JP2006526383A - 杯細胞関連疾患の診断、予防、改善、治療を行なうための方法と薬 - Google Patents

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Abstract

本発明は正常杯細胞機能特に粘液産生にはhAG-2またはgob-4[アフリカツメガエル(Xenopus laevis)セメント腺遺伝子XAG-2のホモログ; 本書ではAGR2ともいう]が必要とされるという観測結果を基礎とする。特に粘液産生障害のある一突然変異体を単離した。この変異体では残基位置137でバリンからグルタミン酸へのアミノ酸交換が起きている。この変異をもつトランスジェニック・マウスは下痢と繁殖能力欠損とを示す。この観測結果に基づく本発明はとりわけ、正常杯細胞機能の変化に関連する疾患の予防、改善または治療のための産物と方法に関する。

Description

本発明は、特に、正常な杯細胞の機能変化に伴う医学的症状を予防、改善、治療する方法に関する。本発明は、対象がそのような症状になるリスクが大きいことを示す疾患関連マーカーのスクリーニング方法と、ヒト対象者がそのような症状になる傾向のスクリーニングと診断を行なう方法にも関する。本発明はさらに、そのような医学的症状とその裏にある分子メカニズムを研究するのに役立つモデル動物と、そのモデル動物を利用して例えば杯細胞関連疾患の予防、改善、治療に役立つ診断マーカーまたは薬を同定する方法にも関する。上記の方法で役に立つ新規な薬（例えばポリペプチドとその断片、核酸、抗体）と、新規な医薬組成物も同様に提供される。本発明はさらに、上記の方法を実施するのに役立つアゴニストとアンタゴニストをスクリーニングする方法にも関する。本発明のこれらの側面とさらに別の側面を以下にさらに詳しく説明する。
上皮粘膜層は、乾燥、有害な外来物質、病原体から動物の身体を保護する上で重要な化学的、物理的障壁である。粘液がゲル層を形成し、上皮の表面を覆い、上皮と外部環境の間の半透性障壁として機能する。粘液は多くの機能を有する。例えば剪断応力や化学的損傷からの保護や、特に呼吸樹における粒子状物質や微生物の捕捉と除去などの機能がある。腸上皮の最上面にある粘液層は、宿主の内部環境と腸内細菌の間の障壁である。脊椎動物の目では、涙液膜の内側層は粘液分泌生成物からなる。粘液は、ムチンと呼ばれる高度にグリコシル化されたタンパク質が電解質溶液の中に懸濁されたものを主成分とする粘性流体である（Dekker他、2002年）。粘液のムチンとそれ以外の成分は、杯細胞と呼ばれる特殊な柱状上皮細胞の先端面から分泌される（Verdugo、1990年）。
杯細胞は多くの臓器（特に腸管と気管）の上皮にある他の細胞に分布している。結膜などの領域では他のタイプの細胞と比べて杯細胞の数は少ないが、大腸などの組織でははるかに数が多い。杯細胞は、膜結合分泌顆粒を基本とした特徴的な形態であり、その顆粒に粘液が含まれている（SpecianとOliver、1991年）。
杯細胞の機能はムチンとそれ以外の生成物（例えばトレフォイル・ペプチド・ファミリーなどのプロテアーゼ抵抗性ペプチド）の分泌であり、これらが、上皮を損傷から保護し、上皮細胞の再構成を通じて修復を促進する（Podolsky、2000年）。粘液の分泌は、分泌顆粒のエキソサイトーシスによって起こる（Verdugo、1991年）。ムチンは水和能力を持っていて粘性ゲルを形成し、上皮表面に被さる保護用の足場を作り出す。
構成的分泌または基本的分泌は低レベルで起こり、本質的に調節されておらず連続的である。刺激された分泌は、顆粒が細胞外刺激（例えばホルモン、神経ペプチド、炎症メディエータ）に応答して調節されたエキソサイトーシスを起こすことに対応する（Jackson、2001年；Laboisse他、1996年）。この経路により、粘液の分泌を劇的に増大させる能力が提供される。腸管の管腔には、腸内細菌などの多数の分泌促進物質が不可避的に含まれている（DepanckeとGaskins、2001年）。肺では、塵や煙などの刺激物質が杯細胞からの分泌の強力な誘導物質になる（Maestrelli他、2001年）。刺激による貯蔵されたムチン顆粒のエキソサイトーシスだけでなく分泌促進物質に長時間曝露されると、ムチン遺伝子の発現と杯細胞の過形成が誘導される（AhlstedtとEnander、1987年；Maestrelli他、2001年；Nadel、2001年）。粘膜組織における上皮の分化は、胃腸管内胚葉と気管支でかなり詳細に研究されてきた（Nadel、2001年；van Den Brink他、2001年）。腸では、杯細胞が多能幹細胞（多能幹細胞からは、腸細胞、杯細胞、腸内分泌細胞、パーネト細胞という4種類の上皮細胞が生まれる）から分化する（Yang他、2001年）。最近の遺伝子データによると、マウスの腸杯細胞が分化するのに転写因子Math1、Klf4、Elf3とGTPアーゼRac1が必要であることが明らかになった（Katz他、2002年；StappenbeckとGordon、2000年；Yang他、2001年）。気道では上皮増殖因子受容体のリガンドが上皮細胞の分化とムチンの発現を促進しているというアイディアが出されている（Nadel、2001年）。
上皮の機能に関係する遺伝子を同定する別の方法として、われわれは、マウスの上皮機能（例えば腸粘膜による栄養の吸収）に影響を与える突然変異を探すゲノム・スケールのスクリーニングを行なった。このスクリーニングの範囲内で、突然変異C3Hマウスが慢性の下痢と繁殖能力の欠陥を抱えていることが明らかになった。このマウスは繁殖能力があり、その表現型は劣性で子孫に伝えられた。この新規な突然変異マウスを今後は“MTZ”と呼ぶ。組織学的分析により、この新規な突然変異C3Hマウスで観察される表現型の欠陥の主な原因は、分化（特に最終分化）の欠陥または腸粘膜における杯細胞の機能の欠陥であることがわかった。関与する突然変異がポジショナル・クローニングによって同定され、既知の遺伝子内のアミノ酸交換であることが明らかになった。この遺伝子は、マウス・ゲノム・データベースによると“前勾配2”（Agr2）と名づけられていた。対応するcDNAの発現は、インサイチュ・ハイブリダイゼーションによってマウス腸組織（特に腸杯細胞）において報告されている（Komiya他、1999年）。ヒト・オーソロガス遺伝子は、マウスAgr2遺伝子とアミノ酸が91％一致するタンパク質をコードしており、“前勾配2ホモログ”（AGR2）と呼ばれている。
ヒトAGR2（BCMP7、XAG-1とも呼ばれる）は既知のタンパク質である。例えばWO 98/07749にはヒト増殖因子群が開示されていて、その中にはhuXAG-1と同定された配列が含まれている。このhuXAG-1はヒトAGR2に対応しており、この出願では大腸がんの増殖因子かつマーカーであることが示唆されている。
WO 99/53040には、ESTデータベースに由来する多数の配列が開示されており、その中には、AGR2に対応する配列（配列ID265と288であると同定された配列）が含まれている。
WO 99/55858にも、ESTデータベースに由来する多数の配列が開示されている。その中には、AGR2に対応する配列（配列ID8と181であると同定された配列）が含まれており、その配列は膵臓がん組織でより多く発現することが示唆されている。
WO 00/53755には、AGR2に対応する配列（PRO 1030）が開示されている。遺伝子複製増幅法を利用し、複製遺伝子の数が主に肺がんと大腸がんで増大することが報告されている。
AGR2に対応する配列はWO 99/40189にも開示されている。
アメリカ合衆国特許出願第2002111303では、AGR2（この出願ではBCMP7と呼ばれている）がN末端シグナル配列を有する細胞外タンパク質であることが予測されており、さらに、AGR2は乳がんと前立腺がんのマーカーになることが示唆されている。
ヒトAGR2のmRNAは、気管、肺、胃、大腸、前立腺、小腸で発現することがわかっている（ThompsonとWeigel、1998年）。
ヒトAGR2のcDNA配列はアメリカ合衆国特許第6,312,922号に記載されている（配列番号61と149）。
細胞レベルまたは臓器レベルでのAGR2タンパク質の実際の機能は、これまで哺乳動物では知られていない。AGR2のホモログ・タンパク質に関する唯一の機能分析はアフリカツメガエルでなされ、Abergerらによって報告されている（Aberger他、1998年）。彼らは、XAG-2の過剰発現によって異所性セメント腺分化と前神経マーカー遺伝子発現の両方がアフリカツメガエルの胚において誘導されることを示した。しかしマウスおよびヒトのAGR2と比べたときにアミノ酸が最もよく一致するアフリカツメガエルのタンパク質はCGSというタンパク質（EMBL/GenBank/DDBJデータベース登録番号AAL26844；TrEMBLエントリーQ90Y05）であり、マウスAgr2タンパク質とアミノ酸が59％一致し、ヒトAGR2とはアミノ酸が60％一致する。アフリカツメガエルにおけるAGR2オルソログと想定されるCGSの機能はまだ報告されていない。
われわれは、最近、マウスAgr2遺伝子とヒトAGR2遺伝子のRNA発現プロファイルを詳細に分析した。この明細書に記載したモデル・マウスで観察された表現型から、モデル哺乳動物の体内で杯細胞が正常に機能するのにAgr2の機能が必要であることが初めて明らかになった。
粘液産生の変化がさまざまな疾患に関与していることが指摘されてきた。例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症などであり、これらの疾患は粘液産生の増大を特徴とする。ドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患などの疾患は、粘液の産生低下を特徴とする。粘液産生の変化は、結腸直腸がんなどの悪性疾患でも報告されている（Corfield他、2001年；Einerhand他、2002年；Fahy、2001年；Forstner、1978年；JassとWalsh、2001年；Maestrelli他、2001年；Melton、2002年；Puchelle他、2002年；Schreiber他、2002年；SlomianyとSlomiany、2002年；Velcich他、2002年；Voynow、2002年；Watanabe、2002年）。したがって上皮細胞の分化、粘液産生の調節、粘液の分泌、完全な粘膜表面の維持に関するメカニズムを理解するための生体医学の研究において多大な努力がなされている。粘液の産生を変化させるいくつかの戦略が提案されている（以下に示す特許と特許出願を参照のこと）。そのためには、例えば、LTB4アンタゴニスト（WO 02/55065）、EGF受容体アンタゴニスト（WO 02/05842）、ポリカチオン性ペプチド（アメリカ合衆国特許第6,245,320号）、KGF（WO 94/23032）（Farrell他、2002年）、KGF-2（WO 99/41282）を用いる。最近、粘液産生細胞を含むさまざまなタイプの組織における上皮細胞の分化に関する概説がいくつか発表された（Bhat、2001年；BrittanとWright、2002年；Daniels他、2001年；Emura、2002年；Foster他、2002年；Otto、2002年）。しかしAGR2遺伝子またはその遺伝子産物が粘液の産生に関係することは示唆されていない。
この明細書に記載した発明は、杯細胞が正常に機能する（特にムチンを産生する）のにAGR2が必要であることを初めて明らかにする。したがって本発明は、粘液産生組織の機能不全が関係する上記疾患、または粘液産生の変化が治療効果を有する可能性のある他のあらゆる症状を診断して治療する新たな機会を提供する。
第1の特徴として、本発明により、ヒトにおける杯細胞関連疾患（例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症、ドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患（特にクローン病または潰瘍性大腸炎）、悪性疾患（例えば結腸直腸がん））のモデルとして役立つ非ヒト動物が提供される。
一実施態様では、本発明の動物は、野生型配列と比べて変化したアミノ酸配列を有するAGR2タンパク質をコードしている突然変異したAGR2遺伝子を持っている。一実施態様では、AGR2タンパク質は、機能している表現型が失われる原因となる変化したアミノ酸配列を持つことができる。あるいはAGR2は、機能する表現型を獲得する原因となる変化したアミノ酸配列を持つことができる。
本発明は、本発明のモデル動物を利用してAGR2の突然変異が関係する疾患を研究する方法にも関する。本発明の一実施態様により、AGR2またはそれをコードしている遺伝子の不足または過剰産生を診断する方法が提供される。本発明の別の一実施態様により、本発明のモデル動物を利用してAGR2の突然変異に関連する疾患と症状の予防薬または治療薬のスクリーニング法が提供される。
さらに、本発明により、野生型配列と比べて変化した配列を有する突然変異したAGR2核酸とAGR2ポリペプチド（“ムテイン”とも呼ばれる）が提供される。突然変異した核酸とポリペプチドは、この明細書で考える診断法と治療法で使用することもできる。特別な一実施態様では、配列番号30に示したように、AGR2ムテインが残基137にアミノ酸置換を有する。
内在性AGR2の活性を変化させるモジュレータ（アゴニストまたはアンタゴニスト）としてAGR2ムテインを使用することも考えられる。したがって本発明のAGR2ムテインを含む医薬組成物は、薬理学的に許容可能な基剤をさらに含むことが考えられる。特に、本発明のAGR2ムテイン、それをコードしているポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含むベクターを利用して、対象となる哺乳動物、特にヒト対象者における医学的症状を予防、治療、改善することと、杯細胞または粘液産生の異常を特徴とするあらゆる医学的症状を予防、治療、改善する手段を開発することを考える。
本発明の一実施態様は、標的遺伝子がAGR2タンパク質によって調節されているときに真核細胞においてその標的遺伝子の発現を変化させる方法に関する。この方法は、AGR2（すなわち野生型AGR2またはAGR2ムテイン）の活性を変化させるステップを含んでいる。この方法は1個の細胞に適用できるが、多細胞生物の体内にある真核細胞に適用するほうが好ましい。多細胞生物としては、例えばヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ラット、マウスなどの哺乳動物だけでなく、他の脊椎動物（アフリカツメガエルなどの両生類）も挙げられる。これら多細胞生物の体内にある真核細胞としては、AGR2を発現する細胞、中でもブルンナー腺または気管の粘膜下腺の杯細胞や粘液分泌細胞が考えられる。
本発明の別の一実施態様は、転写がAGR2タンパク質によって調節されている標的遺伝子の発現を哺乳動物の細胞において変化させる方法に関する。この方法では、AGR2（すなわち野生型AGR2またはAGR2ムテイン）の活性を変化させる。すると変化したAGR2が今度は標的遺伝子の発現を変化させる。この方法は、すべての動物、例えばヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ラット、マウスなどの哺乳動物だけでなく、他の脊椎動物（アフリカツメガエルなどの両生類）でもうまくいくであろう。この方法は、AGR2を発現する細胞、例えばブルンナー腺または気管の粘膜下腺の杯細胞や粘液分泌細胞で特に有効である。
AGR2（すなわち野生型AGR2またはAGR2ムテイン）の活性は、多くの方法で変化させることができる。例えば翻訳後修飾の状態を変えるという方法がある。例えば標的遺伝子がリン酸化されたAGR2にとって重要である場合には、AGR2タンパク質のリン酸化状態を増やして標的遺伝子の活性を大きくすることができる。逆にこの遺伝子の活性を低下させたい場合には、AGR2のリン酸化状態を減らすとよい。
別の実施態様として、標的遺伝子がAGR2の脱リン酸化状態にとって重要である場合には、AGR2のリン酸化状態を減少させて標的遺伝子の活性を大きくする。この場合には、AGR2のリン酸化状態を増やすと標的遺伝子の活性を小さくすることができる。
変化としては、AGR2（すなわち野生型AGR2またはAGR2ムテイン）の活性増大、またはAGR2（すなわち野生型AGR2またはAGR2ムテイン）の活性低下が考えられる。AGR2の活性を増大または低下させることのできるあらゆる方法が利用できる。例えばAGR2の発現阻害剤をAGR2 mRNAと接触させてAGR2を減らすことで、タンパク質の翻訳を阻止したり、mRNAの崩壊を促進したりすることができる。AGR2の発現阻害剤としては、核酸などの生体分子が考えられる。核酸としては、例えばアンチセンス核酸（DNA、RNA、PNA、または他の合成核酸アナログ）、siRNA分子、アプタマーが考えられる。核酸としては、AGR2 mRNAに対して特異的なリボザイムが考えられる。核酸を用いるどの場合でも、突然変異したタンパク質をコードしている核酸を野生型核酸から区別できるように核酸を設計するとよい。例えばリボザイムとアンチセンス核酸は、突然変異したAGR2をコードしている配列にはハイブリダイズするが、野生型AGR2をコードしている配列にはハイブリダイズしないという風な配列特異的なハイブリダイゼーションをするように設計するとよい。
あるいはリボザイムとアンチセンス核酸は、野生型AGR2をコードしている配列にはハイブリダイズするが、突然変異したAGR2をコードしている配列にはハイブリダイズしないという風な配列特異的にハイブリダイゼーションをするように設計するとよい。
さらに別の実施態様として、上記のリボザイムは、ハイブリダイゼーション領域と触媒領域からなるようにすることができる。AGR2の発現に影響を与えるように設計したリボザイムは、当然、AGR2 mRNA配列の少なくとも一部にハイブリダイズできるハイブリダイゼーション領域を含むことになる。さらに、リボザイムは、AGR2のmRNA配列を開裂させて発現するAGR2遺伝子の減少または抑制を実現できる触媒領域を含むことになろう。ハイブリダイゼーション領域は、突然変異したAGR2をコードしている配列にだけハイブリダイズして野生型AGR2をコードしている配列にはハイブリダイズしないように構成するとよい。あるいはハイブリダイゼーション領域は、野生型AGR2をコードしている配列にだけハイブリダイズして突然変異したAGR2をコードしている配列にはハイブリダイズしないように構成するとよい。この場合、ハイブリダイゼーション領域には、突然変異を含むAGR2ムテイン配列の一部が含まれない。逆に、ハイブリダイゼーション領域は、AGR2タンパク質が野生型であるか突然変異体であるかに関係なく、AGR2をコードしているすべての配列にハイブリダイズするように構成することもできる。
別の一実施態様では、上記の生体分子としてタンパク質が考えられる。タンパク質としては、抗体、抗体の一部、アンチカリンが考えられる。抗体と抗体断片は、AGR2タンパク質（すなわち野生型AGR2またはAGR2ムテイン）に結合するときに特異性を示す。特異性の大きい抗体と抗体断片が好ましいが、本発明では特異性がより低い抗体と抗体断片も考える。特異性がより低い抗体と抗体断片は、例えば抗体が他の細胞機能を妨げない場合に役立つ可能性がある。
抗体と抗体断片が十分に特異的であって細胞内の他のどのタンパク質とも結合しないことが好ましい。大きな特異性は、モノクローナル抗体を用いることによって実現できる。モノクローナル抗体の製造法はよく知られている。ポリクローナル抗体を製造する別の方法も知られており、例えば動物に注入する方法がある。特異性の大きいポリクローナル抗体は、例えばAGR2を発現しない細胞からのタンパク質と結合するカラム（すなわちカラム・クロマトグラフィ）を用いることによって製造できる。このようなカラムでは非特異的抗体が除去されることになろう。抗体を精製する他の方法は従来技術で知られている。
本発明の別の一実施態様は、例えば配列番号2の残基137に対応する位置にアミノ酸置換を有する突然変異AGR2ポリペプチドに関する。このポリペプチドは少なくとも6個のアミノ酸を含むことができるが、少なくとも7個のアミノ酸を含むことが好ましく、少なくとも8個のアミノ酸を含むことがより好ましく、少なくとも9個のアミノ酸を含むことがさらに好ましく、少なくとも10個のアミノ酸を含むことが最も好ましい。より長いペプチド（例えば位置137にアミノ酸置換を有する完全長AGR2タンパク質）ももちろん考えられる。なぜなら完全長タンパク質は、上記の少なくとも6、7、8、9、10個のアミノ酸という条件よりも長いからである。
アミノ酸置換は、位置137にバリンをコードしているコドンが、バリンでない置換をコードしているコドンになった置換である。遺伝暗号は公知であるため、要求される置換のタイプも当業者には知られている。置換の一例は、バリンがグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換わった置換である。置換の別の一例は、バリンがグリシンまたはプロリンで置き換わった置換である。置換の別の一例は、バリンが、塩基性アミノ酸（ヒスチジン、アルギニン、リシン）、脂肪族ヒドロキシル側鎖アミノ酸（セリン、トレオニン）、芳香族側鎖アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、アミド側鎖アミノ酸（アスパラギン、グルタミン）、イオウ含有側鎖アミノ酸（システイン、メチオニン）、脂肪族側鎖アミノ酸（アラニン、ロイシン、イソロイシン）のいずれかで置き換わった置換である。
本発明の一実施態様は、AGR2のポリペプチド断片をコードしていて、そのポリペプチド断片には完全長AGR2の残基137に対応するアミノ酸置換が含まれている核酸セグメントに関する。アミノ酸置換としては、残基137をコードしているコドンが、バリンをコードしていない任意のコドンに置き換わった置換が考えられる。バリンをコードしていないコドンとしては、例えば、フェニルアラニン（TTT、TTC）；ロイシン（TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG）；イソロイシン（ATT、ATC、ATA）；メチオニン（ATG）；セリン（TCT、TCC、TCA、TCG）、プロリン（CCT、CCC、CCA、CCG）；トレオニン（ACT、ACC、ACA、ACG）、アラニン（GCT、GCC、GCA、GCG）；チロシン（TAT、TAC）；ヒスチジン（CAT、CAC）、アスパラギン酸（GAT、GAC）；グルタミン（CAA、CAG）；アスパラギン（AAT、AAC）；リシン（AAA、AAG）；グルタミン酸（GAA、GAG）；システイン（TGT、TGC）；トリプトファン（TGG）；アルギニン（CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG）；セリン（AGT、AGC）；グリシン（GGT、GGC、GGA、GGG）をコードしているコドンが可能である。上記のあらゆる置換のうち、配列番号2に示したようにコドン137においてバリンからグルタミン酸（GAA、GAG）への置換をコードしている核酸が最も好ましい。
本発明の核酸としては、組み換えによって生まれるエピソーム・エレメントの一部が考えられる。エピソーム・エレメントとしては、例えばプラスミド、コスミド、バクテリオファージの核酸、ウイルスの核酸などが考えられる。組み換えによって生まれる核酸としては、ゲノムの一部（例えばバクテリオファージのゲノム、細菌のゲノム、ウイルスのゲノム）が考えられる。ウイルスのゲノムとしては、DNAウイルスのゲノムまたはRNAウイルスのゲノムが可能である（両方とも+鎖ウイルスまたは-鎖ウイルス）。
本発明の別の一実施態様は、AGR2のポリペプチド断片をコードしていて、そのポリペプチド断片に完全長AGR2の残基137に対応するアミノ酸置換が含まれている核酸セグメントを含むベクターに関する。このベクターは、発現ベクター、突然変異誘発ベクター、一体化ベクター、突然変異ベクターのいずれでもよい。発現ベクターは従来技術において周知であり、例えばプラスミド・ベクター、コスミド・ベクター、ファージ・ベクター、ファージミド・ベクター、ウイルス・ベクター、レトロウイルス・ベクターなどが挙げられる。
本発明では、上記のベクターと核酸のうちの1つをトランスフェクトされた宿主細胞も考える。宿主細胞としては、例えば、真核細胞または原核細胞が考えられる。ベクターではない核酸で形質転換した宿主細胞としては、例えば、アンチセンスDNAまたはリボザイムで形質転換した細胞が考えられる。
本発明の別の一実施態様は、突然変異AGR2タンパク質の製造方法に関する。この方法では、AGR2のポリペプチド断片をコードしていて、そのポリペプチド断片に完全長AGR2の残基137に対応するアミノ酸置換が含まれている核酸で形質転換した宿主細胞を培養し、その核酸を発現させる。発現ベクターが望ましいが、必ずしも発現ベクターは必要でないことに注意されたい。例えば一時的な発現では、ベクター配列は発現に必要ではない。発現後、培養した細胞を回収し、突然変異AGR2タンパク質を細胞から精製する。精製して均一化することが望ましいが、必ずしもそうする必要はない。精製には、AGR2を発現した細菌からライセートを得る操作だけが含まれていてもよい。その場合にはAGR2タンパク質を精製する。なぜなら、自然の状態で関係のあったタンパク質（真核生物のタンパク質）とはもはや関係がないからである。別の実施態様として、ヒト細胞で発現させたマウスAgr2タンパク質も、自然の状態で関係のあるタンパク質（マウスのタンパク質）とはもはや関係がないため精製する。
本発明の別の一実施態様は、患者の状態に変化を誘導するための組成物に関する。この組成物は、残基137に対応する置換突然変異を含む突然変異AGR2ポリペプチド、またはこの明細書に記載した他の任意のAGR2ムテインを含むことができる。野生型AGR2タンパク質の具体例を配列番号3または配列番号4に示してある。したがって配列番号3または配列番号4の残基137に置換突然変異を有するポリペプチドは、組成物の一成分になることができる。置換突然変異としては、位置137のバリンがバリンでないアミノ酸に置き換わった置換が考えられる。組成物は、野生型AGR2タンパク質（例えば配列番号4のタンパク質）も含むことができる。さらに、組成物は、薬理学的に許容可能な基剤を含むことができる。
本発明の別の一実施態様は、転写がAGR2によって正または負に調節される遺伝子の発現を真核細胞において選択的に抑制する方法に関する。真核細胞としては、哺乳動物の細胞（ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ラット、マウスに由来する細胞が好ましい）だけでなく、他の脊椎動物（アフリカツメガエルなどの両生類）に由来する細胞も好ましい。この方法は、上記動物（好ましくはヒト）の体内の細胞にも関係する。真核細胞としては、それ自体がAGR2を発現する細胞、中でもブルンナー腺または気管の粘膜下腺の杯細胞や粘液分泌細胞が考えられる。
本発明の別の一実施態様は、活性が変化したAGR2タンパク質を発現させる方法に関する。この方法では、例えば位置137のバリンがバリンでないアミノ酸で置換された置換突然変異を有するAGR2タンパク質をコードしているcDNAを含むエピソーム・エレメントを持つ宿主細胞を用意する。次にこの宿主細胞を培養し、突然変異AGR2タンパク質を発現させる。
本発明の別の一実施態様は、AGR2タンパク質（すなわち野生型AGR2タンパク質またはAGR2ムテイン）の発現を抑制するのに十分な長さのアンチセンス核酸分子に関する。細胞の全AGR2タンパク質の生物学的活性を抑制するのに十分なアンチセンス核酸分子も考える。アンチセンス核酸分子は、哺乳動物のAGR2核酸配列（例えばヒトAGR2配列、マウスAGR2配列、ラットAGR2配列）と相補的である。抑制する生物学的活性としては、杯細胞の機能（例えば粘液の産生）、または例えばブルンナー腺の腺上皮の粘液分泌細胞の増殖が考えられる。活性は、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％抑制することができる。アンチセンス核酸は、長さを少なくとも15個のヌクレオチドにすることができる。
本発明の別の一実施態様は、リボザイムに関する。リボザイムは、ハイブリダイゼーション領域と触媒領域を含んでいる。ハイブリダイゼーション領域は、ゲノムAGR2配列から転写された標的mRNA配列の少なくとも一部とハイブリダイズすることができ、触媒領域は、標的mRNA配列を開裂させてAGR2の機能（すなわち野生型AGR2タンパク質またはAGR2ムテインの機能）の低下または抑制を実現することができる。
本発明の別の一実施態様は、siRNA分子に関する。siRNA分子は、遺伝子サイレンシングによってAGR2遺伝子の発現（すなわち野生型AGR2またはAGR2ムテインの遺伝子発現）を効果的に抑制するように設計する。
本発明のさらに別の一実施態様は、アプタマーに関する。アプタマーは、AGR2（すなわち野生型AGR2またはAGR2ムテイン）と効果的に結合するように設計する。アプタマーが十分に特異的であって細胞内の他のどのタンパク質とも結合しない、あるいは実質的に結合しないことが好ましい。
本発明の別の一実施態様は、AGR2を媒介とした機能（すなわち野生型AGR2またはAGR2ムテインの機能）の抑制または低下を実現する核酸分子を含む医薬組成物に関する。核酸は長さが少なくとも約10ヌクレオチドであり、AGR2のmRNA分子とハイブリダイズするか、あるいはAGR2のmRNA分子とヘテロ二本鎖を形成する。核酸分子としては、アンチセンス分子またはsiRNA分子が考えられる。医薬組成物は、上記の核酸分子に加え、1種類以上の薬理学的に許容可能な基剤を含んでいる。
本発明の別の一実施態様は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に関するものであり、その哺乳動物のすべての生殖細胞と体細胞には、その哺乳動物またはその1匹の子孫が胚段階のときに導入された突然変異AGR2遺伝子が含まれている。導入遺伝子（突然変異AGR2遺伝子）は、例えばAGR2タンパク質のアミノ酸137に対応する位置にアミノ酸置換突然変異をコードしている。
上記トランスジェニック哺乳動物の突然変異AGR2タンパク質としては、野生型AGR2タンパク質配列に由来するものが考えられる。野生型AGR2タンパク質は、配列番号3または配列番号4に記載されている。突然変異したAGR2タンパク質は、配列番号3または配列番号4の配列を含むが、例えばアミノ酸137に置換突然変異を有する。置換突然変異としては、位置137のバリンがバリンでないアミノ酸で置き換えられた置換が考えられる。トランスジェニック哺乳動物はさらに、ノックアウトされた野生型AGR2遺伝子を含むことができる。さらに、ノックアウトされた野生型AGR2遺伝子がホモであってトランスジェニック動物に野生型AGR2が含まれないようにすることができる。この場合には、トランスジェニック動物の唯一のAGR2遺伝子は突然変異したAGR2遺伝子である。当然のことながら、唯一のAGR2遺伝子が突然変異した遺伝子であるため、トランスジェニック動物のAGR2タンパク質は突然変異したAGR2タンパク質だけである。ノックアウトされた内在性AGR2と機能する突然変異AGR2を有する動物を構成するのに複数の方法が存在している。1つの方法は、両方の内在性AGR2遺伝子を相同的組み換えによってノックアウトするというものである。
より簡単な方法は、一方の内在性AGR2遺伝子をノックアウトし、このノックアウトしたAGR2遺伝子座をホモ接合性にすることであろう。突然変異AGR2遺伝子の導入は、ノックアウト構造体の一部に対して行なうことができる。すなわち内在性AGR2遺伝子が標的となるように設計した遺伝子構造体は、それ自体が突然変異AGR2遺伝子を含むことができる。したがって遺伝子のノックアウトと突然変異AGR2遺伝子の導入は合わせて実施することができる。あるいはノックアウト動物系（ホモまたはヘテロ）を利用し、突然変異AGR2 DNA構造体を用いたトランスジェニック動物を作ることもできる。最後に、ノックアウトAGR2動物系は、突然変異AGR2遺伝子を持つトランスジェニック動物と交配させることができる。AGR2のノックアウトと突然変異AGR2を持つことに関してホモの動物は、標準的な遺伝子技術を利用して作ることができる。
突然変異AGR2遺伝子構造体を用いてトランスジェニック動物を作る場合には、この遺伝子構造体はさらに、AGR2をコードしている内在性配列の転写を制御するプロモータ配列とは異なるプロモータ配列を含むことができる。したがってこの突然変異AGR2は、どのプロモータ配列を選択するかに応じ、望む任意の組織で発現させることができる。さらに、プロモータ配列は、誘導性プロモータからのものが可能である。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物はどの哺乳動物でもよいとはいえ、好ましい動物は囓歯類のラットまたはマウスである。
別の一実施態様は、本発明の核酸を用いた生体内の送達と発現に関する。この方法は遺伝子治療とも呼ばれている。遺伝子治療は、役に立つのに完全な効果をもたらす必要はないことに注意されたい。哺乳動物の疾患の症状を緩和できる遺伝子治療の1つの方法をこの明細書で開示する。遺伝子治療は従来技術において公知である。この用語は、組み換えバイオテクノロジー技術を利用して多彩な材料を細胞に送達するための多彩な方法を記述するのに用いられてきた。そのような方法として、例えば、遺伝子、アンチセンスRNA、siRNA分子、アプタマー、細胞毒性剤などをベクターによって生体内または生体外の哺乳動物の細胞、好ましくはヒト細胞に送達する方法が挙げられる。ほとんどの研究は、ウイルスのベクターを用いてこれら細胞を形質転換することを目的としていた。それは、いくつかのウイルスが、細胞に感染してその遺伝材料を高い効率で宿主細胞と一体化させる能力を有するからであった。この方法で役に立つウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス（ワクシニア・ウイルスを含む）、ヘルペスウイルスなどが挙げられる。さらに、さまざまな非ウイルス・ベクター（例えばリガンド-DNA共役体）も用いられてきた。導入遺伝子の一時的発現は、複製効率が低い一体化されないウイルス・ベクターを用いることによっても実現されてきた。
本発明の別の実施態様は、この明細書に記載した核酸とタンパク質を用いて哺乳動物の細胞内でAGR2（すなわち野生型AGR2タンパク質またはAGR2ムテイン）の発現または活性を変化させる方法；あるいは転写がAGR2タンパク質によって直接または間接に調節される標的遺伝子の発現を変化させる方法に関する。
この方法を動物（例えばヒトなどの哺乳動物）に適用する場合に大きな医学的価値がある。したがって本発明の別の一実施態様は、この明細書に記載したタンパク質と核酸を医薬品として用いる方法に関する。この医薬組成物は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症、ドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患、悪性疾患（例えば結腸直腸がん）などの疾患の予防、改善、治療に用いることができる。医学的症状または疾患は、場合によってはブルンナー腺の腺上皮の増殖増大にさらに関係していてもよい。
本発明によるタンパク質（すなわち野生型AGR2またはAGR2ムテイン、抗体、他のタンパク質など、この明細書に記載したすべてのタンパク質）、化学分子（例えば小分子アゴニストや小分子アンタゴニストなどの小分子も含む）、核酸は、後出のよく知られた送達方法で患者に投与することができる。この薬を用いて杯細胞の機能を変化させることができる。本発明の組成物と薬を用いてAGR2（すなわち野生型AGR2タンパク質またはムテイン）の生物学的活性を変化させることができる。
本発明のさらに別の実施態様は、この明細書に記載したベクター、エピソーム・エレメント、宿主細胞を利用して杯細胞の活性または不足に関連する疾患（例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症、ドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患、悪性疾患（例えば結腸直腸がん））を予防、改善、治療する方法と、本発明の非ヒト・モデル動物を用いて、AGR2が活性になったりAGR2の影響を受けたりする生理学的プロセスの分子メカニズムを解明する方法に関する。
さらに別の実施態様には、本発明の非ヒト・モデル動物を用いることにより、疾患の遺伝子やタンパク質の診断マーカーを同定する方法、あるいはAGR2の活性または不足に関係するこの明細書に記載した疾患の予防、改善、治療に役立つ化合物を同定する方法も含まれる。
本発明における上記の実施態様とさらに別の実施態様を以下にさらに詳しく説明する。
発明の詳細な説明
本発明のさまざまな特徴と利点は、以下の詳細な説明から明らかになろう。
この明細書で扱う杯細胞は、顆粒を通じて粘液を分泌することに特化した細胞であり、特に、胃腸（GI）管の細胞（例えば、食道、胃表面、幽門腺、腸上皮の杯細胞）または気道（例えば、鼻上皮、気管、気管支、気管の粘膜下腺の杯細胞）の細胞が挙げられる。
この明細書で杯細胞に関して用いる“分化”という用語は、初期分化から後期分化、最終分化まで、すなわち成熟粘液分泌杯細胞になるまでのすべての細胞分化ステップを意味する。したがって杯細胞の最終分化は、成熟杯細胞への最終分化ステップを意味する。
この明細書では、“粘液分泌細胞”という用語は、顆粒にあらかじめ粘液を貯蔵することなく粘液を分泌することに特化した細胞を意味する。具体例としてはブルンナー腺の粘液分泌細胞がある。
モデル動物とその利用
本発明により、例えば、野生型AGR2タンパク質のアミノ酸配列と比べてアミノ酸位置137が変化したAGR2タンパク質を発現する非ヒト脊椎動物が提供される。この動物は哺乳動物が可能であるが、囓歯類であることが好ましい。特に、ハツカネズミ属（例えばマウス）、クマネズミ属（例えばラット）、アナウサギ属（例えばウサギ）、ゴールデンハムスター属（例えばハムスター）からの動物であることが好ましい。しかしイヌ、ネコ、ヒツジ、ウマも同様に本発明に適している。同じことが、両生類、特にアフリカツメガエルなどの脊椎動物にも当てはまる。
この明細書でAGR2タンパク質とそれに関する核酸に関して用いる“変化した”という用語は、野生型AGR2（例えば配列番号3または配列番号4に従う野生型AGR2タンパク質）と比べて変化していることを意味する。
この明細書では、“表現型”という用語は、細胞または生物が持っていて、遺伝子型と環境の間の相互作用によって生じる形態的、生理学的、挙動的、生化学的な特徴の集合を意味する。したがって本発明の非ヒト脊椎動物は、野生型動物と比べたときに容易に観察できる異常を示す。好ましい一実施態様では、本発明の動物は、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくは少なくとも4つの異常な表現型の特徴を示す。その異常は、上記カテゴリーのすべてに由来することが好ましい。
より一般に、本発明の非ヒト脊椎動物は、そのいくつかの細胞または全細胞のゲノム中に、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％一致するタンパク質をコードしている遺伝子の対立遺伝子を持っている。
以下の定義は、この明細書全体を通じて核酸配列またはアミノ酸配列の一致に言及する場合にすべて当てはまる。“配列一致”という用語は、2つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域全体で残基ごとに比較したときに一致している程度を意味する。“パーセント・アミノ酸一致”または“％アミノ酸一致”という用語は、2つ以上のアミノ酸配列または核酸配列を比較したときに見られる配列一致の割合を意味する。パーセント一致は、例えばコンピュータでメガライン・プログラム（DNAスター社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いることによって容易に明らかにすることができる。メガライン・プログラムは、2つ以上の配列のアラインメントを異なる方法で作り出すことができる。そのうちの1つはクラスタル法である。例えばHigginsとSharpを参照のこと（HigginsとSharp、1988年）。クラスタル・アルゴリズムは、すべてのペアの間の距離を調べることによって配列をクラスターに分ける。クラスターは対にしてアラインメントされた後、グループにされる。2つのアミノ酸配列（例えば配列Aと配列B）の間のパーセント類似は、配列Aと配列Bの間で一致する残基数の和を、配列Aの長さから配列A中のギャップ残基の数を差し引き、配列B中のギャップ残基の数を差し引いた数で割り、100倍することによって計算される。2つのアミノ酸配列の間の相同性が少なかったりなかったりするときのギャップは、パーセント類似を決めるときに含まれない。
本発明の目的で2つのタンパク質配列の間のアミノ酸一致を調べるための特に好ましい1つの方法は、Tatusovaが報告している“ブラスト2配列”（bl2seq）アルゴリズムを用いる方法である（Tatiana A. Tatusova、Thomas L. Madden、「ブラスト2配列 - タンパク質とヌクレオチドの配列を比較する新しいツール」、FEMS Microbiol. Lett.、第174巻、247〜250ページ、1999年）。この方法により、“ブラスト”エンジンを用いて所定の2つの配列のアラインメントが作られる。“2つの配列のブラスト”へは、NCBIのサーバーからhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.htlmを通じてオンラインでアクセスすることができる。2つの配列のブラスト（bl2seq）を独立に実行できるプログラムは、NCBIのftpサイト（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables）から入手することができる。2つのタンパク質間のアミノ酸の数とパーセント一致またはパーセント類似を明らかにするのに用いるブラスト・プログラムの設定は以下の通りである。
