Low level expression of only one of the three transcripts for aquaporin 3 (a gene not found in the embryo membrane in the same study as aquaporin 1) in the fetus tested here. There was a minimal difference in the expression of aquaporin 3 between any of the cases (TTT or hydrope) compared to the control.
胎盤遺伝子：胎盤に特異的な遺伝子（コルチコトロピン関連ホルモン、絨毛膜体乳腺発育ホルモン１（胎盤ラクトゲン）、およびヒト絨毛膜性腺刺激ホルモンのβサブユニットが挙げられる）を、羊水中で試験した。なぜなら、妊婦の胎盤におけるこれらの遺伝子の存在は、無細胞ＲＮＡの胎児−母体輸送の証拠を提供するからである（Ｅ．Ｋ．Ｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００３，１００：４７４８−４７５３およびＥ．Ｋ．Ｎｇら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２００３，４９：７２７−７３１）。これらの遺伝子（合計８）に対する転写産物は、試験されたサンプルのいずれにおいても発現されなかった。羊水中の胎盤特異的遺伝子の非存在は、核酸の胎児−母体の経胎盤輸送が、主として一方向（母親に向かって）であるという概念を支持する。以前の研究は、母体の血漿中の無細胞胎児ＤＮＡが、胎児の血漿中の無細胞母体ＤＮＡと比較して、有意により濃厚であることを示した（Ａ．Ｓｅｋｉｚａｗａら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．，２００３：１１３：３０７−３１０）。 Placental genes: Placenta-specific genes, including corticotropin-related hormones, chorionic mammary growth hormone 1 (placental lactogen), and human chorionic gonadotropin beta subunit, were tested in amniotic fluid. Because the presence of these genes in the placenta of pregnant women provides evidence of fetal-maternal transport of cell-free RNA (EK Ng et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 2003: 100: 4748-4753 and EK Ng et al., Clin. Chem., 2003, 49: 727-731). Transcripts for these genes (total 8) were not expressed in any of the samples tested. The absence of placenta-specific genes in amniotic fluid supports the notion that fetal-maternal transplacental transport of nucleic acids is primarily unidirectional (towards the mother). Previous studies have shown that acellular fetal DNA in maternal plasma is significantly more concentrated compared to acellular maternal DNA in fetal plasma (A. Sekizawa et al., Hum. Gen., 2003: 113: 307-310).
（考察）
本願は、本出願人が知る限り、無細胞羊水から単離された胎児ｍＲＮＡのオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析による、生存ヒト胎児における全体的な遺伝子発現の最初のインビボ研究である。無細胞胎児ＲＮＡが、この代表的には処分される羊水の成分から首尾よく抽出され、増幅され、標識され、そしてオリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズされた。
(Discussion)
This is the first in vivo study of global gene expression in living human fetuses by oligonucleotide microarray analysis of fetal mRNA isolated from acellular amniotic fluid, to the best of Applicants' knowledge. Cell-free fetal RNA was successfully extracted from this typically discarded amniotic fluid component, amplified, labeled, and hybridized to an oligonucleotide microarray.
この研究において実施された分析は、生存ヒト胎児における遺伝子発現の存在およびレベルに関する重要な情報を明らかにした。さらに、この予備的なデータは、観察された遺伝子発現パターンが、症例とコントロールと間の既知の変数（性、在胎齢および疾患状態）に相関することを示すようである。リアルタイム定量逆転写ＰＣＲを使用して得られる結果を確証するためには最適であったが、このことは、制限されたサンプルテンプレートに起因して、可能ではなかった。しかし、１つのＹ染色体転写産物が、４つ全ての男性サンプルに存在するが、女性サンプルには存在しないことは、このデータの生理学的確証を提供した。次いで、在胎齢に伴う変化を探すために、発現の差が、胎児の発育において重要であることが公知である遺伝子ファミリーにおいて評価された。有意な差が、肺、腸、および皮膚上皮細胞（これらは全て、羊水と接触する）において発現されるいくつかの遺伝子において観察された。 The analysis performed in this study revealed important information regarding the presence and level of gene expression in living human fetuses. Furthermore, this preliminary data appears to indicate that the observed gene expression pattern correlates with known variables (sex, gestational age and disease state) between cases and controls. Although optimal to validate the results obtained using real-time quantitative reverse transcription PCR, this was not possible due to the limited sample template. However, the fact that one Y chromosome transcript is present in all four male samples but not in female samples provided a physiological confirmation of this data. Then, to look for changes with gestational age, expression differences were evaluated in gene families that are known to be important in fetal development. Significant differences were observed in several genes expressed in lung, intestine, and skin epithelial cells, all in contact with amniotic fluid.
本研究は、サンプルの大部分について、羊水由来の無細胞ＲＮＡが、マイクロアレイに首尾よくハイブリダイズすることを示した。しかし、いくつかのサンプルは、さほど良好にはハイブリダイズしなかった。このことはおそらく、ＲＮＡが分解したからである。ＲＮＡの分解は、サンプルのプロセシングまたは凍結／解凍サイクルの導入の前の遅延から生じる。しかし、凍結および解凍は、男性コントロールに対して有害ではないようであり、これは、−８０℃で貯蔵されたアーカイブされた羊水サンプルの組成物にもかかわらず、良好にハイブリダイズした。さらに、単一の凍結／解凍サイクルは、血漿においても血清においても、無細胞ＲＮＡ濃度に対して有意な影響を生じないことが示された（Ｎ．Ｂ．Ｔｓｕｉら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２００２，４８：１６４７−１６５３）。無細胞ＲＮＡが、固有に分解し、従って、全細胞から抽出されたＲＮＡとは異なる特性を有することが、可能である。ＲＮＡは、分解しやすく、従って、羊水中のあらゆる無細胞ＲＮＡが、抽出まで生存することは、驚くべきことである。血漿中の循環ＲＮＡが、安定化粒子と会合することの証拠が存在する（Ｅ．Ｋ．Ｎｇら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２００２，４８：１２１２−１２１７）。本研究において、特定の腸コントロール遺伝子は、全てのサンプルにおいて、正常な３’／５’比を有し、一方で、特定の他の遺伝子の比は、常に高かった。この食い違いは、特定のＲＮＡ転写産物の保存のパターンを示唆し、これは、アポトーシスの間のｍＲＮＡの変化およびパッケージングに関連し得る。ハウスキーピング遺伝子は、種々の組織および生物の間で、その発現パターンが有意に変化し（Ｌ．Ｌ．Ｈｓｉａｏら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００１，７：９７−１０４）、そして羊水中の無細胞ＲＮＡのこれらのパターンは、未知である。さらに、羊水中の無細胞ＲＮＡの動力学は、まだ調査されていない。 This study showed that for most of the samples, cell-free RNA from amniotic fluid successfully hybridizes to the microarray. However, some samples did not hybridize so well. This is probably because the RNA was degraded. RNA degradation results from a delay before sample processing or introduction of freeze / thaw cycles. However, freezing and thawing did not appear to be harmful to male controls, which hybridized well despite the composition of archived amniotic fluid samples stored at -80 ° C. Furthermore, a single freeze / thaw cycle has been shown to have no significant effect on cell-free RNA concentrations in plasma or serum (NB Tsui et al., Clin. Chem., 2002). , 48: 1647-1653). It is possible that cell-free RNA degrades inherently and thus has different properties than RNA extracted from whole cells. RNA is prone to degradation and it is therefore surprising that any cell-free RNA in amniotic fluid survives extraction. There is evidence that circulating RNA in plasma associates with stabilizing particles (EK Ng et al., Clin. Chem., 2002, 48: 1212-1217). In this study, certain intestinal control genes had a normal 3 '/ 5' ratio in all samples, while the ratio of certain other genes was always high. This discrepancy suggests a pattern of conservation of specific RNA transcripts that may be related to mRNA changes and packaging during apoptosis. Housekeeping genes have significantly altered expression patterns between various tissues and organisms (LL Hsiao et al., Physiol. Genomics, 2001, 7: 97-104) and cell-free RNA in amniotic fluid. These patterns of are unknown. Furthermore, the kinetics of cell-free RNA in amniotic fluid has not yet been investigated.
本研究において観察された、低レベルの有意でない偽陽性は、アレイ上の短いオリゴヌクレオチドプローブの、共通して短い配列を有する異なるｍＲＮＡとの交差ハイブリダイゼーションに起因し得る。しかし、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアルゴリズムは、これを考慮に入れており、そしてこの誤差の源を大部分は排除している（Ｊ．Ｌｉら，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２００２，６９：３８３−３９０）。さらに、症例およびコントロールは、異なる遺伝背景および他の変数（在胎齢および疾患状態）を有した。なぜなら、羊水穿刺は、一般に、１９〜２０週齢より大きい健常な胎児において実施されないからである。さらに、少量の材料汚染が、おそらく、結果を混乱させ得る。従って、胎児の遺伝子発現の多様性に関するデータは、調査のこの段階において注意深く解釈されなければならず、そして確実な結論が導き出され得る前に、さらなる研究が必要である。 The low level of insignificant false positives observed in this study may be due to cross-hybridization of short oligonucleotide probes on the array with different mRNAs having a common short sequence. However, the Affymetrix algorithm takes this into account and largely eliminates this source of error (J. Li et al., Toxicol. Sci., 2002, 69: 383-390). In addition, cases and controls had different genetic backgrounds and other variables (gestational age and disease state). This is because amniocentesis is generally not performed on healthy fetuses older than 19-20 weeks of age. Furthermore, small amounts of material contamination can possibly disrupt the results. Therefore, data on the diversity of fetal gene expression must be carefully interpreted at this stage of the study and further research is needed before a definitive conclusion can be drawn.
