JP2007000061A - 昆虫由来のc−Junアミノ末端リン酸化酵素活性に関わる有害生物の生理状態に変化を与える薬剤 - Google Patents
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-
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Abstract
【解決手段】有害生物の生理状態に変化を与える薬剤であり、昆虫由来のc−Junアミノ末端リン酸化酵素(以下、本酵素と記す)の活性を変化させる能力を有することを特徴とする薬剤、並びに、被験物質が有する有害生物防除能力の検定方法であって、(1)例えば、開示されるアミノ酸配列からなる蛋白質等を含む群Aから選択される本酵素と被験物質との接触系内における前記本酵素の活性を測定する第一工程、及び(2)第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の有害生物防除能力を評価する第二工程、を有することを特徴とする方法等。
【選択図】なし
Description
ところで、農薬は、従来、化合物を昆虫、菌類、植物等の対象生物に直接作用させ、その生物学的活性を検定するランダムスクリーニングによって見出されてきた。この場合、農薬の安全性や環境への負荷を予測するために、有用な生物活性を有する化合物が特定された後に、その化合物がどのような作用機構で効力を有するか、その化合物が作用する標的が何であるかを分子レベルで詳細に研究する必要があった。
即ち、本発明は、
1.有害生物の生理状態に変化を与える薬剤であり、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)の活性を変化させる能力を有することを特徴とする薬剤;
2.昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素が、ワタアブラムシ由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素であることを特徴とする前項1記載の薬剤;
3.有害生物の生理状態に変化を与える薬剤が、有害生物防除剤であることを特徴とする前項1記載の薬剤;
4.昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)の活性を変化させる能力が、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)と配列番号14で示されるペプチドとの反応を阻害する能力であることを特徴とする前項1記載の薬剤;
5.有効成分として、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)の活性を変化させる能力を有する化学物質又はその農学的に許容される塩を含有することを特徴とする有害生物防除剤;
6.前記化学物質が、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素と配列番号14で示されるペプチドとの反応を阻害する能力を有する化学物質であることを特徴とする前項5記載の有害生物防除剤;
7.前記化学物質が、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素と配列番号14で示されるペプチドとの無細胞反応系において、前記化学物質の存在濃度が10μM以上の場合に、当該化学物質が存在しない場合よりもc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性が低くなるように阻害する能力を有する化学物質であることを特徴とする前項6記載の有害生物防除剤;
8.前記化学物質が、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素と配列番号14で示されるペプチドとの反応の無細胞反応系において、100μM以下のIC50となるように阻害する能力を有する化学物質であることを特徴とする前項6記載の有害生物防除剤;
9.被験物質が有する有害生物防除能力の検定方法であって、
(1)下記の群Aから選択されるc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)と被験物質との接触系内における前記c-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性を測定する第一工程、及び
(2)第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の有害生物防除能力を評価する第二工程、
を有することを特徴とする方法
<群A>
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有する蛋白質
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列と83%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有する蛋白質
(d)配列番号2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
(e)配列番号2で示される塩基配列と65%以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有する蛋白質
(f)配列番号2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有する蛋白質
(g)昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列からなる蛋白質
(h)ワタアブラムシ由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列からなる蛋白質;
10.前項9記載の検定方法により評価された有害生物防除能力を有する物質を選抜することを特徴とする有害生物防除能力を有する物質の探索方法;
11.前項10記載の探索方法により選抜された物質又はその農学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする有害生物防除剤;
12.前項5、6、7、8又は11記載の有害生物防除剤の有効量を、保護すべき作物、有害生物又は有害生物の生息場所に施用することを特徴とする有害生物防除方法;
13.前項9記載の検定方法により評価された有害生物防除能力を有する物質を特定し、特定された有害生物防除能力を有する物質と有害生物とを接触させることを特徴とする有害生物防除方法;
14.下記の群Bのいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)
<群B>
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(d)配列番号2で示される塩基配列を有するアミノ酸配列
(e)配列番号2で示される塩基配列と75%以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(f)配列番号2で示される塩基配列に対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(g)ワタアブラムシ由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素が有するアミノ酸配列;
15.有害生物防除能力を評価するための指標を提供する試薬としての、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素の使用;
16.有害生物防除能力を評価するための指標を提供する試薬としての、前項14記載の昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素の使用;
17.前項14記載のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド;
18.配列番号2で示される塩基配列からなることを特徴とする前項17記載のポリヌクレオチド;
19.前項17又は18記載のポリヌクレオチドが有する塩基配列に対し相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド;
20.前項17又は18記載のポリヌクレオチドの部分塩基配列又はその部分塩基配列に対して相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド;
21.配列番号3又は4で示される塩基配列からなることを特徴とする前項20記載のポリヌクレオチド;
22.c-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの取得方法であって、前項20又は21記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより所望のポリヌクレオチドを増幅する工程、増幅された所望のポリヌクレオチドを特定する工程、及び、特定された所望のポリヌクレオチドを回収する工程、を有することを特徴とする方法;
23.c-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの取得方法であって、前項19、20又は21記載のポリヌクレオチドをプローブとして用いたハイブリダイゼーションにより所望のポリヌクレオチドを検出する工程、検出された所望のポリヌクレオチドを特定する工程、及び、特定された所望のポリヌクレオチドを回収する工程、を有することを特徴とする方法;
24.前項17又は18記載のポリヌクレオチドを、バキュロウイルス由来のプロモーターに機能可能な形で連結してなることを特徴とする環状ポリヌクレオチド;
25.バキュロウイルス由来のプロモーターが、ポリヘドリン遺伝子のプロモーターであることを特徴とする前項24記載の環状ポリヌクレオチド;
26.前項24又は25記載の環状ポリヌクレオチドであって、宿主細胞内で自己複製の為の複製開始点を有することを特徴とする環状ポリヌクレオチド;
27.ポリヌクレオチドが、バキュロウイルスシャトルベクターの塩基配列を有し、昆虫細胞内でウイルスとして増殖可能であるポリヌクレオチドであることを特徴とする前項24、25又は26記載の環状ポリヌクレオチド;
28.前項17又は18記載のポリヌクレオチドをベクターに連結することを特徴とする環状ポリヌクレオチドの製造方法;
29.前項17又は18記載のポリヌクレオチドが導入されてなることを特徴とする形質転換体;
30.形質転換体が形質転換昆虫細胞であることを特徴とする前項29記載の形質転換体;
31.前項17又は18記載のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体の製造方法;
32.前項17又は18記載のポリヌクレオチドをゲノムに含むことを特徴とする組換えバキュロウィルス;
33.前項29又は30記載の形質転換体を培養し、産生された昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)を回収する工程を有することを特徴とするc-Junアミノ末端リン酸化酵素の製造方法;
34.研究ツールとしての、前項14記載の昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素或いは前項17乃至21のいずれかの前項記載のポリヌクレオチドの使用;
35.研究ツールが有害生物防除剤をスクリーニングするための実験ツールであることを特徴とする前項34記載の「使用」;
36.被験物質について、当該被験物質が有する昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)の活性を変化させる能力に係るデータ情報を入力・蓄積・管理する手段、前記データ情報を所望の条件に基づき照会・検索する手段、及び、照会・検索された結果を表示・出力する手段を具備することを特徴とするシステム;
等を提供するものである。
半翅目害虫:ヒメトビウンカ(Laodelphax striatellus)、トビイロウンカ(Nilaparvata lugens)、セジロウンカ(Sogatella furcifera)等のウンカ類、ツマグロヨコバイ(Nephotettix cincticeps)、チャノミドリヒメヨコバイ(Empoasca onukii)等のヨコバイ類、ワタアブラムシ(Aphis gossypii)、モモアカアブラムシ(Myzus persicae)等のアブラムシ類、カメムシ類、オンシツコナジラミ(Trialeurodes vaporariorum)、タバココナジラミ(Bemisia tabaci)、シルバーリーフコナジラミ(Bemisia argentifolii)等のコナジラミ類、カイガラムシ類、グンバイムシ類、キジラミ類等;
鱗翅目害虫:ニカメイガ(Chilo suppressalis)、コブノメイガ(Cnaphalocrocis medinalis)、ヨーロピアンコーンボーラー(Ostrinia nubilalis)、シバツトガ(Parapediasia teterrella)等のメイガ類、ハスモンヨトウ(Spodoptera litura)、シロイチモジヨトウ(Spodoptera exigua)、アワヨトウ(Pseudaletia separata)、ヨトウガ(Mamestra brassicae)、タマナヤガ(Agrotis ipsilon)、トリコプルシア属(Trichoplusia spp.)、ヘリオティス属(Heliothis spp.)、ヘリコベルパ属(Helicoverpa spp.)、エアリアス属(Earias spp.)等のヤガ類、モンシロチョウ(Pieris rapae crucivora)等のシロチョウ類、リンゴコカクモンハマキ(Adoxophyes orana fasciata)、ナシヒメシンクイ(Grapholita molesta)、コドリングモス(Cydia pomonella)等のハマキガ類、モモシンクイガ(Carposina niponensis)等のシンクイガ類、モモハモグリガ(Lyonetia clerkella)等のチビガ類、キンモンホソガ(Phyllonorycter ringoniella)等のホソガ類、ミカンハモグリガ(Phyllocnistis citrella)等のコハモグリガ類、コナガ(Plutela xylostella)等のスガ類、ピンクボールワーム(Pectinophora gossypiella)等のキバガ類、ヒトリガ類、ヒロズコガ類等;
双翅目害虫:アカイエカ(Culex pipiens pallens)、コガタアカイエカ(Culex tritaeniorhynchus)、ネッタイイエカ(Culex quinquefasciatus)等のイエカ類、(Aedes aegypti)、(Aedes albopictus)等のエーデス属、(Anopheles sinensis)等のアノフェレス属、ユスリカ類、イエバエ(Musca domestica)、オオイエバエ(Muscina stabulans)等のイエバエ類、クロバエ類、ニクバエ類、ヒメイエバエ類、タネバエ(Delia platura)、タマネギバエ(Delia antiqua)等のハナバエ類、ミバエ類、ショウジョウバエ類、チョウバエ類、ブユ類、アブ類、サシバエ類、ハモグリバエ類等;
