JP2006522611A - より優れた触媒効果を持つブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド及び使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、より優れたコカイン加水分解活性を持つブチリルコリンエステラーゼ及びそれをコード化する対応核酸を提供する。本発明は更にコカイン・ベースのブチリルコリンエステラーゼ基質の加水分解法、及び本発明の変異体によるコカイン誘発症状の治療方法も提供する。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、合衆国国立衛生研究所による認可番号１Ｒ０１ ＤＡ０１１７０７の下に政府の支援を得て行なわれた。合衆国政府は本発明に何らかの権利を有している。

発明の背景

本発明は一般的にコンピューター化学及び分子モデリングの分野に関し、更に具体的には、より優れた触媒効果を持つブチリルコリンエステラーゼ・ポリペプチド変異体に関する。

コカインの乱用は米国では重大な社会及び医学的問題であり、慢性の使用者が推定で３６０万人いる事からもそれは窺える。コカインの乱用は長期的な依存症となり、生命を脅かすような過剰摂取にも至る。しかしコカインの強化作用及び毒性作用に対抗できるような有効な拮抗薬は現在存在しない。

コカイン中毒を治療する拮抗薬の発見が難しい主な理由の一つは、コカインの作用機構にある。特にコカインは神経伝達物質の再摂取を阻害するので、報酬経路の刺激過剰が起きやすい。コカインの強化作用の基礎になっているのがこの刺激過剰である。更にコカインは、高濃度の場合、中枢神経及び心臓血管システムの複数の受容体と相互作用を起こし、過剰摂取に伴う毒性が誘発される。こういう複数の作用機構の故に、コカインの強化作用と毒性作用の両方を治療する選択的な拮抗薬を見つけるのは困難である。更に、コカインと受容体との結合を阻害する拮抗薬は、コカイン同様、多くの有害な作用を引き起こす傾向にある。

最近、血液中のコカインを遮断及び中性化する代替治療方法が提案されている。例えば、ドーパミンＤ１、Ｄ２、Ｄ３拮抗薬は、ラットに於いてコカインの強化力に影響を及ぼすが、こういう拮抗薬の有効用量の範囲は狭く、コカイン作用力の低下の程度もかなり小さい。更にこういうドーパミン拮抗薬は、コカインの自己投与行動に影響を及ぼすレベルを用量が僅かに超えただけで、ドーパミンによって制御をうける他の作用を大幅に低下させてしまう。

別の治療方法は、抗体を使ってコカインの影響から部分的に体を保護する方法である。コカインとの結合後、抗体が化学量論的に枯渇するのも免疫化法の限界である。血液中でコカインを代謝する触媒的抗体を利用すれば、コカインを代謝し放出する事により更に多くのコカインと結合できるので、この問題を部分的に緩和することが可能である。しかし現在見出されている最も優れた触媒的抗体でも、ヒトの内因性血清エステラーゼよりはるかに緩やかな速度でしかコカインを代謝できない。

インビボでは、コカインは主に次の３つの経路で代謝される。（１）肝臓のＮデメチレーションによりノルコカインを形成、（２）血清及び肝臓のエステラーゼによりエクゴニン・メチル・エステルを形成、及び（３）非酵素的加水分解によりベンゾイルエクゴニンを形成。ヒトでは、ノルコカインは代謝物の量としては僅かであり、ベンゾイルエクゴニン及びエクゴニン・メチル・エステルとして投与量の約９０％が代謝される。コカインの代謝物は急速に***され、コカインの毒性や強化作用は示さないようである。血清中のブチリルコリンエステラーゼのレベルが低いと、コカインの過剰摂取後、生理学的に有害作用が生じる。これもブチリルコリンエステラーゼが血漿中コカインの加水分解活性に関係している証拠である。ブチリルコリンエステラーゼ遺伝子に欠陥のある個人から得た血漿には、インビトロでコカインを加水分解する能力はほとんど又は全くないし、ブチリルコリンエステラーゼ遺伝子に欠陥コピーと野生型コピーを１つずつ含む個人の血漿では、コカインの加水分解は通常の半分の速度で進行する。従って、ブチリルコリンエステラーゼ遺伝子に欠陥のある個人は、コカインに対して致命的な反応をする危険性が高い。最近ブチリルコリンエステラーゼの投与によりマウス及びラットをコカインからある程度保護する事が証明された。

ブチリルコリンエステラーゼの投与がインビボでコカインの毒性にある程度の効果を示すのは事実であるが、コカインの加水分解用触媒としては決して有効ではない。野生型ブチリルコリンエステラーゼはコカイン加水分解の活性が低いので、治療用としては、純度の高い酵素を限界量以上に大量に使用しなければならない。

ヒトにも多くの種類のブチリルコリンエステラーゼが存在し他の種にも様々な変種が存在するが、優れたコカイン加水分解活性を示すものは一つも存在しない。様々な組み換えブチリルコリンエステラーゼが試みられたが、コカイン加水分解の活性に増加のみられた変異体はＡ３２８Ｙと名付けられた一つだけであった。ブチリルコリンエステラーゼの臨床評価を行なうには、コカイン加水分解の活性を増大させるブチリルコリンエステラーゼ変異体を更に探す必要がある。

従って、野生型ブチリルコリンエステラーゼよりはるかに効果的にコカインを加水分解できる組み換えブチリルコリンエステラーゼ・ポリペプチドが必要である。本発明はこういうニーズを満たし、それに関連した利点も提供している。

発明の要約

本発明は、より優れたコカイン加水分解活性を持つブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド及びそれをコード化する対応核酸を提供する。本発明は更にコカイン・ベースのブチリルコリンエステラーