JP2007020494A - Targeted gene therapy using anti-cea antibody - Google Patents

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Hirofumi Hamada
洋文 濱田
Toshihiro Tanaka
俊裕 田中
Kazunori Kato
和則 加藤
Masahide Kuroki
政秀 黒木
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To improve nonspecific gene delivery by an adenoviral vector for gene therapy of carcinoma and to improve problems of cross-reactivity in carrying out therapy of carcinoma using the antibody and problems of immunoreaction. <P>SOLUTION: The invention provides the therapeutic agent for carcinoma comprising anti-CEA monoclonal antibody, especially provides a complete human type anti-CEA monoclonal antibody. typically, the therapeutic agent for carcinoma including a complex of the antibody and a genetically mutated fiber type adenovirus to link with the antibody. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、抗ＣＥＡ抗体を用いた標的化遺伝子治療に関する。   The present invention relates to targeted gene therapy using anti-CEA antibodies.

胃癌は、世界で最も一般的な、癌に関連する死の原因である。胃癌の発生率はアジアで高く、日本において、特に胃癌は、癌による死の最も一般的な原因である。現在の処置ストラテジーには、外科手術、化学療法、および放射線療法などがあるが、これらはその治療効果が限られている。したがって、これらの疾患の治療のための新たな治療態様が必要とされていることが明らかである。遺伝子治療は、この点において、進行した胃癌の治療のための合理的なアプローチを代表する。   Gastric cancer is the most common cause of cancer-related death in the world. The incidence of gastric cancer is high in Asia, and in Japan, especially gastric cancer is the most common cause of cancer death. Current treatment strategies include surgery, chemotherapy, and radiation therapy, but these have limited therapeutic effectiveness. Therefore, it is clear that there is a need for new therapeutic modes for the treatment of these diseases. Gene therapy represents a reasonable approach for the treatment of advanced gastric cancer in this respect.

しかしながら、癌遺伝子治療に対する主要な障壁の１つは、癌細胞への不十分かつ非特異的な遺伝子送達であり、これは、自殺遺伝子療法、免疫学的遺伝子療法のようないくつかの効果的ストラテジーが、遺伝子導入していない癌細胞をある程度治療し得、そして部分的にこの問題を避けることができるにもかかわらず、遺伝子導入していない腫瘍細胞からの再発のために、臨床試験において不満足な結果を導くに至っている。したがって、遺伝子治療における課題は、より良い腫瘍選択性に基づいて現在の治療態様を改善することである。   However, one of the major barriers to cancer gene therapy is inadequate and non-specific gene delivery to cancer cells, which has some effective effects such as suicide gene therapy and immunological gene therapy. Strategy is unsatisfactory in clinical trials due to recurrence from non-transgenic tumor cells, despite the ability to treat cancer cells that are not transgenic to some extent and partially avoiding this problem Has led to a good result. Thus, the challenge in gene therapy is to improve current treatment modalities based on better tumor selectivity.

現在までに、アデノウイルスベクターは高力価で産生され得、そして多くの異なる細胞型に感染し得るため、遺伝子を腫瘍細胞に導入するために広範に適用されている。５型アデノウイルス（Ａｄ５）の感染は、コクサッキーアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）へのアデノウイルスファイバーノブの高親和性結合、およびそれに続く細胞表面上のインテグリンαｖβ３およびαｖβ５へのペントンベース中のＲＧＤモチーフの結合によって仲介される内部移行によって仲介される。   To date, adenoviral vectors have been widely applied to introduce genes into tumor cells because they can be produced at high titers and can infect many different cell types. Infection with type 5 adenovirus (Ad5) is associated with high affinity binding of the adenovirus fiber knob to the coxsackie adenovirus receptor (CAR), followed by the RGD motif in the penton base to integrins αvβ3 and αvβ5 on the cell surface. Mediated by internalization mediated by binding.

しかしながら、癌遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの広範な適用は、ＣＡＲが正常細胞および悪性細胞の両方に発現することによる悪性細胞の特異性の欠如のために阻まれている（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１３２０−１３２３，１９９７：非特許文献１）。すなわち、ＣＡＲ受容体は肝細胞をはじめとする多くの正常細胞でも十分に発現している。また、癌細胞ではＣＡＲの発現はさまざまであり、扁平上皮癌、悪性黒色腫、前立腺がん、一部の消化器癌などでは極めて発現が低く、通常のアデノウイルスでは十分な遺伝子導入効率が得られない。このような状況で全身にアデノウイルスを投与されると、肝毒性等の副作用が出現してしまうのが実情である。全身性疾患（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）である癌を治療するためには、原発巣のみならず、全身に転移しうる癌細胞に対し全身的な特異的な治療が必要であり、アデノウイルスによる癌遺伝子治療を飛躍させるためには、効率の良い標的化（腫瘍の標的化）が求められている。   However, the widespread application of adenoviral vectors for cancer gene therapy has been hampered by the lack of specificity of malignant cells due to the expression of CAR in both normal and malignant cells (Bergelson, J. et al. M., et al. Science, 275: 1320-1323, 1997: Non-Patent Document 1). That is, the CAR receptor is sufficiently expressed in many normal cells including hepatocytes. In addition, the expression of CAR in cancer cells varies, and is extremely low in squamous cell carcinoma, malignant melanoma, prostate cancer, some digestive organ cancers, etc., and normal adenovirus has sufficient gene transfer efficiency. I can't. When adenovirus is administered systemically in such a situation, side effects such as hepatotoxicity appear. In order to treat cancer, which is a systemic disease, systemic specific treatment is required not only for the primary lesion but also for cancer cells that can metastasize throughout the body. Cancer gene therapy using adenovirus In order to leap forward, efficient targeting (tumor targeting) is required.

近年、アデノウイルスの指向性は、Ａｄ５を代替のレセプターに再標的化するように改変されることができ、それによってウイルス感染をＣＡＲ非依存性にすることができることがわかっている。Ａｄ５カプシド改変のための最も一般的に利用される部位は、ファイバータンパク質ノブドメインである（Ｃｕｒｉｅｌ， Ｄ． Ｔ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ８８６：１５８−１７１，１９９９：非特許文献２）。ＣＡＲ非依存性遺伝子送達のためのいくつかのストラテジーが、報告されている。例えば、抗ファイバーノブ抗体および標的化レセプターリガンドの融合タンパク質（Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｓ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１００４−１０１２，１９９７：非特許文献３）、ファイバーノブおよび腫瘍関連抗原に対する二重特異的抗体（Ｈａｉｓｍａ， Ｈ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ６： １４６９−１４７４， １９９９：非特許文献４；Ｎｅｔｔｅｌｂｅｃｋ， Ｄ． Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ３： ８８２−８９１， ２００１：非特許文献５）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）結合ドメイン（Ｚ３３）のノブタンパク質および標的化レセプターへの挿入（Ｖｏｌｐｅｒｓ， Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７７： ２０９３−２１０４， ２００３：非特許文献６）である。本発明者らは、３番目のストラテジー、つまり、ブドウ球菌プロテインＡに由来する合成３３アミノ酸ＩｇＧ結合ドメイン（Ｚ３３）が、アデノウイルスファイバータンパク質に挿入されることに注目する。ファイバーは、３量体になる能力を維持しており、ＩｇＧに高親和性で結合し、ベクター粒子に組み込まれた。Ｖｏｌｐｅｒｓらは、Ｚ３３改変アデノウイルスベクターのＥＧＦＲ発現細胞への遺伝子導入効率は、ＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体との組み合わせによって強力にかつ用量依存的に増強されたことを報告した（非特許文献６）。   Recently, it has been found that the directionality of adenovirus can be modified to retarget Ad5 to alternative receptors, thereby making viral infection CAR independent. The most commonly utilized site for Ad5 capsid modification is the fiber protein knob domain (Curiel, DT Ann NY Acad Sci, 886: 158-171, 1999: Non-Patent Document 2). Several strategies for CAR-independent gene delivery have been reported. For example, anti-fiber knob antibody and targeting receptor ligand fusion protein (Watkins, S. J., et al., Gene Ther. 4: 1004-10102, 1997: Non-Patent Document 3), fiber knob and tumor-associated antigen Bispecific antibodies (Haisma, HJ, et al. Gene Ther, 6: 1469-1474, 1999: Non-Patent Document 4; Nettelbeck, DM, et al. Mol Ther, 3: 882-891 2001, Non-Patent Document 5), Insertion of an immunoglobulin G (IgG) binding domain (Z33) into a knob protein and a targeted receptor (Volpers, C., et al. J Virol, 77: 2093-2104, 2003: Non-patent literature ) It is. We note that a third strategy, a synthetic 33 amino acid IgG binding domain (Z33) derived from staphylococcal protein A, is inserted into the adenovirus fiber protein. The fiber maintained the ability to become a trimer, bound to IgG with high affinity, and incorporated into vector particles. Volpers et al. Reported that the gene transfer efficiency of the Z33-modified adenovirus vector into EGFR-expressing cells was strongly and dose-dependently enhanced by combination with an EGFR-specific monoclonal antibody (Non-patent Document 6).

ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、高度にグリコシル化された同型／異型の細胞表面細胞内接着分子のグループに属し、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの一部であるヒトＣＥＡ遺伝子ファミリーの原型メンバーである（Ｐａｘｔｏｎ， Ｒ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８４： ９２０−９２４， １９８７：非特許文献７）。ＣＥＡは、種々のヒト組織の癌細胞の９５％までにおいて、および正常胃腸組織および胎児の小腸の上皮細胞の表面に広範に発現されている。
Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１３２０−１３２３，１９９７ Ｃｕｒｉｅｌ， Ｄ． Ｔ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ８８６：１５８−１７１，１９９９ Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｓ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１００４−１０１２，１９９７ Ｈａｉｓｍａ， Ｈ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ６： １４６９−１４７４， １９９９ Ｎｅｔｔｅｌｂｅｃｋ， Ｄ． Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ３： ８８２−８９１， ２００１ Ｖｏｌｐｅｒｓ， Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７７： ２０９３−２１０４， ２００３ Ｐａｘｔｏｎ， Ｒ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８４： ９２０−９２４， １９８７ Human carcinoembryonic antigen (CEA) belongs to a group of highly glycosylated homologous / atypical cell surface intracellular adhesion molecules and is a prototypical member of the human CEA gene family that is part of the immunoglobulin gene superfamily. (Paxton, RJ, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 84: 920-924, 1987: Non-Patent Document 7). CEA is widely expressed in up to 95% of various human tissue cancer cells and on the surface of normal gastrointestinal tissue and fetal small intestinal epithelial cells.
Bergelson, J.M. M.M. , Et al. Science, 275: 1320-1323, 1997 Curiel, D.C. T.A. Ann NY Acad Sci, 886: 158-171, 1999 Watkins, S .; J. et al. , Et al. , Gene Ther. 4: 1004-1012, 1997 Haisma, H .; J. et al. , Et al. Gene Ther, 6: 1469-1474, 1999 Nettelbeck, D.D. M.M. , Et al. Mol Ther, 3: 882-891, 2001. Volpers, C.I. , Et al. J Virol, 77: 2093-2104, 2003. Paxton, R.M. J. et al. , Et al. Proc Natl Acad Sci USA, 84: 920-924, 1987

上述のように、癌の遺伝子治療は、５型アデノウイルスベクターを使用することによって限定されている。このアプローチの主要な問題は、癌細胞中でのアデノウイルスレセプターであるコクサッキーアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）の発現が弱いことによる遺伝子導入効率が低いこと、および／または正常細胞中でのＣＡＲの発現による副作用に関係していると考えられている。   As mentioned above, cancer gene therapy is limited by the use of type 5 adenoviral vectors. The main problem with this approach is that gene transfer efficiency is low due to weak expression of coxsackie adenovirus receptor (CAR), an adenovirus receptor in cancer cells, and / or CAR expression in normal cells. It is thought to be related to side effects caused by.

上述のような状況に鑑み、本発明者らは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を癌細胞中での特異的分子として選択し、ＣＥＡ発現ヒト腫瘍細胞に対し、ファイバー変異型アデノウイルスベクター（Ａｄｖ−ＦＺ３３）と結合させたヒト型抗ＣＡＥモノクローナル抗体を用いて、インビトロおよびインビボの両方において標的化治療の検討を行なった。   In view of the situation as described above, the present inventors have selected carcinoembryonic antigen (CEA) as a specific molecule in cancer cells, and a CEA-expressing human tumor cell is subjected to a fiber mutant adenoviral vector (Adv). A targeted anti-CAE monoclonal antibody conjugated to -FZ33) was investigated both in vitro and in vivo.

その結果、本発明者らは、抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を結合させたＡｄｖ−ＦＺ３３による癌細胞に対する標的化効果を実証し、本発明を完成した。   As a result, the present inventors demonstrated the targeting effect on cancer cells by Adv-FZ33 conjugated with anti-CEA monoclonal antibody (mAb), and completed the present invention.

したがって、本発明は、以下の抗ＣＥＡ抗体を提供する。
（１）抗ＣＥＡモノクローナル抗体を取得し、
上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記腫瘍細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価し、そして
上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択すること、
によって調製される、抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
（２）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（１）に記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
（２ａ）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも５０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（１）に記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
（３）上記ファイバー変異型アデノウイルスが、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターである、上記（１）に記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
（４）Ｃ２−４５である、上記（１）に記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体。 Therefore, the present invention provides the following anti-CEA antibodies.
(1) Obtaining an anti-CEA monoclonal antibody,
In the presence of the anti-CEA monoclonal antibody, the fiber mutant adenovirus modified to bind to the antibody and the tumor cell are contacted to infect the fiber mutant adenovirus with the tumor cell, and the fiber Evaluating the efficiency of infection of the mutant adenovirus to the tumor cells by a reporter gene expression assay, and selecting a monoclonal antibody such that the expression level of the reporter gene is at least twice as high as that of a control antibody;
An anti-CEA monoclonal antibody prepared by
(2) The anti-CEA monoclonal antibody according to (1) above, wherein a monoclonal antibody is selected such that the expression level of the reporter gene is at least 10 times higher than that of the control antibody.
(2a) The anti-CEA monoclonal antibody according to (1) above, wherein a monoclonal antibody is selected such that the expression level of the reporter gene is at least 50 times higher than that of the control antibody.
(3) The anti-CEA monoclonal antibody according to (1) above, wherein the fiber mutant adenovirus is a Z33 fiber mutant adenovirus vector.
(4) The anti-CEA monoclonal antibody according to (1), which is C2-45.

本発明はまた、以下に記載する複合体を提供する。
（５）抗ＣＥＡモノクローナル抗体とＩｇＧ結合モチーフを有する遺伝的に改変されたアデノウイルスベクターとの複合体。
（６）上記アデノウイルスベクターが、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターである、上記（５）に記載の複合体。
（７）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、上記（５）または（６）に記載の複合体。 The present invention also provides the composite described below.
(5) A complex of an anti-CEA monoclonal antibody and a genetically modified adenoviral vector having an IgG binding motif.
(6) The complex according to (5), wherein the adenovirus vector is a Z33 fiber mutant adenovirus vector.
(7) The complex according to (5) or (6) above, wherein the anti-CEA monoclonal antibody is the anti-CEA monoclonal antibody according to any one of (1) to (4).

本発明はまた、以下に記載する癌の治療薬を提供する。
（８）抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する、癌の治療薬。
（９）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、上記（８）に記載の癌の治療薬。
（１０）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子を担持したウイルスベクター、および薬剤を担持した非ウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている、上記（８）または（９）に記載の癌の治療薬。
（１１）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターに結合されている、上記（１０）に記載の癌の治療薬。
（１２）上記非ウイルスベクターが、リポソームベクター、重合リポソーム、脂質小胞、デンドリマー、ポリエチレングリコール集合体、ポリリジン、デキストラン、ポリヒドロキシ酪酸、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドベクター、およびプラスミドＤＮＡネイキッドベクターからなる群から選択される、上記（１０）に記載の癌の治療薬。
（１３）上記リポソームベクターが、飽和リン脂質、不飽和リン脂質、フォスファチジルコリン（ＰＣ）、フォスファチジルセリン（ＰＳ）、フォスファチジルグリセロール（ＰＧ）、フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）からなる群から選択されるリポソーム、または該リポソームの２種以上のいずれかの組み合わせからなるリポソームである、上記（１２）に記載の癌の治療薬
（１４）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現癌細胞を溶解またはその成長を阻害する、上記（８）〜（１３）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（１５）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、ＣＥＡ発現細胞をオプソニン化する、上記（８）〜（１３）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（１６）上記癌が、ＣＥＡ産生癌である、上記（８）〜（１５）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（１７）上記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（１６）に記載の癌の治療薬。 The present invention also provides the following therapeutic agents for cancer.
(8) A therapeutic drug for cancer containing an anti-CEA monoclonal antibody.
(9) The therapeutic agent for cancer according to (8), wherein the anti-CEA monoclonal antibody is the anti-CEA monoclonal antibody according to any one of (1) to (4).
(10) The anti-CEA monoclonal antibody is any one of a radioisotope, a therapeutic protein, a low molecular drug, a viral vector carrying a therapeutic gene, and a non-viral vector carrying a drug, or any combination thereof The therapeutic agent for cancer according to (8) or (9), which is chemically or genetically bound to
(11) The therapeutic agent for cancer according to (10) above, wherein the anti-CEA monoclonal antibody is bound to a Z33 fiber mutant adenovirus vector.
(12) The non-viral vector is a group consisting of a liposome vector, polymerized liposome, lipid vesicle, dendrimer, polyethylene glycol aggregate, polylysine, dextran, polyhydroxybutyric acid, Sendai virus envelope vector, plasmid vector, and plasmid DNA naked vector The cancer therapeutic agent according to (10), which is selected from:
(13) The liposome vector is a saturated phospholipid, an unsaturated phospholipid, phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine (PS), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylethanolamine (PE), A liposome selected from the group consisting of dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB), dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), dioleoylphosphatidylserine (DOPS), or 2 of the liposomes The therapeutic agent for cancer according to (12) above, which is a liposome comprising any combination of at least species (14) The anti-CEA monoclonal antibody lyses CEA-expressing cancer cells via immunological effector cells Or Inhibiting the growth, a therapeutic agent for cancer according to any one of (8) to (13).
(15) The therapeutic agent for cancer according to any of (8) to (13), wherein the anti-CEA monoclonal antibody opsonizes CEA-expressing cells.
(16) The cancer therapeutic agent according to any one of (8) to (15), wherein the cancer is a CEA-producing cancer.
(17) The cancer treatment according to (16), wherein the cancer is gastric cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, or prostate cancer. medicine.

本発明はまた、以下に記載する薬剤の標的化送達方法を提供する。
（１８）抗ＣＥＡ抗体を用いて、薬剤を標的部位へ送達することを包含する、薬剤の標的指向化方法。
（１９）上記抗ＣＥＡ抗体が、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、上記（１８）に記載の方法。
（２０）上記薬剤が、上記抗ＣＥＡ抗体と化学的または遺伝子工学的に結合している、上記（１８）または（１９）に記載の方法。
（２１）上記薬剤が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を含む、上記（１８）または（１９）に記載の方法。
（２２）上記治療遺伝子が、ウイルスベクターに担持されている、上記（２１）に記載の方法。
（２３）上記ウイルスベクターが、上記抗ＣＥＡ抗体が結合し得るファイバー変異型アデノウイルスである、上記（２２）に記載の方法。
（２４）上記標的部位が、ＣＥＡを特異的に発現している細胞、組織、または臓器である、上記（１８）〜（２３）のいずれかに記載の方法。 The present invention also provides a targeted delivery method for the drug described below.
(18) A method for targeting a drug, comprising delivering the drug to a target site using an anti-CEA antibody.
(19) The method according to (18) above, wherein the anti-CEA antibody is the anti-CEA monoclonal antibody according to any one of (1) to (4).
(20) The method according to (18) or (19) above, wherein the drug is chemically or genetically bound to the anti-CEA antibody.
(21) The method according to (18) or (19) above, wherein the drug comprises a radioisotope, a therapeutic protein, a small molecule drug, or a therapeutic gene.
(22) The method according to (21) above, wherein the therapeutic gene is carried on a viral vector.
(23) The method according to (22) above, wherein the viral vector is a fiber mutant adenovirus to which the anti-CEA antibody can bind.
(24) The method according to any one of (18) to (23), wherein the target site is a cell, tissue, or organ that specifically expresses CEA.

本発明はまた、以下に記載する抗ＣＥＡ抗体を使用する方法を提供する。
（２５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡ抗体を用いてＣＥＡ発現細胞をオプソニン化する方法。
（２６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡ抗体を用いて、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現細胞を溶解またはその成長を阻害する方法。 The invention also provides methods of using the anti-CEA antibodies described below.
(25) A method of opsonizing CEA-expressing cells using the anti-CEA antibody according to any one of (1) to (4) above.
(26) A method of lysing a CEA-expressing cell or inhibiting its growth via an immunological effector cell using the anti-CEA antibody according to any one of (1) to (4) above.

本発明はまた、以下に記載する抗ＣＥＡモノクローナル抗体の調製方法を提供する。
（２７）腫瘍特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を調製する方法であって、
ＣＥＡまたはＣＥＡ陽性腫瘍細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、および
上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記腫瘍細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する、方法。
（２８）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の存在下での、上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞への感染が、
（Ａ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物を、上記腫瘍細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に接触させるか、
（Ｂ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、上記腫瘍細胞に接触させるか、または
（Ｃ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、上記腫瘍細胞に接触させること、
によって行われる上記（２７）に記載の方法。
（２８ａ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の代わりに、予め調製された抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いる、上記（２７）または（２８）に記載の方法。
（２９）上記感染効率を評価する工程が、レポーター遺伝子発現アッセイによって上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する上記感染効率を評価することを含み、ここで上記ファイバー変異型アデノウイルスは、上記感染の際に上記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現する、上記（２７）または（２８）に記載の方法。
（３０）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（２９）に記載の方法。
（３１）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（２９）に記載の方法。
（３１ａ）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも５０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（２９）に記載の方法。
（３２）上記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺまたはＥＧＦＰである、上記（２９）〜（３１）のいずれかに記載の方法。
（３３）上記ＣＥＡ陽性腫瘍細胞が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌細胞である、上記（２７）〜（３２）のいずれかに記載の方法。
（３４）上記（２７）〜（３３）のいずれかに記載の方法によって得られる、抗ＣＥＡモノクローナル抗体。 The present invention also provides a method for preparing the anti-CEA monoclonal antibody described below.
(27) A method for preparing a monoclonal antibody against a tumor-specific CEA antigen, comprising:
Immunizing a mammal with CEA or CEA positive tumor cells, fusing lymphocytes from the immunized mammal with myeloma cells to produce a hybridoma library, and presence of the hybridoma-derived product from the library The fiber mutant adenovirus modified to bind to an antibody and the tumor cell are contacted with each other to infect the tumor cell with the fiber mutant adenovirus, and the fiber mutant adenovirus is treated with the tumor. A step of evaluating the efficiency of infection to cells,
Including the method.
(28) Infection of the tumor cells with the fiber mutant adenovirus in the presence of the hybridoma-derived product from the library,
(A) After contacting the hybridoma-derived product from the library with the tumor cell, the fiber mutant adenovirus modified to bind to the antibody is contacted with the tumor cell,
(B) The hybridoma-derived product derived from the library is reacted in advance with a fiber mutant adenovirus modified so as to bind to an antibody, and then contacted with the tumor cell, or (C) the library Contacting the tumor cells by simultaneously administering the hybridoma-derived product derived from and a fiber mutant adenovirus modified to bind to an antibody,
The method according to (27), which is performed by
(28a) The method according to (27) or (28) above, wherein an anti-CEA monoclonal antibody prepared in advance is used in place of the hybridoma-derived product derived from the library.
(29) The step of evaluating the infection efficiency includes evaluating the infection efficiency of the fiber mutant adenovirus with respect to the tumor cells by a reporter gene expression assay, wherein the fiber mutant adenovirus comprises the infection. The method according to (27) or (28) above, wherein a reporter gene for evaluating the infection efficiency is expressed at the time.
(30) The method according to (29), wherein the monoclonal antibody is selected so that the expression level of the reporter gene is at least twice as high as that of the control antibody.
(31) The method according to (29) above, wherein a monoclonal antibody is selected such that the expression level of the reporter gene is at least 10 times higher than that of the control antibody.
(31a) The method according to (29) above, wherein a monoclonal antibody is selected so that the expression level of the reporter gene is at least 50 times higher than that of the control antibody.
(32) The method according to any one of (29) to (31) above, wherein the reporter gene is lacZ or EGFP.
(33) The above (27) to (27), wherein the CEA positive tumor cells are gastric cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, or prostate cancer cell. 32) The method according to any one of the above.
(34) An anti-CEA monoclonal antibody obtained by the method according to any one of (27) to (33).

本発明はまた、以下に記載する癌の診断薬を提供する。
（３５）抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する、癌の診断薬。
（３６）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、上記（３５）に記載の癌の診断薬。
（３７）上記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（３５）または（３６）に記載の癌の診断薬。
（３８）上記抗ＣＥＡ抗体が、標識されている、上記（３５）〜（３７）のいずれかに記載の癌の診断薬。
（３９）上記抗ＣＥＡ抗体が、放射性同位元素、蛍光基、発光基、フリーラジカル基、粒子、バクテリオファージ、細胞、金属、酵素、または補酵素によって標識されている、上記（３８）に記載の癌の診断薬。
（４０）上記癌が、ＣＥＡ産生癌である、上記（３５）〜（３９）のいずれかに記載の癌の診断薬。
（４１）上記ＣＥＡ産生癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（４０）に記載の診断薬。 The present invention also provides a diagnostic agent for cancer described below.
(35) A diagnostic agent for cancer comprising an anti-CEA monoclonal antibody.
(36) The diagnostic agent for cancer according to (35), wherein the anti-CEA monoclonal antibody is the anti-CEA monoclonal antibody according to any one of (1) to (4).
(37) The cancer described in (35) or (36) above, wherein the cancer is gastric cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, or prostate cancer. Cancer diagnostics.
(38) The diagnostic agent for cancer according to any one of (35) to (37), wherein the anti-CEA antibody is labeled.
(39) The anti-CEA antibody according to (38), wherein the anti-CEA antibody is labeled with a radioisotope, a fluorescent group, a luminescent group, a free radical group, a particle, a bacteriophage, a cell, a metal, an enzyme, or a coenzyme. A diagnostic agent for cancer.
(40) The cancer diagnostic agent according to any one of (35) to (39), wherein the cancer is a CEA-producing cancer.
(41) The diagnosis according to (40), wherein the CEA-producing cancer is gastric cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, or prostate cancer. medicine.

本発明はまた、以下に記載する癌の診断方法を提供する。
（４２）被験者由来の生体試料中のＣＥＡタンパク質もしくはその断片、またはこれらをコードする核酸を診断マーカーとして検出および／または定量する工程を包含する、癌の診断方法。
（４３）被験者由来の生体試料中のＣＥＡを、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いて免疫学的に検出および／または定量する、上記（４２）に記載の方法。
（４４）上記生体試料と抗ＣＥＡ抗体とを接触させる工程、および
該生体試料中のＣＥＡと該抗ＣＥＡ抗体との結合を検出および／または定量する工程
を包含する、上記（４２）または（４３）に記載の方法。
（４５）上記検出および／または定量する工程が、標識された抗ＣＥＡ抗体を用いて、ＣＥＡと抗ＣＥＡ抗体との結合を検出および／または定量することを包含する、上記（４２）〜（４４）のいずれかに記載の方法。
（４６）上記生体試料が、被験者由来の組織、細胞、血液、尿、リンパ液、***、唾液、または汗である、上記（４２）〜（４５）のいずれかに記載の方法。
（４７）ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテインＡ免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法に従う、上記（４３）〜（４６）のいずれかに記載の方法。
（４８）上記癌が、ＣＥＡ産生癌である、上記（４２）〜（４７）に記載の方法。
（４９）上記ＣＥＡ産生癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（４８）に記載の方法。 The present invention also provides a method for diagnosing cancer described below.
(42) A method for diagnosing cancer, comprising a step of detecting and / or quantifying CEA protein or a fragment thereof in a biological sample derived from a subject, or a nucleic acid encoding them as a diagnostic marker.
(43) In the above (42), CEA in a biological sample derived from a subject is immunologically detected and / or quantified using the anti-CEA monoclonal antibody described in any of (1) to (4) above. The method described.
(44) The above (42) or (43) comprising the step of bringing the biological sample into contact with an anti-CEA antibody, and the step of detecting and / or quantifying the binding between CEA and the anti-CEA antibody in the biological sample. ) Method.
(45) The steps (42) to (44), wherein the step of detecting and / or quantifying comprises detecting and / or quantifying the binding of CEA and anti-CEA antibody using a labeled anti-CEA antibody. ) Any one of the methods.
(46) The method according to any one of (42) to (45), wherein the biological sample is tissue, cells, blood, urine, lymph, semen, saliva, or sweat derived from a subject.
(47) Western blotting, radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), sandwich immunoassay, fluorescence immunoassay (FIA), time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA), enzyme immunoassay (EIA), luminescence immunoassay (LIA), electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), latex agglutination, immunoprecipitation assay, sedimentation reaction, gel diffusion sedimentation reaction, immunodiffusion assay, agglutinin assay The method according to any one of (43) to (46) above, according to an immunoassay selected from the group consisting of a complementation assay, a complement binding assay, an immunoradiometric assay, a fluorescence immunoassay, and a protein A immunoassay the method of.
(48) The method according to (42) to (47), wherein the cancer is a CEA-producing cancer.
(49) The method according to (48), wherein the CEA-producing cancer is gastric cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, or prostate cancer. .