この予備的研究のために、大きい体積のサンプルが、実施可能性を示すために使用された。しかし、健常な胎児由来の羊水サンプルは、羊水過多症を有する胎児由来の羊水サンプルよりも高濃度の無細胞ｍＲＮＡを含有するようである（表１を参照のこと）。技術的改善は、慣用的に収集される羊水サンプル（３０ｍＬ未満）からのｍＲＮＡの抽出を改善し、それによって、将来には、個々の胎児が研究され得ることに方向付けられる。 For this preliminary study, a large volume sample was used to demonstrate feasibility. However, healthy fetal amniotic fluid samples appear to contain higher concentrations of cell-free mRNA than fetal amniotic fluid samples with hyperamniotic fluid (see Table 1). Technological improvements are directed to improving the extraction of mRNA from conventionally collected amniotic fluid samples (less than 30 mL), thereby enabling individual fetuses to be studied in the future.
要約として、本研究は、無細胞胎児ｍＲＮＡが、羊水から単離され得、そしてオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用して、首尾よく検出され得ることを示す。予備的な遺伝子発現分析は、異なる性、在胎齢、および疾患状態の胎児の間で変動する遺伝子発現パターンを示すようである。この研究全体は、代表的には処分される羊水の一部分を使用して実施され、従って、将来の研究における使用のために容易に利用可能である。観察された興味深い遺伝子発現の差は、この技術が、ヒト発育研究の進歩を容易にし得、そして生存胎児の評価のための新たなバイオマーカーを養うことを示唆する。 In summary, this study shows that cell-free fetal mRNA can be isolated from amniotic fluid and successfully detected using oligonucleotide microarrays. Preliminary gene expression analysis appears to show gene expression patterns that vary between fetuses of different gender, gestational age, and disease state. This entire study is typically conducted using a portion of amniotic fluid that is disposed of and is therefore readily available for use in future studies. The interesting differences in gene expression observed suggest that this technology may facilitate advances in human developmental research and cultivate new biomarkers for the assessment of live fetuses.
将来の研究は、特定の遺伝子がアップレギュレートされているかダウンレギュレートされているかを示すための、健常な胎児および異常な胎児における羊水からの遺伝子発現プロフィールの比較を包含する。この様式で、新規のパターンの遺伝子発現が、異常な胎児（例えば、異数体の胎児）において検出され得、このことは、潜在的に、母体の血液中での増幅のための将来の標的として働き得る。肺成熟試験を受けている胎児由来の羊水もまた、正常な肺遺伝子発現または遅延した肺遺伝子発現のプロフィールが確立されているか否かを決定するために、試験される。羊水は、種々の異なる臨床適応症について得られるので、本アプローチは、胎内にいる間の成長または発育の問題を有する胎児を評価するための、新たな様式を構築し得る。 Future studies will include a comparison of gene expression profiles from amniotic fluid in healthy and abnormal fetuses to show whether a particular gene is up-regulated or down-regulated. In this manner, a new pattern of gene expression can be detected in abnormal fetuses (eg, aneuploid fetuses), which may potentially be a future target for amplification in maternal blood. Can work as. Amniotic fluid from fetuses undergoing a lung maturation test is also tested to determine whether a normal or delayed lung gene expression profile has been established. Since amniotic fluid can be obtained for a variety of different clinical indications, this approach can build a new way to evaluate fetuses with growth or development problems while in the womb.
さらに、実施例５において報告された予備的実験は、在胎齢に伴う異なる遺伝子の発現のバリエーションを明らかにする、興味深い結果を提供した。これらのバリエーション（例えば、サーファクタント遺伝子およびムチンファミリーの遺伝子について観察されたバリエーション）は、さらに調査される予定であり、その最終目的は、各在胎週における健常な胎児についての正常な遺伝子発現プロフィールを確立し、これによって、問題を有する胎児が比較され得ることである。 Furthermore, preliminary experiments reported in Example 5 provided interesting results that revealed variations in the expression of different genes with gestational age. These variations (eg, those observed for surfactant genes and mucin family genes) will be further investigated, with the ultimate goal of establishing a normal gene expression profile for healthy fetuses at each gestational week This allows the fetus with the problem to be compared.
