JP2006527028A - Integrated device for extraction and insemination of microfluidic sperm - Google Patents

Integrated device for extraction and insemination of microfluidic sperm Download PDF

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Abstract

【課題】
【解決手段】微細流体***の抽出と卵母細胞の受精を行う一体型装置であって、これにより活発な***サンプルを用いて繊細な手技を最小限にして試験管内で受精させることができる。***の選別は、より活発な***が***と媒質液の層流間の界面を横切って移動する公知のソートチャネルを用いて行われる。【Task】
An integrated apparatus for extracting microfluidic sperm and fertilizing an oocyte, whereby an active sperm sample can be fertilized in a test tube with a minimum of delicate procedures. Sperm sorting is performed using a known sort channel in which more active sperm move across the interface between the laminar flow of semen and medium fluid.

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２００３年６月６日に出願された米国仮出願番号６０／４７６，６６４号の利益を主張するものである。 CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS This application claims the benefit of US Provisional Application No. 60 / 476,664, filed June 6, 2003.

発明の背景
１．発明の分野
本発明は、***の運動性によって***をソート（選別）し、ソートした***を卵母細胞に授精させる一体型の微細流体装置、これに用いる方法、さらに卵母細胞の微細流体授精方法に関する。 Background of the Invention FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to an integrated microfluidic device for sorting spermatozoa according to sperm motility and inseminating the sorted sperm into an oocyte, a method used therefor, and microfluidic insemination of an oocyte Regarding the method.

２．背景技術
従来の試験管内授精技術は、活発でないな***、奇形の***、細胞の残骸等から活発な***を分離する工程を含むが、これにより***がダメージを受ける場合があった。それでも、人工的な選別はしばしば必要である。卵母細胞に***を授精させる場合はさらに、壊れやすい卵母細胞にダメージを与えうる多数の工程を含む。例えば、細胞質内への***注入を行う場合、特に***の生存率が低い場合、微細操作技術を用いて卵子に１つの***を注入する場合などである。ところが卵母細胞の５−７％はこのプロセスで溶解してしまう。この観点からセンターウェル培養皿での人工授精が望ましいが、***の濃度が低いと受精率が相当低下してしまう。 2. BACKGROUND ART Conventional in vitro insemination techniques include the step of separating active sperm from inactive sperm, malformed sperm, cell debris, etc., which may damage the sperm. Nevertheless, artificial sorting is often necessary. Insemination of sperm into an oocyte further includes a number of steps that can damage fragile oocytes. For example, when sperm injection into the cytoplasm is performed, particularly when the sperm survival rate is low, a single sperm is injected into an egg using a fine manipulation technique. However, 5-7% of the oocytes are lysed by this process. From this point of view, artificial insemination in a center well culture dish is desirable, but if the concentration of sperm is low, the fertilization rate is considerably reduced.

人間の人工授精は、婚姻した夫婦に不妊の問題がある場合によく用いられる。しかし、人工授精は動物類においても、子の性別をコントロールしたり他の理由で用いられる。この処理は上述のように複雑で、顕微鏡による操作工程を伴うため、一般に非常に高価となる。   Human artificial insemination is often used when a married couple has infertility problems. However, artificial insemination is also used in animals to control offspring sex and for other reasons. Since this process is complicated as described above and involves an operation step using a microscope, it is generally very expensive.

独立型で、廉価で、***の選別と卵母細胞の授精の両方が可能で、操作工程が少なく、これによりコストが低減され授精効率を増加させた、人口授精のための装置が望まれていた。さらに、従来の培養方法より***濃度が低い場合にも効果的な授精方法が望まれていた。   There is a need for a device for artificial insemination that is stand-alone, inexpensive, capable of both sperm sorting and oocyte insemination, has fewer operational steps, thereby reducing costs and increasing insemination efficiency. It was. Furthermore, an effective insemination method has been desired even when the sperm concentration is lower than the conventional culture method.

発明の概要
運動性に基づき***をソートし、ソートした***と卵母細胞を授精させる一体型装置であって、***用と媒質液用の最低２つの重力駆動ポンプと、より活発な***が***および媒質液の層流間の境界を越えて移動する共通ソートチャネルとを備える。この媒質液は、より活発な***を取り込み、捕獲した卵母細胞を”チップ上で”受精させ、あるいは微細流体装置を用いて捕獲した卵母細胞を授精させる SUMMARY OF THE INVENTION An integrated device that sorts sperm based on motility and fertilizes the sorted sperm and oocyte, with at least two gravity-driven pumps for sperm and medium fluid, and more active sperm And a common sort channel that moves across the boundary between the laminar flows of the liquid medium. This medium fluid takes up more active sperm and fertilizes the captured oocytes “on the chip” or fertilizes the captured oocytes using a microfluidic device

本発明の一体型装置は”チップ上で”***をソートするものであり、これは***など***を含有する流体と、***が生存しうる媒質液との層流の境界を越えて移動する***の運動能力を利用する。この原理が図２に示されており、媒質液と***の流れが共通ソートチャネルにて合流し、より活発な***が２つの流れの境界を越えて移動する。２つの流れはその後分離される。この結果、媒質液に活発な***が取り込まれる。このプロセスは、並列または直列あるいはこの両方で繰り返し行われ、効率のよい***の選別が行われる。このような選別法が、Schuster他による"Isolation of Motile Sperm From Semen Samples Using Microfluidecs", REPROD. BIOMED. ONLINE 7, 75-81に記載されている。   The integrated device of the present invention sorts sperm "on the chip", which moves across a laminar boundary between a fluid containing sperm, such as semen, and a medium fluid in which the sperm can survive. Use your athletic ability. This principle is illustrated in FIG. 2, where the fluid and semen flows merge in a common sort channel, and the more active sperm moves across the boundary of the two flows. The two streams are then separated. As a result, active sperm is taken into the medium fluid. This process is repeated in parallel and / or in series for efficient sperm sorting. Such a sorting method is described in "Isolation of Motile Sperm From Semen Samples Using Microfluidecs" by Schuster et al., REPROD. BIOMED. ONLINE 7, 75-81.

効率的な選別を可能とするには、層流が必須となる。マイクロ流体装置では、小さなチャネルにごく少量の流体で一定の流量とする必要があるが、これが従来の注射器やポンプ等では困難であった。流量や流圧の変動により障害が生じ、流れに乱れが生じてしまう。この乱れにより、***を選別するソートチャネルが破壊され混流作用が生じる。定量で、少ない流量とするため、本発明の装置は定量ヘッド（constant head）を備える重力駆動水平ポンプ（gravity driven horizontal pump）を用いる。この定量ヘッドにより、際だって安定した流量を得ることができる。重力駆動ポンプについては、本発明の装置による***ソート部とともに後に詳述する。   To enable efficient sorting, laminar flow is essential. In a microfluidic device, it is necessary to have a constant flow rate with a very small amount of fluid in a small channel, but this is difficult with a conventional syringe or pump. Disturbances occur due to fluctuations in the flow rate and flow pressure, and the flow is disturbed. This disturbance destroys the sort channel that sorts sperm and causes a mixed flow effect. In order to achieve a low flow rate with a fixed amount, the apparatus of the present invention uses a gravity driven horizontal pump with a constant head. With this quantitative head, an extremely stable flow rate can be obtained. The gravity driven pump will be described in detail later together with the sperm sorting unit by the apparatus of the present invention.

本発明の一体型装置の残りの構成要素は、授精チャンバである。蓄えられた***はソートチャネルから直接、あるいは後続のソート***リザーバ内の第１層から、授精チャンバに入る。チャンバ内には最初に１またはこれ以上の卵母細胞が導入され、これらは適切なバリヤにより、流体および***は通過可能であるが卵母細胞がチャンバを出ないよう守られている。授精チャンバはそれ自体単独で、あるいは層流を用いた***選別法あるいは従来の選別法で分離された***とともに用いることができる。驚くべきことに、***濃度が低い場合、センターウェル式、培養チューブ式、またはオイル下での微細ドロップといった従来の培養技術より微細流体授精の方が効果的である。   The remaining component of the integrated device of the present invention is the insemination chamber. The stored sperm enters the insemination chamber directly from the sort channel or from the first layer in the subsequent sort sperm reservoir. One or more oocytes are initially introduced into the chamber and are protected by a suitable barrier to allow fluids and sperm to pass but not to leave the chamber. The insemination chamber can be used by itself or with sperm separated by laminar sperm sorting or conventional sorting. Surprisingly, at low sperm concentrations, microfluidic insemination is more effective than conventional culture techniques such as centerwell, culture tube, or fine drop under oil.

上述した***の選別および卵母細胞の授精の各局面で加わる力は非常に微小であるため、授精の失敗や、***、卵母細胞、および受精卵のダメージは最小限となる。この装置には様々な材料を用いることができる。しかしながら、生物学的に不活性であり扱いが容易であるキャスタブル（castable）シリコンを好適に用いることができる。以下に、この装置について構成要素ごとに詳細に説明する。   Since the force applied in each aspect of sperm selection and oocyte insemination described above is very small, insemination failure and damage to sperm, oocytes, and fertilized eggs are minimized. Various materials can be used for this device. However, castable silicon that is biologically inert and easy to handle can be suitably used. Below, this apparatus is demonstrated in detail for every component.

重力駆動微細流体ポンプシステムは、水平配置された液体供給リザーバと、ポンプ流体が流れるマイクロチャネルを介して連結され水平配置された出口リザーバとを備える。液体供給リザーバは実質的に水平であり、動作に必要な量の液体を運搬するのに十分なサイズを有する。「実質的に水平」とは、供給リザーバ内の液体により生じる静水圧が比較的一定である水平あるいはほぼ水平の位置をいう。水平リザーバは、絶対的な水平位置から外れて、静水圧を作為的に発生させ時間を変化させるポンプシステムを作成してもよい。通常、水平から１０°以下の傾きであり、好ましくは５°以下が適切である。例えば１−３°といったごく僅かな傾きを供給出口に向けて設けると、排出される液体とリザーバの壁との間の表面張力による反対作用が生じる。一般に所定時間必要となる液量を確保すべく、供給リザーバの容量は液体が流れる微細チャネルの容量より一般に大きいことが望ましい。例えば、１０００−３０００ｎＬ／時の流量レートでは、リザーバの容量は数ｍＬとなる。重力駆動ポンプは実質的に定量”ヘッド”に液体を供給する。   The gravity driven microfluidic pump system includes a horizontally disposed liquid supply reservoir and an horizontally disposed outlet reservoir connected via a microchannel through which the pump fluid flows. The liquid supply reservoir is substantially horizontal and has a size sufficient to carry the amount of liquid required for operation. “Substantially horizontal” refers to a horizontal or nearly horizontal position where the hydrostatic pressure caused by the liquid in the supply reservoir is relatively constant. The horizontal reservoir may deviate from an absolute horizontal position to create a pump system that intentionally generates hydrostatic pressure and changes time. Usually, the inclination is 10 ° or less from the horizontal, preferably 5 ° or less. If a very slight inclination, for example 1-3 °, is provided towards the supply outlet, there will be an opposite effect due to the surface tension between the liquid to be discharged and the wall of the reservoir. Generally, it is desirable that the capacity of the supply reservoir is generally larger than the capacity of the fine channel through which the liquid flows in order to ensure the amount of liquid required for a predetermined time. For example, at a flow rate of 1000-3000 nL / hour, the capacity of the reservoir is several mL. Gravity driven pumps substantially supply liquid to a metered “head”.

リザーバは直線的な中空セクションを構成してもよいし、スペースの節約のためＵ字型または水平スパイラルに曲げられていてもよい。好ましい構成が図５に示されており、これについては後に詳述する。この空胴セクションの内側断面は任意の形状であってよい。好適には内部断面は半円形状であるが、内部の液体が外部に漏れないよう十分な表面張力を有する形状であれば長円形、四角形、三角形、八角形（多面体）または他の断面形状であってもよい。液体は、ほぼ空の場合でも表面張力によりリザーバの高さ全体に亘る。この断面形状はリザーバの長さに沿って変化し、リザーバ内の液量により定められるタイミングで場所ごとに異なる静水圧がかかるようにしてもよい。このマイクロ流体装置に別の供給リザーバを連結して、より長い時間液体を供給してもよい。例えば、ガラス管のリザーバに標準的な微細流体コネクタを設け、例えばポリジメチルシロキサンのエストラマー（ＰＤＭＳ）やポリスルホン等の適切な管を介してマイクロ流体装置と接続できるようにしてもよい。このような装置では、供給リザーバとマイクロチャネルとの少なくとも一部の高さは異なっており、これにより供給リザーバを水平配置した場合に、リザーバとマイクロチャネル出口の間に重力による静水圧状態が生じる。マイクロチャネルは水平、傾斜、垂直のいずれでもよいが、水平が好ましい。   The reservoir may constitute a straight hollow section or be bent into a U-shape or a horizontal spiral to save space. A preferred configuration is shown in FIG. 5, which will be described in detail later. The inner cross section of the cavity section may be any shape. Preferably, the inner cross section is semicircular, but any oval, quadrilateral, triangular, octagonal (polyhedron) or other cross-sectional shape can be used as long as it has sufficient surface tension so that the liquid inside does not leak to the outside. There may be. The liquid spans the entire height of the reservoir due to surface tension even when it is almost empty. This cross-sectional shape may change along the length of the reservoir, and different hydrostatic pressures may be applied to each place at a timing determined by the amount of liquid in the reservoir. Another supply reservoir may be connected to the microfluidic device to supply the liquid for a longer time. For example, a standard microfluidic connector may be provided in the glass tube reservoir so that it can be connected to the microfluidic device via a suitable tube, such as polydimethylsiloxane elastomer (PDMS) or polysulfone. In such a device, the height of at least a part of the supply reservoir and the microchannel is different, so that when the supply reservoir is horizontally arranged, a hydrostatic pressure state due to gravity occurs between the reservoir and the microchannel outlet. . The microchannel may be horizontal, inclined, or vertical, but is preferably horizontal.