本発明はまた、以下のような自己抗体を用いた癌の診断方法を提供する。
（５０）ＣＥＡに対する自己抗体を癌の診断マーカーとして使用する方法。
（５１）被験者由来の生体試料中の抗ＣＥＡ自己抗体を検出および／または定量する工程を包含する、上記（５０）に記載の方法。
（５２）上記癌が、ＣＥＡ産生癌である、上記（５０）または（５１）に記載の方法。
（５３）上記ＣＥＡ産生癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（５２）に記載の方法。 The present invention also provides a method for diagnosing cancer using the following autoantibodies.
(50) A method of using an autoantibody against CEA as a diagnostic marker for cancer.
(51) The method according to (50) above, comprising a step of detecting and / or quantifying an anti-CEA autoantibody in a biological sample derived from a subject.
(52) The method according to (50) or (51) above, wherein the cancer is a CEA-producing cancer.
(53) The method according to (52), wherein the CEA-producing cancer is gastric cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, or prostate cancer. .

本発明はさらに、以下の抗ＣＥＡ抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、該ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、抗ＣＥＡ抗体の製造方法、およびそれにより製造される抗ＣＥＡ抗体を提供する。
（５４）抗ＣＥＡ抗体をコードするＤＮＡ。
（５５）抗ＣＥＡ抗体のＨ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）またはＬ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）をコードするＤＮＡ。
（５６）上記（５４）または（５５）に記載のＤＮＡを含有するベクター。
（５７）上記（５６）に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（５８）上記（５７）に記載の形質転換体を適切な培地で培養する工程、および
該培養物から抗ＣＥＡ抗体を収集する工程
を包含する、抗ＣＥＡ抗体の製造方法。
（５９）上記（５８）に記載の方法により製造される、抗ＣＥＡ抗体。
（６０）Ｈ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）またはＬ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）を含有する、上記（５９）の抗ＣＥＡ抗体。 The present invention further includes DNA encoding the following anti-CEA antibody, a vector containing the DNA, a transformant obtained by introducing the vector into a host cell, a method for producing the anti-CEA antibody, and a product produced thereby. An anti-CEA antibody is provided.
(54) DNA encoding an anti-CEA antibody.
(55) DNA encoding the H chain V region (including CDRs 1 to 3) or the L chain V region (including CDRs 1 to 3) of an anti-CEA antibody.
(56) A vector containing the DNA of (54) or (55) above.
(57) A transformant obtained by introducing the vector according to (56) above into a host cell.
(58) A method for producing an anti-CEA antibody, comprising the steps of culturing the transformant according to (57) above in an appropriate medium, and collecting the anti-CEA antibody from the culture.
(59) An anti-CEA antibody produced by the method according to (58) above.
(60) The anti-CEA antibody according to the above (59), comprising an H chain V region (including CDRs 1 to 3) or an L chain V region (including CDRs 1 to 3).

本発明はまた、以下のような特徴を有する抗ＣＥＡ抗体を提供する。
（６１）特定の細胞に対するウイルスベクターによる遺伝子導入効率を高めることができる、抗ＣＥＡ抗体。
（６２）抗ＣＥＡ抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含むヒト化抗ＣＥＡ抗体。
（６３）ヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である、上記（６２）に記載のヒト化抗ＣＥＡ抗体。
（６４）完全にヒト型である、上記（６２）または（６３）に記載のヒト化抗ＣＥＡ抗体。
（６５）モノクローナル抗体である、上記（６１）〜（６４）に記載の抗ＣＥＡ抗体。
（６６）上記（６１）〜（６５）のいずれかに記載の抗ＣＥＡ抗体と放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤とを化学的または遺伝子工学的に結合させた誘導体。 The present invention also provides an anti-CEA antibody having the following characteristics.
(61) An anti-CEA antibody that can increase the efficiency of gene transfer to a specific cell using a viral vector.
(62) A humanized anti-CEA antibody comprising an H chain V region and an L chain V region of an anti-CEA antibody.
(63) The humanized anti-CEA antibody according to (62) above, which is a human chimeric antibody or a human CDR-grafted antibody.
(64) The humanized anti-CEA antibody according to (62) or (63), which is completely human.
(65) The anti-CEA antibody according to (61) to (64) above, which is a monoclonal antibody.
(66) A derivative obtained by chemically or genetically coupling the anti-CEA antibody according to any one of (61) to (65) above to a radioisotope, a therapeutic protein, or a low molecular weight drug.

本発明は、抗ＣＥＡ抗体と、ＩｇＧ結合モチーフを有する遺伝的に改変したアデノウイルスベクターとの組み合わせを使用することによって、癌（特にＣＥＡ産生癌）の遺伝子治療を、遺伝子導入効率および特異性の両面において顕著に改善し得る。   By using a combination of an anti-CEA antibody and a genetically modified adenoviral vector having an IgG binding motif, the present invention provides gene therapy for cancer (especially CEA-producing cancer) with gene transfer efficiency and specificity. It can be remarkably improved on both sides.

本発明の抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、ＣＥＡ産生癌（特に転移癌）の標的化療法、診断等の用途において有用である。特に、抗体のＦｃドメインに結合するように改変されたファイバー変異型アデノウイルスと共に用いた場合、ＣＥＡ陽性細胞に対するアデノウイルスの感染効率を特異的に高めることから、ＣＥＡ産生癌特異的な遺伝子療法に有用である。   The anti-CEA monoclonal antibody of the present invention is useful in applications such as targeted therapy and diagnosis of CEA-producing cancer (particularly metastatic cancer). In particular, when used in combination with a fiber mutant adenovirus modified to bind to the Fc domain of an antibody, the efficiency of adenovirus infection against CEA positive cells is specifically increased. Useful.

また、マウス抗ＣＥＡ抗体が、臨床試験で癌に対して抗癌剤として使用される場合、モノクローナル抗体の正常組織との交差反応性およびマウスモノクローナル抗体に対するヒトの免疫反応は、主要な問題である。ＣＥＡファミリーは、７つの発現された遺伝子からなる。それらのうち、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、およびＣＥＡＣＡＭ８はしばしば種々のタイプの正常組織に存在するため、非常に障害となる。本発明の完全ヒト型の抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いることにより、上記免疫反応の問題は解決される。また、本発明の抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、実施例に示すように、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、またはＣＥＡＣＡＭ８のいずれとも交差反応しないため、上記の交差反応性の問題も解決される。   Also, when mouse anti-CEA antibodies are used as anti-cancer agents against cancer in clinical trials, cross-reactivity of monoclonal antibodies with normal tissues and human immune responses to mouse monoclonal antibodies are major issues. The CEA family consists of seven expressed genes. Of these, CEACAM1, CEACAM6, and CEACAM8 are very disturbing because they are often present in various types of normal tissues. By using the fully human anti-CEA monoclonal antibody of the present invention, the above problem of immune reaction is solved. In addition, since the anti-CEA monoclonal antibody of the present invention does not cross-react with any of CEACAM1, CEACAM6, or CEACAM8 as shown in the Examples, the above-mentioned problem of cross-reactivity is solved.

本発明者らは、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスを用いた癌への遺伝子導入療法において、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞への特異的な遺伝子導入効率を高めるモノクローナル抗体を同定した。   The present inventors have identified a monoclonal antibody that increases specific gene transfer efficiency to CEA positive tumor cells in cancer gene transfer therapy using Z33 fiber mutant adenovirus.

本発明者らは、上記モノクローナル抗体を併用して、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスを用いたＣＥＡ陽性もしくは陰性の胃癌細胞または正常細胞への遺伝子導入を評価し、ＣＥＡ陽性胃癌細胞において特異的に遺伝子導入効率が顕著に高まることを見出した。本発明の抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、上記Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスとの組み合わせのみならず、他の薬剤（例えば、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子など）と組み合わせて、ＣＥＡ産生癌の標的化療法に用いることができる。   The present inventors have evaluated the gene transfer into CEA positive or negative gastric cancer cells or normal cells using Z33 fiber mutant adenovirus in combination with the above monoclonal antibody, and the gene is specifically expressed in CEA positive gastric cancer cells. It was found that the introduction efficiency was remarkably increased. The anti-CEA monoclonal antibody of the present invention is not only used in combination with the Z33 fiber mutant adenovirus, but also in combination with other drugs (for example, radioisotopes, therapeutic proteins, small molecule drugs, or therapeutic genes) It can be used for targeted therapy of CEA producing cancer.

ＣＥＡは、正常成人組織において、円柱上皮細胞の腔側に局在し、そのため、正常ＣＥＡは、血流または組織液に直接接していない。それゆえ、腫瘍ＣＥＡは、抗ＣＥＡ抗体を用いた遺伝子治療のための魅力的な標的分子であり得る。   CEA is localized in the cavity side of columnar epithelial cells in normal adult tissues, so that normal CEA is not in direct contact with blood flow or tissue fluid. Tumor CEA may therefore be an attractive target molecule for gene therapy with anti-CEA antibodies.

したがって、本発明は、ＣＥＡをマーカーとして利用するＣＥＡ産生癌の診断、および／またはＣＥＡを標的としたＣＥＡ産生癌の標的化療法を提供する。本発明はまた、癌特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を調製する方法を提供する。癌特異的ＣＥＡ抗原に特異的に結合し得る抗体を同定することにより、癌のイメージングおよび／または処置のために有用なシステムが提供される。   Therefore, the present invention provides diagnosis of CEA-producing cancer using CEA as a marker and / or targeted therapy for CEA-producing cancer targeting CEA. The present invention also provides a method for preparing monoclonal antibodies against a cancer-specific CEA antigen. Identifying antibodies that can specifically bind to a cancer-specific CEA antigen provides a useful system for cancer imaging and / or treatment.

１．抗ＣＥＡ抗体
本発明は、ＣＥＡに対する抗体を提供する。 1. Anti-CEA Antibody The present invention provides an antibody against CEA.

本明細書中、「ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）」、「ＣＥＡタンパク質」、または「ＣＥＡ抗原」とは、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにアクセッション番号Ｐ０６７３１で登録されているアミノ酸配列（配列番号１）で特定される７０２アミノ酸残基のタンパク質、ならびに上記タンパク質の断片、またはこれらの誘導体を意味する。ここで、「誘導体」とは、ＣＥＡタンパク質またはその断片のアミノ酸配列において１または複数個（例えば、数個（例、６個））のアミノ酸残基の変異、置換、欠失および／または付加を含み、実質的にＣＥＡタンパク質と同じ抗原性を有するペプチドまたはポリペプチドを意味するものとする。ここで、「実質的に」とは、ＣＥＡの発現によって特徴付けられる疾患の診断および／または治療に使用され得る程度に、抗ＣＥＡ抗体によって特異的に認識されるような特異性の程度を意味する。誘導体の典型的な例には、ＣＥＡ多型、スプライシングなどによる配列変化がある。ここで、「断片」の長さとしては、抗ＣＥＡ抗体に特異的な抗原として認識され得る長さであれば制限はないが、好ましくは６アミノ酸以上、より好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは１０アミノ酸以上である。また、これらの断片は、ＣＥＡタンパク質の任意の部分であり得るが、ＣＥＡタンパク質のエピトープに対応するか、エピトープに対応する部分を含んでいることがより好ましい。   In this specification, “CEA (carcinoembryonic antigen)”, “CEA protein”, or “CEA antigen” is identified by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) registered in the NCBI protein sequence database under the accession number P06731. 702 amino acid residues, as well as fragments of these proteins, or derivatives thereof. Here, the “derivative” refers to mutation, substitution, deletion and / or addition of one or more (for example, several (eg, 6)) amino acid residues in the amino acid sequence of CEA protein or a fragment thereof. It is intended to mean a peptide or polypeptide that contains substantially the same antigenicity as the CEA protein. Here, “substantially” means the degree of specificity that is specifically recognized by an anti-CEA antibody to the extent that it can be used for diagnosis and / or treatment of diseases characterized by CEA expression. To do. Typical examples of derivatives include sequence changes due to CEA polymorphism, splicing and the like. Here, the length of the “fragment” is not limited as long as it can be recognized as an antigen specific to the anti-CEA antibody, but is preferably 6 amino acids or more, more preferably 8 amino acids or more, and still more preferably 10 amino acids or more. These fragments may be any part of the CEA protein, but more preferably correspond to an epitope of the CEA protein or include a part corresponding to the epitope.

本明細書中、「抗ＣＥＡ抗体」または「ＣＥＡに対する抗体」は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体をいい、元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を示す当該抗体の断片（本明細書中、「機能的断片」と呼ぶ）または誘導体をも含むものとする。抗体の機能的断片または誘導体には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドのような抗体の機能的断片、またはヒト化抗体（例えば、ＣＤＲ移植完全ヒト型抗体）のような誘導体などが含まれる。本発明に使用する抗体は、以下に詳述するように、動物を免疫化し、血清（ポリクローナル）または脾臓細胞を回収すること（適切な細胞との融合によるハイブリドーマの作製のため）を含む、従来の方法により作製することができる。 In the present specification, an “anti-CEA antibody” or “an antibody against CEA” refers to an antibody that specifically binds to CEA, and a fragment of the antibody that exhibits substantially the same antigen specificity as the original antibody (the present specification (Also referred to as “functional fragments”) or derivatives. Functional fragments or derivatives of antibodies include antibody functions such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , single chain antibodies (scFv), disulfide stabilized V region fragments (dsFv), or peptides containing CDRs. Or a derivative such as a humanized antibody (eg, a CDR-grafted fully human antibody). The antibodies used in the present invention conventionally comprise immunizing an animal and collecting serum (polyclonal) or spleen cells (for the production of hybridomas by fusion with appropriate cells) as detailed below. It can produce by the method of.

本明細書中、抗体があるタンパク質またはその断片に「特異的に結合する」とは、その抗体が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、１０９Ｍ−１、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１またはそれより高い、例えば、最高で１０１３Ｍ−１またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。 As used herein, an antibody “specifically binds” to a protein or fragment thereof refers to the specific amino acid sequence of these proteins or fragments thereof rather than its affinity for other amino acid sequences. Binding with substantially high affinity. Here, “substantially high affinity” means high affinity that allows the specific amino acid sequence to be detected separately from other amino acid sequences by a desired measuring device. Has a binding constant (K a ) of at least 10 7 M −1 , preferably at least 10 8 M −1 , more preferably 10 9 M −1 , even more preferably 10 10 M −1 , 10 11. It means a binding affinity such that it is M −1 , 10 12 M −1 or higher, for example up to 10 13 M −1 or higher.

本発明の抗ＣＥＡ抗体は、マウス抗ＣＥＡ抗体などのヒト以外の哺乳動物の抗体であってもよいが、ヒト化抗体であることがヒトへの適用には抗原性が低く副作用が少ないため好ましく、完全ヒト型抗体であることが最も好ましい。また、本発明の抗ＣＥＡ抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得るが、モノクローナル抗体であることが好ましい。   The anti-CEA antibody of the present invention may be a non-human mammal antibody such as a mouse anti-CEA antibody, but a humanized antibody is preferable for human application because it has low antigenicity and few side effects. Most preferably, it is a fully human antibody. The anti-CEA antibody of the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.

以下、本発明の抗ＣＥＡ抗体の作製において利用し得る、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片等の一般的な作製方法について説明する。   Hereinafter, general methods for producing a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, an antibody fragment, etc. that can be used in the production of the anti-CEA antibody of the present invention will be described.

（モノクロナール抗体の作製方法）
モノクローナル抗体産生細胞の作製
ＣＥＡに対するモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。ＣＥＡを、哺乳動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。 (Method for producing monoclonal antibody)
Production of Monoclonal Antibody-Producing Cells Monoclonal antibodies against CEA can be produced as follows. CEA is administered to a mammal at the site where antibody production is possible, or with a carrier and a diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, 2 to 10 times in total. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep and goats, and mice and rats are preferably used.

モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は既知の方法、例えば、コーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５）に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。   When producing monoclonal antibody-producing cells, select a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual with a confirmed antibody titer from a mouse, collect spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization, A monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained with myeloma cells. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used. Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, etc., and P3U1 is preferably used. The preferred ratio of the number of antibody-producing cells (spleen cells) to be used and the number of myeloma cells is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. The cell fusion can be efficiently carried out by incubating at about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 minutes.

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用し得るが、例えば、タンパク質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に、放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行うことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％のウシ胎仔血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。   Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (for example, a microplate) on which a protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier. A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (if the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A And a method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase adsorbed with an anti-immunoglobulin antibody or protein A, adding a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme, etc. . Selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method similar thereto, but can be usually performed in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium may be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal calf serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1 to 10% fetal calf serum, or serum-free for hybridoma culture A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) etc. can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks. Culturing can usually be performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.

モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行うことができる。 Purification of monoclonal antibodies Separation and purification of monoclonal antibodies can be performed by separation and purification of immunoglobulins as in the case of separation and purification of ordinary polyclonal antibodies [for example, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion Absorbing and desorbing with an exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G, and collecting the antibody alone to obtain the antibody by dissociating the binding Specific purification method].

（ポリクローナル抗体の作製方法）
ＣＥＡに対するポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質の抗原）と担体タンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原と担体タンパク質との複合体に関して、担体タンパク質の種類および担体とハプテンとの混合比は、担体に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、任意のものを任意の比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプリングさせる方法が用いられる。また、ハプテンと担体のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタールアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行うことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。 (Polyclonal antibody production method)
A polyclonal antibody against CEA can be produced according to a known or similar method. For example, a complex of an immunizing antigen (protein antigen) and a carrier protein is prepared, a mammal is immunized in the same manner as the above monoclonal antibody production method, and an antibody-containing product against the protein of the present invention is collected from the immunized animal. The antibody can be produced by separating and purifying the antibody. Regarding the complex of immunizing antigen and carrier protein used to immunize mammals, the kind of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten should be such that antibodies can be efficiently produced against hapten immunized by crosslinking to the carrier. Any of them may be cross-linked at an arbitrary ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole, limpet, hemocyanin, etc. are about 0.1 to 20, preferably about 0.1 to 20 in weight ratio to hapten 1. A method of coupling at a ratio of about 1 to 5 is used. In addition, various condensing agents can be used for coupling the hapten and the carrier, but an active ester reagent containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, dithiobilidyl group, or the like is used. The condensation product is administered to warm-blooded animals at the site where antibody production is possible, or with a carrier and a diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration can be performed about once every 2 to 6 weeks, usually about 3 to 10 times in total. Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc. of mammals immunized by the above method, preferably from blood. The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer in the serum. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described monoclonal antibody separation and purification.

（抗体断片または誘導体の製造方法）
Ｆａｂは、ＩｇＧをタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂは、ＣＥＡに特異的に結合する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。 (Method for producing antibody fragment or derivative)
Fab is a fragment obtained by treating IgG with the proteolytic enzyme papain (cleaved at the amino acid residue at position 224 of the H chain), and about half of the N chain side of the H chain and the entire L chain are disulfide bonds. It is an antibody fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 50,000. The Fab of the present invention can be obtained by treating an antibody that specifically binds to CEA with the proteolytic enzyme papain.

Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。 Among F (ab ′) 2 fragments obtained by treating IgG with protein pepsin (cleaved at the 234th amino acid residue of the H chain), Fab was bound via a disulfide bond in the hinge region. It is an antibody fragment having an antigen-binding activity having a molecular weight of about 100,000, which is slightly larger than the above. The Fab ′ of the present invention can be obtained by treating an antibody that specifically binds to CEA with the proteolytic enzyme pepsin.

Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。 Fab ′ is an antibody fragment having an antigen-binding activity having a molecular weight of about 50,000, which is obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 . The Fab ′ of the present invention can be obtained by treating an antibody that specifically binds to CEA with a reducing agent dithiothreitol.

上記Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、またはＦａｂ’はまた、全長抗ＣＥＡ抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、またはＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物もしくは真核生物に導入して発現することによっても製造することができる（例えば、Ｃｏ Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６； Ｂｅｔｔｅｒ Ｍ．＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ Ａ．Ｈ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６； Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆ Ｓｋｅｒｒａ Ａ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４９７−５１５； Ｌａｍｏｙｉ Ｅ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６５２−６６３； Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ Ｊ．ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６６３−６６９； Ｂｉｒｄ Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７等を参照）。   The Fab, F (ab ′), or Fab ′ may also be used to convert a DNA encoding the Fab, F (ab ′), or Fab ′ fragment of the full-length anti-CEA antibody into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector. It can also be produced by inserting and expressing the vector in prokaryotes or eukaryotes (eg, Co MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976). Better M. & Horwitz AH Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Pleweckun, A. & Skerra A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-5L; See Enzymology (1986) 121, 652-663; Rousesea J. et al., Methods in Enzymology (1986) 121, 663-669; Bird RE, et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137, etc. ).

一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖと略すこともある）は、一本の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＶＨと略す）と一本の軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＶＬと略す）とを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと略す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬまたはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３を参照）。本発明の一本鎖抗体は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、一本鎖抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入して発現させることにより、製造することができる。   A single chain antibody (hereinafter sometimes abbreviated as scFv) is composed of a single heavy chain variable region (hereinafter abbreviated as VH) and a single light chain variable region (hereinafter referred to as VH). VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide linked with an appropriate peptide linker (hereinafter abbreviated as P) (for example, Huston, J. S. et al.). , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). The single-chain antibody of the present invention obtains cDNA encoding the VH and VL of an antibody that specifically binds to CEA, constructs a DNA encoding the single-chain antibody, and uses this to construct a prokaryotic expression vector or true It can be produced by inserting into an expression vector for nuclei and introducing the expression vector into a prokaryote or eukaryote for expression.

ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖとも略すこともある）は、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをシステイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ７，６９７ （１９９４））に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるジスルフィド安定化Ｖ領域断片に含まれるＶＨおよびＶＬは、ＣＥＡに特異的に結合する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。   A disulfide-stabilized V region fragment (hereinafter sometimes abbreviated as dsFv) is obtained by binding a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is replaced with a cysteine residue via a disulfide bond between cysteine residues. Say something. The amino acid residue substituted for the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697 (1994)). As VH and VL contained in the disulfide-stabilized V region fragment used in the present invention, antibodies that specifically bind to CEA, for example, humanized antibodies or human antibodies can be used.

本発明のジスルフィド安定化Ｖ領域断片は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片をコードするＤＮＡを構築し、これを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入して発現させることにより製造することができる。相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲと略す）を含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。   The disulfide-stabilized V region fragment of the present invention obtains cDNA encoding the antibody VH and VL that specifically binds to CEA, constructs a DNA encoding the disulfide-stabilized V region fragment, and uses this for prokaryotes. It can be produced by inserting into an expression vector or an expression vector for eukaryotes, introducing this expression vector into a prokaryote or eukaryote and expressing it. A peptide including a complementary determining region (hereinafter abbreviated as CDR) includes at least one region of an H chain or L chain CDR. Multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.

本発明のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＥＡに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物もしくは真核生物へ導入して発現させることにより、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
（ヒト化抗体） The CDR-containing peptide of the present invention is obtained by obtaining cDNA encoding VH and VL of an antibody that specifically binds to CEA, and then constructing DNA encoding CDR, and using this DNA as a prokaryotic expression vector or eukaryotic It can be produced by inserting into an expression vector for organisms and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism for expression. Moreover, the peptide containing CDR can also be manufactured by chemical synthesis methods, such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
(Humanized antibody)

ヒト以外の動物の抗体を、遺伝子組換え技術を利用してヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、または完全ヒト型抗体などとしたヒト化抗体もまた、本発明において有利に使用することができる。ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１（２１），６８５１−６８５５，１９８４）、ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域中のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Ｊｏｎｅｓ Ｐ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，３２１（６０６９），５２２−５２５，１９８６）。また、完全ヒト型抗体とは、マウスのようなヒト以外の動物で作成した抗体を遺伝子組換え技術によりヒト化部分を１００％含むようにした抗体である。ヒト化抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続する。また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖）Ｃ領域としてγ１サブクラスを使用すれば、血中で安定で、かつ抗体依存性細胞障害活性などのエフェクター活性の高いヒト化抗体を作製することができる（Ｃｏ Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６（５），１１１８−１１２５，１９９６）。エフェクター活性の高いヒト化抗体は、癌などの標的の破壊が望まれる場合に有用である。一方、単に標的を中和する作用のみが必要とされる場合や、エフェクター活性による標的の破壊による副作用が懸念される場合には、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域としてγ４サブクラスを使用すれば、γ４サブクラスは一般的にエフェクター活性が低いため（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６６（５），１３５１−１３６１，１９８７； Ｂｉｎｄｏｎ Ｃ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６８（１），１２７−１４２，１９８８）、副作用を回避でき、しかもマウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８５（４），６６８−６７４，１９９５）。さらに、蛋白質工学、遺伝子工学的手法を用いてヒト化抗体を含めた抗体から作製したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ （Ｂｉｒｄ Ｒ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２（４８７７），４２３−４２６，１９８８）、ｄｓＦｖ（Ｗｅｂｂｅｒ Ｋ．Ｏ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２（４），２４９−２５８，１９９５）、ＣＤＲを含むペプチド（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１（６），２９６６−２９７１，１９９６）などのより分子量の小さい抗体断片を使用することもできる。これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ分子量が小さいために、標的組織への移行性に優れており、有利である（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２，３４０２−３４０８，１９９２）。 Humanized antibodies in which non-human animal antibodies are converted into human chimeric antibodies, human CDR-grafted antibodies, or fully human antibodies using genetic recombination techniques can also be advantageously used in the present invention. it can. A human chimeric antibody is an antibody in which the variable region of an antibody (hereinafter referred to as V region) is an antibody from an animal other than a human and the constant region (hereinafter referred to as C region) is a human antibody (Morrison). S. L. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 81 (21), 6851-6855, 1984), human CDR-grafted antibody is the amino acid sequence of CDR in the V region of an antibody of a non-human animal. It is an antibody grafted at an appropriate position of a human antibody (Jones PT et al., Nature, 321 (6069), 522-525, 1986). A fully human antibody is an antibody prepared from a non-human animal such as a mouse so as to contain 100% of a humanized portion by gene recombination technology. When administered to humans, humanized antibodies have fewer side effects than antibodies from non-human animals, and their therapeutic effects last for a long time. In addition, humanized antibodies can be prepared as molecules of various forms using gene recombination techniques. For example, if the γ1 subclass is used as the heavy chain (hereinafter referred to as H chain) C region of a human antibody, a humanized antibody that is stable in blood and has high effector activity such as antibody-dependent cytotoxic activity can be produced. (Co MS et al., Cancer Research, 56 (5), 1181-1125, 1996). Humanized antibodies with high effector activity are useful when destruction of a target such as cancer is desired. On the other hand, if only the action of neutralizing the target is required, or if there are concerns about side effects due to target destruction due to effector activity, γ4 subclass can be used by using the γ4 subclass as the H chain C region of the human antibody. Subclasses generally have low effector activity (Bruggemann M et al., Journal of Experimental Medicine, 166 (5), 1351-1361, 1987; Bindon C.I. et al., Journal of Mental 8 Ex 8) ), 127-142, 1988), side effects can be avoided, and blood half-life is expected to be longer than that of mouse antibodies (Stephens S. et al., Immunology, 85 (4), 668-674, 19). 5). Furthermore, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv (Bird RE, et al., Science, 242 (4877) produced from antibodies including humanized antibodies using protein engineering and genetic engineering techniques. ), 423-426, 1988), dsFv (Webber K.O. et al., Molecular Immunology, 32 (4), 249-258, 1995), peptides containing CDRs (Monfardini C et al., Journal of Biological Chemical). , 271 (6), 2966-2971, 1996), and the like. Since these antibody fragments have a smaller molecular weight than a complete antibody molecule, they have excellent transferability to a target tissue and are advantageous (Cancer Research, 52, 3402-3408, 1992).