プログラム：blastp
マトリックス：BLOSUM62
ギャップが空いたときのペナルティ：11
延長ギャップのペナルティ：1
ギャップx_ dropoff：50
予測：10.0
ワード・サイズ：3
低複雑性フィルタ：オン
この明細書の目的で％アミノ酸配列一致に言及するとき、好ましい一実施態様では、上記の設定を利用してブラスト・プログラムに従って決定した％一致を意味する。
上記のタンパク質としては、例えば配列番号3に従うマウスAgr2または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質に対応するオルソログが考えられる。配列番号3に従うマウスAgr2または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質の変異体または上記オルソログ（対立遺伝子その他）の変異体で、所定のアミノ酸または一部のアミノ酸配列に置換、付加、欠失があるものも考えられる。
好ましい一実施態様では、上記対立遺伝子を含む動物細胞のゲノムは、野生型AGR2遺伝子を表わす機能している対立遺伝子（例えばその動物に関する対応する野生型オルソログ、または細胞のゲノムDNAに関してヘテロな野生型AGR2遺伝子）をさらに2つ以上含むことはない。上記細胞のゲノムは、野生型AGR2遺伝子を表わす機能している余分な対立遺伝子（すなわち対応する野生型オルソログの機能している対立遺伝子、またはヘテロな野生型AGR2遺伝子の機能している対立遺伝子）をまったく含んでいないことが特に好ましい。
非ヒト脊椎動物の細胞のゲノムに含まれる上記の突然変異した対立遺伝子は突然変異を含んでおり、その突然変異は、その動物のすべての細胞または実質的にすべての細胞のゲノムにホモの形で存在しているのであれば、対応する野生型動物と比べて杯細胞の機能が変化したことに伴う表現型をもたらす。この突然変異は対立遺伝子のコード領域に存在していても非コード領域に存在していてもよいことが理解できよう。
上記の表現型は、杯細胞の分化、特に最終分化における変化、あるいは杯細胞の粘液産生または粘液分泌の変化を特徴とする可能性がある。この表現型は、粘液の組成変化（例えば典型的な粘液の成分（例えばムチン2（muc2）またはトレフォイル・ペプチド）のレベルでの変化）を特徴とする可能性もある。このような表現型は、これらの現象のあらゆる組み合わせを特徴とする可能性もある。
この点に関する非ヒト脊椎動物の典型的な表現型は、杯細胞に含まれる前ムチン貯蔵顆粒の減少、粘液分泌の変化、腸粘膜上皮または粘膜下組織における二次炎症浸潤を特徴とする表現型である。この明細書に記載した非ヒト脊椎動物の表現型は、場合によっては、ブルンナー腺の腺上皮の増殖増大とも関係している可能性がある。
本発明による非ヒト脊椎動物の表現型は、杯細胞に含まれる後期分化マーカーであるMuc-2とTFF3の転写レベルの低下を特徴とする可能性もある。
さらに、本発明による非ヒト脊椎動物の典型的な表現型は、上記の変化によって下痢または繁殖能力の欠陥をもたらす表現型である。
本発明による別の非ヒト脊椎動物では、突然変異した対立遺伝子は、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質の突然変異に対応する突然変異を含んでいる。その結果、突然変異したタンパク質のインビトロ・アッセイにおける生物学的活性は、対応する野生型マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比較したときに変化している。
この点に関してとこの明細書全体を通じて用いる“に対応する”という表現は、突然変異した対立遺伝子が、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質と配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質におけるアミノ酸レベルでの突然変異を反映していることを意味する。突然変異に隣接する対立遺伝子の配列が、上記のマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質のアミノ酸配列中の対応する位置にあるアミノ酸と一致するアミノ酸をコードしていない場合には、当業者は、好ましくはアミノ酸配列の一致を明らかにする上記の方法を利用して、マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の対応するアミノ酸に隣接する配列によってコードされているアミノ酸配列のアラインメントを容易に作り、上記のタイプのマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質における突然変異が、上記対立遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に反映されているかどうかを明らかにすることができよう。アミノ酸が置換または挿入されている場合には、突然変異は、対立遺伝子によってコードされているタンパク質の対応する位置に同じアミノ酸またはアミノ酸配列が見いだされるような形で、その対立遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に反映されていることが好ましい。アミノ酸が欠失している場合には、突然変異は、対立遺伝子によってコードされているタンパク質の対応する位置で同じか対応するアミノ酸またはアミノ酸配列が欠失しているような形で、その対立遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に反映されていることが好ましい。
インビトロ・アッセイに関してとこの明細書全体を通じて用いる“インビトロ・アッセイにおける変化した生物学的活性”という表現は、生物学的活性が増大または低下していることを意味する。生物学的活性の増大は、配列番号3に従うマウス野生型Agr2タンパク質または配列番号4に従うヒト野生型AGR2タンパク質と比べて少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、70％、80％、90％、100％またはそれ以上であることが好ましい。同様に、生物学的活性の低下は、配列番号3に従うマウス野生型Agr2タンパク質または配列番号4に従うヒト野生型AGR2タンパク質と比べて少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％の低下、あるいは生物学的活性の完全な消失であることが好ましい。生物学的活性の増大または低下は、対応する突然変異を有するマウスAgr2ムテインまたはヒトAGR2ムテインを、マウス野生型Agr2タンパク質またはヒト野生型AGR2タンパク質と同じアッセイにおいて、好ましくは同じアッセイ条件下で1つずつ並べて比べ、その結果として相対値が明らかになるため、当業者は、本発明で考えているインビトロ・アッセイにおける生物学的活性の変化に関する上記のパーセントを容易に決定できることが理解されよう。
大腸細胞の増殖をモニターするというのは、マウス野生型Agr2タンパク質またはヒト野生型AGR2タンパク質と比べて本発明のAGR2ムテインの生物学的活性が変化したことを調べるのに適した1つのアッセイである。この点に関する好ましいアッセイを実施例20に記載してある。このような好ましいアッセイでは、培地に添加した標識が培養している大腸細胞の細胞DNAに組み込まれるのをモニターする。培養する細胞は、哺乳動物の大腸がん細胞系であることが好ましい。特に好ましいのは、哺乳動物の大腸がん細胞系LS 174TまたはHT29である。細胞に、野生型AGR2発現ベクター（例えば配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質を発現するベクター）または興味の対象であるAGR2ムテイン（すなわちこの明細書と請求項に記載した新規なAGR2タンパク質またはタンパク質断片の任意のもの）を発現させる発現ベクターをトランスフェクトする。あるいは野生型AGR2タンパク質（例えば配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質）と興味の対象であるAGR2ムテイン（この場合にも、この明細書と請求項に記載した新規なAGR2タンパク質またはタンパク質断片の任意のもの）を培養物中の上記細胞に別々に添加することもできる。好ましい一実施態様では、細胞の増殖をモニターするのに用いる標識は、ヌクレオシド・アナログ（例えばブロモデオキシウリジン（BrdU））である。BrdUは、抗BrdUマウス・モノクローナル抗体を用い、免疫蛍光法、免疫組織学的方法、ELISA法、比色法のいずれかによって検出することができる。あるいは細胞DNAに[3H]チミジンを組み込んだ後に液体シンチレーション・クロマトグラフィを利用することもできる。
マウス野生型Agr2タンパク質またはヒト野生型AGR2タンパク質と比べて本発明のAGR2ムテインで生物学的活性が変化したことを調べるのに適した別のインビトロ・アッセイは、培養物中の杯細胞の粘液分泌を測定するというものである。この点に関する好ましいアッセイを実施例21に記載してある。このような好ましいアッセイでは、哺乳動物の杯細胞、好ましくは哺乳動物の大腸がん細胞系LS 174TまたはHT29に、野生型AGR2発現ベクター（例えば配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質を発現するベクター）または興味の対象であるAGR2ムテイン（すなわちこの明細書と請求項に記載した新規なAGR2タンパク質またはタンパク質断片の任意のもの）を発現させる発現ベクターをトランスフェクトする。あるいは野生型AGR2タンパク質（例えば配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質）と興味の対象であるAGR2ムテイン（この場合にも、この明細書と請求項に記載した新規なAGR2タンパク質またはタンパク質断片の任意のもの）を培養物中の上記細胞に別々に添加することもできる。その後、細胞を分析し、腸杯細胞が分泌した主要なムチンのサブタイプの発現（好ましくはムチン2（muc2）の発現）が変化したかどうかを明らかにする。これは、例えばmuc2に対して特異的なプライマーと、トランスフェクトされた対照細胞およびトランスフェクトされていないか模擬トランスフェクトされた対照細胞からのmRNAとを用いてRT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を実施した後、定量PCR分析を行なうことによって実現できる。この方法の代わりに、あるいはこの方法に加えて、この場合にも例えばトレフォイルに対して特異的なプライマーと、トランスフェクトされた対照細胞およびトランスフェクトされていないか模擬トランスフェクトされた対照細胞からのmRNAとを用いてRT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を実施した後、定量PCR分析を行なうことによって細胞を分析し、トレフォイル・タンパク質の発現がどう変化したかを調べる。
マウス野生型Agr2タンパク質またはヒト野生型AGR2タンパク質と比べて本発明のAGR2ムテインで生物学的活性が変化したことを調べるのに適したさらに別のインビトロ・アッセイは、アフリカツメガエルのセメント腺の分化を、例えばAbergerらが記載しているようにして（Aberger他、1998年）測定するというものである。この点に関する好ましいアッセイを実施例19に記載してある。このような好ましいアッセイでは、野生型AGR2タンパク質またはAGR2ムテインの発現または過剰発現がアフリカツメガエルの胚においてセメント腺の異所性分化と前神経マーカー遺伝子の発現を誘導する効果を分析する。特に、野生型AGR2タンパク質（例えば配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質）をコードしているmRNA、または興味の対象であるAGR2ムテイン（すなわちこの明細書と請求項に記載した新規なAGR2タンパク質またはタンパク質断片の任意のもの）をコードしているmRNAを発現させることのできるベクターに試験管内で転写を行なわせた後、得られたRNAの品質を必要に応じて試験管内翻訳系（例えば網状赤血球ライセート）を通じて分析し、このようにして得られたキャップの付いたmRNAをアフリカツメガエルの初期卵割段階にある胚に注入する。次に、ムチン分泌セメント腺の分化をモニターすることによって生物学的活性を分析する。セメント腺の拡大または追加される異所性セメント腺の存在を例えばAbergerらが記載しているようにしてモニターすることによって生物学的活性を分析する。
本発明による非ヒト脊椎動物は、突然変異した対立遺伝子が、配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質の突然変異に対応する突然変異を含んでいるものでもよい。この突然変異は、杯細胞の機能変化に伴う医学的症状がヒト対象者で進行するリスクが増大していること、あるいはAGR2の発現または機能が変化したことで杯細胞の機能が変化したことに伴いヒト対象者に医学的症状が生じることを示している。“に対応する”という表現は、ここでも、上に詳しく説明したようにして対立遺伝子に突然変異が反映されていることを意味する。この点に関して考えられるタイプの突然変異と、それを突き止める適切な方法を以下に詳しく説明する。
杯細胞が正常に機能するのにAGR2が必要であること、またこの遺伝子とその遺伝子産物に突然変異があると杯細胞が機能せず、それに対応してこの突然変異のある動物において生理学的、医学的な異常が生じる可能性があることを、本発明において初めて証明した。そのことを考慮すると、今度はAGR2遺伝子の発現またはAGR2タンパク質の機能に影響を与える他の遺伝子とその産物が、同様にして、杯細胞に関係した表現型と生理学的、医学的症状に影響を与えることは、当業者にとって明らかであろう。したがって本発明により、さらに別の側面として、非ヒト脊椎動物であって、その動物のいくつかの細胞または全細胞のゲノム中に、その動物のAGR2タンパク質の発現または機能に影響を与えるタンパク質をコードしている遺伝子の対立遺伝子を含んでおり、この対立遺伝子には突然変異が含まれていて、その突然変異が、その動物のすべての細胞または実質的にすべての細胞のゲノムにホモの形で存在しているのであれば、対応する野生型動物と比べて杯細胞の機能が変化したことに伴う表現型をもたらすことを特徴とする非ヒト脊椎動物が提供される。
本発明の動物に関して上に説明した遺伝子は、その動物の内在性遺伝子であることが好ましい。好ましい実施態様では、その遺伝子は、その動物に関して配列番号3と配列番号4によって規定されているAGR2タンパク質のオルソログであるタンパク質をコードすることになる。しかしこの遺伝子は、その動物に関してヘテロな遺伝子でもよい。例えば本発明のマウスとしては、内在性マウスAgr2遺伝子が、突然変異したヒトAGR2遺伝子（例えば配列番号30に従うタンパク質をコードしているAGR2遺伝子）で置換されているマウスが考えられる。同様に、本発明のラットとしては、内在性ラットAGR2遺伝子が、突然変異したマウスAgr2遺伝子（例えば配列番号2に従うタンパク質をコードしているAgr2遺伝子）で置換されているラットが考えられる。
これまでの説明から明らかなように、本発明の非ヒト脊椎動物は、トランスジェニック動物でもよい。すなわち、上記遺伝子の突然変異した対立遺伝子は、その動物のゲノムDNAに関してヘテロであるDNAを表わしていてもよいし、その動物のゲノムDNAに関してヘテロであるDNAが挿入されたために突然変異したものであってもよい。ヘテロなDNAの挿入は、例えばマウスの胚幹細胞のAgr-2ゲノムDNA遺伝子座の位置にベクターを用いて相同性組み換えを起こさせ、内在性Agr-2対立遺伝子をヘテロDNAによって置換する方法によって実現することができる。この方法は、当業者には明らかであろう。トランスジェニック動物は、その後交配させることによって作り出すことができる。
AGR2遺伝子の内在性プロモータ、またはそのAGR2遺伝子の発現や機能に影響を与える遺伝子は、ヘテロ・プロモータ（例えば遺伝子に異なった組織特異的発現をさせるプロモータ、または化学的手段または物理的手段で誘導できるプロモータ）で置き換えることができる。
本発明による非ヒト脊椎動物は、AGR2遺伝子、またはAGR2タンパク質の発現や機能に影響を与える遺伝子が“ノックアウトされた”動物でもよい。このような動物では、上記の突然変異によってその遺伝子の発現が低下したり完全に消失したりする。
突然変異した対立遺伝子は、非ヒト脊椎動物の生殖細胞と体細胞のいずれかまたは両方に存在している可能性がある。好ましい一実施態様では、その細胞のゲノムはその対立遺伝子に関してホモである。
本発明によりさらに、本発明の突然変異したAGR2核酸を有する近交連続系動物が提供される。この動物は、実質的に均一な遺伝的背景を提供するという利点を持つ。遺伝的に均一な動物系は、杯細胞の機能と粘膜上皮の変化に関係する異常や症状を機能的に再現できるモデル系を提供する。
特に好ましい一実施態様では、本発明による非ヒト脊椎動物は、少なくともいくつかの細胞、好ましくは杯細胞において、配列番号2または配列番号30で表わされるポリペプチドを発現する。
本発明の動物は、当業者に知られている任意の方法で作ることができる。例えば、微量注入、電気穿孔、細胞銃、細胞融合、奇形がん腫幹細胞またはそれと機能的に同等な胚幹細胞の胚への微量注入などの方法がある。本発明の動物は、正常なAGR2遺伝子またはAGR2タンパク質の機能の変化または破壊を起こさせるように外来性遺伝材料を一体化したゲノムを有する動物にする手続きを適用することによって作ることができる。本発明の動物を作るための好ましい手続きは、実施例1に記載した手続きである。
あるいはその手続きに、実施例5に示したように、野生型AGR2タンパク質をコードしている遺伝材料またはその一部を取得する操作が含まれていてもよい。次に、単離した元々の配列を遺伝子操作して本発明の明細書と請求項に記載した突然変異（例えば配列番号3または配列番号4に示したアミノ酸配列の位置137にある残基と置換するのに適した突然変異）のいずれかを挿入する。次に、遺伝子操作で得られたこの構造体を例えば電気穿孔によって胚幹細胞に挿入する。この手続きを行なった細胞をスクリーニングして正の細胞、すなわちゲノムの中に変化したAGR2をコードしている望む構造体と一体化した細胞を見つけ出す。正の細胞は、単離し、クローニング（または拡張）し、同じ種または異なる種の宿主動物から得られた胚盤胞に注入するとよい。例えば正の細胞をマウスからの胚盤胞に注入した後、その胚盤胞をメス宿主動物に移して最後まで増殖させる。その後メスの子どもをテストしてどの動物がトランスジェニックであるか、すなわちどの動物が突然変異した外来性DNA配列を挿入されたかを明らかにする。適切な1つの方法は、受精した卵母細胞段階で組み換え遺伝子を導入し、遺伝子配列が“創始者”動物のすべての生殖細胞と体細胞に存在しているようにするというものである。この明細書では、“創始者動物”という用語は、胚が1細胞段階のときに組み換え遺伝子が導入された動物を意味する。
本発明の動物は、細胞培養実験（例えば従来技術で知られている任意の方法（例えばレトロウイルス形質転換）による不死化した細胞系の作製）を行なうためにさまざまな組織から一次細胞を供給するための供給源として利用することもできる。この明細書と請求項に記載した任意の非ヒト脊椎動物に由来するこのような一次細胞または不死化細胞系も、やはり本発明の範囲に含まれる。そのような動物からの不死化細胞は、好ましいことに、正常な培養細胞と形質転換された培養細胞両方の望ましい性質を示す可能性がある。すなわちその不死化細胞は、形態的、生理学的に正常またはほぼ正常であるが、長期間、おそらく無期限に培養することができるであろう。一次細胞、または一次細胞由来の細胞系は、本発明のモデル動物を作るのに利用することもできる。
別の実施態様では、本発明の細胞系は、上記の表現型を本発明のモデル動物に与えるコドンが含まれた本発明の核酸配列またはその断片を含む核酸構造体を挿入することによって調製できる。挿入に適した細胞としては、動物から回収した一次細胞や、不死化細胞系のメンバーである細胞から回収した一次細胞が挙げられる。以下に説明する本発明の組み換え核酸構造体は、従来技術で知られている任意の方法で細胞に導入することができる。その方法としては、トランスフェクション、レトロウイルス感染、微量注入、電気穿孔、形質導入、DEAE-デキストランなどが挙げられる。組み換え構造体を発現する細胞は、例えば、選択的発現をさせるのに用いるレポーター遺伝子を含む二次組み換え核酸構造体を用いて同定することができる。本発明の核酸配列またはその断片を発現する細胞は、レポーター遺伝子の発現を検出することによって間接的に同定することができる。
本発明による非ヒト脊椎動物は、杯細胞の機能または機能不全や、杯細胞に関連した表現型や医学的症状に関してさまざまな点で有用である。
したがって本発明の1つの側面は、非ヒト脊椎動物を用い、杯細胞に関連した疾患のタンパク質診断マーカーまたは核酸診断マーカーを同定する方法である。本発明の範囲には、杯細胞に関連した疾患の分子メカニズムまたは生理学的プロセスのモデルとしてその動物を用いることも含まれる。
さらに、本発明による非ヒト脊椎動物を利用し、杯細胞関連疾患の予防、改善、治療に役立つ薬を同定してテストすることができる。そのような杯細胞関連疾患としては、特に、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症、ドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患（特にクローン病または潰瘍性大腸炎）、腸がんなどがある。
この明細書に記載した非ヒト脊椎動物の別の用途は本発明のさらに別の側面であり、内在性AGR2の低下した活性または望ましくない（例えば増大した）活性の分子メカニズム、その活性に関係する生理学的プロセス、その活性に関係する症状、その活性の影響を受ける症状を研究することに関する。同様に、内在性AGR2の低下した発現、低下した産生、望ましくない（例えば増大した）産生も分析することができる。
この明細書に記載した非ヒト脊椎動物は、上記の疾患を予防、改善、治療するのに役立つ薬のスクリーニング、同定、テストを行なうためのモデル・システムとして非常に有効であることもわかるであろう。そのような薬としては、例えば、小分子薬、ペプチドまたはポリペプチド、核酸などが挙げられる。本発明の目的のためには、小分子薬は、分子量が2,000ドルトン以下であることが好ましい。分子量は1500ドルトン以下であることがより好ましく、1000ドルトン以下であることがさらに好ましく、500ドルトン、400ドルトン、300ドルトン以下、さらには200ドルトン以下でさえあることが最も好ましい。このような薬は、野生型AGR2またはAGR2ムテインの生物学的活性を変えることができる。すなわちこのような薬は、両方のタイプのタンパク質にアゴニストまたはアンタゴニストとして作用を及ぼすことができる。
上の説明から、この明細書に記載した非ヒト脊椎動物が、タンパク質診断マーカーまたは核酸診断マーカー（例えば、杯細胞の機能変化に伴う医学的症状（例えば野生型AGR2またはAGR2ムテインの不足または過剰発現と関係する疾患）の初期相、および／または中間相、および／または後期相においてある役割を演じる遺伝子または遺伝子産物に関する診断マーカー）を同定するのに非常に役立つことも明らかであろう。このような診断マーカーがAGR2遺伝子またはそのタンパク質産物と関係している可能性があることが理解されよう。しかし本発明の非ヒト脊椎動物は、AGR2遺伝子またはAGR2タンパク質の発現または機能に影響を与える他の遺伝子または遺伝子産物に関するマーカーや、発現または機能がAGR2タンパク質の影響を受ける他の遺伝子または遺伝子産物に関するマーカーの同定にも使用できることが理解できよう。さらに、本発明の非ヒト脊椎動物は杯細胞の機能の変化に関係する医学的症状の病因を研究するための非常に有効なモデル・システムであるため、AGR2遺伝子またはAGR2タンパク質の発現または機能に直接影響を与えない遺伝子または遺伝子産物に関する疾患関連マーカーや、発現または機能がAGR2タンパク質の影響を直接受けない遺伝子または遺伝子産物に関する疾患関連マーカーの同定にも用いることができる。上記の用途は本発明のさらに別の特徴となっていることが理解できよう。
最後に、上に説明したことから、この明細書に記載した非ヒト脊椎動物が、AGR2タンパク質の受容体の同定と、AGR2タンパク質またはAGR2遺伝子の活性によって調節されていて、調節異常によってAGR2の不足または過剰発現に関係する疾患になる上流または下流の遺伝子またはタンパク質の同定に非常に有用であることが理解できよう。
核酸
本発明により、以下に詳細に説明するAGR2ムテイン（例えば本発明によるネズミ類とヒトの突然変異したAGR2）をコードしている核酸配列がさらに提供される。本発明の好ましい一実施態様により、ネズミ類AGR2の突然変異した核酸配列（配列番号1）が提供される。さらに、本発明によってヒトAGR2の突然変異した核酸配列（配列番号29）が提供される。突然変異したヒトAGR2遺伝子は、例えば、野生型ヒトAGR2遺伝子（配列番号5）のコドン137を変化させてコドン137がもはやバリンをコードしないようにすることによって作ることができる。137番目のコドンがバリンをコードしていない遺伝子の構造はよく知られている。
バリンはGTT、GTC、GTA、GTGによってコードされている。バリンをコードしていないコドンは、例えば、フェニルアラニン（TTT、TTC）；ロイシン（TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG）；イソロイシン（ATT、ATC、ATA）；メチオニン（ATG）；アスパラギン酸（GAC、GAT）；セリン（TCT、TCC、TCA、TCG）、プロリン（CCT、CCC、CCA、CCG）；トレオニン（ACT、ACC、ACA、ACG）、アラニン（GCT、GCC、GCA、GCG）；チロシン（TAT、TAC）；ヒスチジン（CAT、CAC）、；グルタミン（CAA、CAG）；アスパラギン（AAT、AAC）；リシン（AAA、AAG）；グルタミン酸（GAA、GAG）；システイン（TGT、TGC）；トリプトファン（TGG）；アルギニン（CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG）；セリン（AGT、AGC）；グリシン（GGT、GGC、GGA、GGG）をコードしているコドンであるか、停止コドン（TAA、TAG、TGA）の1つである可能性がある。部位特異的な核酸の突然変異を導入する方法は周知である。
本発明のAGR2変異体をコードしている核酸配列は、単独で、あるいは他の核酸との組み合わせ（例えばプラスミドなどのベクター分子（発現ベクターやクローニング・ベクターなど））として存在することができる。
この明細書では、“核酸配列”という用語は、ヌクレオチド塩基が連続したあらゆる配列（すなわちポリヌクレオチド）を意味する。核酸配列は、リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）であることが好ましい。核酸配列は、cDNAであることが好ましい。しかし核酸配列は、例えばペプチド核酸（PNA）であってもよい。
この明細書では、“単離された”核酸分子は、通常は核酸の天然供給源の中に存在している他の核酸分子から分離されている核酸分子を意味する。“単離された”核酸は、自然の状態でDNAの天然（野生型）供給源となっている生物のゲノムDNAの中で隣接している核酸（すなわち核酸の5'末端と3'末端に位置する配列）を含んでいないことが好ましい。
AGR2遺伝子分子は、標準的なハイブリダイゼーション法とクローニング法を利用して単離することができる。その方法は、例えばSambrook他編、『分子クローニング：実験室マニュアル』（第2版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、1989年；Ausbel他編、『分子生物学の最新プロトコル』、ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1993年に記載されている。
本発明の核酸は、鋳型としてのcDNA、mRNA、ゲノムDNAいずれかと、適切なオリゴヌクレオチド・プライマーとを利用して標準的なPCR増幅法に従って増幅することができる。このようにして増幅した核酸は、クローニングして適切なベクターの中に入れることや、DNA配列分析によってキャラクテリゼーションを行なうことができる。さらに、AGR2ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成法（例えば自動化DNA合成装置）によって調製することができる。
この明細書では、“オリゴヌクレオチド”という用語は、互いに結合した一連のヌクレオチド残基を意味する。このオリゴヌクレオチドは、PCR反応で使用するのに十分な数のヌクレオチド残基を備えている。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはcDNA配列に基づいたもの、あるいはゲノム配列またはcDNA配列から設計したものが可能であり、特定の細胞または組織の中に存在するDNAまたはRNAで一致するもの、類似するもの、相補的なものの増幅、確認、検出に用いられる。一般に、“オリゴヌクレオチド”という用語は、長さが約100ヌクレオチド（nt）以下である一連の連続したヌクレオチド（ポリヌクレオチド）を意味する。オリゴヌクレオチドは例えば核酸配列の一部で長さが約100nt、50nt、20ntのいずれかである。核酸配列は、長さが約15nt〜30ntであることが好ましい。
この明細書では、“相補的”という用語は、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソン-クリック型塩基対またはフーグスティーン型塩基対を意味し、“結合”という用語は、2つのポリペプチドまたは化合物、あるいは会合したポリペプチドまたは化合物、あるいはその組み合わせの間の物理的または化学的な相互作用を意味する。
“相同な核酸配列”または“相同なアミノ酸配列”またはその変異体は、それぞれヌクレオチド・レベルまたはアミノ酸レベルで相同であることを特徴とする配列を意味する。相同なヌクレオチド配列には、AGR2ポリペプチドのアイソフォームをコードしている配列も含まれる。アイソフォームは、例えばRNAの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織で発現させることができる。あるいはアイソフォームは、異なる遺伝子によってコードすることもできる。
この明細書では、“厳しいハイブリダイゼーション条件”という表現は、プローブ、プライマー、オリゴヌクレオチド、またはこの明細書に登場する他の任意の核酸配列が、標的配列とはハイブリダイズするが、他のどの配列ともハイブリダイズしない条件を意味する。厳しい条件は配列に依存するが、異なった状況では違ったものになる。長い配列は、短い配列よりも高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、厳しい条件は、所定のイオン強度とpHにおける特定の配列の融点（Tm）よりも約5℃低い温度になるように選択する。Tmは、（所定のイオン強度、pH、核酸濃度のもとで）平衡状態において、標的配列と相補的なプローブの50％が標的配列とハイブリダイズする温度である。標的配列はTmにおいて一般に過剰に存在しているため、平衡時にプローブの50％が占拠される。典型的な厳しい条件は、pHが7.0〜8.3になっていて塩の濃度が約1.0M未満のナトリウム・イオン（一般には約0.01〜1.0Mのナトリウム・イオン（または他の塩））であり、温度が、短いプローブ、プライマー、オリゴヌクレオチド（例えば10nt〜50nt）に関しては少なくとも約30℃、より長いプローブ、プライマー、オリゴヌクレオチドに関しては少なくとも約60℃という条件である。厳しい条件は、不安定化剤（例えばホルムアミド）を添加することによっても実現できる。厳しい条件は当業者に知られており、Ausbel他編、『分子生物学の最新プロトコル』、ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1989年の6.3.1〜6.3.6に見ることができる。
本発明の核酸（例えば以下に詳しく説明するアンチセンス核酸）に合致する好ましい厳しいハイブリダイゼーション条件は、6×SSC、50mMのトリス-HCl（pH7.5）、1mMのEDTA、0.02％のPVP、0.02％のフィコール、0.02％のBSA、500mg/mlの変性したサケ***DNAを含む大きな塩濃度の緩衝液の中で65℃にてハイブリダイズさせた後、0.2×SSC、0.01％のBSAで50℃にて1回以上洗浄するというものである。
例えば以下に詳しく説明するアンチセンス核酸に関してこの明細書で用いる“生理学的条件下のハイブリダイゼーション”という表現は、プローブ、プライマー、オリゴヌクレオチド、または他の任意の核酸配列が、多細胞生物内の真核細胞の内部という条件下で、あるいは細胞培養物または組織培養物となっている真核細胞の内部という条件下で、標的配列とハイブリダイズすることを意味する。このような条件は、温度が約37℃または正確に37℃であることと、ホルムアミドがな存在しないことと、生理学的緩衝液に対応するイオン強度であることを特徴とすることが好ましい。
アンチセンス核酸
本発明の好ましい核酸は、本発明のムテインをコードしているmRNAの一部と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸である。mRNAのこの部分は、ムテインとの関連でより詳しく説明する突然変異に対応するアミノ酸またはアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードしている。
好ましい別のアンチセンス核酸は、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質、あるいは上記のマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質とアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％一致しているオルソログをコードしているmRNAの一部と相補的なヌクレオチド配列を含んでいる。mRNAのこの部分は、非コード部であり、上記タンパク質またはオルソログをコードしていて、そのタンパク質またはオルソログの発現に影響を与える遺伝子内の突然変異に対応する配列を含んでいる。
好ましいさらに別のアンチセンス核酸は、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質の発現または機能、あるいは配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質とアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％一致しているオルソログの発現または機能に影響を与えるタンパク質をコードしているmRNAの一部と相補的なヌクレオチド配列を含んでいる。
好ましい一実施態様では、アンチセンス核酸は、生理学的条件（特に上記の好ましい生理学的条件）下で、相補的なヌクレオチド配列を通じてmRNAとハイブリダイズすることができる。この場合には、アンチセンス核酸は、杯細胞の機能変化に伴う医学的症状の予防、治療、改善に関する本発明の方法と用途で使用するのに特に適している。別の好ましい一実施態様では、本発明のアンチセンス核酸は、非常に厳しい条件（特に上記の好ましい非常に厳しい条件）下で上記のmRNAとハイブリダイズすることができる。
アンチセンス核酸としては、触媒領域を含むリボザイムが考えられる。この触媒領域は、アンチセンスRNAに、そのアンチセンスRNAがハイブリダイズするmRNAを特異的に開裂させることができると好ましい。
本発明のアンチセンス核酸は、配列番号3に従うマウス野生型Agr2タンパク質または配列番号4に従うヒト野生型AGR2タンパク質に対応するタンパク質をコードしているmRNAではなく、突然変異したアミノ酸配列を有する同じタンパク質の標的mRNAのほうにより効果的にハイブリダイズできると好ましかろう。配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質をコードしている野生型遺伝子、あるいは対応するオルソログをコードしている野生型遺伝子によってコードされているmRNAではなく、標的mRNAのほうにより効果的にハイブリダイズするアンチセンス核酸も好ましい。さらに、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質の発現または機能に影響を与える対応するタンパク質の野生型遺伝子によってコードされているmRNAではなく、標的mRNAのほうにより効果的にハイブリダイズするアンチセンス核酸も好ましい。
上記のアンチセンス核酸で形質転換した原核宿主細胞と真核宿主細胞は、どちらも本発明の範囲に含まれる。
アプタマー
アプタマーは、タンパク質に強く結合する核酸（例えばRNA、DNA）からなる巨大分子である。本発明により、この明細書に記載したタンパク質と特異的に結合するアプタマーが提供される。アプタマーが十分に特異的であって、細胞内の他のどのタンパク質とも結合しないこと、あるいは実質的に結合しないことが好ましい。好ましいアプタマーは、本発明のAGR2ムテイン、またはその一部でこの明細書に記載した突然変異（例えばアミノ酸137の置換）を含むものと結合する。別の好ましいアプタマーは、野生型AGR2タンパク質またはその一部と結合する。本発明のアプタマーは、ナノモルの範囲（例えばK(D)値が12nM〜130nMという低いナノモルの範囲）でリガンドと高い特異性かつ親和性で結合することが好ましい。
干渉RNA
本発明の1つの特徴によると、AGR2遺伝子の発現をRNA干渉によって弱めることができる。従来技術において周知の1つの方法は、短い干渉RNA（siRNA）による遺伝子サイレンシングである。その場合、AGR2遺伝子の発現産物が、AGR2遺伝子転写産物の長さが少なくとも19〜25ntあるセグメントと相補的であって、5'非翻訳（UT）領域と、オープン・リーディング・フレーム（ORF）と、3'非翻訳（UT）領域とを含むsiRNAヌクレオチド配列に由来する特異的二本鎖AGR2の標的にされる。例えばPCT出願WO 00/44895、WO 99/32619、WO 01/75164、WO 01/92513、WO 01/29058、WO 01/89304、WO 02/16620、WO 02/29858を参照のこと。なお各出願の内容は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。標的遺伝子としては、AGR2遺伝子、あるいはAGR2遺伝子の発現またはAGR2タンパク質の活性を変化させる上流または下流のモジュレータが考えられる。例えばAGR2のホスファターゼまたはキナーゼの発現をsiRNAの標的にすることができる。
本発明の方法によれば、短い干渉RNAを用いてAGR2遺伝子の発現を沈黙させる。本発明のAGR2ポリヌクレオチドにはsiRNAポリヌクレオチドが含まれる。AGR2のこのようなsiRNAは、AGR2ポリヌクレオチド配列を用い、例えば細胞を含まない系（例えばショウジョウバエ抽出液）の中でAGR2リボポリヌクレオチド配列をプロセシングすることによって、あるいは組み換え二本鎖AGR2 RNAを転写することによって、あるいはAGR2配列と相同なヌクレオチド配列を化学的に合成することによって得られる。例えばTuschl、Zamore、Lehmann、Bartel、Sharp、Genes & Dev.、第13巻、3191〜3197ページ、1999年（Tuschl他、1999年）を参照のこと。なおこの論文の内容はその全体が参考としてこの明細書に組み込まれているものとする。典型的な0.2マイクロモル・スケールのRNA合成により、約1mgのsiRNAが得られる。この量は、24ウエルの組織培養プレートを用いてトランスフェクションの実験を1000回行なうのに十分な量である。
最も効果的なサイレンシングは、一般に、21ntセンス鎖と21ntアンチセンス鎖が、2ntからなる3'張出部を持つようにしてペアにされている二本鎖siRNAで観察される。2ntからなる3'張出部の配列は、siRNAが標的を認識するときの特異性にわずかに寄与する。特異性への寄与は、第1のペア塩基に隣接するペアになっていないヌクレオチドに限定される。一実施態様では、3'張出部のヌクレオチドはリボヌクレオチドである。別の一実施態様では、3'張出部のヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。3'張出部に2'-デオキシヌクレオチドを用いるのはリボヌクレオチドを用いるのと同じくらい効果的であるが、デオキシリボヌクレオチドのほうが合成コストが低いことがしばしばあり、ヌクレアーゼに対する抵抗力もより大きそうである。
本発明の組み換え発現ベクターは、クローニングされたAGR2 DNA分子を含んでいる。この発現ベクターは、（DNA分子の転写によって）両方の鎖を発現できるよう、機能上リンクした調節配列をAGR2配列に隣接して含んでいる。AGR2のmRNAにとってアンチセンスであるRNA分子は第1のプロモータ（例えばクローニングしたDNAのプロモータ配列3'）によって転写され、AGR2のmRNAにとってセンス鎖であるRNA分子は第2のプロモータ（例えばクローニングしたDNAのプロモータ配列5'）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖は生体内でハイブリダイズし、AGR2遺伝子を沈黙させるためのsiRNA構造体を作る。あるいは2つの構造体を利用して1つのsiRNA構造体のセンス鎖とアンチセンス鎖を作ることもできる。最終的に、クローニングしたDNAは、二次構造を有する構造体をコードすることができる。この場合の唯一の転写産物は、標的遺伝子からのセンス配列と、それと相補的なアンチセンス配列の両方を有する。この実施態様の1つの具体例では、ヘアピンRNAi産物は標的遺伝子の全体または一部と相同である。別の具体例では、ヘアピンRNAi産物はsiRNAである。AGR2配列に隣接した調節配列は同じでも異なっていてもよいため、その発現は、独立に調節すること、あるいは時間的または空間的に調節することができる。
特別な一実施態様では、siRNAは、例えば小さな核RNA（snRNA）のU6またはヒトRNアーゼP RNAのH1からのRNAポリメラーゼIII転写ユニットを含むベクターの中にAGR2遺伝子鋳型をクローニングすることによって細胞内で転写される。ベクター系の一例は、ジーンサプレッサー（登録商標）RNA干渉キット（イムジェネックス社から市販されている）。U6プロモータとH1プロモータは、ポリメラーゼIIIプロモータのタイプIIIクラスのメンバーである。U6様プロモータの+1ヌクレオチドは常にグアノシンであるのに対し、H1プロモータの+1ヌクレオチドはアデノシンである。これらプロモータの終止シグナルは、5個の連続したチミジンによって規定される。転写産物は、一般に2番目のウリジンの後で開裂する。この位置が開裂することで、発現したsiRNAに3'UU張出部が生じる。これは、合成siRNAの3'張出部と似ている。長さが400ヌクレオチド未満のどの配列もこれらプロモータによって転写することができるため、これらプロモータは、例えば約50ヌクレオチドのRNAステム-ループ転写産物の中で約21ヌクレオチドのsiRNAを発現させるのに理想的である。
siRNAベクターは、発現を長期にわたってノックアウトすることが望ましい合成siRNAよりも優れているように見える。siRNA発現ベクターをトランスフェクトされた細胞は、安定で長期にわたるmRNAの抑制を実現するであろう。逆に、外来性合成siRNAをトランスフェクトされた細胞は、一般に、7日以内に、あるいは細胞が10回***するまでにmRNAの抑制から回復する。siRNA発現ベクターが長期にわたって遺伝子を沈黙させる能力は、遺伝子治療に応用できる可能性がある。
一般に、siRNAはより長いdsRNAから、ダイサーと呼ばれるATP依存性リボヌクレアーゼによって切断される。ダイサーは、二本鎖RNA特異的エンドヌクレアーゼのRNアーゼIIIファミリーのメンバーである。siRNAは細胞のタンパク質と合わさってエンドヌクレアーゼ複合体になる。ショウジョウバエに関する試験管内での研究によると、siRNA／タンパク質複合体（siRNP）は、次に、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）と呼ばれる第2の酵素複合体に移されることが示唆される。このRISCは、ダイサーとは異なるエンドリボヌクレアーゼを含んでいる。RISCは、アンチセンスsiRNA鎖によってコードされている配列を利用して相補的配列のmRNAを発見し、破壊する。したがってsiRNAはガイドとして機能し、リボヌクレアーゼがsiRNAの二本鎖の一方と相補的なmRNAだけを開裂させるよう制限する。
siRNAが標的とするAGR2のmRNA領域は、一般に、開始コドンの50〜100nt下流から始まる望むAGR2配列から選択する。あるいは5'UTRまたは3'UTRと、開始コドン近傍の領域とを用いることもできるが、それは一般に避けられる。というのもここには調節タンパク質と結合する部位がより多く含まれているからである。UTR結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、siRNPまたはRISCエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げる可能性がある。選択したsiRNA配列を探す最初のBLASTホモロジー検索は、1つの遺伝子だけが標的となるよう、利用可能な1つのヌクレオチド・ライブラリに関して行なう。二本鎖siRNAは標的を特異的に認識するため、二本鎖siRNAのペアになった領域に点突然変異が1つあれば標的とするmRNAの分解を妨げるのに十分であることがわかる。Elbashir他、EMBO J.、第20巻(23)、6877〜6888ページ、2001年（Elbashir他、2001年b）を参照のこと。したがって望む遺伝子を標的にする場合には、SNP、多型、対立遺伝子変異体、種特異的な違いに対処できるようにする必要がある。
完全なAGR2 siRNA実験には、適切な負の対照が含まれている必要がある。負の対照となるsiRNAは、AGR2 siRNAと同じ組成のヌクレオチドでなくてはならないが、ゲノムと相同な重要な配列が欠けている。一般に、AGR2 siRNAのヌクレオチド配列を集め、ホモロジー検索を行なって他のどの遺伝子との相同性もないことを確認することになろう。
2つの独立な二本鎖AGR2 siRNAを用いて標的AGR2遺伝子をノックアウトすることができる。これは、サイレンシング効果の特異性を制御するのに役立つ。さらに、同じ濃度の異なる二本鎖AGR2 siRNAを用いて2つの独立な遺伝子の発現を同時にノックアウトすることができる。siRNA関連タンパク質を利用できるかどうかが、標的mRNAにアクセスできるかどうかよりも重要な制限因子になると考えられている。
標的とするAGR2領域は、一般に、2つのアデニン（AA）と2つのチミジン（TT）が19残基（N19）のスペーサ領域で分割された配列である（例えばAA(N19)TT）。望ましいスペーサ領域は、G/C含有量が約30％〜70％であり、より好ましいのは約50％である。配列AA(N19)TTが標的配列の中に存在していない場合には、代わりになる標的領域はAA(N19)であろう。AGR2センスsiRNAの配列は、それぞれ(N19)TTまたはN21に対応する。後者の場合、AGR2ポリヌクレオチドに自然の状態でそのような配列が生じないのであれば、センスsiRNAの3'末端をTTに変換することができる。配列をこのように変換する理由は、センス3'張出部とアンチセンス3'張出部の配列組成に関して二本鎖を対称にするためである。対称な3'張出部になっていると、ほぼ同じ割合のセンス標的RNA開裂siRNPとアンチセンス標的RNA開裂siRNPでsiRNPを形成しやすくなる（Elbashir、Lendeckel、Tuschl、Genes & Dev.、第15巻、188〜200ページ、2001年を参照のこと。なおこの論文の内容は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする）（Elbashir他、2001年）。アンチセンスsiRNA鎖が標的の認識を助けるため、標的とするmRNAの認識に二本鎖siRNAのセンス配列の張出部の修飾が影響を与えるとは考えられない。
あるいはAGR2標的mRNAが適切なAA（N21）配列を含んでいない場合には、NA（N21）配列を探すとよい。さらに、センス鎖とアンチセンス鎖の配列は、5'(N19)TTとして合成することもできる。なぜなら、アンチセンスsiRNAの最も3'側のヌクレオチド配列は特異性には寄与しないと考えられているからである。アンチセンス法またはリボザイム法とは異なり、標的mRNAの二次構造はサイレンシングに強い影響力を持っているようには見えない。Harborth他、J. Cell Science、第114巻、4557〜4565ページ、2001年を参照のこと（なおこの論文の内容は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする）（Harborth、2001年）。
AGR2二本鎖siRNAのトランスフェクションは、標準的な核酸トランスフェクション法（例えばインヴィトロジェン社から市販されているオリゴフェクタミン試薬）で実現することができる。AGR2遺伝子を沈黙させるアッセイは、一般に、トランスフェクションの約2日後に実施する。トランスフェクション試薬がないときにはAGR2遺伝子の沈黙は観察されなかったため、野生型AGR2表現型と沈黙したAGR2表現型を比較して分析することができる。特別な一実施態様では、24ウエルのプレートのウエル1つにつき約0.84μgの二本鎖siRNPがあれば十分である。細胞は一般に前日に植え、約50％の集密度でトランスフェクトする。細胞培地と細胞培養条件の選択は、当業者にとっては日常的な作業であり、どのタイプの細胞を選択するかで異なることになる。トランスフェクションの効率は、細胞のタイプだけでなく、細胞の継代数と集密度にも依存する。siRNA-リポソーム複合体（例えば転倒かボルテックスか）を形成する時間と方法も極めて重要である。トランスフェクションの効率が低いというのが、AGR2のサイレンシングがうまくいかない最大の理由である。新たな細胞系を使用するごとにトランスフェクションの効率を注意深く調べる必要がある。好ましい細胞は、哺乳動物に由来する。より好ましいのは、囓歯類（例えばラットやマウス）からの細胞であり、最も好ましいのはヒトからの細胞である。治療に用いる場合には細胞は自己由来であることが好ましいが、本発明の範囲で非自己由来の細胞供給源も考えることができる。
対照実験としてAGR2一本鎖センスsiRNAを0.84μgトランスフェクトした場合には、0.84μgの二本鎖siRNAと比べてAGR2のサイレンシングに対する効果はなく、アンチセンスsiRNAが0.84μgだとサイレンシングに対して弱い効果がある。対照実験により、野生型AGR2表現型と沈黙したAGR2表現型をやはり比較して分析することができる。トランスフェクションの効率を制御するには、一般にありふれたタンパク質（例えば、ラミンA/C）を標的にしたり、CMVによってEGFPを発現するプラスミド（例えばクロンテック社から入手できる）をトランスフェクションしたりする。この具体例では、細胞内のノックアウトされたラミンA/C分画の測定は、翌日に、免疫蛍光法、ウエスタン・ブロット法、あるいはタンパク質または遺伝子の発現を調べる他の同様なアッセイを利用して行なう。ラミンA/Cモノクローナル抗体は、サンタ・クルス・バイオテクノロジー社から入手することができる。
細胞内の標的とするAGR2ポリヌクレオチドの豊富さと半減期（または代謝回転率）に応じ、ノックアウトされた表現型が、1〜3日後、あるいはそれ以降に現われる可能性がある。AGR2をノックアウトされた表現型が観察されない場合には、免疫蛍光法またはウエスタン・ブロット法によってAGR2ポリヌクレオチドの欠乏が観察される可能性がある。AGR2ポリヌクレオチドが3日後にもまだ豊富にある場合には、細胞群を分割して新鮮な24ウエルのプレートに移し、再度トランスフェクションを行なう必要がある。標的タンパク質（AGR2、またはAGR2の上流か下流にある遺伝子）のノックアウトが観察された場合には、トランスフェクトされた二本鎖siRNAによって標的mRNAが実際に破壊されたかどうかを分析することが望ましかろう。
トランスフェクションの2日後、全RNAを調製し、標的特異的なプライマーを用いて逆転写し、プレ-mRNAの増幅を制御するため少なくとも1つのエキソン-エキソン接合部を含むプライマー対を用いてPCRで増幅する。標的としないmRNAのRT-PCRも対照として必要である。mRNAが実際に欠乏したのに標的タンパク質の減少がまだ検出できないというのは、安定なAGR2タンパク質の大きなリザーバが細胞内に存在していることを示す。標的タンパク質が最終的に欠乏して表現型が現われるまで、十分に長い間隔で多数回のトランスフェクションを行なう必要があろう。多数回のトランスフェクションが必要な場合には、トランスフェクションの2〜3日後に細胞群を分割する。分割の直後に細胞にトランスフェクションを行なってもよい。
本発明の治療法では、AGR2の発現または活性の増大または異常を打ち消すための薬としてAGR2 siRNA構造体を投与することを考える。AGR2リボポリヌクレオチドを取得して処理することによって上記のsiRNA断片にする。AGR2 siRNAは、上記のように、公知の核酸トランスフェクション法を利用して細胞または組織に投与する。AGR2遺伝子に対して特異的なAGR2 siRNAは、AGR2転写産物を減らしたりなくしたりするため、AGR2ポリペプチドの産生が低下し、細胞または組織の内部でのAGR2ポリペプチドの活性が低下することになる。
本発明との関連で特に好ましいのは、二本鎖ヌクレオチド配列を含んでいて、そのうちの1本の鎖が、この明細書に記載した本発明のムテインをコードしているmRNAの少なくとも19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個いずれかの長さのヌクレオチド・セグメントと相補的であるsiRNAである。このセグメントは、ムテインとの関連で以前に明らかにした突然変異のどれかに対応するアミノ酸またはアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードしている。
上記の鎖が、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質、あるいは上記のマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質とアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％一致しているオルソログをコードしているmRNAの少なくとも19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個いずれかの長さのヌクレオチド・セグメントと相補的であるsiRNAも好ましい。このセグメントは非コード部であり、上記タンパク質またはオルソログをコードしている遺伝子内にあって、そのタンパク質またはオルソログの発現に影響を与える突然変異に対応する配列を含んでいる。
上記の鎖が、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質の発現または機能、あるいは配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質とアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％一致しているオルソログの発現または機能に影響を与えるタンパク質をコードしているmRNAの少なくとも19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個いずれかの長さのヌクレオチド・セグメントと相補的であるsiRNAも好ましい。
上記のセグメントは、5'非翻訳（UT）領域からの配列を含むことができる。上記のセグメントは、その代わりに、あるいはそれに加えて、オープン・リーディング・フレーム（ORF）に対応する配列を含むことができる。さらに上記のセグメントは、その代わりに、あるいはそれに加えて、3'非翻訳（UT）領域からの配列を含むことができる。
上記のsiRNAで形質転換された原核宿主細胞と真核宿主細胞は、どちらも本発明の範囲に含まれる。
本発明は、AGR2タンパク質の存在と関連するヒトの疾患または症状を治療する方法であって、そのヒトに、分解を目的としてそのタンパク質のmRNA（そのタンパク質をコードしているmRNA）を標的とするRNAi構造体を投与する操作を含む方法にも関する。特別なRNAi構造体としては、プロセシングによってsiRNAになる二本鎖遺伝子転写産物が挙げられる。治療をすると、標的タンパク質が産生されなくなるか、治療を行なわなかったときほどは標的タンパク質が産生されなくなる。
AGR2遺伝子の機能が既知の表現型と相関していない場合には、対照サンプルである健康な人の細胞または組織が、AGR2の発現レベルを明らかにするための基準となる。発現レベルは、すでに説明したRT-PCR、ノーザン・ブロッティング、ウエスタン・ブロッティング、ELISAなどのアッセイを利用して検出する。対象となる細胞サンプルまたは組織サンプルを、疾患状態の哺乳動物（好ましくはヒト）から採取する。AGR2リボポリヌクレオチドを用い、AGR2遺伝子産物に対して特異的なsiRNA構造体を作る。核酸を細胞または組織にトランスフェクトするための方法でAGR2 siRNAを細胞または組織に投与することによってその細胞または組織を治療した後、対象となるサンプル中のAGR2ポリペプチドまたはAGR2ポリヌクレオチドの発現の変化を観察して対照サンプルと比べる。AGR2遺伝子をノックアウトするこの方法により、治療した対象サンプル中のAGR2表現型を明らかにする迅速な方法が提供される。したがって治療した対象サンプル中のAGR2表現型は、治療中の疾患状態の変化をモニターするマーカーとして役立つ。
タンパク質とアミノ酸
本発明により、例えばネズミ類とヒトの突然変異したAGR2アミノ酸配列（ムテイン）も提供される。ネズミ類とヒトの野生型アミノ酸配列は、それぞれ配列番号3と配列番号4に示してある。マウスのアミノ酸配列が突然変異して位置137のバリンがグルタミン酸になっているものは、配列番号2に示してある。ヒトのアミノ酸配列が突然変異して位置137のバリンがグルタミン酸になっているものは、配列番号30に示してある。
より一般に、本発明により、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％一致するタンパク質が提供される。本発明には、配列番号3および配列番号4の対応するアミノ酸と比べたときに上記割合のアミノ酸が一致している少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも110個、少なくとも120個、少なくとも130個、少なくとも140個、少なくとも150個、少なくとも160個、少なくとも165個、少なくとも170個、少なくとも171個、少なくとも172個、少なくとも173個、少なくとも174個の連続したアミノ酸を含む断片も含まれる。
この明細書に記載した本発明によれば、上記のタンパク質またはタンパク質断片は、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質における突然変異に対応するアミノ酸またはアミノ酸配列を含んでいる。この突然変異は、マウスAgr2遺伝子によってコードされていてマウスのすべての細胞または実質的にすべての細胞のゲノムにホモの形で存在しているのであれば、対応する野生型動物と比べて杯細胞の機能が変化したことに伴う表現型をもたらす。
別の実施態様では、上記のタンパク質またはタンパク質断片は、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質における突然変異に対応するアミノ酸またはアミノ酸配列を含んでいる。この突然変異により、突然変異したタンパク質では、インビトロ・アッセイにおいて、対応するマウス野生型Agr2タンパク質またはヒト野生型AGR2タンパク質と比べて生物学的活性が変化することになる。この点に関して考えられるインビトロ・アッセイは、例えば、上記の非ヒト脊椎動物との関連で詳しく説明したアッセイである。
さらに別の実施態様では、上記のタンパク質またはタンパク質断片は、配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質における突然変異に対応するアミノ酸またはアミノ酸配列を含んでいる。この突然変異は、杯細胞の機能の変化に伴う医学的症状がヒト対象者で進行するリスクが大きいこと、あるいはAGR2の発現または機能が変化した杯細胞の機能変化に伴う医学的症状をヒト対象者が有することを示している。この段落または前の段落で用いた“に対応する”という表現は、この明細書ですでに説明したようにして対立遺伝子に突然変異が反映されていることを意味する。この段落では配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質における突然変異に言及しているが、この突然変異はやはりこの明細書の別の箇所でより詳しく説明したようなものであり、この明細書と請求項に記載した方法で同定することができる。
好ましい一実施態様では、本発明のタンパク質は、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質のオルソログであるが、脊椎動物のオルソログであることが好ましい。脊椎動物は、両性動物、特にアフリカツメガエルである。あるいは本発明のタンパク質は、哺乳動物のオルソログでもよく、特にラット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマのオルソログが可能である。本発明のタンパク質としては、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質の変異体、またはこれらタンパク質のオルソログ（対立遺伝子その他）で、いくつかのアミノ酸またはアミノ酸配列の一部に置換、付加、欠失があるようなものも考えられる。
好ましい別の一実施態様では、上記の突然変異があるために、配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質のアミノ酸が欠失していたり、別のアミノ酸で置換されていたりする。あるいは上記の突然変異があるために、上記のマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質のアミノ酸配列に通常は存在しないアミノ酸が付加される可能性もある。
欠失、置換、挿入は、マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の進化上保存された領域にも起こる可能性がある。特に、マウス、ラット、ヒトのAGR2で一致または類似しているアミノ酸、好ましくはマウス、ラット、ヒト、アフリカツメガエルのAGR2で一致または類似しているアミノ酸、より好ましくはマウス、ラット、ヒト、アフリカツメガエル、セノラブディティス・エレガンスのAGR2で一致または類似しているアミノ酸が、別のアミノ酸で置換されていてもよい。そのようなアミノ酸は、天然に存在しないアミノ酸でも、天然に存在するアミノ酸でもよい。当業者であれば、図2に示したような配列の比較に基づき、異なる種の間で一般に進化上保存された領域を容易に明らかにすることができよう。上に具体的に言及した種同士の間で一致または類似しているアミノ酸は、当業者であれば、図16、図17、図18に示したアミノ酸配列の比較図と添付の表（それぞれ表1、表2、表3）に基づいて容易に同定することもできよう。
変化したAGR2タンパク質の野生型残基は、サイズおよび／または極性が異なるアミノ酸で置換されていることが好ましい。すなわちその置換は、以下に示すような非保存アミノ酸置換であることが好ましい。
配列番号4に従うAGR2の残基137が、大きな脂肪族非極性アミノ酸以外のアミノ酸で置換されているAGR2ムテインも好ましい。残基137は酸性アミノ酸で置換されていることが好ましく、グルタミン酸で置換されていることが最も好ましい。
好ましい一実施態様では、本発明によるネズミ類のAgr2ムテインは、配列番号2に示したアミノ酸配列を持つ。
好ましい別の一実施態様では、本発明によるヒトAGR2ムテインは、配列番号30に示したアミノ酸配列を持つ。
この明細書と請求項に記載した“単離された”または“精製された”ポリペプチドまたはタンパク質、またはその生物学的に活性な断片は、そのポリペプチドまたはタンパク質の出所である細胞または組織の供給源からの細胞材料や他の汚染性タンパク質を実質的に含んでいないか、化学的に合成したときに化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含んでいない。“細胞材料を実質的に含んでいない”という表現には、AGR2タンパク質の調製物が含まれる。AGR2タンパク質は、そのタンパク質が単離されることになる細胞の細胞成分からその調製物の中で分離するか、その調製物の中で組み換えによって産生させる。
本発明にはさらに、成熟したマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質、または脊椎動物のおけるそのオルソログ（例えば上記の特別なオルソログ）で、上記の突然変異に対応するアミノ酸またはアミノ酸配列を含んでいるものも含まれる。この明細書では、ポリペプチドまたはタンパク質の“成熟した”形態は、翻訳後修飾によって生み出すことができる。このような追加プロセスとしては、例えば、タンパク質分解による開裂（例えばリーダー配列の開裂）、グリコシル化、ミリストイル化、リン酸化などがある。一般に、本発明の成熟したポリペプチドまたはタンパク質は、これらプロセスのうちの1つ、またはその任意の組み合わせによって生み出すことができる。
すでに説明したように、例えば配列番号3の残基137がサイズおよび／または極性が異なるアミノ酸で置換されている場合（この位置の野生型残基は除く）には、非保存アミノ酸置換と呼ばれる。非保存置換は、アミノ酸が、以下に示す5つの標準的なアミノ酸グループの異なるグループに含まれる別のアミノ酸で置き換えられていることと定義される。
1．小さくて非極性またはわずかに極性の脂肪族残基：アラニン、セリン、トレオニン、（プロリン）、（グリシン）；
2．負に帯電した残基とそのアミド：アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン；
3．正に帯電した残基：ヒスチジン、アルギニン、リシン；
4．大きくて極性のある脂肪族残基：メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、（システイン）；
5．大きな芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
保存された置換は、上に示した5つの標準的なアミノ酸グループの同じグループに含まれる別のアミノ酸で置き換えられていることと定義される。3つの残基が括弧に入っているのは、それらがタンパク質の構造において特別な役割を持っているからである。グリシンは側鎖のない唯一の残基であるため、鎖に柔軟性を与える。プロリンは普通とは異なる幾何学的形状であり、鎖を強く束縛する。システインはジスルフィド結合に関与することができる。
本発明により、キメラ・タンパク質または融合タンパク質も提供される。この明細書では、“キメラ・タンパク質”または“融合タンパク質”に、非AGR2ポリペプチド（すなわちAGR2またはその断片を含まないポリペプチド）に結合した新規なAGR2ポリペプチドが含まれる。
一実施態様では、融合タンパク質は、AGR2配列がGST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）のC末端に融合したGST-AGR2重鎖融合タンパク質である。このような融合タンパク質によって組み換えAGR2ポリペプチドの精製を容易に行なうことができる。
別の一実施態様では、融合タンパク質は、AGR2配列が免疫グロブリン・タンパク質ファミリー（特にFc領域のポリペプチド）に由来する配列に融合したAGR2-免疫グロブリン融合タンパク質である。精製または標識（例えばポリヒスチジン尾部（ヘキサヒスチジン・セグメントなど）、フラグ・タグ、ストレプトアビジン）を容易にするのに一般に用いられるアミノ酸配列にAGR2配列（突然変異タンパク質または突然変異断片）が融合した融合体も考えられる。
本発明のアミノ酸配列は、従来技術において周知のペプチド合成法によって作ること、あるいは組み換えDNA操作と組み換え発現によって作ることができる。ペプチド合成法としては、固相ペプチド合成法がある（例えば『合成ペプチド、ユーザー・ガイド』（Grant, G.A.編、W.H.フリーマン社、ニューヨーク、1992年）の第3章のFields他、「固相合成の原理と実際」、77〜183ページ；『FMOC固相ペプチド合成』（Chan, W.C.とWhite, P.D.編、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、2000年）の第9章のBarlos, K.とGatos, D.、「収束ペプチド合成」、215〜228ページを参照のこと）。既知配列を有するDNAの所定の部位に置換突然変異を起こすための方法はよく知られており、例えばM13突然変異誘発法がある。DNA配列を操作して置換変異体、挿入変異体、欠失変異体となる変異体タンパク質を作る方法は、例えばSambrook他、1989年の上記文献に記載されている。
抗体
本発明のさらに別の特徴は、以下に詳しく説明するムテイン内のエピトープを特異的に認識する抗体である。このエピトープは、ムテインとの関連で説明する突然変異に対応するムテイン内のアミノ酸またはアミノ酸配列を含んでいる。
本発明には、ムテインAGR2ポリペプチドの断片（アミノ末端の断片を含む）に対する抗体と、AGR2ムテイン・ポリペプチドまたはAGR2ムテイン・ポリペプチド断片を含む融合タンパク質に対する抗体も含まれる。この明細書では、“抗体”という用語は、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリン（Ig）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち抗原と特異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含む分子）を意味する。そのような抗体としては、例えば、ポリクローナル・フラグメント、モノクローナル・フラグメント、キメラ・フラグメント、一本鎖フラグメント、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab発現ライブラリが挙げられる。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、分子内に存在する重鎖の性質が互いに異なるIgG、IgM、IgA、IgE、IgDというクラスのいずれかと関係している。いくつかのクラスはサブクラスも持っている。例えばIgG1、IgG2などである。さらに、ヒトでは、軽鎖としてはκ鎖またはλ鎖が可能である。この明細書で抗体に言及する場合には、このようなすべてのクラス、サブクラス、ヒト抗体種のタイプがすべてその中に含まれる。
この明細書に記載したAGR2ポリペプチド、すなわち野生型AGR2または突然変異AGR2は、抗原として、あるいはその一部またはそのフラグメントとして機能するほか、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を調製する標準的な方法を利用して免疫特異的に抗原に結合する抗体を生じさせる免疫原としても使用できる。免疫原として使用する抗原の抗原性ペプチド断片としては、例えば突然変異した領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号2、配列番号30、配列番号3、配列番号4に示したアミノ酸配列）の少なくとも7個のアミノ酸残基や、そのエピトープで、ペプチドに対して発生した抗体が完全長タンパク質またはそのエピトープを含む任意の断片と特異的免疫複合体を形成するものが挙げられる。抗原性ペプチドは、少なくとも10個のアミノ酸残基、あるいは少なくとも15個のアミノ酸残基、あるいは少なくとも20個のアミノ酸残基、あるいは少なくとも30個のアミノ酸残基を含んでいることが好ましい。抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、タンパク質で表面に位置している領域である。それは、一般には親水性領域である。
本発明のいくつかの実施態様では、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも1つのエピトープは、ムテインまたは野生型AGR2ポリペプチドで表面に位置している領域（例えば親水性領域）である。ムテインまたは野生型AGR2ポリペプチドの疎水性分析によると、ムテインまたは野生型AGR2タンパク質のどの領域が特に親水性であって抗体産生の標的として有用な表面残基をコードしている傾向があるかが示される。抗体産生を目的として、従来技術において周知の任意の方法（例えばKyte-Doolittle法またはHopp-Woods法）で親水性領域と疎水性領域を示すヒドロパシー・プロットを行なうことができる。この方法ではフーリエ変換は行なう場合と行なわない場合がある。例えば、HoppとWoods、1981年；KyteとDoolittle、1982年b；KyteとDoolittle、1982年aを参照のこと。抗原性タンパク質、その誘導体、その断片、そのアナログ、そのホモログに含まれる1つ以上のドメインに対して特異的な抗体も、この明細書で提供される。
本発明のタンパク質、その誘導体、その断片、そのアナログ、そのホモログ、そのオルソログは、これらタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体を生成させるときに免疫原として用いることができる。
従来技術で知られているさまざまな手続きを利用し、本発明のタンパク質、その誘導体、その断片、そのアナログ、そのホモログ、そのオルソログに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製することができる。例えば『抗体：実験室マニュアル』、HarlowとLane、1988年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州を参照のこと。これら抗体のうちのいくつかについて以下に説明する。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を作るには、適切なさまざまな宿主動物（例えばウサギ、ヤギ、マウス、あるいは他の哺乳動物）に本発明のタンパク質、その合成変異体、これらのものの誘導体のいずれかを1回以上注射するとよい。適切な免疫原性調製物は、例えば、自然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質となる化学的に合成したポリペプチド、組み換えで発現させた免疫原性タンパク質を含むことができる。さらに、タンパク質は、免疫状態にする哺乳動物の体内で免疫原性であることが知られている第2のタンパク質と共役させることができる。そのような免疫原性タンパク質の具体例としては、スカシガイのヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのチログロブリン、ダイズのトリプシンインヒビターなどが挙げられる。
この調製物はさらにアジュバントを含むことができる。免疫応答を増大させるのに用いられるさまざまなアジュバントとしては、フロイント（完全、不完全）アジュバント、無機ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、ジニトロフェノールなど）、ヒトに使えるアジュバント（例えばカルメット-ゲラン菌、コリネバクテリウム・パルブム）、同様の免疫刺激剤などが挙げられる。使用できるアジュバントのさらに別の具体例として、MPL-TDMアジュバント（モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコレート）がある。
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体分子は、哺乳動物（例えば血液）から単離し、主として免疫血清のIgG分画を提供する周知の方法（例えばプロテインAまたはプロテインGを用いたアフィニティ・クロマトグラフィ）でさらに精製することができる。その後、あるいはその代わりに、探している免疫グロブリンの標的である特異的抗原またはそのエピトープをカラム上に固定化し、免疫アフィニティ・クロマトグラフィによって免疫特異的抗体を精製することができる。
モノクローナル抗体
この明細書では、“モノクローナル抗体”（MAb）または“モノクローナル抗体組成物”という用語は、唯一の軽鎖遺伝子産物と唯一の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子という1つの分子種だけを含む抗体分子の集団を意味する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）は、集団内のすべての分子で同じである。したがってMAbは、抗原の特定のエピトープだけに対する結合親和性を特徴としていてそのエピトープと免疫反応することのできる抗原結合部位を含んでいる。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えばKohlerとMilsteinが記載している方法（KohlerとMilstein、1975年））を利用して調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、あるいは他の適切な宿主動物を一般に免疫感作剤を用いて免疫状態にし、その免疫感作剤に特異的に結合する抗体を産生させるか産生させうるリンパ球を刺激する。あるいはリンパ球は、試験管内で免疫状態にすることもできる。
典型的な免疫感作剤としては、タンパク質抗原、その断片、その融合タンパク質が挙げられる。一般に、ヒト由来の細胞が望ましい場合には末梢血リンパ球が用いられ、非ヒト哺乳動物供給源が望ましい場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞が用いられる。次に、適切な融合剤（例えばポリエチレングリコール）を用い、リンパ球を不死化細胞系と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する。Goding、『モノクローナル抗体：原理と実際』、アカデミック出版、1986年、59〜103ページ。不死化細胞系は、通常は、形質転換した哺乳動物の細胞（特に囓歯類、ウシ、ヒトに由来する骨髄腫細胞）である。通常はラットまたはマウスの骨髄腫細胞系が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、適切な培地の中で培養することができる。この培地には、融合していない不死化細胞の増殖または生存を抑制する1種類以上の物質が含まれていることが好ましい。例えば親細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）が欠けている場合には、ハイブリドーマの培地は、一般に、HGPRT欠乏細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含むことになる（“HAT培地”）。
好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による安定で高レベルの発現を支え、HAT培地などの培地に対する感受性のある細胞系である。より好ましい不死化細胞系はネズミ類の骨髄腫系であり、例えばソーク研究所細胞分配センター、サン・ディエゴ、カリフォルニア州と、アメリカ基準培養物コレクション、マナサス、ヴァージニア州から入手することができる。ヒト骨髄腫細胞系とマウス-ヒト異種骨髄腫細胞系も、ヒト・モノクローナル抗体産生用として報告されている（（Kozbor他、1984年）、Brodeur他、『モノクローナル抗体の製造法と応用』、マルセル・デッカー社、ニューヨーク、1987年、51〜63ページ）。
次に、ハイブリドーマ細胞を培養する培地の中に、抗原に対するモノクローナル抗体が存在しているかどうか調べることができる。ハイブリドーマ細胞が産生したモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法またはインビトロ結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（RIA）、固相酵素免疫検定法（ELISA））によって調べる。このような方法やアッセイは従来技術で知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonとRodbardのスクラッチャード分析（MunsonとRodbard、1980年）によって明らかにすることができる。標的抗原に対する特異性と結合親和性が大きい抗体を単離することが好ましい。
望むハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈法によってクローンをサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる。この目的に合った培地としては、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地とRPMI-1640培地が挙げられる。あるいはハイブリドーマ細胞を哺乳動物の体内で腹水として生体内増殖させることもできる。
サブクローンが分泌するモノクローナル抗体は、培地または腹水から従来の免疫グロブリン精製法（例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、アフィニティ・クロマトグラフィ）で単離または精製することができる。