液体供給リザーバの”直径”または断面寸法は、液体とリザーバ壁との間の表面張力が、与えられたリザーバ内径においてリザーバ内の液体を保持するのに十分であればよく、ただしこの内径は表面張力により流れが妨げられない程度に小さくてはならない。この表面張力と内部寸法の関係は、リザーバの内部断面形状、リザーバの内壁の材質、液体の性状など様々な要素により変化する。特定のリザーバが適当か否かは、そのリザーバに液体を満たしこれに連結したマイクロチャネルに液体を送り込む間に液体を安定的に保持するかを観察することにより容易に評価することができる。   The “diameter” or cross-sectional dimension of the liquid supply reservoir need only be such that the surface tension between the liquid and the reservoir wall is sufficient to hold the liquid in the reservoir at a given reservoir inner diameter, although this inner diameter is the surface It must not be so small that the flow is not hindered by tension. The relationship between the surface tension and the internal dimensions varies depending on various factors such as the internal cross-sectional shape of the reservoir, the material of the inner wall of the reservoir, and the properties of the liquid. Whether or not a particular reservoir is suitable can be easily evaluated by observing whether the liquid is stably held while the reservoir is filled with the liquid and fed into the microchannel connected thereto.

例えば、断面形状が正方形または矩形のリザーバは、内部断面における角の壁と液体との相互作用が増大し、非円形の断面により容量に比して液面が高くなるため、断面が円形の場合よりも大きな”直径”を期待できる。水様の流体には、親水性の内壁は、親水性の低い（または、疎水性の高い）壁面より流体−壁面間の相互作用が低くなる。最後に、流体自体の性質が重要である。流体内に表面張力が低下する化合物があると、これに応じて最大”直径”が変化する。   For example, a reservoir with a square or rectangular cross-section has a circular cross section because the interaction between the corner walls and the liquid in the internal cross section increases and the liquid level is higher than the volume due to the non-circular cross section. A larger “diameter” can be expected. For water-like fluids, a hydrophilic inner wall has a lower fluid-wall interaction than a less hydrophilic (or more hydrophobic) wall. Finally, the nature of the fluid itself is important. If there is a compound with a reduced surface tension in the fluid, the maximum “diameter” will change accordingly.

例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を１．０重量％含む流体では、内径（”Ｉ．Ｄ．”と称す）が５−６ｍｍのリザーバは表面張力により流体を保持できず、これに対し２．５ｍｍのリザーバは高い表面張力を示す。しかしながら、名目上の直径が３．５ｍｍから４．０ｍｍの間のリザーバは、このような適用例に非常に適していることが分かる。様々な内部”直径”／形状の適切さは、第１に、リザーバを水平にしたときに流体がリザーバ内に保持されるかをみて、流体が自ら流れ出ないかを確認し；第２に、リザーバの壁と流体の相互作用がそれほど高くなく、リザーバと与えられたマイクロチャネルとの所望の流量が得られないか確認する、ことにより容易に検証することができる。マイクロ流体装置のチャネルは、供給リザーバとマイクロチャネル間の（重力場に対する）高さの差から生じる静水圧により流体が流れる。   For example, in a fluid containing 1.0% by weight of BSA (bovine serum albumin), a reservoir having an inner diameter (referred to as “ID”) of 5-6 mm cannot hold the fluid due to surface tension. A 5 mm reservoir exhibits high surface tension. However, it can be seen that a reservoir with a nominal diameter between 3.5 mm and 4.0 mm is very suitable for such an application. The appropriateness of the various internal “diameters” / shapes first confirms that the fluid does not flow out itself by looking at whether the fluid is retained in the reservoir when the reservoir is leveled; This can be easily verified by checking that the fluid interaction between the reservoir wall and the fluid is not so high that the desired flow rate between the reservoir and a given microchannel is obtained. The channels of the microfluidic device are flowed by hydrostatic pressure resulting from the height difference (relative to the gravitational field) between the supply reservoir and the microchannel.

装置のソートチャネルの端部は出口につながっている。この出口は、出口に滴が形成されることにより圧力が変動するのを防ぐため、好ましくは出口流体リザーバに流路で連結されている。この出口リザーバはマイクロチャネルが連結する簡単な容器、または供給リザーバと同じ寸法、材料、形状の出口リザーバを用いることができるが、高さが低く及び／又は垂直配置されている。この状況において、毛管引力がほぼ打ち消され、重力による静水圧が液体に加わる唯一の駆動力となる。   The end of the sort channel of the device is connected to the outlet. The outlet is preferably connected to the outlet fluid reservoir by a flow path to prevent pressure fluctuations due to droplet formation at the outlet. The outlet reservoir can be a simple container to which the microchannel is connected, or an outlet reservoir of the same size, material, and shape as the supply reservoir, but is low in height and / or arranged vertically. In this situation, the capillary attraction is almost canceled and the hydrostatic pressure due to gravity is the only driving force applied to the liquid.

供給リザーバと出口リザーバが同じ形状構成の場合、形状誘導と材質誘導（すなわち親水性／疎水性）の性質は完全に相殺され、これにより流れの安定度が増す。このようにすれば、最初に装置に流体を満たすと、供給リザーバと出口との間に僅かな圧力差が生じ、同様の出口リザーバを用いなくとも、内部寸法が小さすぎるリザーバから流れが生じる。   If the supply and outlet reservoirs are of the same configuration, the shape induction and material induction (ie, hydrophilic / hydrophobic) properties are completely offset, thereby increasing flow stability. In this way, when the device is initially filled with fluid, there is a slight pressure difference between the supply reservoir and the outlet, and flow occurs from a reservoir whose internal dimensions are too small without the use of a similar outlet reservoir.

本発明の一体型装置は、少なくとも２つの流体供給リザーバを備えており、１つはソートされる前の***用であり、１つはより活発な***を取り込む媒質液用である。さらに、この一体型装置は、異なる養分、発育因子などの異なる成分の流れ、または単一のリザーバのみでは不可能な流量を供給するため、さらなるリザーバを備えてもよい。流体供給リザーバの長さは簡単に伸ばすことができるが、断面が大きすぎると流体がリザーバの高さ全体に亘りづらくなるため、その断面は大きくしない。これらの工夫は出口リザーバには施す必要がないが、これらはともに同じ基準で構成される方が望ましい。   The integrated device of the present invention comprises at least two fluid supply reservoirs, one for sperm before sorting and one for medium fluids that take up more active sperm. In addition, the integrated device may include additional reservoirs to provide different nutrients, different component streams such as growth factors, or flow rates that are not possible with a single reservoir alone. The length of the fluid supply reservoir can be easily extended, but if the cross section is too large, the cross section is not enlarged because the fluid is difficult to travel across the entire height of the reservoir. These devices do not need to be applied to the outlet reservoir, but it is desirable that both be constructed according to the same standard.

例えば様々な流体のリザーバから出入りする装置通路には、バルブが設けられていてもよい。複数の媒質リザーバが設けられる場合にはバルブ制御が特に重要となる。バルブ制御は、チップ内に設けられ公知の手段で駆動される動作マイクロバルブや、チップ外において装置の弾性性質を利用して各流路を”絞る”構成としてもよい。硬い装置では内部バルブに頼る必要があり、例えば電磁場を利用した内部駆動または外部駆動による。当業者であれば適切なバルブを適用可能であろう。あるリザーバから次の授精へのバルブを制御して、試験管内システムの栄養成分を変化させて実験してもよい。   For example, a valve may be provided in a device passage to and from various fluid reservoirs. Valve control is particularly important when multiple media reservoirs are provided. The valve control may be an operation microvalve provided in the chip and driven by a known means, or a configuration in which each flow path is “squeezed” using the elastic property of the apparatus outside the chip. Hard devices need to rely on internal valves, for example by internal or external drive using an electromagnetic field. A person skilled in the art will be able to apply a suitable valve. Experiments may be performed by controlling the valves from one reservoir to the next insemination to change the nutrient components of the in vitro system.

重力ポンプ装置のリザーバとマイクロチャネルを図５に示す。この装置では、供給リザーバはマイクロチャネルより十分大きく構成され、これにより一定期間流れが生じる。図５では、供給リザーバ６８は出口リザーバ６９より面積も高さも大きく構成されている。流体が蓄えられると、２つのリザーバの高さの差により、２つのリザーバの液面高さが等しくなるまでマイクロチャネル７０に流れが生じる。   The reservoir and microchannel of the gravity pump device are shown in FIG. In this device, the supply reservoir is configured to be sufficiently larger than the microchannel, thereby creating a flow for a period of time. In FIG. 5, the supply reservoir 68 is configured to have a larger area and height than the outlet reservoir 69. When fluid is stored, the difference in height between the two reservoirs causes flow in the microchannel 70 until the liquid level in the two reservoirs is equal.

装置全体は、ガラス、金属、またはシリカなど他の基質を微細加工して得ることができるが、好ましくは熱可塑性または熱硬化性のポリマーで”マスター”を用いてキャストする。キャストしたポリジメチルシリコンエストラマーを好適に用いることができる。この製造法の詳細は後述する。***リザーバと媒質リザーバは、各リザーバに接続され流体を供給する微細管を設けて、あるいは装置表面に設けられピペットの先端や注射針などを受けて装置に流体を供給するよう構成された簡単な供給流路に接続されていてもよい。同様に、活発な***が減少した流体用リザーバと選別***用リザーバは、流体供給が不要であり、通常は流れを妨げるエアロックが形成されないよう少なくとも屈曲されることが必要である。好ましくは装置に流体を満たし、卵母細胞と***サンプルをそれぞれの場所に注入し、流れを生じさせるポンプ動作を開始するだけでよい。   The entire device can be obtained by microfabrication of other substrates such as glass, metal, or silica, but is preferably cast using a “master” with a thermoplastic or thermoset polymer. A cast polydimethylsilicone elastomer can be preferably used. Details of this manufacturing method will be described later. The sperm reservoir and the medium reservoir are connected to each reservoir and provided with a fine tube for supplying a fluid, or provided on the surface of the device and configured to supply the fluid to the device by receiving a tip of a pipette or an injection needle. It may be connected to the supply channel. Similarly, fluid reservoirs with reduced active sperm and sorted sperm reservoirs do not require a fluid supply and usually need to be at least bent so that an airlock is not formed to prevent flow. Preferably, the device only needs to be filled with fluid, the oocyte and sperm samples are injected into their respective locations, and a pumping action is initiated that creates a flow.

図１は、本発明にかかる***選別部の理解を容易にするための図であり、本図はこの機能を実現する比較的簡単な装置の実施例であり、図２に活発でない分子から活発な分子をソートする方法を示す。   FIG. 1 is a diagram for facilitating the understanding of a sperm sorting unit according to the present invention. FIG. 1 is an example of a relatively simple device that realizes this function. How to sort the most important molecules.

図１は、装置の平面図であり、上から見た状態を示す図である。この装置１の実施例は運動分子ソート液流入路２（または、運動分子供給リザーバが流入路として作用する）と、媒質液流入路３（または媒質リザーバ）と、活発な分子が減少したソート液流出路（またはリザーバ）４と、活発な分子が増加した流出路（またはリザーバ）５とを備える。流入路２、３と流出路４、５の間にはソートチャネル６が設けられている。ソートチャネル６と各流入路および流出路とは、ソート液流入チャネル７、媒質流入チャネル８、運動分子減少ソート液流出チャネル９、運動分子増大媒質流出チャネル１０とで接続されている。ソート液流路チャネルの幅は試料の分子が効果的にブロックされることなく通過するのに十分な広さであり、これは双方の流出路についても同様である。一般に、流入および流出する流れはソートチャネルより小さい断面となる。相対的な断面は様々な流れにおける流量や流量レートに依存する。線形の流量レートはほぼ同じであることが好ましいが、相対的な流量レートはソート液と媒質液の混合が生じる場合にのみ制限される。媒質やソート液の粘度など様々な要素により、分子の運動性と、選別すべき分子とは異なるサイズの分子や小片が出現または消滅し、ソートチャネルの各セクションにおいて媒質液の量はソート液の量より少なくても、ほぼ等しくても、多くてもよい。   FIG. 1 is a plan view of the apparatus, showing a state seen from above. The embodiment of the apparatus 1 includes a sorter liquid in which a kinetic molecule sort liquid inflow path 2 (or a kinetic molecule supply reservoir acts as an inflow path), a medium liquid inflow path 3 (or medium reservoir), and a sort liquid in which active molecules are reduced. An outflow channel (or reservoir) 4 and an outflow channel (or reservoir) 5 with increased active molecules are provided. A sort channel 6 is provided between the inflow channels 2 and 3 and the outflow channels 4 and 5. The sort channel 6 is connected to each inflow path and outflow path by a sort liquid inflow channel 7, a medium inflow channel 8, a motion molecule decreasing sort liquid outflow channel 9, and a motion molecule increasing medium outflow channel 10. The width of the sort liquid flow channel is wide enough for sample molecules to pass through without being effectively blocked, as is the case for both outflow channels. Generally, the incoming and outgoing flows have a smaller cross section than the sort channel. The relative cross section depends on the flow rate and flow rate in various flows. The linear flow rate is preferably approximately the same, but the relative flow rate is limited only when mixing of the sort liquid and the medium liquid occurs. Depending on various factors such as the viscosity of the medium and the sort liquid, molecular mobility and molecules or small pieces of different size from the molecules to be sorted appear or disappear, and the amount of medium liquid in each section of the sort channel It may be less than, approximately equal to or greater than the amount.