本発明のＣＥＡに特異的に結合する抗体（例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体およびそれらの抗体断片）に、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体は、ＣＥＡに特異的に反応する抗体および抗体断片のＨ鎖或いはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、該抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには該抗体および抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、治療タンパク質あるいは低分子の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させることにより製造することができる（例えば、抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４を参照）。   A radioisotope, a therapeutic protein, a small molecule drug, or the like is chemically or genetically bound to an antibody that specifically binds to the CEA of the present invention (eg, a humanized antibody, a human antibody, or an antibody fragment thereof). The antibody specifically reacts with CEA and the N- or C-terminal side of the H chain or L chain of the antibody fragment, an appropriate substituent or side chain in the antibody and antibody fragment, and the antibody and It can be produced by chemically or genetically linking a radioisotope, therapeutic protein, or low molecular weight drug to a sugar chain in an antibody fragment (for example, Introduction to antibody engineering, Osamu Kanmitsu, Jinjinshokan) 1994).

２．診断薬および治療薬
本発明はまた、別の態様において、抗ＣＥＡ抗体を含有する癌の診断薬および治療薬を提供する。なお、本願明細書中、用語「癌」と「腫瘍」とは同じ意味を有する用語として使用される。 2. Diagnostic Agents and Therapeutic Agents In another aspect, the present invention also provides cancer diagnostic agents and therapeutic agents containing anti-CEA antibodies. In the present specification, the terms “cancer” and “tumor” are used as terms having the same meaning.

本明細書の実施例において具体的に記載するように、本発明の抗ＣＥＡ抗体を含有する治療薬または診断薬は、ＣＥＡを発現または高発現することによって特徴づけられる任意の疾患（例えば、胃癌など）の診断または治療に適している。   As specifically described in the examples herein, a therapeutic or diagnostic agent containing an anti-CEA antibody of the invention may be any disease characterized by the expression or high expression of CEA (eg, gastric cancer Suitable for diagnosis or treatment).

癌の診断または治療に使用するための本発明の抗ＣＥＡ抗体は、本発明の診断薬または治療薬において、必要に応じて、モニタリング等のための標識物質（例えば、放射性同位元素、蛍光物質など）で標識されていてもよい。   The anti-CEA antibody of the present invention for use in the diagnosis or treatment of cancer is used in the diagnostic or therapeutic agent of the present invention, if necessary, as a labeling substance (for example, a radioisotope, a fluorescent substance, etc.) for monitoring. ).

また、本発明の抗ＣＥＡ抗体は、本発明の診断薬または治療薬において、それ自体が、抗原の活性を減弱させるような中和活性を有する薬剤（ａｇｅｎｔ）であり得るが、必要に応じて、治療効果を奏するための他の薬剤（例えば、放射性同位元素、治療タンパク質、または低分子の薬剤など、あるいは標的への遺伝子導入のためのウイルスベクターもしくは非ウイルスベクター）と化学的または遺伝子工学的に結合され得る。ここで、「化学的な結合」には、イオン結合、水素結合、共有結合、分子間力による結合、疎水性相互作用による結合などが含まれるものとし、「遺伝子工学的な結合」には、例えば、抗体と治療タンパク質とからなる融合タンパク質を遺伝子組換えなどの技術を用いて作製した場合の、抗体と治療タンパク質との間の結合様式などが含まれるものとする。   In addition, the anti-CEA antibody of the present invention may itself be an agent having neutralizing activity that attenuates the activity of the antigen in the diagnostic or therapeutic agent of the present invention. Chemically or genetically engineered with other agents that exert therapeutic effects (eg, radioisotopes, therapeutic proteins, small molecule agents, or viral or non-viral vectors for gene transfer to a target) Can be combined. Here, “chemical bond” includes ionic bond, hydrogen bond, covalent bond, bond by intermolecular force, bond by hydrophobic interaction, etc., and “genetic bond” For example, a binding mode between an antibody and a therapeutic protein when a fusion protein composed of an antibody and a therapeutic protein is produced using a technique such as gene recombination is included.

ｉｎ ｖｉｖｏでの診断に使用するための抗体調製物の調製および使用方法は当該分野でよく知られている。例えば、インジウム−１１１で標識した抗体とキレート剤との結合体（抗体−キレート剤）が、癌胎児性抗原を発現している腫瘍のラジオイムノシンチグラフィーによるイメージングでの使用に関して記述されている（Ｓｕｍｅｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． １９９０ １７：２４７−２５４）。特にこれらの抗体−キレート剤は、再発性の結腸直腸癌を有する疑いのある患者において腫瘍を検出するのに用いられている（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃ． １９９１ ９：６３１−６４０）。磁気共鳴イメージングで用いる標識としての常磁性イオンを有する抗体もまた記載されている（Ｌａｕｆｆｅｒ， Ｒ．Ｂ． Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９１ ２２：３３９−３４２）。   The preparation and use of antibody preparations for use in in vivo diagnosis are well known in the art. For example, a conjugate of an antibody labeled with indium-111 and a chelating agent (antibody-chelating agent) has been described for use in radioimmunoscintigraphic imaging of tumors expressing carcinoembryonic antigen ( Sumerdon et al. Nucl. Med. Biol. 1990 17: 247-254). In particular, these antibody-chelators have been used to detect tumors in patients suspected of having recurrent colorectal cancer (Griffin et al. J. Clin. Onc. 1991 9: 631-640). . Antibodies with paramagnetic ions as labels for use in magnetic resonance imaging have also been described (Lauffer, RB Magnetic Resonance in Medicine 1991 22: 339-342).

ＣＥＡに対する抗体も同様に用いることができる。すなわち、ＣＥＡに特異的に結合する標識された抗体を、例えば、癌を有する疑いのある患者に、その患者の疾患の状態の診断または病期診断等の目的で注射することができる。用いる標識は、用いるイメージングの様式に応じて選択し得る。例えば、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）またはヨウ素−１３１（１３１Ｉ）などの放射性標識は、平面スキャンまたはシングルフォトン断層撮影に用いることができる。フッ素−１８（１８Ｆ）などのポジトロン放出標識をポジトロン断層撮影に用いることができる。ガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）などの常磁性イオンを磁気共鳴イメージングに用いることができる。標識の局在性を検査することにより、癌の播種の判定をすることができる。また、器官または組織内の標識の量により、その器官または組織における癌の存在または欠如を決定することができる。 Antibodies against CEA can be used as well. That is, a labeled antibody that specifically binds to CEA can be injected, for example, into a patient suspected of having cancer for the purpose of diagnosing the disease state or staging of the patient. The label used can be selected depending on the type of imaging used. For example, Indium -111 (111 In), radiolabels such as technetium-99m (99m Tc) or iodine -131 (131 I) can be used for planar scans or single photon tomography. Positron emission labels such as fluorine-18 ( 18 F) can be used for positron tomography. Paramagnetic ions such as gadolinium (III) or manganese (II) can be used for magnetic resonance imaging. By examining the localization of the label, it is possible to determine the dissemination of cancer. Also, the amount of label in an organ or tissue can determine the presence or absence of cancer in that organ or tissue.

したがって、好ましくは、本発明の診断薬または治療薬中の抗ＣＥＡ抗体は、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を担持したウイルスベクター等と化学的にまたは遺伝子工学的に結合されている。   Therefore, preferably, the anti-CEA antibody in the diagnostic or therapeutic agent of the present invention is chemically or genetically engineered with a radioisotope, a therapeutic protein, a small molecule drug, a viral vector carrying a therapeutic gene, or the like. Are combined.

「放射性同位元素」の例としては、フッ素−１８、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、およびヨウ素−１３１などの放射性ハロゲン元素が挙げられる。これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属元素と同様に抗体やペプチドに標識して、放射性診断薬あるいは放射性治療薬として広く利用し得る。例えば、１２５Ｉまたは１３１Ｉでのヨード化は、クロラミンＴ法等の公知の方法により、抗体または抗体断片に結合させることができる。 Examples of “radioisotopes” include radioactive halogen elements such as fluorine-18, iodine-125 ( 125 I), and iodine-131. These radioactive halogen elements can be widely used as radiodiagnostic drugs or radiotherapeutic drugs by labeling antibodies and peptides in the same manner as the above-mentioned radiometal elements. For example, iodination with 125 I or 131 I can be bound to an antibody or antibody fragment by a known method such as the chloramine T method.

さらに、診断用としてはテクネチウム−９９ｍ、インジウム−１１１およびガリウム−６７（６７Ｇａ）など、また治療用としてはイットリウム−９０（９０Ｙ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）またはレニウム−１８８（１８８Ｒｅ）などが使用され得る。放射性同位元素を用いて抗体に標識する場合には、通常、金属キレート剤が用いられる。金属キレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ジアミノジチオ化合物、サイクラム、およびＤＯＴＡなどが知られている。これらのキレート剤は抗体に予め結合しておき、その後放射性金属で標識する場合と、放射性金属キレートを形成後、抗体に結合して標識する方法がある。 Further, as the diagnostic technetium-99m, indium-111 and gallium -67 (67 Ga), etc., also yttrium -90 (90 Y) is for the treatment, rhenium -186 (186 Re) or rhenium -188 (188 Re ) Etc. can be used. When the antibody is labeled with a radioisotope, a metal chelating agent is usually used. Known metal chelating agents include EDTA, DTPA, diaminodithio compounds, cyclam, and DOTA. These chelating agents may be preliminarily bound to the antibody and then labeled with a radioactive metal, or there may be a method in which a radiometal chelate is formed and then bound to the antibody and labeled.

「治療タンパク質」の例としては、免疫を担う細胞を活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン１２等が挙げられる。また、癌細胞を直接殺傷するため、リシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、治療タンパク質との融合抗体については、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに治療タンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを原核生物または真核生物用の発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。   Examples of “therapeutic proteins” are preferably cytokines that activate cells responsible for immunity, such as human interleukin 2, human granulocyte-macrophage-colony stimulating factor, human macrophage colony stimulating factor, human interleukin 12 Etc. Moreover, in order to directly kill cancer cells, toxins such as ricin and diphtheria toxin can be used. For example, for a fusion antibody with a therapeutic protein, a cDNA encoding the fusion protein is constructed by linking the cDNA encoding the therapeutic protein to a cDNA encoding the antibody or antibody fragment, and this DNA is used for prokaryotic or eukaryotic organisms. The fusion antibody can be produced by inserting the expression vector into a prokaryotic organism or a eukaryotic organism and expressing the expression vector.

「低分子の薬剤」は、本明細書中で「放射性同位元素」や「治療タンパク質」等以外の診断または治療用化合物を意味するものとして用いられる。「低分子の薬剤」の例としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロファスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ，ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤（臨床腫瘍学（日本臨床腫瘍研究会編 １９９６年 癌と化学療法社））、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤（炎症と抗炎症療法 昭和５７年 医歯薬出版株式会社）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。   “Small molecule drug” is used herein to mean a diagnostic or therapeutic compound other than “radioisotope”, “therapeutic protein” and the like. Examples of the “small molecule drug” include alkylating agents such as nitrogen mustard and cyclofasfamide, antimetabolites such as 5-fluorouracil and methotrexate, and antibiotics such as daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin and doxorubicin. Substances, plant alkaloids such as vincristine, vinblastine, vindesine, anticancer agents such as hormonal agents such as tamoxifen, dexamethasone (Clinical Oncology (1996 Clinical Oncology Society, Cancer and Chemotherapy)), or hydrocortisone, prednisone, etc. Steroids, non-steroids such as aspirin and indomethacin, immunomodulators such as gold thiomalate and penicillamine, immunosuppressants such as cyclophosphamide and azathioprine, chlor maleate And anti-inflammatory agents such as phenylamine and clemacytin (inflammation and anti-inflammatory therapy 1982, Yakuhin Shuppan Co., Ltd.). For example, as a method of binding daunomycin and antibody, a method of binding between daunomycin and the amino group of the antibody via glutaraldehyde, a method of binding the amino group of daunomycin and the carboxyl group of the antibody via water-soluble carbodiimide, etc. Is given.

「ウイルスベクター」の例としては、本発明の抗ＣＥＡ抗体に結合し得るように改変されたウイルスベクター（例えば、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルス）が使用し得る。このようなウイルスベクターには、細胞増殖関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、免疫制御遺伝子等の、標的部位（例えば、癌）において、例えば、癌細胞のアポトーシスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子（治療遺伝子）が組み込まれる。抗ＣＥＡ抗体に結合するウイルスベクターは、抗ＣＥＡ抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与された場合、抗ＣＥＡ抗体が認識する抗原（すなわち、ＣＥＡ）が存在する部位に指向されることができる。   As an example of the “viral vector”, a viral vector modified so as to be able to bind to the anti-CEA antibody of the present invention (for example, Z33 fiber mutant adenovirus) can be used. Such viral vectors include genes (therapeutic effects) such as cell proliferation-related genes, apoptosis-related genes, immunoregulatory genes and the like that induce therapeutic effects such as inducing apoptosis of cancer cells at target sites (for example, cancer). Gene). A viral vector that binds to an anti-CEA antibody can be directed to a site where an antigen recognized by the anti-CEA antibody (ie, CEA) is present when administered to a patient in need of gene therapy along with the anti-CEA antibody. .

３．組換えアデノウイルス発現システムの作製方法
本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルスベクターは、当該分野で周知の分子生物学的手法によって作製することができる。例えば、一般的な分子生物学的手法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９； Ａｕｓｂｅｌ． Ｆ ｅｔ ａｌ．：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７；田村隆明編、改訂第２版 遺伝子工学実験ノート 上・下 洋土社 ２００１などを参照することができる。また、組換えアデノウイルスの作製のためには、ウイルスゲノムの両端に共有結合した末端タンパク質を保持したままのゲノム−末端タンパク質複合体（以下ＤＮＡ−ＴＰＣと略す）を用いる方法、例えば、Ｙｏｓｈｉｄａらの方法（Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：２５０３−１５１５ （１９９８））を利用することができる。これらの手法はいずれも当業者に良く知られたものである。典型的な作製方法においては、まず、ｐＡｘＣｗ、ｐＡｘＣＡｗｔ等のコスミドカセットに目的とする遺伝子を組み込んだコスミドを作製する。一方、ウイルスからＤＮＡ−ＴＰＣを調製し、適当な制限酵素で切断しておく。次に、前述のコスミドおよび制限酵素処理したＤＮＡ−ＴＰＣを適切な宿主細胞、例えば２９３細胞にコトランスフェクションする。その後適当な条件で一定期間培養し、培養液中にウイルス粒子として放出された組換えアデノウイルス粒子を回収することができる。 3. Production Method of Recombinant Adenovirus Expression System The recombinant adenovirus vector typically used in the present invention can be produced by molecular biological techniques well known in the art. For example, for general molecular biology techniques, see Sambrook, J. et al. et al. : Molecular Cloning. A laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausbel. F et al. : Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1987; edited by Takaaki Tamura, revised 2nd edition, Genetic Engineering Experiment Notes, Kamiyo Shido Corporation 2001, and the like. In order to produce a recombinant adenovirus, a method using a genome-terminal protein complex (hereinafter abbreviated as DNA-TPC) that retains a terminal protein covalently bound to both ends of the viral genome, for example, Yoshida et al. (Yoshida et al., Hum. Gene Ther. 9: 2503-1515 (1998)). All of these techniques are well known to those skilled in the art. In a typical production method, first, a cosmid in which a target gene is incorporated into a cosmid cassette such as pAxCw or pAxCAwt is produced. On the other hand, DNA-TPC is prepared from virus and cleaved with an appropriate restriction enzyme. Next, the above-described cosmid and restriction enzyme-treated DNA-TPC are co-transfected into an appropriate host cell, for example, 293 cells. Thereafter, the cells are cultured for a certain period of time under appropriate conditions, and the recombinant adenovirus particles released as virus particles in the culture solution can be recovered.

本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルス粒子は、前述のように組換えアデノウイルス発現用核酸分子を適切な培養細胞にトランスフェクションし、その細胞を更に培養し、培養上清を回収することによって多量に調製することができる。必要であれば、回収したアデノウイルスを更に適切な宿主細胞で必要な回数だけ継代することによって更に大量のアデノウイルベクター粒子を調製することができる。アデノウイルスの増殖および回収のために適した細胞、トランスフェクションの条件、トランスフェクトした細胞の培養条件および培地等は当業者に良く知られたものである。例えば、通常よく使用されるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ領域に欠損のあるアデノウイルスを増殖させる場合には、恒常的にＥ１Ａ、Ｅ１Ｂを発現している２９３細胞等を使用すればよい。更に、必要に応じて、塩化セシウムの濃度勾配遠心法を用いて濃縮精製することもできる。濃縮することにより、１０９〜１０１１粒子／ｍｌ程度の高力価のウイルス液を得ることができる。   As described above, the recombinant adenovirus particles typically used in the present invention are transfected with a nucleic acid molecule for expressing a recombinant adenovirus into an appropriate cultured cell, the cell is further cultured, and the culture supernatant is recovered. Can be prepared in large quantities. If necessary, larger quantities of adenovirus vector particles can be prepared by passage of the recovered adenovirus as many times as necessary in a suitable host cell. Suitable cells for the growth and recovery of adenovirus, transfection conditions, culture conditions and media for the transfected cells, etc. are well known to those skilled in the art. For example, when an adenovirus deficient in the commonly used E1A and E1B regions is propagated, 293 cells that constantly express E1A and E1B may be used. Furthermore, if necessary, it can be concentrated and purified using a concentration gradient centrifugation method of cesium chloride. By concentrating, a high titer virus solution of about 109 to 1011 particles / ml can be obtained.

本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルス発現用核酸分子は、外来遺伝子を組み込むことができ、組み込まれた外来遺伝子を効率的に標的細胞に導入することができる。本発明において使用される組換えアデノウイルス発現用核酸分子に組み込む外来遺伝子としては、直接または間接的に標的細胞に対して細胞毒性を示すような分子をコードする遺伝子、細胞増殖因子、細胞増殖抑制因子、アポトーシス制御遺伝子、癌抑制遺伝子、細胞周期調節遺伝子、免疫調節遺伝子等が挙げられる。更に、非毒性のプロドラッグと組み合わせて使用するための自殺遺伝子を組み込むことも可能である。そのような組み合わせとしては、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）とガンシシクロビルの組み合わせ（ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ）、シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシンの組み合わせ（ＣＤ／５ＦＣ）、ウラシルホスホリラーゼと５−フルオロウラシルの組み合わせ（ＵＰ／５ＦＵ）、ＨＳＶｔｋとＵＰを組み合わせた系（ＵＰＴＫ／５ＦＵ＋ＧＣＶ）が挙げられる。このような外来遺伝子は、一般にはアデノウイルスゲノムのＥ１領域および／またはＥ３領域と置換され、またはこの領域に挿入される。   The recombinant adenovirus expression nucleic acid molecule typically used in the present invention can incorporate a foreign gene, and can efficiently introduce the incorporated foreign gene into a target cell. Examples of the foreign gene incorporated into the nucleic acid molecule for expression of the recombinant adenovirus used in the present invention include a gene encoding a molecule that exhibits cytotoxicity directly or indirectly to the target cell, cell growth factor, and cell growth suppression. Factors, apoptosis regulatory genes, tumor suppressor genes, cell cycle regulatory genes, immune regulatory genes and the like. Furthermore, it is possible to incorporate a suicide gene for use in combination with a non-toxic prodrug. Such combinations include herpes simplex virus thymidine kinase (HSVtk) and gancicyclovir (HSVtk / GCV), cytosine deaminase and 5-fluorocytosine (CD / 5FC), uracil phosphorylase and 5-fluorouracil ( UP / 5FU), and a combination of HSVtk and UP (UPTK / 5FU + GCV). Such foreign genes are generally replaced with or inserted into the E1 region and / or E3 region of the adenovirus genome.

ファイバー変異型組み換えアデノウイルスの作製方法については、報告されている例を参照し得る（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９８； Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００２； Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ２００３など）。   For methods of producing fiber mutant recombinant adenoviruses, reference may be made to reported examples (Yoshida et al., Hum. Gene Ther. 1998; Nakamura et al., Hum. Gene Ther. 2002; Nakamura et al. , J. Virol. 2003, etc.).

本発明において好適に用いられるベクターの非限定的な例としては、抗体のＦｃドメインに結合するように改変されたＺ３３ファイバー変異型アデノウイルス、アデノウイルスに抗体を任意の方法で結合（共有結合、ビオチン−アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させた修飾型のアデノウイルスなどが挙げられる。Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスは、図３に模式的にその概要を示すように、抗体のＦｃドメインに結合するプロテインＡのＺ３３モチーフ（ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号１４））をノブ（Ｋｎｏｂ）のＨＩループ部位（ｎｇｔｑｅｔｇｌｉｋ−−−−−ｉｄａｓｄｔｔｐｓａ）に含むＦＺ３３ファイバー変異型Ａｄ５ウイルスをベースとして、ｌａｃＺ、ＥＧＦＰなどのレポーター遺伝子が組み込まれたアデノウイルスである。なお、これは非限定的な例示であり、他のウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、シンドビスウイル、麻疹ウイルス、センダイウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、など各種ウイルスの外被（エンベロープ）やキャプシドに修飾を施した各種変異型ウイルス、または前記各種ウイルスに抗体を任意の方法で結合（例えば、共有結合、ビオチン−アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させた修飾型のウイルスもまた、本発明の抗ＣＥＡ抗体とともに使用し得ることを、当業者は理解し得る。あるいは、ウイルスベクターに限らず、リポソームベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドＤＮＡネイキッド（ｎａｋｅｄ）ベクターなどの非ウイルスベクターもまた、抗体を任意の方法で結合（ＦＺ３３などの抗体結合分子を結合させる方法、化学的共有結合、ビオチン−アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレングリコールでベクターを包む、など）させた修飾型の非ウイルスベクターとすることによって、本発明の抗ＣＥＡ抗体とともに使用し得ることを、当業者は理解し得る。   Non-limiting examples of vectors suitably used in the present invention include Z33 fiber mutant adenovirus modified so as to bind to the Fc domain of the antibody, and the antibody is bound to adenovirus by any method (covalent bond, A modified adenovirus obtained by crosslinking with biotin-avidin or enveloping the virus with polyethylene glycol chemically bound to an antibody). As schematically shown in FIG. 3, the Z33 fiber mutant adenovirus has a protein A Z33 motif (FNMQQQRRFYEALHDPNNLEEQRNAKIKSIRDD (SEQ ID NO: 14)) that binds to the Fc domain of the antibody and a HI loop site of the knob (Knob). This is an adenovirus in which a reporter gene such as lacZ or EGFP is incorporated on the basis of the FZ33 fiber mutant Ad5 virus contained in (nggtqetglik ----- idasdttpsa). This is a non-limiting example, and other viruses (for example, retrovirus, lentivirus, herpes simplex virus, Sindbis virus, measles virus, Sendai virus, reovirus, poxvirus, poliovirus, coxsackie virus, adeno Various mutant viruses with modified envelopes and capsids of various viruses such as virus-associated viruses, or binding of antibodies to the various viruses by any method (for example, covalent bonding, cross-linking with biotin-avidin, antibodies A person skilled in the art can understand that modified viruses obtained by wrapping a virus in polyethylene glycol chemically bound to each other can also be used with the anti-CEA antibody of the present invention, or not limited to viral vectors. , Liposome vector, Sendai Non-viral vectors such as a Rus envelope vector and a plasmid DNA naked vector can also be combined with an antibody by any method (method of binding an antibody binding molecule such as FZ33, chemical covalent bond, cross-linking with biotin-avidin, antibody Those skilled in the art can understand that the present invention can be used with the anti-CEA antibody of the present invention by making it a modified non-viral vector in which the vector is encapsulated in polyethylene glycol conjugated chemically, etc.

本発明の抗ＣＥＡ抗体に結合し得るように改変されたウイルスベクターを使用する利点として、以下のような点が挙げられる。通常、ウイルスベクターを使用する場合、そのウイルスが本来認識する細胞表面のレセプター（例えば、アデノウイルスの場合のＣＡＲ、またはシンドビスウイルスの場合の高親和性ラミニンレセプター（ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌａｍｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＬＡＭＲ）、ポリオウイルスの場合のＣＤ１５５、コクサッキーウイルスＡ２１の場合のＩＣＡＭ／ＤＡＦ、麻疹ウイルスの場合のＳＬＡＭ／ＣＤ４６など）を細胞表面に発現している細胞に対して標的化される。したがって、使用するウイルスに特異的な細胞表面レセプターを発現していないか、発現の程度が低い細胞に対しては、通常、ウイルスベクターを用いた遺伝子の効果的な標的指向化導入は困難である。しかしながら、本発明の抗ＣＥＡ抗体と結合し得るかまたは結合するように改変されたウイルスベクターを用いれば、そのウイルスの本来の細胞表面レセプターを発現していない細胞であっても、その細胞がＣＥＡを発現する細胞であれば、その細胞に対してウイルスベクターを用いた治療遺伝子の標的指向化導入および発現が容易に可能となる。図４に、ファイバーノブに結合させた抗ＣＥＡ抗体を結合させることによって、アデノウイルスをＣＥＡ発現細胞へ指向化し得ることを模式的に示す。   Advantages of using a viral vector modified to bind to the anti-CEA antibody of the present invention include the following points. Usually, when a viral vector is used, a cell surface receptor that the virus originally recognizes (for example, CAR for adenovirus, or high-affinity laminin receptor (LAMR) for Sindbis virus). CD155 for poliovirus, ICAM / DAF for coxsackievirus A21, SLAM / CD46 for measles virus, and the like). Therefore, for cells that do not express cell surface receptors specific for the virus to be used or have a low level of expression, it is usually difficult to effectively target and introduce genes using viral vectors. . However, if a viral vector capable of binding to or modified to bind to the anti-CEA antibody of the present invention is used, even if the cell does not express the original cell surface receptor of the virus, the cell is CEA. Cell can be easily introduced into and targeted to a therapeutic gene using a viral vector. FIG. 4 schematically shows that adenovirus can be directed to CEA expressing cells by binding an anti-CEA antibody bound to a fiber knob.

なお、本発明において使用される組換えアデノウイルスの作製については、さらに下記文献を参照することができる。   For the production of the recombinant adenovirus used in the present invention, the following documents can be further referred to.

Yoshida Y., Sadata A., Zhang W., Shinoura N. and Hamada H. “Generation of fiber-mutant recombinant adenoviruses for gene therapy of malignant glioma.”Human Gene Therapy, 9(17): 2503-2515, 1998.   Yoshida Y., Sadata A., Zhang W., Shinoura N. and Hamada H. “Generation of fiber-mutant recombinant adenoviruses for gene therapy of malignant glioma.” Human Gene Therapy, 9 (17): 2503-2515, 1998.

Nakamura T., Sato K. and Hamada H. “Effective Gene Transfer to Human Melanomas via Integrin-Targeted Adenoviral Vectors.”Hum. Gene Ther., 13(5): 613-626, 2002.   Nakamura T., Sato K. and Hamada H. “Effective Gene Transfer to Human Melanomas via Integrin-Targeted Adenoviral Vectors.” Hum. Gene Ther., 13 (5): 613-626, 2002.

Nakamura T., Sato K. and Hamada H. “Reduction of natural adenovirus tropism to the liver by both ablation of fiber-Coxsackievirus and adenovirus receptor interaction and use of replaceable short fiber.”J. Virol., 77(4): 2512-2521, 2003.   Nakamura T., Sato K. and Hamada H. “Reduction of natural adenovirus tropism to the liver by both ablation of fiber-Coxsackievirus and adenovirus receptor interaction and use of replaceable short fiber.” J. Virol., 77 (4): 2512 -2521, 2003.

Uchida H, Tanaka T, Sasaki K, Kato K, Dehari H, Ito Y, Kobune M, Miyagishi M, Taira K, Tahara H, Hamada H. “Adenovirus-Mediated Transfer of siRNA against Survivin Induced Apoptosis and Attenuated Tumor Cell Growth in Vitro and in Vivo.” Mol Ther. 10(1):162-71, 2004.   Uchida H, Tanaka T, Sasaki K, Kato K, Dehari H, Ito Y, Kobune M, Miyagishi M, Taira K, Tahara H, Hamada H. “Adenovirus-Mediated Transfer of siRNA against Survivin Induced Apoptosis and Attenuated Tumor Cell Growth in Vitro and in Vivo. ”Mol Ther. 10 (1): 162-71, 2004.