モノクローナル抗体は、組み換えDNA法で作ることもできる。その方法は、例えばアメリカ合衆国特許第4,816,567号に記載されている。本発明のモノクローナル抗体をコードしているDNAは、従来法（例えばネズミ類の抗体の重鎖と軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチド・プローブを用いる）を利用して容易に単離してシークエンシングすることができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなDNAを供給するための好ましい供給源になる。DNAは、単離後、発現ベクターの中に入れ、次いでその発現ベクターを宿主細胞（別のときには免疫グロブリン・タンパク質を産生しない例えばサルCOS細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞、骨髄腫細胞）にトランスフェクトすることができる。するとその組み換え宿主細胞の中でモノクローナル抗体が合成される。DNAの修飾は、例えばヒトの重鎖と軽鎖の定常領域のコード配列でもってそれと相同なネズミ類の配列を置き換えることによって（アメリカ合衆国特許第4,816,567号；Morrison、1994年b）、あるいは免疫グロブリンをコードしている配列に、非免疫グロブリン・ポリペプチドをコードしている配列の全体または一部を共有結合させることによっても実現できる。このような非免疫グロブリン・ポリペプチドは、本発明による抗体の定常領域で置き換えることにより、あるいは本発明による抗体の1つの抗原結合部位の可変領域で置き換えることにより、キメラ2価抗体を作ることができる。
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含むことができる。これらの抗体はヒトに投与するのに適しており、ヒトでは投与した免疫グロブリンに対する免疫応答を起こさない。ヒト化抗体は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、その断片（例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2、あるいは抗体の他の抗原結合部分配列）のいずれかであり、主としてヒト免疫グロブリンの配列からなり、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列は最小限含まれている。
ヒト化は、Winterとその共同研究者の方法（Jones他、1986年；Riechmann他、1988年b；Verhoeyen他、1988年a；Riechmann他、1988年a；Verhoeyen他、1988年b）に従って囓歯類のCDRまたはCDR配列を対応するヒト抗体の配列で置換することによって実現できる。（アメリカ合衆国特許第5,225,539号も参照のこと。）場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域の残基を対応する非ヒト残基で置き換える。ヒト化抗体は、レシピエントの抗体にも、導入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含むこともできる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの（一般には2つの）可変領域の実質的にすべてを含むことになる。可変領域では、すべてまたは実質的にすべてのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、すべてまたは実質的にすべてのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のフレームワーク領域である。最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン（一般にはヒト免疫グロブリン）の定常領域（Fc）の少なくとも一部も含むことになる（Jones他、1986年；Riechmann他、1988年b；Riechmann他、1988年a）。
ヒト抗体
完全なヒト抗体は、軽鎖と重鎖の両方の配列のほぼ全体が、CDRも含めてヒト遺伝子からのものである抗体分子に関係する。このような抗体は、この明細書では、“ヒト抗体”または“完全なヒト抗体”と名づける。ヒト・モノクローナル抗体は、トリオーマ法で調製することができる。ヒトB細胞ハイブリドーマ法とEBVハイブリドーマ法でヒト・モノクローナル抗体を製造する（Cole他、1985年、『モノクローナル抗体とがんの治療』、アラン R.リス社、77〜96ページを参照のこと）。ヒト・モノクローナル抗体を利用して本発明を実施することができる。またヒト・モノクローナル抗体を製造するのに、ヒト・ハイブリドーマを利用すること（Cote他、1983年）または試験管内でヒトB細胞をエプスタイン・バー・ウイルスで形質転換すること（Cole他、1985年、『モノクローナル抗体とがんの治療』、アラン R.リス社、77〜96ページを参照のこと）ができる。
さらに、ヒト抗体は、別の方法（例えばファージ提示ライブラリ）を利用して製造することもできる（HoogenboomとWinter、1992年；Marks他、1991年a；Marks他、1991年b）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内在性免疫グロブリン遺伝子の一部または全体が不活性化されているトランスジェニック動物（例えばマウス）に導入することによっても製造できる。チャレンジを行なうと、ヒト抗体の産生が観察される。これは、ヒトで見られるのとあらゆる点（例えば遺伝子の再構成、組み立て、抗体のレパートリー）で非常によく似ている。この方法は、例えばアメリカ合衆国特許第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号と、Fishwild他、1996年b；Lonberg他、1994年b；LonbergとHuszar、1995年b；Marks他、1992年；Morrison、1994年b；Neuberger、1996年b；Fishwild他、1996年a；Lonberg他、1994年a；LonbergとHuszar、1995年a；Morrison、1994年a；Neuberger、1996年aに記載されている。
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を産生するように改変した非ヒト・トランスジェニック動物を利用して産生させることもできる。WO 94/02602を参照のこと。非ヒト宿主で免疫グロブリンの重鎖と軽鎖をコードしている内在性遺伝子を不活化し、ヒト免疫グロブリンの重鎖と軽鎖をコードしている活性な遺伝子座を宿主のゲノムに挿入する。ヒト遺伝子は、例えば必要なヒトDNAセグメントを含む酵母人工染色体を用いて組み込む。次に、望むすべての改変部を有する動物を、すべての改変部ではなくそれよりも少数の改変部を含むトランスジェニック動物を異種交配させることによって子どもとして得る。このような非ヒト動物の好ましい実施態様はマウスであり、PCT公開公報WO 96/33735とWO 96/34096に開示されているようにゼノマウス（登録商標）と名づける。この動物は、ヒト免疫グロブリンを十分に分泌するB細胞を作り出す。抗体は、興味の対象である免疫原を用いて動物を免疫状態にした後、例えばポリクローナル抗体調製物としてその動物から直接得ること、あるいはその動物に由来する不死化B細胞（例えばモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から直接得ることができる。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードしている遺伝子を回収して発現させることによって抗体を直接得ること、あるいはその遺伝子をさらに修飾して抗体アナログ（例えば一本鎖Fv分子）を得ることができる。
内在性免疫グロブリンの重鎖の発現が欠けている非ヒト宿主（例えばマウス）を作る1つの具体的な方法がアメリカ合衆国特許第5,939,598号に開示されている。このようなマウスは、選択マーカーをコードしている遺伝子を含む標的ベクターを用いて胚幹細胞内の少なくとも1つの内在性重鎖遺伝子座からJセグメント遺伝子を除去することにより、その遺伝子座の再構成を阻止するとともに、再構成された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写産物が形成されるのを阻止し；体細胞と生殖細胞に選択マーカーをコードしている遺伝子が含まれたトランスジェニック・マウスをその胚幹細胞から作ることによって得られる。
興味の対象である抗体（例えばヒト抗体）の製造方法は、アメリカ合衆国特許第5,916,771号に開示されている。この方法は、重鎖をコードしているヌクレオチド配列を含む発現ベクターを培地の中にある哺乳動物の1つの宿主細胞に導入し、軽鎖をコードしているヌクレオチド配列を含む発現ベクターを哺乳動物の別の宿主細胞に導入し、これら2つの細胞を融合してハイブリッド細胞を形成する操作を含んでいる。このハイブリッド細胞は、重鎖と軽鎖を含む抗体を発現する。
この方法をさらに改良した方法として、免疫原と臨床上関係のあるエピトープを同定する方法と、関係するそのエピトープと高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関法が、PCT公開公報WO 99/53049に開示されている。
Fabフラグメントと一本鎖抗体
本発明によると、本発明の抗原性タンパク質に対して特異的な一本鎖抗体を作れるように方法を変更することができる（アメリカ合衆国特許第4,946,778号を参照のこと）。さらに、タンパク質、その誘導体、その断片、そのアナログ、そのホモログを探すため、Fab発現ライブラリ（Huse他、1989年）の構成法を変更し、望む特異性でモノクローナルFabフラグメントを迅速かつ効果的に同定できるようにすることができる。タンパク質抗原のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、従来技術で知られている方法で作ることができる。得られる抗体フラグメントとしては、（i）抗体分子をペプシンで消化させて得られるF(ab')2フラグメント；（ii）F(ab')2フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって得られるFabフラグメント；（iii）抗体分子をパパインと還元剤を用いて処理することによって得られるFabフラグメント；（iv）Fvフラグメントがある。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、異なる少なくとも2つの抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体は、ヒト・モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。ここでは、結合特異性の一方が、本発明の抗原性タンパク質に関係している。第2の結合標的は他の任意の抗原であり、その標的は、細胞表面タンパク質、受容体、受容体のサブユニットのいずれかであることが好ましい。
二重特異性抗体の製造法は従来技術において公知である。組み換えによって二重特異性抗体を産生させる従来法は、重鎖の特異性が互いに異なる2つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアを同時発現させることに基づいている（MilsteinとCuello、1983年）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖はランダムに組み合わせれるため、ハイブリドーマ（クワドローマ）は異なる10種類の抗体分子の潜在的な組み合わせを産生する。そのうちの1つだけが、正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常はアフィニティ・クロマトグラフィによってなされる。同様の手続きがWO 93/08829とTraunecker他（Traunecker他、1991年）に開示されている。
望む結合特異性を有する抗体の可変領域（抗体-抗原結合部位）を免疫グロブリン定常領域の配列と融合させることができる。この融合は、少なくともヒンジ領域と、CH2領域と、CH3領域の一部とを含む免疫グロブリンの重鎖定常領域との間で実現することが好ましい。軽鎖の結合にとって必要で融合体の少なくとも1つに存在している部位が、第1の重鎖定常領域（CH1）に含まれていることが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードしているDNAを発現ベクターに挿入し、望むのであればさらに免疫グロブリン軽鎖を別の発現ベクターに挿入することにより、適切な宿主生物に同時にトランスフェクトする。二重特異性抗体の製造に関するさらに詳しいことは、例えばSurechらの論文（Surech他、1986年）を参照のこと。
WO 96/27011に記載されている別の方法によると、抗体分子ペアの界面を操作し、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。好ましい界面は、抗体定常領域のCH3領域の少なくとも一部を含んでいる。この方法では、第1の抗体分子の界面からの1つ以上のアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシンやトリプトファン）で置き換える。その大きな側鎖とサイズが同じか同程度の補償用“キャビティ”を第2の抗体分子の界面に作るが、それは、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって実現する。これが、ヘテロ二量体の収率を、ホモ二量体などの他の望ましくない最終生成物の収率よりも大きくするメカニズムである。
二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント（例えばF(ab')2二重特異性抗体）として調製することができる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を作る方法は文献に記載されている。二重特異性抗体は、例えば化学的結合によって調製することができる。Brennanら（Brennan他、1985年）は、完全な抗体をタンパク質分解によって開裂させてF(ab')2フラグメントを生み出す方法を記載している。そのフラグメントをジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して近くのジチオールを安定化させ、分子間にジスルフィド結合が形成されるのを阻止する。次に、生成したFab'フラグメントをチオニトロ安息香酸塩（TNB）誘導体に変換する。次に、メルカプトエチルアミンを用いた還元によりFab'-TNB誘導体の1つを再度変換してFab'-チオールにし、同じモル数の他のFab'-TNB誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。得られた二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化剤として用いることができる。
さらに、Fab'フラグメントを大腸菌から直接回収し、化学的結合によって二重特異性抗体を形成することもできる。Shalabyら（Shalaby他、1992年）は、完全なヒト化二重特異性抗体F(ab')2分子の製造法を記載している。それぞれのFab'フラグメントは大腸菌から別々に分泌され、試験管内で化学的に結合されて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、ErbB2受容体を過剰発現する細胞と正常なヒトT細胞に結合することができ、ヒト乳がん標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の分解活性をトリガーすることもできた。
二重特異性抗体フラグメントを作って組み換え細胞培養物から直接単離するさまざまな方法も報告されている。例えばロイシン・ジッパーを用いて二重特異性抗体が作られている（Kostelny他、1992年）。遺伝子融合により、Fosタンパク質とJunタンパク質からのロイシン・ジッパー・ペプチドを2つの異なる抗体のFab'部と結合させる。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して一量体を形成した後、再度酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法は、抗体ホモ二量体を作るのにも利用できる。“二重特異性抗体”法（Hollinger他、1993年）は、二重特異性抗体フラグメントを作る別のメカニズムを提供してきた。このフラグメントは、リンカーによって軽鎖可変領域（VL）に接続された重鎖可変領域（VH）を含んでいる。このリンカーは、同じ鎖上でこれら2つの領域をペアにするには短すぎる。したがって1つのフラグメントのVH領域およびVL領域が別のフラグメントの相補的なVL領域およびVH領域と強制的にペアにされ、2つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Fv（sFv）二量体を用いて二重特異性抗体フラグメントを作る別の方法も報告されている（Gruber他、1994年）。
3価以上の抗体を考慮する。例えば三重特異性抗体を調製することができる（Tutt他、1991年）。
例えば二重特異性抗体は2つの異なるエピトープに結合することができる。そのうちの少なくとも一方は、本発明の抗原タンパク質に由来する。二重特異性抗体は、特定の抗原を発現する細胞にさまざまな薬剤を送るのに用いることもできる。二重特異性抗体は、抗原結合アームと、放射性核種キレータ（例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、TETA）などの薬剤と結合するアームとを備えている。
異種共役抗体
異種共役抗体も本発明の範囲に含まれる。異種共役抗体は、共有結合した2つの抗体からなる。そのような抗体としては、例えば、免疫系細胞が望まない細胞を標的とするような抗体（アメリカ合衆国特許第4,676,980号）、HIV感染を治療するための抗体（WO 91/00360；WO 92/200373；ヨーロッパ特許第03089号）が提案されている。合成タンパク質の化学において公知の方法（例えば架橋剤を用いる方法）で抗体を試験管内で調製できるようにすることも考えられる。例えばジスルフィド交換反応を利用することによって、あるいはチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構成することができる。この目的に合った試薬の具体例としては、メチル-4-メルカプトブチルイミデートや、例えばアメリカ合衆国特許第4,676,980号に開示されているものが挙げられる。
エフェクター機能の操作
例えば抗体の効果を大きくするため、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾するのが望ましい場合がある。例えばシステイン残基をFc領域に導入することにより、鎖間のジスルフィド結合がこの領域に形成されるようにすることができる。このようにして作ったホモ二量体抗体は、向上した内部化能力および／または向上した補体依存性細胞殺傷能力と抗体依存性細胞毒性（ADCC）を持っている可能性がある（Caron他、1992年；Shopes、1992年a；Shopes、1992年b）。抗腫瘍活性が増大したホモ二量体抗体は、Wolffらの論文（Wolff他、1993年）に記載されているように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。あるいは2つのFc領域を有する抗体を操作することによって増大した補体溶解性とADCC能力を持つようにすることもできる（Stevenson他、1989年）。
免疫共役体
本発明は、細胞毒性剤（例えば化学療法剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物、動物に由来し、酵素によって活性化する毒素またはその断片）、放射性同位体（すなわち放射性共役体））と共役した抗体を含む免疫共役体にも関する。
酵素によって活性化する毒素またはその断片で使用可能なものとしては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の結合しない活性な断片、外毒素A鎖（緑膿菌からのもの）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ・タンパク質、ジアンチン・タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ・タンパク質（PAPI、PAPII、PAP-S）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセンなどが挙げられる。放射性共役抗体を作るのに多彩な放射性核種が利用できる。具体的には212Bi、131I、131In、90Y、186Reが挙げられる。
抗体と細胞毒性剤の共役体は、さまざまな二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作られる。二官能性タンパク質カップリング剤としては、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートHCL）、活性なエステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えばビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えばビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトリレン 2,6-ジイソシアネート）、ビス-活性フッ素化合物（例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）などが挙げられる。例えばリシン免疫毒素を報告されているようにして調製することができる（Vitetta他、1983年）。炭素14で標識した1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、放射性ヌクレオチドを抗体と共役させるためのキレート剤の一例である。WO 94/11026を参照のこと。
別の一実施態様では、腫瘍が優先的な標的となるようにするため抗体を“受容体”（例えばストレプトアビジン）と共役させた抗体-受容体共役体を患者に投与し、クリアリング剤を用いて結合しない共役体を循環から除去した後、今度は細胞毒性剤と共役する“リガンド”（例えばアビジン）を投与することができる。
本発明の免疫共役体は、イメージング剤と共役した上記の抗体を含むものでもよい。この場合の適切なイメージング剤は、例えば、やはりいくつかの放射性同位体である。この場合に適切なのは、18F、64Cu、67Ga、68Ga、99mTc、111In、123I、125I、131I、169Yb、186Re、201Tlである。この場合に特に好ましいのは99mTcである。放射性同位体は、キレート基を通じて抗体に共役させることが好ましい。このキレート基は、抗体に共有結合していて放射性同位体のキレート化を可能にする。
アンチカリン（Anticaline）
アンチカリンは、足場としての天然のリポカリンに由来する抗体様結合基を有する人工タンパク質である。ほんの約150〜190個のアミノ酸からなるこの小さなモノマー・タンパク質は、例えば固形腫瘍の場合に抗体よりも優れた点をいくつか有する。それは、例えば大きな結合特異性や、向上した組織浸透性である。本発明のアンチカリンは、対応するリガンドとナノモルの範囲（例えばK(D)の値が12nM〜35nMという小さなナノモルの範囲）において高い特異性かつ大きな親和性で結合することが好ましい。アンチカリンの4つのループの集合は、遺伝子レベルで容易に操作することができる（WeissとLowmann、2000年；Skerra、2001年）。本発明による好ましいアンチカリンは、この明細書に記載したAGR2ムテインに特異的に結合する。別の好ましいアンチカリンは、野生型AGR2タンパク質（例えば配列番号3または配列番号4に従うAGR2タンパク質）に特異的に結合する。
タンパク質と核酸に対して特異的なアプタマーの製造方法は公知である。例えばアメリカ合衆国特許第5,840,867号、第5,756,291号、第5,582,981号を参照のこと。
AGR2タンパク質を発現するベクターと細胞
本発明の別の側面は、AGR2ムテイン、またはその誘導体、その断片、そのアナログ、そのホモログをコードしている核酸を含むベクター（好ましくは発現ベクター）に関する。この明細書では、“ベクター”は、別の核酸を結合させて運搬することのできる核酸分子を意味する。ベクターの1つのタイプは“プラスミド”である。プラスミドとは、環状二本鎖DNA分子で、その中に付加DNAセグメントを連結させうるものを意味する。別のタイプのベクターはウイルス・ベクターであり、そのウイルスのゲノムに付加DNAセグメントを連結することができる。いくつかのベクター（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターや、エピソーム哺乳類ベクター）は、導入された宿主細胞の中で自律的複製をすることができる。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されるとその宿主細胞のゲノムと一体化するため、その宿主細胞とともに複製される。さらに、いくつかのベクターは、そのベクターと機能上リンクした遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターをこの明細書では“発現ベクター”と呼ぶ。
本発明の宿主細胞（例えば培養物中の原核宿主細胞または真核宿主細胞）を用いてAGR2ムテインを産生（すなわち発現）させることができる。したがって本発明により、本発明の宿主細胞を用いてAGR2ムテインを産生させる方法がさらに提供される。一実施態様では、この方法は、本発明の宿主細胞（その中に、AGR2ムテイン・タンパク質をコードしている組み換え発現ベクターを導入した）を適切な培地の中で培養してAGR2ムテインを産生させる操作を含んでいる。別の一実施態様では、この方法は、培地または宿主細胞からAGR2ムテインを単離する操作をさらに含んでいる。
本発明の宿主細胞を用いて非ヒト・トランスジェニック動物を作ることもできる。例えば一実施態様では、本発明の宿主細胞は、AGR2タンパク質をコードしている配列を内部に導入した受精卵母細胞または胚幹細胞である。次にこのような宿主細胞を用い、外来性AGR2配列をゲノムに導入した非ヒト・トランスジェニック動物、あるいは内在性AGR2配列を変化させた相同的組み換え動物を作る。このような動物は、AGR2タンパク質の機能および／または活性を研究するのに役立ったり、AGR2タンパク質の活性を変化させるモジュレータの同定および／または評価に役立ったりする。この明細書では、“トランスジェニック動物”は、1個以上の細胞に導入遺伝子が含まれている非ヒト動物を意味する。この動物は、哺乳動物であることが好ましく、囓歯類（ラットやマウス）であることがさらに好ましい。トランスジェニック動物の別の具体例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。本発明の変化したAGR2を発現するトランスジェニック動物を作るのに本発明のポリヌクレオチドおよびこの明細書に記載した方法とともに利用できる標準的な方法が従来技術において知られている。
疾患関連AGR2対立遺伝子のスクリーニング法
本発明の1つの側面は、ヒト対象者で杯細胞の機能変化に伴う医学的症状が現われるリスクが大きいことを示すタンパク質マーカーまたは核酸マーカーの同定方法に関する。この方法は、ヒト対象者に由来するテスト・サンプルを分析し、病気でないヒト対象者または上記の医学的症状が現われるリスクを持たないことがわかっているヒト対象者に由来する同様のテスト・サンプルと比べて違いの存在を探すステップを含んでおり、その違いが、配列番号4に従うAGR2タンパク質をコードしている遺伝子の1つの対立遺伝子、あるいはAGR2タンパク質の発現または機能に影響を与えるタンパク質をコードしている遺伝子の1つの対立遺伝子に突然変異が存在していることを示している。
本発明はさらに、ヒト対象者における杯細胞の機能変化に伴う医学的症状が、変化したAGR2の発現または機能と関係していることを示すタンパク質マーカーまたは核酸マーカーの同定方法にも関する。この方法は、ヒト対象者に由来するテスト・サンプルを分析し、病気でないヒト対象者または上記の医学的症状が現われるリスクを持たないことがわかっているヒト対象者に由来する同様のテスト・サンプルと比べて違いの存在を探すステップを含んでおり、その違いが、配列番号4に従うAGR2タンパク質をコードしている遺伝子の1つの対立遺伝子、あるいはAGR2タンパク質の発現または機能に影響を与えるタンパク質をコードしている遺伝子の1つの対立遺伝子に突然変異が存在していることを示している。
上記の方法では、ヒト対象者に由来するテスト・サンプルは、そのヒト対象者から直接得ることができる。しかしそのテスト・サンプルは、以前に得たサンプルでもよい。本発明のテスト・サンプルとしては、例えばより早い段階のヒト対象者に由来する組織サンプルから得たmRNAをもとにして調製したcDNA調製物も挙げられる。本発明のテスト・サンプルは、より早い段階に得たそのような組織サンプルに含まれるDNAに由来するクローニングしたDNAまたはPCR増幅したDNAでもよい。
本発明の方法によると、テスト・サンプルを分析し、病気でないヒト対象者または杯細胞の機能変化に伴う医学的症状が現われるリスクを持たないことがわかっているヒト対象者に由来する同様のテスト・サンプルとの違いを探す。この方法は、比較のためにそのようなヒト対象者からテスト・サンプルを取り出す、あるいは直接取得する操作を含んでいるが、比較に用いる同様のテスト・サンプルの構造上の特徴と性質に関する必要な情報はすでに利用可能であることがしばしばあろう。したがって本発明による上記方法のためには、同様のテスト・サンプルが実際に病気でないヒト対象者または上記の医学的症状が現われるリスクを持たないことがわかっているヒト対象者から得られるのであれば、その同様のテスト・サンプルとの違いを分析すれば十分であることがしばしばある。
テスト・サンプルとしては、核酸サンプル（例えばmRNAまたはそれをもとにしたcDNA）、またはゲノムDNAが考えられる。
テスト・サンプルは、タンパク質サンプルでもよい。
分析する違いとしては、その核酸またはタンパク質の発現レベルの違いが考えられる。あるいはヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のレベルで違いがあるかどうかを分析することもできる。
したがって本発明による上記の方法には、テスト・サンプル間の違いを分析するステップに、核酸配列、核酸中のPCR増幅した部分の配列、テスト・サンプルの配列のいずれかを部分的または完全に決定し、場合によってはさらに、同様のテスト・サンプル（または同様の複数のテスト・サンプル）の核酸配列または核酸中のPCR増幅した部分の配列を部分的または完全に決定する操作が含まれる実施態様が含まれる。
核酸配列の一部または全体を決定する適切な方法は当業者には周知であるため、上記違いを検出する方法は当業者には周知である。方法としては、例えばサザン・ブロッティング検出法、TGGE（温度勾配ゲル電気泳動）検出法、DGGE（変性勾配ゲル電気泳動）検出法、SCCP（一本鎖立体配座多型）検出法などがある。Kristensenらが記載している高スループット配列分析法（Kristensen他、BioTechniques、第30巻、318〜332ページ、2001年：その全体が参考としてこの明細書に組み込まれているものとする）もやはり適した方法であるため、本発明との関係で考慮する。
アミノ酸配列の一部または全体を決定するのに適した方法も同様によく知られており、例えば特異的抗体を通じたタンパク質サンプル内の特定のエピトープの検出を、ドット・ブロット・アッセイ、スロット・ブロット・アッセイ、ウエスタン・ブロット・アッセイ、ELISA、RIAのいずれかによって行なったり、シークエンサーを用いたエドマン分解によるアミノ酸配列の部分的決定によって行なったりする方法がある。高スループット法もやはり利用することができる。
本発明のさらに別の側面は、ヒト対象者で杯細胞の機能変化に伴う医学的症状が現われる傾向を明らかにする方法であって、そのヒト対象者に由来するテスト・サンプルが、そのヒト対象者で杯細胞の機能変化に伴う医学的症状が現われるリスクが大きいことを示す突然変異が配列番号4に従うAGR2タンパク質をコードしている遺伝子の1つの対立遺伝子に存在していることを示しているかどうかを明らかにするステップを含む方法である。
本発明との関係では、ヒト対象者で杯細胞の機能変化に伴う医学的症状が、AGR2の発現または機能の変化と関連しているかどうかを明らかにする方法であって、そのヒト対象者に由来するテスト・サンプルが、AGR2の発現または機能が変化していることを示す突然変異が配列番号4に従うAGR2タンパク質をコードしている遺伝子の1つの対立遺伝子に存在していることを示しているかどうかを明らかにするステップを含む方法も考慮する。
上記のいろいろな方法の場合と同様、前2つの段落に記載した方法ではテスト・サンプルは直接ヒト対象者に由来するものであったが、テスト・サンプルは以前に得たサンプルでもよい。さらに、本発明による適切なテスト・サンプルは、例えば、より早い段階のヒト対象者に由来する組織サンプルから得たmRNAをもとにして調製したcDNA調製物である。テスト・サンプルとしては、より早い段階に得たそのような組織サンプルに含まれるDNAに由来するDNAをクローニングしたものまたはPCR増幅したものも考えられる。
テスト・サンプル（すでに述べたように、核酸テスト・サンプルまたはタンパク質テスト・サンプルが可能である）に上記突然変異が存在しているかどうかを明らかにするステップでは、核酸配列またはアミノ酸配列の一部または全体を決定する上記の方法をやはり利用することができる。
ヒト対象者で杯細胞の機能変化に伴う医学的症状が現われる傾向を明らかにする上記の方法、あるいはそのような医学的症状と変化したAGR2の発現または機能の間の潜在的な関連を明らかにする上記の方法によると、テスト・サンプルを分析し、そのような医学的症状が現われるリスクが大きいことを示す突然変異、あるいはAGR2の発現または機能が変化していることを示す突然変異がAGR2遺伝子の1つの対立遺伝子に存在しているかどうかを明らかにする。このような突然変異は、特に、本発明のタンパク質および核酸との関係でこの明細書で扱っているものであり、このタイプの突然変異は、例えばこの点に関して説明したインビトロ・アッセイまたはモデル動物によって容易に突き止めることができる。この突然変異は、疾患関連AGR2対立遺伝子をスクリーニングするための上記方法のどれを利用して突き止めてもよい。
医薬組成物
本発明には、AGR2の活性（すなわちAGR2ムテインまたは野生型AGR2の活性）を変化させることのできる薬剤を含む医薬組成物も含まれる。そのような薬剤としては、生体分子（例えばこの明細書に記載したようなタンパク質、ムテイン、キナーゼ、ホスファターゼ、抗体、抗体フラグメント、核酸、リボザイム、アンチカリン、アプタマー）や、このような生体分子に対する抗体（例えばムテインまたは野生型タンパク質に対する抗体、抗イディオタイプ抗体）を含む医薬組成物が挙げられる。さらに、薬剤としては、AGR2に直接影響を与える可能性のある化合物（例えば小分子アゴニスト、小分子アンタゴニスト）も挙げられる。さらに、薬剤は、生体分子や化合物でもよい。例えば、AGR2（すなわちAGR2ムテインまたは野生型タンパク質）とその生理学的リガンド（細胞膜など）の間の相互作用に影響を与える生体分子や化合物で、これまでに示したものまたはこれから示すものがある。
組成物は、体内で使用するのに適していることが好ましい。組成物は、本発明の薬理学的に活性な化合物の有効量を、単独で、あるいは1種類以上の薬理学的に許容可能な基剤と組み合わせて含んでいる。その化合物は、毒性があっても非常に小さいという点で特に有用である。
本発明の薬剤とそれに対する抗体を薬理学的に許容可能な基剤と組み合わせて医薬組成物で用いることができる。この明細書では、“薬理学的に許容可能な基剤”に、投与する医薬組成物に適合する溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などがすべて含まれるものとする。適切な基剤は、この分野の標準的な教科書である『レミントンの薬理科学』の最新版（第18版、Alfonso R. Gennaro編、マック出版、イーストン、ペンシルヴェニア州、1990年）に記載されている（なおその内容は、参考としてこの明細書に組み込まれているものとする）。そのような基剤または希釈剤の具体例としては、水、生理食塩水、フィンガー液、デキストロース溶液、5％ヒト血清アルブミンなどが挙げられる。リポソームや非水性ビヒクル（例えば不揮発性油）も用いることができる。このような媒体や薬剤を薬理学的に活性な物質として用いることは従来技術において周知である。従来のどの媒体や薬剤も、活性化合物と適合しない場合を除き、組成物で使用することが考えられる。追加の活性化合物も組成物に組み込むことができる。
本発明の医薬組成物は、目的とする投与経路に適した製剤にする。投与経路の具体例としては、非経口投与（例えば静脈内投与、皮内投与、皮下投与）、経口投与（例えば吸入）、経皮投与（すなわち局所投与）、経粘膜投与、直腸投与がある。非経口投与、皮内投与、皮下投与するのに用いる溶液または懸濁液としては以下のものが挙げられる：殺菌希釈液（例えば注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、あるいは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えばベンジルアルコール、メチルパラベン）；抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（EDTA））；緩衝液（例えば酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩）や、張性調節剤（例えば塩化ナトリウム、デキストロース）。pHは、酸または塩基（例えば塩酸、水酸化ナトリウム）を用いて調節することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックでできたアンプル、使い捨て注射器、1回分の用量を含む複数個のバイアルに閉じ込めることができる。
注射に適した医薬組成物としては、殺菌した水溶液（水溶性である場合）または分散液と、殺菌した注射用の水溶液または分散液をその場で調製するための殺菌粉末が挙げられる。静脈内投与に適した基剤としては、生理的食塩水、静菌水、クレモフォアEL（登録商標）（BASF社、パーシッパニー、ニュージャージー州、アメリカ合衆国）、リン酸緩衝液（PBS）が挙げられる。いずれの場合にも、組成物は殺菌状態でなくてはならず、しかも容易に注射器に入れられる程度の流動性を有する必要がある。組成物は製造条件と保管条件のもとで安定でなくてはならず、微生物（例えば細菌や真菌）の汚染作用から保護されていなくてはならない。
基剤としては、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）やこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体が考えられる。適切な流動性は、例えばコーティング（例えばレシチン）を利用することによって、あるいは必要な粒径を維持することによって（分散液の場合）、あるいは界面活性剤を用いることによって維持できる。微生物の作用を阻止するには、さまざまな抗菌剤や抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）を用いることができる。多くの場合、等張剤（例えば糖類、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウムなど）を組成物の中に含めることが好ましい。注射組成物が長時間にわたって吸収されるようにするには、吸収を遅延させる物質（例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチン）を組成物の中に含めるとよい。
例えば錠剤またはカプセル（例えばゼラチン・カプセル）の形態で経口投与するには、活性な薬剤成分を経口用の非毒性で薬理学的に許容可能な不活性な基剤（例えばエタノール、グリセロール、水など）と組み合わせることができる。さらに、望む場合や必要な場合には、適切な結合剤、潤滑剤、分解剤、着色剤もその混合物に組み込むことができる。適切な結合剤としては、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプン・ペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、天然の糖類（例えばグルコース、β-ラクトース）、トウモロコシ甘味剤、天然または合成のゴム（アラビアゴム、トラガカントゴム）、アルギン酸ナトリウム、
ポリエチレングリコール、蝋などが挙げられる。上記投与形態の製剤で用いる潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム塩とカルシウム塩、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。分解剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムデンプン、アルギン酸とそのナトリウム塩、発泡性混合物などが挙げられる。希釈剤としては、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリシンなどが挙げられる。