鞘翅目害虫:ウエスタンコーンルートワーム(Diabrotica virgifera virgifera)、サザンコーンルートワーム(Diabrotica undecimpunctata howardi)等のコーンルートワーム類、ドウガネブイブイ(Anomala cuprea)、ヒメコガネ(Anomala rufocuprea)等のコガネムシ類、メイズウィービル(Sitophilus zeamais)、イネミズゾウムシ(Lissorhoptrus oryzophilus)、アズキゾウムシ(Callosobruchuys chienensis)等のゾウムシ類、チャイロコメノゴミムシダマシ(Tenebrio molitor)、コクヌストモドキ(Tribolium castaneum)等のゴミムシダマシ類、イネドロオイムシ(Oulema oryzae)、ウリハムシ(Aulacophora femoralis)、キスジノミハムシ(Phyllotreta striolata)、コロラドハムシ(Leptinotarsa decemlineata)等のハムシ類、シバンムシ類、ニジュウヤホシテントウ(Epilachna vigintioctopunctata)等のエピラクナ類、ヒラタキクイムシ類、ナガシンクイムシ類、カミキリムシ類、アオバアリガタハネカクシ(Paederus fuscipes)等;
アザミウマ目害虫:ミナミキイロアザミウマ(Thrips palmi)等のスリップス属、ミカンキイロアザミウマ(Frankliniella occidentalis)等のフランクリニエラ属、チャノキイロアザミウマ(Sciltothrips dorsalis)等のシルトスリップス属等のアザミウマ類、クダアザミウマ類等;
膜翅目害虫:ハバチ類、アリ類、スズメバチ類等;
網翅目害虫:ゴキブリ類、チャバネゴキブリ類等;
直翅目害虫:バッタ類、ケラ類等;
隠翅目害虫:ヒトノミ等;
シラミ目害虫:ヒトジラミ等;
シロアリ目害虫:シロアリ類等;
ダニ目害虫:ナミハダニ(Tetranychus urticae)、カンザワハダニ(Tetranychus kanzawai)、ミカンハダニ(Panonychus citri)、リンゴハダニ(Panonychus ulmi)、オリゴニカス属等のハダニ類、ミカンサビダニ(Aculops pelekassi)、リンゴサビダニ(Aculus schlechtendali)等のフシダニ類、チャノホコリダニ(Polyphagotarsonemus latus)等のホコリダニ類、ヒメハダニ類、ケナガハダニ類、フタトゲチマダニ(Haemaphysalis longicornis)、ヤマトチマダニ(Haemaphysalis flava)、タイワンカクマダニ(Dermacentor taiwanicus)、ヤマトマダニ(Ixodes ovatus)、シュルツマダニ(Ixodes persulcatus) 、オウシマダニ(Boophilus microplus)等のマダニ類、ケナガコナダニ(Tyrophagus putrescentiae)等のコナダニ類、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides ptrenyssnus)等のヒョウヒダニ類、ホソツメダニ(Cheyletus eruditus)、クワガタツメダニ(Cheyletus malaccensis)、ミナミツメダニ(Cheyletus moorei)等のツメダニ類、ワクモ類等;
線虫類:ミナミネグサレセンチュウ(Pratylenchus coffeae)、キタネグサレセンチュウ(Pratylenchus fallax)、ダイズシストセンチュウ(Heterodera glycines)、ジャガイモシストセンチュウ(Globodera rostochiensis)、キタネコブセンチュウ(Meloidogyne hapla)、サツマイモネコブセンチュウ(Meloidogyne incognita)等。
本発明において「「有害生物の生理状態に変化を与える薬剤」とは、有害生物に投与することによって有害生物の生理状態に変化を与えることができる薬剤である。
c-Jun アミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase、EC 2.7.1.37)は、蛋白質キナーゼであり、ATPのリン酸基をc-Junに転移する活性を有する、MAPキナーゼファミリーの一つである。
ペプチド鎖の9〜12残基にSer/Thr蛋白質リン酸化酵素の活性中心部位が接触すると考えられているが、7残基の短いペプチド鎖にも結合することが示されている。ペプチド基質の特異性は一般的にリン酸化部位の+3〜−3の残基に限定されるが、この領域以外残基でも基質特異性に寄与することがあり得る。キナーゼのペプチド基質は、既知の生体内での基質の配列及び文献情報から選抜できる。当該方法を用いて複数の異なるペプチド基質をデザインする。例えば、ワタアブラムシ由来のc-Jun アミノ末端リン酸化酵素の当該基質に対する活性を放射活性に基づいた方法によって測定する。それらの測定結果から、例えば、最もリン酸基の転移活性が高い基質を選抜すればよい。そのような基質として、例えば、配列番号14に示すペプチドが挙げられる。
選抜されたペプチド基質は、前記のように放射活性に基づいた方法に用いることができるが、また例えば、IMAP技術を用いた蛍光偏光法に用いて、c-Jun アミノ末端リン酸化酵素の活性を測定可能である。IMAP技術は、ナノ粒子上に固定化されたmetal coordination complex によるリン酸基への特異的結合に基づくものである。このIMAP binding reagent はc-Jun アミノ末端リン酸化酵素の反応で生成される蛍光標識されたリン酸化されたペプチド上のリン酸基と結合する。その結合はペプチドの分子の運動の割合に変化を引き起こし、その結果、ペプチド末端に付加された蛍光ラベルに観察される蛍光偏光値を増加させる。
以上のような様々なc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性測定の中で、多検体のc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性を機械的に効率よく測定する方法としては、前記の配列番号14に示すペプチドを基質としたIMAP技術を用いた蛍光偏光法が望ましい。具体的には例えば、IMAP screening Express Kit with progressive Binding system(Molecular Device社製)を用いてかつアミノ基末端にビオチンが付加された配列番号13で示されるアミノ酸配列からなるペプチド及びカルボキシルキ末端が蛍光標識された配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを基質として、当該キットに付属される取扱説明書に記載される方法に準じた方法等が挙げられる。
また、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性を測定する方法は、上記の方法と同様な方法に準じて実施することができる。
また、後述の方法によって、これまで未知であったワタアブラムシ由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列を明らかにすることが可能であり、それらの方法によって得られたアミノ酸配列は配列番号1、遺伝子の塩基配列は配列番号2にそれぞれ開示されている。
一方、昆虫以外のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列は、線虫(Caenorhabditis elegans 、accession No. NP_741434)、ヒト(Homo sapiens 、accession No. NP_002744、NP_620448、NP_620446)等において、及び遺伝子の塩基配列は、線虫(Caenorhabditis elegans 、accession No. NM_171371)、ヒト(Homo sapiens 、accession No. NM_002753、NM_138982 、NM_138980)等において、それぞれ公共のデータベースに開示されている。
ワタアブラムシ由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列に対する既知配列の同一性は表1に示される。
当該反応における被験物質のIC50値とは、当該反応の活性を50%阻害する被験物質の濃度を意味する。被験物質のIC50値は、前記のc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性測定反応系に異なる濃度の被験物質を添加して、各添加濃度(用量)でのc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性(反応)を算出し、用量-反応曲線(dose response curve)を作成して、c-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を50%阻害する被験物質の添加濃度を算出することによって決定できる。より具体的には、4パラメーターロジスティックモデル(4 Parameter Logistic Model)或いは、シグモイド用量-反応モデル(Sigmoidal Dose-Response Model)
f(x) = (A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))
を用いて用量-反応曲線を作成し、IC50を算出することができる。また実務的には、市販の計算ソフトウェアであるXLfit (IDBS社製)を用いて算出することが可能である。
昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性を変化させる能力を有することを特徴とする薬剤とは、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を変化させる能力を有する物質を有効成分とする薬剤である。
有害生物防除能力を測定する方法の一つとして、本発明で開示される方法の他に、例えば、前記の有害生物に対する殺虫活性を測定する方法が挙げられる。具体的には、例えば、以下の方法に従い、測定することができる。
下記濃度(表2参照)に滅菌済み人工飼料を調製し、供試薬剤のDMSO溶液を該人工飼料の0.5%容量添加し、混合する以外は、Handbook of Insect Rearing Vol.1 (Elsevier Science Publisers 1985) 35頁〜36頁に記載される方法に準じてワタアブラムシを飼育し、6日後にワタアブラムシの生存数を調査し、次の式により防除価を求める。
尚、式中の文字は以下の意味を表す。
Cb:無処理区の処理前の虫の生存数
Cai:無処理区の観察時の生存虫数
Tb:処理区の処理前の虫の生存数
Tai:処理区の観察時の虫の生存数
有意に高い防除価を示す供試薬剤については、有害生物防除活性があると言える。また、より好ましくは、当該防除価が30%以上の供試薬剤は実質的な殺虫活性があると判断でき、当該防除価が30%未満の供試化合物は実質的な殺虫活性が無いと判断できる。
本発明において、農学的に許容される塩とは、防除剤としての製造、及び該製造物の施用に関して、その製造及び施用が不可能とならない形態の塩を指し、どのような形態の塩でもあってもよい。かかる塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム等の無期塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基、リジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。
ここで、群Aとは、
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有する蛋白質
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列と83%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有する蛋白質
(d)配列番号2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
(e)配列番号2で示される塩基配列と65%以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有する蛋白質
(f)配列番号2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有する蛋白質
(g)昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列からなる蛋白質
(h)ワタアブラムシ由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列からなる蛋白質
を示す(以下、群Aと記す。)。
当該第一工程及び当該第二工程を有する、被験物質が有する有害生物防除能力の検定方法に使用されるc-Junアミノ末端リン酸化酵素は、前記群Aに示す蛋白質である。上記の群Aの蛋白質のうち、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)に示される蛋白質のアミノ酸配列において、(a)に示されるアミノ酸配列との間に認められることのある相違は、一部のアミノ酸の欠失、置換、付加等である。これらには、例えば、上記の(a)で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシングによる欠失が含まれる。また、該蛋白質が由来する生物の種差や個体差等により天然に生じる遺伝子変異や、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、突然変異処理等によって人為的に導入される遺伝子変異等により生じるアミノ酸の欠失、置換、付加等が含まれる。
かかる欠失、置換、付加等を受けるアミノ酸の数は、c-Junアミノ末端リン酸化酵素のペプチダーゼ活性を見出すことのできる範囲内の数であれば良い。また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、pK、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への置換をあげることができる。このような置換としては、具体的には例えば、(1)グリシン、アラニン;(2)バリン、イソロイシン、ロイシン;(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、(4)セリン、スレオニン;(5)リジン、アルギニン;(6)フェニルアラニン、チロシン等のグループ内での置換が挙げられる。
かかるアミノ酸の欠失、付加若しくは置換(以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。)を人為的に行う手法としては、例えば、(a)で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法(ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984))、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。また、アミノ酸の改変を人為的に行う手法としては、例えば、(a)で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対してランダムに変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法も挙げられる。ここでランダムに変異を導入する手法としては、例えば、上記のアミノ酸配列のいずれかをコードするDNAを鋳型とし、それぞれのDNAの全長を増幅できるようなプライマー対を用い、基質に用いるdATP、dTTP、dGTP、dCTPの各々の添加濃度を通常とは変化させた反応条件や、或いはポリメラーゼの反応を促進させるMg2+の濃度を通常よりも増加させた反応条件でPCRを行う方法等が挙げられる。このようなPCRの手法としては、例えば、Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112 に記載される方法があげられる。また、WO0009682号公報に記載される方法をあげることもできる。
ここで「配列同一性」とは、2つの塩基配列又は2つのアミノ酸配列間の同一性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた2つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列又はアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいては、付加又は欠失(例えばギャップ等)を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、FASTA[Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,4, 2444-2448(1988)]、BLAST[Altschulら、Journal of Molecular Biology, 215, 403-410(1990)]、CLUSTAL W[Thompson,Higgins&Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680(1994a)]等のプログラムを用いて相同性解析を行いアラインメントを作成することによって算出することができる。上記のプログラムは、例えば、DNA Data Bank of Japan[国立遺伝学研究所 生命情報・DDBJ研究センター (Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan ;CIB/DDBJ)内で運営される国際DNAデータバンク]のホームページ(http://www.ddbj.nig.ac.jp)等において、一般的に利用可能である。また、配列同一性は市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。具体的には例えば、GENETYX-WIN Ver.5(ソフトウェア開発株式会社製)」を用い、Lipman-Pearson法[Lipman, D. J. and Pearson, W.R., Science, 227, 1435-1441,(1985)]により相同性解析を行ってアラインメントを作成することにより算出することができる。
(f)に記載される「ストリンジェントな条件」としては、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行(Cold Spring Harbor Laboratory press)等に記載される通常の方法に準じて行われるハイブリダイゼーションにおいて、例えば、6×SSC(1.5M NaCl、0.15M クエン酸三ナトリウムを含む溶液を10×SSCとする)を含む溶液中で45℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで50℃にて洗浄するような条件(Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6)等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、2×SSC(低ストリンジェンシーな条件)から0.2×SSC(高ストリンジェンシーな条件)までの条件から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温(低ストリンジェンシーな条件)から65℃(高ストリンジェンシーな条件)までの条件から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
(h)記載の蛋白質は、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素の中で、ワタアブラムシに存在するc-Junアミノ末端リン酸化酵素を示し、(a)記載のアミノ酸配列からなる蛋白質も含まれる。
また、群Aの蛋白質には、(g)記載の昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列からなる蛋白質、が含まれるが、より望ましくは、最大の配列同一性が得られるよう配列番号1で示されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号1で示されるアミノ酸配列の(I)64位、(II)66位、(III)90位、(IV)107位、(V)112位、(VI)195位、(VII)288位、(VIII)289位、(IX)358位、(X)359位、(XI)368位に相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基;(I)64位はスレオニン、(II)66位はグルタミン、(III)90位はフェニルアラニン、(IV)107位はアラニン、(V)112位はアルギニン、(VI)195位はスレオニン、(VII)288位はアスパラギン酸、(VIII)289位はアルギニン、(IX)358位はセリン、(X)359位はバリン、(XI)368位はグルタミンである蛋白質が用いられる。ここで、「最大の配列同一性が得られるように配列番号1で示されるアミノ酸配列と整列させる」とは、上記のFASTA、BLAST、CLUSTAL W等のプログラムを用いて配列番号1で示されるアミノ酸配列を含めて対象となる複数のアミノ酸配列の配列同一性解析を行い整列させることを意味する。このような方法で複数の配列を整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、各アミノ酸配列中における相同アミノ酸残基の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象の蛋白質の特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。例えば、本発明で配列が開示されるc-Junアミノ末端リン酸化酵素を含め、既知の昆虫のc-Junアミノ末端リン酸化酵素は、アミノ酸配列最大の配列同一性が得られるよう配列番号1で示されるアミノ酸配列と整列させた場合に、配列番号1で示されるアミノ酸配列の(I)64位、(II)66位、(III)90位、(IV)107位、(V)112位、(VI)195位、(VII)288位、(VIII)289位、(IX)358位、(X)359位、(XI)368位に相当する位置のアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基;(I)64位はスレオニン、(II)66位はグルタミン、(III)90位はフェニルアラニン、(IV)107位はアラニン、(V)112位はアルギニン、(VI)195位はスレオニン、(VII)288位はアスパラギン酸、(VIII)289位はアルギニン、(IX)358位はセリン、(X)359位はバリン、(XI)368位はグルタミン、である。
また、前記のc-Junアミノ末端リン酸化酵素を用いた有害生物防除能力の検定方法によっても有害生物防除能力を有する物質を探索することが可能である。具体的には、前記のc-Junアミノ末端リン酸化酵素を用いた有害生物防除能力の検定方法を用いて、被験物質の有害生物防除能力がある一定値以上、或いは一定値以下であることが特定された場合、当該物質を選抜することによって有害生物防除能力を有する物質を探索できる。
またこの探索方法によって選抜された物質は、有害生物防除能力を有することから、その物質又はその農学的に許容される塩を有効成分として含有する有害生物防除剤となり得る。
有害生物防除剤を農林用として用いる場合には、その施用量は通常1000m2有害生物防除剤の量で0.1〜1000gである。有害生物防除剤が乳剤、水和剤、フロアブル剤、マイクロカプセル剤等に製剤化されたものである場合には、通常有効成分濃度が1〜10000ppmとなるように水で希釈して散布することにより施用し、有害生物防除剤が粒剤、粉剤等に製剤化されたものである場合には、通常そのまま施用する。
有害生物防除剤は有害生物から保護すべき作物等の植物に対して茎葉処理することにより使用することができ、作物の苗を植え付ける前の苗床や植付けの時に植穴や株元に処理することにより使用することもできる。さらに、耕作地の土壌に生息する有害生物を防除する目的で該土壌に処理することにより使用してもよい。また、シート状やひも状等に加工した樹脂製剤を作物に巻き付ける、作物の近傍に張り渡す及び/又は株元の土壌表面に敷く等の方法で使用することもできる。
有害生物防除剤を防疫用害虫防除剤として用いる場合には、乳剤、水和剤、フロアブル等は、通常、有効成分濃度が0.01〜10000ppmになるように水で希釈して施用し、油剤、エアゾール、燻煙剤、毒餌等についてはそのまま施用する。
有害生物防除剤の用途の一つとして、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等の家畜、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の小動物の外部寄生虫防除があげられ、この場合は獣医学的に公知の方法で動物に投与する事ができる。具体的な投与方法としては、全身的抑制(systemic control)を目的とする場合には、例えば錠剤、飼料混入、坐薬、注射(筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内等)等により投与され、非全身的抑制(non-systemic control)を目的とする場合には、例えば油剤若しくは水性液剤を噴霧する、ポアオン若しくはスポットオン処理を行う、シャンプー製剤で動物を洗う又は樹脂製剤を首輪や耳札にして動物につける等の方法により用いられる。動物体に投与する場合の有害生物防除剤の量は、通常動物1kgに対して、化合物Aと化合物Bとの合計量で、0.1〜1000mgの範囲である。
これらの施用量、施用濃度は、いずれも製剤の種類、施用時期、施用場所、施用方法、有害生物の種類、被害程度の等の状況によって異なり、上記の範囲にかかわることなく増減させることができ、適宜選択する事ができる。
以上に示した有害生物防除の方法に、前記の有害生物防除剤を用いることができる。
また一方、前記の、群Aから選択されるc-Junアミノ末端リン酸化酵素を用いた第一工程及び第二工程を有する、被験物質が有する有害生物防除能力の検定方法、によって評価された有害生物防除能力を有する物質を特定し、特定された有害生物防除能力を有する物質と有害生物とを接触させることによって有害生物を防除することも可能である。ここで特定された有害生物防除能力を有する物質と有害生物とを接触させる方法としては、前記の製剤方法、施用方法等を用いることが出来る。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(d)配列番号2で示される塩基配列を有するアミノ酸配列
(e)配列番号2で示される塩基配列と75%以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(f)配列番号2で示される塩基配列に対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(g)ワタアブラムシ由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素が有するアミノ酸配列
かかる欠失、置換、付加等を受けるアミノ酸の数は、c-Junアミノ末端リン酸化酵素のペプチダーゼ活性を見出すことのできる範囲内の数であれば良い。また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、pK、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への置換をあげることができる。このような置換としては、具体的には例えば、(1)グリシン、アラニン;(2)バリン、イソロイシン、ロイシン;(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、(4)セリン、スレオニン;(5)リジン、アルギニン;(6)フェニルアラニン、チロシン等のグループ内での置換が挙げられる。
かかるアミノ酸の欠失、付加若しくは置換(以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。)を人為的に行う手法としては、例えば、(a)で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法(ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984))、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。また、アミノ酸の改変を人為的に行う手法としては、例えば、(a)で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対してランダムに変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法も挙げられる。ここでランダムに変異を導入する手法としては、例えば、上記のアミノ酸配列のいずれかをコードするDNAを鋳型とし、それぞれのDNAの全長を増幅できるようなプライマー対を用い、基質に用いるdATP、dTTP、dGTP、dCTPの各々の添加濃度を通常とは変化させた反応条件や、或いはポリメラーゼの反応を促進させるMg2+の濃度を通常よりも増加させた反応条件でPCRを行う方法等が挙げられる。このようなPCRの手法としては、例えば、Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112 に記載される方法があげられる。また、WO0009682号公報に記載される方法をあげることもできる。
ここで「配列同一性」は、2つの塩基配列又は2つのアミノ酸配列間の同一性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた2つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列又はアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいては、付加又は欠失(例えばギャップ等)を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、FASTA[Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,4, 2444-2448(1988)]、BLAST[Altschulら、Journal of Molecular Biology, 215, 403-410(1990)]、CLUSTAL W[Thompson,Higgins&Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680(1994a)]等のプログラムを用いて相同性解析を行いアラインメントを作成することによって算出することができる。上記のプログラムは、例えば、DNA Data Bank of Japan[国立遺伝学研究所 生命情報・DDBJ研究センター (Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan ;CIB/DDBJ)内で運営される国際DNAデータバンク]のホームページ(http://www.ddbj.nig.ac.jp)等において、一般的に利用可能である。また、配列同一性は市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。具体的には例えば、GENETYX-WIN Ver.5(ソフトウェア開発株式会社製)」を用い、Lipman-Pearson法[Lipman, D. J. and Pearson, W.R., Science, 227, 1435-1441,(1985)]により相同性解析を行ってアラインメントを作成することにより算出することができる。
(f)に記載される「ストリンジェントな条件」としては、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行(Cold Spring Harbor Laboratory press)等に記載される通常の方法に準じて行われるハイブリダイゼーションにおいて、例えば、6×SSC(1.5M NaCl、0.15M クエン酸三ナトリウムを含む溶液を10×SSCとする)を含む溶液中で45℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで50℃にて洗浄するような条件(Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6)等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、2×SSC(低ストリンジェンシーな条件)から0.2×SSC(高ストリンジェンシーな条件)までの条件から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温(低ストリンジェンシーな条件)から65℃(高ストリンジェンシーな条件)までの条件から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
(h)記載の蛋白質は、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素の中で、ワタアブラムシに存在するc-Junアミノ末端リン酸化酵素を示し、(a)記載のアミノ酸配列からなる蛋白質も含まれる。
群Bに示されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、例えば、群Bに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて後述の方法に従い調製することができる。
また、有害生物防除能力を評価するための指標を提供する試薬として昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素を使用する場合において、より好ましくは、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素は、前記の群Bに示されるアミノ酸配列を有するc-Junアミノ末端リン酸化酵素であることが望ましい。
例えば、ポリヌクレオチド群Bに含まれる配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの取得方法を以下に示す。工程としては、ワタアブラムシから全RNAを取得し、cDNAライブラリーを合成して、PCR増幅を行うことによって目的のポリヌクレオチドを取得できる。
以上のようにして配列番号2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを取得することが可能である。
また、ポリヌクレオチド群Bに示されるポリヌクレオチドは、配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを基にして、前記の部位特異的変異導入法であるアンバー変異を利用する方法、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等によって変異が導入されたポリヌクレオチドを作製することによっても得ることが可能である。
また、ポリヌクレオチド群Bに示されるポリヌクレオチドは、配列番号2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド等をプローブとしたハイブリダイゼーション法によっても取得可能である。より具体的には、前記のSambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行(Cold Spring Harbor Laboratory press)等に記載される通常の方法に準じて行われるハイブリダイゼーション法に従い実施可能である。
また、ポリヌクレオチド群Bに示されるポリヌクレオチドは、既知のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列配列を基にプライマーを作製しPCRによって取得することも可能である。具体的には、チャバネゴキブリ(Blatella germanica)等の他の昆虫種におけるc-Junアミノ末端リン酸化酵素相同遺伝子を得るために、Codehop program(http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html)を利用してディジェネレートプライマーを設計する。この時、前述のワタアブラムシ由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子配列及び既に公知であるイヌコウチュウ(NCBI accession number AAF00539)、アフリカツメガエル(BAB91438及びBAB85483)、ヒト(NP_620448及びNP_002744)、マウス(BAC31240)、ラット(S43969)、ニワトリ(BAA19188)、キイロショウジョウバエ(AAF52883及びAAC47325)、 ガンビエハマダラカ(EAA05905)、ヒトスジシマカ(AAO31950)の配列を参考にする。選択した昆虫種におけるc-Junアミノ末端リン酸化酵素相同遺伝子の部分配列は、該昆虫種由来のcDNA第1鎖を鋳型とした一連のPCRにより増幅する。ここで、鋳型とするcDNA第1鎖は前述のSuperscript IIIを用いた方法により調製する。PCRには、フォワード及びリバースプライマーとしてそれぞれのディジェネレートプライマーと、Amplitaq Gold (Applied Biosystems社製)を用いて、付属される説明書に従って行う。PCRの条件は、94℃、10分間、続いて94℃、30秒間、45℃、1分間、72℃、予想される増幅産物の長さ1kbにつき1分間、を40サイクルとし、最後に72℃、7分間とする。PCR産物はアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のDNA断片をpCR-XL-TOPO vector (Invitrogen社製)にクローニング後、塩基配列を決定する。
3' RACE及び5' RACE反応には、SMART PCR cDNA Synthesis Kitに同梱されているuniversal primer mix (UPM)と、目的の遺伝子配列に特異的なフォワードプライマー又はリバースプライマーをそれぞれ組み合わせて用いる。PCRの条件は、94℃、10分間を1サイクル、94℃、15秒間、63℃、15秒間、72℃、1分間/期待される増幅産物の長さ1kbを40サイクル、72℃、7分間を1サイクルとした。得られたPCR産物はアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のDNA断片をpCR-XL-TOPO vector (Invitrogen社製)にクローニング後、該DNA断片の塩基配列を決定する。
1回目のPCRで明確な増幅産物が得られない場合には、1回目のPCR産物を鋳型としてnested PCRを行う。プライマーはSMART PCR cDNA Synthesis Kitに同梱されているNUP primerと、1回目のPCRに用いた特異的プライマーよりも内側に設計した特異的フォワード及びリバースプライマーをそれぞれ組み合わせて用いる。PCRの条件は、94℃、10分間を1サイクル、94℃、15秒間、63℃、15秒間、72℃、2分間を40サイクル、72℃、7分間を1サイクルとする。得られたPCR産物はアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のDNA断片をpCR-XL-TOPO vector (Invitrogen社製)にクローニング後、該DNA断片の塩基配列を決定する。
以上の配列決定により、昆虫のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のN末端領域をコードする5'末端配列及びC末端領域をコードする3'末端配列を明らかにする。
このようにして、ポリヌクレオチド群Bに示されるポリヌクレオチドは、既知の昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列配列を基にプライマーを作製しPCRによって取得することができる。
本発明における取得方法には、ハイブリダイゼーションにより所望のポリヌクレオチドを検出する工程、検出された所望のポリヌクレオチドを特定する工程、及び、特定された所望のポリヌクレオチドを回収する工程、が含まれる。以降に各工程を具体的に説明する。
具体的には例えば、配列番号2で示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列を有するDNAを、Random Primed DNA Labelling Kit(ベーリンガー社製)、Random Primer DNA Labelling Kit Ver.2(宝酒造社製)、ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Ditection System(Amersham biosciences社製)、Megaprime DNA-labelling system(Amersham biosciences社製)等を用いた公知の方法によってラジオアイソトープ標識又は蛍光標識することによって、これをプローブとして使用することができる。
ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、ストリンジェントな条件をあげることができ、具体的には例えば、6×SSC(0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム)、5×デンハルト溶液(0.1%(w/v) フィコール400、0.1%(w/v) ポリビニルピロリドン、0.1%BSA)、0.5%(w/v) SDS及び100μg/ml変性サケ***DNA存在下に、又は100μg/ml変性サケ***DNAを含むDIG EASY Hyb溶液(ベーリンガーマンハイム社)中で、65℃で保温し、次いで1×SSC(0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム)及び0.5%SDS存在下に、室温で15分間の保温を2回行い、さらに0.1×SSC(0.015M NaCl、0.0015Mクエン酸ナトリウム)及び0.5%SDS存在下に、68℃で30分間保温する条件をあげることができる。
より具体的には、例えば、ポリヌクレオチド群Bの塩基配列に対し相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドを鋳型にしてMegaprime DNA-labelling system(アマシムファルマシアバイオテク社製)を用いてキット指定の反応液を用いることにより32Pでラベルしたプローブを作成することが出来る。このプローブを用いて定法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行い、6×SSC(0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム)、5×デンハルト溶液(0.1%(w/v) フィコール400、0.1%(w/v) ポリビニルピロリドン、0.1%BSA)、0.5%(w/v) SDS及び100μg/ml変性サケ***DNA存在下に、又は100μg/ml変性サケ***DNAを含むDIG EASY Hyb溶液(ベーリンガーマンハイム社)中で、65℃で保温し、次いで1×SSC(0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム)及び0.5%SDS存在下に、室温で15分間の保温を2回行い、さらに0.1×SSC(0.015M NaCl、0.0015Mクエン酸ナトリウム)及び0.5%SDS存在下に、68℃で30分間保温することでハイブリダイズするポリヌクレオチド(を含むコロニー)を検出することができる。こうして、ハイブリダイゼーションにより所望のポリヌクレオチドを検出し、また検出された所望のポリヌクレオチドを特定することができる。
尚、ポリヌクレオチド群Bの塩基配列の部分塩基配列又はその部分塩基配列に対して相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドは、PCR法のみならず、前記のハイブリダイゼーション法を用いるポリヌクレオチド群Bに示されるポリヌクレオチドの取得にも使用することが可能である。より具体的には、配列番号3又は4で示される塩基配列からなるポリペプチドが挙げられる。
また、前記のc-Junアミノ末端リン酸化酵素を用いた有害生物防除能力の検定方法に用いるc-Junアミノ末端リン酸化酵素も、用いるc-Junアミノ末端リン酸化酵素をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いて、同様の方法で群Aに示される蛋白質を製造、取得することが可能である。
ポリヘドリン(多核体)遺伝子のプロモーターは、バキュロウィルスが昆虫細胞に感染したときに産生される核内封入体の主成分であるポリヘドリンをコードする遺伝子のプロモーターである。ポリヘドリンはウィルスの複製に必要な蛋白質ではなく、その遺伝子を目的の蛋白質の遺伝子と置き換えることによって細胞タンパクの50%に達する目的の蛋白質を発現させることができる。
プラスミドDNAは、比較的低分子の環状ポリヌクレオチドであり、例としては、大腸菌での遺伝子クローニングや遺伝子発現に用いられるpET(タカラバイオ社製)やpBluescriptII(Stratagene社製)等が挙げられる。また、バキュロウィルス発現カセットを含むpFastBac1、pFastBac HT A、pFastBac HT B、pFastBac HT C、pFastBac Dual、pBlueBacII (Invitrogen社製)、pAcSG2 (Pharmingen社製)等が挙げられる。
バクミドDNAは、バキュロウィルスゲノムを含むBAC(bacterial artificial chromosome)からなる高分子量のDNAであり、例えば大腸菌DH10BacTM に含まれるbMON14272 (136 kb) (Invitrogen社製)等が挙げられる。バクミドDNAは、巨大プラスミドとして大腸菌細胞の中で自己複製し、バキュロウィルスプロモーターの制御下の外来遺伝子発現カセットを含んでいる。
上記方法に従ってクローニングされたワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含むプラスミドDNAをEcoRIで切断し、得られる約1.3kbpのワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含むDNA断片を、あらかじめEcoRIで切断したプラスミドベクターpFastBac HT B (Invitrogen社製)とライゲーションする。こうして得られるプラスミドは、バキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含むDNA断片を含む環状ポリヌクレオチドの一例である。また、Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に記載される方法に従い、このプラスミドを大腸菌DH10Bacへ導入し、細胞内での組換え反応によって、ポリヘドリン遺伝子プロモーターとワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含む断片をバクミドDNAに挿入することが可能である。例えば以上の方法によって、バキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含むDNA断片を含む環状ポリヌクレオチドを製造、取得することができる。
また、同様に前記群Bに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドをベクターに連結して環状ポリヌクレオチドを製造することができる。
前記群Bに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体とは、例えば、バキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含むDNA断片が導入された形質転換大腸菌、が挙げられる。具体的には、以下の方法に従って作製することが可能である。
前記の、ワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含むDNA断片がEcoRIサイト及びXhoIサイト間に挿入されたプラスミドベクターpFastBac HT B (Invitrogen社製)は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載される方法に従い大腸菌細胞に導入することによって形質転換体を作製することができる。また同じプラスミドベクターを、Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に記載される方法に従い、大腸菌DH10Bacへ導入することによっても、形質転換体を作製することが可能である。また、前記の、ポリヘドリン遺伝子プロモーターとワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含む断片が挿入されたバクミドDNAを、Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に記載される方法に従い、昆虫細胞にトランスフェクションすることによって、形質転換体を得ることも可能である。
組換えバキュロウィルスの具体例としては、例えば、バキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含むDNA断片を含む組換えバキュロウィルスが挙げられる。
例えば、組換えバキュロウィルスは、昆虫細胞内においてバキュロウィルスDNAとトランスファーベクターDNAとの相同組換えによって作製することが可能である(Kitts (1996) Cytotechnology 20, 111-123)。また、例えば、前記方法で作製された、バキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含むDNA断片を含む組換えバクミドDNAを昆虫細胞へ導入することによって、組換えバキュロウィルスを作製することも可能である。
具体的には、前記のバキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含むDNA断片を含む組換えバクミドDNAを、Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に記載される方法に従い、昆虫細胞にトランスフェクションすることによって、組換えバキュロウィルスを作製することが可能である。より具体的には、前記組換えバクミドDNAは、Bac-to-Bac BaculovirusTM Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に従って、Sf9細胞(ATCC: CRL-1711)にトランスフェクションし、組み換えバキュロウイルスを得る。トランスフェクションには、セルフェクチン(Invitrogen社製)、Grace's Insect Cell Culture Medium supplemented with L-amino acids (Invitrogen社製、Gibco)、 10%ウシ胎児血清(Clontech社製)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies社製)を用いる。またトランスフェクションには、2 μgのバクミドDNAと7 μlのセルフェクチンを用いる。P1組み換えバキュロウイルスストックは、Bac-to-Bac BaculovirusTM Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に従って8日後に回収する。例えば、さらにこのバキュロウイルスストック0.5mlを、1×106 cells/mlのSf9細胞300mlに接種することで増幅することができる。増幅したバキュロウイルスストックは、Bac-to-Bac BaculovirusTM Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に従って4日後に回収する。Sf9細胞は三角フラスコにて27℃、135rpmの条件下で浮遊培養する。この培養に用いる培地の成分は、Grace's Insect Cell Culture Medium supplemented with L-amino acids (Invitrogen社製、Gibco)、10% ウシ胎児血清(Clontech社製) 、ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies社製)、終濃度0.1%プルロニックF-68(Sigma-aldrich社製)である。
例えば、c-Junアミノ末端リン酸化酵素は組換えバキュロウィルス/昆虫培養細胞Sf9発現系を用いることによって製造することができる。この発現系は最も強力で用途の広い真核生物細胞を用いた蛋白質発現系の一つであり、かび、植物、細菌、ウイルス等多くの生物材料由来の外来遺伝子発現系である。また、c-Junアミノ末端リン酸化酵素は、大腸菌発現系によっても製造可能である。この発現系は、異種蛋白質の大量発現系として原核生物の発現系で最もよく使用される系である。大腸菌は遺伝的にまた生理学的にも最もよく解析された生物であり、取り扱いも容易で、多くの技術が適用可能である。また、生育が早く、安価な培地で生育するため、異種蛋白質の合成能力が極めて高い系である。
また、形質転換体の培養によって産生された昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素は、超音波破砕やプレンチプレス、ダイノミル等の方法によって破砕され、細胞粗抽出液に含まれる形で回収し、イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー等の、酵素精製に通常用いられる手法を用いて精製物を得ることができる。また、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素がヒスタグ等のペプチド断片が結合した形で産生されるようにしておけば、細胞粗抽出液からヒスタグを特異的に認識し結合するアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって迅速に精製物を得ることが可能である。このような方法によって、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素を製造することが可能である。
例えば上記の、バキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含むDNA断片が導入された形質転換昆虫細胞、を培養し、さらには細胞をフレンチプレスで破砕し、カラムクロマトグラフィーによって精製することによって、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素を製造することができる。
より具体的には、例えば、前記の方法で作製された、バキュロウィルスのポリヘドリンプロモーターに機能可能な形で連結されたワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子を含むDNA断片を含む組換えバクミドDNAを含む組換えバキュロウィルスのストック液(例えば、30ml)にSf9細胞(例えば、4×108)を懸濁し、これを三角フラスコ(例えば、125ml)に入れて旋回培養(例えば、27℃、135rpm回転、1時間)する。培養後、得られた細胞懸濁液を三角フラスコ(例えば、250ml)3本に均等に分け、各三角フラスコの培養液の体積が当該三角フラスコ容量の2/5程度(例えば、100ml)となるまで新鮮な培地を加える。さらに、例えば、10%プルロニック溶液(例えば、1ml)等を添加した後、培養を継続する。培養(例えば、48時間)後、当該培養液をバキュロウィルスが感染したSf9細胞を遠心分離(例えば、290×g、5分間)することにより回収する。回収されたSf9細胞をバッファーA(50mM Hepes-HaOH pH7.5, 0.5M NaCl, 10mM imidazole)に再懸濁した後、当該細胞再懸濁液を試料として、前記Sf9細胞をフレンチプレス(Thermo Spectronic社製)を用いてバッファーA中で破砕する。細胞破砕のための圧力は、例えば、1,300〜1,500psiである。フレンチプレス処理後の細胞破砕液を遠心分離(例えば、13,000×g、2℃、20分間)することにより、上清を回収し、次いで回収された上清に対して0.45μmフィルター処理を施す。次に、このようにして調製された上清を、バッファーA(50mM Hepes-HaOH pH7.5, 0.5M NaCl, 10mM imidazole)で平衡化された2本直列に連結されたHiTrap HisTrapアフィニティーカラム(カラム体積5ml、Amersham biosciences社製)に注入した後、バッファーA(例えば、100ml)で当該カラムを洗浄する。次いで、Aバッファー93%とBバッファー(50mM Hepes-HaOH pH7.5, 0.5M NaCl, 500mM imidazole)7%とが混合されたバッファー(例えば、150ml)でカラムを洗浄する。最後にAバッファー50%とBバッファー50%とが混合されたバッファー(例えば、60ml)をカラムに注入する。この溶出画分を分画(例えば、1mlずつ)して保存し、当該溶出画分の一部をSDS-PAGE及び/又はウエスタンブロット法で解析することにより、46Kdaのc-Junアミノ末端リン酸化酵素タンパク質が含まれる溶出画分を特定する。またさらに、c-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性を増大させるために、MKK4/SKK1, active (Upstate社製)及び MKK7 beta 1, active (Upstate社製)を用いて保温処理することもできる。この場合、MKK4/SKK1, active (Upstate社製)及びMKK7 beta 1, active (Upstate社製)に付属される説明書に記載されるキナーゼアッセイ法を一部改変し、c-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性化を行うこともできる。尚、必要なバッファー及び試薬としては、例えば、以下のものを挙げることができる。