Volpers C et al. “Antibody-mediated targeting of an adenovirus vector modified to contain a synthetic immunoglobulin G-binding domain in the capsid.” J. Virol. 77: 2093-2104, 2003.   Volpers C et al. “Antibody-mediated targeting of an adenovirus vector modified to contain a synthetic immunoglobulin G-binding domain in the capsid.” J. Virol. 77: 2093-2104, 2003.

Braisted AC and Wells JA “Minimizing a binding domain from protein A.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5688-5692, 1996.   Braisted AC and Wells JA “Minimizing a binding domain from protein A.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5688-5692, 1996.

４．薬剤の標的指向化
上記２．の説明からも明らかなように、本発明の抗ＣＥＡ抗体を用いて、疾患の診断および／または治療に有用な薬剤を標的となる疾患の部位へ送達することができる。したがって、本発明はまた、抗ＣＥＡ抗体を用いて、疾患の診断および／または治療に有用な薬剤を標的となる疾患の部位へ送達する方法を提供する。 4). Targeting of drugs 2. As will be apparent from the above description, the anti-CEA antibody of the present invention can be used to deliver a drug useful for diagnosis and / or treatment of a disease to a target disease site. Accordingly, the present invention also provides a method of delivering an agent useful for diagnosis and / or treatment of a disease to a target disease site using an anti-CEA antibody.

「薬剤（ａｇｅｎｔ）」の例としては、既に説明した放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子などが挙げられる。   Examples of “agent” include the radioisotopes, therapeutic proteins, small molecule drugs, therapeutic genes, etc. already described.

典型的な例として、本発明の抗ＣＥＡ抗体は、抗ＣＥＡ抗体が結合し得る、治療遺伝子を組み込んだファイバー変異型アデノウイルスベクターに結合される。これにより、アデノウイルス本来の受容体である（ＣＡＲ）に依存する感染のみの場合と比較して、標的細胞への感染効率を高めることができ、ファイバー変異型アデノウイルスを用いた標的部位への治療遺伝子の導入を効果的に行うことができる。   As a typical example, an anti-CEA antibody of the invention is conjugated to a fiber mutant adenoviral vector incorporating a therapeutic gene to which an anti-CEA antibody can bind. As a result, the efficiency of infection to the target cells can be increased compared to the case of only the infection dependent on the original adenovirus receptor (CAR), and the target site using the fiber mutant adenovirus can be increased. It is possible to effectively introduce a therapeutic gene.

本発明において、「標的部位」は、ＣＥＡを発現または高発現している細胞、組織、臓器等であり、特に、ＣＥＡを高発現している腫瘍細胞である。そのような細胞の非限定的な例として、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌細胞等が本発明の目的にとって好適なものとして挙げられ得る。また、本発明において、「ＣＥＡ産生癌」とは、ＣＥＡを発現または高発現する癌（ＣＥＡ陽性の癌）のことをいうものとする。また、本明細書中、「腫瘍特異的ＣＥＡ抗原」とは、腫瘍細胞において発現しているＣＥＡをいうものとする。   In the present invention, the “target site” is a cell, tissue, organ or the like that expresses or highly expresses CEA, and in particular, a tumor cell that highly expresses CEA. As non-limiting examples of such cells, gastric cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer cell and the like are suitable for the purpose of the present invention. Can be mentioned as In the present invention, “CEA-producing cancer” refers to a cancer that expresses or highly expresses CEA (CEA-positive cancer). In the present specification, “tumor-specific CEA antigen” refers to CEA expressed in tumor cells.

５．本発明の抗ＣＥＡ抗体を用いるエフェクター細胞を介在する疾患の治療およびオプソニン化
本発明はまた、１つの態様において、本発明の治療薬に有効成分として含まれる抗ＣＥＡ抗体が、被験者に投与された場合に、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現細胞を溶解または成長を阻害するように作用する、ＣＥＡの高発現によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）の治療薬およびそのような治療薬を被験者に投与することによる該疾患の治療方法を提供する。 5. Treatment and Opsonization of Effector Cell-Mediated Diseases Using Anti-CEA Antibodies of the Present Invention In one aspect, the present invention also provides an anti-CEA antibody contained as an active ingredient in a therapeutic agent of the present invention. In some cases, therapeutics for diseases characterized by high expression of CEA (eg, cancer) and such treatments that act to lyse or inhibit growth of CEA-expressing cells via immunological effector cells Provided is a method for treating the disease by administering a drug to a subject.

用語「免疫学的エフェクター細胞」は、当該分野で通常用いられる意味で本明細書中でも用いられるが、特に、免疫応答の認識及び活性化段階ではなく、免疫応答のエフェクター段階に関与する免疫細胞を言うものとする。免疫学的エフェクター細胞の非限定的な例には、Ｔ細胞（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ））、ＮＫ細胞、ＮＫ様Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、多核白血球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞）などが含まれる。例えば、本発明者の抗ＣＥＡ抗体は、免疫学的エフェクター細胞表面上のＦｃ受容体に結合することができる。エフェクター細胞は、特異的なＦｃ受容体を発現して、抗体の結合によって特異的な免疫機能を奏することができ、例えば、好中球は、抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。このように、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現細胞を貪食するか、または溶解させることができる。   The term “immunological effector cell” is also used herein in the sense that is commonly used in the art, but specifically refers to immune cells involved in the effector phase of the immune response, rather than the recognition and activation phase of the immune response. Say it. Non-limiting examples of immunological effector cells include T cells (eg, cytolytic T cells (CTL), helper T cells (Th)), NK cells, NK-like T cells, B cells, monocytes, Macrophages, dendritic cells, Kupffer cells, Langerhans cells, polynuclear leukocytes (for example, neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells) and the like are included. For example, our anti-CEA antibodies can bind to Fc receptors on the surface of immunological effector cells. Effector cells can express specific Fc receptors and exert specific immune functions through antibody binding, for example, neutrophils induce antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) can do. Thus, CEA expressing cells can be phagocytosed or lysed via immunological effector cells.

本発明者はまた、さらに別の態様において、本発明の治療薬に有効成分として含まれる抗ＣＥＡ抗体が、被験者に投与された場合に、ＣＥＡ発現細胞をオプソニン化するように作用する、ＣＥＡの高発現によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）の治療薬、およびそのような治療薬を被験者に投与することによる該疾患の治療方法を提供する。   In yet another aspect, the inventor of the present invention also acts to opsonize CEA-expressing cells when an anti-CEA antibody contained as an active ingredient in the therapeutic agent of the present invention is administered to a subject. Provided are therapeutic agents for diseases characterized by high expression (eg, cancer), and methods for treating such diseases by administering such therapeutic agents to a subject.

例えば、本発明の抗ＣＥＡ抗体は、ＣＥＡに対する少なくとも１つの第１の結合特異性と、第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性とを含む二重特異的または多重特異的分子であり得る。例えば、上記第２の標的エピトープは、例えば、ヒトＦｃγＲＩ又はヒトＦｃα受容体などのＦｃ受容体であり得る。従って、本発明には、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ又はＦｃεＲを発現しているエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多核白血球など）と、ＣＥＡを発現している標的細胞との両方に結合し得る二重特異的または多重特異的分子が含まれる。また上記第２の標的エピトープは抗ＣＥＡ抗体の補体結合部でもあり得る。抗ＣＥＡ抗体は補体を介して補体受容体を発現しているエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多核白血球など）と、ＣＥＡを発現している標的細胞との両方に結合し得る二重特異的または多重特異的分子が含まれる。これらの二重特異的または多重特異的分子は、ＣＥＡ発現細胞をエフェクター細胞に狙わせ、ＣＥＡ発現細胞のファゴサイトーシス、ＡＤＣＣ、サイトカイン放出、またはスーパーオキシドアニオン産生などのＦｃ受容体媒介エフェクター細胞活性を惹起することができる。   For example, an anti-CEA antibody of the invention can be a bispecific or multispecific molecule comprising at least a first binding specificity for CEA and a second binding specificity for a second target epitope. . For example, the second target epitope can be an Fc receptor such as, for example, a human FcγRI or a human Fcα receptor. Accordingly, the present invention includes dual specificity that can bind to both effector cells expressing FcγR, FcαR or FcεR (such as monocytes, macrophages or polynuclear leukocytes) and target cells expressing CEA. Or multispecific molecules are included. The second target epitope may also be a complement binding part of an anti-CEA antibody. An anti-CEA antibody is capable of binding to both an effector cell (eg monocyte, macrophage or polynuclear leukocyte) expressing a complement receptor via complement and a target cell expressing CEA. Specific or multispecific molecules are included. These bispecific or multispecific molecules target CEA-expressing cells to effector cells, and Fc receptor-mediated effector cell activities such as phagocytosis, ADCC, cytokine release, or superoxide anion production of CEA-expressing cells Can be evoked.

６．ＣＥＡを診断マーカーとして検出および／または定量する方法
本発明は、１つの態様において、被験者由来の生体試料中のＣＥＡタンパク質もしくはその断片、またはそれらをコードする核酸を診断マーカーとして検出および／または定量する工程を包含する、癌の診断方法を提供する。 6). Method for detecting and / or quantifying CEA as a diagnostic marker In one aspect, the present invention detects and / or quantifies CEA protein or a fragment thereof in a biological sample derived from a subject, or a nucleic acid encoding them as a diagnostic marker. A method for diagnosing cancer comprising the steps is provided.

本明細書中、「被験者」とは、ＣＥＡを高発現することによって特徴づけられる疾患、代表的には、癌を罹患しているか、そのような疾患を罹患していると疑われるか、またはそのような疾患を罹患する危険性のある、ヒトの被験者を意味するものとする。本発明の目的に従う代表的な「癌」の例としては、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。   As used herein, a “subject” is a disease characterized by high expression of CEA, typically cancer or suspected of suffering from such a disease, or It shall mean a human subject at risk of suffering from such a disease. Exemplary “cancers” according to the purpose of the present invention include gastric cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, and prostate cancer. However, it is not limited to these.

本明細書中、「生体試料」とは、検査のために採取された被験者由来の細胞、組織、臓器、体液などを意味する。体液には、血液、リンパ液、***、唾液、汗等が含まれ、血液には、全血の他、血清、血漿などの血液製剤も含まれるものとする。より具体的には、生体試料は、癌細胞（または癌組織）であり得、好ましくは、ＣＥＡ陽性癌細胞である。   In the present specification, the “biological sample” means cells, tissues, organs, body fluids and the like derived from a subject collected for examination. The body fluid includes blood, lymph, semen, saliva, sweat, and the like, and blood includes blood products such as serum and plasma in addition to whole blood. More specifically, the biological sample can be a cancer cell (or cancer tissue), preferably a CEA positive cancer cell.

本発明はまた、１つの態様において、被験者由来の生体試料中のＣＥＡを、抗ＣＥＡ抗体を用いて免疫学的に検出および／または定量する方法を提供する。   The present invention also provides, in one aspect, a method for immunologically detecting and / or quantifying CEA in a biological sample derived from a subject using an anti-CEA antibody.

好ましい態様に係る本発明の方法は、（１）生体試料と抗ＣＥＡ抗体とを接触させる工程、および（２）該生体試料中のＣＥＡと該抗ＣＥＡ抗体との結合を検出および／または定量する工程を包含する。   The method of the present invention according to a preferred embodiment comprises (1) a step of contacting a biological sample with an anti-CEA antibody, and (2) detecting and / or quantifying the binding between CEA and the anti-CEA antibody in the biological sample. Process.

このような方法は、ＣＥＡを例えば、正常細胞と比較して高発現することによって特徴づけられる疾患、代表的には、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌等を含む癌の診断のために使用することができる。通常、ＣＥＡと抗ＣＥＡ抗体との結合体のレベル（または量）に基づいて、生体試料中のＣＥＡのレベル（または量）が評価される。生体試料中のＣＥＡのレベルと正常なヒトのコントロールで測定したレベルとを比較し、その変化（または差違）に基づいて、癌の存在が診断される。通常、正常ヒトコントロールと比較して高いＣＥＡレベルは、癌の存在を示す。この場合、通常少なくとも２倍、好ましくは、５倍程度高いＣＥＡレベルが、被験者が癌を有することを示す陽性結果である。あるいは、生体試料中のＣＥＡの存在そのものが、被験者における癌の存在を示し得る。   Such methods include diseases characterized by high expression of CEA, for example, compared with normal cells, typically gastric cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, It can be used for diagnosis of cancer including breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer and the like. Usually, the level (or amount) of CEA in a biological sample is assessed based on the level (or amount) of a conjugate of CEA and anti-CEA antibody. The level of CEA in the biological sample is compared with the level measured in normal human controls, and the presence of cancer is diagnosed based on the change (or difference). Usually, a high CEA level compared to a normal human control indicates the presence of cancer. In this case, a CEA level that is usually at least 2 times, preferably about 5 times higher, is a positive result indicating that the subject has cancer. Alternatively, the presence of CEA in the biological sample itself can indicate the presence of cancer in the subject.

ヒト由来の生体試料において、ＣＥＡのようなタンパク質の発現レベルを決定するのに用いることができるアッセイ技術は、当業者によく知られている。このようなアッセイ方法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡアッセイ）、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、結合タンパク質競合アッセイ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、およびプロテオミクスアプローチ（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ）を含む。これらの中で、ＥＬＩＳＡが、生物学的液体における遺伝子の発現タンパク質の診断に好まれることが多い。   Assay techniques that can be used to determine expression levels of a protein, such as CEA, in a biological sample derived from a human are well-known to those of skill in the art. Such assay methods include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA assay), Western blot analysis, radioimmunoassay, binding protein competition assay, reverse transcriptase PCR (RT-PCR) assay, immunohistochemical assay, in situ hybridization. Includes assays, and proteomics approaches. Of these, ELISA is often preferred for diagnosis of gene expressed proteins in biological fluids.

もし商業的に容易に入手できない場合、ＥＬＩＳＡ分析は、最初に、ＣＥＡに特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体の調製を含む。さらに、一般的に、ＣＥＡに特異的に結合するレポーター抗体が調製される。レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光試薬または例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼなどの酵素試薬などの検出可能な試薬を付着している。   If not readily available commercially, ELISA analysis initially involves the preparation of an antibody that binds specifically to CEA, preferably a monoclonal antibody. In addition, a reporter antibody is generally prepared that specifically binds to CEA. The reporter antibody is attached to a detectable reagent such as a radioactive reagent, a fluorescent reagent or an enzyme reagent such as horseradish peroxidase enzyme or alkaline phosphatase.

ＥＬＩＳＡを行う場合、ＣＥＡに特異的に結合する抗体は、例えば、ポリスチレンディッシュなどの、抗体を結合する固体支持体上でインキュベートされる。次に、ディッシュ上の任意の遊離タンパク質結合部位（ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）は、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質とインキュベートすることにより被覆される。次に、分析される試料は、ＣＥＡがポリスチレンディッシュに付着した特異抗体に結合する時間中、ディッシュ内でインキュベートされる。非結合試料はバッファーで洗い流される。ＣＥＡに対して特異的に指向し、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出可能な試薬を連結したレポーター抗体がディッシュ内に設置され、該レポーター抗体がＣＥＡに結合した任意のモノクローナル抗体に結合する。次に非結合レポーター抗体が洗い流される。比色基質を含むペルオキシダーゼ活性のための試薬が、次にディッシュに加えられる。抗ＣＥＡ抗体に連結した、固定化したペルオキシダーゼが着色反応産物を産生する。所定の時間内に発生した色素の量は、試料中のＣＥＡタンパク質の量に比例している。量的な結果は、通常標準曲線を参照して得られる。   When performing an ELISA, an antibody that specifically binds CEA is incubated on a solid support that binds the antibody, such as, for example, a polystyrene dish. Next, any free protein binding sites on the dish are coated by incubating with a non-specific protein such as bovine serum albumin. The sample to be analyzed is then incubated in the dish for the time that CEA binds to the specific antibody attached to the polystyrene dish. Unbound sample is washed away with buffer. A reporter antibody directed specifically to CEA and linked to a detectable reagent such as horseradish peroxidase is placed in the dish and the reporter antibody binds to any monoclonal antibody bound to CEA. Unbound reporter antibody is then washed away. Reagents for peroxidase activity including a colorimetric substrate are then added to the dish. Immobilized peroxidase linked to an anti-CEA antibody produces a colored reaction product. The amount of dye generated within a given time is proportional to the amount of CEA protein in the sample. Quantitative results are usually obtained with reference to a standard curve.

競合アッセイもまた用いることができ、そこでは、ＣＥＡに特異的に結合する抗体が固体支持体に付着しており、標識したＣＥＡおよび患者またはヒト対照に由来する試料が固体支持体上を通過する。固体支持体に付着した検出標識量を試料中のＣＥＡの量に相関させることができる。   A competitive assay can also be used, in which an antibody that specifically binds CEA is attached to a solid support, and labeled CEA and a sample from a patient or human control passes over the solid support. . The amount of detection label attached to the solid support can be correlated to the amount of CEA in the sample.

上記に例示した個々の測定法以外にも、例えば、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、またはプロテインＡ免疫検定法などのいずれかの免疫学的な測定方法を本発明において用いることができる。   In addition to the individual measurement methods exemplified above, for example, sandwich immunoassay, fluorescence immunoassay (FIA), time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA), enzyme immunoassay (EIA), luminescence immunoassay ( LIA), electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), latex agglutination, immunoprecipitation assay, sedimentation reaction, gel diffusion sedimentation reaction, immunodiffusion assay, agglutinin assay, complement binding assay, immunization Any immunological assay such as a radiometric assay, a fluorescent immunoassay, or a protein A immunoassay can be used in the present invention.

ＣＥＡを診断マーカーとして使用する意味において、ＣＥＡの核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いた核酸法（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｏｄ）もまた、肺癌を含む癌のマーカーとしてのＣＥＡのｍＲＮＡを検出するのに用いることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列をもとにした増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）などのその他の核酸法を、様々な悪性腫瘍を診断およびモニタリングするための悪性細胞の検出に用いることができる。例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、特定のｍＲＮＡ集団の存在を、何千ものその他のｍＲＮＡ種の複雑な混合物の中で検出するために用いることができる強力な技術である。ＲＴ−ＰＣＲにおいては、１種類のｍＲＮＡが、酵素である逆転写酵素を用いて最初に相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写され、次にそのｃＤＮＡが標準的なＰＣＲ反応と同様に増幅される。このように、ＲＴ−ＰＣＲは、増幅により、単一種のｍＲＮＡの存在を明らかにすることができる。したがって、このｍＲＮＡがそれを産生する細胞に高度に特異的である場合、ＲＴ−ＰＣＲは、特定の種類の細胞の存在を同定するのに用いることができる。また、リアルタイムＰＣＲ法も、ＣＥＡをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を定量し、被験者と健常者との比較において、ＣＥＡをマーカーとして被験者の癌の診断を行うために使用することができる。   In the sense of using CEA as a diagnostic marker, the nucleic acid method using all or part of the CEA nucleic acid sequence as a hybridization probe also detects CEA mRNA as a marker for cancer, including lung cancer. Can be used. Other nucleic acid methods such as polymerase chain reaction (PCR) and ligase chain reaction (LCR) and nucleic acid sequence-based amplification (NASABA) to diagnose and monitor various malignancies Can be used to detect malignant cells. For example, reverse transcriptase PCR (RT-PCR) is a powerful technique that can be used to detect the presence of a particular mRNA population in a complex mixture of thousands of other mRNA species. In RT-PCR, one type of mRNA is first reverse transcribed into complementary DNA (cDNA) using the enzyme reverse transcriptase, and then the cDNA is amplified as in a standard PCR reaction. Thus, RT-PCR can reveal the presence of a single species of mRNA by amplification. Thus, if this mRNA is highly specific for the cell that produces it, RT-PCR can be used to identify the presence of a particular type of cell. The real-time PCR method can also be used for quantifying CEA-encoding nucleic acid (for example, mRNA) and diagnosing cancer in a subject using CEA as a marker in comparison between the subject and a healthy subject.


また、ＣＥＡをマーカーとして、被験者の癌の進展の経過あるいは治療経過をモニタリングすることもできる。そのような癌としては、ＣＥＡ陽性の癌であれば特に種類を問わず、ＣＥＡ陽性の胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌などの診断に好適に使用することができる。例えば、抗体とマグネチックビーズとを用いた細胞の分別と濃縮（エンリッチメント）、ならびにＲＴ−ＰＣＲ法による高感度のｍＲＮＡの検出法を組み合わせることによって、例えば、５ｍｌの被験者の血液中に存在する数個の腫瘍細胞を検出することが可能である。血液中に存在する腫瘍細胞を検出すること、そのＣＥＡの発現量またはｍＲＮＡの量を検出または測定することによって、感度および特異性の高い腫瘍の診断が可能である。このような方法については、さらに以下の参考文献を参照することができる。
In addition, the progress of cancer progression or treatment progress of a subject can be monitored using CEA as a marker. Such a cancer is not particularly limited as long as it is a CEA positive cancer, CEA positive stomach cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, Alternatively, it can be suitably used for diagnosis of prostate cancer and the like. For example, it is present in, for example, 5 ml of the blood of a subject by combining cell sorting and enrichment (enrichment) using antibodies and magnetic beads, and highly sensitive detection of mRNA by RT-PCR. It is possible to detect several tumor cells. By detecting a tumor cell present in blood and detecting or measuring the CEA expression level or mRNA level, a highly sensitive and specific tumor can be diagnosed. The following references can be further referred to for such methods.

Zieglschmid V, Hollmann C, Bocher O. “Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood.” Crit Rev Clin Lab Sci. 2005;42(2):155-96. Zieglschmid V, Hollmann C, Bocher O. “Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood.” Crit Rev Clin Lab Sci. 2005; 42 (2): 155-96.

Waguri N, Suda T, Nomoto M, Kawai H, Mita Y, Kuroiwa T, Igarashi M, Kobayashi M, Fukuhara Y, Aoyagi Y. “Sensitive and specific detection of circulating cancer cells in patients with hepatocellular carcinoma; detection of human telomerase reverse transcriptase messenger RNA after immunomagnetic separation.” Clin Cancer Res. 2003 Aug 1;9(8):3004-11.   Waguri N, Suda T, Nomoto M, Kawai H, Mita Y, Kuroiwa T, Igarashi M, Kobayashi M, Fukuhara Y, Aoyagi Y. “Sensitive and specific detection of circulating cancer cells in patients with hepatocellular carcinoma; detection of human telomerase reverse transcriptase messenger RNA after immunomagnetic separation. ”Clin Cancer Res. 2003 Aug 1; 9 (8): 3004-11.

Zhang YL, Feng JG, Gou JM, Zhou LX, Wang P. “Detection of CK20mRNA in peripheral blood of pancreatic cancer and its clinical significance.” World J Gastroenterol. 2005 Feb 21;11(7):1023-7.   Zhang YL, Feng JG, Gou JM, Zhou LX, Wang P. “Detection of CK20mRNA in peripheral blood of pancreatic cancer and its clinical significance.” World J Gastroenterol. 2005 Feb 21; 11 (7): 1023-7.

Demel U, Tilz GP, Foeldes-Papp Z, Gutierrez B, Albert WH, Bocher O. “Detection of tumour cells in the peripheral blood of patients with breast cancer. Development of a new sensitive and specific immunomolecular assay.” J Exp Clin Cancer Res. 2004 Sep;23(3):465-8.   Demel U, Tilz GP, Foeldes-Papp Z, Gutierrez B, Albert WH, Bocher O. “Detection of tumour cells in the peripheral blood of patients with breast cancer.Development of a new sensitive and specific immunomolecular assay.” J Exp Clin Cancer Res. 2004 Sep; 23 (3): 465-8.

固体支持体上に配列（すなわち、グリッド化（ｇｒｉｄｄｉｎｇ））されたクローンまたはオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションもまた、その遺伝子の発現の検出および発現レベルの定量の両方に用いることができる。この手法では、ＣＥＡ遺伝子をコードするｃＤＮＡが基材に固定される。基材は、ガラス、ニトロセルロース、ナイロンまたはプラスチックを含むがこれらに限定されない任意の好適な種類であってもよい。ＣＥＡ遺伝子をコードするＤＮＡの少なくとも一部を基材に付着させ、次に、当該組織から単離したＲＮＡまたはＲＮＡのコピーである相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であってもよい検体とインキュベートする。基材に結合したＤＮＡと検体とのハイブリダイゼーションは、検体またはハイブリッド検出用の二次分子を放射性標識または蛍光標識することを含むがこれらに限定されないいくつかの手段で検出し定量することができる。本発明において使用し得る標識の非限定的な例としては、放射性同位元素、蛍光基、発光基、フリーラジカル基、粒子、バクテリオファージ、細胞、金属、酵素、または補酵素等が挙げられる。遺伝子の発現レベルの定量は、検体からの信号の強度を、既知の標準から決定したレベルと比較することによってなされる。標準は、標的遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写、収量の定量化、およびこの材料を用いて標準曲線を作成することにより得ることができる。   Hybridization to clones or oligonucleotides sequenced on a solid support (ie, gridding) can also be used for both detection of expression of the gene and quantification of expression levels. In this method, cDNA encoding the CEA gene is immobilized on a substrate. The substrate may be of any suitable type, including but not limited to glass, nitrocellulose, nylon or plastic. At least a portion of the DNA encoding the CEA gene is attached to a substrate and then incubated with a specimen, which may be RNA isolated from the tissue or a complementary DNA (cDNA) that is a copy of RNA. Hybridization between the DNA bound to the substrate and the analyte can be detected and quantified by several means including, but not limited to, radioactively or fluorescently labeling the analyte or secondary molecule for hybrid detection. . Non-limiting examples of labels that can be used in the present invention include radioisotopes, fluorescent groups, luminescent groups, free radical groups, particles, bacteriophages, cells, metals, enzymes, or coenzymes. Quantification of gene expression levels is done by comparing the intensity of the signal from the specimen to a level determined from a known standard. Standards can be obtained by in vitro transcription of target genes, quantification of yield, and using this material to create a standard curve.

プロテオミクスアプローチでは、２次元電気泳動が当業者によく知られた技術である。すなわち、血清などの試料からの個別のタンパク質は、通常ポリアクリルアミドゲル上で、タンパク質の異なる特性による分離を連続的に行うことによって単離することができる。最初に、タンパク質は電流を用いて大きさにより分離される。電流は全てのタンパク質に均等に作用し、それにより、小さいタンパク質は大きいタンパク質よりもゲル上で早く移動する。第２次元では、第１次元に対して直角に電流をかけ、タンパク質を大きさに基づいてではなく、各タンパク質が有する特定の電荷に基づいて分離する。異なる配列の２つのタンパク質で大きさおよび電荷の両方に関して同一なものは存在しないため、２次元分離の結果は、各タンパク質が固有のスポットを占有する正方形のゲルとなる。該スポットの化学的プローブまたは抗体プローブによる分析、またはそれに引き続くタンパク質のマイクロシーケンスにより、所定のタンパク質の相対的な存在度を明らかにし、試料中のタンパク質の同定をすることができる。   In the proteomic approach, two-dimensional electrophoresis is a technique well known to those skilled in the art. That is, individual proteins from a sample such as serum can be isolated by continuously performing separations according to different properties of the protein, usually on a polyacrylamide gel. First, proteins are separated by size using an electric current. The current acts equally on all proteins, so that small proteins move faster on the gel than larger proteins. In the second dimension, an electric current is applied at right angles to the first dimension and the proteins are separated based on the specific charge each protein has rather than based on size. Because no two proteins of different sequence are identical in both size and charge, the result of the two-dimensional separation is a square gel where each protein occupies a unique spot. Analysis of the spot with a chemical or antibody probe, or subsequent protein microsequencing can reveal the relative abundance of a given protein and identify the protein in the sample.

以上詳述した検出および／または定量方法は、組織生検材料および検死解剖材料を含む患者または被験者から得られた様々な細胞、体液および／または組織抽出物（ホモジネートまたは可溶化した組織）に由来する試料について行うことができる。本発明に有用な体液は、血液、尿、唾液または任意のその他の体分泌物またはそれらの派生物を含む。血液は、全血、血漿、血清、または任意の血液の派生物を含む。   The detection and / or quantification methods detailed above are derived from various cells, body fluids and / or tissue extracts (homogenated or solubilized tissue) obtained from patients or subjects including tissue biopsy material and autopsy material. This can be done on a sample. Body fluids useful in the present invention include blood, urine, saliva or any other body secretion or derivative thereof. Blood includes whole blood, plasma, serum, or any blood derivative.