注射組成物は、等張水溶液または等張懸濁液であることが好ましく、座薬は脂肪エマルジョンまたは脂肪懸濁液から調製することが好ましい。組成物は、殺菌すること、および／またはアジュバント（例えば保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶液化促進剤、浸透圧を調節するための塩、緩衝液）を含むことができる。さらに、組成物は、治療に役立つ他の物質も含むことができる。組成物は、従来からある混合法、粉砕法、コーティング法のいずれかに従って調製する。組成物は、活性成分を約0.1〜75％、好ましくは約1〜50％含んでいる。
本発明の化合物は経口投与形態（例えば徐放や持続放出する錠剤またはカプセル、ピル、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ、懸濁液、シロップ、エマルジョンの形態）で投与することもできる。
液体、特に注射組成物は、例えば溶解、分散などによって調製することができる。活性化合物を薬理学的に純粋な溶媒に溶かすことにより、あるいは薬理学的に純粋な溶媒と混合することにより、注射溶液または注射懸濁液にする。溶媒としては、例えば水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどがある。さらに、注射前に液体に溶かすのに適した固体形態のものも作ることができる。注射組成物は、等張水溶液または等張水性懸濁液であることが好ましい。組成物は、殺菌すること、および／またはアジュバント（例えば保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶液化促進剤、浸透圧を調節するための塩、緩衝液）を含むことができる。さらに、組成物は、治療に役立つ他の物質も含むことができる。
本発明の化合物は、静脈内（ボーラスと輸液の両方）、腹腔内、皮下、筋肉内に投与することができる。どの場合にも、薬理学において当業者によく知られている形態を用いる。注射液は、従来からある溶液または懸濁液の形態にすることができる。
非経口注射投与物は、一般に皮下、筋肉内、静脈内への注射または輸液で利用される。さらに、非経口投与する1つの方法では、アメリカ合衆国特許第3,710,795号による徐放系または持続放出系を埋め込む。すると一定の投与レベルが保証される。なおこの特許の内容は、参考としてこの明細書に組み込まれているものとする。
さらに、本発明の好ましい化合物は、適切な鼻内ビヒクルを局所的に用いて鼻内に投与すること、あるいは当業者に周知の経皮パッチを用いて経皮投与することができる。経皮送達系の形態で投与するには、投与は、もちろん投与期間を通じて間欠的ではなく連続的になる。他の好ましい局所調製物としては、クリーム、軟膏、ローション、エーロゾル・スプレー、ゲルなどがあり、その場合の活性成分の濃度は、0.1〜15％w/wまたはw/vになろう。
固体組成物の賦形剤としては、医薬品質のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを使用することができる。上記の活性化合物は座薬の形態にすることもできる。そのためには、例えばポリアルキレングリコール（例えばプロピレングリコール）を基剤として用いる。いくつかの実施態様では、座薬を脂肪エマルジョンまたは脂肪懸濁液から調製することが好ましい。
本発明の化合物は、リポソーム送達系の形態（例えば小さな単層小胞、大きな単層小胞、多層小胞）で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、ホスファチジルコリンなどの多彩なリン脂質から形成することができる。いくつかの実施態様では、アメリカ合衆国特許第5,262,564号に記載されているように、脂質成分からなる膜を薬の水溶液で水和し、薬を包み込む脂質層を形成する。
本発明の化合物は、モノクローナル抗体を用いて送達することもできる。その場合、モノクローナル抗体は、化合物分子を結合させる個々の基剤となる。本発明の化合物は、可溶性ポリマーと結合させることもできる。そのようなポリマーとして、ポリビニルピロリドン、ピラン・コポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド-フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール、パルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンなどが挙げられる。さらに、本発明の化合物は、薬を制御放出するのに役立つ一群の生物分解性ポリマーと結合させることができる。そのような生物分解性ポリマーとしては、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシブチル酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、架橋した、または両親媒性のヒドロゲル・ブロック・コポリマーがある。
望むのであれば、投与する医薬組成物は少量の非毒性補助物質も含むことができる。そのような補助物質としては、例えば湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、他の物質（例えば酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンなど）がある。
この化合物を用いた投与計画は、さまざまな因子を考慮して選択する。因子としては、対象のタイプ、種、年齢、体重、性別、医学的症状；治療する症状の重さ；投与経路；対象の腎臓と肝臓の機能；用いる個々の化合物またはその塩などがある。一般の内科医または獣医は、症状進行の阻止、無効化、停止に必要な薬の有効量を容易に決定して処方することができる。
本発明の経口投与物は、経口投与で一般に用いられている任意の形態で提供することが好ましかろう。形態としては、例えば、分割式錠剤、徐放カプセル、液体充填カプセル、ゲル、粉末、液体がある。錠剤またはカプセルの形態で提供する場合には、1単位当たりの用量を周知の方法に従って変えることができる。例えば個々の投与量の中に活性成分を0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0、1000.0mg含めることができる。薬物治療（例えば本発明の薬物療法）における1日の投与量は、1日に1〜10錠、あるいはそれ以上にすることができることがよく知られている。
本発明の医薬組成物に含まれる化合物を1日に1回で投与すること、あるいは1日の合計投与量を1日に2回、または3回、または4回に分けて投与することができる。
上記のどの医薬組成物も、この明細書と請求項に具体的に記載した野生型AGR2ポリペプチド、タンパク質と断片、抗体、ならびにこれらをさまざまに修飾した形態を、0.1〜99％（w/wまたはw/v）、好ましくは1〜70％（w/wまたはw/v）含むことができる。
望むのであれば、医薬組成物はアジュバントとともに提供することができる。アジュバントについてはすでに説明した。いくつかの実施態様では、アジュバントを用いて免疫応答を増大させることができる。アジュバントとしては、宿主の種によって異なるが、フロイント（完全または不完全）アジュバント、無機ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、スカシガイのヘモシアニン、ジニトロフェノールなど）、役立つ可能性のあるヒト・アジュバント（例えばBCG（カルメット-ゲラン菌）、コリネバクテリウム・パルブム）などが挙げられる。一般に、動物に抗原を数回連続して注射する。その中には少なくとも3回のブースター注射が含まれることが好ましい。
遺伝子治療
本発明のさらに別の側面は、杯細胞の機能変化に伴う医学的症状で苦しんでいるヒト対象者の細胞、あるいは杯細胞の機能変化に伴う医学的症状が現われるリスクのあることがわかっているヒト対象者の細胞に、配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質をコードしているAGR2遺伝子の1つの対立遺伝子の配列、あるいは配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質とアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％一致するタンパク質をコードしている配列、あるいは上記の医学的症状がないヒト対象者または上記の医学的症状が現われるリスクを持たないことがわかっているヒト対象者のAGR2遺伝子の1つの対立遺伝子の配列を含むDNA構造体を送達する操作を含む遺伝子治療法である。
本発明には、上記のタイプの遺伝子治療法において、ヒト対象者の細胞に送達されるDNA構造体が、配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質をコードしているDNA配列、あるいは上記の医学的症状がないヒト対象者または上記の医学的症状が現われるリスクを持たないことがわかっているヒト対象者のAGR2遺伝子によってコードされているヒトAGR2タンパク質をコードしているDNA配列、あるいは配列番号3に従うマウスAgr2タンパク質または配列番号4に従うヒトAGR2タンパク質とアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％一致するタンパク質をコードしているDNA配列を含むことを特徴とする遺伝子治療法も含まれる。
DNA構造体が、本発明のアンチセンス核酸をコードしているDNA配列、あるいは上記の医学的症状がないヒト対象者または上記の医学的症状が現われるリスクを持たないことがわかっているヒト対象者のAGR2遺伝子によってコードされているmRNAと相補的な核酸配列を含むアンチセンス核酸をコードしているDNA配列を含むことを特徴とする方法も本発明に含まれる。
DNA構造体が、この明細書と請求項に記載したsiRNAをコードしているDNA配列を含むことを特徴とする方法も本発明に含まれる。
あるいはDNA構造体は、この明細書に記載したAGR2ムテインまたはAGR2野生型タンパク質と特異的に結合するアプタマーをコードしているDNAを含むことができる。
さらに別の一実施態様では、DNA構造体は、この明細書に記載したAgr2ムテインをコードしているDNA配列を含むことができる。
杯細胞の機能変化に伴う医学的症状で苦しんでいるヒト対象者、あるいは杯細胞の機能変化に伴う医学的症状が現われるリスクのあることがわかっているヒト対象者を治療するために上記のDNA構造体を用いる方法であって、そのDNA構造体をそのヒト対象者の少なくともいくつかの細胞、好ましくはその対象者の杯細胞に送達する操作を含む方法も本発明に含まれる。
AGR2の活性を変化させる方法と対応する用途
本発明のさらに別の側面は、ヒト対象者で杯細胞の機能変化に伴う医学的症状を予防、改善、治療する方法であって、そのヒト対象者のAGR2の活性（すなわちAGR2ムテインまたは野生型AGR2の活性）を変化させることのできる薬剤を含む医薬組成物をそのヒト対象者に投与する操作を含む方法である。この明細書全体で説明した杯細胞の機能変化に伴う医学的症状は、場合によっては、ブルンナー腺の腺上皮の増殖増大とも関係している可能性がある。
医学的症状は、粘液の産生低下と関係している可能性がある。その場合の医学的症状としては、例えばドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患（特にクローン病、潰瘍性大腸炎）、腸がんがある。
あるいは医学的症状は、粘液の産生増加と関係している可能性がある。その場合の医学的症状としては、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症がある。
AGR2の活性を変化させることのできる薬剤としては、この明細書と請求項に具体的に記載した薬剤の1つが考えられる。それは、例えば、この明細書に記載したムテイン、核酸（例えばムテインをコードしている核酸）、アンチセンス核酸、siRNA、AGR2ムテインに対するアプタマーやAGR2ムテインと特異的に結合するアプタマー、抗体、AGR2ムテインまたは野生型AGR2タンパク質の小分子アゴニストや小分子アンタゴニストのうちの1つである。
上記の医学的症状がAGR2遺伝子の対立遺伝子の一方における突然変異によって起こり、AGR2ムテインの発現が低下したり消失したりする場合には、そのAGR2ムテインに対するアンチセンス核酸、siRNA分子、アプタマー、アンチカリン、抗体が、治療上有効である可能性があることが理解できよう。あるいはAGR2の活性増大を特徴とするAGR2ムテインまたはそれをコードしている核酸を投与すること、あるいはAGR2（例えばその核酸によってコードされている内在性野生型AGR2または野生型AGR2）の発現を増大させうる核酸を投与することが、治療する上で同様に有効である可能性がある。
内在性AGR2タンパク質の量または活性が上記の医学的症状によって過剰になる場合には、AGR2の活性低下を特徴とするAGR2ムテインまたはそれをコードしている核酸を投与すること、あるいはAGR2（例えば突然変異した内在性AGR2または野生型AGR2）の発現を低下させうる核酸を投与することが、治療する上で同様に有効である可能性がある。
野生型AGR2タンパク質に関する薬剤も、例えば内在性AGR2の量または活性の低下がヒト対象者における上記医学的症状の原因である場合には、その医学的症状に苦しんでいるヒト対象者に投与すると同様に好ましいことが理解できよう。したがって野生型AGR2タンパク質を、あるいは野生型AGR2タンパク質と一部のアミノ酸配列が一致していて、すでに説明したどのインビトロ・アッセイでも同じか実質的に同じ生物学的活性を示すタンパク質（またはそのようなタンパク質の断片または融合体）を、そのような症状に苦しんでいるヒト対象者に投与すると好ましい可能性があることが理解できよう。この場合に適切なタンパク質は、例えばそうしたインビトロ・アッセイの助けを借りて容易に決定することができる。
内在性AGR2の過剰または活性がヒト対象者における医学的症状の原因である場合には、野生型AGR2タンパク質に対するアンチセンス核酸、siRNA分子、アプタマー、アンチカリン、抗体を治療に使用できることもわかるであろう。
当業者は、所定のAGR2ムテインの活性を明らかにするのに、あるいはそのようなAGR2ムテインまたは野生型AGR2タンパク質に関する薬剤の効果を明らかにするのに、この明細書に記載したインビトロ・アッセイを利用できることが理解されよう。当業者であれば、この情報に基づき、治療すべき疾患状態と関係する適切な薬剤を選択して同定することが容易にできるであろう。
アッセイと診断
本発明の動物は、粘液の産生および／または機能の変化という異常に関係する多数の症状を特徴とする表現型を示す。したがって本発明のモデル動物は、そのような疾患を研究するための特に適切なモデルになる。疾患としては、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、嚢胞性線維症、ドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患、悪性疾患（例えば結腸直腸がん）などがある。
本発明の動物を利用してAGR2の不足に関連する疾患の初期診断マーカーを同定することもできる。不足という用語は、タンパク質の機能がプラス（=機能の増大）とマイナス（=機能の低下）の両方向に変化することを意味する。代替マーカー（例えばリボ核酸またはタンパク質）は、従来技術で知られているプロテオミクス分析または遺伝子発現分析の手続きを実施することによって同定できる。例えばプロテオミクス分析の手続きとしては、AGR2の活性不足または活性増大に伴う疾患の進行またはその症状のいろいろな時期または段階にあるあらゆる臓器サンプルまたは組織サンプル（例えば血液サンプルまたはその誘導体（好ましくは血漿））に関するELISA、2D-ゲル、タンパク質マイクロアレイ、質量分光分析などがある。さらに別の一例として、遺伝子発現分析の手続きには、例えば、AGR2の活性不足に伴う疾患の進行またはその症状のいろいろな時期または段階にあるあらゆる臓器サンプルまたは組織サンプル（例えば血液サンプルまたはその誘導体）からのリボ核酸種の品質と量に関するディファレンシャル・ディスプレイ分析、cDNAマイクロアレイ分析などがある。
本発明のモデル動物を用い、上記の疾患や異常の予防または治療に有効な薬剤の活性をモニターすることができる。テストする薬剤を本発明の動物に投与し、さまざまな表現型パラメータを測定したりモニターしたりすることができる。さらに別の一実施態様では、本発明の動物を用い、AGR2の不足または過剰発現に伴って現われることがわかっている何らかの異常または症状に対する治療薬をテストすることができる。
本発明の動物は、AGR2の不足に伴う上記疾患を促進または深刻化することが疑われる化学物質やペプチドなどの材料（特に医薬）をテストするためのモデル系として利用することもできる。その材料のテストは、例えば本発明の動物を、そのような材料のいろいろな組み合わせに時間、投与量を変えて曝露し、本発明の動物の表現型に対する効果（例えば杯細胞の機能変化、すなわちムチンの適切な産生）をモニターすることによって実施できる。さらに、本発明の動物を利用してAGR2経路のメカニズムを解明することもできる。すなわち、AGR2の活性によって調節されたり、AGR2の活性不足または活性増大に伴う異常において下方調節されたりする受容体や、下流の遺伝子またはその遺伝子によるタンパク質を同定することもできる。これは、例えば、AGR2を発現してAGR2に対する刺激に応答する本発明の動物の組織に関する2Dゲル分析、タンパク質チップ・マイクロアレイ、質量分光分析などの方法を利用したディファレンシャル・プロテオミクス分析によって実現できる。
生物サンプルの中にAGR2ムテインが存在しているか不在であるかを検出する方法の一例は、生物サンプルをテスト対象から取得し、その生物サンプルを、AGR2ムテインをコードしているAGR2タンパク質または核酸（例えばmRNA、ゲノムDNA）を検出できる化合物または薬剤と接触させ、AGR2の存在を生物サンプル中で検出する操作を含んでいる。AGR2ムテインのmRNAまたはゲノムDNAを検出する薬剤は、AGR2ムテインのmRNAまたはゲノムDNAとハイブリダイズすることのできる標識した核酸プローブである。
この明細書に記載した診断法を利用し、AGR2の異常な発現または活性に伴う疾患または異常を有する対象、あるいはAGR2の異常な発現または活性に伴う疾患または異常が進行するリスクを有する対象を同定することもできる。例えばこの明細書に記載したアッセイ（例えば上記の診断アッセイまたは以下に示すアッセイ）を利用し、AGR2タンパク質やAGR2核酸の発現または活性に伴う異常を有する対象、あるいはAGR2タンパク質やAGR2核酸の発現または活性に伴う異常が進行するリスクを有する対象を同定することもできる。あるいは予後アッセイを利用し、疾患または異常を有する対象、あるいは疾患または異常が進行するリスクを有する対象を同定することもできる。したがって本発明により、テスト・サンプルを対象から取得し、AGR2タンパク質またはAGR2核酸（例えばmRNA、ゲノムDNA）を検出することでAGR2の異常な発現または活性に伴う疾患または異常を同定する方法が提供される。この方法では、AGR2タンパク質またはAGR2核酸が存在していると、AGR2の異常な発現または活性に伴う疾患または異常が進行するリスクを対象が有すると診断される。この明細書全体を通じて使用する“テスト・サンプル”は、興味のある対象から得られる生物サンプルを意味する。例えばテスト・サンプルとしては、体液（例えば血液、血漿、血清）、細胞サンプル、組織サンプルが考えられる。
さらに、この明細書に記載した予後アッセイを利用し、AGR2の異常な発現または活性に伴う疾患または異常を治療するのに対象に薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、他の薬剤候補）を投与できるかどうかを調べることができる。例えばこのような方法を利用し、ある疾患のためのある薬剤を用いて対象を効果的に治療できるかどうかが調べられる。
AGR2の活性（例えばAGR2遺伝子の発現）に対して促進効果または抑制効果を有する薬剤またはモジュレータで、この明細書に記載したスクリーニング・アッセイによって同定したものを個人に投与し、AGR2による疾患に対処（予防または治療）することができる。治療薬の代謝の違いで薬理学的に活性な薬の投与量と血中濃度の関係が変わるため、大きな毒性が現われたり、治療が失敗したりする可能性がある。したがって個人の薬理ゲノミクスがわかると、個人の遺伝子型を考慮して予防または治療に有効な薬剤（例えば薬）を選択することができる。このような薬理ゲノミクスを利用し、適切な投与量と治療計画を決めることもできる。したがって、一人の人におけるAGR2タンパク質の活性、AGR2核酸の発現、AGR2遺伝子に含まれる突然変異の量を明らかにすることで、その人の治療または予防に適した薬剤を選択することができる。
本発明により、AGR2の活性不足または活性増大の診断法も提供される。患者のペプチド材料（特に血液、血清、血漿の中にあるペプチド材料、または血液、血清、血漿に由来するペプチド材料）を分析し、本発明による1つ以上のアミノ酸配列を探す。ペプチド材料は、直接分析してもよいし、標準的な方法で抽出、単離、精製した後に分析してもよい。
本発明の一実施態様では、診断法は、配列番号4に示したアミノ酸配列の位置137に対応する位置にアミノ酸置換があることに伴う変化を有するAGR2を同定する操作を含んでいる。本発明の診断法には、変化したAGR2の活性が元のAGR2の作用と競合してその作用を阻止することを検出する操作を含む方法も含まれる。変化したAGR2を同定する方法としては、本発明のアミノ酸配列が野生型AGR2と比べて立体配座に関してどのように変化したかを明らかにすることのできる公知のあらゆる方法がある。方法としては、修飾されたタンパク質を他のタンパク質（特に抗体）で特異的に認識する方法；公知のプロテアーゼまたは化学物質で個々のアミノ酸配列または組み合わせたアミノ酸配列を消化させる方法などがある。同様の別の実施態様では、別のタンパク質が修飾されたタンパク質を認識できないことを利用する。その具体例は、配列番号4の位置137を含む野生型AGR2のエピトープに対する抗体と、AGR2のうちで野生型AGR2の分子表面のこの部分が認識されるか関与するAGR2受容体である。
本発明のさらに別の一実施態様では、診断法の原理は、本発明の変化したAGR2をコードしている核酸配列の検出である。その方法としては、例えば、核酸がハイブリダイズする性質を利用した公知のあらゆる方法がある。それは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法、ノーザン・ブロット法、サザン・ブロット法、マイクロアレイと公知の制限酵素による核酸消化パターンを利用した核酸（ゲノムDNA、cDNA、mRNA、合成オリゴヌクレオチド）で標準的な方法である。
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明する。しかし請求項に記載した本発明がこれら実施例に限定されることはない。以下の実施例は、説明だけを目的として提供したものであり、本発明の範囲を制限することはまったく意図していない。本発明の特徴と利点は、以下の実施例から明らかになろう。
突然変異を起こさせた動物を作るためのENU（エチル-ニトロソ-尿素）処理
変異体を作るため、オスのC3HeB/FeJマウス（ザ・ジャクソン・ラボラトリー社、バー・ハーバー、メイン州、アメリカ合衆国）の腹腔内にエチル-ニトロソ-尿素（ENU）（セルヴァ・エレクトロフェオレシス社、ハイデルベルク、ドイツ国）を体重1kgにつき90mgの投与量で3回（年齢が8〜10週のときに一週間間隔で）注射した。注射されたオスのマウスを、最後の注射を行なってから50日後、メスの野生型C3HeB/FeJパートナーと定期的に交配させた。得られたF1子孫（100匹まで）に関して優性表現型を分析した。
F3子孫の作製 - 交配スキーム
図3Aに示した交配スキームを利用してF3子孫を作る。交配パートナーはすべて年齢が8週間を超えていた。メスは年齢が8〜12週間で、オスは年齢が8〜16週間であることが好ましかった。
F1動物の作製（db1）
上記のようにして作ったそれぞれのENU-オスを用いて30匹を超えるオスの子どもと30匹を超えるメスの子どもを作り、以下に説明するようにして異種交配させた。
F2動物の作製（rf1）
毎週、20組の交配を設定し、1匹のオスF1（db1）×1匹のメスF1（db1）から20組の家系を作った。交配させる一組のマウスは、異なるENUマウスの子どもである（交配型：rf1）。
F3動物の作製（rbs）
年齢8週間のrf1マウスを、1つの家系につき1回、F2（オス1匹）×F2（メス1匹）の形で交配させる（交配型：rbs）。それぞれのrbs交配から、少なくとも15匹の子どもが生まれる。最も若いrbsマウスのスクリーニングを終えるまでrf1-メスを生かしておく（年齢=160日）。子どもの数が15匹に達した後にrf1-オスを安楽死させて凍結する。F3動物を最初のスクリーニングで分析する。
最初のスクリーニングとしてF3動物に対して一連のテストを行ない、関係する表現型を同定した。本発明に関しては、下痢の観察と一般的な組織学的検査の結果から、F3集団内で異常な表現型を同定するための情報が得られた。
突然変異動物の生理学的特徴
巨視的な評価から、遺伝的背景がC3Hの同系交配におけるホモのMTZ子孫は100％、下痢をしていることが目で観察され、繁殖能力が欠けていることがわかる。繁殖能力の欠陥は、同じ出産で生まれた野生型マウスと比べて少ない体重と短い体長に現われていた。
突然変異動物の剖検と臓器の組織学的検査
目に見える下痢と繁殖能力の欠陥があったことから、次にMTZマウスの小腸を検査した。
例えばMTZマウスからの大腸壁の切片をヘマトキシリン／エオシン染色したもの（図11）、またはレクチン染色したもの（図13）を組織学的に調べると、杯細胞で前ムチン貯蔵顆粒が非常に少なくなっており、その結果として粘液の分泌が減り、大腸粘膜上皮と粘膜下組織に二次炎症性浸潤が現われる（図12に星印で表示）。さらに、大腸粘膜のわずかな糜爛が検出される（図12に矢印で表示）。パネス細胞と腸クロム親和細胞は影響を受けない。
正常なAGR2タンパク質がないことで杯細胞が機能不全になるという観察は、ネズミ類Agr2のmRNAを発現する他の粘膜器官（例えば目、鼻、気管、肺、食道、唾液腺、胃、小腸、直腸、胸腺、精巣、精巣上体、子宮、胎盤）にも拡張される。そのことはPCRからわかる。これについては実施例6で説明してあり、図6にも示してある。ヒトmRNAのノーザン分析により、杯細胞を有する胃腸管、気道のすべての組織と器官においてと、前立腺、子宮頸において、Agr2 mRNAの発現が確認された。そのことは、実施例8に説明してあり、図8にも示してある。
MTZマウスは、大腸に関して説明した杯細胞の表現型に加え、ブルンナー腺が膨張し、腺上皮の増殖が増える。ブルンナー腺の近くに位置する十二指腸上皮は、図14に示したように、杯細胞が失われていること、上皮が増殖していること、わずかな炎症の徴候があることを特徴とする。ブルンナー腺におけるAGR2 mRNAの発現は、RNAインサイチュ-ハイブリダイゼーション法で検出した。
本発明の突然変異動物における突然変異のマッピングとクローニング
1． あとで染色体マッピングを行なうためのF5異系交配マウスの作製
図3Bに示したスキームに従ってF5子孫を作る。これは、表現型が明らかになったF3突然変異体をC57B1/6マウスと交配させてF4異系交配マウスを得る操作を伴う。次に、F4子孫を異種交配させてF5世代を得る。以前に説明したパラメータに従ってF5世代の表現型を調べる。MTZ系の2匹のF3マウスから出発し、40匹のF4マウス（オス22匹、メス18匹）と236匹のF5マウス（オス115匹、メス121匹）を得た。F5異系交配マウスを用い、マウスのゲノムにENU突然変異を起こすMTZ表現型の位置を突き止めた。
2．囓歯類の尾からのDNA単離
マウスの尾の切れ端1cm分から、“DNイージー96組織キット”（キアジェン社、ヒルデン、ドイツ国）を製造者のプロトコルに従って使用し、マウスのゲノムDNAを精製した。
3．大まかなマッピング
F5異系交配マウスでは、C57B1/6対立遺伝子とC3H対立遺伝子の頻度は、遺伝のメンデルの法則に従うと平均で1：1である。表現型がプラスであるマウスのグループと表現型がマイナスであるマウスのグループで操作することによってこの比が表現型の近傍のマーカー位置でだけ変化し、その比は、表現型がプラスのグループでは0：1に、表現型がマイナスのグループでは1：0に近づく。表現型がプラスのF5異系交配マウスのグループでマーカー（例えばSSLP、SNP）を含む分散ゲノムについて対立遺伝子頻度分析を行なうと、突然変異部位は比C3H：C57B1/6が3を超える値として示される。
MTZマウスの分析を行ない、C3H系を表わす単一ヌクレオチド多型（SNP）について対立遺伝子の頻度が増大している染色体遺伝子座を探した。この分析におけるマーカーは、C3H系とC57B1/6系の間で90個のSNPであり、これらSNPはマウスの19個の常染色体に均等に分布していた。MTZ表現型を探すため、14匹のF5異系交配マウスからのプールした尾のDNAサンプルに対して2段階で分析を行なった。第1段階は競合PCRであり、その後、第2段階のSNP対立遺伝子頻度測定をPCR産物混合物に対してパイロシークエンシング法によって行なった（PSQ96系；http://www.pyrosequencing.com/pages/ applications.html）。
プールした尾のDNA（1ml、10μg/ml：10μg/マウス14匹=0.71μg/マウス（濃度を大まかに判定し、アガロース・ゲルで調節して基準と比較）、プールしたもの、全量1ml）を、あらかじめSNPマーカーPCRプライマーを（ウエル1つにつきSNPが1個の割合で）入れた96ウエルのプレートに分配した。標準的なPCR反応を行なわせた（容積50μl）。2つのSNPプライマーの一方をビオチニル化した。これは次にパイロシークエンシング法で一本鎖PCR産物を精製するのに必要である。一本鎖（ss）PCR産物を精製し、パイロシークエンシング・キット（PSQ96SNP試薬キット、5×96）とともに提供された指示に従ってssPCR産物上のSNPの位置を狭い範囲でシークエンシングした。SNP配列の多型bp位置に得られるピークは、元のDNAプールに存在していたこの対立遺伝子の量と相関している。そのピークをPSQ96データバンクから取り出し、エクセルのマクロに入れて処理した。
エクセルのマクロでは、すべてのSNP位置におけるC3H/BL6ピーク高の比を式：（ピーク高CH3／ピーク高BL6）／定数個々のSNPに従って計算した。定数個々のSNPは、さまざまなSNP位置でのCH3／BL6ピーク高という比を比較しやすくするためのものである。定数個々のSNPは、ヘテロ接合C3H／C57B1/6マウス（F1異系交配マウス）のピーク高CH3／ピーク高BL6の平均値である。この値は、個々のSNPすべてについて9回（3日間に3回ずつ）の測定を行なって実験的に決定したものであり、理論上は1に近いことが予想されるが、実際には1と異なることがしばしばある。最後に、エクセルのマクロから、CH3／BL6ピーク高という比の計算値をもとにしたグラフを出力させた（図4）。このグラフでは、値が3を超える領域が、突然変異している染色***置であることを示している。
MTZ表現型がプラスであるDNAプールを分析した結果は、第12染色体で3を超える大きな値であることを示しており、突然変異が第12染色体の0〜30cMにあることが特定された。
4．細かいマッピング
この最初のマッピング結果は、第12染色体上の重要な領域に位置するマイクロサテライト・マーカーを用いて合計で236匹のF5異系交配MTZマウスについてマウス1匹のレベルのハプロタイプ分析を行なうことによって確認した。それに続き、それぞれの領域に染色体の切断点を有するマウスをもとにして候補領域のマッピングを洗練させた。最終的に、分析によって突然変異の位置が、SNPマーカーIdb2（配列番号11、プライマーは配列番号12、13）とD12Mit64（配列番号14、プライマーは配列番号15、16）の間の約25.7Mbpの間隔に狭まった。MTZマウス#764（プラスの表現型）ではIdb2という近位領域が除外されているのに対してMTZマウス#799と#899（どちらもプラスの表現型）ではD12Mit64という遠位領域が除外されているため、これは明らかであった（図5）。その結果、これらマーカーの間に全体または一部が位置する遺伝子が突然変異を含んでいる可能性があるという結論になる。
マーカーIdb2とD12Mit64の間のゲノム間隔を走査し、マウスとヒトの公開データベースを詳細に分析することによって遺伝子を探した。注釈付きのいくつかの遺伝子がこの領域内に記録されていた。それらのうち、同定されたAGR2遺伝子は杯細胞で発現することが知られていたため、突然変異探しに最も関係のある候補遺伝子の1つであると考えられた。
5．マウスAgr2遺伝子のPCR増幅とシークエンシング
ゲノム構造と、AGR2エキソンの正確な位置と、AGR2タンパク質（配列番号3）をコードしているオープン・リーディング・フレーム、ポリアデニル化シグナル、ポリAストレッチを含む想定される完全長cDNA（配列番号6）とを、公開されているマウスAgr2 cDNA配列（GenBank登録番号NM_011783）とマウスのゲノムDNAデータ（アンサンブル、2002年2月時点のマウス・アセンブリー）から導き出した。同じことをヒトAGR2（GenBank登録番号NM_006408）について行なった。マウスAgr2に関しては、8個のエキソンが、サイズ、配列、ゲノムの文脈、染色体エキソンの分布に関してヒトAGR2遺伝子と非常によく似ていることを明らかにできた（図1Bを参照のこと）。これは、進化するときにマウスAgr2とヒトAGR2の機能が保存されたことを示している（図1を参照のこと）。
BioTherme-DNA-ポリメラーゼ（ジーンクラフト社、ドイツ国）を製造者のプロトコルに従って使用してAGR2遺伝子のゲノムDNA断片を取得した。公開されているプライマー設計プログラム（プライマー3、www.genome.wo.mit.edu）を利用してオリゴヌクレオチド・プライマーを設計し、AGR2のエキソンに対して特異的な一連のオリゴヌクレオチド・プライマーを作った。増幅に用いるプライマーを配列番号17〜28に示してある（プライマー配列番号17と18を用いてエキソン2を増幅し、プライマー配列番号19と20を用いてエキソン3+4を増幅し、プライマー配列番号21と22を用いてエキソン5を増幅し、プライマー配列番号23と24を用いてエキソン6を増幅し、プライマー配列番号25と26を用いてエキソン7を増幅し、プライマー配列番号27と28を用いてエキソン8を増幅し、エキソン1は非コード・エキソンであるためシークエンシングしなかった）。QIAクイックPCR精製キット（キアジェン社、ヒルデン、ドイツ国）を製造者のプロトコルに従って使用し、PCRで増幅した産物を精製した。順／逆PCRプライマーと“ビッグ・ダイ”熱サイクル・シークエンシング・キット（ABIプリズム、アプライド・バイオシステムズ社、フォスター・シティ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を用いてPCR産物のシークエンシングを行なった。反応生成物をABI 3700 DNAシークエンシング装置で反応生成物を分析した。
6．配列の分析
配列を手で編集し、シークエンサー、バージョン4.0.5（ジーン・コーヅ社、アン・アーバー、ミシガン州、アメリカ合衆国）というソフトウエアでさまざまな配列断片を組み立てて1つの連続配列にした。MTZ表現型がプラスのホモ接合F2異系交配マウスとヘテロ接合マウスについてAGR2遺伝子のシークエンシングを行なった。両方の場合でCH3マウスとC57B1/6マウスの配列を対照として用いた。シークエンシングの結果は、エキソン2〜6とエキソン8に突然変異がないことを示していた。しかしエキソン7で配列ATCCCTGACGGTGAGGGCAGAC（配列番号6参照）の下線部TがA（配列番号1）になる一塩基交換があったため、ヘテロ・マウスではA/T二重ピークになり、ホモMTZマウスでは純粋なAであった。この突然変異は、MTZ表現型がプラスのテストしたすべてのマウスで確認された。候補領域内の他の遺伝子からのコード領域をシークエンシングしたところ、他の突然変異はないことがわかった。
突然変異が同定された結果として、コドンGTGがGAGに変化しており、突然変異したAGR2タンパク質は、野生型（突然変異していない）タンパク質における非極性のバリン（V）の代わりに帯電したグルタミン酸（E）を位置137に有する。
本発明の突然変異動物を遺伝子ターゲティング法で作る方法
マウスAgr2遺伝子のエキソン7に点突然変異を挿入するための組み換えターゲティング・ベクターを作るには、周知の方法を利用することができる。例えばNehlsとWattler（WO 01/75127）のλ-KO-Sfi系がある。
1．ベクターの構成
第1ステップでは、1.5kbpのゲノムDNA断片をPCRで増幅する。この断片は、構成するターゲティング・ベクターの左アームと相同である。その後PCR断片のサブクローニングを行なってプラスミド・ベクター、すなわちpCR2.1-TOPO（K4500-01、インヴィトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）に製造者の指示に従って入れた後、正しいAGR2挿入体を有するプラスミドDNAに対し、クイックチェンジ部位指定突然変異キット（200518、ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を製造者の指示に従って用いて部位指定突然変異を起こさせる。要するに、プラスミド・ベクター（親DNA鋳型）と2つのオリゴヌクレオチド・プライマー（それぞれのプライマーはベクター挿入体の反対側の鎖と相補的であり、望む点突然変異（AGR2のcDNAのエキソン7、位置462）を含んでいる）を変性させ、キットに備わっているプルーフ・リーディングDNAポリメラーゼ（Pfuターボ）を用いてPCRで増幅する。PfuターボDNAポリメラーゼの非鎖置換作用を利用して突然変異誘発プライマーを組み込んで延長させ、切れ目の入った環状DNA鎖にする。DpnIを用いた制限消化では、メチル化された親DNA鋳型だけがDpnIにより消化される。キットに付いているXL1-ブルー超コンピテント細胞の中で形質転換を行なった後、突然変異した（点突然変異）プラスミドDNAの切れ目を修復する。突然変異に関してプラスのコロニーを選択し、プラスミドDNAを製造者（ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）の指示に従って単離する。
本発明で説明したようにエキソン7に点突然変異を有するプラスミドDNAを、公開特許出願WO 01/75127に記載されているように、SfiC配列またはSfiA配列がそれぞれ張り出したプライマーを用いてPCRで増幅する。この特許出願に記載されているようにして、相同部の左アームを表わすPCR断片をさらに処理する。WO 01/75127に記載されているベクターとしては、スタッファ（stuffer）断片と、大腸菌の複製起点と、細菌を選択するための抗生物質耐性遺伝子と、哺乳動物の細胞で用いるのに適した2つのネガティブ選択マーカーと、cre組み換え酵素によって線状λファージを多数の複製プラスミドに変換するためのLoxP配列とを含む線状λベクター（λ-KO-Sfi）がある。最終的なλターゲティング・ベクターでは、上記の特許出願に記載されているように、スタッファ断片が、（エキソン7の中にAGR2点突然変異を有する）相同部の左アームのSfi A、B、C、D連結部、ES細胞選択カセット、相同部の右アームによって置き換えられている。連結産物の試験管内パッケージング、ファージ・ライブラリのプレーティング、プラスミドの変換、相同的組み換えプラスミド・ベクターのDNA単離を、当業者に知られている標準的な手続きに従って行なう。
2．ES細胞の形質転換とマウスの作製
点突然変異を有するターゲティング・ベクターを用いてマウスES細胞の形質転換を行ない、従来技術でよく知られている標準的な方法を利用して胚盤胞の注入と移入を行なうことにより、キメラ・マウスを作製する。キメラを野生型マウスと交配させて生殖系列の伝達を調べる。ヘテロ接合体を、それに続いてホモ接合体を、周知の方法に従って作る。
ネズミ類AGR2の発現
ネズミ類AGR2遺伝子の細胞RNA発現パターンを同定するため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を利用した。マウスの異なる組織または異なる成長段階からの48種類の組織cDNAを利用した。組織は以下のものである：脳全体、大脳、大脳左半球、大脳右半球、小脳、延髄、脊髄、甲状腺／気管、嗅葉、肺、舌、食道、唾液腺、胃、下垂体、膵臓、小腸、大腸、目、虫垂、鼻上皮、直腸、気管、胸腺、心臓、子宮、腸間膜、胎盤、胆嚢、胸骨、肝臓、骨髄、脾臓、全血、腎臓、皮膚、副腎、脂肪組織、膀胱、骨格筋、精巣、ES細胞、精巣上体、前立腺、5.5日目の胚 、9.5日目の胚、13.5日目の胚頭部、13.5日目の胚本体、18.5日目の胚頭部、18.5日目の胚本体、10〜12日目の胚（アンビオン社）、cDNAプール。負の対照は水である。