(i)Hepesバッファー、MgCl2、ATP
(ii)大腸菌で発現させた市販の組み換えMKK4/SKK1, active (Upstate社)
50mM Tris/HCl, Ph 7.5、150mM NaCl、0.1mM EGTA、0.03% Brij 35、270mM sucrose、1mM benzamidine、0.2mM PMSF、0.1% 2-mercaptoehtanol中に終濃度53.5μMでストックする。
(iii)大腸菌で発現させた市販の組み換えMKK7 beta 1, active (Upstate社)
50mM Tris/HCl, Ph 7.5、150mM NaCl、0.1mM EGTA、0.03% Brij 35、270mM sucrose、1mM benzamidine、0.2mM PMSF、0.1% 2-mercaptoehtanol中に終濃度14.6μMでストックする。
最初に、MilliQ水を1ml、500mM Hepes bufferを1ml、MKK4/SKK1, active (375nM)及びMKK7 beta1, active (375nM)の混合物を2ml、MgCl2 (75mM)及びATP (500μM) の混合物を2ml、を全て混合し、そこへc-Junアミノ末端リン酸化酵素(1mg/ml)を4ml加える。続いて、室温にて1時間インキュベートした。異なるバッチで活性化したc-Junアミノ末端リン酸化酵素を全て集め、終濃度が10%となるようにグリセロールを添加した後、1mlずつ小分けにして、-80℃に保存する。
また前記の方法とは別に、既報の論文(Ian N. Foltz, et al. (1998) The Journal of Biological Chemistry Vol 273, 9344-9351)に記載される、in vivo stimulationのような他の活性化方法の可能性も考えられる。
また、前記の群Bに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドやそれらに対して相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド、また前記の群Bに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの部分塩基配列又はその部分塩基配列に対して相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号3又は4で示される塩基配列からなるポリペプチドは、研究ツールとして使用することができる。例えば、これらの一部は、前記のようにc-Junアミノ末端リン酸化酵素の製造法に用いられるポリヌクレオチドとして機能する。また一部は、前記のようにして、PCRを用いるポリヌクレオチド群Bに示されるポリヌクレオチドの取得、或いは、ハイブリダイゼーションを用いるポリヌクレオチド群Bに示されるポリヌクレオチドの取得、等を実施するための重要な研究ツールとして使用できる。
特に、有害生物防除剤のスクリーニングを実施するにあたっては、スクリーニングのために実施する実験の実験ツールとして使用できる。具体的には、前記の有害生物防除能力の検定や、有害生物防除能力を有する化学物質の探索、等を実施するにあたって行う実験のための実験ツールとして使用することができる。
(1)ワタアブラムシからの全RNAの抽出
ポット植えのキュウリ葉上で飼育されたワタアブラムシ(Aphis gossypii)の成虫及び幼虫の混合した集団630mgを葉上から細筆又は小さなハケでかきとり、これを液体窒素中で乳鉢及び乳棒を用いて粉末状になるまで破砕した。凍結された破砕粉体からRNA抽出試薬ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用いてRNAを単離した。
乳鉢中の凍結された破砕粉体に10mlのISOGENを加えた後、前記破砕粉体を10分間磨砕した。この時、乳鉢は氷上に置いた状態で操作した。磨砕後、液体状の試料をピペットにて15mlチューブに移し、これに2mlのクロロホルム(和光純薬工業社製)を加えた。直ちに当該混合物を15秒間激しく混和した後、これを室温で3分間静置した。次いで静置された混和物を4℃、15分間、12,000×gで遠心分離した後、上層の水相を5mlずつ2本の新しいチューブに移した。ぞれぞれのチューブにISOGENを5ml加え、直ちに当該混合物を15秒間激しく混和した後、これを室温で3分間静置した。次いで静置された混和物を4℃、15分間、12,000×gで再度遠心分離した後、上層の水相10mlをそれぞれ新しい50mlチューブに移した。続いて、ぞれぞれのチューブにイソプロパノール(和光純薬工業社製)を10ml加えた後、当該混合物を氷上で30分間静置した。静置された混合物を4℃、10分間、12,000×gで遠心分離することにより、RNAを沈殿させた。上清を除去した後、残渣に20mlの70%エタノールを加えた。得られた混合物を4℃、5分間、10,000×gで分離した。上清を除去した後、チューブの口を下にして3分間静置することにより全RNAを沈殿させた。さらにこれを軽く乾燥させてから、当該沈殿を市販のRNase-free water(ナカライテスク社製)1mlに溶解させた。このようにして調製された全RNAの濃度(260 nmの吸光度から算出)は6.9mg/mlであった。
人工飼育されたチャバネゴキブリ(Blattella germanica)を成虫、幼虫、卵鞘の3種類の試料として準備した。成虫としては雄10頭及び雌(卵鞘を取り除いた個体)10頭で1.1g、幼虫としては雄10頭及び雌10頭で1.0g、卵鞘としては26個で1.0gを用いた。3種類の試料を別々の乳鉢及び乳棒を用いて、液体窒素中で粉末状になるまで破砕した。凍結された破砕粉体からRNA抽出試薬ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用いてRNAを単離した。乳鉢中の凍結された破砕粉体に10mlのISOGENを加えた後、前記破砕粉体を10分間磨砕した。この時、乳鉢は氷上に置いた状態で操作した。磨砕後、液体状の試料をピペットにて15mlチューブに移し、これに2mlのクロロホルム(和光純薬工業社製)を加えた。直ちに当該混合物を15秒間激しく混和した後、これを室温で3分間静置した。次いで静置された混和物を4℃、15分間、12,000×gで遠心分離した後、上層の水相を5mlずつ2本の新しいチューブに移した。ぞれぞれのチューブにISOGENを5ml加え、直ちに当該混合物を15秒間激しく混和した後、これを室温で3分間静置した。次いで静置された混和物を4℃、15分間、12,000×gで再度遠心分離した後、上層の水相10mlをそれぞれ新しい50mlチューブに移した。続いて、ぞれぞれのチューブにイソプロパノール(和光純薬工業社製)を10ml加えた後、当該混合物を氷上で30分間静置した。静置された混合物を4℃、10分間、12,000×gで遠心分離することにより、RNAを沈殿させた。上清を除去した後、残渣に20mlの70%エタノールを加えた。得られた混合物を4℃、5分間、10,000×gで遠心分離した。上清を除去した後、チューブの口を下にして3分間静置することにより全RNAを沈殿させた。さらにこれを軽く乾燥させてから、当該沈殿を市販のRNase-free water(ナカライテスク社製)1mlに溶解させた。このようにして調製された全RNAの濃度(260 nmの吸光度から算出)は、成虫由来の全RNAの場合には1.1mg/ml、幼虫由来の全RNAの場合には2.5mg/ml、卵鞘由来の全RNAの場合には1.4mg/mlであった。
ワタアブラムシ全RNAからのcDNA第1鎖は、RT-PCR用のRandom Primers (Invitrogen社製)及びSuperscript III (Invitrogen社製)を用いて、当該試薬に付属される説明書に従って合成された。
ワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素cDNA全長は、当該遺伝子配列に特異的なプライマーである配列番号3に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号4に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとPfu Turbo (Stratagene社製)とを用いてかつ前述のcDNAを鋳型として、当該試薬に付属される説明書に従ってPCR増幅された。尚、PCRの条件は、94℃、10分間、続いて94℃、30秒間、50℃、30秒間、72℃、2分間を30サイクルとし、最後に72℃、7分間とした。次いで得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的の1260bpのDNA断片を取得した。このようにして取得されたDNA断片をpCR-blunt vector (Invitrogen社製)にクローニングした。得られたベクターをoGAO58-59 in pCRbluntと名付け、クローニングされたDNA断片の塩基配列を決定し、クローニングされたDNA断片には配列番号2に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれていることを確認した。当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質であった。
チャバネゴキブリ(Blatella germanica)等の他の昆虫種におけるc-Junアミノ末端リン酸化酵素相同遺伝子を得るために、Codehop program(http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html)を利用してディジェネレートプライマーを設計する。この時、前述のワタアブラムシ由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列及び既に公知であるイヌコウチュウ(NCBI accession number AAF00539)、アフリカツメガエル(BAB91438、BAB85483)、ヒト(NP_620448、NP_002744)、マウス(BAC31240)、ラット(S43969)、ニワトリ(BAA19188)、キイロショウジョウバエ(AAF52883及びAAC47325)、 ガンビエハマダラカ(EAA05905)、ヒトスジシマカ(AAO31950)の塩基配列を参考にする。
選択された昆虫種におけるc-Junアミノ末端リン酸化酵素相同遺伝子の部分配列は、当該昆虫種由来のcDNA第1鎖を鋳型とした一連のPCRにより増幅する。ここで、鋳型とするcDNA第1鎖は、前述のSuperscript IIIを用いた方法により調製する。PCRには、フォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれのディジェネレートプライマーと、Amplitaq Gold (Applied Biosystems社製)とを用いて、当該試薬に付属される説明書に従ってPCR増幅される。尚、PCRの条件は、94℃、10分間、続いて94℃、30秒間、45℃、1分間、72℃、予想される増幅産物の長さ1kbにつき1分間、を40サイクルとし、最後に72℃、7分間とする。次いで得られるPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のDNA断片を取得した。さらにこのようにして取得されたDNA断片をpCR-XL-TOPO vector (Invitrogen社製)にクローニングした後、塩基配列を決定する。
このようにして、配列番号15に示される塩基配列からなるチャバネゴキブリのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子の部分配列を取得した。また当該塩基配列から推定されるアミン酸配列は、配列番号16に示される。
次に、得られた昆虫のc-Junアミノ末端リン酸化酵素相同遺伝子の部分配列に対する特異的プライマーを設計し、当該遺伝子の全長配列を獲得するために、3' RACE PCR 又は5' RACE PCRを実施する。3' 及び5' RACE PCRは、昆虫の全RNAより調製されたcDNA第1鎖を鋳型としてかつSMART PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech社製)を用いて、当該キットに付属される説明書に従って実施する。
3' RACE及び5' RACE反応には、SMART PCR cDNA Synthesis Kitに同梱されているuniversal primer mix (UPM)と、目的の遺伝子配列に特異的なフォワードプライマー又はリバースプライマーとをそれぞれ組み合わせて用いる。PCRの条件は、94℃、10分間を1サイクル、94℃、15秒間、63℃、15秒間、72℃、予想される増幅産物の長さ1kbにつき1分間、を40サイクル、72℃、7分間を1サイクルとした。次いで得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のDNA断片を取得した。さらにこのようにして取得されたDNA断片をpCR-XL-TOPO vector (Invitrogen社製)にクローニングした後、当該DNA断片の塩基配列を決定する。
1回目のPCRで明確な増幅産物が得られない場合には、1回目のPCR産物を鋳型としてnested PCRを行う。プライマーはSMART PCR cDNA Synthesis Kitに同梱されているNUP primerと、1回目のPCRに用いた特異的プライマーよりも内側に設計された特異的フォワードプライマー及びリバースプライマーをそれぞれ組み合わせて用いる。PCRの条件は、94℃、10分間を1サイクル、94℃、15秒間、63℃、15秒間、72℃、2分間を40サイクル、72℃、7分間を1サイクルとする。得られたPCR産物はアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のDNA断片を取得した。さらにこのようにして取得されたDNA断片をpCR-XL-TOPO vector (Invitrogen社製)にクローニングした後、当該DNA断片の塩基配列を決定する。
以上の配列決定により、昆虫のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のN末端領域をコードする5'末端配列及びC末端領域をコードする3'末端配列を明らかにする。
実施例2で取得されたプラスミドoGAO58-59 in pCRbluntをEcoRIで切断して得られた1272bpのDNA断片を単離・精製した後、遺伝子発現用ベクターpFastBac(登録商標)HTbのEcoRIクローニングサイトにライゲーションした。以下、得られたベクターをoGAO58-59 in pFastBacHTbと名付けた。