適用例では、供給された***がソート液流入路２から導入され、運動分子減少ソート液流出路９側への流れが生じ、最初にチャネル７、次にソートチャネル６を通り、その次に流出チャネル９へと流れる。選別しようとする***に影響を及ぼさない（破壊しない）媒質供給流が媒質流入路３に導入され、チャネル８からチャネル６を通り運動分子増加媒質流出路５への流れが生じる。チャネル７と８の合流点では、交わらず、好ましくは層流となり、ソート液と媒質液が平行してソートチャネル内を流れる。非活発（またはあまり活発でない）分子はソート液に残り、活発な分子はランダムに泳ぎ回り媒質液側に入る。このランダム移動の結果として、ソート液には活発な***が減少し、逆に媒質液はだんだん豊富になる。   In the application example, the supplied sperm is introduced from the sort liquid inflow path 2, and a flow toward the kinetic molecule-reduced sort liquid outflow path 9 occurs, first through the channel 7, then through the sort channel 6, and then outflow. It flows to channel 9. A medium supply flow that does not affect (not destroy) the sperm to be sorted is introduced into the medium inflow path 3, and a flow from the channel 8 through the channel 6 to the moving molecule increasing medium outflow path 5 occurs. At the merging point of channels 7 and 8, it is preferably a laminar flow without intersecting, and the sort liquid and medium liquid flow in the sort channel in parallel. Inactive (or less active) molecules remain in the sort liquid, and active molecules swim randomly and enter the medium liquid side. As a result of this random movement, the sort solution loses active sperm and conversely the medium solution becomes increasingly rich.

本発明について、さらに図２ａ、２ｂ、２ｃを参照して広範に説明し、これらの図は図１の装置のソートチャネルにて非活発な***や他の非活発な分子から活発な***を分離する状態を図示したものである。図２ａは、ソート液１１と媒質液１２との合流点のソートチャネル６を示す。ソート液１１は、活発な***１３と、非活発な***１４を含んでおり、これには”丸い細胞”１５として示す他の非活発な分子が含まれる。平面でみた媒質液のサイズは、当然その量も、ソート液より十分に大きい。***（および同様に他の活発な分子）が短期の間に流体全体に実質的にランダムに分配されると仮定すると、より多くの量の媒質を用いると活発な***１３をより多く含むことができる。   The present invention is further described extensively with reference to FIGS. 2a, 2b, 2c, which separate active sperm from inactive sperm and other inactive molecules in the sort channel of the apparatus of FIG. The state to perform is illustrated. FIG. 2 a shows the sort channel 6 at the junction of the sort liquid 11 and the medium liquid 12. Sort solution 11 includes active sperm 13 and inactive sperm 14, which includes other inactive molecules shown as “round cells” 15. Obviously, the size of the medium liquid in a plane is sufficiently larger than the sort liquid. Assuming that sperm (and other active molecules as well) are distributed virtually randomly throughout the fluid in a short period of time, using a larger amount of medium may contain more active sperm 13. it can.

図２ｂは、２つの流れにて活発な***のランダム移動が始まり、所望程度のランダム化が得られるまで連続する状態を示す図である。このランダム度合いは、媒質の量に対する活発な***の濃度が、ソート液の量に対する濃度以上であることが好ましい。ここでソート液と媒質液は異なる流れとして維持されており、それぞれが層流をなしており、これらは共通の界面または境界１６をもつ。純粋なランダム化による媒質液における活発な分子の濃度を命令の量を越えて大きくするには、媒質液において活発な***の運動量が増すよう、例えばソート液よりも粘度の低い媒質液を選択したり、活発な***の運動量を非活発あるいは運動性の低い***よりも増大させる添加剤を含めることがある。   FIG. 2b is a diagram showing a state in which random movement of active sperm begins in two flows and continues until a desired degree of randomization is obtained. The degree of randomness is preferably such that the concentration of active sperm relative to the amount of medium is equal to or greater than the concentration relative to the amount of sort liquid. Here, the sort liquid and the medium liquid are maintained as different flows, and each of them has a laminar flow, and they have a common interface or boundary 16. To increase the concentration of active molecules in the medium fluid by pure randomization beyond the commanded amount, for example, select a medium fluid that has a lower viscosity than the sort solution so that the momentum of the active sperm increases in the medium fluid. Or additives that increase the momentum of active sperm over inactive or less motile sperm.

図２ｃでは、活発な***に富んだ媒質液が、運動分子増大チャネル１０に分けられ採取され、一方で運動分子が減少したソート液はチャネル９を出口４へと流れる。   In FIG. 2 c, the active sperm-rich medium fluid is collected in the kinetic molecule augmentation channel 10, while the sorted fluid with the depleted motility molecule flows through the channel 9 to the outlet 4.

活発な分子が減少したソート液を活発な分子が増大した媒質液と分ける分岐点は、この地点で２つの流れの混合が防げるものであれば様々な構成とすることができる。分岐点１７は、例えばこの地点ではソート液入路とほぼ同じチャネル構成（すなわち、高さと幅）とすることができる。媒質液の非活発な***による汚染を最小限とするには、分岐点１７はまた、媒質液のごく一部がさらに活発な分子が減少したソート液出路９に向けて構成されてもよい。この場合、活発な***がわずかに少なくなるが、結果として非活発な***が活発な***に富んだ媒質液に入る可能性が少なくなる。   The branching point that separates the sort liquid in which the active molecules are reduced from the medium liquid in which the active molecules are increased can have various configurations as long as the mixing of the two flows can be prevented at this point. For example, the branch point 17 may have substantially the same channel configuration (that is, height and width) as the sort liquid inlet path at this point. To minimize contamination of the medium fluid by inactive spermatozoa, the bifurcation point 17 may also be configured towards the sort liquid outlet 9 where a small portion of the medium fluid is depleted of more active molecules. In this case, there are slightly fewer active spermatozoa, but as a result there is less chance of inactive sperm entering the medium fluid rich in active sperm.

ソート液の性質はさほど重要ではない。このソート液は***といった生物学的に導出されたものであり、（活発な***が減少したまたは活発な***が増加した）所望の流出路において洗浄され、希釈され、添加剤が加えられ、着色または蛍光着色され、粘度調節され、緩衝剤が加えられてもよい。   The nature of the sort liquid is not so important. This sort solution is biologically derived, such as semen, and is washed, diluted, added with additives, colored in the desired spillage (active sperm decreased or active sperm increased) Alternatively, it may be fluorescently colored, viscosity adjusted, and buffer added.

媒質液は、ソート液の選択または変形に適用するものと同じ感覚で選ぶことができる。幾つかのケースでは、媒質液は水であり、しかしながら生物学システムでは、一般に生理的塩類溶液、緩衝食塩水、栄養汁など生物学的活動を維持あるいは拡大する流体を用いる。人間の***の場合、好適な媒質は人間の気管の液にバッファされたＨＥＰＥＳである。   The medium liquid can be selected with the same feeling as that applied to the selection or modification of the sort liquid. In some cases, the medium fluid is water, however, biological systems typically use fluids that maintain or expand biological activity, such as physiological saline solutions, buffered saline, and nutrient juices. For human sperm, the preferred medium is HEPES buffered in human tracheal fluid.

媒質液およびソート液の性質は、可能であれば、浸透効果による界面における混合を防止すべく選択されてもよい。このケースは、例えば、媒質液とソート液で共通する液体（例えば水）の溶融成分、例えば塩、酸、塩基（bases）、緩衝剤（buffers）溶融無機成分などがほぼ同じ量の場合である。これらの液体はまた、可能であれば、界面における核酸による混合を防止すべく選択されてもよい。ただし、この観点において拡散が完全に失われるのは望ましくない帰結である。   The nature of the media liquid and the sort liquid may be selected to prevent mixing at the interface due to osmotic effects, if possible. In this case, for example, the liquid component (for example, water) that is common in the medium liquid and the sort liquid, such as salt, acid, base (bases), buffering agent (buffers) molten inorganic component, etc. are almost the same amount . These liquids may also be selected to prevent mixing with nucleic acids at the interface, if possible. However, the complete loss of diffusion in this respect is an undesirable consequence.

液量の相対関係は、所望の媒質側の活発な分子の混合度合いにより選択することができる。高度に混合していると、媒質量はソート液の量に対して多くなる。ただし、特に連続するソートが行われる場合には、適当な多くない量の媒質を用いることができる。ソート液に対する媒質液は１：１００から１００：１であり、好ましくは１：１０から１０：１の範囲である。いくつかの例では、ソート液にたいする媒質液の量は１：１から３：１である。媒質液の量は最も好ましくはソート液より多い。   The relative relationship between the liquid amounts can be selected depending on the active degree of mixing of molecules on the desired medium side. When mixing is highly carried out, the amount of medium increases with respect to the amount of sort liquid. However, an appropriate amount of medium can be used, particularly when continuous sorting is performed. The medium liquid for the sort liquid is in the range of 1: 100 to 100: 1, preferably in the range of 1:10 to 10: 1. In some examples, the amount of medium liquid for the sort liquid is 1: 1 to 3: 1. The amount of medium liquid is most preferably greater than the sort liquid.

ソート液と媒質液の直線流量はほぼ同じであり、すなわち１．５：１から１：１．５の範囲内である。この媒質の直線流量がソート液のより大きい場合、これによって媒質液の横切る量を活発な分子の編入の同じ度合いに用いることができる。流れは好ましくは同時発生であるが、ただし界面における混合がソート液と媒質液の減少／増加度合いを容易にするものを越えて悪化しない限り同時発生でなくてもよい。   The linear flow rates of the sort liquid and the medium liquid are almost the same, that is, in the range of 1.5: 1 to 1: 1.5. If the linear flow rate of this medium is greater than that of the sort liquid, this allows the amount that the medium liquid crosses to be used for the same degree of active molecular incorporation. The flow is preferably simultaneous, but not necessarily as long as the mixing at the interface does not worsen beyond what facilitates the reduction / increase of the sort / medium liquid.

ソート液と媒質液の界面は好ましくはほぼ非混合界面である。ここで”非混合”は２液間での過剰な乱れによる混合がないことをいう。例えば、最も好ましいのは平行で、同時発生で、層流が、実質的に”安定”した界面が得られ、この反対が波があり、流れており、渦がある場合である。荒い流れは通常流れの一部または全部を混合させ、活発な分子の減少／増加が有効でなくなるか完全に不可能となる。活発な分子の理論上最良の分離は、静的に見える界面が現れたときか、拡散および浸透効果により”線型”となったときに得られる。しかしながら、本発明の目的からすれば界面の乱れはない方がよい。所望の分離度合いが得られなくなったら乱れが過度であり、装置の複合ステージでも同様である。レイノルズ数で表される乱れは、いかなる場合でも2000以下であり、より好ましくは100以下であり、さらに好ましくは10以下であり、最も好ましくは１以下である。ここに図示したような高機能の装置はレイノルズ数が約0.1を示す。   The interface between the sort liquid and the medium liquid is preferably a substantially unmixed interface. Here, “non-mixing” means that there is no mixing due to excessive disturbance between the two liquids. For example, it is most preferred if the parallel, co-occurring, laminar flow provides a substantially “stable” interface, and the opposite is wave, flowing, and vortexed. Rough flow usually mixes some or all of the flow and active molecular depletion / increase becomes ineffective or completely impossible. The theoretically best separation of active molecules is obtained when a statically appearing interface appears or becomes “linear” due to diffusion and permeation effects. However, for the purposes of the present invention, it is better not to disturb the interface. If the desired degree of separation cannot be obtained, the turbulence is excessive, and the same applies to the composite stage of the apparatus. In any case, the disturbance represented by the Reynolds number is 2000 or less, more preferably 100 or less, further preferably 10 or less, and most preferably 1 or less. A highly functional device as shown here has a Reynolds number of about 0.1.

界面の性質、すなわち乱れの度合いは、分離度合いにより評価することができる。ただし、この乱れは他の多くの方法でも評価することができる。例えば、後述するＰＤＭＳ装置では、光学的に透明な装置とすると、界面における色の変化により界面自体を顕微鏡で観察可能である。従来の光学技術では、屈折率の異なる媒質間の界面を簡単に観察することができる。ソート液と媒質液の混合度合いはタグ添加物（taggant）、例えば放射性の溶性合成物または活発でない細胞、可視または蛍光の染料などを一方の液にのみ導入することにより観察できる。最初にタグ添加物を含まない流れの、出口流でのタグの出現は、乱れの一種、拡散または浸透による界面の混合の証拠となる。後者の２つの効果によるある程度の混合が望ましいが、ただし最小限であることが望ましい。タグ付けしていない流れにタグ添加物が５０％混ざっている場合、実質的に完全に混合されたことになる。タグ付けしていない流れへのタグ添加物の混合は２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、最も好ましくは１％以下が望ましい。レイノルド数が適当に低い限り、乱れの度合いは満足すべきものとなる。上記の条件を満たす流れを”実質的に乱れのない流れ”と称す。同じ向きに流すと逆向きに流すより乱れは少なくなり、界面における混合もしかりである。   The nature of the interface, that is, the degree of disturbance can be evaluated by the degree of separation. However, this disturbance can be evaluated in many other ways. For example, in a PDMS device described later, when an optically transparent device is used, the interface itself can be observed with a microscope due to a color change at the interface. In the conventional optical technique, an interface between media having different refractive indexes can be easily observed. The degree of mixing of the sort liquid and the medium liquid can be observed by introducing a tag additive such as a radioactive soluble compound or inactive cells, a visible or fluorescent dye, etc. into only one liquid. The appearance of the tag in the outlet stream, initially without the tag additive, is evidence of a kind of turbulence, interfacial mixing due to diffusion or infiltration. Some mixing due to the latter two effects is desirable but minimal. If 50% of the tag additive is mixed in the untagged stream, it is substantially completely mixed. The mixing of tag additives into the untagged stream should be 20% or less, more preferably 10% or less, even more preferably 5% or less, and most preferably 1% or less. As long as the Reynolds number is reasonably low, the degree of disturbance will be satisfactory. A flow that satisfies the above conditions is referred to as a “substantially undisturbed flow”. Flowing in the same direction results in less turbulence than flowing in the reverse direction and mixing at the interface.