使用するプライマーは、mAgr2-7 5'-CAGACCCTTGATGGTCATTC（配列番号7）と、mAgr2-2 5'-GTCTCCTGACCCGGTGCGCAG（配列番号8）である。長さが349bpのPCR産物は、マウスAgr2に対して特異的なPCR産物である。そのことは配列分析によって確認される。図6に示したように、マウスAgr2の発現が以下の細胞および器官で確認された：延髄、目、鼻上皮、気道、甲状腺、肺、食道、唾液腺、胃、小腸、大腸、虫垂、直腸、胆嚢、精巣、精巣上体、子宮、胎盤、5.5日目の胚 、13.5日目の胚。
ヒトAGR2の発現
ヒトAGR2遺伝子の細胞RNA発現パターンを同定するため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を利用した。ヒトの異なる組織からの29種類の組織cDNAを利用した。組織は以下のものである：脳全体、大脳、気管、肺、食道、胃、唾液腺、膵臓、大腸、直腸、胸腺、心臓、心膜、肝臓、胎児の肝臓、脾臓、腎臓、副腎、膀胱、子宮、子宮頸、胎盤、***、乳腺、精巣、前立腺、皮膚、脂肪組織、骨格筋。使用するプライマーは、hAGR2-1 5'-GAACCTGCAGATACAGCTCTG（配列番号9）と、hAGR2-4 5'-CACACTAGCCAGTCTTCTCAC（配列番号10）である。長さが170bpのPCR産物は、ヒトAGR2に対して特異的なPCR産物である。そのことは配列分析によって確認される。図7に示したように、ヒトAGR2の強い発現が以下の組織で確認された：気管、胃、唾液腺、大腸、直腸、腎臓、子宮、子宮頸、乳腺、前立腺。
両方の遺伝子、すなわちマウスAgr2とヒトAGR2の組織特異的発現プロファイルは非常に似ている。
ノーザン・ハイブリダイゼーションで分析したヒトAGR2 mRNAの組織特異的発現
ヒトAGR2特異的DNAプローブを使用し、ヒトのいくつかの組織に由来するポリA+RNAのノーザン・ハイブリダイゼーションを実施した。このプローブは、AGR2のオープン・リーディング・フレームを含むプライマーhAgr2-3（配列番号31）とhAgr2-4（配列番号32）を用いて作ったPCR産物を精製して配列を確認したものに放射性標識して作った。このプローブは長さが532bpであった（配列番号33を参照のこと）。市販されている複数組織ノーザン・ブロット（4つの異なるMTNブロット（MTN1、MTN2、MTN3、MTN4）で、それぞれのレーンにポリA+RNAが3μg含まれている：バイオチェーン・インスティチュート社、ヘイウォード、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）と、ヒト消化系12レーンMTN（MTN12）ブロット（それぞれのレーンにポリA+RNAが3μg含まれている：クロンテック／ベクトン・ディキンソン社、サンノゼ、アメリカ合衆国）を、製造者の指示に従ってハイブリダイズさせた。
これらブロットを最適化して1.0〜4.0kbの範囲で最高の分解能になるようにし、9.5、7.5、4.4、2.4、1.35、0.24kbのマーカーRNAを基準として走らせた。膜に30分間にわたってあらかじめハイブリダイズさせ、ExpressHybハイブリダイゼーション溶液（クロンテック・ラボラトリーズ社、パロ・アルト、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）の中で製造者の指示に従って68℃にて一晩にわたってハイブリダイズさせた。使用したDNAプローブは、ランダム・プライマー標識キット（メガプライムDNA標識系；アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、アメリカ合衆国）を用いて[α-32P]dCTPで標識した。このDNAプローブは、比活性が1×109dpm/μgであった。ブロットを2×SSC、0.05％SDSの中で室温にて30〜40分の間に数回洗浄した後、0.1×SSC、0.1％SDSの中で50℃にて40分間洗浄した（Sambrook他、1989年、『分子クローニング：実験室マニュアル』、コールド・スプリング・ハーバー出版、ニューヨーク州を参照のこと）。ブロットを家庭にある普通のプラスチック・ラップで覆い、2つの増感スクリーンとともに-70℃にて18時間にわたってX線フィルムに曝露した。
クロンテック／ベクトン・ディキンソン社のヒト消化系12レーンMTN（MTN12）ブロットとバイオチェーン・インスティチュート社の複数組織ノーザン・ブロットに現われた組織は以下の通りである。
Figure 2006526383
この実験の結果は、ヒトAGR2のmRNAが、胃、十二指腸、回腸部、回腸、下行結腸、横行結腸、盲腸、直腸で強く発現していることを示している。より弱い発現は、肺、子宮頸、前立腺で検出される（図8を参照のこと）。2つの異なるポリアデニル化シグナルを用いると、長さが950ヌクレオチドと1800ヌクレオチドのAGR2転写産物が得られる。
ヒトAGR2タンパク質とマウスAgr2タンパク質の特徴と組織特異的発現
マウスAgr2タンパク質のヒト・オルソログであるヒトAGR2タンパク質は、長さが175アミノ酸残基である（対応するマウスのタンパク質は175アミノ酸残基）。図2には、マウスAgr2とヒトAGR2のアミノ酸のアラインメントを示してある。アミノ酸が91％一致しており、これは両者がオルソログであることを示している。
実施例11と図10に示してあるように、マウスAgr2タンパク質が、抗マウスAgr2抗血清を用いて杯細胞で検出された。杯細胞の特異性を抗TFF3抗体（親切にもW. Hoffmanm（マグデブルク大学付属病院、ドイツ）から提供された）を用いて確認した。インサイチュ・ハイブリダイゼーションによってブルンナー腺でのAgr2タンパク質の発現を確認した（データは示さず）。
クローニングしたヒトAGR2とマウスAgr2の発現ベクターへの導入
野生型AGR2と突然変異体AGR2を細菌細胞または真核細胞で発現させるためには、標準的なクローニング法とトランスフェクション法を利用してcDNAをクローニングして発現ベクターに入れることができる。これらの方法は、例えばSambrook他編、『分子クローニング：実験室マニュアル』（第2版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、1989年；Ausbel他編、『分子生物学の最新プロトコル』、ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1993年に記載されている。好ましい方法は、cDNAをサブクローニングし、ゲートウェイ・クローニング／発現系（インヴィトロジェン社、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）の発現ベクターの中に製造者の指示に従って入れる方法である。
組み換えAGR2を宿主細胞から精製するには当業者によく知られている方法を利用することができる。標準的な参考文献としては、上記のものを参照のこと。
AGR2エピトープに対して特異的な抗体の製造方法
AGR2に対して特異的な抗体を周知の方法に従って製造した。その方法は、例えば、この明細書に、あるいはPaul Suhir、『抗体工学のプロトコル』、ヒューマナ出版、1995年；William C. Davis編、『モノクローナル抗体の製造』、ヒューマナ出版、1995年に記載してある。
1．抗原の調製
動物を免疫状態にする抗原を得るには、標準的な方法に従って組み換えAGR2タンパク質またはその断片を原核細胞または真核細胞の中で発現させ、細胞ライセートから精製するとよい。その方法は、例えば、Joseph Sambrook他、『分子クローニング：実験室マニュアル』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、第3版、2001年と、実施例10に記載してある。あるいは、Schnolzer他（1992年）が記載しているように、AGR2の一部と約60残基まで一致する配列、好ましくは15〜25残基が一致する配列に対して特異的なペプチドを合成し、C末端またはN末端に付加したシステインを通じてスカシガイのヘモシアニン（KLH）またはウシ血清アルブミン（BSA）と結合させた。免疫状態にするためのペプチドは、AGR2のアミノ酸配列の任意の部分に由来するものが可能であるが、（例えばヨーロッパ分子生物学オープン・ソフトウエア・セットの配列分析ツールを用いて予測されるように）このタンパク質の表面に局在する確率が大きく、公知の他のタンパク質との配列相同性が少ない領域からのものであることが好ましい。好ましいペプチドは、TVKSGAKKDPKDSRPKLPQ（配列番号34）である。
2．免疫感作
動物の体内で抗体を産生させるため、担体タンパク質に結合させた合成ペプチド、または精製した組み換えタンパク質をその動物に皮下注射した。マウスまたはウサギでは、抗体を100〜200μg使用した。抗体を適切なアジュバントに溶かし、最終体積を動物1匹につき約200μlにした。アジュバントは、1回目の注射用には完全フロイント・アジュバント（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）、以後のすべての注射用には不完全フロイント・アジュバント（シグマ社）が好ましい。
数週間後、複数回のブースター注射を行なった。ブースター注射は、最初に注射してから5、9、13週間後が好ましい。4回目の注射を行なってからしばらくして（10日後が好ましい）、動物を麻酔し、心臓穿刺によって安楽死させた。血清を分離した。
ウエスタン・ブロット分析。AGR2は、培養した大腸がん細胞から放出された分泌タンパク質である。
ウエスタン・ブロット分析を、Ausbel他編、『分子生物学の最新プロトコル』、ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1993年に記載されているようにして実施した。AGR2タンパク質を、実施例11に記載したように抗マウスAGR2抗血清を用いて検出した。ヒト大腸がん細胞系Caco-2（ATCC番号HTB-37）、HT-29（ATCC番号HTB-38）、LS 174T（ATCC番号CL-188）が、ヒトAGR2タンパク質を内在性発現する。それに対してサルの線維芽様細胞系COS-7（ATCC番号CRL-1651）は検出可能な量のAGR2タンパク質を発現しない。（図20、IP（免疫沈降）細胞ペレットを参照のこと。）この実施例では、1×107個の細胞を1mlの溶解用洗剤緩衝液（1％のNP-40、25mMのトリス（pH7.5）、150mMのNaCl、5mMのEDTAを含む）の中で溶解させた。タンパク質濃縮液を作り、タンパク質の合計量30μgに対応する量のライセートをSDS-PAGEによって溶かした。ニトロセルロース膜の上にブロッティングを行なった後、AGR2特異的ウサギ抗血清（TBSTの中で1000倍に希釈）と、ぺルオキシダーゼに結合した二次抗ウサギIgG試薬とを用いてAGR2タンパク質を検出した。化学発光によって目に見えるようにした。
AGR2は分泌タンパク質である。なぜなら、図20に示してあるように、AGR2タンパク質は、それぞれHT-29とLS 174Tで条件づけた上澄みを濃縮し、上記の抗ネズミ類AGR2抗血清を用いた免疫沈降を行なった後にその上澄みの中で検出されたからである。上澄みは、それぞれ1日間と3日間にわたって条件づけを行なった（IP 1d条件づけ上澄み、IP 3d条件づけ上澄み）。AGR2タンパク質は、ライセート細胞ペレットでも検出される。この実施例では、20μlのMon-1特異的ウサギ抗血清を、1×107個の細胞でそれぞれ24時間と72時間にわたって条件づけした培養物の上澄み10mlに添加した。培養後、固定化したプロテインAを添加することによってMon-1タンパク質を含む免疫複合体を回収し、SDS-PAGEによって分離させた。免疫沈降したMon-1タンパク質は上記のようにして検出した。
遺伝子治療
遺伝子治療のため、多数のウイルス（レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスなど）が生きたウイルス・ベクターとして開発されてきた。突然変異したAGR2タンパク質（配列番号30）または野生型AGR2タンパク質（配列番号4）をコードしている核酸を親ウイルスのゲノムに挿入し、そのウイルスの中でその核酸を発現させる。これは、まず最初に、親ウイルスを用いて生体内組み換えをさせるためのDNAドナー・ベクターを構成することによって実現される。
DNAドナー・ベクターは、（i）原核生物の複製起点（このベクターを原核宿主細胞の中で増幅できるようにするため）と、（ii）このベクターを含む原核宿主細胞の選択を可能にするマーカーをコードしている遺伝子（例えば抗生物質に対する耐性をコードしている遺伝子）と、（iii）望むタンパク質をコードしていて、転写プロモータに隣接した位置にあってそのタンパク質の発現を指示する少なくとも1つの遺伝子と、（iv）エレメント（iii）の構造体に隣接していて、親ウイルスのゲノムで外来性遺伝子が挿入される領域と相同なDNA配列とを含んでいる。
このドナー・ベクターはさらに、挿入された外来性DNAを含む組み換えウイルスを同定できるようにするための1つ以上のマーカーをコードしている別の遺伝子群を含んでいる。使用するマーカー遺伝子としては、抗生物質または化合物に対する耐性をコードしている遺伝子（例えばSpyropoulos他、J. Virol.、第62巻、1046ページ、1988年；FalknerとMoss、J. Virol.、第62巻、1849ページ、1988年；Franke他、Mol. Cell. Biol.、第5巻、1918ページ、1985年を参照のこと）や、比色アッセイによって組み換えウイルスのプラークを同定できる大腸菌LacZ遺伝子（Panicali他、Gene、第47巻、193〜199ページ、1986年）が挙げられる。
感染細胞の中でのドナー・プラスミドDNAとウイルスDNAの間の相同的組み換えは標準的な方法でなされる。組み換えにより、ヒト突然変異AGR2（配列番号29）またはヒト野生型AGR2（配列番号5）をコードしている核酸を組み込んだ組み換えウイルスが形成される。生体内での組み換えに適した宿主細胞は、そのウイルスを感染させ、プラスミド・ベクター（例えばニワトリの胚線維芽細胞、HuTK143（ヒト）細胞、CV-1細胞、BSC-40細胞（最後の2つはサルの腎臓細胞））をトランスフェクトすることのできる真核細胞である。細胞へのウイルス感染と、その細胞へのプラスミド・ベクターのトランスフェクションは、標準的な方法で実現する。
生体内組み換えの後、マーカーまたはインディケータをコードしている遺伝子と興味の対象である外来遺伝子（ここではβ-ガラクトシダーゼ遺伝子）が一体化していることで組み換えウイルスの子孫を同定する。β-ガラクトシダーゼ遺伝子の存在は、発色基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシダーゼを用いて選択される（Panicali他、Gene、第47巻、193ページ、1986年）。組み換えウイルスは、宿主細胞の中に青い斑点となって現われる。挿入遺伝子がコードしているポリペプチドの発現は、ウイルスのプラークに対して行なうインサイチュ酵素免疫検定法や、ウエスタン・ブロット分析法、放射性免疫沈降法（RIPA）、酵素免疫検定法（EIA）によっても確認される。プラスのウイルスを培養し、増殖させ、保管する。
siRNAの作製とsiRNAを利用した治療
RNAの作製
AGR2のセンスRNA（ssRNA）とアンチセンスRNA（asRNA）を公知の方法（例えばRNA発現ベクターへの転写）を利用して作った。最初の実験では、センスRNAとアンチセンスRNAは長さがそれぞれ約500塩基である。作ったssRNAとasRNAを、20mMのNaClを含む10mMのトリス-HCl（pH7.5）の中で1分間にわたって95℃に加熱した後、冷却し、室温にて12〜16時間にわたってアニールした。RNAが沈殿したため溶解用緩衝液（以下に示す）の中に再び懸濁させた。アニーリングをモニターするため、2％アガロース・ゲルを含むTBE緩衝液の中でRNAの電気泳動を行ない、臭化エチジウムで染色した（Sambrook他、『分子クローニング：実験室マニュアル』（第2版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、プレインヴュー、ニューヨーク州、1989年）。
ライセートの調製
未処理のウサギの網状赤血球ライセート（アンビオン社）を製造者の指示に従って作る。dsRNAをライセートの中で30℃にて10分間にわたってインキュベートした後、mRNAを添加した。次に、AGR2のmRNAを添加し、インキュベーションをさらに60分間継続した。二本鎖RNAとmRNAのモル比は約200：1である。AGR2のmRNAに（公知の方法で）放射性標識し、その安定性をゲル電気泳動でモニターする。
同じ条件で並行して行なった実験では、二本鎖RNAの内部にα-32P-ATPで放射性標識する。2×プロテイナーゼK緩衝液を添加することによって反応を停止させ、以前に報告されているようにしてタンパク質を除去する（Tuschul他、Genes Dev.、第13巻、3191〜3197ページ、1999年）。適切な基準RNAを使用し、生成物をシークエンシング用の15％または18％ポリアクリルアミド・ゲル中の電気泳動によって分析する。ゲルの放射能をモニターすることにより、二本鎖RNAに由来する10〜25ntのRNAが自然に生成されることが明らかになる。
約21〜23塩基の二本鎖RNAのバンドが溶離される。これら21〜23量体がAGR2の転写を抑制する効率は、上に説明したのと同じウサギ網状赤血球アッセイを利用して試験管内で調べることができる。そのとき、アッセイごとに二本鎖の21〜23量体を50ナノモル用いる。次に、標準的な核酸シークエンシング法を利用して21〜23量体の配列を決定する。
RNAの調製
エクスペダイトRNAホスホロアミダイトとチミジンホスホロアミダイト（プロリゴ社、ドイツ国）を用い、決定された配列に基づいて21ntのRNAを化学的に合成した。合成オリゴヌクレオチドの保護をはずし、ゲルで精製し（Elbashir, S.M.、Lendeckel, W.、Tuschul ,T.、Genes & Dev.、第15巻、188〜200ページ、2001年）、Sep-Pak C18カートリッジ（ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）で精製した（Tuschul ,T.他、Biochemistry、第32巻、11658〜11668ページ、1993年）。
一本鎖RNA（20μM）をアニーリング用緩衝液（100mMの酢酸カリウム、30mMのヘペス-KOH（pH7.4）、2mMの酢酸マグネシウム）の中で90℃にて1分間にわたってインキュベートした後、37℃にて1時間にわたってインキュベートする。
細胞培養
規則正しくAGR2を発現する細胞培養物（例えばFDC-P1細胞、J774A.1細胞、WEHI-231細胞）を標準的な条件で増殖させる。トランスフェクションの24時間前、約80％の集密度にて細胞をトリプシン処理し、抗生物質なしの新鮮な培地（1〜3×105細胞/ml）で5倍に希釈し、24ウエル・プレート（ウエル1つにつき500μl）に移す。市販されているリポフェクション・キットを用いてトランスフェクションを行ない、正と負の対照を用いて標準的な方法でAGR2の発現をモニターする。正の対照は自然にAGR2を発現する細胞であるのに対し、負の対照はAGR2を発現しない細胞である。3'末端張出部を有する対になった21ntと22ntのsiRNAが、ライセートと細胞培養物の中で配列特異的なmRNAを実際に分解するのが見られる。さまざまな濃度のsiRNAを用いる。試験管内において哺乳動物培養物の中で抑制するのに有効な濃度は、最終濃度で25nM〜100nMである。これは、siRNAが、アンチセンス遺伝子またはリボザイム遺伝子を標的とした従来の実験で用いる濃度よりも数桁低い濃度で有効であることを示している。
上記の方法により、AGR2のsiRNA配列を導出するとともに、そのようなsiRNAを利用して試験管内で抑制を実現する手段が提供される。生体内での抑制は、周知の生体内トランスフェクション技術または遺伝子治療トランスフェクション技術を利用し、同じsiRNAを用いて実施することができる。
好ましい実施態様を含めて本発明を詳しく説明してきたが、当業者であれば、ここに開示した内容を考慮することで、請求項に記載した本発明の精神と範囲を逸脱することなく変更や改良を施しうることが理解されよう。この特許出願で引用したすべての参考文献、特許、特許出願、GenBankのデータは、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。
Agr2導入遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を遺伝子ターゲティング技術で作る方法
哺乳動物のAgr2導入遺伝子を有するトランスジェニック・マウスは、胚幹細胞法、あるいは前核法で作られる。このどちらの方法も従来技術において周知である。WO 01/75127に記載されているNehlsとWattlerの方法を利用することが好ましい。トランスジェニック法に関しては、アメリカ合衆国特許第6,436,701号、第6,018,097号、第5,942,435号、第5,824,837号、第5,731,489号、第5,523,226号も参照のこと。
Agr2シグナル・ペプチドの予測
公開されているプログラム“シグナルP V1.1”を用いてネズミ類とヒトのAgr2におけるN末端シグナル・ペプチドの確率を予測した（Nielsen他、1997年）。“シグナルP V1.1”のCスコア（開裂部位スコアの生データ）は、開裂部位を認識し、他の配列位置は認識しないように鍛えたネットワークからの出力スコアを表わす。+1の位置（開裂部位の直後）では大きく、他のすべての位置では小さくなるようにこのプログラムを鍛えた。“シグナルP V1.1”のSスコア（シグナル・ペプチドのスコア）は、シグナル・ペプチドを認識し、非シグナル・ペプチド位置は認識しないように鍛えたネットワークからの出力スコアを表わす。開裂部位の前にあるすべての位置で大きく、開裂部位から30個の位置と非分泌タンパク質のN末端では小さくなるようにこのプログラムを鍛えた。“シグナルP V1.1”のYスコア（総合開裂部位スコア）は、どこでCスコアが大きく、どこでSスコアが大きな値から小さな値に変化するかを観察することによって最適化した開裂部位の予測位置を表わす。Yスコアは、Cスコアの大きさとSスコアの勾配を組み合わせることによってそれを得点化する。特に、Yスコアは、Cスコアと、Sスコアの滑らかな微分との間の幾何学的平均である（すなわち、現在の位置よりも前の位置d個での平均Sスコアと現在の位置よりも後の位置d個での平均Sスコアの差（ただしdはどのネットワーク集合を選択するかで異なる））。3つのスコアはすべて、データのそれぞれ異なる部分に関して鍛えた5つのネットワークの平均である。
マウスAgr2に関しては、このプログラムは、高い確率で、アミノ酸1〜20によってコードされるN末端シグナル配列と、アミノ酸20と21の間の開裂部位を予測する（図15Aを参照のこと）。
ヒトAGR2に関しては、このプログラムは、高い確率で、アミノ酸1〜20によってコードされるN末端シグナル配列と、アミノ酸20と21の間の開裂部位を予測する（図15Bを参照のこと）。
マウスとヒトのAGR2でのアミノ酸の比較
この明細書に記載したマウスとヒトのAGR2に関するcDNAのオープン・リーディング・フレームは、サイズがそれぞれ175個のアミノ酸からなる推定タンパク質をコードしている。配列の構造解析により、トランスロケーション・シグナル・ペプチドが膜を通過した後に除去される確率が高いことがわかる。両方のペプチドにおいて、最も確実な開裂点は、アミノ酸20と21の間（ヒトではLA-RD、マウスではLA-KD）であり、その開裂によって、アミノ酸が155個の成熟タンパク質がそれぞれ得られる。シグナル・ペプチドの予測は、生物配列分析センター（BioCentrum-DTU、デンマーク工科大学）のウェブサイト（www.cbs.dtu.dk）を利用して、実施例16で説明したようにして実施した。その結果を図15Aと図15Bに示してある。マウスとヒトのAgr2ペプチドでアミノ酸の一致度は91％であるのに対し、類似度は95％に達する。
さまざまな種に由来するAgr2タンパク質のキャラクテリゼーション - アミノ酸の保存
1．マウス、ラット、ヒトという種の間でAgr2ペプチドのアミノ酸を比較すると、全体的一致度はほぼ91％であるが、類似度は95％に達する。アミノ酸の一致度と類似度が大きいというのは、種間で残基がよく保存されていること（図16と表1を参照のこと）と、この実施例で比較したペプチドにおいて保存されているこれら残基が機能的に重要であることを示している。MTZ表現型で置換されたアミノ酸（137V）は、比較した種の間では同じである。
2．マウス、ラット、ヒト、アフリカツメガエルという種の間でAgr2ペプチドのアミノ酸を比較すると、全体的一致度は67％であるが、類似度は82％に達する。アミノ酸の一致度と類似度が大きいというのは、種間で残基がよく保存されていること（図17と表2を参照のこと）と、この実施例で比較したペプチドにおいて保存されているこれら残基が機能的に重要であることを示している。この場合にも、MTZ表現型で置換されたアミノ酸（137V）は、比較した種の間では同じである。
3．マウス、ラット、ヒト、アフリカツメガエル、セノラブディティス・エレガンスという種の間でAgr2ペプチドのアミノ酸を比較すると、全体的一致度は32％であるが、類似度は46％に達する。アミノ酸の一致度と類似度がこの程度であるというのは、種間で残基がよく保存されていること（図18と表3を参照のこと）と、この実施例で比較したペプチドにおいて保存されているこれら残基が機能的に重要であることを示している。MTZ表現型で置換されたアミノ酸（137V）は、セノラブディティス・エレガンス以外はこの実施例で比較した種の間で同じである。セノラブディティス・エレガンスのAGR2タンパク質は、対応する残基位置137に、似たアミノ酸、すなわち非極性かつ疎水性のアミノ酸（VではなくL）を有する。
進化圧が、これら残基を分子内のその特別な位置に保存させてきた。どの非保存アミノ酸置換も、ペプチドの正常な生物学的機能を本発明で観察されるのと同様に変化させることが予測される。したがってそのように異常なAgr2ペプチド配列、またはそのように異常なAgr2ペプチド配列をコードしているcDNAが生物サンプル中で同定されるというのは、本発明の表現型が出現する確率が大きいことを示している。
アフリカツメガエルのセメント腺分化アッセイ
マウスAgr2タンパク質とそのオルソログであるAGR2ペプチドの機能分析は、Abergerら（Aberger他、1998年）が記載している方法で実施することができる。彼らは、XAG-2（セメント腺において特異的に作用する分泌タンパク質）の過剰発現により、アフリカツメガエルの胚におけるセメント腺の異所性分化と、前神経マーカー遺伝子の発現の両方が誘導されることを証明した。XAG-2は、AGR2と相同な分泌タンパク質である。
このアッセイは、胚発生の間にセメント腺が特殊化する際の特定の遺伝子の機能をテストするのに利用できる。セメント腺は、アフリカツメガエルの胚におけるムチン分泌器官であり、杯細胞と機能が似ている。
Agr2の完全長cDNA配列を含むPCR断片をサブクローニングし、プラスミド・ベクターpCR 2.1-TOPO（K4500-01、インヴィトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）に製造者の指示に従って入れる。実施例5に記載したようにして、正しいAgr2挿入体を含むこのプラスミドDNAに対し、クイックチェンジ部位指定突然変異キット（200518、ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を用いて部位指定突然変異を起こさせる。
特定のコドン配列を、コドンの塩基対を1つ、または2つ、または3つ置換することによって変化させると、表1、2、3にそれぞれ示した残基位置が非保存アミノ酸で交換されたAGR2タンパク質が得られる。
SP6 mメッセージmマシン・キット（アンビオン社）を用いてキャップの付いたmRNAを合成する。小さなmRNAサンプルを網状赤血球ライセート系（プロメガ社）を用いて、あるいは別の方法を利用して試験管内で翻訳し、RNAの品質を分析する。別の方法は、例えばSambrook他編、『分子クローニング：実験室マニュアル』（第2版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、1989年；Ausbel他編、『分子生物学の最新プロトコル』、ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1993年に記載されている。精製したmRNAを、Abergerら（1998年）が記載しているようにしてアフリカツメガエルの初期卵割段階の胚に注入する。
点突然変異とその後（表1、2、3にそれぞれ示した残基位置に）導入する非保存アミノ酸置換が何であるかに応じ、ムチン分泌セメント腺の特殊化に関してAGR2の機能を分析する。Abergerらが記載しているようにして形態学的および組織学的な検査を行ない、拡大したセメント腺または追加の異所性セメント腺があるかどうかを分析する。
細胞増殖におけるAgr2の機能 - 増殖因子アッセイにおけるDNA標識
細胞増殖におけるAGR2の活性を測定するにはDNA標識アッセイを利用することができる。哺乳動物のAGR2では、大腸がん細胞系（例えばLS 174T、HT29）を使用できる。IwakiraとPodolsky（Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.、第280巻、G1114〜G1123ページ、2001年）が記載しているように、LS 174T細胞は杯細胞様の表現型を示し、大量の分泌ムチンを産生する。HT29細胞は、腸細胞やムチン分泌杯細胞の表現型が持つ特徴を有する細胞に分化することができる。AGR2に応答する他の任意の細胞も使用できる。
哺乳動物のAgr遺伝子のwtと突然変異したcDNA配列を含むAGR2発現ベクターを実施例10に記載したようにして構成する。好ましい1つの方法は、cDNAをサブクローニングしてゲートウェイ・クローニング／発現系（インヴィトロジェン社、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）の発現ベクターに製造者の指示に従って入れる方法である。
従来技術において周知の細胞増殖アッセイを実施するのにいくつかのプロトコルがある。典型的なのは、新たに合成したDNAにヌクレオシド・アナログを組み込んで細胞集団の中で増殖（活性な細胞の成長）を測定する方法である。例えばブロモデオキシウリジン（BrdU）をDNA標識試薬として用い、抗BrdUマウス・モノクローナル抗体を検出試薬として用いることができる。この抗体は、BrdUが組み込まれたDNAを含む細胞にだけ結合する。多数の検出法をこのアッセイと組み合わせて利用することができる。検出法としては、例えば免疫蛍光法、免疫組織学法、ELISA、比色法などがある。BrdUと抗BrdUマウス・モノクローナル抗体を含むキットは、F.ホフマン-ラ・ロッシュ社（バーゼル、スイス国）から市販されている。アッセイは、製造者のプロトコルに指示されているようにして行なう。
杯細胞の分化におけるAgr2の機能 - 定量PCRアッセイにおける杯細胞特異的マーカーの分析
杯細胞の分化（例えば杯細胞の初期分化または最終分化）におけるAGR2の活性を測定するには、細胞培養物をベースとしたアッセイを利用できる。哺乳動物のAGR2では、大腸がん細胞系（例えばLS 174T、HT29）を使用できる。IwakiraとPodolsky（Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.、第280巻、G1114〜G1123ページ、2001年）が記載しているように、LS 174T細胞は杯細胞様の表現型を示し、大量の分泌ムチンを産生する。HT29細胞は、腸細胞やムチン分泌杯細胞の表現型が持つ特徴を有する細胞に分化することができる。
哺乳動物のAgr遺伝子のwtと突然変異したcDNA配列を有するAGR2発現ベクターと、追加の対照ベクターを、実施例10に記載したようにして構成する。好ましい1つの方法は、cDNAをサブクローニングしてゲートウェイ・クローニング／発現系（インヴィトロジェン社、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）の発現ベクターに製造者の指示に従って入れる方法である。
細胞に上記の発現ベクターをトランスフェクトする。細胞培養物に発現ベクターをトランスフェクトする方法は従来技術でよく知られており、例えばSambrook他編、『分子クローニング：実験室マニュアル』（第2版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、1989年；Ausbel他編、『分子生物学の最新プロトコル』、ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1993年に記載されている。
腸杯細胞が分泌するムチンの主要なサブタイプはムチン2である。ムチン2は、ムチンのサブタイプTFF3と同様、最終分化のマーカーとして役立つ。ヒトmuc2プライマーを設計し、cDNAをもとにした約200bpのDNA断片をPCRによって増幅する。このcDNAは、トランスフェクトした対照細胞とトランスフェクトしていない対照細胞のmRNAをもとにして新たに合成する。定量PCR分析（ライト・サイクラー；ロッシュ社、バーゼル、スイス国）を製造者の指示に従って実施する。
ヒトmuc2のPCR産物を定量することにより、杯細胞の分化におけるAGR2の機能を分析する。特異的なPCR産物の量は、トランスフェクションに用いたAGR2発現ベクターの個々のタイプ（野生型cDNA、突然変異したcDNA、突然変異の位置）に依存する。分析するのはmuc2に限定されない。
突然変異によって生じる異常なAGR2タンパク質の発現レベル
AGR2遺伝子に何らかの突然変異が起こってある人のAGR2ペプチドの発現レベルが異常になると、そのペプチドの正常な生物学的機能が例えば本発明で観察されるのと同じように妨げられることになる。AGR2ペプチドの発現レベルが異常になる突然変異は、遺伝子発現のあらゆる側面（例えばDNAの転写、mRNAの輸送とプロセシング、mRNAの翻訳、AGR2ペプチドの半減期そのもの）に影響を与える可能性がある。
例えば生物サンプルでAGR2ペプチドのレベルが異常であることは、本発明の表現型が現われるリスクが大きいことを示している。生物サンプルにおけるペプチド発現レベルを定量する方法は従来技術において周知である。AGR2ペプチドのレベルは、個人からバイオプシー・サンプルを取得し、AGR2ペプチドを特異的に認識する抗体または他の任意のプローブを用いて（例えばELISAまたはウエスタン・ブロットによって）ペプチド発現レベルの大きさを測定することによって分析できよう。
あるいは生物サンプルでAGR2 mRNAのレベルが異常であることは、本発明の表現型が現われるリスクが大きいことを示している。生物サンプルにおけるmRNA発現レベルを定量する方法は従来技術において周知である。AGR2 mRNAのレベルは、個人からバイオプシー・サンプルを取得し、AGR2 mRNAを特異的に認識するプローブを用いた定量RT-PCRまたは他の任意の方法を利用してAGR2 mRNAの量を測定することによって分析できよう。
あるいは生物サンプルでAGR2 mRNAの輸送またはプロセシングが異常であることは、本発明の表現型が現われるリスクが大きいことを示している。AGR2 mRNAのプロセシングは、個人からバイオプシー・サンプルを取得し、AGR2 mRNAのプロセシングを特異的に認識するノーザン・ブロッティング、またはRT-PCR、または他の任意の方法を利用してAGR2 mRNAのプロセシングを測定することによって分析できよう。
さらに、AGR2遺伝子におけるあらゆる突然変異がAGR2の発現に及ぼす効果は、適切な人工発現系を用いてテストすることができよう。
例えば突然変異した任意のAGR2ペプチドをコードしているcDNAは、単離して適切な発現系の中で発現させることができよう。発現したAGR2ペプチドの量、またはmRNAの量、またはAGR2 mRNAが輸送されてプロセシングを受ける量は、上記の方法と似た方法によって分析することができよう。
別の方法として、AGR2遺伝子の調節配列を単離して適切な発現系の中で分析することもできよう。適切なレポーター遺伝子の発現レベルは、AGR2調節配列が遺伝子の発現を指示する効率を示しているであろう。
AGR2遺伝子に突然変異が起こって個人または適切な発現系でのAGR2ペプチドの発現レベルが異常になったことがわかると、その知見を利用して従来技術において周知の手段（個人のAGR2 cDNAまたはゲノムDNAのシークエンシング）で適切なあらゆる生物サンプルをスクリーニングし、そのような突然変異が存在しているかどうかを調べることができよう。これまでに特徴を明らかにした突然変異のどれかを有する人は、本発明の表現型が現われるリスクが大きいことになる。
AGR2ハプロタイプと疾患リスクの相関を明らかにするための、集団の統計的分析
本発明の表現型が現われるリスクが大きいことを示すヒトAGR2遺伝子の突然変異を同定するため、AGR2ハプロタイプを、健康である適切な対照集団ではなく、本発明で説明した病気の表現型と関連する病気の表現型を示す所定の患者集団の中から明らかにする。対照集団と比べて病気集団で有意に過剰発現しているAGR2対立遺伝子をその疾患のリスクと相関させる。Griffiths, Anthony J.F.；Gelbart, William M.；Miller, Jeffrey H.；Lewontin, Richard C.、『最新遺伝子分析』、ニューヨーク、W.H.フリーマン社、1999年頃を参照のこと。
したがって過剰発現したこれらAGR2対立遺伝子のどれかを持っている人は、本発明の表現型が現われるリスクが大きいことになる。
大腸で発現している転写調節が異常な遺伝子の検出
杯細胞の機能と生物学的に関係していると考えられるために選択した一連の遺伝子を分析し、新生MTZマウスの大腸における変化したRNA発現レベルを野生型マウスの大腸における発現レベルと比較した。図19に示したように、ムチン2（Muc2）とトレフォイル因子（TFF3）に関して発現レベルの有意な低下が見られた。両方の遺伝子はムチンの主要タンパク質成分をコードしており、両方のタンパク質（Muc2とTFF3）は杯細胞の後期分化マーカーとして役立つ。これら分化マーカー遺伝子の転写活性が低下しているというのは、杯細胞の成熟プロセスが不完全であることを示している。転写の異常は、定量PCR-ライト・サイクラー技術（ロッシュ・ディアグノスティックス社、マンハイム、ドイツ国）を製造者の指示に従って利用することによって明らかにした。