次いで実施例2で取得されたoGAO58-59 in pCRbluntを鋳型として、Pfu Turbo polymerase (Stratagene社)を用いたPCRを行うことにより、663bpのDNA断片を得た。PCRは当該試薬に添付される説明書に従って行い、プライマーは特異性の高いプライマーであり、配列番号5に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号6に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。PCRの条件は、95℃、5分間を1サイクル、95℃、30秒間、50℃、30秒間、72℃、1分30秒間を25サイクル、72℃、7分間を1サイクルとした。次いで得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分析・精製することにより、目的のDNA断片を取得した。さらにこのようにして取得されたDNA断片をpCR-blunt vector (Invitrogen社製)にクローニングした後、当該DNA断片の塩基配列を決定した。このようにして取得されたベクターをoGAO60-61 in pCRbluntと名付けた。
上記で取得されたoGAO60-61 in pCRbluntをBamHI/NdeIで切断して得られた605bpのDNA断片を単離し精製した後、oGAO58-59 in pFastBacHTbのBamHI/NdeIクローニングサイトにライゲーションした。得られたベクターをpGAO1.1.と名付けた。次いで塩基配列を決定した結果、コンストラクトに用いられたpFastBacHTbに変異が含まれていることが判明した。
pGAO1.1をBamHI及びEcoRIで切断して得られた切断物を、アガロースゲル電気泳動によって分析・精製することにより、目的とする1241bpのDNA断片を単離・精製した後、当該DNA断片を発現用ベクターpFastBac(登録商標)HTbのBamHI/EcoRI断片4850bpにクローニングした。先のpGAO1.1の代わりに得られた当該ベクターを pGAO1と名付けた。
このようにして取得されたpGAO1を用いて大腸菌DH10Bacのコンピテントセルを形質転換した。ワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素組み換えバクミドDNAは、形質転換された大腸菌DH10Bacから単離した。手順は全てBac-to-Bac BaculovirusTM Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に従った。
組み換えバクミド中に含まれる目的遺伝子の有無は、PCR解析により検証された。当該バクミドはM13フォワード(-40)プライマー及びM13リバースプライマーのサイトを含むので、M13フォワード(-40)プライマー及びM13リバースプライマーが用いられた。また、M13フォワード(-40)プライマー又はM13リバースプライマーとインサートに特異的なプライマーとの組み合わせも用いられた。各操作はBac-to-Bac BaculovirusTM Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に従って実施された。尚、各PCRの条件は以下であった。
(i)94℃、5分間
(ii)94℃、15秒間、60℃、15秒間、72℃、3分間を40サイクル
(iii)72℃、7分間
(i)94℃、5分間
(ii)94℃、15秒間、68℃(+1サイクルごとに0.5℃の減分)、15秒間、72℃、3分間を16サイクル
(iii)94℃、15秒間、60℃、15秒間、72℃、3分間を20サイクル
(iv)72℃、7分間
(i)94℃、5分間
(ii)94℃、15秒間、60℃、15秒間、72℃、3分間を40サイクル
(iii)72℃、7分間
(i)94℃、5分間
(ii)94℃、15秒間、65℃、15秒間、72℃、3分間を20サイクル
(iii)94℃、15秒間、65℃、15秒間、72℃、3分間(+1サイクルごとに5秒の増分)を25サイクル
(iv)72℃、7分間
(1)組み換えバクミドのトランスフェクション
Bac-to-Bac BaculovirusTM Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に従って、Sf9細胞(ATCC: CRL-1711)に組み換えバクミドpgao1.1をトランスフェクションすることにより、組み換えバキュロウイルスを得た。当該トランスフェクションでは、セルフェクチン(Invitrogen社製)、Grace's Insect Cell Culture Medium supplemented with L-amino acids (Invitrogen社製、Gibco)、 10%ウシ胎児血清(Clontech社製)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies社製)を使用した。2μgのバクミドDNAと7μlのセルフェクチンとを用いた。P1組み換えバキュロウイルスストックは、Bac-to-Bac BaculovirusTM Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に従って、8日後に回収された。
ワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素バキュロウイルスストックを、1×106 cells/mlのSf9細胞300mlに対してP1ウイルスストック又はP2以降のウイルスストック(MOI=0.1)を0.5ml接種することにより増幅した。増幅されたバキュロウイルスストックは、Bac-to-Bac BaculovirusTM Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に従って、4日後に回収された。尚、Sf9細胞は三角フラスコ(Elscolab社製)にて27℃、135rpm回転の条件下で浮遊培養された。培地成分は、Grace's Insect Cell Culture Medium supplemented with L-amino acids (Invitrogen社製、Gibco)、10% ウシ胎児血清(Clontech社製) 、ペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies社製)、終濃度0.1%プルロニックF-68(Sigma-aldrich社製)が使用された。
因みに、バキュロウィルスストックのタイターは、Bac-to-Bac BaculovirusTM Expression System(Invitrogen社製)に付属される説明書に従ってプラークアッセイにより決定された。但し、プラークアッセイに使用される培地は、4%寒天の代わりに2%寒天が使用された。
ワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素遺伝子が導入された組み換えバキュロウイルスストック30mlに4×108個のSf9細胞を懸濁し、これを125mlの三角フラスコ(Elscolab社製)に入れて27℃、135rpm回転で1時間旋回培養した。培養後、得られた細胞懸濁液を250mlの三角フラスコ(Elscolab社)3本に均等に分け、各三角フラスコ内の培養液の体積が100mlになるまで実施例5に記載された培地を加えた。このようにして調製された培養液内でSf9細胞を27℃、135rpm回転で48時間旋回培養した後、当該培養液を1200rpmで遠心分離することにより、バキュロウイルスが感染したSf9細胞を回収した。尚、回収されたSf9細胞は、液体窒素により瞬間凍結し、使用するまで-80℃にて保存された。
(1)粗抽出液の調製
凍結保存しておいたバキュロウイルスが感染したSf9細胞を、30 ml のバッファーA(50mM Hepes pH 7.5, 0.5M NaCl, 10mM imidazole)に再懸濁した後、当該細胞再懸濁液を試料として、前記Sf9細胞をフレンチプレス(Thermo Spectronic社製)を用いてバッファーA中で破砕した。細胞破砕のための圧力は1300-1500 psiであった。フレンチプレス処理後の細胞破砕液を13,000×g、2℃、20分間遠心分離することにより、上清を回収し、次いで回収された上清に対して0.45μmフィルター処理を施した後、これを氷上に置いた。
ワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素を、pFastBacHTb中に6xHisタグを付加した状態でクローニングした。次いで組み換えタンパク質を、HiTrap Chelating HP (Amersham biosciences社製)又はHisTrap HP (Amersham biosciences社製)カラムを用いて、当該カラムに付属される説明書に従って金属アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。尚、精製の各ステップではAKTA-FPLC (Amersham biosciences社製)が使用された。
HiTrap/HisTrapアフィニティーカラム(Amersham biosciences社製)は、当該カラムに付属される説明書に従って調製された。開始バッファーであるバッファーAの組成は、50mM Hepes pH 7.5, 0.5M NaCl, 10mM imidazoleとした。溶出バッファーであるバッファーBの組成は50mM Hepes pH 7.5、0.5M NaCl、500mMイミダゾールとした。ワタアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素の精製は以下の手順で行った。
(ii)カラムの体積(CV)の10倍量のバッファーAによる非結合タンパク質の洗浄
(iii)CVの15倍量の15% バッファーB (75 mMイミダゾール)によるカラムの平衡化
(iv)CVの13倍量の50 %バッファーB (250 mMイミダゾール)による精製タンパク質の溶出
(v)CVの10倍量の100 %バッファーB(500 mMイミダゾール)によるカラムの洗浄
SDS-PAGE及びウエスタンブロットにより分析した後、目的の溶出画分を集めて、これに終濃度が10%となるようにグリセロールが添加された。タンパク質濃度は、Pre-diluted Protein Assay Standards: Bovine Serum Albumin Fraction V Set(Bio-Rad社製)を用いて、ブラッドフォード法により測定した。手順は当該キットに添付される説明書に従った。次いで集められた溶出画分は小分けし、これを直ちに液体窒素にて瞬間凍結した後、-80℃で保存した。
(3)c-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性化
c-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性を増大させるために、MKK4/SKK1, active (Upstate社製)及びMKK7 beta 1, active (Upstate社製)を用いて保温処理した。この場合、MKK4/SKK1, active (Upstate社製)及びMKK7 beta 1, active (Upstate社製)に付属される説明書に記載されるキナーゼアッセイ法を一部改変し、c-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性化を行った。尚、必要なバッファー及び試薬は以下の通りであった。
(i)Hepesバッファー、MgCl2、ATP
(ii)大腸菌で発現させた市販の組み換えMKK4/SKK1, active (Upstate社)
50mM Tris/HCl, Ph 7.5、150mM NaCl、0.1mM EGTA、0.03% Brij 35、270mM sucrose、1mM benzamidine、0.2mM PMSF、0.1% 2-mercaptoehtanol中に終濃度53.5μMでストックする。
(iii)大腸菌で発現させた市販の組み換えMKK7 beta 1, active (Upstate社)
50mM Tris/HCl, Ph 7.5、150mM NaCl、0.1mM EGTA、0.03% Brij 35、270mM sucrose、1mM benzamidine、0.2mM PMSF、0.1% 2-mercaptoehtanol中に終濃度14.6μMでストックする。
精製されたc-Junアミノ末端リン酸化酵素のリン酸化は最終体積が10mlとなるようにし、以下の手順で行った。
最初に、1mlのMilliQ水、1mlの500mM Hepes buffer、2mlのMKK4/SKK1, active (375nM)及びMKK7 beta1, active (375nM)の混合物、2mlのMgCl2 (75mM)及びATP (500μM) の混合物を全て混合し、当該混合物に4mlのc-Junアミノ末端リン酸化酵素(1mg/ml)を加えた。次いで、室温で1時間保温処理した。異なるバッチで活性化されたc-Junアミノ末端リン酸化酵素を全て集めて、これに終濃度が10%となるようにグリセロールが添加された。次いで、これに1mlずつ小分けにして、-80℃で保存した。
c-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を変化させる化合物の選抜は、実施例7で調製されたアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素を用いた試験管内反応系に、試験化合物を添加することによって変化するc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性を測定し、評価する系で実施した。
アブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性測定は、IMAP screening Express Kit with progressive Binding system(Molecular Device社製)を用いてかつアミノ基末端にビオチンが付加された配列番号13で示されるアミノ酸配列からなるペプチド及びカルボキシルキ末端が蛍光標識された配列番号14で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを基質として、当該システムに付属される取扱説明書に記載される方法に準じて実施した。