７．抗ＣＥＡ自己抗体を検出および／または定量する方法
本発明はまた、別の態様において、被験者由来の生体試料中のＣＥＡに対する自己抗体（抗ＣＥＡ自己抗体）を検出および／または定量する方法を提供する。 7). Method for Detecting and / or Quantifying Anti-CEA Autoantibodies In another aspect, the present invention also provides a method for detecting and / or quantifying autoantibodies against CEA (anti-CEA autoantibodies) in a biological sample derived from a subject. .

被験者からの生体試料中の抗ＣＥＡ自己抗体の検出は、任意の多くの方法で行うことができるが、代表的な方法には、免疫アッセイがあり、例えば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、プロテインＡ免疫検定法等が挙げられる。   Detection of anti-CEA autoantibodies in a biological sample from a subject can be performed in any of a number of ways, but representative methods include immunoassays, such as Western blot, radioimmunoassay, ELISA, sandwich Immunoassay, fluorescence immunoassay (FIA), time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA), enzyme immunoassay (EIA), luminescence immunoassay (LIA), electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), latex agglutination Methods, immunoprecipitation assays, sedimentation reaction methods, gel diffusion sedimentation reaction methods, immunodiffusion assays, agglutinin assays, complement binding assays, immunoradiometric assays, protein A immunoassays, and the like.

このような免疫アッセイは、様々な方法で実施することができる。例えば、このようなアッセイを実施するための１つの方法は、ＣＥＡタンパク質の固相支持体上への繋留、およびそれに対して特異的な抗ＣＥＡ抗体の検出を包含する。本発明のアッセイに用いられるＣＥＡタンパク質は、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって調製し得る。例えば、ＣＥＡタンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクター中に遺伝子組換え技術により導入して、ＣＥＡタンパク質を大規模に発現することができる。好ましくは、ＣＥＡの標識、固定化または検出を容易にすることができる融合タンパク質が遺伝子操作される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載された技術を参照）。別法として、ＣＥＡタンパク質は天然の供給源から精製することができる。例えば、当該分野において周知のタンパク質分離技術を用いて前立腺がん細胞から精製する。このような精製技術には、分子シーブクロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーが包含されるが、これらに限定されない。実際にはＣＥＡタンパク質の固体支持体としては、マイクロタイタープレートが好都合に使用される。   Such immunoassays can be performed in a variety of ways. For example, one method for performing such an assay involves tethering a CEA protein on a solid support and detecting an anti-CEA antibody specific thereto. The CEA protein used in the assay of the present invention can be prepared by recombinant DNA techniques well known in the art. For example, the CEA protein can be expressed on a large scale by introducing a DNA encoding the CEA protein into an appropriate expression vector by a gene recombination technique. Preferably, a fusion protein capable of facilitating labeling, immobilization or detection of CEA is genetically engineered (eg, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N (See the technique described in Y.). Alternatively, CEA protein can be purified from natural sources. For example, it is purified from prostate cancer cells using protein separation techniques well known in the art. Such purification techniques include, but are not limited to, molecular sieve chromatography and / or ion exchange chromatography. In practice, a microtiter plate is advantageously used as the solid support for the CEA protein.

８．薬剤の標的指向化療法において使用し得る抗体分子を探索する方法
本明細書の実施例に、抗ＣＥＡ抗体とＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターとを用いて具体的に例示したＣＥＡ陽性、陰性または正常細胞への遺伝子導入効率の評価の方法は、ＣＥＡを標的とした標的化療法に使用し得る抗体を同定するための方法として有用である。 8). Methods of Searching for Antibody Molecules that can be Used in Drug Targeted Therapy Examples in this specification include CEA positive, negative or normal specifically exemplified using anti-CEA antibodies and Z33 fiber mutant adenoviral vectors The method for evaluating the efficiency of gene transfer into cells is useful as a method for identifying antibodies that can be used in targeted therapy targeting CEA.

したがって、本発明は、薬剤の標的指向化療法において使用し得る腫瘍特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を同定する方法を提供する。   Accordingly, the present invention provides a method for identifying monoclonal antibodies against tumor-specific CEA antigens that can be used in drug targeted therapy.

本発明は、１つの態様において、腫瘍特異的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製方法を提供し、この方法は、
（１）ＣＥＡまたはＣＥＡ陽性腫瘍細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、
（２）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物（例えば、抗体など）の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記腫瘍細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する感染効率を評価する工程、および
（３）上記感染効率が上記ハイブリドーマ由来産物（抗体など）を上記腫瘍細胞と接触させない場合と比較して増大したハイブリドーマを選択し、クローニングする工程
を包含する。 In one aspect, the present invention provides a method for producing a hybridoma that produces a monoclonal antibody against a tumor-specific antigen, the method comprising:
(1) immunizing a mammal with CEA or CEA positive tumor cells, fusing lymphocytes from the immunized mammal with myeloma cells, and preparing a hybridoma library;
(2) In the presence of the hybridoma-derived product (eg, antibody) derived from the library, the fiber mutation is brought into contact with the tumor cell by contacting the fiber mutant adenovirus modified to bind to the antibody with the tumor cell. Infecting the tumor cells with the adenovirus type, and evaluating the infection efficiency of the fiber mutant adenovirus with respect to the tumor cells, and (3) the infection efficiency of the hybridoma-derived product (such as an antibody) and the tumor cells Selecting and cloning hybridomas that are increased compared to the non-contact case.

本発明はまた、腫瘍特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を調製する方法を提供する。この調製方法は、
（１）ＣＥＡまたはＣＥＡ陽性腫瘍細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、および
（２）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物（例えば、抗体など）の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記腫瘍細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する。 The present invention also provides a method for preparing monoclonal antibodies against tumor-specific CEA antigens. This preparation method is
(1) immunizing a mammal with CEA or CEA positive tumor cells, fusing lymphocytes from the immunized mammal with myeloma cells, and producing a hybridoma library, and (2) derived from the library In the presence of the hybridoma-derived product (such as an antibody), the fiber mutant adenovirus modified to bind to the antibody is contacted with the tumor cell, whereby the fiber mutant adenovirus is brought into contact with the tumor cell. Infecting and evaluating the infection efficiency of the fiber mutant adenovirus against the tumor cells,
Is included.

ここで、好ましくは、上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の存在下での、上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞への感染は、
（Ａ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物を、上記腫瘍細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に接触させるか、
（Ｂ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、上記腫瘍細胞に接触させるか、または
（Ｃ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、上記腫瘍細胞に接触させること、によって行われる。 Here, preferably, the infection of the tumor cells with the fiber mutant adenovirus in the presence of the hybridoma-derived product derived from the library,
(A) After contacting the hybridoma-derived product from the library with the tumor cell, the fiber mutant adenovirus modified to bind to the antibody is contacted with the tumor cell,
(B) The hybridoma-derived product derived from the library is reacted in advance with a fiber mutant adenovirus modified so as to bind to an antibody, and then contacted with the tumor cell, or (C) the library It is carried out by bringing the hybridoma-derived product derived from and the fiber mutant adenovirus modified so as to bind to the antibody into contact with the tumor cells by simultaneous administration.

上記調製方法では、感染効率を評価した結果、通常、感染効率がハイブリドーマ由来産物（抗体など）を腫瘍細胞と接触させない場合と比較して、またはコントロール抗体と腫瘍細胞とを接触させた場合と比較して、増大したハイブリドーマを選択し、クローニングすることによって、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。なお、予め抗ＣＥＡモノクローナル抗体が入手可能な場合（例えば、市販の抗ＣＥＡモノクローナル抗体を使用し得る場合）は、上記のハイブリドーマのライブラリーを作製する工程は省略し得ることは明らかである。好ましい態様では、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程は、レポーター遺伝子発現アッセイによって上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する上記感染効率を評価することを含む。ここで、上記ファイバー変異型アデノウイルスは、上記感染の際に上記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現することができるように作製されている。また、上記レポーター遺伝子発現アッセイは、例えば、分光光度計あるいはフローサイトメトリーを利用してレポーター遺伝子ＥＧＦＰの発現測定を行うことができる。ここで、上記発現効率の増大したハイブリドーマの選択においては、レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体を使用した場合と比較して、少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも１０倍、より好ましくは、少なくとも２０倍、より好ましくは、少なくとも３０倍、より好ましくは、少なくとも４０倍、最も好ましくは、少なくとも５０倍であるモノクローナル抗体が選択される。なお、ここでいう「コントロール抗体」とは、ＩＢＬ社（ｌｏｔ Ｎｏ ９Ｇ−７１７）のようなマウス抗ＣＥＡ抗体のことをいう。   In the above preparation method, as a result of evaluating the infection efficiency, the infection efficiency is usually compared with the case where a hybridoma-derived product (such as an antibody) is not contacted with a tumor cell, or when the control antibody is contacted with a tumor cell. Then, the desired monoclonal antibody can be obtained by selecting and cloning the increased hybridoma. If an anti-CEA monoclonal antibody is available in advance (for example, when a commercially available anti-CEA monoclonal antibody can be used), it is obvious that the step of preparing the above hybridoma library can be omitted. In a preferred embodiment, the step of selecting a hybridoma that produces the monoclonal antibody of interest comprises evaluating the infection efficiency of the fiber mutant adenovirus against the tumor cells by a reporter gene expression assay. Here, the fiber mutant adenovirus is prepared so that a reporter gene for evaluating the infection efficiency can be expressed during the infection. The reporter gene expression assay can measure the expression of the reporter gene EGFP using, for example, a spectrophotometer or flow cytometry. Here, in the selection of the hybridoma having increased expression efficiency, the expression level of the reporter gene is at least 2-fold, preferably at least 10-fold, more preferably at least 20-fold compared to the case where the control antibody is used. Monoclonal antibodies that are fold, more preferably at least 30 fold, more preferably at least 40 fold, and most preferably at least 50 fold are selected. The term “control antibody” used herein refers to a mouse anti-CEA antibody such as IBL (lot No 9G-717).

また、レポーター遺伝子発現アッセイの代替的な実施方法としては、例えば、レポーター遺伝子としてｌａｃＺを使用する場合には、ｌａｃＺ遺伝子産物の発現は、市販の化学発光β−Ｇａｌレポーター測定キット（例えば、Ｇａｌａｃｔｏ Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製：コード番号Ｔ１０１１）など）を使用して測定し得る。また、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用する場合には、市販のルシフェラーゼ定量システムとして、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ１５００）などを使用して測定し得る。   Further, as an alternative implementation method of the reporter gene expression assay, for example, when lacZ is used as the reporter gene, the expression of the lacZ gene product is expressed by a commercially available chemiluminescent β-Gal reporter measurement kit (for example, Galacto Light Measurement may be performed using a Plus Reporter Gene Assay System (Roche, Inc .: code number T1011). Moreover, when using a luciferase gene as a reporter gene, it can measure using Luciferase assay system (Promega, Cat No. E1500) etc. as a commercially available luciferase quantification system.

上記方法において、抗体に結合するように改変されたファイバー変異型アデノウイルスとしては、例えば、抗体のＦｃドメインに結合するプロテインＡのＺ３３モチーフをノブのＨＩループ部位に含むＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスが挙げられる。上記方法においては、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスに限らず、抗体とある程度以上のアフィニティー（例えば、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、１０９Ｍ−１以上であるような結合親和性；以下同様）をもって結合できる性質を付与したベクターであれば、その種類を問わない。例えば、アデノウイルスにＦＺ３３などの抗体結合分子もしくはペプチドを任意の方法で結合（Ｚ３３などを共有結合、Ｚ３３などをビオチン−アビジンによって架橋、Ｚ３３などを化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させたＺ３３などの修飾型のアデノウイルス、などが挙げられる。また、アデノウイルスのファイバーのＣＡＲ受容体（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）との結合部位を欠いたファイバー変異型アデノウイルス、すなわち、Ｋｉｒｂｙ Ｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３： ９５０８−９５１４， １９９９．； Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９： ７６９−７７６， ２００２．； ＲｏｅｌｖｉｎｋＰＷ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８６： １５６８−１５７１， １９９９．などの参考文献に基づいて作られるファイバー変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のアフィニティーをもって結合できる性質を付与したベクターであっても良い。また、アデノウイルスのインテグリン分子群との反応性を欠いた、ペントンベースタンパク変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のアフィニティーをもって結合できる性質を付与したベクターであっても良い。また、アデノウイルスの肝臓への取り込みを欠いたファイバー変異型アデノウイルス、すなわち、Ｓｍｉｔｈ ＴＡ ｅｔ ａｌ （Ｓｍｉｔｈ ＴＡ， Ｉｄａｍａｋａｎｔｉ Ｎ， Ｒｏｌｌｅｎｃｅ ＭＬ， Ｍａｒｓｈａｌｌ−Ｎｅｆｆ Ｊ， Ｋｉｍ Ｊ， Ｍｕｌｇｒｅｗ Ｋ， Ｎｅｍｅｒｏｗ ＧＲ， Ｋａｌｅｋｏ Ｍ， Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ＳＣ． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ５ ｆｉｂｅｒ ｓｈａｆｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００３ Ｍａｙ ２０；１４（８）：７７７−８７．）などの参考文献に基づいて作られるファイバー変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のアフィニティーをもって結合できる性質を付与したベクターであっても良い。なお、これらは非限定的な例示であり、他のウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、シンドビスウイル、麻疹ウイルス、センダイウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、など）の外被（エンベロープ）やキャプシドに修飾を施した変異型ウイルス、または上記各種ウイルスにＦＺ３３などの抗体結合分子ないしペプチドを任意の方法で結合（ＦＺ３３などを共有結合、ＦＺ３３などをビオチンーアビジンによって架橋、ＦＺ３３などを化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させた修飾型のウイルスもまた、本発明の方法に使用し得る。あるいは、ウイルスベクターに限らず、リポソームベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドＤＮＡネイキッド（ｎａｋｅｄ）ベクターなどの非ウイルスベクターに、抗体結合分子ないしペプチドを任意の方法で結合（抗体結合分子を化学的に共有結合させる、ビオチンーアビジンによって架橋させる、抗体結合分子を化学結合させたポリエチレングリコールでベクターを包む、など）させた修飾型の非ウイルスベクターも、本発明において有利に使用することができる。 In the above method, the fiber mutant adenovirus modified so as to bind to the antibody includes, for example, a Z33 fiber mutant adenovirus containing a Z33 motif of protein A that binds to the Fc domain of the antibody at the HI loop site of the knob. Can be mentioned. In the above method, not only the Z33 fiber mutant adenovirus but also an antibody having a certain affinity (for example, a binding constant (K a ) of at least 10 7 M −1 , preferably at least 10 8 M −1 , more preferably). Any kind of vector can be used as long as it has a binding affinity such that it has a binding affinity of 10 9 M −1 or more; For example, an antibody-binding molecule or peptide such as FZ33 is bound to adenovirus by any method (Z33 or the like is covalently bonded, Z33 or the like is cross-linked by biotin-avidin, Z33 or the like is chemically bound to polyethylene glycol, etc.) ) Modified adenoviruses such as Z33. In addition, a fiber mutant adenovirus lacking a binding site of adenovirus fiber to the CAR receptor (Coxsackievirus adenovirus receptor), ie, Kirby I et al. J. et al. Virol. 73: 9508-9514, 1999. Mizuguchi et al. Gene Therapy 9: 769-776, 2002. Roelvin PW et al. Science, 286: 1568-1571, 1999. Based on the fiber mutant adenovirus produced based on the references such as, a vector imparted with a property capable of binding to an antibody with a certain degree of affinity may be used. Moreover, the vector which gave the property which can be combined with an antibody with a certain amount of affinity based on the penton base protein variant adenovirus lacking the reactivity with the integrin molecule group of adenovirus may be used. Also, fiber mutant adenoviruses lacking adenovirus uptake into the liver, ie, Smith TA et al (Smith TA, Idamakanti N, Rollen ML, Marshall-Neff J, Kim J, MulewK, NemerK , Stevenson SC. Adenovirus serotype 5 fiber shafts in vivo gene transfer in mice, based on Hum Gene Ther. 2003 May 20; Originally, it is a vector that has the property of being able to bind to an antibody with a certain degree of affinity. It may be. These are non-limiting examples, and other viruses (for example, retrovirus, lentivirus, herpes simplex virus, Sindbis virus, measles virus, Sendai virus, reovirus, poxvirus, poliovirus, coxsackie virus, adeno Mutant viruses in which the envelope (envelope) or capsid of the virus-associated virus, etc. is modified, or antibody-binding molecules or peptides such as FZ33 are bound to the various viruses by any method (FZ33 is covalently bound, FZ33 Etc. can also be used in the method of the present invention. The modified virus can be used in the method of the present invention, for example, by cross-linking with biotin-avidin and enveloping the virus with polyethylene glycol chemically bound with FZ33 or the like. Alternatively, antibody binding molecules or peptides can be bound by any method to non-viral vectors such as liposome vectors, Sendai virus envelope vectors, plasmid DNA naked vectors, etc. (antibody binding molecules are chemically shared). Modified non-viral vectors that are bound, cross-linked by biotin-avidin, encapsulated in polyethylene glycol with chemically bound antibody binding molecules, etc.) can also be used advantageously in the present invention.

レポーター遺伝子としては、例えば、ｌａｃＺ、ＥＧＦＰなどの蛍光タンパク、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。これらのレポーター遺伝子は、当業者に周知のレポーター遺伝子アッセイ系を用いて検出し得る。例えば、ｌａｃＺを発現するように調製されたＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスの感染効率は、市販の化学発光β−Ｇａｌレポーターキット（例えば、Ｇａｌａｃｔｏ Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製：コード番号Ｔ１０１１）など）を使用して測定し得る。ルシフェラーゼ定量システムとしては Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ ， Ｃａｔ ＮｏＥ１５００）などを使用して測定し得る。ＥＧＦＰなどの蛍光タンパクは、分光光度計あるいはフローサイトメトリーによって発現量を測定し得る。   Examples of reporter genes include fluorescent proteins such as lacZ and EGFP, and luciferase genes. These reporter genes can be detected using reporter gene assay systems well known to those skilled in the art. For example, the infection efficiency of a Z33 fiber mutant adenovirus prepared to express lacZ is determined using a commercially available chemiluminescent β-Gal reporter kit (for example, Galacto Light Plus Reporter Gene Assay System (Roche Corporation: code number T1011)). Etc.). As a luciferase quantification system, measurement can be performed using Luciferase assay system (Promega, Cat NoE1500). The expression level of a fluorescent protein such as EGFP can be measured by a spectrophotometer or flow cytometry.

なお、上記した薬剤の標的指向化療法に使用するためのモノクローナル抗体の作製および精製については、さらに以下の文献を参照することができる。   For the preparation and purification of monoclonal antibodies for use in the above-mentioned drug targeting therapy, the following documents can be further referred to.

Hamada H. and Tsuruo T. “Functional role for the 170- to 180-kDa glycoprotein specific to drug-resistant tumor cells as revealed by monoclonal antibodies.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7785-7789, 1986.   Hamada H. and Tsuruo T. “Functional role for the 170- to 180-kDa glycoprotein specific to drug-resistant tumor cells as revealed by monoclonal antibodies.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7785-7789, 1986 .

Hamada H. and Tsuruo T. “Determination of membrane antigens by a covalent crosslinking method with monoclonal antibodies.”Anal. Biochem., 160: 483-488, 1987.   Hamada H. and Tsuruo T. “Determination of membrane antigens by a covalent crosslinking method with monoclonal antibodies.” Anal. Biochem., 160: 483-488, 1987.

Hamada H., Hagiwara K., Nakajima T. and Tsuruo T. “Phosphorylation of the Mr 170,000 to 180,000 glycoprotein specific to multidrug-resistant tumor cells: Effects of verapamil, trifluoperazine, and phorbol esters.”Cancer Res., 47: 2860-2865, 1987.   Hamada H., Hagiwara K., Nakajima T. and Tsuruo T. “Phosphorylation of the Mr 170,000 to 180,000 glycoprotein specific to multidrug-resistant tumor cells: Effects of verapamil, trifluoperazine, and phorbol esters.” Cancer Res., 47: 2860 -2865, 1987.

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Mishell BB, Shiigi SM eds. “Selected Methods in Cellular Immunology” WH Freeman and Co., San Francisco, 1980. (邦訳 細胞免疫実験操作法、今井ら訳、理工学社、1982)   Mishell BB, Shiigi SM eds. “Selected Methods in Cellular Immunology” WH Freeman and Co., San Francisco, 1980.

Birch JR and Lennox ES eds. “Monoclonal antibodies: Principles and Applications.” Wiley-Liss, New York, 1995.   Birch JR and Lennox ES eds. “Monoclonal antibodies: Principles and Applications.” Wiley-Liss, New York, 1995.

Goding JW “Monoclonal antibodies: Principles and practice.” Academic Press, London, 1983.   Goding JW “Monoclonal antibodies: Principles and practice.” Academic Press, London, 1983.

Goding JW “Monoclonal antibodies: Principles and practice.” Third ed. Academic Press, London, 1996.   Goding JW “Monoclonal antibodies: Principles and practice.” Third ed. Academic Press, London, 1996.

上記の腫瘍特異的抗原に対する抗ＣＥＡモノクローナル抗体を同定する方法により、ＣＥＡ産生癌細胞の標的化治療に実用化可能な抗体を系統的に探索することができる。   By the method for identifying an anti-CEA monoclonal antibody against the above tumor-specific antigen, it is possible to systematically search for an antibody that can be practically used for targeted therapy of CEA-producing cancer cells.

９．標的化療法における標的分子および抗体の配列決定およびクローニング
本発明の上記方法により、同定された抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は、当業者に周知の配列決定法により決定することができる。 9. Sequencing and cloning of target molecules and antibodies in targeted therapy The amino acid sequence of the antibody identified by the above method of the invention and the nucleic acid sequence encoding it can be determined by sequencing methods well known to those skilled in the art. .

アミノ酸配列決定法としては、気相シークエンサー（例えば、Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９０ｃＬＣ ＡＢＩ社、ＨＰ２４１ ＨＰ社など）を用いるアミノ酸配列の決定方法、酵素や化学分解により切断して得られたペプチドのＨＰＬＣによる分離、ゲル電気泳動によるペプチドマップ法、質量分析装置によるＨＰＬＣで分離されたペプチドのアミノ酸配列分析等が使用され得る。核酸配列の決定方法としては、ＰＣＲを用いたサイクルシークエンス法などのような当業者に周知の核酸配列の決定法が使用され得る。   The amino acid sequence determination method includes a method for determining an amino acid sequence using a gas phase sequencer (for example, Procise 490cLC ABI, HP241 HP, etc.), separation by HPLC of peptides obtained by cleaving by enzyme or chemical degradation, gel electricity Peptide mapping by electrophoresis, amino acid sequence analysis of peptides separated by HPLC using a mass spectrometer, and the like can be used. As a method for determining a nucleic acid sequence, a method for determining a nucleic acid sequence well known to those skilled in the art, such as a cycle sequencing method using PCR, can be used.

得られた標的分子またはそれに対する抗体のＤＮＡの塩基配列が決定されれば、それに基づいて遺伝子工学的手法により、本発明の抗体を作製したり、他の分子との融合体を作製したりすることができる。目的とするＤＮＡは、プラスミドベクターによるクローニング法等の当業者に周知の分子生物学的手法を用いて大量に得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９等を参照）。   Once the base sequence of the obtained target molecule or the DNA of the antibody to the target molecule is determined, the antibody of the present invention or a fusion with another molecule is prepared by genetic engineering techniques based on the determined base molecule. be able to. The target DNA can be obtained in large quantities using molecular biological techniques well known to those skilled in the art, such as cloning methods using plasmid vectors (for example, Sambrook, J. et al .: Molecular Cloning. A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, etc.).

１０．製剤化および製剤の投与方法
本発明の抗体を含有する治療薬、本発明の抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、および治療遺伝子を担持したウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている治療薬は、公知の手法に基づいて製剤化することができる。 10. Formulation and method of administration of the formulation A therapeutic agent containing the antibody of the present invention, the antibody of the present invention is any one of a radioactive isotope, a therapeutic protein, a small molecule drug, and a viral vector carrying a therapeutic gene, or A therapeutic agent chemically or genetically engineered with any combination of these can be formulated based on known techniques.

本発明の治療薬の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。   In formulating the therapeutic agent of the present invention, a pharmaceutically acceptable carrier can be added as necessary according to a conventional method. For example, surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters, taste masking However, the present invention is not limited thereto, and other commonly used carriers can be appropriately used. Specifically, light anhydrous silicic acid, lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylacetal diethylaminoacetate, polyvinylpyrrolidone, gelatin, medium chain fatty acid triglyceride, Examples thereof include polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, and inorganic salts.

本発明の治療薬の剤型の種類としては、例えば、経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。有効成分は、製剤中０．１から９９．９重量％含有することができる。   Examples of the dosage form of the therapeutic agent of the present invention include tablets, powders, pills, powders, granules, fine granules, soft / hard capsules, film coating agents, pellets, and sublingual agents as oral preparations. And pastes such as injections, suppositories, transdermal agents, ointments, plasters, liquids for external use, etc. You can choose. The active ingredient can be contained in the preparation in an amount of 0.1 to 99.9% by weight.

本発明の薬剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して一日につき約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜１００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇに対して）、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。しかしながら、最終的には、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。   The dose of the active ingredient of the drug of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like, but in the case of oral administration, for example, generally for a patient (as 60 kg) per day About 0.1 mg to 1,000 mg, preferably about 1.0 to 100 mg, more preferably about 1.0 to 50 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of an injection, for example, a patient (for 60 kg), It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. However, the final decision can be made as appropriate based on the judgment of a doctor or veterinarian in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptoms, and the like.

このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。ヒト以外の動物の場合も、上記の６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。   The preparation thus obtained can be administered to, for example, humans and other mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Also in the case of animals other than humans, the amount converted per 60 kg can be administered.

本発明の治療剤は、対象となる細胞、組織、臓器、または癌の種類は特定のものに限定されないが、ＣＥＡ産生癌（例えば、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、および前立腺癌）の治療に用いることができる。   The therapeutic agent of the present invention is not limited to a specific cell, tissue, organ, or cancer type, but CEA-producing cancer (eg, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer) , Esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, and prostate cancer).

また、本発明において典型的に使用されるウイルスベクター粒子は、医薬組成物の成分の一つとして、抗ＣＥＡ抗体と組み合わせて、治療、特に腫瘍の治療のために使用することができる。組換えアデノウイルス粒子と抗ＣＥＡ抗体との組み合わせを治療のために使用する場合は、これら単独で使用してもよいが、一般には製薬的に許容できる担体と共に使用される。そのような担体としては、既に上記したような担体、ならびに水、生理食塩水、グルコース、ヒトアルブミン等の水性等張溶液が好ましい。更に、製薬的に通常使用される添加剤、保存剤、防腐剤、衡量等を添加することもできる。そのように調製した医薬組成物は、治療すべき疾病に依存して適切な投与形態、投与経路によって投与することができる。投与形態としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル、錠剤、顆粒剤、注射剤、軟膏等が挙げられる。本発明の抗ＣＥＡ抗体−ウイルスベクター粒子またはこれを含む医薬組成物を治療のために投与する場合は、通常成人一人当たり１回に１０３〜１０１５個のウイルス粒子を投与するのが好ましいが、疾病の状態や標的細胞・組織の性質によって変更してよい。投与回数は、１日１回〜数回でよく、投与期間は１日〜数ヶ月以上にわたってもよく、１〜数回の投入を１セットとして、長期にわたって断続的に多数セットを投与してもよい。また、本発明において使用されるウイルスベクター粒子またはウイルスベクター核酸分子は、特定の細胞および／または組織の検出、または疾病状態の診断に使用することができる。例えば、ウイルスベクターの核酸分子に検出可能なマーカー遺伝子を組込み、これを適切な宿主細胞にトランスフェクションして得られたウイルスベクター粒子は、抗ＣＥＡ抗体と組み合わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。あるいは、抗ＣＥＡ抗体に検出可能な標識を結合させて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。 In addition, the viral vector particles typically used in the present invention can be used as a component of a pharmaceutical composition in combination with an anti-CEA antibody for treatment, particularly for tumor treatment. When a combination of recombinant adenoviral particles and anti-CEA antibody is used for therapy, these may be used alone, but are generally used with a pharmaceutically acceptable carrier. As such a carrier, a carrier as described above and an aqueous isotonic solution such as water, physiological saline, glucose, human albumin and the like are preferable. Furthermore, additives, preservatives, preservatives, balances and the like that are commonly used in pharmaceutics can be added. The pharmaceutical composition thus prepared can be administered by an appropriate administration form and administration route depending on the disease to be treated. Examples of the dosage form include emulsions, syrups, capsules, tablets, granules, injections, ointments and the like. When administering the anti-CEA antibody-virus vector particles of the present invention or a pharmaceutical composition containing the same for treatment, it is usually preferable to administer 10 3 to 10 15 virus particles once per adult. Depending on the disease state and the nature of the target cell / tissue, it may be changed. The administration frequency may be once to several times a day, the administration period may be from one day to several months or more, and one set may be one to several injections, and multiple sets may be administered intermittently over a long period of time. Good. Moreover, the viral vector particle or viral vector nucleic acid molecule used in the present invention can be used for detection of specific cells and / or tissues, or diagnosis of disease states. For example, viral vector particles obtained by incorporating a detectable marker gene into a nucleic acid molecule of a viral vector and transfecting it into an appropriate host cell can be used in combination with an anti-CEA antibody to detect and diagnose tumor cells. can do. Alternatively, it can be used to detect and diagnose tumor cells by binding a detectable label to the anti-CEA antibody.