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マウスとヒトでそれぞれの種のAGR2遺伝子を有する合成染色体領域（図1A）と、AGR2のエキソン-イントロン構造をマウスとヒトで比較した図（図1B）である。コードしているエキソンだけを灰色にしてある。エキソンのサイズは、エキソンの上（コードしているエキソンの場合）または下（コードしていないエキソンの場合）に塩基対の数で示してある。イントロンのサイズは塩基対の長さで示してある。 マウスとヒトの野生型AGR2タンパク質配列のアラインメントであり、アミノ酸残基が2つのタンパク質で一致していることを示している。突然変異の位置は灰色で強調してある。 F3を作製するためのチャート（図3A）と、観察された表現型の異常に関係する突然変異をマウスの第12染色体にマッピングするのに用いる異系交配スキーム（図3B）である。凡例：細い平行線はゲノムの2つの対立遺伝子を表わし、交差した細い線は突然変異事象を表わし；太い線は異系交配に用いる別のマウス系の野生型を表わす。mWTは野生型のオス；fWTは野生型のメス；DB1は優***配1；RF1は劣性F1×F1；RBSは劣性の兄弟-姉妹；ROCは劣性の異系交配；RICは劣性の異種交配である。小文字の略号は、それぞれの交配段階に関与するマウスを表わし、その名称はどの段階で生まれたマウスであるかを示している。 病気のF5 MTZマウスに対してパイロシークエンシング法で実施したゲノム全体でのSNP分析からの最終データであり、突然変異が近位染色体12にあることが突き止められた。 情報が豊富なMTZマウスのハプロタイプ・スキームに染色体の切断点を示した図であり、第12染色体上でマーカーIdb2とマーカーD12Mit64の間に突然変異があることを示している。記号“c”、“hz”、“b”はそれぞれ、C3H（c）マウス、ヘテロ（hz）マウス、c57B16（b）マウスを示す。 マウスの組織のcDNAにおいてマウスAGR2のmRNAの発現を調べた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）分析からのデータである。349bpのバンドは、マウスAGR2に対して特異的なPCR産物を表わしている。 ヒトの組織のcDNAにおいてヒトAGR2のmRNAの発現を調べた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）分析からのデータである。170bpのバンドは、ヒトAGR2に対して特異的なPCR産物を表わしている。 ヒトAGR2プローブとハイブリダイズしたノーザン・ブロットである。 元々はゲノム全体で突然変異誘発をスクリーニングすることによって同定されたMTZマウスの子孫の遺伝子型と表現型をリストにした表である。両方の対立遺伝子にAgr2遺伝子のミスセンス突然変異を持つマウスは“mut”で示し、一方が突然変異で一方が野生型である対立遺伝子を持つマウスは“het”で示してある。Agr2遺伝子座に2つの野生型対立遺伝子を持つマウスは“wt”で示してある。両方の対立遺伝子にAgr2遺伝子のミスセンス突然変異を持つマウスはMTZ表現型（すなわち慢性の下痢と繁殖能力の欠陥）を示すのに対し、他のすべてのマウスは正常な表現型であった。 遺伝的背景がC3Hである野生型マウスの大腸壁の断面図である。サンプルはホルマリンで固定し、抗TFF3（トレフォイル・ペプチド3）抗体と抗ムリンAgr2抗血清でそれぞれ染色した。杯細胞におけるTFF3とAgr2の発現を示している。 遺伝的背景がC3HであるMTZマウスの大腸壁の断面図であり、それぞれの野生型マウスを対照として用いた。サンプルはホルマリンで固定し、H/E（ヘマトキシリン／エオシン）で染色した。野生型マウスでは、杯細胞は、前ムチンと粘液の他の成分を貯蔵する小胞を多く含むことを特徴としている。そのことは、この染色で明るい球形の液滴として見ることができる。液滴は、MTZマウスの大腸上皮にはほとんど存在していない。 遺伝的背景がC3HであるMTZマウスの大腸壁の断面図である。サンプルはホルマリンで固定し、H/E（ヘマトキシリン／エオシン）で染色した。MTZマウスの大腸壁は、粘膜上皮と粘膜下組織の中に浸潤性炎症免疫細胞を含んでいる。これらはサイズが小さいことと球形の核が暗く染色されていることで同定可能である（＊で示す）。さらに、大腸粘膜のわずかな糜爛が検出される。それは矢印で示してある。 遺伝的背景がC3HであるMTZマウスの大腸壁の断面図であり、それぞれの野生型マウスを対照として用いた。サンプルはホルマリンで固定し、蛍光標識したレクチン（コムギ胚芽アグルチニン（WGA）とフジマメのアグルチニン（DBA））で染色した。野生型マウスでは、高度にグリコシル化されたムチンが、杯細胞が貯蔵している球形の液滴濃縮物を示す明るい染色によって同定できる。その一方で、MTZマウスの大腸上皮には明るく染色された液滴がほとんど存在していない。 C3H遺伝的背景でのMTZマウスの十二指腸壁の断面図であり、それぞれの野生型マウスを対照として用いた。サンプルはホルマリンで固定し、H/E（ヘマトキシリン／エオシン）で染色した。野生型マウスでは、正常なブルンナー腺と正常な十二指腸上皮が検出される。MTZマウスでは、ブルンナー腺が膨張し、十二指腸上皮は増殖している。ブルンナー腺は星印で示し、十二指腸上皮は矢印で示してある。 Ａ）公開されているプログラム“シグナルP V1.1”（Nielsen他、1997年）をマウスAgr2のアミノ酸1〜30に適用したときの結果である。このプログラムからは、アミノ酸1〜20によってコードされるN末端シグナル配列と、アミノ酸20と21の間の開裂が、高い確率で予測される。Ｂ）公開されているプログラム“シグナルP V1.1”（Nielsen他、1997年）をヒトAGR2のアミノ酸1〜30に適用したときの結果である。このプログラムからは、アミノ酸1〜20によってコードされるN末端シグナル配列と、アミノ酸20と21の間の開裂が、高い確率で予測される。 マウス、ヒト、ラットでAgr2タンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。アミノ酸の一致度が91％でアミノ酸の類似度が95％というのは、進化してもアミノ酸残基が非常によく保存されていることを示す。保存されたアミノ酸（すなわち一致しているか類似しているもの）を添付の表1にリストにしてある。 マウス、ヒト、ラット、アフリカツメガエルでAgr2タンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。アミノ酸の一致度が67％でアミノ酸の類似度が82％というのは、進化してもアミノ酸残基が非常によく保存されていることを示す。保存されたアミノ酸（すなわち一致しているか類似しているもの）を添付の表2にリストにしてある。 マウス、ヒト、ラット、アフリカツメガエル、セノラブディティス・エレガンスでAgr2タンパク質のアミノ酸配列を比較した図である。アミノ酸の一致度が32％でアミノ酸の類似度が46％というのは、進化してもアミノ酸残基が非常によく保存されていることを示す。保存されたアミノ酸（すなわち一致しているか類似しているもの）を添付の表3にリストにしてある。 MTZマウスと野生型対照の新生児から調製した新鮮な大腸cDNAを対象としてPCR-ライト・サイクラー法でmRNAを定量的に検出したデータである。Agr2転写産物の想定量と、muc2（ムチン2）およびTFF3の転写産物の減少量を示してある。遺伝子Muc2とTFF3はどちらも、粘液の主要成分を含むタンパク質をコードしている。同じデータが、成熟したMTZマウスと野生型対照マウスの大腸cDNAに関するアッセイで得られた。mRNAの調節は、内部基準遺伝子ALAS（アミノレブリン酸シンターゼ1）の転写量に対する倍数として測定した。 ウエスタン・ブロットのデータであり、大腸がん細胞系で条件づけた上澄の中にAGR2タンパク質が分泌されたことを示している。

Claims (207)

  1. 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する単離されたタンパク質、もしくは配列番号3および配列番号4の対応するアミノ酸と比べたときに上記割合のアミノ酸が一致している少なくとも6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、165個、170個、171個、172個、173個または174個の連続したアミノ酸を含む上記タンパク質の単離された断片であって、
    (a) 前記マウスAgr2タンパク質の突然変異であって、それがマウスAgr2遺伝子によってコードされ、かつマウスのすべてのまたは実質的にすべての細胞のゲノム中にホモ接合的に存在する場合には、対応する野生型動物と比べた場合の杯細胞機能の変化を伴う表現型をもたらすような突然変異; および/または
    (b) 前記マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、結腸細胞増殖アッセイ、杯細胞粘液分泌アッセイ、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)セメント腺分化アッセイからなる群より選択されるインビトロ・アッセイで突然変異タンパク質の生物学的活性を対応する野生型マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比較したときに、該活性の変化を示すような突然変異; および/または
    (c) 前記ヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、杯細胞機能の変化に伴う疾患をヒト対象者が発現するリスクの増大を示すような、または杯細胞機能の変化に伴うヒト対象者の疾患とAGR2発現または機能の変化との関連を示すような、突然変異;
    に対応するアミノ酸またはアミノ酸配列を含むことを特徴とする、単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  2. 前記タンパク質がマウスAgr2またはヒトAGR2タンパク質のオルソログ、好ましくは脊椎動物オルソログ、特に該脊椎動物がアフリカツメガエルである場合のオルソログ、または哺乳動物オルソログ、特に該脊椎動物がマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジおよびウマからなる群より選択される場合のオルソログであることを特徴とする、請求項1に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  3. 前記変化が機能欠損型の表現型をもたらす、請求項1または2に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  4. 前記変化が機能獲得型の表現型をもたらす、請求項1または2に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  5. 前記変化が杯細胞分化、特に最終分化の変化、および/または杯細胞粘液産生または分泌および/または粘液組成の変化である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  6. 前記変化が杯細胞中の前ムチン貯蔵顆粒の減少、粘液分泌の変化、腸粘膜上皮および粘膜下組織の二次炎症浸潤を特徴とする、請求項1〜3または請求項5のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  7. 前記表現型がさらにブルンナー腺の腺上皮の増殖増大を伴う、請求項1〜3または請求項5〜6のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  8. 前記変化が下痢、または下痢と繁殖能力欠損とを招く、請求項1〜3または請求項5〜7のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  9. 前記疾患が喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症、ドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患、特にクローン病または潰瘍性大腸炎、および腸癌からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  10. 前記突然変異がマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質中のアミノ酸の欠失または他アミノ酸による置換、もしくは該マウスAgr2タンパク質または該ヒトAGR2タンパク質のアミノ酸配列中に通常は存在しない追加アミノ酸の挿入を招く、請求項1〜9のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  11. 前記欠失、置換または挿入がマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の保存領域に起こる、請求項10に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  12. マウス、ラットおよびヒトAGR2の間で、好ましくはマウス、ラット、ヒトおよびアフリカツメガエルAGR2の間で、より好ましくはマウス、ラット、ヒト、アフリカツメガエルおよび線虫(Caenorhabditis elegans)AGR2の間で、一致または類似しているアミノ酸の、他アミノ酸による置換を招くことを特徴とする、請求項10または11に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  13. 前記マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質中のアミノ酸の他アミノ酸による置換が非保存的置換である、請求項10〜12のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  14. 前記マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質中の欠失または置換アミノ酸がVal 137である、請求項10〜13のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  15. 前記第137位での置換が、以下の:
    a) Val→GluまたはAspなどのような酸性アミノ酸;
    b) Val→His、ArgまたはLysなどのような塩基性アミノ酸;
    c) Val→SerまたはThrなどのような脂肪族ヒドロキシル側鎖アミノ酸;
    d) Val→AsnまたはGlnなどのようなアミド側鎖アミノ酸;
    e) Val→CysまたはMetなどのようなイオウ含有側鎖アミノ酸;
    f) Val→Phe、Tyr、Trpなどのような芳香族側鎖アミノ酸
    g) Val→GlyまたはPro; および
    h) Val→Ala、LeuまたはIle、
    いずれかの置換であることを特徴とする請求項14に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  16. 前記第137位での置換がバリンのグルタミン酸による置換である、請求項15に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  17. 前記アミノ酸が天然アミノ酸によって置換される、請求項10〜15のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片。
  18. 配列番号2または配列番号30で表わされるアミノ酸配列をもつ単離されたタンパク質、または該アミノ酸配列中の、Glu 137に対応するアミノ酸を含めて少なくとも6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、165個、170個、171個、172個、173個または174個の連続したアミノ酸を含む上記タンパク質の単離された断片。
  19. 請求項1〜18のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質またはタンパク質断片を、配列番号3および配列番号4中の対応するアミノ酸に対して前記割合のアミノ酸配列の一致を欠く他のタンパク質またはタンパク質断片に融合させた融合タンパク質。
  20. 前記他タンパク質が配列番号3および配列番号4にそれぞれ対応するマウスAgr2またはヒトAGR2タンパク質とは無関係のタンパク質である、請求項19に記載の融合タンパク質。
  21. 前記他タンパク質がグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、免疫グロブリン・ペプチド、ポリヒスチジン・ペプチド、フラグ(FLAG)タグおよびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項19または20に記載の融合タンパク質。
  22. 請求項1〜18のいずれか1項に記載のタンパク質またはタンパク質断片をコードする単離された核酸、または該核酸に対して相補的である単離された核酸。
  23. 配列番号1または配列番号29で表されるヌクレオチド配列をもつ単離された核酸、または該核酸に対して相補的である単離された核酸。
  24. 請求項22または23のいずれか1項に記載の核酸を含むエピソーム・エレメント。
  25. 前記エピソーム・エレメントがプラスミド、コスミド、バクテリオファージの核酸、またはウイルスの核酸からなる群より選択される、請求項24に記載のエピソーム・エレメント。
  26. 請求項22または23のいずれか1項に記載の核酸を含むゲノム。
  27. 前記ゲノムがバクテリオファージ・ゲノム、細菌ゲノムまたはウイルス・ゲノムである、請求項26に記載のゲノム。
  28. 前記ウイルス・ゲノムがDNAウイルス・ゲノムまたはRNAウイルス・ゲノムである、請求項27に記載のゲノム。
  29. 請求項1〜21のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸分子を含むベクター。
  30. 前記ベクターが発現ベクター、突然変異誘発ベクター、一体化ベクターおよび突然変異ベクターからなる群より選択される、請求項29に記載のベクター。
  31. 前記ベクターが発現ベクターであり、またタンパク質をコードする配列がプロモータ配列と作動可能に連結されていることを特徴とする、請求項30に記載のベクター。
  32. 前記ベクターが発現ベクターであり、かつプラスミド・ベクター、コスミド・ベクター、ファージ・ベクター、ファージミド・ベクター、ウイルス・ベクターおよびレトロウイルス・ベクターからなる群より選択されることを特徴とする、請求項30または31に記載のベクター。
  33. 請求項24〜32のいずれか1項に記載のエピソーム・エレメント、ゲノムまたはベクターをトランスフェクトした宿主細胞。
  34. 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項33に記載の宿主細胞。
  35. 前記宿主細胞が原核細胞である、請求項33に記載の宿主細胞。
  36. 以下の部分:
    (i) 請求項1〜21のいずれか1項に記載のタンパク質をコードするmRNAの一部分であって、
    (a) 配列番号3に一致するマウスAgr2タンパク質の突然変異であって、それがマウスAgr2遺伝子によってコードされ、かつマウスのすべてのまたは実質的にすべての細胞のゲノム中にホモ接合的に存在する場合には、対応する野生型動物と比べた場合の杯細胞機能の変化を伴う、場合によりさらにブルンナー腺の腺上皮の増殖を伴う表現型をもたらすような突然変異; および/または
    (b) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、結腸細胞増殖アッセイ、杯細胞粘液分泌アッセイ、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)セメント腺分化アッセイからなる群より選択されるインビトロ・アッセイで突然変異タンパク質の生物学的活性を対応する野生型マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比較したときに、該活性の変化を示すような突然変異; および/または
    (c) 配列番号4に対応するヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、杯細胞機能の変化に伴う疾患をヒト対象者が発現するというリスクの増大を示すような、または杯細胞機能の変化に伴うヒト対象者の疾患とAGR2発現または機能の変化との関連を示すような、突然変異;
    に対応するアミノ酸またはアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする部分;
    (ii) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質を、または前記マウスAgr2またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する該タンパク質のオルソログを、コードするmRNAの一部分であって、該部分は非コード部分であり、かつ該タンパク質またはオルソログをコードする遺伝子中の、該タンパク質またはオルソログの発現に影響を及ぼす突然変異に対応する配列を含むことを特徴とするmRNAの部分; または
    (iii) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の発現または機能に影響を及ぼすタンパク質を、または配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致する前記マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する該タンパク質のオルソログを、コードするmRNAの一部分、
    に対して相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸。
  37. 前記アンチセンス核酸がDNA、RNA、および合成核酸アナログ、たとえばPNA(ペプチド核酸)、からなる群より選択される、請求項36に記載のアンチセンス核酸。
  38. 前記アンチセンス核酸がmRNAと、相補ヌクレオチド配列を介して、生理学的条件または厳しい条件下で、好ましくは6×SSC、50mMトリス-HCl（pH7.5）、1mMのEDTA、0.02％のPVP、0.02％のフィコール、0.02％のBSAおよび変性サケ***DNA 500mg/mlを含む高い塩濃度の緩衝液中、65℃でのハイブリダイゼーションとそれに続く0.2×SSC、0.01％のBSA、50℃での1回または複数回の洗浄というハイブリダイゼーション条件下で、さらに6×SSC、50mMトリス-HCl（pH7.5）、1mMのEDTA、0.02％のPVP、0.02％のフィコール、0.02％のBSAおよび変性サケ***DNA 500mg/mlを含む高い塩濃度の緩衝液中、65℃でのハイブリダイゼーションとそれに続く0.2×SSC、0.01％のBSA、65℃での1回または複数回の洗浄というハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズしうることを特徴とする、請求項36または37に記載のアンチセンス核酸。
  39. 前記アンチセンス核酸がリボザイムでありかつ触媒領域をさらに含む、請求項36〜38のいずれか1項に記載のアンチセンス核酸。
  40. 前記触媒領域がmRNAを切断しうる、請求項39に記載のアンチセンス核酸。
  41. 請求項38〜40のいずれか1項に記載のアンチセンス核酸であって、前記mRNAとのハイブリダイゼーションのほうが
    (i) 同じタンパク質、ただし配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致する野生型マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質に上記アミノ酸配列の点で対応する同じタンパク質を、コードするmRNA;
    (ii) 前記マウスAgr2またはヒトAGR2タンパク質の野生型遺伝子または対応するオルソログの野生型遺伝子によってコードされるmRNA; または
    (iii) 前記マウスAgr2またはヒトAGR2タンパク質の発現または機能に影響を及ぼす対応するタンパク質の野生型遺伝子によってコードされるmRNA;
    とのハイブリダイゼーションよりも効果的であることを特徴とするアンチセンス核酸。
  42. 請求項36〜41のいずれか1項に記載のアンチセンス核酸で形質転換した宿主細胞。
  43. 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項42に記載の宿主細胞。
  44. 前記宿主細胞が原核細胞である、請求項42に記載の宿主細胞。
  45. 二本鎖ヌクレオチド配列を含む短い干渉RNA(siRNA)であって、そのうちの一方の鎖が、
    (a) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質、もしくは配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する該タンパク質のオルソログ; または
    (b) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の、もしくは配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する該タンパク質のオルソログの、発現または機能に影響を及ぼすタンパク質;
    をコードするmRNAの少なくとも19、20、21、22、23、24または25ヌクレオチド長のセグメントに対して相補的であることを特徴とするsiRNA。
  46. 前記siRNAがmRNAをコードするAGR2遺伝子に対するサイレンシング能、すなわち発現抑制能を有する、請求項45に記載のsiRNA。
  47. 前記AGR2遺伝子が脊椎動物AGR2遺伝子、特にアフリカツメガエルのAGR2遺伝子、または哺乳動物AGR2遺伝子、特にヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジおよびウマの各AGR2遺伝子からなる群より選択されるAGR2遺伝子、最も好ましくはマウスAgr2遺伝子またはヒトAGR2遺伝子であることを特徴とする、請求項45または46に記載のsiRNA。
  48. 前記AGR2遺伝子が杯細胞機能の変化に関連する疾患に罹っていないまたは上記疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者のAGR2遺伝子である、請求項45〜47のいずれか1項に記載のsiRNA。
  49. 二本鎖ヌクレオチド配列を含む短い干渉RNA(siRNA)であって、そのうちの一方の鎖が次のタンパク質:
    (i) 請求項1〜21のいずれか1項に記載のタンパク質であって、該セグメントが
    (a) 配列番号3に一致するマウスAgr2タンパク質の突然変異であって、それがマウスAgr2遺伝子によってコードされ、かつマウスのすべてのまたは実質的にすべての細胞のゲノム中にホモ接合的に存在する場合には、対応する野生型動物と比べた場合の杯細胞機能の変化を伴う、場合によりさらにブルンナー腺の腺上皮の増殖を伴う表現型をもたらすような突然変異; および/または
    (b) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、結腸細胞増殖アッセイ、杯細胞粘液分泌アッセイ、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)セメント腺分化アッセイからなる群より選択されるインビトロ・アッセイで突然変異タンパク質の生物学的活性を対応する野生型マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比較したときに、該活性の変化を示すような突然変異; および/または
    (c) 配列番号4に対応するヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、杯細胞機能の変化に伴う疾患をヒト対象者が発症するというリスクの増大を示すような、または杯細胞機能の変化に伴うヒト対象者の疾患とAGR2発現または機能の変化との関連を示すような、突然変異;
    に対応するアミノ酸またはアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とするタンパク質;
    (ii) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質、または前記マウスAgr2またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する該タンパク質のオルソログであって、該セグメントが非コード部分であり、かつ該タンパク質またはオルソログをコードする遺伝子中の、該タンパク質またはオルソログの発現に影響を及ぼす突然変異に対応する配列を含むことを特徴とするタンパク質またはオルソログ; または
    (iii) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の発現または機能に影響を及ぼすタンパク質、または配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致する前記マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する該タンパク質のオルソログ、
    をコードするmRNAの少なくとも19、20、21、22、23、24または25ヌクレオチド長のセグメントに対して相補的であることを特徴とするsiRNA。
  50. 前記セグメントがmRANの5'非翻訳(UT)領域、オープン・リーディング・フレーム(ORF)または3'非翻訳(UT)領域に由来する配列を含むことを特徴とする、請求項45〜49のいずれか1項に記載のsiRNA。
  51. 請求項45〜50のいずれか1項に記載のsiRNAで形質転換した宿主細胞。
  52. 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項51に記載の宿主細胞。
  53. 前記宿主細胞が原核細胞である、請求項51に記載の宿主細胞。
  54. 請求項1〜21のいずれか1項に記載のタンパク質中のエピトープを特異的に認識する抗体であって、該エピトープが、以下の：
    (a) 配列番号3に一致するマウスAgr2タンパク質の突然変異であって、それがマウスAgr2遺伝子によってコードされ、かつマウスのすべてのまたは実質的にすべての細胞のゲノム中にホモ接合的に存在する場合には、対応する野生型動物と比べた場合の杯細胞機能の変化を伴う、場合によりさらにブルンナー腺の腺上皮の増殖を伴う表現型をもたらすような突然変異; および/または
    (b) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、結腸細胞増殖アッセイ、杯細胞粘液分泌アッセイ、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)セメント腺分化アッセイからなる群より選択されるインビトロ・アッセイで突然変異タンパク質の生物学的活性を対応する野生型マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比較したときに、該活性の変化を示すような突然変異; および/または
    (c) 配列番号4に対応するヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、杯細胞機能の変化に伴う疾患をヒト対象者が発症するというリスクの増大を示すような、または杯細胞機能の変化に伴うヒト対象者の疾患とAGR2発現または機能の変化との関連を示すような、突然変異; および/または
    (d) 配列番号2および配列番号30中のGlu 137;
    に対応する、該タンパク質中のアミノ酸またはアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗体。
  55. 前記抗体が高親和性抗体である、請求項54記載の抗体。
  56. 前記抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体およびFab、Fab’またはF(ab')2フラグメントからなる群より選択される、請求項54または55に記載の抗体。
  57. 前記抗体がIgG、IgM、IgA、IgEおよびIgDより選択されるクラスに属する、請求項54〜56のいずれか1項に記載の抗体。
  58. 前記抗体がIgG1またはIgG2のクラスに属する、請求項57に記載の抗体。
  59. 前記抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項54〜58のいずれか1項に記載の抗体。
  60. 前記抗体が二重特異性抗体、好ましくは一方の結合特異性がエピトープに対する特異性であり、他方の結合特異性が細胞表面タンパク質、たとえば細胞表面受容体または細胞表面受容体サブユニットに対する特異性であるような抗体であることを特徴とする、請求項54〜59のいずれ1項に記載の抗体。
  61. 前記抗体が他の抗体と共有結合して異種共役(ヘテロコンジュゲート)抗体を形成していることを特徴とする、請求項54〜59のいずれ1項に記載の抗体。
  62. 前記抗体をそのエフェクター機能に関して修飾することを特徴とする、請求項54〜61のいずれか1項に記載の抗体。
  63. 前記請求項54〜62のいずれか1項に記載の抗体を
    (a) 細胞毒性剤;
    (b) 細胞毒性剤と、または細胞毒性剤に結合したリガンドまたは受容体と相互作用しうる受容体またはリガンド;
    (c) イメージング剤;
    と共役させて含む免疫共役体。
  64. 前記細胞毒性剤が化学療法剤、毒素または放射性同位体より選択される、請求項63に記載の免疫共役体。
  65. 前記受容体がストレプトアビジンであり細胞毒性剤に結合したリガンドがアビジンである、請求項63または64に記載の免疫共役体。
  66. 前記イメージング剤が放射性同位体、好ましくは18F、64Cu、67Ga、68Ga、99mTc、111In、123I、125I、131I、169Yb、186Reおよび201Tlより選択される放射性同位体好ましくはは99mTcである、請求項63に記載の免疫共役体。
  67. 前記イメージング剤が抗体に共有結合したキレート基と錯体を形成する、請求項63または66に記載の免疫共役体。
  68. 請求項1〜21のいずれか1項に記載のタンパク質中のエピトープに特異的に結合するアンチカリンであって、該エピトープが、以下の：
    (a) 配列番号3に一致するマウスAgr2タンパク質の突然変異であって、それがマウスAgr2遺伝子によってコードされ、かつマウスのすべてのまたは実質的にすべての細胞のゲノム中にホモ接合的に存在する場合には、対応する野生型動物と比べた場合の杯細胞機能の変化を伴う、場合によりさらにブルンナー腺の腺上皮の増殖を伴う表現型をもたらすような突然変異; および/または
    (b) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、結腸細胞増殖アッセイ、杯細胞粘液分泌アッセイ、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)セメント腺分化アッセイからなる群より選択されるインビトロ・アッセイで突然変異タンパク質の生物学的活性を対応する野生型マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比較したときに、該活性の変化を示すような突然変異; および/または
    (c) 配列番号4に対応するヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、杯細胞機能の変化に伴う疾患をヒト対象者が発症するというリスクの増大を示すような、または杯細胞機能の変化に伴うヒト対象者の疾患とAGR2発現または機能の変化との関連を示すような、突然変異; および/または
    (d) 配列番号2および配列番号30中のGlu 137;
    に対応する、該タンパク質中のアミノ酸またはアミノ酸配列を含むことを特徴とするアンチカリン。
  69. 以下の：
    (a) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質、もしくは配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する該タンパク質のオルソログ; または
    (b) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の、もしくは配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する該タンパク質のオルソログの、発現または機能に影響を及ぼすタンパク質;
    に対応するタンパク質中のエピトープに特異的に結合するアンチカリン。
  70. 請求項1〜21のいずれか1項に記載のタンパク質中のエピトープに特異的に結合するアプタマーであって、該エピトープが、以下の：
    (a) 配列番号3に一致するマウスAgr2タンパク質の突然変異であって、それがマウスAgr2遺伝子によってコードされ、かつマウスのすべてのまたは実質的にすべての細胞のゲノム中にホモ接合的に存在する場合には、対応する野生型動物と比べた場合の杯細胞機能の変化を伴う、場合によりさらにブルンナー腺の腺上皮の増殖を伴う表現型をもたらすような突然変異; および/または
    (b) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、結腸細胞増殖アッセイ、杯細胞粘液分泌アッセイ、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)セメント腺分化アッセイからなる群より選択されるインビトロ・アッセイで突然変異タンパク質の生物学的活性を対応する野生型マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比較したときに、該活性の変化を示すような突然変異; および/または
    (c) 配列番号4に対応するヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、杯細胞機能の変化に伴う疾患をヒト対象者が発症するというリスクの増大を示すような、または杯細胞機能の変化に伴うヒト対象者の疾患とAGR2発現または機能の変化との関連を示すような、突然変異; および/または
    (d) 配列番号2および配列番号30中のGlu 137;
    に対応する該タンパク質中のアミノ酸またはアミノ酸配列を含むことを特徴とするアプタマー。
  71. 以下の：
    (a) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質、もしくは配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する該タンパク質のオルソログ; または
    (b) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の、もしくは配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する該タンパク質のオルソログの、発現または機能に影響を及ぼすタンパク質;
    に対応するタンパク質中のエピトープに特異的に結合するアプタマー。
  72. 少なくともそのいくつかの細胞のゲノム中に、配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致するタンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子を含み、該対立遺伝子が下記の突然変異を、すなわち
    (a) 該動物のすべてのまたは実質的にすべての細胞のゲノム中にホモ接合的に存在する場合には、対応する野生型動物と比べた場合の杯細胞機能の変化を伴う表現型をもたらす突然変異; および/または
    (b) 前記マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、結腸細胞増殖アッセイ、杯細胞粘液分泌アッセイ、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)セメント腺分化アッセイからなる群より選択されるインビトロ・アッセイで突然変異タンパク質の生物学的活性を対応する野生型マウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比較したときに、該活性の変化を示すような突然変異に対応する突然変異; および/または
    (c) 前記ヒトAGR2タンパク質の突然変異であって、杯細胞機能の変化に伴う疾患をヒト対象者が発症するというリスクの増大を示すような、または杯細胞機能の変化に伴うヒト対象者の疾患とAGR2発現または機能の変化との関連を示すような突然変異に対応する突然変異;
    を含むことを特徴とするヒト以外の脊椎動物。
  73. 少なくともそのいくつかの細胞のゲノム中に、該動物のAGR2タンパク質の発現または機能に影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子を含み、該対立遺伝子が突然変異を、すなわち該動物のすべてのまたは実質的にすべての細胞のゲノム中にホモ接合的に存在する場合には、対応する野生型動物と比べた場合の杯細胞機能の変化を伴う表現型をもたらす突然変異を、含むことを特徴とするヒト以外の脊椎動物。
  74. 前記変化が機能欠損型の表現型をもたらす、請求項72または73に記載の動物。
  75. 前記変化が機能獲得型の表現型をもたらす、請求項72または73に記載の動物。
  76. 前記変化が杯細胞分化、特に最終分化の変化、および/または杯細胞粘液産生または分泌および/または粘液組成の変化である、請求項72〜75のいずれか1項に記載の動物。
  77. 前記変化が杯細胞中の前ムチン貯蔵顆粒の減少、粘液分泌の変化、腸粘膜上皮または粘膜下組織における二次炎症浸潤を特徴とする変化である、請求項72〜74または請求項76のいずれか1項に記載の動物。
  78. 前記表現型がさらにブルンナー腺の腺上皮の増殖増大を伴う、請求項72〜74または請求項76〜77のいずれか1項に記載の動物。
  79. 前記変化が下痢、または下痢と繁殖能力欠損とを招く、請求項72〜74または請求項76〜78のいずれか1項に記載の動物。
  80. 前記遺伝子が当の動物から見て内在性遺伝子である、請求項72〜79のいずれか1項に記載の動物。
  81. 前記遺伝子が当の動物から見て配列番号3および配列番号4のオルソログであるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項72または請求項74〜80のいずれか1項に記載の動物。
  82. 前記遺伝子が当の動物から見てヘテロな遺伝子である、請求項72〜79のいずれか1項に記載の動物。
  83. 前記遺伝子が請求項1〜18のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする、請求項72または請求項74〜82のいずれか1項に記載の動物。
  84. 前記遺伝子が配列番号2または配列番号30のアミノ酸配列をもつタンパク質をコードする、請求項83に記載の動物。
  85. 前記動物がトランスジェニック動物である、請求項72〜84のいずれか1項に記載の動物。
  86. 前記突然変異が遺伝子の発現の低下または完全消失を招く、請求項72〜85のいずれか1項に記載の動物。