上述のように流量を乱れが少なくなる条件とすると、このレート自信は幅広く変化する。選別装置の壁はまた、流れに対して静的であるため乱れの原因となる。この壁による効果は、細いチャネルが設けられている場合、特にソート液または媒質液の細い部分に壁が接するときに最も重要となる。対象となる装置が相当小さく、チャネルも相当小さいため、１０ｃｍ／ｓの線形流量レート、好ましくは１０ｍｍ／ｓ以下が望ましい。線形流量レートの下限は、ソート流から媒質流へのブラウン運動による活発でない細胞の混合により定まる。例えば、流量レートがゼロであれば、流体の成分ベースが同一であれば（例えば緩衝食塩水）、媒質相への活発でない分子の分配は最終的にこれらの濃度が同一となったときに完了する。流量レートが高い場合、活発でない分子のブラウン再分配が低くなる。流量レートの上限は、流れの界面に乱れが生じた場合であり、これでは混合度合いが高くなってしまう。   As described above, the rate confidence varies widely when the flow rate is a condition that the disturbance is reduced. The sorter wall is also turbulent because it is static with respect to the flow. The effect of this wall is most important when a thin channel is provided, particularly when the wall is in contact with a thin portion of the sort liquid or medium liquid. Since the target device is quite small and the channel is also quite small, a linear flow rate of 10 cm / s, preferably 10 mm / s or less, is desirable. The lower limit of the linear flow rate is determined by inactive cell mixing due to Brownian motion from the sort flow to the media flow. For example, if the flow rate is zero, and if the fluid component base is the same (eg, buffered saline), the distribution of inactive molecules into the media phase is finally complete when these concentrations are the same. To do. When the flow rate is high, the brown redistribution of inactive molecules is low. The upper limit of the flow rate is when the flow interface is disturbed, which increases the degree of mixing.

与えられた流れの相対的な液量、相対的な流量、絶対的な流量は、例えばソート流と媒質流について、それぞれのレートと量を変化させ、それぞれの濃度や減少量を決定するなどして、当業者であれば簡単な計算および／または分析により、定まった方法で決定することができる。   The relative liquid volume, relative flow rate, and absolute flow rate of a given flow are determined by changing the rate and amount of the sort flow and the medium flow, respectively, and determining the concentration and the decrease amount. Thus, those skilled in the art can make the determination in a fixed manner by simple calculation and / or analysis.

装置の構成は変更してもよい。例えばソートチャネルの長さは、活発な分子が２つの相間でランダム化する速度や流速の要素となる。例えば、与えられた流速において、限られた運動量の活発な分子には長いソートチャネルが必要となり、与えられたソートチャネル長さでは、活発な分子には流れが遅い方がよい。界面の範囲はまた装置の構成に影響する。例えば、平らな四角形のソートチャネルにおいて、一方の流体が大きな面積のチャネル表面に平行に接しており他方の流体が隣接している場合はランダム化が早くなり、したがって小さな面積のチャネル表面に平行に接している場合よりも流体ソートチャネルの長さを短くする必要がある。後者の場合、前者に比べて界面範囲が小さくなる。ほとんどの場合、ソートチャネルは非所に短く、大体２−５ｃｍ以下であり、そしてほとんどの装置では、１００μｍから１ｃｍである。静止の選別には、例えば、ソートチャネル長さを５０００μｍ（５ｍｍ）とすると公的である。本件装置では、ソートチャネルは短い方が望ましい。   The configuration of the apparatus may be changed. For example, the length of the sort channel is a factor in the speed and flow rate at which active molecules randomize between the two phases. For example, an active molecule with limited momentum at a given flow rate requires a long sort channel, and for a given sort channel length, an active molecule should have a slower flow. The extent of the interface also affects the configuration of the device. For example, in a flat rectangular sort channel, if one fluid is in contact with the large area channel surface and the other fluid is adjacent, the randomization is faster and therefore parallel to the small area channel surface. The length of the fluid sorting channel needs to be shorter than that in contact. In the latter case, the interface range is smaller than the former. In most cases, the sort channel is short in length, roughly 2-5 cm or less, and in most devices it is 100 μm to 1 cm. For example, when the length of the sort channel is set to 5000 μm (5 mm), it is official for the selection of stationary. In the present apparatus, it is desirable that the sort channel is short.

ソートチャネルの断面形状はそれほど重要ではない。正方形、四角形、楕円形、円形、台形、または他の断面形状であってよい。製造を用意にすべく、正方形、四角形、三角形、台形、半円、半楕円形といったアンダーカットのない形が適している。これらの形状は、例えば、ニートキャスティング（neat casting）または成分キャスティング（solution casting）法で製造する場合に好適である。ステレオリソグラフィー技術（ＳＬＡ）により、より複雑な形を簡単に製造できるようになった。アンダーカットしたチャネルを施した複雑な形はキャスティング技術を用いて、装置を連続する層ごおｔに形成し接着などで結合させるキャスティングにより得ることができる。しかしながら、チャネル幅は、媒質液とソート液がともに一体化する幅とする。人間の***の選別では、例えば、実施的に四角形のチャネルで高さが５０μｍで幅が５００μｍが適している。参考までに、人間の***は頭部直径が２．５μｍで長さが５μｍ、全体の長さが６０μｍである。   The cross-sectional shape of the sort channel is not very important. It can be square, square, oval, circular, trapezoidal, or other cross-sectional shapes. To prepare for production, shapes without undercut such as square, quadrangle, triangle, trapezoid, semicircle, semi-ellipse are suitable. These shapes are suitable, for example, when manufactured by neat casting or solution casting. Stereolithography technology (SLA) has made it easier to produce more complex shapes. Complex shapes with undercut channels can be obtained by casting techniques using casting techniques to form devices on successive layers and bond them together, such as by gluing. However, the channel width is set so that both the medium liquid and the sort liquid are integrated. In the selection of human sperm, for example, a rectangular channel with a height of 50 μm and a width of 500 μm is suitable. For reference, human sperm has a head diameter of 2.5 μm, a length of 5 μm, and an overall length of 60 μm.

断面の範囲と供給チャネル、出口チャネルの寸法は一般にソートチャネルより小さい。ソート液流入チャネルの最低寸法はソート液内の分子のサイズによる。好適には、ソート液チャネルは、内包する細胞サイズの３〜１０倍のサイズにする。媒質液流出チャネルのサイズについても同様であり、ただし媒質液流入口はこの限りではない。こうてきには、ソート液流入／流出チャネルは比較可能なサイズであり、いくつかの例では、上述したように、流出チャネルは流入チャネルより大きいことが望ましく、これにより媒質液の部分がソート液に合流する。***の選別では、四角いソート液流入チャネルは高さ５０μｍ、幅１００μｍ、長さ５０００μｍが適している。   The cross-sectional area and the dimensions of the supply and exit channels are generally smaller than the sort channels. The minimum dimension of the sort liquid inflow channel depends on the size of the molecules in the sort liquid. Preferably, the sort solution channel is 3 to 10 times the size of the encapsulated cell. The same applies to the size of the medium liquid outflow channel, except for the medium liquid inlet. Thus, the sort liquid inflow / outflow channels are of comparable size, and in some cases, as described above, the outflow channels are preferably larger than the inflow channels so that the portion of the media liquid is sorted. To join. For sorting sperm, it is suitable that the square sort liquid inflow channel has a height of 50 μm, a width of 100 μm, and a length of 5000 μm.

様々な流入／流出チャネルの長さは重要ではない。少なくとも流入チャネルは、ソート液チャネルと媒質液チャネルとが合流する前の段階で層流が形成されるようにある程度の長さであることが好ましい。通常、粘性のある流体は粘性のない流体のチャネルほど長い距離を必要としない。いくつかのケースでは、流入チャネルは完全に省略され、すなわちソート液流入口（またはリザーバ）および／ばたは媒質液流入口（またはリザーバ）がソートチャネルに直接供給する。多くの場合は、しかしながら、選別装置の製造を容易にすべく、流入チャネルが設けられている。口述する***の選別装置にあｈ、例えば、長さが３ｍｍの流入チャネルが適している。   The length of the various inflow / outflow channels is not critical. It is preferable that at least the inflow channel has a certain length so that a laminar flow is formed at a stage before the sort liquid channel and the medium liquid channel merge. Typically, viscous fluids do not require as much distance as non-viscous fluid channels. In some cases, the inflow channel is completely omitted, ie the sort liquid inlet (or reservoir) and / or the medium liquid inlet (or reservoir) feeds directly into the sort channel. In many cases, however, inflow channels are provided to facilitate the manufacture of the sorting device. For example, an inflow channel with a length of 3 mm is suitable for the sperm sorting device to be dictated.

ソート液と媒質液の合流点１８（図１）は、流れがスムースに合流し過度な混合が生じないよう構成されていることが好ましい。通常、このため、合流点は比較的鋭角に構成される。ソート液流入チャネルとソートチャネル、媒質液流入チャネルとソートチャネルの角度は同じでも違ってもよく、すなわち装置は対称である必要はない。これはソート液と媒質液とが分離する、または互いにそれる分岐点１７にも同様である。しかしながら、ソート液流入チャネル、ソートチャネル、ソート液流出チャネルはほぼ直線として、ソート液内の活発でない分子の乱れをできるだけ少なくすることが望ましい。   It is preferable that the confluence 18 (FIG. 1) of the sort liquid and the medium liquid is configured so that the flow smoothly merges and excessive mixing does not occur. For this reason, the merging point is usually configured at a relatively acute angle. The angles of the sort liquid inflow channel and the sort channel, the medium liquid inflow channel and the sort channel may be the same or different, that is, the apparatus does not have to be symmetrical. The same applies to the branching point 17 where the sort liquid and the medium liquid are separated or deviate from each other. However, it is desirable that the sort liquid inflow channel, the sort channel, and the sort liquid outflow channel be substantially straight lines so as to minimize the disturbance of inactive molecules in the sort liquid.

装置を構成する材料は様々な適切なものを用いることができ、また装置の製造も様々な方法をとることができる。例えば、装置はガラス、シリカ、シリコン、金属のエッチングにより化学的な微細加工によってもよいし、ポリマー等の溶剤エッチングによってもよい。装置は独自に周知のステレオリソグラフィー技術により製造してもよい。この装置は、例えばシリコンラバー、熱可塑性ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテテトラフルオロエチレン、ポリビニルクロロイド、ポリビニリデンクロロイド、ポリアミド、ポリエステルなどの射出形成または型枠ポリマーによることができる。   Various suitable materials can be used for the device, and the device can be manufactured in various ways. For example, the apparatus may be chemical microfabrication by etching glass, silica, silicon, metal, or solvent etching of polymers or the like. The device may be produced by a well-known stereolithography technique. This device can be by injection-molded or formwork polymers such as silicone rubber, thermoplastic polyurethane, polyethylene, polypropylene, polytetrafluoroethylene, polyvinyl chloroid, polyvinylidene chloroid, polyamide, polyester and the like.

この装置の成型には、ネガティブの”マスタ”を作成し、キャスタブルな材料をマスタにキャストすることが好ましい。好適なキャスト材料は、エポキシ樹脂、硬化性ポリウレタンエストラマー、ポリマー溶剤すなわちアクリレートポリマーをメチレン黒路IDOまたは他の溶剤に溶融させたポリマーであり、好ましくは硬化性ポリオルガノシロキサン、コスト面で最も好ましいのは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのメチルグループを伴うポィオルガノシロキサンである。硬化性ＰＤＭＳポリマーはよく知られており様々なところから入手可能であり、過酸化養生システムも同様である。これらのＰＤＭＳポリマーは、架橋剤を形成する反応群の割合が低く、および／または、養生時に鎖結合を生じる。１パート（ＲＴＶ−１）と２パート（ＲＴＶ−２）のシステムが利用可能である。生物学上の細胞生存率が不可欠である場合は更なる養生システムを用いる。   For molding this device, it is preferable to create a negative “master” and cast the castable material to the master. Suitable cast materials are epoxy resins, curable polyurethane elastomers, polymers obtained by melting polymer solvents or acrylate polymers in methylene black road IDO or other solvents, preferably curable polyorganosiloxanes, most preferred in terms of cost. Are polyorganosiloxanes with methyl groups such as polydimethylsiloxane (PDMS). Curable PDMS polymers are well known and available from a variety of sources, as are peroxidation curing systems. These PDMS polymers have a low proportion of reaction groups that form crosslinkers and / or produce chain bonds during curing. One part (RTV-1) and two part (RTV-2) systems are available. Additional biological systems are used where biological cell viability is essential.