当該活性測定に、最終濃度が10μMとなるようにDMSOに溶解された試験化合物を含ませた時のアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性測定を実施した。また、試験化合物に代わりにDMSOを含ませた時のアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性測定を実施した。次いで試験化合物に代わりにDMSOを含ませた時のアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性測定値に対する、DMSOに溶解された試験化合物を含ませた時のアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性値が何%になるかを算出し、その算出値を100%から差し引いた値を阻害度(%)とした。各試験化合物における結果を、実施例9の結果と合わせて実施例9における表4に示した。
また上記の活性測定に、最終濃度が各々、100μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μMとなるような濃度でDMSOに溶解された試験化合物を含ませた時のアブラムシのc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性測定を実施した。各試験化合物における各濃度での結果から濃度依存性試験解析ソフトXL fit(idbs社製)を用いてIC50(μM)を算出した。その結果を、実施例9の結果と合わせて実施例10における表5に示した。
下記の組成(表3)からなる滅菌済み人工飼料を調製した。次いで、最終濃度が640μMとなるようにDMSOに溶解された試験化合物を当該人工飼料の0.5%容量添加・混合すること以外は、Handbook of Insect Rearing Vol.1 (Elsevier Science Publisers 1985) 35頁〜36頁に記載される方法と同様にしてワタアブラムシを飼育した。飼育6日後にワタアブラムシの生存数を調査し、次の式により防除価を求めた。
防除価(%)={1−(Cb×Tai)/(Cai×Tb)}×100
尚、式中の文字は以下の意味を表す。
Cb:無処理区の処理前の虫の生存数
Cai:無処理区の観察時の虫の生存数
Tb:処理区の処理前の虫の生存数
Tai:処理区の観察時の虫の生存数
その結果を、実施例8の結果と合わせて、実施例9における表4に示した。
最終濃度が50ppmとなるようにDMSOに溶解された試験化合物を添加すること以外は実施例9と同様にして、殺虫活性試験を実施した。その結果を、実施例8の結果と合わせて、実施例10における表5に示した。
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号4
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号5
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号6
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号7
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号8
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号9
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号10
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号11
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号12
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号13
c-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性測定において用いられる基質として調製されたアミノ基末端にビオチンが付加されたペプチド
配列番号14
c-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性測定において用いられる基質として調製されたカルボキシル基末端が蛍光標識されたペプチド
Claims (36)
- 有害生物の生理状態に変化を与える薬剤であり、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)の活性を変化させる能力を有することを特徴とする薬剤。
- 昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素が、ワタアブラムシ由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素であることを特徴とする請求項1記載の薬剤。
- 有害生物の生理状態に変化を与える薬剤が、有害生物防除剤であることを特徴とする請求項1記載の薬剤。
- 昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)の活性を変化させる能力が、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)と配列番号14で示されるペプチドとの反応を阻害する能力であることを特徴とする請求項1記載の薬剤。
- 有効成分として、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)の活性を変化させる能力を有する化学物質又はその農学的に許容される塩を含有することを特徴とする有害生物防除剤。
- 前記化学物質が、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素と配列番号14で示されるペプチドとの反応を阻害する能力を有する化学物質であることを特徴とする請求項5記載の有害生物防除剤。
- 前記化学物質が、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素と配列番号14で示されるペプチドとの無細胞反応系において、前記化学物質の存在濃度が10μM以上の場合に、当該化学物質が存在しない場合よりもc-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性が低くなるように阻害する能力を有する化学物質であることを特徴とする請求項6記載の有害生物防除剤。
- 前記化学物質が、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素と配列番号14で示されるペプチドとの反応の無細胞反応系において、100μM以下のIC50となるように阻害する能力を有する化学物質であることを特徴とする請求項6記載の有害生物防除剤。
- 被験物質が有する有害生物防除能力の検定方法であって、
(1)下記の群Aから選択されるc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)と被験物質との接触系内における前記c-Junアミノ末端リン酸化酵素の活性を測定する第一工程、及び
(2)第一工程により測定された活性と対照における活性とを比較することにより得られる差異に基づき前記物質の有害生物防除能力を評価する第二工程、
を有することを特徴とする方法。
<群A>
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有する蛋白質
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列と83%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有する蛋白質
(d)配列番号2で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質
(e)配列番号2で示される塩基配列と65%以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有する蛋白質
(f)配列番号2で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有する蛋白質
(g)昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列からなる蛋白質
(h)ワタアブラムシ由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列からなる蛋白質 - 請求項9記載の検定方法により評価された有害生物防除能力を有する物質を選抜することを特徴とする有害生物防除能力を有する物質の探索方法。
- 請求項10記載の探索方法により選抜された物質又はその農学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする有害生物防除剤。
- 請求項5、6、7、8又は11記載の有害生物防除剤の有効量を、保護すべき作物、有害生物又は有害生物の生息場所に施用することを特徴とする有害生物防除方法。
- 請求項9記載の検定方法により評価された有害生物防除能力を有する物質を特定し、特定された有害生物防除能力を有する物質と有害生物とを接触させることを特徴とする有害生物防除方法。
- 下記の群Bのいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)。
<群B>
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(d)配列番号2で示される塩基配列を有するアミノ酸配列
(e)配列番号2で示される塩基配列と75%以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(f)配列番号2で示される塩基配列に対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつc-Junアミノ末端リン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(g)ワタアブラムシ由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素が有するアミノ酸配列 - 有害生物防除能力を評価するための指標を提供する試薬としての、昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素の使用。
- 有害生物防除能力を評価するための指標を提供する試薬としての、請求項14記載の昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素の使用。
- 請求項14記載のc-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
- 配列番号2で示される塩基配列からなることを特徴とする請求項17記載のポリヌクレオチド。
- 請求項17又は18記載のポリヌクレオチドが有する塩基配列に対し相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
- 請求項17又は18記載のポリヌクレオチドの部分塩基配列又はその部分塩基配列に対して相補性を有する塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
- 配列番号3又は4で示される塩基配列からなることを特徴とする請求項20記載のポリヌクレオチド。
- c-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの取得方法であって、請求項20又は21記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより所望のポリヌクレオチドを増幅する工程、増幅された所望のポリヌクレオチドを特定する工程、及び、特定された所望のポリヌクレオチドを回収する工程、を有することを特徴とする方法。
- c-Junアミノ末端リン酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの取得方法であって、請求項19、20又は21記載のポリヌクレオチドをプローブとして用いたハイブリダイゼーションにより所望のポリヌクレオチドを検出する工程、検出された所望のポリヌクレオチドを特定する工程、及び、特定された所望のポリヌクレオチドを回収する工程、を有することを特徴とする方法。
- 請求項17又は18記載のポリヌクレオチドを、バキュロウイルス由来のプロモーターに機能可能な形で連結してなることを特徴とする環状ポリヌクレオチド。
- バキュロウイルス由来のプロモーターが、ポリヘドリン遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項24記載の環状ポリヌクレオチド。
- 請求項24又は25記載の環状ポリヌクレオチドであって、宿主細胞内で自己複製の為の複製開始点を有することを特徴とする環状ポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドが、バキュロウイルスシャトルベクターの塩基配列を有し、昆虫細胞内でウイルスとして増殖可能であるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項24、25又は26記載の環状ポリヌクレオチド。
- 請求項17又は18記載のポリヌクレオチドをベクターに連結することを特徴とする環状ポリヌクレオチドの製造方法。
- 請求項17又は18記載のポリヌクレオチドが導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 形質転換体が形質転換昆虫細胞であることを特徴とする請求項29記載の形質転換体。
- 請求項17又は18記載のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体の製造方法。
- 請求項17又は18記載のポリヌクレオチドをゲノムに含むことを特徴とする組換えバキュロウィルス。
- 請求項29又は30記載の形質転換体を培養し、産生された昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)を回収する工程を有することを特徴とするc-Junアミノ末端リン酸化酵素の製造方法。
- 研究ツールとしての、請求項14記載の昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素或いは請求項17乃至21のいずれかの請求項記載のポリヌクレオチドの使用。
- 研究ツールが有害生物防除剤をスクリーニングするための実験ツールであることを特徴とする請求項34記載の「使用」。
- 被験物質について、当該被験物質が有する昆虫由来のc-Junアミノ末端リン酸化酵素(c-Jun NH2-terminal kinase)の活性を変化させる能力に係るデータ情報を入力・蓄積・管理する手段、前記データ情報を所望の条件に基づき照会・検索する手段、及び、照会・検索された結果を表示・出力する手段を具備することを特徴とするシステム。
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