以下、実施例によって本発明をより具体的に記載するが、本発明の範囲は、以下の実施例によって限定されない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the scope of the present invention is not limited by a following example.

１．材料および方法
1.1. 細胞培養
高レベルのＣＥＡを産生するヒト胃腺癌から樹立したＭＫＮ４５細胞株を、日本癌研究リサーチリソースバンク（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ）（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から入手した。ＭＫＮ−７４（ＣＥＡを発現しないヒト胃癌細胞）は、Ｄｒ．Ｋｕｒｏｋｉから提供された。ヒト正常肝細胞株であるＣｈａｎ−ｌｉｖｅｒは、Ｄｒ．Ｎｉｉｔｕ（Ｆｏｒｔｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓａｐｐｏｒｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により提供された。これらの細胞を、１０％ ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃、５％ ＣＯ２で増殖させた。 1. Materials and methods
1.1. Cell Culture A MKN45 cell line established from human gastric adenocarcinoma producing high levels of CEA was obtained from the Japan Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan). MKN-74 (human gastric cancer cells that do not express CEA) is a Dr. Provided by Kuroki. Chan-liver, a human normal hepatocyte cell line, is Dr. Provided by Niitu (Forth Department of Internal Medicine Sapporo Medical University). These cells were grown in RPMI 1640 supplemented with 10% FBS at 37 ° C., 5% CO 2 .

1.2. ｐＡｘ３プラスミド構築
Ｓａｉｔｏらによって最初に開発されたコスミドＤＮＡ ｐＡｄｅｘ１ｃｗは、アデノウイルスゲノムの最左端の３３塩基対（ｂｐ）および最右端の約２００塩基対（ｂｐ）の両方を欠失するため、本発明者らは、アデノウイルスゲノムの左端および右端の両方の全長配列を提供する組換えアデノウイルス産生のためにコスミドＤＮＡを作製することを試みた。コスミドｐＡｘ３５７−ＦＲＧＤ（単にｐＡｘ３と略記されることもある）は、以下のようにこのプロジェクトのために構築された。Ａｄ５ゲノムの左端の３５７ｂｐを、Ａｄ５ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、そしてＭｕｎＩ（ｃａａｔｔｇ）、ＰａｃＩ（ｔｔａａｔｔａａ）、およびＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｄ）部位を含む５’プライマー：５’ＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡ−３’（配列番号２）、およびＣｌａＩ（ａｔｃｇａｔ）、ＳｗａＩ（ａｔｔｔａａａｔ）、およびＢｇｌＩＩ（ａｇａｔｃｔ）部位を含む３’プライマー：５’ＣＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣＴＡＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＧＣＧＣ−３’（配列番号３）を用いてＰＣＲによって得た。得られた４０１ｂｐのＰＣＲ産物を、ＭｕｎＩおよびＣｌａＩで消化し、そしてＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｊａｐａｎ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入したｐＷＥ１５コスミドのＥｃｏＲＩ（ＭｕｎＩ接着末端と互換性）およびＣｌａＩ部位にライゲーションし、コスミドｐＷＥ３５７ＰａｃＩを得た。Ａｄ５ゲノムの３５７ｂｐ左側末端を含有するｐＷＥ３５７ＰａｃＩ由来のＣｌａＩ／ＲｓｒＩＩフラグメント（フラグメントＡ）を、ｐＡｘ−ＦＲＧＤ由来のＡｄ５ゲノムＤＮＡの約２４ｋｂｐの中央部分を含有するＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント（フラグメントＢ）（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１３（５）：６１３−２６，２００２）、およびｐＡｘＦＲＧＤ由来のＦＲＧＤファイバー変異体Ａｄ５ゲノムの右側６．７ｋｂｐを含有するＥｃｏＲＩ／ＲｅｒＩＩフラグメント（フラグメントＣ）へ、フラグメントＡ、ＢおよびＣの３部分ライゲーションによってライゲーションした。得られたコスミドＤＮＡを、ｐＡｘ３５７−ＦＲＧＤと命名した（これはまた、単にｐＡｘ３とも略記される）。 1.2. Construction of pAx3 plasmid The cosmid DNA pAdex1cw originally developed by Saito et al . Deletes both the leftmost 33 base pairs (bp) and the rightmost about 200 base pairs (bp) of the adenovirus genome. The inventors have attempted to create cosmid DNA for the production of recombinant adenovirus that provides both the left and right full length sequences of the adenovirus genome. Cosmid pAx357-FRGD (sometimes abbreviated simply as pAx3) was constructed for this project as follows. 357 bp at the left end of the Ad5 genome, using the Ad5 genomic DNA as a template, and a 5 'primer containing MunI (caattg), PacI (tattata), and BamHI (ggatcd) sites: And 3 ′ primer containing ClaI (atcgat), SwaI (attataat), and BglII (agatct) sites: obtained by PCR using 5′CCATCGATTTAAAATAGATCTGCGGCCCCTAGCAAAATATACGCGC-3 ′ (SEQ ID NO: 3). The resulting 401 bp PCR product was digested with MunI and ClaI and ligated to EcoRI (compatible with MunI cohesive ends) and ClaI sites of pWE15 cosmid purchased from Clontech (Japan BD Biosciences Clontech, Tokyo, Japan) Cosmid pWE357PacI was obtained. A ClaI / RsrII fragment (fragment A) from pWE357PacI containing the 357 bp left end of the Ad5 genome was converted to a ClaI / EcoRI fragment (fragment B) containing about 24 kbp central portion of Ad5 genomic DNA from pAx-FRGD (Nakamura T , Hum Gene Ther., 13 (5): 613-26, 2002), and the EcoRI / RerII fragment (fragment C) containing 6.7 kbp on the right side of the FRGD fiber mutant Ad5 genome derived from pAxFRGD. Ligation was performed by three-part ligation of B and C. The resulting cosmid DNA was named pAx357-FRGD (this is also simply abbreviated as pAx3).

図１は、本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルス作製のためのアデノウイルスベクターｐＡｘ３の模式図である。図１に示されるように、ｐＡｘ３プラスミドＤＮＡは、ＰａｃＩ部位を、Ａｄ５ゲノム（Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド（ｎｔ）１〜３５７）の左側末端および右側末端の両方に含有し、続いてＢｇｌＩＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ、およびＳａｌＩ制限酵素部位を含有する。ｐＡｘ３は、ｎｔ３５８〜３３２８のＥ１ＡおよびＥ１８コード領域を欠失する。これはまた、Ｅ３をコードする１．８ｋｂｐ ＸｂａＩ−ＸｂａＩフラグメントを欠失する。それは、ＲＧＤファイバー変異をコードするＣＤＣＲＧＤＣＦＣをファイバーノブのＨＩループに含有し、Ａｄ５ゲノムの全長右側末端を含有する。ＲＧＤ変異を有するファイバーノブＨＩループのＤＮＡ配列は、以下の通りであり：ＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＡＧＴＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴ（配列番号４）、ＳａｃＩＩ部位をＲＧＤリガンド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）コード領域に有し、続いてＡｓｅＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩ、およびＳａｌＩ制限酵素部位を有する。   FIG. 1 is a schematic diagram of an adenovirus vector pAx3 for producing a recombinant adenovirus used as a representative example in the present invention. As shown in FIG. 1, pAx3 plasmid DNA contains a PacI site at both the left and right ends of the Ad5 genome (nucleotides (nt) 1-357 of the Ad5 genome), followed by BglII, SwaI, ClaI. And a SalI restriction enzyme site. pAx3 lacks the E1A and E18 coding regions of nt 358-3328. This also deletes the 1.8 kbp XbaI-XbaI fragment encoding E3. It contains the CDCRGDCFC encoding the RGD fiber mutation in the HI loop of the fiber knob and contains the full length right end of the Ad5 genome. DNA sequence of the fiber knob HI loop with a RGD mutations are as follows: TGTGACTGCCGCGGAGACTGTTTCTGCCCAAGTGCATACTCTATGTCATTTTCATGGGACTGGTCTGGCCACAACTACATTAATGAAATATTTGCCACCTCGAGTTACACTTTTTCATACATTGCCCAAGAATAAGGATCCACGCGTGTCGACAAGAATAAAGAAT (SEQ ID NO: 4) has a SacII site RGD ligands (CDCRGDCFC) coding region, followed by AseI, XhoI, BamHI, MluI, And has a SalI restriction enzyme site.

1.3. ＦＺ３３アデノウイルスベクター構築のためのプラスミド
ａ．プラスミドｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮ構築
ＡｄｖファイバーノブＨＩループの遺伝子工学を簡略化するために、本発明者らはまず、Ａｇｅｌ（ＡＣＣＧＧＴ）部位およびＮｈｅＩ（ＧＣＴＡＧＣ）部位を含有するＨＩループをコードするＤＮＡフラグメントを作製し、このフラグメントをｈｉＡＮと名付けた。ｈｉＡＮフラグメントの５’側半分は、５’プライマー＃２０９１および３’プライマー＃２０９２を使用して、プラスミドｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ．２００２（前出））をテンプレートとして使用してＰＣＲによって合成した。ＫｐｎＩ（ｇｇｔａｃｃ）部位を有する＃２０９１の３７塩基プライマーの配列は、以下の通りである：ｃｇｇｇｇｔａｃｃａａｔａｔｃｔｇｇａａｃａｇｔｔｃａａａｇｔｇｃｔｃａｔ（配列番号５）。ＥｃｏＲＩ部位およびＡｇｅＩ（ａｃｃｇｇｔ）部位を有する＃２０９２の４７塩基プライマーの配列は、以下の通りである：ｃｇｇａａｔｔｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｃｃｇｇｔｔｔｃｃｔｇｔｇｔａｃｃｇｔｔｔａｇｔｇｔａａｔｇ（配列番号６）。得られる３１４ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮプラスミド構築のために使用した。ｈｉＡＮフラグメントの３’側半分を、５’プライマー＃２０９３および３’プライマー＃２０６８を使用して、プラスミドｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００２（前出））をテンプレートとして使用して合成した。ＮｈｅＩ（ｇｃｔａｇｃ）部位を有する＃２０９３の５２塩基プライマーの配列は、以下の通りである：ｃｃｇａａｔｔｃｃｇｃｔａｇｃｇａｃａｃａａｃｔｃｃａａｇｔｇｃａｔａｃｔｃｔａｔｇｔｃａｔｔｔｔｃａｔ（配列番号７）。＃２０６８の２６塩基プライマーの配列は、以下の通りである：ａｔａｔｇｇｔａｃｃｇｇｇａｇｇｔｇｇｔｇａａｔｔａ（配列番号８）。得られる９７４ｂｐのＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、１３６ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮプラスミド構築のために使用した。５’および３’部分を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ部位に、３部分ライゲーションによってサブクローニングし、プラスミドｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮを得た。 1.3. Plasmid a. For construction of FZ33 adenovirus vector a. Plasmid pSKII + hiAN Construction To simplify the genetic engineering of the Adv fiber knob HI loop, we first generated a DNA fragment encoding the HI loop containing the Agel (ACCGGT) and NheI (GCTAGC) sites, This fragment was named hiAN. The 5 ′ half of the hiAN fragment was templated using plasmid pWE6.7R-F / wt-2 (Nakamura T et al. 2002 (supra)) using 5 ′ primer # 2091 and 3 ′ primer # 2092. And synthesized by PCR. The sequence of the # 2091 37-base primer with a KpnI (ggtacc) site is as follows: cggggtaccatatatctggaacagttcaaagtgctcat (SEQ ID NO: 5). The sequence of the 4792 primer of # 2092 with EcoRI and AgeI (accggt) sites is as follows: cggatattcggcgcgccaccggtttcctgtgtacgtgttagtgtatg (SEQ ID NO: 6). The resulting 314 bp PCR fragment was digested with KpnI and EcoRI and used for pSKII + hiAN plasmid construction. The 3 ′ half of the hiAN fragment was used as a template using plasmid pWE6.7R-F / wt-2 (Nakamura et al. 2002 (supra)) using 5 ′ primer # 2093 and 3 ′ primer # 2068. And synthesized. The sequence of the # 2093 52 base primer with NheI (gctagc) site is as follows: ccgaattccgctagcgacacaactccaagtgcatactcttatgttatttcat (SEQ ID NO: 7). The sequence of the # 2068 26 base primer is as follows: atatggtaccgggggagtgggtgaatta (SEQ ID NO: 8). The resulting 974 bp PCR fragment was digested with EcoRI and BamHI, and the 136 bp EcoRI / BamHI fragment was used for pSKII + hiAN plasmid construction. The 5 ′ and 3 ′ portions were subcloned into the KpnI / BamHI sites of pBluescript SKII + (Stratagene) by three-part ligation, resulting in plasmid pSKII + hiAN.

ｂ．ｐＳＫＩＩ＋Ｚ３３プラスミド構築
Ｚ３３ペプチドモチーフを有するＤＮＡフラグメントを、４８塩基の＃２０８５ ５’プライマーおよび４８塩基 ＃２０８６ ３’プライマーを用いて、８６塩基 ＃２０８７オリゴヌクレオチドテンプレートを使用してＰＣＲによって合成した。このオリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである：＃２０８５、４８ｂ：ｇａａａｃｃｇｇｔｃｔｃａｔｃａａｇｔｔｔａａｃａｔｇｃａｇｃａｇｃａｇｃｇｃｃｇｃｔｔｔｔａｃ（配列番号９）、＃２０８６、４８ｂ：ｇｔｃｇｃｔａｇｃａｔｃｔａｔｇｔｃｇｔｃｇｃｇａａｔｇｃｔｃｔｔａａｔｃｔｔｇｇｃｇｔｔｇｃｇ（配列番号１０）、＃２０８７、８６ｂ：ａｔｇｃａｇｃａｇｃａｇｃｇｃｃｇｃｔｔｔｔａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃｇａｃｃｃｃａａｃｃｔｇａａｃｇａｇｇａｇｃａｇｃｇｃａａｃｇｃｃａａｇａｔｔａａｇａｇｃａｔｔｃｇ（配列番号１１）。得られた１３２ｂｐのＰＣＲ産物（ＧＡＡＡＣＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＡＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＴＴＴＴＡＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＡＣＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＴＴＡＡＧＡＧＣＡＴＴＣＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＣＴＡＧＣＧＡＣ（配列番号１２））を、ＡｇｅＩおよびＮｈｅＩで消化し、ｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮのＡｇｅＩ／ＮｈｅＩ部位に挿入し、プラスミドｐＳＫＩＩ＋Ｚ３３を得た。１３２ｂｐフラグメントによってコードされるアミノ酸配列は、以下の通りである：ＥＴＧＬＩＫＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤＩＤＡＳＤ（配列番号１３）。報告されたＦＺ３３配列：ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号１４）には、下線を付している。さらに、下線を付したＴＧは、ＡＣＣＧＧＴ（ＡｇｅＩ部位）としてコードされ、そして下線を付したＡＳはＧＣＴＡＧＣ（ＮｈｅＩ部位）としてコードされる。 b. pSKII + Z33 Plasmid Construction A DNA fragment with the Z33 peptide motif was synthesized by PCR using a 48 base # 2085 5 'primer and a 48 base # 2086 3' primer using an 86 base # 2087 oligonucleotide template. The oligonucleotide sequences are as follows: # 2085,48b: gaaaccggtctcatcaagtttaacatgcagcagcagcgccgcttttac (SEQ ID NO: 9), # 2086,48b: gtcgctagcatctatgtcgtcgcgaatgctcttaatcttggcgttgcg (SEQ ID NO: 10), # 2087,86b: atgcagcagcagcgccgcttttacgaggccttgcacgaccccaacctgaacgaggagcagcgcaacgccaagattaagagcattcg (SEQ ID NO: 11). PCR product resulting 132bp the (GAAACCGGTCTCATCAAGTTTAACATGCAGCAGCAGCGCCGCTTTTACGAGGCCTTGCACGACCCCAACCTGAACGAGGAGCAGCGCAACGCCAAGATTAAGAGCATTCGCGACGACATAGATGCTAGCGAC (SEQ ID NO: 12)) was digested with AgeI and NheI, was inserted into the AgeI / NheI site of pSKII + hiAN, resulting in plasmid pSKII + Z33. Amino acid sequence encoded by the 132bp fragment is as follows: E TG LIK FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIRDD ID AS D ( SEQ ID NO: 13). The reported FZ33 sequence: FNMQQQRRFYEALHDPNNLEEQRNAKIKSIRDD (SEQ ID NO: 14) is underlined. Furthermore, the underlined TG is encoded as ACCGGT (AgeI site) and the underlined AS is encoded as GCTAGC (NheI site).

ｃ．ｐＷＥ６．７Ｒ−ＦＺ３３プラスミド構築
Ａｄ５ファイバーのＮ末端領域（フラグメントＡ）をコードするｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２由来のＸｂａＩ／ＢｓｔＸＩフラグメント、Ａｄ５ゲノムの右側末端を含有するｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２由来のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩフラグメント（フラグメントＢ）、およびＺ３３モチーフをコードするｐＳＫＩＩ＋Ｚ３３由来のＢｓｔＸＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（フラグメントＣ）を、３部分ライゲーションによってライゲーションし、ｐＷＥ６．７Ｒ−ＦＺ３３を得た。 c. pWE6.7R-FZ33 Plasmid Construction pWE6.7R-F / wt-2 derived XbaI / BstXI fragment encoding the N-terminal region of Ad5 fiber (fragment A), pWE6.7R-F / containing the right end of the Ad5 genome. The BamHI / XbaI fragment derived from wt-2 (fragment B) and the BstXI / BamHI fragment derived from pSKII + Z33 encoding the Z33 motif (fragment C) were ligated by three-part ligation to obtain pWE6.7R-FZ33.

ｄ．ｐＡｘ３−ＦＺ３３プラスミド構築
Ａｄ５ゲノムの左側末端３５７ｂｐを含有するｐＡｘ３由来のＲｓｒＩＩ／ＣｌａＩフラグメント（３９５６ｂｐ）、Ａｄ５ゲノムの中央の２４ｋｂｐを含有するｐＡｘ３由来のＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント、およびｐＷＥ６．７Ｒ−ＦＺ３３由来のＥｃｏＲＩ／ＲｓｒＩＩフラグメントを、３部分ライゲーションによってライゲーションして、ｐＡｘ３−ＦＺ３３を得た。図２は、ｐＡｘ３−ＦＺ３３プラスミドの模式図である。 d. pAx3-FZ33 Plasmid Construction An RsrII / ClaI fragment derived from pAx3 (3956 bp) containing the left end 357 bp of the Ad5 genome, a ClaI / EcoRI fragment derived from pAx3 containing the central 24 kbp of the Ad5 genome, and pWE6.7R-FZ33 The EcoRI / RsrII fragment was ligated by 3-part ligation to give pAx3-FZ33. FIG. 2 is a schematic diagram of the pAx3-FZ33 plasmid.

ｅ．ｐＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３プラスミド構築
ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするＤＮＡフラグメントを、ＮｏｔＩ消化およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端化、およびその後のＥｃｏＲＩでの消化によって、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から切り出した。そのフラグメントを、ｐＣＡｃｃ（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．ＢＢＲＣ（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｙ ａｎｄ Ｈａｍａｄａ Ｈ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３０，４２６−４３０．１９９７）のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ（Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって予め平滑末端化した）部位へ挿入し、ｐＣＡＥＧＦＰを得た。ｐＣＡＥＧＦＰ由来のＣｌａＩフラグメントを、ｐＡｘ３−ＦＺ３３のＣｌａＩ部位にライゲーションし、コスミドｐＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を得た。左側方向のプラスミドｐＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ（Ｌ）−ＦＺ３３（ここで、ＥＧＦＰをコードする遺伝子を駆動するプロモーターはＥ１Ａプロモーターに対して反対向きである）をアデノウイルス産生のために使用した。 e. pAx3CAEGFP-FZ33 Plasmid Construction A DNA fragment encoding EGFP (enhanced green fluorescence protein) was excised from pEGFP-N1 (Clontech) by NotI digestion and blunting with T4 DNA polymerase and subsequent digestion with EcoRI. The fragment was pre-blunted with EcoRI / BglII (T4 DNA polymerase) of pCAcc (Yoshida et al. BBRC (Yoshida Y and Hamada H. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun., 230, 426-430.1997). PCAEGFP was obtained, and the ClaI fragment derived from pCAEGFP was ligated to the ClaI site of pAx3-FZ33 to obtain cosmid pAx3CAEGFP-FZ33, left-handed plasmid pAx3CAEGFP (L) -FZ33 (here And the promoter driving the gene encoding EGFP is opposite to the E1A promoter) was used for adenovirus production.

ｆ．ｐＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３プラスミド構築
プラスミドｐＣＡＺ３（ここで、ｌａｃＺ遺伝子は、ＣＡプロモーター（ニワトリβアクチンプロモーターを有するサイトメガロウイルスエンハンサー）によって駆動される）を作製した（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． ２００２（前出））。βガラクトシダーゼ発現カセット（ＣＡＺ３、５１５３ｂｐ）を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ消化によって、ｐＣＡＺ３から切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端化し、そしてｐＡｘ３−ＦＺ３３のＳｗａＩ部位にライゲーションし、コスミドｐＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３を得た。左側方向プラスミドｐＡｘ３ＣＡＺ３（Ｌ）−ＦＺ３３（ここで、ｌａｃＺ遺伝子を駆動するプロモーターは、Ｅ１Ａプロモーターに対して反対向きである）を、アデノウイルス産生のために使用した。 f. pAx3CAZ3-FZ33 Plasmid Construction Plasmid pCAZ3 (where the lacZ gene is driven by the CA promoter (cytomegalovirus enhancer with chicken β-actin promoter)) (Nakamura et al. 2002 (supra)). The β-galactosidase expression cassette (CAZ3, 5153 bp) was excised from pCAZ3 by BamHI / BglII digestion, blunted with T4 DNA polymerase, and ligated into the SwaI site of pAx3-FZ33, resulting in cosmid pAx3CAZ3-FZ33. The left-handed plasmid pAx3CAZ3 (L) -FZ33 (where the promoter driving the lacZ gene is opposite to the E1A promoter) was used for adenovirus production.

ｇ．ｐＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３プラスミド構築
プラスミドｐＣＡＵＰ（大腸菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴａｓｅ）遺伝子は、ＣＡプロモーターによって駆動される）を作製した（Ｋａｎａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）。ＵＰＲＴ遺伝子発現カセット（ＣＡＵＰ、２．８ｋｂｐ）を、ＳａｌＩ／ＨｉｎｄｌＩＩ消化によってｐＣＡＵＰから切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端化し、そしてｐＡｘ３−ＦＺ３３のＳｗａＩ部位にライゲーションし、コスミドｐＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を得た。左側方向のプラスミドｐＡｘ３ＣＡＵＰ（Ｌ）−ＦＺ３３（ＵＰＲＴａｓｅを駆動するプロモーターは、Ｅ１Ａプロモーターに関して反対方向に向いている）を、アデノウイルス産生のために使用した。 g. Construction of plasmid pAx3CAUP-FZ33 Plasmid pCAUP (E. coli uracil phosphoribosyltransferase (UPRTase) gene is driven by the CA promoter) was prepared (Kanai et al. Cancer Res.). The UPRT gene expression cassette (CAUP, 2.8 kbp) was excised from pCAUP by SalI / HindlII digestion, blunted with T4 DNA polymerase, and ligated into the SwaI site of pAx3-FZ33, resulting in cosmid pAx3CAUP-FZ33. The left-handed plasmid pAx3CAUP (L) -FZ33 (the promoter driving UPRTase is oriented in the opposite direction with respect to the E1A promoter) was used for adenovirus production.

組換えアデノウイルスの作製のために、各コスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したリポフェクションによって２９３細胞中へトランスフェクトした。トランスフェクトした２９３細胞から生じるプラークを単離し、そしてウイルスゲノムの制限酵素消化および発現ユニットの配列決定によって評価した。得られたアデノウイルスベクターを、２９３細胞中で拡大し、そして塩化セシウム超遠心分離によって精製した。精製したウイルスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で、１０％グリセロールとともに透析し、そして−７０℃で使用するまで保存した。ウイルス濃度（ｖｐ／ｍｌ）を決定するために、ウイルス溶液を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中にインキュベートし、そしてＡ２６０で測定した。濃度をｖｐ／ｍｌ＝Ａ２６０×（１．１×１０１２）として規定した。使用前に、ウイルスストックへのレプリコンコンピテントウイルスの混入を、Ｅ１Ａに特異的なプライマー：フォワードプライマー：５’−ＡＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号１５）、リバースプライマー：５’−ＣＣＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＧＣＣＡＴＧＣＡ−３’（配列番号１６）、Ｅ１Ｂに特異的なプライマー：フォワードプライマー：５’−ＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１７）、リバースプライマー：５’−ＧＴＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＣＴＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号１８）、およびＥ２Ｂ（陽性コントロール）に特異的なプライマー：フォワードプライマー：５’−ＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号１９）、リバースプライマー：５’−ＣＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＴＧＧ−３’（配列番号２０）を使用したＰＣＲ分析によって排除した。図３は、このようにして作製したＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスのファイバー部分の構造の模式図である。 For the production of recombinant adenovirus, each cosmid was transfected into 293 cells by lipofection using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen). Plaques arising from transfected 293 cells were isolated and evaluated by restriction enzyme digestion of the viral genome and sequencing of the expression unit. The resulting adenoviral vector was expanded in 293 cells and purified by cesium chloride ultracentrifugation. Purified virus was dialyzed with 10% glycerol in phosphate buffered saline (PBS) and stored at −70 ° C. until use. To determine the virus concentration (vp / ml), the virus solution was incubated in 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) and measured at A260. The concentration was defined as vp / ml = A260 × (1.1 × 10 12 ). Prior to use, contamination of the replicon-competent virus into the virus stock was carried out using a primer specific for E1A: forward primer: 5′-ATTACCGAAGAAATGGCCGC-3 ′ (SEQ ID NO: 15), reverse primer: 5′-CCCATTAACACGCCCCATCA-3 ′ ( SEQ ID NO: 16), E1B specific primer: forward primer: 5′-CGCCGTCGTTGCTTTTTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 17), reverse primer: 5′-GTATTCTCATCGCTAGAGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 18), and E2B (positive control) Specific primer: forward primer: 5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3 '(SEQ ID NO: 19), reverse primer: 5'-CATCTGAAC CAAAGCGTGG-3 'was eliminated by PCR analysis using (SEQ ID NO: 20). FIG. 3 is a schematic diagram of the structure of the fiber portion of the Z33 fiber mutant adenovirus thus prepared.