多くの場合、透明な装置であることが望ましい。このような装置はガラスまたは透明ポリマーで製造することができる。ＰＤＭＳポリマーは透明な装置に適している。わずかにエラストマーを含むポリマーを用いると、型から取り外してチャネルをアンダーカットで形成できる利点があり、これは一般に硬い材料を用いると不可能である。微細流体装置の製造法は、シリコンポリマーをキャスティングする方法が良く知られている。D.C. Duffy et al., "Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane)", ANALYTICAL CHEMISTRY 70, 4974-4984(1998)を参照されたい。また、J.R. Anderson et al., ANALYTICAL CHEMISTRY 72, 3158-64 (2000); およびM.A Unger et al., SCIENCE 288, 113-16,(2000); J.C. McDonald, et al., "Oly(dimethilsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices", ACCOUNTS OF CHEMICAL RESEARCH, 35491-99を参照されたい。ポリメチルメタクリレートの装置については、L. Martynova, et al, "Fabrication of Plastic Microfluidic Channels by Imprinting Mehtods", ANALYTICAL CHEMISTRY 69, 4783-4789を参照されたい。   In many cases, a transparent device is desirable. Such devices can be made of glass or transparent polymer. PDMS polymers are suitable for transparent devices. The use of a slightly elastomeric polymer has the advantage that it can be removed from the mold and the channel formed with an undercut, which is generally not possible with hard materials. As a manufacturing method of the microfluidic device, a method of casting a silicon polymer is well known. See D.C. Duffy et al., “Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly (dimethylsiloxane)”, ANALYTICAL CHEMISTRY 70, 4974-4984 (1998). JR Anderson et al., ANALYTICAL CHEMISTRY 72, 3158-64 (2000); and MA Unger et al., SCIENCE 288, 113-16, (2000); JC McDonald, et al., "Oly (dimethilsiloxane) as a material for manufacturing microfluidic devices ", ACCOUNTS OF CHEMICAL RESEARCH, 35491-99. See L. Martynova, et al, "Fabrication of Plastic Microfluidic Channels by Imprinting Mehtods", ANALYTICAL CHEMISTRY 69, 4783-4789 for polymethylmethacrylate equipment.

装置のチャネルとリザーバの壁の詳細は、装置の応用例と使用する流体の目的に応じて選択される。さらに、これらの壁は、その表面が生物学的に融和性または対生物作用の被覆を有し、または化学機能をもつ。***の分別では、チャネルをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でコートすると、チャネル内で液体がよく流れ、細胞がチャネル壁に非特異的に吸着するのが防止される。   The details of the device channels and reservoir walls are selected depending on the application of the device and the purpose of the fluid used. Furthermore, these walls have a biologically compatible or bioactive coating on their surface, or have a chemical function. For sperm fractionation, coating the channel with bovine serum albumin (BSA) prevents the liquid from flowing well in the channel and nonspecifically adsorbing the cells to the channel wall.

卵母細胞受精チャンバとソート***リザーバは、両方の機能を有する１つのリザーバであってよい。あるいは、別に受精チャンバを設けてもよい。後者の場合、受精チャンバとソート生成リザーバは、***含有液を受精チャンバに導くフローチャネルで接続されていることが望ましい。この流れにはバルブが設けられてもよく、媒質リザーバと***リザーバと同様に重力ポンプで駆動され、または別に例えば吸い込みなど圧力や吸引力の補助を得て、供給が開始（維持）される。   The oocyte fertilization chamber and sort sperm reservoir may be a single reservoir having both functions. Alternatively, a fertilization chamber may be provided separately. In the latter case, it is desirable that the fertilization chamber and the sort generation reservoir are connected by a flow channel that guides the sperm-containing liquid to the fertilization chamber. A valve may be provided in this flow, and the supply is started (maintained) by being driven by a gravity pump like the medium reservoir and the sperm reservoir, or separately with the assistance of pressure or suction force such as suction.

受精チャンバのサイズは導入される卵母細胞の数と個々のサイズによって決められる。このチャンバは１以上の卵母細胞をチャンバへ導入する手段を備える。このチャンバは卵母細胞を調整すべく幅が細くなるよう構成されてもよく、必要に応じて、卵母細胞の中心に堆積した細胞を除去または送る。卵母細胞の微細操作技術は周知である。Beebe et al., "Microfluidic Technology for Assisted Reproduction", THERIOGENOLOGY, 57, 125-135 (2002)を参照されたい。例えば、チャンバは装置外側でピペット片を受けるよう構成された漏斗型開口に接続され、受精チャンバと接続し卵母細胞が通るのに十分大きい直径を有する”卵母細胞ダクト”を備えてもよい。   The size of the fertilization chamber is determined by the number of oocytes introduced and the individual size. The chamber includes means for introducing one or more oocytes into the chamber. This chamber may be configured to narrow to adjust the oocyte, removing or delivering cells deposited in the center of the oocyte as needed. Techniques for fine manipulation of oocytes are well known. See Beebe et al., "Microfluidic Technology for Assisted Reproduction", THERIOGENOLOGY, 57, 125-135 (2002). For example, the chamber may be connected to a funnel-shaped opening configured to receive a pipette piece on the outside of the device, and may include a “oocyte duct” that is connected to the fertilization chamber and has a diameter large enough for oocytes to pass through. .

受精チャンバは静的であるのに対し、新たな***ソース、栄養媒質などを供給するために、また細胞の代謝物を除去するために、チャンバを通って流体が流れるのを確立するのが好ましい。したがって、この卵母細胞チャンバは一般に、流体や***が流れる穴または通路を備えるバリアで会って卵母細胞がバリアを越えて移動するのを防ぐバリアを備える。このバリアは原則として受精チャンバにおいて流体と***を通過させる小さな出口またはチャネルを備える壁である。しかしながら、さらなる穴またはチャネルを設けて、代謝副産物および／または細胞毒素が蓄積されるのを好適に防ぐようにしてもよい。微細流体装置は非常に小さく、したがって肉眼で見える装置用に意図されたバリア構造は微細装置の製造に用いることができない場合がある。   While the fertilization chamber is static, it is preferable to establish fluid flow through the chamber to supply new sperm sources, nutrient media, etc., and to remove cellular metabolites. . Thus, the oocyte chamber typically includes a barrier that meets the barrier with holes or passages through which fluid and sperm flow to prevent the oocyte from moving across the barrier. This barrier is in principle a wall with a small outlet or channel through which fluid and sperm pass in the fertilization chamber. However, additional holes or channels may be provided to suitably prevent the accumulation of metabolic byproducts and / or cytotoxins. Microfluidic devices are very small and thus barrier structures intended for devices that are visible to the naked eye may not be used in the manufacture of microdevices.

よくできたバリア構造４６の一例が図４に示されている。多くの微細流体相違と同様に、このバリアの設計はキャストされたポリマーの複合レイヤによるものであり、これらが最終的に装置に組み込まれる。図４では、下側レイヤ６０はチャンバ内に導入される典型的な卵母細胞６２の高さ、好ましくは多少高めで厚さ６３のブロック壁６１を設けて構成される。上側レイヤ６４は、厚さ６３より長い複数の平行な溝またはチャネル６５を設けて構成され、チャネルが直接ブロック壁に被さるように第２のレイヤが第１のレイヤに被せられた場合、ブロック壁を越える複数の通路が作成される。これらのチャネルは、受精チャンバの幅全体に横向きに延在してもよい。このような装置によれば、卵母細胞にバリアとして作用する一方で、実質的に妨げのない流れを得ることができる。   An example of a well-made barrier structure 46 is shown in FIG. As with many microfluidic differences, this barrier design is due to a composite layer of cast polymer that is ultimately incorporated into the device. In FIG. 4, the lower layer 60 is configured with a block wall 61 having a thickness 63 of a typical oocyte 62 introduced into the chamber, preferably slightly higher in height. The upper layer 64 is configured with a plurality of parallel grooves or channels 65 that are longer than the thickness 63, and when the second layer is placed over the first layer such that the channel directly covers the block wall, the block wall A plurality of passages are created. These channels may extend laterally across the width of the fertilization chamber. According to such an apparatus, while substantially acting as a barrier to the oocyte, a substantially unhindered flow can be obtained.

１またはそれ以上の卵母細胞を受けるよう構成された微細チャネルを備える微細流体受精装置であって、チャネルとともに説明したバリアを備える。漏斗型または他の形の開口が設けられ、卵母細胞をチャネルへ注入またはピペット移動させ、連続する液体の流れにより卵母細胞がチャネルをバリア部分まで移動する。このバリアと微細チャネルは互いに組合わさり受精チャンバを構成する。***含有液は好ましくはチャンバ内へと流れる。後述する肥沃化により、液体の流れは栄養含有液に変わる。様々な液体が交互にガラス管システムで検証される。   A microfluidic fertilization device comprising a microchannel configured to receive one or more oocytes, comprising the barrier described with the channel. A funnel or other shaped opening is provided to inject or pipette the oocyte into the channel, and the continuous flow of liquid moves the oocyte through the channel to the barrier portion. The barrier and the fine channel are combined with each other to form a fertilization chamber. The sperm-containing liquid preferably flows into the chamber. By the fertilization described later, the liquid flow is changed to a nutrient-containing liquid. Various liquids are alternately verified in the glass tube system.

図３は、***の選別と受精の一体型装置３０の実施例を示す図である。本図は装置の通路を示し、この装置は好適にはキャストシリコンエストラマーの複数のレイヤを組み立ててることができる。ソートチャネル３１は***受けリザーバ３２から***の供給を受け、このリザーバはＰＤＭＳ装置の外側に延びる通路３３を備え、漏斗型の開口３４を備えピペットチップや他の派生装置をより好適に受ける。リザーバ３２の高さと幅は流体が外からチャネル３１へ流れ、液面レベルは落ちることなく、その代わり流体の”プラグ”が水平に移動する。***含有液、すなわち***が通路３３を通りリザーバに導入される。   FIG. 3 is a diagram showing an embodiment of an integrated apparatus 30 for sperm sorting and fertilization. The figure shows the path of the device, which can preferably be assembled with multiple layers of cast silicon elastomer. The sort channel 31 receives a sperm supply from a sperm receiving reservoir 32, which has a passage 33 extending outside the PDMS device and has a funnel-shaped opening 34 to better receive a pipette tip or other derivative device. The height and width of the reservoir 32 allows the fluid to flow from the outside to the channel 31 and the liquid level does not drop, but instead the fluid “plug” moves horizontally. A sperm-containing liquid, that is, semen is introduced into the reservoir through the passage 33.

ソート媒質液が、漏斗型の開口３７が端部に設けられたソート媒質リザーバ３５に通路３６を介して導入される。ソート媒質リザーバから、流体は媒質チャネル３８を介してソートチャネル３１に流れる。***とソート媒質液の合流点において、ソートチャネル３１は広がり層流をなし、この幅広の部分３９が分離点４０の連続流４１まで続き、***減少リザーバへ流れ、好ましくは外部への出口またはベント４３を備える。ソート媒質は、現在は活発な***で肥沃し、ソート***チャネル４４を介して卵母細胞チャンバ４５へ流れる。卵母細胞チャンバ４５はチャネル４４と同じ寸法であり、あるいは、図に示すように少し大きい。卵母細胞受精チャンバの前後には、媒質液と***を通すが卵母細胞を通さないバリア４６が設けられる。このバリアは図４に示すのと同様である。チャンバ４５から、流体は、出口またはベント４９を備えるソート***リザーバ４８に連続的に流れる。   The sort medium liquid is introduced through a passage 36 into a sort medium reservoir 35 provided with a funnel-shaped opening 37 at its end. From the sort medium reservoir, fluid flows to the sort channel 31 via the medium channel 38. At the confluence of semen and sort medium, the sort channel 31 forms a spreading laminar flow, and this wide portion 39 continues to a continuous flow 41 at the separation point 40 and flows to the sperm depletion reservoir, preferably an outlet or vent to the outside. 43. The sort medium is now fertile with active sperm and flows to the oocyte chamber 45 via the sort sperm channel 44. The oocyte chamber 45 is the same size as the channel 44 or is slightly larger as shown. Before and after the oocyte fertilization chamber, a barrier 46 through which the medium fluid and sperm pass but not through the oocyte is provided. This barrier is similar to that shown in FIG. From chamber 45, fluid continuously flows to sort sperm reservoir 48 with an outlet or vent 49.

チャンバ４５へ１またはこれ以上の卵母細胞を配置するには、端部に漏斗型開口部５１を有する卵母細胞ダクト５０を用いる。ダクト５０の内部直径は卵母細胞がダクトを通ってチャンバ４５に通過しうる大きさとする。ダクト５０の一部５２はチャンバ４５に入る前に水平となり、バルブ５３によるバルブ制御が可能となっている。バルブ５３は内部的な自律開始バルブ（internal actively initiated valve）であり、あるいは電磁的または圧電性駆動の触覚センサを有するプログラム可能なディスプレイに見られるような外部バルブである。卵母細胞のダクトをバルブ制御して後続の卵母細胞を止めると、卵母細胞ダクトの高さは装置を通る流れに影響しない。後続の授精により、卵母細胞は装置を分解して、あるいはバルブ５３を開けて卵母細胞ダクト５０から卵母細胞を回収するｋとにより除去される。   To place one or more oocytes in the chamber 45, an oocyte duct 50 having a funnel-shaped opening 51 at the end is used. The internal diameter of the duct 50 is set such that the oocyte can pass through the duct and into the chamber 45. A portion 52 of the duct 50 becomes horizontal before entering the chamber 45, and valve control by the valve 53 is possible. Valve 53 is an internally actively initiated valve or an external valve as found on a programmable display having an electromagnetic or piezoelectrically driven tactile sensor. When the oocyte duct is valve controlled to stop subsequent oocytes, the height of the oocyte duct does not affect the flow through the device. By subsequent insemination, the oocytes are removed by disassembling the device or opening the valve 53 and collecting the oocytes from the oocyte duct 50.