Claims (45)
を包含するプロセスによって得られる、請求項１に記載の胎児ＲＮＡ。 The fetal RNA according to claim 1, obtained by a process comprising a step of processing an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman, so that fetal RNA present in the amniotic fluid is extracted to obtain amniotic fluid fetal RNA. .
前記羊水中に存在する細胞集団を単離する工程；
該単離された細胞を必要に応じて培養する工程；および
該単離された細胞から胎児ＲＮＡを抽出する工程
を包含する、請求項２に記載の胎児ＲＮＡ。 Processing the amniotic fluid sample comprises:
Isolating a cell population present in the amniotic fluid;
The fetal RNA according to claim 2, comprising a step of culturing the isolated cell as necessary; and a step of extracting fetal RNA from the isolated cell.
羊水胎児ＲＮＡのサンプルを提供する工程；
該羊水胎児ＲＮＡを分析して、胎児ＲＮＡに関する情報を得る工程；および
該得られた情報に基づいて、出生前診断を提供する工程を包含する、方法。 A method of prenatal diagnosis, including:
Providing a sample of amniotic fluid fetal RNA;
Analyzing the amniotic fluid fetal RNA to obtain information about fetal RNA; and providing a prenatal diagnosis based on the obtained information.
妊婦から得られた羊水サンプルから細胞集団を取り出して、単離された細胞を得る工程；
必要に応じて、該単離された細胞を培養する工程；および
該単離された細胞を処理し、その結果、該細胞中に存在する胎児ＲＮＡが抽出されて分析に利用可能になり、羊水胎児ＲＮＡが得られる工程
によって得られる、請求項６に記載の方法。 The amniotic fluid fetal RNA is:
Removing a cell population from an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman to obtain isolated cells;
Optionally culturing the isolated cells; and processing the isolated cells so that fetal RNA present in the cells is extracted and made available for analysis; The method according to claim 6, wherein the method is obtained by a step in which fetal RNA is obtained.
（ａ）前記羊水胎児ＲＮＡを増幅して増幅された胎児ＲＮＡを得て、そして該増幅された胎児ＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、（ｂ）該羊水胎児ＲＮＡを断片化して、断片化した胎児ＲＮＡを得て、そして該断片化した胎児ＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、（ｃ）該羊水胎児ＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換して胎児ｃＤＮＡを得て、そして該胎児ｃＤＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、または（ｄ）該羊水胎児ＲＮＡを相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）に変換して胎児ｃＲＮＡを得て、そして該胎児ｃＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程
をさらに包含する、請求項６に記載の方法。 Before the analyzing step, the following:
(A) amplifying the amniotic fluid fetal RNA to obtain an amplified fetal RNA, and labeling the amplified fetal RNA as necessary with a detectable agent; (b) the amniotic fluid fetus Fragmenting the RNA to obtain a fragmented fetal RNA and optionally labeling the fragmented fetal RNA with a detectable agent; (c) the amniotic fluid fetal RNA complementary DNA Converting to (cDNA) to obtain fetal cDNA, and optionally labeling the fetal cDNA with a detectable agent, or (d) the amniotic fluid fetal RNA into complementary RNA (cRNA) 7. The method of claim 6, further comprising converting to obtain fetal cRNA and optionally labeling the fetal cRNA with a detectable agent.
羊水胎児ＲＮＡの試験サンプルを提供する工程であって、該胎児ＲＮＡは、妊婦から得られた羊水のサンプルに由来し、該試験サンプルは、検出可能な薬剤を用いて標識された複数の核酸セグメントを含む、工程；
複数の遺伝子プローブを含む遺伝子発現アレイを提供する工程であって、各遺伝子プローブは、基板表面上の別々のスポットに固定されて、該アレイを形成する、工程；
該サンプル中の該核酸セグメントが該アレイ上の該遺伝子プローブに特異的にハイブリダイズする条件下で、該アレイを該試験サンプルと接触させる工程；
該アレイ上に固定された個々の遺伝子プローブに対する該試験サンプルの個々の核酸セグメントの結合を決定して、結合パターンを得る工程；および
該得られた結合パターンに基づいて、該胎児について遺伝子発現パターンを確立する工程
を包含する、方法。 A method for establishing gene expression in a fetus comprising the following steps:
Providing a test sample of amniotic fluid fetal RNA, wherein the fetal RNA is derived from a sample of amniotic fluid obtained from a pregnant woman, the test sample comprising a plurality of nucleic acid segments labeled with a detectable agent; Comprising a step;
Providing a gene expression array comprising a plurality of gene probes, each gene probe being immobilized on a separate spot on a substrate surface to form the array;
Contacting the array with the test sample under conditions in which the nucleic acid segments in the sample specifically hybridize to the gene probes on the array;
Determining binding of individual nucleic acid segments of the test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern; and gene expression patterns for the fetus based on the resulting binding pattern; Establishing a method.