1.4. 完全ヒト型ＣＥＡ抗体
本発明では、Ｃ２−４５クローン（ＩｇＧ４κ）を、完全ヒト型抗ＣＥＡモノクローナル抗体として使用した。抗ＣＥＡヒトモノクローナル抗体の調製を、以前に記載されたように行った（Ｉｍａｋｉｉｒｅ， Ｔ．，ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， １０８： ５６４−５７０， ２００４；Ｓｈｉｂａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２４：３３５５−３３６０，２００４）。簡単に説明すると、大腸癌由来の精製したＣＥＡで免疫したＫＭマウスの脾細胞を、Ｐ３−Ｕ１マウスミエローマ細胞と融合させた。ＣＥＡ反応性クローンを選択し、プロテインＧカラムを使用して精製した。抗ＣＥＡヒトモノクローナル抗体のＣＥＡＣＡＭとの交差反応性（表１を参照）、抗体のＣＥＡ抗原との親和性（表２を参照）、および抗体に対するＣＥＡ上のエピトープを、それぞれ分析した。
表１から明らかなように、Ｃ２−４５クローンは、正常組織にも発現しているＣＥＡファミリーであるＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ１、またはＣＥＡＣＡＭ８とは結合せず、ＣＥＡに特異的に結合することが示された。
表２から明らかなように、Ｃ２−４５クローンは、ＣＥＡ抗原に対して高い親和性を有することが示された。 1.4. Completely human CEA antibody In the present invention, C2-45 clone (IgG 4 κ) was used as a fully human anti-CEA monoclonal antibody. Anti-CEA human monoclonal antibodies were prepared as previously described (Imakire, T., et al., Int J Cancer, 108: 564-570, 2004; Shibauchi et al., Anticancer Res., 24 : 3355-3360, 2004). Briefly, spleen cells of KM mice immunized with purified CEA derived from colon cancer were fused with P3-U1 mouse myeloma cells. CEA reactive clones were selected and purified using a protein G column. The cross-reactivity of the anti-CEA human monoclonal antibody with CEACAM (see Table 1), the affinity of the antibody with the CEA antigen (see Table 2), and the epitope on CEA for the antibody were each analyzed.
As is apparent from Table 1, the C2-45 clone did not bind to CEACAM6, CEACAM1, or CEACAM8, which are CEA families expressed in normal tissues, and was shown to specifically bind to CEA. .
As is clear from Table 2, the C2-45 clone was shown to have a high affinity for the CEA antigen.

1.5. ＣＥＡ、ＣＡＲ、およびインテグリンの細胞表面上での発現
腹水液として調製したマウス抗ヒトＣＡＲモノクローナル抗体、ＲｍｃＢは、Ｄｒ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ（ｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から提供された。抗αＶβ３ｍＡｂ ＭＡＢ１９６１、抗αｖβ５ ＭＡＢ１９７６を、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から購入した。ヒト細胞株でのヒトＣＥＡの発現を、Ｃ２−４５によって分析した。コントロールヒトＩｇＧ４を、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ＬＴＤ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から購入した。コントロールマウスＩｇＧおよびＦＩＴＣを結合させた抗マウスＩｇＧを、ＳｉｇｍａおよびＤａｋｏ Ｊａｐａｎ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）からそれぞれ購入した。培養細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．５％）（Ｓｉｇｍａ）を５分間用いて回収した。脱着した細胞を遠心分離し、そして２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１０５細胞／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳ中で再懸濁した。次いで、細胞をＲｍｃＢ、または１０μｇ／ｍＬ Ｃ２−４５または１０μｇ／ｍＬ 抗インテグリン抗体（ＭＡＢ１９６１、ＭＡＢ１９７６）とともに１時間氷上でインキュベートした。続いて、その細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合体化ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ）とともに、３０分間氷上で暗所でインキュベートした。２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中で洗浄後、その細胞を５００μＬの２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中で再懸濁した。分析を、ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行った。 1.5. Expression on the cell surface of CEA, CAR, and integrin A mouse anti-human CAR monoclonal antibody, RmcB, prepared as ascites fluid was provided by Dr Jeffrey Bergelson (the Children's Hospital of Philadelphia, Philadelphia, PA). . Anti-αVβ3 mAb MAB1961 and anti-αvβ5 MAB1976 were purchased from Chemicon International (Temecula, CA). Human CEA expression in human cell lines was analyzed by C2-45. Control human IgG 4 was purchased from The Binding Site LTD (Birmingham, UK). Control mouse IgG and anti-mouse IgG conjugated with FITC were purchased from Sigma and Dako Japan (Kyoto, Japan), respectively. Cultured cells were harvested using trypsin-EDTA solution (0.5%) (Sigma) for 5 minutes. Desorbed cells were centrifuged and resuspended in PBS containing 2% bovine serum albumin (BSA) at a concentration of 10 5 cells / mL. Cells were then incubated for 1 hour on ice with RmcB, or 10 μg / mL C2-45 or 10 μg / mL anti-integrin antibodies (MAB1961, MAB1976). Subsequently, the cells were washed and incubated with FITC-conjugated rabbit anti-mouse IgG (Dako) for 30 minutes on ice in the dark. After washing in 2% BSA / PBS, the cells were resuspended in 500 μL 2% BSA / PBS. Analysis was performed with a FACS caliber (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

1.6. インビトロでの遺伝子導入効率
抗ヒトＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｘ３ＣＡＥＧＦＰＦＺ３３に感染させたＣＥＡ陽性および陰性細胞の遺伝子導入効率を、ＦＡＣＳ分析によって評価した。ＥＧＦＰ遺伝子の遺伝子導入を、以下の方法にしたがって行った。ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７４およびＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞を、アデノウイルスベクターでの感染の１日前に、２×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレート中に播種した。細胞を、３μｇ／ｍｌの抗体（Ｃ２−４５またはコントロールヒトＩｇＧ４）を含有する無血清培地、または抗体を含まない無血清培地で、３７℃、５％ ＣＯ２で１時間処理した。インキュベーションの後、これらの細胞を無血清培地で洗浄し、次いで、細胞をＡｘ３ＣＡＥＧＦＰＦＺ３３（０〜１，０００ウイルス粒子／細胞）を含有する１ｍｌの無血清培地で３７℃、５％ＣＯ２中で１時間感染させた。インキュベーションの後、これらの細胞を、無血清培地で２回洗浄し、次いで、細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間培養した。抗体と結合させたまたはさせていないＡｄｖの遺伝子導入効率を、ＣＥＡ陽性または陰性細胞株および正常肝細胞を感染させることによって比較した。ＧＦＰ活性をＦＡＣＳcａｌｉｂｅｒによって測定した。 1.6. In vitro gene transfer efficiency The gene transfer efficiency of CEA positive and negative cells infected with Ax3CAEGFPFZ33 conjugated with anti-human CEA mAb was evaluated by FACS analysis. EGFP gene introduction was performed according to the following method. MKN-45, MKN-74 and Chang-liver cells were seeded in 6-well plates at 2 × 10 5 cells / well one day prior to infection with adenoviral vectors. Cells were treated with serum-free medium containing 3 μg / ml antibody (C2-45 or control human IgG 4 ) or serum-free medium without antibody for 1 hour at 37 ° C., 5% CO 2 . After incubation, these cells were washed with serum-free medium, then the cells were washed with 1 ml serum-free medium containing Ax3CAEGFPFZ33 (0-1,000 virus particles / cell) at 37 ° C., 5% CO 2. Infected for hours. After incubation, the cells were washed twice with serum-free medium and then the cells were cultured for 24 hours in RPMI-1640 containing 10% FBS. The gene transfer efficiency of Adv with or without antibody binding was compared by infecting CEA positive or negative cell lines and normal hepatocytes. GFP activity was measured by FACScaliber.

1.7. インビトロでのトランスジーン発現
抗ヒトＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３で感染させたＣＥＡ陽性および陰性細胞のトランスジーン発現量を、化学発光レポーター遺伝子アッセイによって評価した。ＬａｃＺ遺伝子の遺伝子導入を、以下の方法に従って行った。ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７４およびＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞を、アデノウイルスベクターでの感染の１日前に１×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。細胞を、３μｇ／ｍｌの抗体（Ｃ２−４５またはコントロールヒトＩｇＧ４）を含有するか、または抗体を含有しない無血清培地で、３７℃、５％ ＣＯ２中で、１時間処理した。インキュベーションの後、これらの細胞を無血清培地で洗浄し、次いで細胞を、Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３（０〜１，０００ウイルス粒子／細胞）を含有する１００μＬの無血清培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２中で、１時間感染させた。インキュベーションの後、これらの細胞を無血清培地で２回洗浄し、次いで、細胞を１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間培養した。抗体と結合させたかまたは結合させていないＡｄｖのトランスジーン発現を、ＣＥＡ陽性または陰性細胞株および正常肝細胞を感染させることによって比較した。ＬａｃＺ活性をｂ−ｇａｌレポーター遺伝子アッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって測定した。 1.7. Transgene expression in vitro Transgene expression levels of CEA positive and negative cells infected with Ax3CAZ3-FZ33 conjugated with anti-human CEA mAb were evaluated by chemiluminescent reporter gene assay. Gene transfer of the LacZ gene was performed according to the following method. MKN-45, MKN-74 and Chang-liver cells were seeded in 96-well plates at 1 × 10 4 cells / well one day prior to infection with adenoviral vectors. Cells were treated with serum-free medium containing 3 μg / ml antibody (C2-45 or control human IgG 4 ) or no antibody at 37 ° C., 5% CO 2 for 1 hour. After incubation, these cells were washed with serum-free medium, and then the cells were washed at 37 ° C., 5% with 100 μL of serum-free medium containing Ax3CAZ3-FZ33 (0-1,000 virus particles / cell). Infected in CO 2 for 1 hour. After incubation, these cells were washed twice with serum-free medium and then the cells were cultured for 24 hours in RPMI-1640 containing 10% FBS. Transgene expression of Adv with or without antibody binding was compared by infecting CEA positive or negative cell lines and normal hepatocytes. LacZ activity was measured by b-gal reporter gene assay (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN).

1.8. インビトロでの５−ＦＵの感受性
抗ヒトＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｘ３ＣＡＵＰＦＺ３３に感染させたＣＥＡ陽性および陰性細胞の５−ＦＵ感受性を、ＭＴＴアッセイによって評価した。大腸菌ＵＰＲＴ遺伝子の遺伝子導入を、以下の方法に従って行った。ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７４、およびＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞を、５×１０４細胞／ウェルで、アデノウイルスベクターでの感染の１日前に、２４ウェルプレートに播種した。細胞を、３μｇ／ｍｌの抗体（Ｃ２−４５またはコントロールヒトＩｇＧ４）を含有するか、または抗体を含有しない無血清培地で、３７℃、５％ＣＯ２中で、１時間処理した。インキュベーション後、これらの細胞を、無血清培地で洗浄し、次いで、細胞を、Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を含有する２００μＬの無血清培地（０〜１００ウイルス粒子／細胞）に、３７℃、５％ＣＯ２中で、１時間感染させた。インキュベーション後、これらの細胞を無血清培地で２回洗浄し、次いで、細胞を、５ＦＵ（０〜１００μＭ）を含有する１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、４日間培養した。抗体を結合させたＡｄｖまたは抗体を結合させていないＡｄｖの５−ＦＵ感受性を、ＣＥＡ陽性または陰性細胞株および正常肝細胞を感染させることによって比較した。細胞生存を、ＭＴＴアッセイによって評価した。 1.8. Sensitivity of 5-FU in vitro The 5-FU sensitivity of CEA positive and negative cells infected with Ax3CAUPFZ33 conjugated with anti-human CEA mAb was assessed by MTT assay. E. coli UPRT gene was introduced according to the following method. MKN-45, MKN-74, and Chang-liver cells were seeded at 5 × 10 4 cells / well in 24-well plates one day prior to infection with the adenoviral vector. Cells were treated with serum-free medium containing 3 μg / ml antibody (C2-45 or control human IgG 4 ) or no antibody for 1 hour at 37 ° C., 5% CO 2 . After incubation, the cells are washed with serum free medium, then the cells are placed in 200 μL of serum free medium (0-100 virus particles / cell) containing Ax3CAUP-FZ33 at 37 ° C., 5% CO 2 . And infected for 1 hour. After incubation, the cells were washed twice with serum-free medium and then the cells were cultured for 4 days in 10% FBS RPMI-1640 medium containing 5FU (0-100 μM). The 5-FU sensitivity of Adv with or without antibody was compared by infecting CEA positive or negative cell lines and normal hepatocytes. Cell survival was assessed by MTT assay.

1.9. 抗ＣＥＡ ｍＡｂと結合させたＡｄｖ−ＦＺ３３を仲介させたインビボｌａｃＺ発現
インビボでの播種性胃癌における、抗ＣＥＡ ｍＡｂと結合させたＺ３３を仲介する遺伝子の遺伝子導入の能力および選択性を評価するために、メス胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ）をＪａｐａｎ ＳＬＧから入手した。これらは、各実験の開始時に４週齢であった。ＰＢＳ中で再懸濁した新たに回収した１×１０７個のＭＫＮ−４５の細胞を、腹腔中へ接種した。次に、異種移植の１０日後に、３μｇ／ｍｌの抗体（Ｃ２−４５またはコントロールヒトＩｇＧ４）を含有するか、または抗体を含有しない無血清培地と結合体化させたＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３（５×１０９ウイルス粒子／動物）を、ウイルスベクター投与の４日後にマウスの腹腔内に投与し、マウスを屠殺し、そして４％パラホルムアルデニドを１５分間全身灌流させることによって固定した。βガラクトシダーゼの発現を検出するために、腹腔をＸ−ｇａｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２中、１ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および４ｍＭ フェリシアン化カリウム）で４時間染色した。 1.9. In vivo lacZ expression mediated by Adv-FZ33 conjugated to anti-CEA mAb To evaluate the ability and selectivity of gene transfer of Z33-mediated genes conjugated to anti-CEA mAb in disseminated gastric cancer in vivo For this purpose, female athymic nude mice (BALB / c nu / nu) were obtained from Japan SLG. These were 4 weeks old at the start of each experiment. Freshly collected 1 × 10 7 MKN-45 cells resuspended in PBS were inoculated into the peritoneal cavity. Next, 10 days after xenotransplantation, Ax3CAZ3-FZ33 (5 ×) containing 3 μg / ml antibody (C2-45 or control human IgG 4 ) or conjugated to serum-free medium containing no antibody. 10 9 virus particles / animal) were administered intraperitoneally 4 days after viral vector administration, the mice were sacrificed and fixed by perfusion of 4% paraformaldehyde for 15 minutes. To detect the expression of β-galactosidase, the peritoneal cavity was subjected to 1 mg / ml X-gal, 2 mM MgCl 2 , and 4 mM potassium ferricyanide in X-gal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) solution (PBS, pH 7.2). ) For 4 hours.

1.10. マウスモデルにおける腹膜播種性胃癌のための、抗ＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｄｖ−ＦＺ３３を仲介する遺伝子治療
樹立された腫瘍に対する、抗ＣＥＡ ｍＡｂを結合したＡｄｖ−ＦＺ３３を仲介させた腫瘍特異的遺伝子治療のインビボでの効力を評価するために、全ての動物実験を札幌医科大学によって確立されたガイドラインの下に行った。雄胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ）を、Ｊａｐａｎ ＳＬＧから購入した。ＭＫＮ ４５細胞（１×１０７細胞／マウス）の腹腔内注射を受けたマウスを、無作為に、処置計画にしたがって以下の５つのグループに分けた。（ａ）３０μｇのＣ２−４５を含有するＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３、続いて５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）処置（ｎ＝３）；（ｂ）３０μｇのコントロールＩｇＧ４を含有するＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３、続いて５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝３）；（ｃ）抗体を含まないＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３、続いて５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝３）；（ｄ）ＰＢＳ、続いて５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝３）；（ｅ）処置無し（ｎ＝３）。総容量３００μｌのアデノウイルスベクター（５×１０９ＶＰ）を、腫瘍移植の４日後にマウスの腹腔内に注射した。次の日から、５−ＦＵまたはＰＢＳを、毎日５日間腹腔内投与した。このプロトコルを、２コース連続的に行った。動物を腫瘍移植の１８日後に屠殺し、その後、各動物の腹腔播種性塊を回収し、重量を測定した。 1.10. Anti-CEA mAb-conjugated Adv-FZ33-mediated tumor-specific tumor-specific tumors for anti-CEA mAb-conjugated Adv-FZ33-mediated tumor-specific tumors for peritoneal disseminated gastric cancer in a mouse model In order to evaluate the in vivo efficacy of gene therapy, all animal experiments were performed under the guidelines established by Sapporo Medical University. Male athymic nude mice (BALB / c nu / nu) were purchased from Japan SLG. Mice that received intraperitoneal injections of MKN 45 cells (1 × 10 7 cells / mouse) were randomly divided into the following five groups according to the treatment plan. (A) Ax3CAUP-FZ33 containing 30 μg C2-45 followed by 5-FU (10 mg / kg) treatment (n = 3); (b) Ax3CAUP-FZ33 containing 30 μg control IgG 4 followed by 5 -FU (10 mg / kg) (n = 3); (c) Ax3CAUP-FZ33 without antibody followed by 5-FU (10 mg / kg) (n = 3); (d) PBS followed by 5-FU (10 mg / kg) (n = 3); (e) No treatment (n = 3). A total volume of 300 μl of adenoviral vector (5 × 10 9 VP) was injected intraperitoneally into mice 4 days after tumor implantation. From the next day, 5-FU or PBS was intraperitoneally administered daily for 5 days. This protocol was performed continuously for two courses. The animals were sacrificed 18 days after tumor implantation, after which the peritoneal disseminated mass of each animal was collected and weighed.

２．結果
2.1. ＣＥＡ陽性または陰性細胞株におけるＣＡＲおよびインテグリンの発現
本発明者らは、まず、胃癌細胞および正常肝細胞株におけるＣＥＡの発現を調べた。何人かの研究者が、ＭＫＮ−４５はＣＥＡを豊富に産生するが、ＭＫＮ−７４のＣＥＡ産生はほとんどないことを報告している（Ｐｒａｎａｙ Ｄ． ｅｔ ａｌ， Ｃａｎ． Ｒｅｓ．， ６１： ３７０-３７５，２００１； ＫＥＮＧ-ＨＳＩＮ ＬＡＮ． ｅｔ ａｌ， ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ．， １１１：１２４１−１２５１，１９９６）。 2. result
2.1. CAR and integrin expression in CEA positive or negative cell lines We first examined CEA expression in gastric cancer cells and normal hepatocyte cell lines. Several investigators have reported that MKN-45 produces abundant CEA, but there is little CEA production of MKN-74 (Planay D. et al, Can. Res., 61: 370- 375, 2001; KENG-HSIN LAN. Et al, GASTROENTROLOGY., 111: 1241-1251, 1996).

図５は、ヒト培養細胞株におけるＣＥＡおよびアデノウイルスエントリーレセプターの発現を示す。図５に示されるように、ＣＥＡは、ＭＫＮ−４５（ＣＥＡ陽性胃癌細胞株）において発現されるが（図５Ａ）、ＭＫＮ−７４（ＣＥＡ陰性胃癌細胞株）またはＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞株（正常肝細胞株）においては発現されない（図５Ｂ）。   FIG. 5 shows CEA and adenovirus entry receptor expression in human cell lines. As shown in FIG. 5, CEA is expressed in MKN-45 (CEA positive gastric cancer cell line) (FIG. 5A), but MKN-74 (CEA negative gastric cancer cell line) or Chang-liver cell line (normal liver). In cell lines) (FIG. 5B).

次に、一次のアデノウイルスレセプターであるＣＡＲ、および二次のアデノウイルスレセプターであるインテグリンαｖβ３およびαｖβ５の発現もまた、ＦＡＣＳにより分析した。その結果もまた、図５に示す。図５に示す結果は、癌細胞および正常細胞が、明らかにＣＡＲおよび両方のインテグリンを発現することを実証した。したがって、これらのデータは、ヒト細胞株におけるＣＡＲまたはインテグリンの発現が、癌遺伝子治療のための特異的な標的ではないことを示唆する。   Next, the expression of the primary adenovirus receptor CAR and the secondary adenovirus receptors integrins αvβ3 and αvβ5 were also analyzed by FACS. The results are also shown in FIG. The results shown in FIG. 5 demonstrated that cancer cells and normal cells clearly express CAR and both integrins. Thus, these data suggest that CAR or integrin expression in human cell lines is not a specific target for cancer gene therapy.

2.2. インビトロでのＣＥＡ陽性細胞に対する遺伝子導入効率の改善
本発明者らは、ファイバードメイン中にＩｇＧ結合配列を担持し、そしてＥＧＦＰ遺伝子をコードする遺伝的に改変したＡｄｖ（Ａｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３）を使用して、ヒトＣＥＡ陽性または陰性細胞株における遺伝子導入効率を評価した。これらの研究において、Ｃ２−４５ウイルスコントロールＩｇＧ４との直接比較を行った。 2.2. Improving gene transfer efficiency for CEA positive cells in vitro We use genetically modified Adv (Ax3CAEGFP-FZ33) carrying an IgG binding sequence in the fiber domain and encoding the EGFP gene Then, gene transfer efficiency in human CEA positive or negative cell lines was evaluated. In these studies, it was directly compared with C2-45 virus control IgG 4.

図６は、ＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子導入効率の比較をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いて行った結果を示すグラフである。Ａｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３のＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞およびＭＫＮ−７４細胞への適用は、Ｃ２−４５を用いた遺伝子導入効率が、コントロール抗体を用いたものと同等であるという結果をもたらした（図６ＡおよびＢ）。次いで、本発明者らは、ＭＫＮ−４５細胞上でＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を試験した。ＣＥＡ陰性細胞とは対照的に、顕著に、Ｃ２−４５を用いた遺伝子導入効率は、コントロール抗体と比較して有意に増大した（図６Ｃ）。特に、ＶＰ１０に感染させたＭＫＮ−４５細胞は、遺伝子移入において１５．２倍の増強を示した。他方、ＶＰ１０００に感染させたアデノウイルスベクターである、Ｃ２−４５結合体化アデノウイルスベクターは、９１％のトランスフェクションを誘導した。これらの結果は、抗ＣＥＡ抗体を結合させたＺ３３アデノウイルスベクターが、ＣＥＡ陽性細胞に対するアデノウイルスにより仲介される遺伝子導入の効率を増強することができることを実証した。   FIG. 6 is a graph showing the results of comparison of gene transfer efficiency between CEA antigen positive and negative strains using FACS caliber. Application of Ax3CAEGFP-FZ33 to Chang-liver and MKN-74 cells resulted in gene transfer efficiency using C2-45 comparable to that using control antibody (FIGS. 6A and B). . The inventors then tested Ax3CAEGFP-FZ33 on MKN-45 cells. In contrast to CEA negative cells, the gene transfer efficiency with C2-45 was significantly increased compared to the control antibody (FIG. 6C). In particular, MKN-45 cells infected with VP10 showed a 15.2 fold enhancement in gene transfer. On the other hand, the C2-45 conjugated adenoviral vector, an adenoviral vector infected with VP1000, induced 91% transfection. These results demonstrated that a Z33 adenoviral vector conjugated with an anti-CEA antibody can enhance the efficiency of adenovirus-mediated gene transfer to CEA positive cells.

2.3. インビトロでのＣＥＡ陽性細胞に対するトランスジーン発現の改善
次に、本発明者らは、ファイバードメインにＩｇＧ結合配列を担持し、ｌａｃＺ遺伝子（Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３）をコードする遺伝的に改変したＡｄｖを用いて、ヒトＣＥＡ陽性または陰性細胞株におけるトランスジーン発現を評価した。Ｃ２−４５ウイルスコントロールＩｇＧ４を用いてこれらの研究において、直接比較を行った。 2.3. Improving transgene expression on CEA-positive cells in vitro Next, we have genetically modified Adv carrying an IgG binding sequence in the fiber domain and encoding the lacZ gene (Ax3CAZ3-FZ33). Used to evaluate transgene expression in human CEA positive or negative cell lines. In these studies with C2-45 virus control IgG 4, it was compared directly.

図７は、ＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子発現量の比較を化学発光β−ｇａｌレポーター遺伝子アッセイを用いて行った結果を示すグラフである。Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３のＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞（図７Ａ）およびＭＫＮ−７４細胞（図７Ｂ）への適用により、Ｃ２−４５でのトランスジーン発現が、コントロール抗体または抗体なしの場合と同等であるという結果を得た。次に、本発明者らは、ＭＫＮ−４５細胞においてＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を試験した。図７Ｃに示されるように、ＣＥＡ陰性細胞とは対照的に、コントロール抗体または抗体なしの場合と比較して、Ｃ２−４５での遺伝子発現は有意に増大した。特に、ＶＰ１，０００に感染させたＭＫＮ−４５細胞は、ｌａｃＺ発現の２０倍の増強を示した。これらの結果は、抗ＣＥＡ抗体と結合させたＡｄｖ−ＦＺ３３アデノウイルスベクターが、ＣＥＡ陽性細胞に対するアデノウイルス仲介遺伝子発現を増強し得ることを実証した。   FIG. 7 is a graph showing the results of comparison of gene expression levels in CEA antigen positive and negative strains using a chemiluminescent β-gal reporter gene assay. Application of Ax3CAZ3-FZ33 to Chang-liver cells (FIG. 7A) and MKN-74 cells (FIG. 7B) shows that transgene expression at C2-45 is equivalent to that without control antibody or antibody. Obtained. Next, we tested Ax3CAEGFP-FZ33 in MKN-45 cells. As shown in FIG. 7C, in contrast to CEA negative cells, gene expression at C2-45 was significantly increased compared to control antibody or no antibody. In particular, MKN-45 cells infected with VP1,000 showed a 20-fold enhancement of lacZ expression. These results demonstrated that the Adv-FZ33 adenoviral vector conjugated with anti-CEA antibody can enhance adenovirus-mediated gene expression on CEA positive cells.

2.4. 抗ＣＥＡ抗体と結合体化したＡｄｖ−ＦＺ３３により仲介されるＵＰＲＴ遺伝子の遺伝子導入は、インビトロでＣＥＡ陽性細胞における５−ＦＵに対して感作する
さらに、本発明者らは、ファイバードメインにＩｇＧ結合配列を担持し、ＵＰＲＴ遺伝子をコードする遺伝的に改変したＡｄｖ（Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３）を使用して、ヒトＣＥＡ陽性または陰性細胞株において５−ＦＵに対する感受性を、ＭＴＴアッセイによって評価した。大腸菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴ）は、ウラシルおよびホスホリボシルピロホスフェート（ＰＲＰＰ）からの、ピリミジンヌクレオチドの前駆体であるＵＭＰの合成を触媒するピリミジン再利用酵素である。ＵＰＲＴ遺伝子の遺伝子導入は、癌細胞耐性５−ＦＵの感受性を改善する。 2.4. Gene transfer of UPRT gene mediated by Adv-FZ33 conjugated with anti-CEA antibody sensitizes to 5-FU in CEA positive cells in vitro . Using genetically modified Adv (Ax3CAUP-FZ33) carrying an IgG binding sequence and encoding the UPRT gene, susceptibility to 5-FU in human CEA positive or negative cell lines was assessed by MTT assay. E. coli uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) is a pyrimidine recycling enzyme that catalyzes the synthesis of UMP, a precursor of pyrimidine nucleotides, from uracil and phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP). Gene transfer of the UPRT gene improves the sensitivity of cancer cell resistant 5-FU.

図８は、インビトロでＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を用いた遺伝子導入後の５−ＦＵに対する細胞株の感受性を示すＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。抗体を含まないＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３によって遺伝子導入された全ての細胞株は、５−ＦＵに対するウイルス粒子依存性の感受性増加を示した。Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３のＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞およびＭＫＮ−７４細胞への適用は、５−ＦＵ感受性を生じ、Ｃ２−４５は、コントロール抗体または抗体無しの場合と同等であった（図８ＡおよびＢ）。本発明者らは、次に、Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３のＭＫＮ−４５細胞に対する効果を試験した。ＣＥＡ陰性細胞とは対照的に、Ｃ２−４５を有するＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３は、有意に、５−ＦＵに対する細胞の感受性を１００倍まで増大させた（Ｃ２−４５でＩＣ２０、０．２μＭに対して、ＩｇＧ４コントロール抗体で２０μＭ）（図８Ｃ）。これらの結果は、抗ＣＥＡ抗体と結合させたＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３が、ＣＥＡ陽性細胞において、５−ＦＵに対する感受性を増強させ得ることを実証した。 FIG. 8 is a graph showing the results of an MTT assay showing the sensitivity of a cell line to 5-FU after gene introduction using Ax3CAUP-FZ33 in vitro. All cell lines transfected with Ax3CAUP-FZ33 without antibody showed virion-dependent increased sensitivity to 5-FU. Application of Ax3CAUP-FZ33 to Chang-liver and MKN-74 cells resulted in 5-FU sensitivity, and C2-45 was comparable to that without control antibody or antibody (FIGS. 8A and B). We next tested the effect of Ax3CAUP-FZ33 on MKN-45 cells. In contrast to CEA negative cells, Ax3CAUP-FZ33 with C2-45 significantly increased the sensitivity of the cells to 5-FU up to 100-fold (for C2-45 IC 20 , 0.2 μM) , 20 μM with IgG4 control antibody) (FIG. 8C). These results demonstrated that Ax3CAUP-FZ33 conjugated with anti-CEA antibody can enhance sensitivity to 5-FU in CEA positive cells.