図３の装置は”通過型”人工授精器であり、選別された***がソート***リザーバへ進む途中で卵母細胞のそばを通る。バルブ制御された卵母細胞のダクトは直接ソート***リザーバ４８に接続され、チャネルよりも授精チャンバまたは窪みを形成している。出口は簡単な”ピン”バリア４７で卵子がチャンバから出ないようにしている。他の装置が図７に示されており、これは卵母細胞と***の接触に高い柔軟性が可能である。図７において図３と同じ要素は同じ符号が付されている。しかしながら、図７では、選別された***は直接ソート***リザーバへ流れる。***はリザーバ４８から***チャネル５５で卵母細胞チャンバ４５へ導かれ、ここに卵母細胞がバリアグレート４６により留められている。卵母細胞は卵母細胞ダクト５０からチャンバ４５に配置される。   The device of FIG. 3 is a “pass-through” artificial inseminator, where the sorted sperm passes by the oocyte on its way to the sort sperm reservoir. The valve-controlled oocyte duct is connected directly to the sort sperm reservoir 48 and forms a fertilization chamber or depression rather than a channel. The exit is a simple “pin” barrier 47 that prevents the egg from leaving the chamber. Another device is shown in FIG. 7, which allows for great flexibility in oocyte-sperm contact. In FIG. 7, the same elements as those of FIG. However, in FIG. 7, the sorted sperm flows directly into the sorted sperm reservoir. The sperm is led from the reservoir 48 through the sperm channel 55 to the oocyte chamber 45 where the oocyte is clamped by the barrier great 46. Oocytes are placed in the chamber 45 from the oocyte duct 50.

***チャネル５５はソート***リザーバ４８および卵母細胞チャンバ４５の間で、例えば”ブライユ（braille）”アクチュエータバルブ５６でバルブ制御される。さらに、***チャネル５５においてソート***リザーバから離れた部分に、アクティブまたはパッシブバルブを配置してもよく、このケースでは、３つ以上の一連のブレイユアクチュエータ５６でチャネルを外側から連続したリズムパターンで押圧し、蠕動ポンプのような動作が得られる。バルブ５６が開けられポンプ５７が動作した場合、選別された***を含む媒質液がソート***リザーバ４８から卵母細胞授精チャンバ４５側に押し出され、ここから収容リザーバ５８に入る。   Sperm channel 55 is valved between sort sperm reservoir 48 and oocyte chamber 45 with, for example, a “braille” actuator valve 56. In addition, an active or passive valve may be placed in the sperm channel 55 away from the sort sperm reservoir. In this case, the channel is connected in a continuous rhythm pattern from the outside by a series of three or more Braille actuators 56. Pressing and operation like a peristaltic pump is obtained. When the valve 56 is opened and the pump 57 is operated, the medium fluid containing the selected sperm is pushed out of the sort sperm reservoir 48 toward the oocyte insemination chamber 45 and enters the storage reservoir 58 from here.

人間あるいは人間以外の胎芽の微細流体培養環境において、動的な培養システムは流れが静的な培養システムと比較して多数の利点を有している。第１に、媒質が胎芽に徐々に移動することにより、胎芽の発育に有害なアンモニアや酸素遊離基といった代謝副産物が除去される。さらに、胎芽を含む独立した卵割球（細胞）が壊死（apoptotic death）する場合があるが、下垂細胞死の因子を破砕し除去する因子が残った卵割球に有害となる。動的培養システムはこのような因子を除去する。第２に、人間の胎芽培養工程は２−３の連続した媒質を突然変異させて３−６日培養するが、これは胎芽に浸透性のストレスをかける場合がある。動的培養システムは徐々に媒質を交換する利点がある。第３に、卵管内で、上皮細胞の睫毛が連続的に”波打ち”、着床前の胎芽が常に動く。この動きが動的な媒質流により得られ、細胞の中心（poles-of-cell）の***や胎芽の発達能力を促進するのに有利となる。第４に、媒質を動的に胎芽に流すと胎芽の副産物の”サンプリング”が可能となり、着床と妊娠の確立においてどの胎芽に最も変化が見られるかが分かる。最後に、胎芽をグループで培養すると、より発育した胎芽（”ヘルパー”）が発達の悪い胎芽（”ラガー”）を発育させる成分を出すと見られ、単独で培養するより優れている。逆に、発達の悪い胎芽は発育のよい胎芽に悪影響を及ぼす。動的媒質流を用いる培養装置はこの不利な相互作用なく容易にヘルパー胎芽の影響をラガー胎芽に与えることができる。胎芽の発育における流体の影響はS. Nonaka et al., "Determination of Left-Right Patterning of the Mouse Embryo by Artificial Nodal Flow", NATURE, 418, pp. 96-99, July, 2002を参照できる。   In a microfluidic culture environment of human or non-human embryos, a dynamic culture system has a number of advantages over a static flow culture system. First, the medium gradually moves into the embryo, thereby removing metabolic byproducts such as ammonia and oxygen free radicals that are detrimental to embryo development. In addition, independent blastomeres (cells), including embryos, may become apoptotic death, which is detrimental to blastomeres that have left a factor that crushes and removes pituitary cell death factors. A dynamic culture system eliminates such factors. Secondly, the human embryo culture process mutates 2-3 continuous media and cultures for 3-6 days, which may impose osmotic stress on the embryo. A dynamic culture system has the advantage of gradually changing the medium. Third, in the fallopian tubes, the epithelial eyelashes continuously “ripple” and the embryo before implantation is always moving. This movement is obtained by dynamic medium flow, which is advantageous to promote poles-of-cell division and embryo developmental ability. Fourth, dynamically flowing media into the embryo allows for “sampling” of embryo by-products, and shows which embryos have the most changes in implantation and establishment of pregnancy. Finally, when embryos are cultured in groups, more developed embryos ("helpers") appear to produce components that develop poorly developed embryos ("lagers"), which is superior to culturing alone. Conversely, a poorly developed embryo adversely affects a well-developed embryo. A culture device using dynamic medium flow can easily influence the helper embryo on the lager embryo without this adverse interaction. See S. Nonaka et al., “Determination of Left-Right Patterning of the Mouse Embryo by Artificial Nodal Flow”, NATURE, 418, pp. 96-99, July, 2002 for the effects of fluid on embryo development.

驚くべき事に、上述した微細流体装置の特徴は、***濃度が低いときに授精面で従来方法より効果的である。例えば、B6C3F1マウスの卵母細胞で、推奨***濃度は１×個／ｍLである。この濃度を微細流体装置で用いると、受精率は相当低くなり、標準の中心注入装置による約３７％と反対で１２％（受精卵の％）しかない。***が０．５×１０６個／ｍLでの受精率は微細流動装置ではさらに悪く８％であり、これに対する中心注入ＩＶＦは３６％である。 Surprisingly, the features of the microfluidic device described above are more effective than conventional methods in terms of insemination when the sperm concentration is low. For example, in a B6C3F1 mouse oocyte, the recommended sperm concentration is 1 × / ml. When this concentration is used in a microfluidic device, the fertilization rate is considerably lower, only 12% (% of fertilized egg) as opposed to about 37% with the standard central injection device. The fertilization rate at 0.5 × 10 6 sperm / mL is even worse in the microfluidic device, which is 8%, whereas the central injection IVF is 36%.

しかしながら、***濃度が０．５×１０６個／ｍL以下となると、顕著な驚くべき変化が生じた。***が０．１５×１０６個／ｍLでは、微細流体チャンバは１８％の成功率を示し、これに対する中央注入ＩＶＦでは１２％であった。***が０．０８×１０６個／ｍLから０．０２×１０６個／ｍLの場合、微細流体ＩＶＦの効率はさらに２倍となった。この結果を図６に示す。したがって、本発明は、本発明の装置を用いることによる***濃度が低い場合の受精率を増加する方法にも関する。この改良は、***濃度と媒質、温度が同じ場合の、微細流動装置の平均受精率と中央注入技術の受精率を比較することにより評価可能である。この改良は、単一種類の***と卵母細胞を用いることにより評価可能であり、異なる種類の結果を用いる場合は平均化する。クレームの発明を評価するために、例えば人間、ウシ属など、適切なデータ収集が困難あるいは費用面で与えられた種類についての統計的データが得られない場合、マウスの種類、特にB6C3F1変異体で進歩を確認する。 However, a remarkable and surprising change occurred when the sperm concentration was 0.5 × 10 6 cells / mL or less. At 0.15 × 10 6 sperm / mL, the microfluidic chamber showed a success rate of 18%, compared to 12% for the central injection IVF. When the sperm was 0.08 × 10 6 / mL to 0.02 × 10 6 / mL, the efficiency of microfluidic IVF was further doubled. The result is shown in FIG. Therefore, the present invention also relates to a method for increasing the fertilization rate when the sperm concentration is low by using the apparatus of the present invention. This improvement can be evaluated by comparing the average fertilization rate of the microfluidic device and the fertilization rate of the central injection technique for the same sperm concentration, medium and temperature. This improvement can be assessed by using a single type of sperm and oocyte, averaging when using different types of results. In order to evaluate the claimed invention, if it is difficult to collect appropriate data, such as humans and bovines, or if statistical data is not available for the given type, the mouse type, especially the B6C3F1 variant Confirm progress.

上記に本発明の一般的な説明をし、さらなる理解のために特定の実施例を以下に説明するが、これは例示に過ぎず、記載事項は限定事項ではない。   The foregoing is a general description of the invention, and specific examples are set forth below for further understanding, but this is illustrative only and the description is not limiting.

微細流体***選別装置をダウコーニング社のＳＹＬＧＡＲＤ８４硬化性シリコン樹脂を用いて作成し、前に引用したD.C.Duffyらに開示されたソフトリソグラフィー技術を用いる。硬化性ＰＤＭＳは所望のリザーバとチャネル構成が突起として設けられたマスターの上からキャストする。キャストされたＰＤＭＳ選別装置はプラズマ酸化され、キャスティングの開口チャネル側がシールされガラスカバースライドとなる。各チャネルとリザーバは１％ウシ血清アルブミンのシグマからＶ分割され、Invitrogen Corporation社の燐酸塩バッファ食塩水（ＰＢＳ）で溶融する。装置全体はカバースライドを除いて６ｍｍの厚みを有し、米国の１ペニー硬化より少し大きい程度である。装置の斜視図を図１に示す。   A microfluidic sperm sorting device is made using SYLGARD 84 curable silicone resin from Dow Corning and uses the soft lithography technique disclosed by D.C. Duffy et al. Curable PDMS is cast from above the master provided with the desired reservoir and channel configuration as protrusions. The cast PDMS sorter is plasma oxidized, and the opening channel side of the casting is sealed to become a glass cover slide. Each channel and reservoir is divided into V from sigma of 1% bovine serum albumin and melted with Invitrogen Corporation's phosphate buffered saline (PBS). The entire device has a thickness of 6 mm, excluding the cover slide, and is slightly larger than the one-penny cure in the United States. A perspective view of the apparatus is shown in FIG.

図１では、ＰＤＭＳキャスティングが透明であり、リザーバとチャネルのみが示されている。ガラスカバースライドまたは他の基板を装置の底面に接着してもよい。各チャネルは断面四角形であり、チャネルの高さは５０μｍであり、これに対しリザーバはほぼ半円形状である。流入リザーバ２，３は高さ約３ｍｍであり、これに対し流出リザーバの高さは約２ｍｍである。流入／流出チャネル７、８、９、１０の長さは約５０００μｍである。***流入チャネル７と活発な***が減少した流出チャネル９の幅は約１００μｍであり、これに対し媒質流入チャネル８と流出チャネル１０の幅は約３００μｍである。ソートチャネル６の幅は約５００μｍであり、長さは約５０００μｍである。   In FIG. 1, the PDMS casting is transparent and only the reservoir and channel are shown. A glass cover slide or other substrate may be adhered to the bottom of the device. Each channel is square in cross section and the channel height is 50 μm, whereas the reservoir is approximately semicircular. The inflow reservoirs 2 and 3 are about 3 mm in height, whereas the outflow reservoir is about 2 mm in height. The length of the inflow / outflow channels 7, 8, 9, 10 is about 5000 μm. The width of the sperm inflow channel 7 and the outflow channel 9 with reduced active sperm is about 100 μm, whereas the width of the medium inflow channel 8 and the outflow channel 10 is about 300 μm. The sort channel 6 has a width of about 500 μm and a length of about 5000 μm.