前記得られた遺伝子発現パターンに基づいて、核型および発生に関して正常な雄性胎児または雌性胎児における異なる在胎齢でのｍＲＮＡ発現のベースラインレベルを確立する工程
をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。 Repeating all of the steps for a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from male or female fetuses normal for different gestational age karyotypes and development; and based on the resulting gene expression pattern 17. The method of claim 16, further comprising establishing baseline levels of mRNA expression at different gestational ages in male or female fetuses normal for karyotype and development.
前記分析した羊水胎児ＲＮＡが雌性胎児に由来する場合、前記遺伝子発現パターンの１以上の特徴を、核型および発生に関して正常な雌性胎児の胎児発生の時間もしくは事象と相関させる工程、
をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。 Correlating one or more characteristics of the gene expression pattern with a normal male fetal fetal development time or event with respect to karyotype and development if the analyzed amniotic fluid fetal RNA is derived from a male fetus, or the analyzed Correlating one or more characteristics of said gene expression pattern with the time or event of fetal development of a normal female fetus with respect to karyotype and development, if the amniotic fluid fetal RNA is derived from a female fetus;
The method of claim 16 further comprising:
該得られた遺伝子発現パターンの１以上の特徴を、核型および発生に関して正常な雄性胎児または雌性胎児の胎児発生の時間または事象と相関させる工程；ならびに
該相関に基づいて、核型および発生に関して正常な雄性胎児または雌性胎児についての、異なる在胎齢での発生遺伝子発現パターンを確立する工程
をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。 Repeating all of the above steps for a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from male or female fetuses normal for different gestational age karyotypes and development;
Correlating one or more characteristics of the resulting gene expression pattern with a time or event of fetal development of a normal male or female fetus with respect to karyotype and development; and based on the correlation, with respect to karyotype and development 17. The method of claim 16, further comprising establishing developmental gene expression patterns at different gestational ages for normal male or female fetuses.
各得られた遺伝子発現パターンを、類似の在胎齢および性別の核型および発生に関して正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルと比較する工程；
該比較に基づいて、該核型に関して異常な胎児において異常に発現され、該染色体異常と関連する１以上の遺伝子を同定する工程；ならびに
必要に応じて、染色体異常と相関するものとして同定された該１以上の遺伝子の目録を作る工程
をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。 Repeating all of the above steps for a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from fetuses with the same chromosomal abnormality and abnormal karyotype;
Comparing each resulting gene expression pattern to baseline levels of mRNA expression established for normal fetuses for similar gestational age and gender karyotype and development;
Based on the comparison, identifying one or more genes that are abnormally expressed in an abnormal fetus with respect to the karyotype and associated with the chromosomal abnormality; and, if necessary, identified as correlating with a chromosomal abnormality 17. The method of claim 16, further comprising the step of creating an inventory of the one or more genes.
各得られた遺伝子発現パターンを、類似の在胎齢および性別の核型および発生に関して正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルと比較する工程；
該比較に基づいて、該発生に関して異常な胎児において異常に発現され、該発生疾患または発生状態と関連する１以上の遺伝子を同定する工程；ならびに
必要に応じて、発生疾患または発生状態と相関するものとして同定された該１以上の遺伝子の目録を作る工程
をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。 Repeating all of the above steps for a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from developmentally abnormal fetuses having the same developmental disease or condition;
Comparing each resulting gene expression pattern to baseline levels of mRNA expression established for normal fetuses for similar gestational age and gender karyotype and development;
Based on the comparison, identifying one or more genes that are abnormally expressed in a fetus abnormal to the development and associated with the developmental disease or developmental condition; and optionally correlate with the developmental disease or developmental condition 17. The method of claim 16, further comprising creating an inventory of the one or more genes identified as being.