2.5. マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いたＡｄｖ−ＦＺ３３による遺伝子導入効率の比較
本発明者らはまた、各種マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いて、Ａｄｖ−ＦＺ３３による遺伝子導入効率の比較を行った。手順を以下に説明する。 2.5. Comparison of gene transfer efficiency by Adv-FZ33 using mouse anti-CEA monoclonal antibody The present inventors also compared gene transfer efficiency by Adv-FZ33 using various mouse anti-CEA monoclonal antibodies. The procedure is described below.

感染の１日前（Ｄａｙ −１）に、ＭＫＮ−４５細胞株を６ウェルプレートに、１×１０５細胞／ウェルで播種した。Ｄａｙ ０において、Ｄｒ．Ｋｕｒｏｋｉ（Fukuoka Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から提供されたか、または市販の各種マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を、無血清ＲＰＭＩ−１６４０中に３μｇ／ｍｌの濃度で調節し、１０００μｌの容量で各種細胞に添加した。陽性コントロールとして、ヒト型抗ＣＥＡ抗体であるＣ２−４５を使用した。Ｉｓｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして、それぞれ、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｃｌｏｎｅ Ｐ３）、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｃｌｏｎｅ ｅＢＭ２ａ）、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｃｌｏｎｅ ｅＢＭＧ２ｂ）、およびＭｏｕｓｅ ＩｇＧ３（ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｃａｔ Ｎｏ ５５３４８４）を使用した。抗体を添加後、１０００μｌの無血清ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した。次いで、無血清ＲＰＭＩ−１６４０にてＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を１０００ＶＰ／細胞の濃度に希釈し、１０００μｌの容量で各種細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって感染させた。インキュベーション後、１０００μｌの無血清ＰＲＭＩ−１６４０にて２回洗浄し、さらに１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間培養した。Ｄａｙ １において、ＧＦＰ活性をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒによって測定した。 One day before infection (Day-1), the MKN-45 cell line was seeded in 6-well plates at 1 × 10 5 cells / well. In Day 0, Dr. Various mouse anti-CEA monoclonal antibodies provided by Kuroki (Fukuoka University) or commercially available were adjusted to a concentration of 3 μg / ml in serum-free RPMI-1640 and added to various cells in a volume of 1000 μl. As a positive control, C2-45, a human anti-CEA antibody, was used. As the Itype control, Mouse IgG1 (eBioscience, clone P3), Mouse IgG2a (eBioscience, clone eBM2a), Mouse IgG2b (eBioscience, clone eBMG2b), and Mouse 34, Mouse34, and M34, respectively. After the antibody was added, it was washed twice with 1000 μl of serum-free RPMI-1640. Next, Ax3CAEGFP-FZ33 was diluted with serum-free RPMI-1640 to a concentration of 1000 VP / cell, added to various cells in a volume of 1000 μl, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After incubation, the cells were washed twice with 1000 μl of serum-free PRMI-1640 and further cultured in RPMI-1640 supplemented with 10% FBS for 24 hours. In Day 1, GFP activity was measured by FACS caliber.

図９は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒの測定結果を示すグラフである。マウス抗ＣＥＡ抗体やキメラ方抗体、でもコントロールに比し、いずれも遺伝子導入効率を上昇させる事が出来た。中でもＣ２−４５は、他のマウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体と比較してＥＧＦＰ遺伝子の導入効率が高いことが示された。   FIG. 9 is a graph showing the measurement results of FACScaliber. Both mouse anti-CEA antibody and chimeric antibody were able to increase gene transfer efficiency compared to control. Among these, C2-45 was shown to have higher EGFP gene introduction efficiency than other mouse anti-CEA monoclonal antibodies.

図９に示す結果はまた、このようにファイバードメイン中にＩｇＧ結合配列を担持し、ＥＧＦＰ遺伝子のようなマーカー遺伝子をコードする遺伝的に改変したＡｄｖ（Ａｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３）を用いて、ヒトＣＥＡ抗原陽性細胞株において遺伝子導入効率の比較を行うことによって、ヒトＣＥＡ抗原に対して特異的に結合し、Ａｄｖの導入効率を改善することができる抗ＣＥＡモノクローナル抗体を同定することができることも実証する。   The results shown in FIG. 9 also show that using a genetically modified Adv (Ax3CAEGFP-FZ33) carrying an IgG binding sequence in the fiber domain and encoding a marker gene such as the EGFP gene, the human CEA antigen It is also demonstrated that by comparing gene transfer efficiency in positive cell lines, anti-CEA monoclonal antibodies that can specifically bind to human CEA antigen and improve Adv transfer efficiency can be identified.

なお、図９に結果を示す実験で使用したマウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、以下の通りである。
１． Ｆ３３−１０４（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG1 (k)
Affinity constant: 3.5 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0 The mouse anti-CEA monoclonal antibody used in the experiment whose result is shown in FIG. 9 is as follows.
1. F33-104 (Ikeda S. et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11: 391-407, 1992.)
Class: IgG1 (k)
Affinity constant: 3.5 x 10 (+8) / M
OD = 14.0 (Ab Conc. = 10.0 mg / ml)
Vol. = 0.5 ml
Total Ab = 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0

２． Ｆ３３−６０（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG2a (k)
Affinity constant: 3.4 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0 2. F33-60 (Ikeda S. et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11: 391-407, 1992.)
Class: IgG2a (k)
Affinity constant: 3.4 x 10 (+8) / M
OD = 14.0 (Ab Conc. = 10.0 mg / ml)
Vol. = 0.5 ml
Total Ab = 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0

３． Ｆ８２−８１（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG2b (k)
Affinity constant: 9.5 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
3. F82-81 (Ikeda S. et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11: 391-407, 1992.)
Class: IgG2b (k)
Affinity constant: 9.5 x 10 (+8) / M
OD = 14.0 (Ab Conc. = 10.0 mg / ml)
Vol. = 0.5 ml
Total Ab = 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0

４． Ｆ１１−１２（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG3 (k)
Affinity constant: 11.2 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0 4). F11-12 (Ikeda S. et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11: 391-407, 1992.)
Class: IgG3 (k)
Affinity constant: 11.2 x 10 (+8) / M
OD = 14.0 (Ab Conc. = 10.0 mg / ml)
Vol. = 0.5 ml
Total Ab = 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0


５． Ｃｈ Ｆ１１−３９ （Ｌｏｔ ２）（Arakawa F. et al, Hybridoma 12: 365-379, 1993.）
Class: 同上
Affinity constant: 同上
OD=2.10 (Ab Conc.= 1.5 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 0.75 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
5. Ch F11-39 (Lot 2) (Arakawa F. et al, Hybridoma 12: 365-379, 1993.)
Class: Same as above
Affinity constant: Same as above
OD = 2.10 (Ab Conc. = 1.5 mg / ml)
Vol. = 0.5 ml
Total Ab = 0.75 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0

６． ＩＢ２ （ＩＢＬ社より購入：ｌｏｔ Ｎｏ ９Ｇ−７１７）
class: IgG2a
Ab Conc. = 1mg/ml 6). IB2 (purchased from IBL: lot No 9G-717)
class: IgG2a
Ab Conc. = 1mg / ml

７． Ｂ６．２／ＣＤ６６ （ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎより購入： ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ ５５１３５５）
Class： IgG1
Ab Conc. 0.5mg/ml 7). B6.2 / CD66 (purchased from BD PharMingen: catalog No 551355)
Class: IgG1
Ab Conc. 0.5mg / ml

2.6. インビボでのＣＥＡ陽性細胞における抗ＣＥＡ抗体を結合したＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３の選択的遺伝子移入
選択的遺伝子移入をインビボで評価するために、腹腔内播種性ＣＥＡ陽性腫瘍を有するマウスを、抗体ありまたはなしのＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３の腹腔内注射で処置した。Ｘ−ｇａｌによるβ−ガラクトシダーゼの発現を染色するために、発現の強度および選択性を評価した。図１０は、マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を介したＡｄｖ−ＦＺ３３によるＥＧＦＰ遺伝子の導入比較を示す写真である。示されるように、Ｃ２−４５を有するＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３（５×１０９ＶＰ）を受けたマウスの腹腔は、播種性腫瘍においてβ−ガラクトシダーゼの発現が選択的に増強された（図１０Ｃを参照）。対照的に、コントロールＩｇＧ４を有するＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３（５×１０９ＶＰ）を受けたマウスは、β−ガラクトシダーゼの発現が弱いことが示された（図１０Ｂを参照）。 2.6. Selective gene transfer of Ax3CAZ3-FZ33 conjugated with anti-CEA antibody in CEA positive cells in vivo In order to assess selective gene transfer in vivo, mice with intraperitoneally disseminated CEA positive tumors are treated with antibodies or Treated with intraperitoneal injection of Ax3CAZ3-FZ33 without. In order to stain the expression of β-galactosidase by X-gal, the intensity and selectivity of expression were evaluated. FIG. 10 is a photograph showing comparison of introduction of EGFP gene by Adv-FZ33 via mouse anti-CEA monoclonal antibody. As shown, the peritoneal cavity of mice receiving Ax3CAZ3-FZ33 (5 × 10 9 VP) with C2-45 had selectively enhanced β-galactosidase expression in disseminated tumors (see FIG. 10C). . In contrast, mice that received Ax3CAZ3-FZ33 a (5 × 10 9 VP) having a control IgG 4, the expression of β- galactosidase weak showed (see Figure 10B).

これらの結果は、抗ＣＥＡ抗体を結合したＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３が、インビボでＣＥＡ陽性細胞において、トランスジーンの発現を選択的に増強し得ることを実証した。   These results demonstrated that Ax3CAZ3-FZ33 conjugated with anti-CEA antibody can selectively enhance transgene expression in CEA positive cells in vivo.

2.7. 抗ＣＥＡ ｍＡｂおよび５−ＦＵを結合したＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３の治療的効果
本発明者らはまた、ＵＰＲＴ（５−ＦＵを５−フルオロウリジンモノホスフェートに直接変換する）を発現するＡｄｖ−ＦＺ３３（Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３）を抗ＣＥＡ ｍＡｂに結合させたものを用いて、播種性胃癌を有する動物においてインビボで遺伝子治療の効果を検証した。処置の手順は以下の通りである。 2.7. Therapeutic effects of Ax3CAUP-FZ33 conjugated with anti-CEA mAb and 5-FU We also have Adv-FZ33 expressing UPRT (which directly converts 5-FU to 5-fluorouridine monophosphate) Ax3CAUP-FZ33) conjugated to anti-CEA mAb was used to verify the efficacy of gene therapy in vivo in animals with disseminated gastric cancer. The procedure of treatment is as follows.

まず、１×１０７個のＭＫＮ−４５細胞をマウスの腹腔内に注射した（ｎ＝１５）。注射の４日後に、さらに以下の条件でマウスを処置した：（ａ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体を結合したＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を５×１０９ＶＰで腹腔内投与（ｎ＝３）；（ｂ）コントロールＩｇＧ４を結合したＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を５×１０９ＶＰで腹腔内投与（ｎ＝３）；（ｃ）Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３のみを５×１０９ＶＰで腹腔内投与（ｎ＝３）；（ｄ）ベクター無し（ｎ＝３）；および（ｅ）処置無し（ｎ＝３）。５日後〜９日後に、上記（ａ）〜（ｄ）のマウスに対して、１０ｍｇ／ｋｇの５ＦＵを腹腔内注射し、（ｅ）のマウスに対してＰＢＳを腹腔内注射した。１０日後に再び上記（ａ）〜（ｅ）と同じ処置を行い、１１〜１５日後に、再び１０ｍｇ／ｋｇの５ＦＵ（（ａ）〜（ｄ））およびＰＢＳ（（ｅ））を腹腔内注射した。１７日後にマウスを屠殺し、ＣＥＡ標的化Ａｄｖ−ＦＺ３３による治療効果の評価を行った。具体的には、各グループのマウスの重量を測定し、各動物の腫瘍塊の重量を測定し、そして腹腔における転移の数を測定した。 First, 1 × 10 7 MKN-45 cells were injected intraperitoneally into mice (n = 15). Four days after the injection, mice were further treated under the following conditions: (a) Ax3CAUP-FZ33 conjugated with anti-CEA monoclonal antibody was intraperitoneally administered at 5 × 10 9 VP (n = 3); (b) Control IgG (4 ) Ax3CAUP-FZ33 to which 4 was bound intraperitoneally administered at 5 × 10 9 VP (n = 3); (c) Ax3CAUP-FZ33 alone was intraperitoneally administered at 5 × 10 9 VP (n = 3); None (n = 3); and (e) No treatment (n = 3). After 5 to 9 days, 10 mg / kg of 5FU was intraperitoneally injected into the mice (a) to (d), and PBS was intraperitoneally injected into the mouse (e). After 10 days, the same treatment as in the above (a) to (e) was performed again, and 11 to 15 days later, 10 mg / kg of 5FU ((a) to (d)) and PBS ((e)) were intraperitoneally injected. did. After 17 days, the mice were sacrificed and the therapeutic effect of CEA-targeted Adv-FZ33 was evaluated. Specifically, each group of mice was weighed, the tumor mass of each animal was weighed, and the number of metastases in the peritoneal cavity was determined.

図１１および図１２に、その結果を示す写真およびグラフをそれぞれ示す。示されるように、Ｃ２−４５を結合させたＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３は、腫瘍重量の有意な減少を示し（ｎ＝３；Ｆｉｓｈｅｒ検定：ｐ＝０．０４６）、コントロール抗体よりも優れた抗腫瘍効果を実証した。   FIG. 11 and FIG. 12 show photographs and graphs showing the results, respectively. As shown, Ax3CAUP-FZ33 conjugated with C2-45 showed a significant decrease in tumor weight (n = 3; Fisher test: p = 0.046), and superior anti-tumor effect over control antibody. Demonstrated.

本発明の抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、ＣＥＡ産生癌（特に転移癌）の標的化療法、診断等の用途において有用である。特に、抗体のＦｃドメインに結合するように改変されたファイバー変異型アデノウイルスと共に用いた場合、ＣＥＡ陽性細胞に対するアデノウイルスの感染効率を特異的に高めることから、ＣＥＡ産生癌特異的な遺伝子療法に有用である。   The anti-CEA monoclonal antibody of the present invention is useful in applications such as targeted therapy and diagnosis of CEA-producing cancer (particularly metastatic cancer). In particular, when used in combination with a fiber mutant adenovirus modified to bind to the Fc domain of an antibody, the efficiency of adenovirus infection against CEA positive cells is specifically increased. Useful.

本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルス作製のためのアデノウイルスベクターｐＡｘ３の模式図である。It is a schematic diagram of adenovirus vector pAx3 for production of recombinant adenovirus used as a representative example in the present invention. Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルス作製のためのｐＡｘ３−ＦＺ３３プラスミドの模式図である。It is a schematic diagram of the pAx3-FZ33 plasmid for production of Z33 fiber mutant adenovirus. 本発明において使用されるＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスのファイバー部分の構造の模式図である。It is a schematic diagram of the structure of the fiber part of Z33 fiber variant adenovirus used in the present invention. Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスに抗ＣＥＡ抗体を結合させることによって、アデノウイルスをＣＥＡ発現細胞へ効果的に指向化し得ることを示す模式図である。It is a schematic diagram showing that adenovirus can be effectively directed to CEA expressing cells by binding an anti-CEA antibody to a Z33 fiber mutant adenovirus. ヒト培養細胞株におけるＣＥＡおよびアデノウイルスエントリーレセプターの発現をＦＡＣＳ分析により評価した結果を示すグラフである。ＭＫＮ−４５におけるＣＥＡ、ＣＡＲ、およびインテグリンの発現を示す。It is a graph which shows the result of having evaluated the expression of CEA and adenovirus entry receptor in a human cultured cell line by FACS analysis. Shows CEA, CAR, and integrin expression in MKN-45. ヒト培養細胞株におけるＣＥＡおよびアデノウイルスエントリーレセプターの発現をＦＡＣＳ分析により評価した結果を示すグラフである。ＭＫＮ−７４およびＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞株におけるＣＥＡ、ＣＡＲ、およびインテグリンの発現を示す。It is a graph which shows the result of having evaluated the expression of CEA and adenovirus entry receptor in a human cultured cell line by FACS analysis. Figure 7 shows CEA, CAR, and integrin expression in MKN-74 and Chang-liver cell lines. Ａｘ３ＥＧＦＰＦＺ３３によって感染させたＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子導入効率の比較をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いて行った結果を示すグラフである。Ｃｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞における遺伝子導入効率を示す。It is a graph which shows the result of having performed the comparison of the gene transfer efficiency in the CEA antigen positive and negative strain infected with Ax3EGFPFZ33 using FACS caliber. The gene transfer efficiency in a Chang-liver cell is shown. Ａｘ３ＥＧＦＰＦＺ３３によって感染させたＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子導入効率の比較をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いて行った結果を示すグラフである。ＭＫＮ−７４における遺伝子導入効率を示す。It is a graph which shows the result of having performed the comparison of the gene transfer efficiency in the CEA antigen positive and negative strain infected with Ax3EGFPFZ33 using FACS caliber. The gene transfer efficiency in MKN-74 is shown. Ａｘ３ＥＧＦＰＦＺ３３によって感染させたＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子導入効率の比較をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いて行った結果を示すグラフである。ＭＫＮ−４５における遺伝子導入効率を示す。It is a graph which shows the result of having performed the comparison of the gene transfer efficiency in the CEA antigen positive and negative strain infected with Ax3EGFPFZ33 using FACS caliber. The gene transfer efficiency in MKN-45 is shown. ＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子発現量の比較を化学発光β−ｇａｌレポーター遺伝子アッセイを用いて行った結果を示すグラフである。（Ａ）Ｃｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞；（Ｂ）ＭＫＮ−７４；（Ｃ）ＭＫＮ−４５。It is a graph which shows the result of having performed the comparison of the gene expression level in a CEA antigen positive and negative strain using the chemiluminescent beta-gal reporter gene assay. (A) Chang-liver cells; (B) MKN-74; (C) MKN-45. インビトロでＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を用いた遺伝子導入後の５−ＦＵに対する細胞株の感受性を示すＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。（Ａ）Ｃｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞；（Ｂ）ＭＫＮ−７４；（Ｃ）ＭＫＮ−４５。It is a graph which shows the result of the MTT assay which shows the sensitivity of the cell line with respect to 5-FU after gene transfer using Ax3CAUP-FZ33 in vitro. (A) Chang-liver cells; (B) MKN-74; (C) MKN-45. 各種マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いてＡｄｖ−ＦＺ３３による遺伝子導入効率の比較を示すＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ測定の結果を表すグラフである。It is a graph showing the result of the FACScaliber measurement which shows the comparison of the gene transfer efficiency by Adv-FZ33 using various mouse | mouth anti- CEA monoclonal antibodies. マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を介したＡｄｖ−ＦＺ３３によるＥＧＦＰ遺伝子の導入比較を示す写真である。（Ａ）Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３のみ投与；（Ｂ）Ａｘ３ＣＡＺ３−Ｆ３３＋ＩｇＧ４を投与；（Ｃ）Ａｘ３ＣＡＺ３−Ｆ３３＋ｃ２−４５を投与。It is a photograph which shows the introduction comparison of the EGFP gene by Adv-FZ33 through a mouse | mouth anti- CEA monoclonal antibody. (A) Ax3CAZ3-FZ33 only administered; (B) Ax3CAZ3-F33 + IgG 4 administered; (C) Ax3CAZ3-F33 + c2-45 administered. 播種性胃癌を有する動物における、抗ＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を用いた遺伝子治療の効果を示す写真である。It is a photograph which shows the effect of the gene therapy using Ax3CAUP-FZ33 which combined anti-CEA mAb in the animal which has disseminated gastric cancer. ＣＥＡを標的化したＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３による遺伝子治療の効果を示すグラフである。It is a graph which shows the effect of the gene therapy by Ax3CAUP-FZ33 which targeted CEA.

Claims (25)

抗ＣＥＡモノクローナル抗体とＩｇＧ結合モチーフを有する遺伝的に改変されたアデノウイルスベクターとの複合体。   A complex of an anti-CEA monoclonal antibody and a genetically modified adenoviral vector having an IgG binding motif. 前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、
当該抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価した場合に、
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項１に記載の複合体。 The anti-CEA monoclonal antibody is
In the presence of the anti-CEA monoclonal antibody, the fiber mutant adenovirus modified to bind to the antibody and the tumor cell are contacted to infect the fiber cell with the fiber mutant adenovirus, and the fiber When the infection efficiency of the mutant adenovirus to the tumor cells was evaluated by a reporter gene expression assay,
The complex according to claim 1, which is a monoclonal antibody such that the expression level of the reporter gene is at least twice as high as that of the control antibody. 前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項２に記載の複合体。   The complex according to claim 2, wherein the anti-CEA monoclonal antibody is a monoclonal antibody in which the expression level of the reporter gene is at least 10 times higher than that of a control antibody. 前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、Ｃ２−４５である、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。   The complex according to any one of claims 1 to 3, wherein the anti-CEA monoclonal antibody is C2-45. 前記アデノウイルスベクターが、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターである、請求項１〜４のいずれかに記載の複合体。   The complex according to any one of claims 1 to 4, wherein the adenovirus vector is a Z33 fiber mutant adenovirus vector. 抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する、癌の治療薬。   A therapeutic agent for cancer comprising an anti-CEA monoclonal antibody. 前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、
当該抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価した場合に、
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項６に記載の癌の治療薬。 The anti-CEA monoclonal antibody is
In the presence of the anti-CEA monoclonal antibody, the fiber mutant adenovirus modified to bind to the antibody and the tumor cell are contacted to infect the fiber cell with the fiber mutant adenovirus, and the fiber When the infection efficiency of the mutant adenovirus to the tumor cells was evaluated by a reporter gene expression assay,
The therapeutic agent for cancer according to claim 6, which is a monoclonal antibody such that the expression level of the reporter gene is at least twice as high as that of the control antibody. 前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項７に記載の癌の治療剤。   The therapeutic agent for cancer according to claim 7, wherein the anti-CEA monoclonal antibody is a monoclonal antibody in which the expression level of the reporter gene is at least 10 times higher than that of a control antibody. 前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、Ｃ２−４５である、請求項６〜８のいずれかに記載の癌の治療剤。   The therapeutic agent for cancer according to any one of claims 6 to 8, wherein the anti-CEA monoclonal antibody is C2-45. 前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子を担持したウイルスベクター、および薬剤を担持した非ウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている、請求項６〜９のいずれかに記載の癌の治療薬。   The anti-CEA monoclonal antibody is chemically combined with any one of a radioisotope, a therapeutic protein, a small molecule drug, a viral vector carrying a therapeutic gene, and a non-viral vector carrying a drug, or any combination thereof. Or the therapeutic agent of the cancer in any one of Claims 6-9 couple | bonded by genetic engineering. 前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターに結合されている、請求項１０に記載の癌の治療薬。   The therapeutic agent for cancer according to claim 10, wherein the anti-CEA monoclonal antibody is bound to a Z33 fiber mutant adenovirus vector. 前記非ウイルスベクターが、リポソームベクター、重合リポソーム、脂質小胞、デンドリマー、ポリエチレングリコール集合体、ポリリジン、デキストラン、ポリヒドロキシ酪酸、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドベクター、およびプラスミドＤＮＡネイキッドベクターからなる群から選択される、請求項１０に記載の癌の治療薬。   The non-viral vector is selected from the group consisting of liposome vectors, polymerized liposomes, lipid vesicles, dendrimers, polyethylene glycol aggregates, polylysine, dextran, polyhydroxybutyric acid, Sendai virus envelope vectors, plasmid vectors, and plasmid DNA naked vectors. The therapeutic agent for cancer according to claim 10. 前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現癌細胞を溶解またはその成長を阻害する、請求項６〜１２のいずれかに記載の癌の治療薬。   The therapeutic agent for cancer according to any one of claims 6 to 12, wherein the anti-CEA monoclonal antibody lyses a CEA-expressing cancer cell or inhibits its growth via an immunological effector cell. 前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、ＣＥＡ発現細胞をオプソニン化する、請求項６〜１２のいずれかに記載の癌の治療薬。   The therapeutic agent for cancer according to any one of claims 6 to 12, wherein the anti-CEA monoclonal antibody opsonizes CEA-expressing cells. 前記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、請求項６〜１４のいずれかに記載の癌の治療薬。   The cancer according to any one of claims 6 to 14, wherein the cancer is gastric cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, or prostate cancer. Remedy. 腫瘍特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を調製する方法であって、
抗ＣＥＡモノクローナル抗体を取得する工程、および
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する、方法。 A method for preparing a monoclonal antibody against a tumor-specific CEA antigen comprising the steps of:
Obtaining the anti-CEA monoclonal antibody, and contacting the tumor cell with the fiber mutant adenovirus modified to bind to the antibody in the presence of the anti-CEA monoclonal antibody; Infecting the tumor cells, and evaluating the infection efficiency of the fiber mutant adenovirus to the tumor cells,
Including the method. 前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下での、前記ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞への感染が、
（Ａ）前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体を、前記腫瘍細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に接触させるか、
（Ｂ）前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、前記腫瘍細胞に接触させるか、または
（Ｃ）前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、前記腫瘍細胞に接触させること、
によって行われる請求項１６に記載の方法。 Infection of the tumor cells with the fiber mutant adenovirus in the presence of the anti-CEA monoclonal antibody,
(A) contacting the anti-CEA monoclonal antibody with the tumor cell and then contacting the tumor cell with a fiber mutant adenovirus modified to bind to the antibody;
(B) pre-reacting the anti-CEA monoclonal antibody with a fiber mutant adenovirus modified to bind to the antibody and then contacting the tumor cell, or (C) the anti-CEA monoclonal antibody; Contacting the tumor cells by simultaneously administering a fiber mutant adenovirus modified to bind to an antibody;
The method according to claim 16, which is performed by: 前記感染効率を評価する工程が、レポーター遺伝子発現アッセイによって前記ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する前記感染効率を評価することを含み、ここで前記ファイバー変異型アデノウイルスは、前記感染の際に前記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現する、請求項１６または１７に記載の方法。   The step of assessing the infection efficiency comprises assessing the infection efficiency of the fiber mutant adenovirus against the tumor cells by a reporter gene expression assay, wherein the fiber mutant adenovirus is subjected to the infection during the infection. The method according to claim 16 or 17, wherein a reporter gene for evaluating the infection efficiency is expressed. 前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、請求項１８に記載の方法。   The method according to claim 18, wherein a monoclonal antibody is selected such that the expression level of the reporter gene is at least twice as high as that of a control antibody. 前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、請求項１９に記載の方法。   The method according to claim 19, wherein a monoclonal antibody is selected such that the expression level of the reporter gene is at least 10 times higher than that of a control antibody. 抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する、癌の診断薬。   A diagnostic agent for cancer comprising an anti-CEA monoclonal antibody. 前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、
当該抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価した場合に、
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の癌の診断薬。 The anti-CEA monoclonal antibody is
In the presence of the anti-CEA monoclonal antibody, the fiber mutant adenovirus modified to bind to the antibody and the tumor cell are contacted to infect the fiber cell with the fiber mutant adenovirus, and the fiber When the infection efficiency of the mutant adenovirus to the tumor cells was evaluated by a reporter gene expression assay,
The diagnostic agent for cancer according to claim 21, which is a monoclonal antibody such that the expression level of the reporter gene is at least twice as high as that of a control antibody. 前記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、請求項２１または２２に記載の癌の診断薬。   The cancer diagnostic agent according to claim 21 or 22, wherein the cancer is gastric cancer, colon cancer, lung cancer, metastatic liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, or prostate cancer. 被験者由来の生体試料中のＣＥＡタンパク質もしくはその断片、またはこれらをコードする核酸を診断マーカーとして検出および／または定量する工程を包含する、癌の診断方法。   A method for diagnosing cancer, comprising a step of detecting and / or quantifying a CEA protein or a fragment thereof in a biological sample derived from a subject, or a nucleic acid encoding them as a diagnostic marker. 被験者由来の生体試料中のＣＥＡを、
抗ＣＥＡモノクローナル抗体を取得し、
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価し、そして
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択すること、
によって調製される抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いて、免疫学的に検出および／または定量する、請求項２４に記載の方法。
CEA in a biological sample derived from a subject,
Acquired anti-CEA monoclonal antibody,
In the presence of the anti-CEA monoclonal antibody, the fiber mutant adenovirus modified to bind to the antibody and the tumor cell are contacted to infect the tumor cell with the fiber mutant adenovirus, and the fiber Evaluating the efficiency of infection of the mutant adenovirus to the tumor cells by a reporter gene expression assay, and selecting a monoclonal antibody such that the expression level of the reporter gene is at least twice as high as that of a control antibody;
25. The method of claim 24, wherein the anti-CEA monoclonal antibody prepared by the method is immunologically detected and / or quantified.
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