***サンプルは観察委員会（institution Review Board）の認可を受け、生殖不能の評価がされたものを用いる。洗浄したサンプルを用いて選別テストを行う。リストのオーダーでは、６０μＬの処理済み媒質を媒質流入リザーバに加え、５０μＬの洗浄済み***サンプルをサンプル流入リザーバに加え、２μＬの媒質を各流出リザーバに入れる。***選別の収量はこれらの希釈要素を加味して計算される。活発な***の数はマクラーカウントチャンバ（Sefi-Medical Instruments社、イスラエル、ハイフィ）により算出される。膜に包まれた***を視覚化すべく、通常は活発でない***に関し、３μＬのpropidium iodide（Molecular Probes社、www.probes.com、処理媒質に６０ｍＭ溶解）を選別前の***サンプルに加える。テキサスレッドフィルタセット（５７７ｎｍ励起、６２０ｎｍ放出）を用いて着色した細胞から赤い蛍光色を見る。逆さまにした顕微鏡（NIKON TE 300、www.nikon-usa.com）とＣＣＤカメラ（Hamamatsu ORCA-100、www.hamamatsu.com）を用いて画像を取得し映像を記録する。   Use semen samples that have been approved by the Institution Review Board and have been evaluated for sterility. A screening test is performed using the washed sample. In the order of the list, 60 μL of treated medium is added to the media inflow reservoir, 50 μL of washed semen sample is added to the sample inflow reservoir, and 2 μL of medium is placed in each outflow reservoir. The yield of sperm sorting is calculated taking these dilution factors into account. The number of active spermatozoa is calculated by a McLaugh count chamber (Sefi-Medical Instruments, Israel, Haifi). To visualize the sperm encapsulated in the membrane, 3 μL of propidium iodide (Molecular Probes, www.probes.com, 60 mM lysis in processing medium) is added to the pre-sorted sperm sample for normally inactive sperm. A red fluorescent color is seen from the cells stained using the Texas Red filter set (577 nm excitation, 620 nm emission). Using an upside-down microscope (NIKON TE 300, www.nikon-usa.com) and a CCD camera (Hamamatsu ORCA-100, www.hamamatsu.com), images are acquired and recorded.

この選別装置は、活発でない***が当初の流れに沿って流れて１つの流出口から出て、活発な***が当初の流れから分かれて別の出口から出る選別システムを用いている。この選別メカニズムは、高速で拡散する微細な分子が比較的遅く拡散する分子や細片と異なる出口から出る”Ｈフィルタ”に用いられている”フィルタリング”機構に共通する。２つの装置の異なる点は、本発明の選別装置では細胞の活発な動きを利用するのに対し、Ｈフィルタでは細胞の受動的な拡散を利用する点である。この種の選別は、小さいチャネルで、複数の層流が互いに平行に、両者の界面に混合による乱れなく流れることにより実現する。選別装置内における典型的な***サンプル流と媒質のレイノルド数は０．１のオーダーである。活発で二亜人間の***は、長さが約６０μｍであり、大きさが同じオーダーの活発でない細片はゆっくり拡散し（D=1.5×1013m2／秒；10μｍ拡散するのに690秒）、当初の流れに留まる。これと反対に、活発な人間の***は２０℃で毎秒２０μｍ以上の早さで泳ぐ。この早い運動性が、活発な***を１秒で５００μｍのチャネル幅をランダムに移動させ、これは活発でない***には不可能である。分離チャネルの終端に設けた分岐により、当初の流れから活発な***のみが収集される。 This sorter uses a sorting system in which inactive sperm flows along the initial flow and exits from one outlet, and active sperm separates from the initial flow and exits from another outlet. This sorting mechanism is common to the “filtering” mechanism used in “H filters” where fine molecules diffusing at high speed exit from a different outlet than molecules and strips diffusing relatively slowly. The difference between the two devices is that the sorting device of the present invention uses the active movement of cells, while the H filter uses passive diffusion of cells. This kind of sorting is realized by a small channel in which a plurality of laminar flows flow parallel to each other and flow without disturbance due to mixing at the interface between them. A typical sperm sample flow and media Reynolds number in the sorter is on the order of 0.1. Active and subhuman sperm are approximately 60 μm in length, and inactive fragments of the same order of magnitude diffuse slowly (D = 1.5 × 10 13 m 2 / sec; 690 seconds to diffuse 10 μm) ), Stay in the original flow. In contrast, active human sperm swim at 20 ° C. at a rate of 20 μm or more per second. This fast motility causes active sperm to move randomly over a 500 μm channel width in 1 second, which is impossible for inactive sperm. Due to the branch provided at the end of the separation channel, only active sperm is collected from the original flow.

上述した選別装置は、例えば流入／流出ポートと、液体リザーバと、ポンプと、電源と、ソートチャネルなど、***の選別に必要なすべての機能を簡単なチップデザインの上に具え、実際に製造し使用することができる。本実施例のデザインの特徴は、４つの水平配置された液体リザーバにあり、これらはサンプルの流入／流出ポートおよび液体ポンプシステムとして機能する。これらリザーバの構成、形状、サイズは重力や表面張力と釣り合うよう設計されており、リザーバ内の液量に拘わらず長い期間に亘り安定した流量レートを発生するポンプシステムを実現する。これは、流入リザーバ内の液量の減少につれて流量レートが時間とともに減少する従来の重力駆動ポンプシステムと対照的である。リザーバの直径は表面張力により水平配置されたリザーバから溢れ出ないよう十分小さく選択されるが、十分な量のサンプル（１０から１００μＬ）を保持できるような大きさで選択され、サンプルの導入と回収が便利なものである。この力のバランスにより、内部の液体をこぼさずにリザーバの水平配置が可能となる。リザーバの水平配置は、流入／流出リザーバにおける液面の高さの差（流入／流出リザーバの天井の高さが１．０ｍｍ異なる）はリザーバ内の液体の量に拘わらず、リザーバ内の液量が変化しても、一定の静水圧を保持する。   The sorting device described above has all the functions necessary for sorting sperm, such as inflow / outflow ports, liquid reservoirs, pumps, power supplies and sort channels, on a simple chip design and is actually manufactured. Can be used. The design features of this example are in four horizontally arranged liquid reservoirs that function as sample inlet / outlet ports and a liquid pump system. The configuration, shape, and size of these reservoirs are designed to balance with gravity and surface tension, thereby realizing a pump system that generates a stable flow rate over a long period regardless of the amount of liquid in the reservoir. This is in contrast to conventional gravity driven pump systems where the flow rate decreases with time as the amount of liquid in the inflow reservoir decreases. The diameter of the reservoir is selected to be small enough not to overflow from the horizontal reservoir due to surface tension, but is chosen to be large enough to hold a sufficient amount of sample (10 to 100 μL), and sample introduction and recovery Is convenient. This balance of forces allows the reservoir to be placed horizontally without spilling the liquid inside. The horizontal arrangement of the reservoir indicates that the difference in liquid level in the inflow / outflow reservoir (the height of the ceiling of the inflow / outflow reservoir is 1.0 mm different) is the amount of liquid in the reservoir regardless of the amount of liquid in the reservoir. Maintains a constant hydrostatic pressure even if changes.

上述した受動的に駆動するポンプシステムは、リザーバ内の液量が減少すると圧力が減少する従来の重力駆動ポンプの問題を解消すべく水平配置リザーバを用いる点でユニークである。さらに、このポンプの構造は、他の機械的または非機械的ポンプシステムに比べて非常に簡単で、容易に製造することができ、ポンプを小さくして一体型装置とすることができる。最後に、重力と表面張力を駆動力として用いると、電池のような電源が不要となり、選別装置の全体サイズを小さくすることができる。重力と、表面張力と、チャネルの抵抗を考慮することにより、この選別装置は***の安定した流れを、メインソートチャネルに滞留時間が約２０秒となるよう設計されている。より具体的には、この装置は、液体リザーバの流れの抵抗が微細流動チャネルの抵抗の１０倍以上となり、これを無視することができる。これにより、チャネルの抵抗は、２．８×１０１２ｋｇ／（秒／ｍ４）と計算され、これはほぼシステム全体の抵抗である。所望の２０秒の滞留時間を得るには０．００８μＬ／秒のバルクフローレートが必要であり、合計の抵抗が２．８×１０１２ｋｇ／（秒／ｍ４）で、液体を流すのに必要となる正味の圧力降下は２３Ｎ／ｍ２である。この所望の圧力降下を得るべく、リザーバの直径を、毛細管引力が１３Ｎ／ｍ２となるようにし（流入リザーバの直径３．０ｍｍ、流出リザーバの直径２．０ｍｍ）、この選別装置における静水圧による微細流動チャネルの圧力降下を（高さの差１．０ｍｍ）９．８Ｎ／ｍ２となるようにしている。毛細管引力の計算には、接触角度は０°と仮定し（ＰＤＭＳでコートされたＢＳＡに水が接触する角度は非常に小さい）、洗浄された***の表面張力を０．０４０Ｎ／ｍと仮定し（タンパク質等の不純物があるため水より小さくした）、洗浄された***の粘度を水と同じとした。観察された流量レートは、１％に希釈したＢＳＡ懸濁液で０．００８μＬ／秒であり、計算値とほぼ一致した。実際の***サンプルは粘着性が高く流量レートが低い場合がある。***サンプルの流量レートが低いと生産性が僅かに低くなるが、出口で回収されたソート***の純度に純度に影響はない。 The passively driven pump system described above is unique in that it uses a horizontal reservoir to eliminate the problems of conventional gravity driven pumps where the pressure decreases as the amount of fluid in the reservoir decreases. Furthermore, the structure of this pump is very simple compared to other mechanical or non-mechanical pump systems, can be easily manufactured, and the pump can be made smaller to be an integrated device. Finally, when gravity and surface tension are used as the driving force, a power source such as a battery becomes unnecessary, and the overall size of the sorting device can be reduced. By taking into account gravity, surface tension and channel resistance, this sorter is designed to provide a stable flow of sperm and a residence time of about 20 seconds in the main sort channel. More specifically, this device has a flow resistance of the liquid reservoir that is more than 10 times that of the microfluidic channel and can be ignored. Thereby, the resistance of the channel is calculated as 2.8 × 10 12 kg / (sec / m 4 ), which is almost the resistance of the entire system. A bulk flow rate of 0.008 μL / second is required to achieve the desired 20 second residence time, with a total resistance of 2.8 × 10 12 kg / (seconds / m 4 ) to allow the liquid to flow. The required net pressure drop is 23 N / m 2 . In order to obtain this desired pressure drop, the reservoir diameter is such that the capillary attraction is 13 N / m 2 (inflow reservoir diameter 3.0 mm, outflow reservoir diameter 2.0 mm), depending on the hydrostatic pressure in this sorter. The pressure drop in the microfluidic channel (height difference 1.0 mm) is set to 9.8 N / m 2 . For the calculation of capillary attraction, the contact angle is assumed to be 0 ° (the angle at which water contacts the PDMS-coated BSA is very small) and the surface tension of the washed semen is assumed to be 0.040 N / m. The viscosity of the washed semen was the same as that of water (it was made smaller than water due to impurities such as proteins). The observed flow rate was 0.008 μL / sec with a BSA suspension diluted to 1%, which almost agreed with the calculated value. Actual sperm samples may be sticky and have a low flow rate. A low sperm sample flow rate results in a slightly lower productivity but does not affect the purity of the sorted sperm collected at the outlet.

選別装置の***選別効率は３つの方法で評価することができる：（i）チャネルでの活発な***の動きを位相差顕微鏡で追跡する、(ii)propidium iodide（ＰＩ）で着色された細胞の動きを蛍光分光顕微鏡で追跡する、(iii)Makler Counting Chamber、グリッドベースの***計算装置を用いて、流入／流出リザーバで活発な***と活発でない***の数を算定する（図８）。この***追跡試験により、活発な***が当初の流れからどのようにして泳ぎ出るかが分かる。ＰＩは、死んだ細胞など膜に損傷のある細胞を着色し、これにより活発でない***がハイライトされ視覚的に赤い蛍光色となり、これに対し活発な***は非着色で残る。図８の棒グラフは選別の前後における活発な***の割合を比較したものである。陰影のないバーは当初の***サンプルを示し、ソリッドなバーは活発な***を取り込んだ媒質液を示す。選別後の活発な***の濃度は、選別前の活発な***に比べてほぼ１００％増えている。（３９％、４２％、４３％）の部分は、活発な***の流出リザーバにおける活発な***の数を***サンプル流入リザーバにおける活発な***の和人比較した割合を示しており、遠心分離した***のペレットからすくい上げるといった直接スイムアップ法といった従来の選別方法と比較した***の回収率が（０．８％から５０％まで）以上であることを示す。また、妊娠の成功に関する他の重要な特性である***の形態を、装置による選別後に観察することができる（厳格***形態学：選別前は９．５±１．１％標準が選別後は２２．４±３．３％標準となった）。クルーガーの厳格***形態学は、***が特定の基準を満たし（頭部の幅と長さ、尾の長さ、***の頭部に所定の割合でアクロソームが形成されているか）、異常がないか（すなわち、頭部が細長かったり、丸かったり、尾が縮れていたりしないか）の条件または基準である。   The sperm sorting efficiency of the sorter can be evaluated in three ways: (i) tracking active sperm movement in the channel with a phase contrast microscope, (ii) cells colored with propidium iodide (PI) (Iii) Makler Counting Chamber, a grid-based sperm calculator, which tracks movement with a fluorescence spectroscopic microscope, calculates the number of active and inactive sperm in the inflow / outflow reservoir (FIG. 8). This sperm tracking test shows how active sperm swim from the initial flow. PI colors cells with damaged membranes, such as dead cells, so that inactive sperm is highlighted and visually red fluorescent, whereas active sperm remains uncolored. The bar graph in FIG. 8 compares the percentage of active sperm before and after selection. The unshaded bar represents the original sperm sample, and the solid bar represents the medium fluid that has taken up active sperm. The concentration of active sperm after sorting is almost 100% higher than that of active sperm before sorting. (39%, 42%, 43%) shows the ratio of the number of active sperm in the active sperm effluent reservoir to the active sperm in the sperm sample inflow reservoir compared to the centrifuge sperm It shows that the sperm recovery rate (from 0.8% to 50%) is higher than that of the conventional sorting method such as the direct swim-up method of scooping up the pellet from the pellet. Also, sperm morphology, another important characteristic of pregnancy success, can be observed after instrument sorting (strict sperm morphology: 9.5 ± 1.1% standard before sorting is 22 after sorting) 4 ± 3.3% standard). Kruger's strict sperm morphology indicates that sperm meet certain criteria (head width and length, tail length, whether acrosomes are formed in the sperm's head at a predetermined rate) and are not abnormal (That is, whether the head is elongated, round, or the tail is not curled).