各得られた遺伝子発現パターンを、類似の在胎齢および性別の核型および発生に関して正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルと比較する工程；
該比較に基づいて、該罹病胎児において異常に発現され、該臨床状態と関連する１以上の遺伝子を同定する工程；ならびに
必要に応じて、臨床状態と相関するものとして同定された該１以上の遺伝子の目録を作る工程
をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。 Repeating all of the above steps for a statistically significant number of amniotic fluid fetal RNA samples from diseased fetuses suffering from the same clinical condition;
Comparing each resulting gene expression pattern to baseline levels of mRNA expression established for normal fetuses for similar gestational age and gender karyotype and development;
Based on the comparison, identifying one or more genes that are abnormally expressed in the affected fetus and associated with the clinical condition; and optionally, the one or more genes identified as correlated with the clinical condition 17. The method of claim 16, further comprising the step of creating a gene inventory.
妊婦から得られた羊水サンプルから細胞集団を取り出して、単離された細胞を得る工程；
必要に応じて、該単離された細胞を培養する工程；および
該単離された細胞を処理し、その結果、該細胞中に存在する胎児ＲＮＡが抽出されて分析に利用可能になる工程
によって得られる、請求項１６に記載の方法。 The amniotic fluid fetal RNA is:
Removing a cell population from an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman to obtain isolated cells;
Optionally culturing the isolated cells; and processing the isolated cells so that fetal RNA present in the cells is extracted and made available for analysis. The method according to claim 16, obtained.
（ａ）前記羊水胎児ＲＮＡを増幅して増幅された胎児ＲＮＡを得て、そして該増幅された胎児ＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、（ｂ）該羊水胎児ＲＮＡを断片化して、断片化した胎児ＲＮＡを得て、そして該断片化した胎児ＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、（ｃ）該羊水胎児ＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換して胎児ｃＤＮＡを得て、そして該胎児ｃＤＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、または（ｄ）該羊水胎児ＲＮＡを相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）に変換して胎児ｃＲＮＡを得て、そして該胎児ｃＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程
をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。 Prior to the contacting step, the following:
(A) amplifying the amniotic fluid fetal RNA to obtain an amplified fetal RNA, and labeling the amplified fetal RNA as necessary with a detectable agent; (b) the amniotic fluid fetus Fragmenting the RNA to obtain a fragmented fetal RNA and optionally labeling the fragmented fetal RNA with a detectable agent; (c) the amniotic fluid fetal RNA complementary DNA Converting to (cDNA) to obtain fetal cDNA, and optionally labeling the fetal cDNA with a detectable agent, or (d) the amniotic fluid fetal RNA into complementary RNA (cRNA) 17. The method of claim 16, further comprising converting to obtain fetal cRNA and optionally labeling the fetal cRNA with a detectable agent.
コンピュータ支援画像化システムを用いて、ハイブリダイゼーション後の該アレイの蛍光画像を得る工程；および
コンピュータ支援画像解析システムを用いて、該得られた蛍光画像を分析して、該アレイから画像化されたデータを解釈して、ゲノム遺伝子座に相関するものとして、蛍光強度として結果を表示する工程
を包含する、請求項１６に記載の方法。 Determining the binding of individual nucleic acid segments of the test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern comprises the following steps:
Obtaining a fluorescent image of the array after hybridization using a computer-aided imaging system; and analyzing the obtained fluorescent image using a computer-aided image analysis system and imaging from the array 17. The method of claim 16, comprising interpreting the data and displaying the results as fluorescence intensity as being correlated to the genomic locus.
羊水胎児ＲＮＡの試験サンプルを提供する工程であって、該胎児ＲＮＡは、既知の性別および在胎齢の胎児を有する妊婦から得られた羊水サンプルに由来し、該試験サンプルは、検出可能な薬剤で標識された複数の核酸セグメントを含む、工程；
複数の遺伝子プローブを備える遺伝子発現アレイを提供する工程であって、各遺伝子プローブは、基板表面上の別々のスポットに固定されて、該アレイを形成する、工程；
該サンプル中の該核酸セグメントが該アレイ上の該遺伝子プローブに特異的にハイブリダイズする条件下で、該アレイを該試験サンプルと接触させる工程；
該アレイ上に固定された個々の遺伝子プローブに対する該試験サンプルの個々の核酸セグメントの結合を決定して、結合パターンを得る工程；
該得られた結合パターンに基づいて、該胎児について遺伝子発現パターンを確立する工程；
該遺伝子発現パターンを分析する工程；および
該分析に基づいて、出生前診断を提供する工程
を包含する、方法。 A method of prenatal diagnosis performed by submitting amniotic fluid fetal RNA to an array-based gene expression analysis, the method comprising the following steps:
Providing a test sample of amniotic fluid fetal RNA, wherein the fetal RNA is derived from an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman having a fetus of known gender and gestational age, the test sample being a detectable agent; Comprising a plurality of labeled nucleic acid segments;
Providing a gene expression array comprising a plurality of gene probes, wherein each gene probe is immobilized on a separate spot on a substrate surface to form the array;
Contacting the array with the test sample under conditions in which the nucleic acid segments in the sample specifically hybridize to the gene probes on the array;
Determining the binding of individual nucleic acid segments of the test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern;
Establishing a gene expression pattern for the fetus based on the obtained binding pattern;
Analyzing the gene expression pattern; and providing a prenatal diagnosis based on the analysis.