  87. 前記対立遺伝子が遺伝子の内在性プロモータ以外のプロモータの制御下に発現する、請求項72〜86のいずれか1項に記載の動物。
  88. 前記プロモータが遺伝子の内在性プロモータの組織特異性とは異なる組織特異性をもつ、請求項87に記載の動物。
  89. 前記プロモータが誘導性プロモータである、請求項87または88に記載の動物。
  90. 前記細胞が動物の生殖細胞である、請求項72〜89のいずれか1項に記載の動物。
  91. 前記細胞が動物の体細胞である、請求項72〜89のいずれか1項に記載の動物。
  92. 前記動物のすべてまたは実質的にすべての生殖細胞および体細胞のゲノムが対立遺伝子を含む、請求項90または91に記載の動物。
  93. 前記細胞のゲノムが対立遺伝子に関してホモ接合体である、請求項72〜92のいずれか1項に記載の動物。
  94. 前記動物が哺乳動物、好ましくは囓歯類である、請求項72〜93のいずれか1項に記載の動物。
  95. 前記動物がマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、ヒツジおよびウマからなる群より選択される、請求項94に記載の動物。
  96. 杯細胞関連疾患に関するタンパク質診断マーカーまたは核酸診断マーカーの同定のための、または杯細胞関連疾患の分子メカニズムまたは関連する生理学的プロセスの研究を目的とした動物モデルとしての、または杯細胞関連疾患の予防、改善または治療に役立つ薬の同定および試験のための、請求項72〜95のいずれか1項に記載のヒト以外の脊椎動物の使用。
  97. 前記杯細胞関連疾患が喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症、ドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患、特にクローン病または潰瘍性大腸炎、および腸癌からなる群より選択されることを特徴とする、請求項96に記載の使用。
  98. 内在性AGR2の活性の低下または活性の望ましくない状態、たとえば上昇、についての分子メカニズム、関連の生理学的プロセス、関連するまたは影響を受ける疾患の研究のための; 内在性AGR2の発現低下、産生の低下または産生の望ましくない状態、たとえば上昇、の研究のための; またはこれらの疾患の予防、改善または治療に役立つ薬の同定および試験のための、請求項72〜95のいずれか1項に記載のヒト以外の脊椎動物の使用。
  99. 前記薬が小分子薬、ペプチドまたはポリペプチドおよび核酸からなる群より選択される、請求項96〜98のいずれか1項に記載の使用。
  100. 前記薬がAGR2のアンタゴニストである、請求項99に記載の使用。
  101. 前記薬がAGR2のアゴニストである、請求項99に記載の使用。
  102. AGR2の不足または過剰発現に関連する疾患に関するタンパク質または核酸診断マーカーたとえば初期相遺伝子診断マーカーの研究または同定のための、請求項72〜95のいずれか1項に記載のヒト以外の脊椎動物の使用。
  103. AGR2タンパク質受容体の同定のための、またはAGR2活性による調節を受けているが、AGR2の不足または過剰発現に関連する疾患に際してはその調節を受けなくなる遺伝子またはタンパク質の同定のための、請求項72〜95のいずれか1項に記載のヒト以外の脊椎動物の使用。
  104. 杯細胞機能の変化に伴う疾患をヒト対象者が発現するというリスクの増大を示すようなタンパク質または核酸マーカーの同定方法であって、ヒト対象者に由来するテスト・サンプルを分析して該疾患に罹っていないヒト対象者または該疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者に由来する類似テスト・サンプルと比べた場合の差異の存在を調べるステップを含み、該差異が、配列番号4に一致するAGR2タンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子中の、あるいは該AGR2タンパク質の発現または機能に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子中の、突然変異の存在を示すことを特徴とする前記同定方法。
  105. 杯細胞機能の変化に伴うヒト対象者の疾患とAGR2発現または機能の変化との関連を示すようなタンパク質または核酸マーカーの同定方法であって、ヒト対象者に由来するテスト・サンプルを分析して該疾患に罹っていないヒト対象者または該疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者に由来する類似テスト・サンプルと比べた場合の差異の存在を調べるステップを含み、該差異が、配列番号4に一致するAGR2タンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子中の、あるいは該AGR2タンパク質の発現または機能に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子中の、突然変異の存在を示すことを特徴とする前記同定方法。
  106. テスト・サンプルを分析して、疾患に罹っていないヒト対象者または疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者に由来する類似テスト・サンプルと比べた場合の差異の存在を調べるステップを含むことを特徴とする、請求項104または105に記載の方法。
  107. テスト・サンプルが分析されるヒト対象者は杯細胞機能の変化に伴う疾患を発症しているかまたは発症するリスクがあると推測されていることを特徴とする、請求項104〜106のいずれか1項に記載の方法。
  108. 疾患に罹っていないまたは疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者またはヒト対象者群から類似テスト・サンプルを獲得するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項104〜107のいずれか1項に記載の方法。
  109. 前記変化が機能欠損型の表現型をもたらす、請求項104〜108のいずれか1項に記載の方法。
  110. 前記変化が機能獲得型の表現型をもたらす、請求項104〜108のいずれか1項に記載の方法。
  111. 前記変化が杯細胞分化、特に最終分化の変化、および/または杯細胞粘液産生または分泌および/または粘液組成の変化である、請求項104〜110のいずれか1項に記載の方法。
  112. 前記変化が杯細胞中の前ムチン貯蔵顆粒の減少、粘液分泌の変化、腸粘膜上皮および粘膜下組織の二次炎症浸潤を特徴とする、請求項104〜109または請求項111のいずれか1項に記載の方法。
  113. 前記疾患がさらにブルンナー腺の腺上皮の増殖増大を伴う、請求項104〜109または請求項111〜112のいずれか1項に記載の方法。
  114. 前記変化が下痢を招く、請求項104〜109または請求項111〜113のいずれか1項に記載の方法。
  115. 前記疾患が喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症、ドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患、特にクローン病または潰瘍性大腸炎、および腸癌からなる群より選択される、請求項104〜110のいずれか1項に記載の方法。
  116. 前記テスト・サンプルが核酸サンプルである、請求項104〜115のいずれか1項に記載の方法。
  117. 前記核酸がmRNAとゲノムDNAとからなる群より選択される、請求項116に記載の方法。
  118. 核酸サンプルを分析するステップがサンプル中の核酸の少なくとも一部分をポリメラーゼ連鎖反応法で増殖させるステップ、および場合により類似サンプルまたは類似サンプル群中の核酸の少なくとも一部分をポリメラーゼ連鎖反応法で増殖させるステップを含むことを特徴とする、請求項116または117に記載の方法。
  119. 前記テスト・サンプルがタンパク質サンプルである、請求項104〜115のいずれか1項に記載の方法。
  120. 前記タンパク質がAGR2タンパク質である、請求項119に記載の方法。
  121. 前記差異が核酸またはタンパク質の発現レベルの差異である、請求項116〜120に記載の方法。
  122. 前記差異が核酸またはタンパク質のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の差異である、請求項116〜120に記載の方法。
  123. 前記分析ステップがサンプル中の核酸の、または該核酸の増殖部分の、配列を部分決定または完全決定するステップ、および場合により類似サンプルまたは類似サンプル群中の核酸の、または該核酸の増殖部分の、配列を部分決定または完全決定するステップを含むことを特徴とする、請求項122に記載の方法。
  124. 前記対立遺伝子がヒト対象者の生殖細胞ゲノムに含まれる、請求項104〜123のいずれか1項に記載の方法。
  125. 前記対立遺伝子がヒト対象者の体細胞ゲノムに含まれる、請求項104〜123のいずれか1項に記載の方法。
  126. 前記生殖細胞または体細胞のゲノムが前記対立遺伝子の突然変異に関してホモ接合体であるかどうかを判定するステップをさらに含む、請求項124または125に記載の方法。
  127. 前記突然変異が対立遺伝子によってコードされるAGR2タンパク質中のアミノ酸の欠失、他アミノ酸による置換、または配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質のアミノ酸配列中に通常は存在しない追加アミノ酸の挿入を招くことを特徴とする、請求項104〜126のいずれか1項に記載の方法。
  128. 前記欠失、置換または挿入がAGR2タンパク質の保存領域で起こる、請求項127に記載の方法。
  129. 前記突然変異がマウス、ラットおよびヒトAGR2の間で、好ましくはマウス、ラット、ヒトおよびアフリカツメガエルAGR2の間で、より好ましくはマウス、ラット、ヒト、アフリカツメガエルおよび線虫(Caenorhabditis elegans)AGR2の間で一致または類似しているアミノ酸の、他アミノ酸による置換を招くことを特徴とする、請求項127または128に記載の方法。
  130. 前記AGR2タンパク質のアミノ酸の他アミノ酸による置換が非保存的置換である、請求項127〜129のいずれか1項に記載の方法。
  131. 前記AGR2タンパク質中の欠失または置換アミノ酸がVal 137である、請求項127〜130のいずれか1項に記載の方法。
  132. 前記第137位での置換が、以下の:
    a) Val→GluまたはAspなどのような酸性アミノ酸;
    b) Val→His、ArgまたはLysなどのような塩基性アミノ酸;
    c) Val→SerまたはThrなどのような脂肪族ヒドロキシル側鎖アミノ酸;
    d) Val→AsnまたはGlnなどのようなアミド側鎖アミノ酸;
    e) Val→CysまたはMetなどのようなイオウ含有側鎖アミノ酸;
    f) Val→Phe、Tyr、Trpなどのような芳香族側鎖アミノ酸
    g) Val→GlyまたはPro; および
    h) Val→Ala、LeuまたはIle、
    のいずれかの置換であることを特徴とする、請求項131に記載の方法。
  133. 前記第137位での置換がバリンのグルタミン酸による置換である、請求項132に記載の方法。
  134. 前記アミノ酸が天然アミノ酸によって置換される、請求項127〜132のいずれか1項に記載の方法。
  135. 杯細胞機能変化に伴う疾患に関するヒト対象者の発症傾向を明らかにする方法であって、該ヒト対象者では杯細胞機能変化に伴う疾患の発症リスクが大きいことを示す突然変異が配列番号4に一致するAGR2タンパク質をコードしている遺伝子の対立遺伝子中に存在することを、該ヒト対象者に由来するテスト・サンプルが示しているかどうかを明らかにするステップを含む前記方法。
  136. 前記疾患の何らかの発症リスクをヒト対象者に割り当てるステップをさらに含む、請求項135に記載の方法。
  137. 杯細胞機能の変化に伴うヒト対象者の疾患がAGR2発現または機能の変化に関連するかどうかの判定方法であって、AGR2タンパク質の発現または機能の変化を示す突然変異が配列番号4に一致するAGR2タンパク質をコードしている遺伝子の対立遺伝子中に存在することを、該ヒト対象者に由来するテスト・サンプルが示しているかどうかを判定するステップを含む前記方法。
  138. AGR2発現または機能の変化との関連をヒト対象者の疾患の原因とするステップをさらに含む、請求項137に記載の方法。
  139. 前記変化が機能欠損型の表現型をもたらす、請求項135〜138のいずれか1項に記載の方法。
  140. 前記変化が機能獲得型の表現型をもたらす、請求項135〜138のいずれか1項に記載の方法。
  141. 前記変化が杯細胞分化、特に最終分化の変化、および/または杯細胞粘液産生または分泌および/または粘液組成の変化である、請求項135〜140のいずれか1項に記載の方法。
  142. 前記変化が杯細胞中の前ムチン貯蔵顆粒の減少、粘液分泌の変化、腸粘膜上皮および粘膜下組織の二次炎症浸潤を特徴とする、請求項135〜139または請求項141のいずれか1項に記載の方法。
  143. 前記疾患がさらにブルンナー腺の腺上皮の増殖増大を伴う、請求項135〜139または請求項141〜142のいずれか1項に記載の方法。
  144. 前記変化が下痢を招く、請求項135〜139または請求項141〜143のいずれか1項に記載の方法。
  145. 前記疾患が喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症、ドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患、特にクローン病または潰瘍性大腸炎、および腸癌からなる群より選択される、請求項135〜140のいずれか1項に記載の方法。
  146. 前記テスト・サンプルが核酸サンプルである、請求項135〜145のいずれか1項に記載の方法。
  147. 前記核酸がmRNAとゲノムDNAとからなる群より選択される、請求項146に記載の方法。
  148. 前記テスト・サンプルがタンパク質サンプルである、請求項135〜145のいずれか1項に記載の方法。
  149. 前記タンパク質がAGR2タンパク質である、請求項148に記載の方法。
  150. 前記対立遺伝子が前記ヒト対象者の生殖細胞ゲノムに含まれる、請求項135〜149のいずれか1項に記載の方法。
  151. 前記対立遺伝子が前記ヒト対象者の体細胞ゲノムに含まれる、請求項135〜149のいずれか1項に記載の方法。
  152. 前記生殖細胞または体細胞のゲノムが対立遺伝子の突然変異に関してホモ接合体であるかどうかを判定するステップをさらに含む、請求項150または151に記載の方法。
  153. 前記突然変異がAGR2タンパク質の発現の低下または完全消失を招く、請求項135〜152のいずれか1項に記載の方法。
  154. 前記突然変異が対立遺伝子によってコードされるAGR2タンパク質中のアミノ酸の欠失、他アミノ酸による置換、または配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質のアミノ酸配列中に通常は存在しない追加アミノ酸の挿入を招くことを特徴とする、請求項135〜153のいずれか1項に記載の方法。
  155. 前記欠失、置換または挿入がAGR2タンパク質の保存領域で起こる、請求項154に記載の方法。
  156. 前記突然変異がマウス、ラットおよびヒトAGR2の間で、好ましくはマウス、ラット、ヒトおよびアフリカツメガエルAGR2の間で、より好ましくはマウス、ラット、ヒト、アフリカツメガエルおよび線虫(Caenorhabditis elegans)AGR2の間で一致または類似しているアミノ酸の、他アミノ酸による置換を招くことを特徴とする、請求項154または155に記載の方法。
  157. 前記AGR2タンパク質のアミノ酸の他アミノ酸による置換が非保存的置換である、請求項154〜156のいずれか1項に記載の方法。
  158. 前記AGR2タンパク質中の欠失または置換アミノ酸がVal 137である、請求項154〜157のいずれか1項に記載の方法。
  159. 前記第137位での置換が、以下の:
    a) Val→GluまたはAspなどのような酸性アミノ酸;
    b) Val→His、ArgまたはLysなどのような塩基性アミノ酸;
    c) Val→SerまたはThrなどのような脂肪族ヒドロキシル側鎖アミノ酸;
    d) Val→AsnまたはGlnなどのようなアミド側鎖アミノ酸;
    e) Val→CysまたはMetなどのようなイオウ含有側鎖アミノ酸;
    f) Val→Phe、Tyr、Trpなどのような芳香族側鎖アミノ酸
    g) Val→GlyまたはPro; および
    h) Val→Ala、LeuまたはIle、
    のいずれかの置換であることを特徴とする、請求項158に記載の方法。
  160. 前記第137位での置換がバリンのグルタミン酸による置換である、請求項159に記載の方法。
  161. 前記アミノ酸が天然アミノ酸によって置換される、請求項154〜159のいずれか1項に記載の方法。
  162. 前記遺伝子が配列番号30に示す配列をもつAGR2タンパク質をコードする、請求項135〜152または請求項154〜161のいずれか1項に記載の方法。
  163. 請求項1〜21のいずれか1項に記載のタンパク質またはタンパク質断片; 請求項22または23に記載の核酸; 請求項24、25、請求項29〜32のいずれか1項に記載のエピソーム・エレメントまたはベクター; 請求項36〜41のいずれか1項に記載のアンチセンス核酸; 請求項45〜50のいずれか1項に記載のsiRNA; 請求項54〜62のいずれか1項に記載の抗体; 請求項63〜67のいずれか1項に記載の免疫共役体; 請求項68または69に記載のアンチカリン; または請求項70または71に記載のアプタマー、および医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
  164. 薬剤として使用するための、請求項1〜21のいずれか1項に記載のタンパク質またはタンパク質断片; 請求項22または23に記載の核酸; 請求項24、25、請求項29〜32のいずれか1項に記載のエピソーム・エレメントまたはベクター; 請求項36〜41のいずれか1項に記載のアンチセンス核酸; 請求項45〜50のいずれか1項に記載のsiRNA; 請求項54〜62のいずれか1項に記載の抗体; 請求項63〜67のいずれか1項に記載の免疫共役体; 請求項68または69に記載のアンチカリン; または請求項70または71に記載のアプタマー。
  165. 前記薬剤がヒト対象者の杯細胞機能の変化に関連する疾患の治療用であり、また該疾患が場合によりブルンナー腺の腺上皮の増殖増大にさらに関連することを特徴とする、請求項164に記載の、そこに明記した用途のための、タンパク質またはタンパク質断片、核酸、エピソーム・エレメント、ベクター、アンチセンス核酸、siRNA、抗体、アプタマー、アンチカリンまたは免疫共役体。
  166. 前記変化が杯細胞分化および/または杯細胞粘液産生または分泌および/または粘液組成の変化であることを特徴とする、請求項165に記載の、そこに明記した用途のための、タンパク質またはタンパク質断片、核酸、エピソーム・エレメント、ベクター、アンチセンス核酸、siRNA、抗体、アプタマー、アンチカリンまたは免疫共役体。
  167. 前記変化が杯細胞中の前ムチン貯蔵顆粒の減少、粘液分泌の変化、腸粘膜上皮および粘膜下組織の二次炎症浸潤を特徴とする請求項165または166に記載の、そこに明記した用途のための、タンパク質またはタンパク質断片、核酸、エピソーム・エレメント、ベクター、アンチセンス核酸、siRNA、抗体、アプタマー、アンチカリンまたは免疫共役体。
  168. 前記変化が下痢を招く請求項165〜167のいずれか1項に記載のタンパク質またはタンパク質断片、核酸、エピソーム・エレメント、ベクター、アンチセンス核酸、siRNA、抗体、アプタマー、アンチカリンまたは免疫共役体。
  169. 前記薬剤が喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症、ドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患、特にクローン病または潰瘍性大腸炎、および腸癌からなる群より選択される疾患の治療用であることを特徴とする、請求項164または165に記載の、そこに明記した用途のための、タンパク質またはタンパク質断片、核酸、エピソーム・エレメント、ベクター、アンチセンス核酸、siRNA、抗体、アプタマー、アンチカリンまたは免疫共役体。
  170. 突然変異AGR2タンパク質の製造方法であって、請求項33〜35のいずれか1項に記載の宿主細胞を好適な培地で、該タンパク質を発現させるような条件下に培養するステップおよび該細胞または培地を回収するステップを含む前記方法。
  171. 続いてタンパク質を、前記細胞または培地からさらに精製する、請求項170に記載の方法。
  172. 杯細胞の機能変化に伴う疾患に罹っているまたは該疾患を発症するリスクがあると判明しているヒト対象者の細胞に、以下の：
    a) 配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質をコードする、または配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致するタンパク質をコードする、AGR2遺伝子の対立遺伝子の配列; または該疾患に罹っていないヒト対象者または該疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者のAGR2遺伝子の対立遺伝子の配列;
    b) 配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質をコードするDNA配列、または該疾患に罹っていないヒト対象者または該疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者のAGR2遺伝子によってコードされるヒトAGR2タンパク質をコードするDNA配列、または配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致するタンパク質をコードするDNA配列;
    c) 請求項36〜41のいずれか1項に記載のアンチセンス核酸をコードするDNA配列、または該疾患に罹っていないヒト対象者または該疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者のAGR2遺伝子によってコードされるmRNAに対して相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸をコードするDNA配列;
    d) 請求項45〜50のいずれか1項に記載のsiRNAをコードするDNA配列;
    e) 請求項70または71に記載のアプタマーをコードするDNA配列; または
    f) 請求項1〜21のいずれか1項に記載のAGR2タンパク質をコードするDNA配列;
    を含むDNA構造体を送達するステップを含む遺伝子治療の方法。
  173. 前記疾患に罹っていないヒト対象者または該疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者のAGR2遺伝子が、配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質をコードする遺伝子である、請求項172に記載の方法。
  174. 前記細胞がヒト対象者の腸細胞好ましくは杯細胞である、請求項172または173に記載の方法。
  175. 前記細胞がヒト対象者の胃腸細胞、好ましくはブルンナー腺の杯細胞および/または粘液分泌細胞である、請求項172または173に記載の方法。
  176. 前記細胞がヒト対象者の気道細胞、好ましくは気管の粘膜下腺の杯細胞および/または粘液分泌細胞である、請求項172または173に記載の方法。
  177. 前記DNA構造体がウイルス・ベクターである、請求項172〜176のいずれか1項に記載の方法。
  178. 前記DNA構造体がタンパク質、アンチセンス核酸またはsiRNAの発現を指示しうる、請求項172〜177のいずれか1項に記載の方法。
  179. 前記発現が一時的である、請求項178に記載の方法。
  180. 前記DNA構造体が細胞のゲノム中に安定的に一体化されうる、請求項172〜178のいずれか1項に記載の方法。
  181. 前記AGR2遺伝子の対立遺伝子の配列が該遺伝子のコード配列を含む、請求項172〜180のいずれか1項に記載の方法。
  182. 前記AGR2遺伝子の対立遺伝子の配列が該遺伝子の非コード配列を含む、請求項172〜181のいずれか1項に記載の方法。
  183. 杯細胞機能の変化に関連し、場合によりブルンナー腺の腺上皮の増殖増大にさらに関連する疾患の治療のための、または該疾患を発症するリスクがあると判明しているヒト対象者の該疾患の予防のための、
    a) 配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質をコードする、または配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致するタンパク質をコードする、AGR2遺伝子の対立遺伝子の配列; または該疾患に罹っていないヒト対象者または該疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者のAGR2遺伝子の対立遺伝子の配列;
    b) 配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質をコードするDNA配列、または該疾患に罹っていないヒト対象者または該疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者のAGR2遺伝子によってコードされるヒトAGR2タンパク質をコードするDNA配列、または配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致するタンパク質をコードするDNA配列;
    c) 請求項36〜41のいずれか1項に記載のアンチセンス核酸をコードするDNA配列、または該疾患に罹っていないヒト対象者または該疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者のAGR2遺伝子によってコードされるmRNAに対して相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸をコードするDNA配列;
    d) 請求項45〜50のいずれか1項に記載のsiRNAをコードするDNA配列;
    e) 請求項70または71に記載のアプタマーをコードするDNA配列; または
    f) 請求項1〜21のいずれか1項に記載のAGR2タンパク質をコードするDNA配列;
    を含むDNA構造体の使用。
  184. ヒト対象者の杯細胞機能の変化に関連する疾患を予防、治療または改善する方法であって、該ヒト対象者のAGR2活性を調節しうる物質を含む医薬組成物を該対象者に投与するステップを含む前記方法。
  185. 前記医薬組成物が請求項163に記載の医薬組成物である、請求項184に記載の方法。
  186. 前記ヒト対象者のAGR2活性を調節しうる物質が、以下の：
    a) 配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質の配列をもつ単離されたタンパク質;
    b) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する単離されたタンパク質であって、結腸細胞増殖アッセイ、杯細胞粘液分泌アッセイ、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)セメント腺分化アッセイからなる群より選択されるインビトロ・アッセイで、配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質と同じまたは実質的に同じ活性を示すタンパク質;
    c) 配列番号3および配列番号4の対応するアミノ酸と比べたときに前記割合のアミノ酸が一致している少なくとも6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、165個、170個、171個、172個、173個または174個の連続したアミノ酸を含む前記(a)または(b)に記載のタンパク質の単離された断片であって、結腸細胞増殖アッセイ、杯細胞粘液分泌アッセイ、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)セメント腺分化アッセイからなる群より選択されるインビトロ・アッセイで、配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質と同じまたは実質的に同じ活性を示す断片;
    d) 前記(a)〜(c)に記載のタンパク質またはタンパク質断片を、配列番号3および配列番号4中の対応するアミノ酸に対して前記割合のアミノ酸配列の一致を欠く他のタンパク質またはタンパク質断片に融合させて、好ましくは配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2またはヒトAGR2タンパク質とは無関係のタンパク質に融合させて、含む融合タンパク質;
    e) 配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質中に、または杯細胞機能の変化に関連する疾患に罹っていないヒト対象者または該疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者のAGR2遺伝子によってコードされるヒトAGR2タンパク質中に含まれるエピトープを、特異的に認識する抗体; または
    f) 該疾患に罹っていないヒト対象者または該疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者のAGR2遺伝子によってコードされる、好ましくは配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質をコードするAGR2遺伝子によってコードされる、mRNAに対して相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸;
    である請求項184に記載の方法。
  187. ヒト対象者の杯細胞機能の変化に関連し、場合によりブルンナー腺の腺上皮の増殖増大にさらに関連する疾患の予防、治療または改善のための医薬の製造への、AGR2活性を調節しうる物質の使用。
  188. 前記物質が請求項1〜21のいずれか1項に記載のタンパク質またはタンパク質断片; 請求項22または23に記載の核酸; 請求項24、25、請求項29〜32のいずれか1項に記載のエピソーム・エレメントまたはベクター; 請求項36〜41のいずれか1項に記載のアンチセンス核酸; 請求項45〜50のいずれか1項に記載のsiRNA; 請求項54〜62のいずれか1項に記載の抗体; 請求項63〜67のいずれか1項に記載の免疫共役体; 請求項68または69に記載のアンチカリン; および請求項70または71に記載のアプタマーからなる群より選択される、請求項187に記載の使用。
  189. 前記ヒト対象者のAGR2活性を調節しうる物質が、以下の：
    a) 配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質の配列をもつ単離されたタンパク質;
    b) 配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質と比べてアミノ酸が少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％一致する単離されたタンパク質であって、結腸細胞増殖アッセイ、杯細胞粘液分泌アッセイ、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)セメント腺分化アッセイからなる群より選択されるインビトロ・アッセイで、配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質と同じまたは実質的に同じ活性を示すタンパク質;
    c) 配列番号3および配列番号4の対応するアミノ酸と比べたときに前記割合のアミノ酸が一致している少なくとも6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、165個、170個、171個、172個、173個または174個の連続したアミノ酸を含む前記(a)または(b)に記載のタンパク質の単離された断片であって、結腸細胞増殖アッセイ、杯細胞粘液分泌アッセイ、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)セメント腺分化アッセイからなる群より選択されるインビトロ・アッセイで、配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質と同じまたは実質的に同じ活性を示す断片;
    d) 前記(a)〜(c)に記載のタンパク質またはタンパク質断片を、配列番号3および配列番号4中の対応するアミノ酸に対して前記割合のアミノ酸配列の一致を欠く他のタンパク質またはタンパク質断片に融合させて、好ましくは配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2またはヒトAGR2タンパク質とは無関係のタンパク質に融合させて、含む融合タンパク質;
    e) 配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質中に、または杯細胞機能の変化に関連する疾患に罹っていないヒト対象者または発症するリスクがないと判明しているヒト対象者のAGR2遺伝子によってコードされるヒトAGR2タンパク質中に、含まれるエピトープを、特異的に認識する抗体; または
    f) 該疾患に罹っていないヒト対象者または該疾患を発症するリスクがないと判明しているヒト対象者のAGR2遺伝子によってコードされる、好ましくは配列番号4に一致するヒトAGR2タンパク質をコードするAGR2遺伝子によってコードされる、mRNAに対して相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸;
    である請求項187に記載の使用。
  190. 野生型AGR2タンパク質、たとえば配列番号4に一致するAGR2野生型タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、たとえば配列番号5に示すヌクレオチド配列をもつ核酸、またはAGR2の小分子アゴニストの、ヒト対象者の杯細胞機能の変化に関連する疾患の予防、治療または改善への使用であって、該疾患がドライアイ症候群、胃疾患、消化性潰瘍、炎症性腸疾患、特にクローン病または潰瘍性大腸炎、および腸癌からなる群より選択されることを特徴とする前記使用。
  191. ヒト対象者の杯細胞機能の変化に関連する疾患の予防、治療または改善へのAGR2の小分子アンタゴニストの使用であって、該疾患が喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)および嚢胞性線維症からなる群より選択されることを特徴とする前記使用。
  192. 杯細胞関連疾患の予防、改善または治療に有用な物質の同定方法であって、
    a) 候補物質の存在または不存在下に哺乳動物の杯細胞を培養するステップ; および
    b) 該物質の存在が該細胞による粘液および/または1つまたは複数の粘液成分の産生の増加を招くかどうかを判定するステップ;
    を含み、該杯細胞がAGR2タンパク質の発現低下または消失を示すか、または内在性AGR2遺伝子の対立遺伝子の一方または両方に突然変異をもつため該対立遺伝子がもはや発現不能となるまたは請求項1〜18のいずれか1項に記載のタンパク質をコードするようになることを特徴とする前記方法。
  193. 杯細胞関連疾患の予防、改善または治療に有用な物質の同定方法であって、
    a) 候補物質の存在または不存在下に哺乳動物の杯細胞を培養するステップ; および
    b) 該物質の存在が細胞による粘液および/または1つまたは複数の粘液成分の産生の増加を招くかどうかを判定するステップ;
    を含み、該杯細胞がAGR2タンパク質の発現増大を示すか、または内在性AGR2遺伝子の対立遺伝子の一方または両方に突然変異をもつため該対立遺伝子が発現の増大を示すまたは請求項1〜18のいずれか1項に記載のタンパク質をコードするようになることを特徴とする前記方法。
  194. AGR2タンパク質のアンタゴニストの同定方法であって、
    a) 野生型の哺乳動物AGR2タンパク質、好ましくは配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の存在または不存在下に哺乳動物の杯細胞を培養するステップ; および
    b) 該培養細胞に候補アンタゴニスト物質を加えたときに、該野生型AGR2タンパク質の存在下に培養した細胞による粘液および/または1つまたは複数の粘液成分の産生の増加が観測されるかどうかを判定するステップ;
    を含む前記方法。
  195. AGR2タンパク質のアンタゴニストの同定方法であって、
    a) 野生型の哺乳動物AGR2タンパク質、好ましくは配列番号3、配列番号4にそれぞれ一致するマウスAgr2タンパク質またはヒトAGR2タンパク質の存在または不存在下に哺乳動物の杯細胞を培養するステップ; および
    b) 該培養細胞に候補アンタゴニスト物質を加えたときに、該野生型AGR2タンパク質の存在下に培養した細胞による粘液および/または1つまたは複数の粘液成分の産生の減少が観測されるかどうかを判定するステップ;
    を含む前記方法。
  196. 杯細胞がAGR2タンパク質の発現低下または消失を示すか、または内在性AGR2遺伝子の対立遺伝子の一方または両方に突然変異をもつため該対立遺伝子がもはや発現不能となるまたは請求項1〜18のいずれか1項に記載のタンパク質をコードするようになることを特徴とする、請求項194または195に記載の方法。
  197. 前記細胞が、突然変異した内在性AGR2対立遺伝子に関してホモ接合体である、請求項192、193または196のいずれか1項に記載の方法。
  198. 前記細胞が野生型AGR2遺伝子の機能性対立遺伝子を追加的に含まない(すなわち対応する野生型オルソログの、またはヘテロな野生型AGR2遺伝子の、機能性対立遺伝子を欠く)、または野生型AGR2タンパク質(対応する野生型オルソログまたはヘテロな野性型AGR2タンパク質のいずれかに相当)を発現する核酸配列を追加的に含まない、請求項192、196または197のいずれか1項に記載の方法。
  199. 突然変異した対立遺伝子によってコードされるタンパク質が配列番号2または配列番号30に示すアミノ酸配列をもつ、請求項192、193または196〜198のいずれか1項に記載の方法。
  200. 前記粘液成分がムチン2またはトレフォイル・ペプチドである、請求項192〜199のいずれか1項に記載の方法。
  201. 前記物質の存在がムチン2と1つまたは複数のトレフォイル・ペプチドの両方の産生の増大を招くかどうか、または野生型AGR2タンパク質の存在下でのムチン2と1つまたは複数のトレフォイル・ペプチドの両方の産生の増大が候補アンタゴニスト物質の添加時に観測されるかどうかを判定する、請求項200に記載の方法。
  202. 物質の存在がムチン2と1つまたは複数のトレフォイル・ペプチドの両方の産生の低下を招くかどうか、または野生型AGR2タンパク質の存在下でのムチン2と1つまたは複数のトレフォイル・ペプチドの両方の産生の低下が候補アンタゴニスト物質の添加時に観測されるかどうかを判定する、請求項200に記載の方法。
  203. ムチン2および/またはトレフォイル・ペプチドの発現がmuc2-およびトレフォイル・ペプチド-特異的プライマーを使用する定量PCR分析によって決定される、請求項200または202に記載の方法。
  204. 前記哺乳動物の杯細胞がLS174TまたはHT29細胞である、請求項192〜203のいずれか1項に記載の方法。
  205. 前記候補物質が、以下の：
    a) ペプチドまたはポリペプチド;
    b) 核酸(ペプチド核酸を含む); および
    c) 分子量が2000ドルトン以下、好ましくは1500ドルトン以下、より好ましくは1000ドルトン以下、最も好ましくは500、400、300、さらには200ドルトン以下の小分子;
    からなる群より選択される、請求項192〜204のいずれか1項に記載の方法。
  206. 請求項192〜205のいずれか1項に記載の方法によって同定した、または同定しうる物質。
  207. 杯細胞機能の変化に関連する疾患の予防、改善または治療への、請求項206に記載の物質使用。
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