図３に示すように、漏斗型の卵母細胞ダクトが***ソートリザーバへ延びるチャネルに接続されている実施例１と類似の装置が示されている。***の選別の前に、マウス堆積塊（a mouse cumulus mass）（卵母細胞２０−３０個）がピペットで導入されている。マウスの***は***リザーバおよび、媒質液リザーバ（選別液）へ流れる媒質液に導入される。１本の層流が流れ出し、より活発な***が層流の界面を越えて移動し、***を取り込んだ媒質液が、受精チャンバの機能も有する選別***リザーバ回収ウェル（容量３０−４０μＬ）へ導入される。その後２４時間の潜伏時間で、回収ウェル（受精チャンバ）内で受精が成功する。   As shown in FIG. 3, an apparatus similar to Example 1 is shown in which a funnel-type oocyte duct is connected to a channel extending to the sperm sort reservoir. Prior to sperm sorting, a mouse cumulus mass (20-30 oocytes) has been introduced by pipette. Mouse spermatozoa are introduced into the sperm reservoir and the media fluid that flows to the media fluid reservoir (sorting fluid). One laminar flow flows out, more active sperm moves across the laminar flow interface, and the medium fluid that has taken up the sperm is introduced into the sorted sperm reservoir recovery well (capacity 30-40 μL) that also functions as a fertilization chamber Is done. Fertilization succeeds in the collection well (fertilization chamber) with a latent time of 24 hours.

レイヤ技術により、ＰＤＭＳから微細流体チャネル／受精装置を作成する。単一の微細チャネルに２つの大きいリザーバを接続し、一方には漏斗型の卵母細胞ダクトが取り付けられており、これはまた液体流入口としても機能する。この微細チャネルは幅が５００μｍで深さが１８０μｍ、長さが約２ｃｍである。その長さの８０％を過ぎたところに、チャネルは図４で説明したバリアグレートを具えている。バリアグレートの平行する溝は、別に設けられたＰＤＭＳ層でありその後チャネルを含む層に接着される。   A microfluidic channel / fertilizer is created from PDMS by layer technology. Two large reservoirs are connected to a single fine channel, one of which is fitted with a funnel-shaped oocyte duct, which also serves as a liquid inlet. The fine channel has a width of 500 μm, a depth of 180 μm, and a length of about 2 cm. Beyond 80% of its length, the channel comprises the barrier great described in FIG. The parallel grooves of the barrier grate are separately provided PDMS layers and then bonded to the layer containing the channel.

Ｂ６Ｃ３Ｆ１のマウスから取得した卵母細胞を、実施例３の装置にピペットで導入し、卵母細胞がバリアグレートへ移動するよう緩衝媒質を加え、そこでブロックさせる。この微細チャネルに***を取り込んだ媒質を流すことにより受精する。***の濃度を変化させ、同種の卵母細胞、媒質、***を用いた中央注入方法との受精率の比較を行う。この結果を図６に示す。   Oocytes obtained from B6C3F1 mice are pipetted into the apparatus of Example 3 and buffer medium is added to block the oocytes to migrate to the barrier great, where they are blocked. Fertilization is performed by flowing a medium containing sperm into the fine channel. The concentration of semen is changed, and the fertilization rate is compared with the central injection method using the same kind of oocyte, medium, and sperm. The result is shown in FIG.

本発明の実施例を図示し説明したが、これらの実施例が本発明の態様のすべてではない。むしろ、明細書中の語句は限定ではなく説明の語句であり、本発明の目的および範囲を逸脱することなく、様々な変更を施すことが可能であると理解されたい。   While embodiments of the invention have been illustrated and described, these embodiments are not all aspects of the invention. Rather, the terms in the specification are words of description rather than limitation, and it should be understood that various changes can be made without departing from the purpose and scope of the invention.

図１は、本発明の一態様における***分類部を示す図である。FIG. 1 is a diagram illustrating a sperm classification unit according to an aspect of the present invention. 図２は、本発明の一態様による***分類の原理を示す図である。FIG. 2 is a diagram illustrating the principle of sperm classification according to an aspect of the present invention. 図３は、本発明の一態様における装置の実施例を示す図である。FIG. 3 illustrates an example of an apparatus according to one embodiment of the present invention. 図４は、受精チャンバ内での卵母細胞の捕獲に用いるバリヤの実施例を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing an example of a barrier used for capturing an oocyte in a fertilization chamber. 図５は、簡単な重力駆動水平ポンプを示す図である。FIG. 5 shows a simple gravity driven horizontal pump. 図６は、***濃度が低い場合におけるマイクロ流体受精の驚くべき効率を示す図である。FIG. 6 shows the surprising efficiency of microfluidic fertilization when the sperm concentration is low. 図７は、本発明のさらなる実施例を示す図である。FIG. 7 shows a further embodiment of the invention.

Claims (13)

微細流体***の分離と授精の一体型装置であって：
ａ）少なくとも２つの重力ポンプ液体リザーバを具え、当該リザーバの１つは***収容リザーバであり、リザーバの別の１つはソート媒質液のリザーバであり、
ｂ）少なくとも１つのソートチャネルを具え、当該ソートチャネルはソート側とリジェクト側に分かれており、前記ソートチャネルのリジェクト側の***収容リザーバに接続された上流部分を具え、前記ソートチャネルのソート側に１以上のソート媒質リザーバを具え、
ｃ）前記ソートチャネルの前記リジェクト側のソートチャネルの下流側に接続されたリジェクト***収容リザーバと、
ｄ）前記ソートチャネルのソート側のソートチャネルの下流部分に接続された***ソートリザーバと、
ｅ）１以上の卵母細胞を選別した***の流れに入れるよう形成された卵母細胞授精チャンバであって、当該チャンバがチャンバ内に配置された卵母細胞が出るのを防止しつつ前記チャンバに液体が流れるのを許容するよう構成された少なくとも１以上のバリアを具え、
前記卵母細胞の授精チャンバと前記ソート***リザーバが一体的に１つのチャンバをなし、前記***収容リザーバ内の***を含む液体と前記第２のリザーバのソート媒質液が前記ソートチャネルにて平行に重力で導かれた層流をなすが間に界面を有する別の流れを示し、活発な***が前記界面を越えて移動し、前記ソートチャネルまたは前記ソート***リザーバから最後に前記ソート媒質液により前記卵母細胞授精チャンバに運ばれることを特徴とする装置。 An integrated device for microfluidic sperm separation and insemination:
a) comprising at least two gravity pump liquid reservoirs, one of which is a sperm containing reservoir, another one of which is a sort medium fluid reservoir;
b) comprising at least one sort channel, the sort channel being divided into a sort side and a reject side, comprising an upstream portion connected to a sperm containing reservoir on the reject side of the sort channel, on the sort side of the sort channel; Comprising one or more sort medium reservoirs,
c) a reject sperm containing reservoir connected downstream of the sort channel on the reject side of the sort channel;
d) a sperm sort reservoir connected to the downstream part of the sort channel on the sort side of the sort channel;
e) an oocyte insemination chamber configured to enter one or more oocytes into a selected sperm stream, wherein the chamber prevents the oocytes disposed in the chamber from exiting; Comprising at least one or more barriers configured to allow liquid to flow therethrough,
The oocyte insemination chamber and the sort sperm reservoir integrally form one chamber, and the liquid containing the sperm in the sperm storage reservoir and the sort medium liquid in the second reservoir are parallel in the sort channel. Showing another flow with a gravitationally guided laminar flow but with an interface in between, active sperm moving across the interface, and finally from the sort channel or the sort sperm reservoir by the sort medium liquid A device characterized in that it is transported to an oocyte insemination chamber. シリコンエラストマーで構成されていることを特徴とする請求項１に記載の装置。   2. The device according to claim 1, wherein the device is made of silicon elastomer. 前記卵母細胞授精チャンバに接続された卵母細胞ダクトを具えることを特徴とする請求項１に記載の装置。   The apparatus of claim 1, comprising an oocyte duct connected to the oocyte insemination chamber. 前記ソート***リザーバと前記卵母細胞授精チャンバが１つのチャンバであり、卵母細胞ダクトに接続していることを特徴とする請求項１に記載の装置。   The apparatus of claim 1, wherein the sort sperm reservoir and the oocyte insemination chamber are one chamber and are connected to an oocyte duct. 前記バリアが、複数のバリア流チャネルを形成してなる３次元バリアグレートを具え、前記バリア流チャネルが、卵母細胞の通過が前記バリア流チャネルにより阻止されるよう卵母細胞の直径より小さく、***がバリアを通過できるよう***のサイズより大きいことを特徴とする請求項１に記載の装置。   The barrier comprises a three-dimensional barrier great formed by forming a plurality of barrier flow channels, wherein the barrier flow channel is smaller than the diameter of the oocyte such that passage of the oocyte is blocked by the barrier flow channel; The device of claim 1, wherein the device is larger than the size of the sperm so that the sperm can pass through the barrier. 卵母細胞の操作を最小限に抑えつつ選別した活発な***で卵母細胞を授精させる人工授精方法において、
ａ）請求項１の装置を用意するステップと、
ｂ）前記卵母細胞の授精チャンバに１以上の卵母細胞を導入するステップと、
ｃ）***を含む第１の流体を、当該***を含む第１の流体よりも高い確立で活発な***を含む第２の流体へとソートすべく導入するステップと、
ｄ）ソートした媒質液を前記ソート媒質液リザーバへと導入するステップと、
ｅ）前記***を含む第１の液体とソート媒質液とを前記ソートチャネルに流すステップと、
ｆ）前記ソートチャネルから前記***を含む第２の流体を分離するステップと、
ｇ）前記***を含む第２の流体を前記卵母細胞に接触させるステップと含むことを特徴とする方法。 In an artificial insemination method in which an oocyte is inseminated with active sperm selected while minimizing the operation of the oocyte,
a) providing the apparatus of claim 1;
b) introducing one or more oocytes into the oocyte insemination chamber;
c) introducing a first fluid containing sperm to be sorted into a second fluid containing a more established and active sperm than the first fluid containing the sperm;
d) introducing the sorted medium liquid into the sorted medium liquid reservoir;
e) flowing a first liquid containing the sperm and a sort medium liquid through the sort channel;
f) separating a second fluid containing the sperm from the sort channel;
g) contacting the oocyte with a second fluid containing the sperm. 前記卵母細胞の授精チャンバは卵母細胞ダクトに接続されており、前記方法がさらに前記卵母細胞を前記卵母細胞ダクトを介して前記卵母細胞授精チャンバに導入するステップと、***に接触した卵母細胞を前記卵母細胞授精チャンバから前記卵母細胞ダクトを介して取り出すステップとを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。   The oocyte insemination chamber is connected to an oocyte duct, and the method further introduces the oocyte into the oocyte insemination chamber via the oocyte duct and contacts the sperm Removing the oocyte from the oocyte insemination chamber via the oocyte duct. 前記***に接触した卵母細胞が受精卵であることを特徴とする請求項７に記載の方法。   The method according to claim 7, wherein the oocyte in contact with the sperm is a fertilized egg. 前記卵母細胞を前記卵母細胞授精チャンバに導入または取り出すステップはピペットを用いて行うことを特徴とする請求項７に記載の方法。   8. The method of claim 7, wherein the step of introducing or removing the oocyte from the oocyte insemination chamber is performed using a pipette. 前記卵母細胞の授精チャンバは、前記チャンバ内にある複数の卵母細胞が流れの方向に対して直列配置されるよう構成されていることを特徴とする請求項６に記載の方法。   7. The method of claim 6, wherein the oocyte insemination chamber is configured such that a plurality of oocytes within the chamber are arranged in series with respect to the direction of flow. 前記***を含む第２の流体の***により１以上の卵母細胞が授精し、少なくとも前記重力ポンプ液体リザーバの１つに栄養媒質液が導入され、前記授精した卵母細胞に栄養媒質液を供給することを特徴とする請求項６に記載の方法。   One or more oocytes are inseminated by the sperm of the second fluid containing the sperm, the nutrient medium liquid is introduced into at least one of the gravity pump liquid reservoirs, and the nutrient medium liquid is supplied to the inseminated oocytes 7. The method of claim 6, wherein: ***濃度が低い場合の受精率を向上する方法において、
微細流体チャネルに１以上の卵母細胞を導入するステップを具え、前記チャネルに、液体と***が通過可能であって卵母細胞が入るには小さすぎる複数の開口を具えるバリアが設けられており；
液体を導入し前記卵母細胞を前記チャネルを通って前記バリアに移動させるステップと；
前記チャネルに濃度の低い***を含む液体を導入し、当該***を含む液体を前記卵母細胞へと流すステップとを具え、
前記***濃度における受精率が中央注入式（center-well）授精より高いことを特徴とする方法。 In a method for improving the fertilization rate when the sperm concentration is low,
Introducing one or more oocytes into the microfluidic channel, wherein the channel is provided with a barrier through which liquid and sperm can pass and which has a plurality of openings that are too small for the oocyte to enter There;
Introducing a liquid and moving the oocyte through the channel to the barrier;
Introducing a liquid containing low concentration sperm into the channel and flowing the liquid containing the sperm into the oocyte,
The method is characterized in that the fertilization rate at the sperm concentration is higher than that of center-well insemination. 前記***濃度が、***が０．５×１０６個／ｍＬ以下であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
The method according to claim 12, wherein the sperm concentration is 0.5 × 10 6 sperms / mL or less.
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