前記胎児の該遺伝子発現パターンを、同一の性別および在胎齢の核型および発生に関して正常な胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルに対して比較するか、または同一の性別および在胎齢の核型および発生に関して正常な胎児について確立された発生遺伝子発現パターンに対して比較する工程を包含する、請求項３２に記載の方法。 The step of analyzing the gene expression pattern includes the following:
Compare the gene expression pattern of the fetus against baseline levels of mRNA expression established for normal fetuses with the same gender and gestational age karyotype and development, or the same gender and gestational age nuclei 33. The method of claim 32, comprising comparing against a developmental gene expression pattern established for a normal fetus with respect to type and development.
処理する工程の前に、前記羊水サンプルから細胞集団が取り出されて、残りの羊水物質が得られる工程をさらに包含する、請求項３８に記載の方法。 40. The method of claim 38, further comprising the step of removing a population of cells from the amniotic fluid sample to obtain the remaining amniotic fluid material prior to the step of processing.
妊婦から得られた羊水サンプルから細胞集団を取り出して、単離された細胞を得る工程；
該単離された細胞を必要に応じて培養する工程；および
該単離された細胞を処理し、その結果、該細胞中に存在する胎児ＲＮＡが抽出されて分析に入手可能になる工程
によって得られる、請求項３２に記載の方法。 The amniotic fluid fetal RNA is:
Removing a cell population from an amniotic fluid sample obtained from a pregnant woman to obtain isolated cells;
Culturing the isolated cells as required; and processing the isolated cells so that fetal RNA present in the cells is extracted and made available for analysis. 35. The method of claim 32, wherein:
（ａ）前記羊水胎児ＲＮＡを増幅して増幅された胎児ＲＮＡを得て、そして該増幅された胎児ＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、（ｂ）該羊水胎児ＲＮＡを断片化して、断片化した胎児ＲＮＡを得て、そして該断片化した胎児ＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、（ｃ）該羊水胎児ＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換して胎児ｃＤＮＡを得て、そして該胎児ｃＤＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程、または（ｄ）該羊水胎児ＲＮＡを相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）に変換して胎児ｃＲＮＡを得て、そして該胎児ｃＲＮＡを、検出可能な薬剤を用いて必要に応じて標識する工程
をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。 Before the analyzing step, the following:
(A) amplifying the amniotic fluid fetal RNA to obtain an amplified fetal RNA, and labeling the amplified fetal RNA as necessary with a detectable agent; (b) the amniotic fluid fetus Fragmenting the RNA to obtain a fragmented fetal RNA and optionally labeling the fragmented fetal RNA with a detectable agent; (c) the amniotic fluid fetal RNA complementary DNA Converting to (cDNA) to obtain fetal cDNA, and optionally labeling the fetal cDNA with a detectable agent, or (d) the amniotic fluid fetal RNA into complementary RNA (cRNA) 33. The method of claim 32, further comprising converting to obtain fetal cRNA and optionally labeling the fetal cRNA with a detectable agent.
コンピュータ支援画像化システムを用いて、ハイブリダイゼーション後の該アレイの蛍光画像を得る工程；および
コンピュータ支援画像解析システムを用いて、該得られた蛍光画像を分析して、該アレイから画像化されたデータを解釈して、ゲノム遺伝子座に相関するものとして、蛍光強度として結果を表示する工程
を包含する、請求項３２に記載の方法。 Determining the binding of individual nucleic acid segments of the test sample to individual gene probes immobilized on the array to obtain a binding pattern comprises the following steps:
Obtaining a fluorescent image of the array after hybridization using a computer-aided imaging system; and analyzing the obtained fluorescent image using a computer-aided image analysis system and imaging from the array 35. The method of claim 32, comprising interpreting the data and displaying the results as fluorescence intensity as correlating to the genomic locus.
妊婦から得られた羊水サンプルから無細胞胎児ＲＮＡを抽出するための材料；
複数の遺伝子プローブを含む遺伝子発現アレイであって、各遺伝子プローブは、基板表面上の別個の点に固定化されて該アレイを形成している、アレイ；
異なる在胎齢での、核型および発生に関して正常な雄性胎児および正常な雌性胎児について確立されたｍＲＮＡ発現のベースラインレベルを含むデータベース；
異なる在胎齢での、核型および発生に関して正常な雄性胎児および正常な雌性胎児について確立された発生遺伝子発現パターンを含むデータベース；ならびに
該材料および請求項３２に記載のアレイを使用することについての指示書
を備える、キット。 Kit with the following components:
Materials for extracting cell-free fetal RNA from amniotic fluid samples obtained from pregnant women;
A gene expression array comprising a plurality of gene probes, wherein each gene probe is immobilized at a separate point on a substrate surface to form the array;
A database containing baseline levels of mRNA expression established for normal and normal female fetuses for karyotype and development at different gestational ages;
A database containing developmental gene expression patterns established for normal male fetuses and normal female fetuses for karyotype and development at different gestational ages; and instructions for using the material and the array of claim 32 A kit with a calligraphy.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005216565A JP2007028985A (en) | 2005-07-26 | 2005-07-26 | Fetal rna in amniotic fluid for determining gene expression in developing fetus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005216565A JP2007028985A (en) | 2005-07-26 | 2005-07-26 | Fetal rna in amniotic fluid for determining gene expression in developing fetus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007028985A true JP2007028985A (en) | 2007-02-08 |
Family
ID=37788984
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005216565A Withdrawn JP2007028985A (en) | 2005-07-26 | 2005-07-26 | Fetal rna in amniotic fluid for determining gene expression in developing fetus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007028985A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013002354A1 (en) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | 株式会社ダナフォーム | Biological sample pretreatment method, method for detecting rna, and pretreatment kit |
-
2005
- 2005-07-26 JP JP2005216565A patent/JP2007028985A/en not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013002354A1 (en) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | 株式会社ダナフォーム | Biological sample pretreatment method, method for detecting rna, and pretreatment kit |
| JPWO2013002354A1 (en) * | 2011-06-29 | 2015-02-23 | 株式会社ダナフォーム | Biological sample pretreatment method, RNA detection method and pretreatment kit |
| US9518901B2 (en) | 2011-06-29 | 2016-12-13 | Kabushiki Kaisha Dnaform | Pretreatment method of biological sample, detection method of RNA, and pretreatment kit |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2650790C2 (en) | Highly multiplex pcr methods and compositions | |
| JP6521956B2 (en) | Method for determining copy number mutations in sexual chromosomes | |
| JP2021003138A (en) | Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses | |
| JP2007515947A (en) | Prenatal diagnosis using acellular fetal DNA in amniotic fluid | |
| US7141372B2 (en) | Universal RT-coupled PCR method for the specific amplification of mRNA | |
| US20070111233A1 (en) | Prenatal diagnosis using cell-free fetal DNA in amniotic fluid | |
| WO2009149026A2 (en) | Genomic approaches to fetal treatment and diagnosis | |
| JP2017524374A (en) | Detection of fetal chromosome partial aneuploidy and copy number variation | |
| EP3323897A1 (en) | Methods and devices for assessing risk to a putative offspring of developing a condition | |
| EP2596127A2 (en) | Identification of differentially represented fetal or maternal genomic regions and uses thereof | |
| US20180218117A1 (en) | Methods for assessing risk of female infertility | |
| CA2774618C (en) | Methods and devices for assessing infertility and/or egg quality | |
| JP2020524987A (en) | Circulating RNA Signature Specific to Preeclampsia | |
| US20060003342A1 (en) | Fetal RNA in amniotic fluid to determine gene expression in the developing fetus | |
| JP2004507206A (en) | Tissue-specific genes important for diagnosis | |
| JP2011528554A (en) | Non-invasive fetal RhD genotyping from maternal whole blood | |
| EP4172357B1 (en) | Methods and compositions for analyzing nucleic acid | |
| US20110118125A1 (en) | Neonatal salivary genomics | |
| US20070054289A1 (en) | Identification of genes involved in fertility, ovarian function and/or fetal/newborn viability | |
| JP2007028985A (en) | Fetal rna in amniotic fluid for determining gene expression in developing fetus | |
| CA2513028A1 (en) | Fetal rna in amniotic fluid to determine gene expression in the developing fetus | |
| US20130261011A1 (en) | Analyzing neonatal saliva and readiness to feed | |
| WO2019016292A1 (en) | Prenatal screening and diagnostic system and method | |
| AU2005203357A1 (en) | Fetal RNA in amniotic fluid to determine gene expression in the developing fetus | |
| WO2007027970A2 (en) | Prenatal diagnosis using cell-free fetal dna in amniotic fluid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20081007 |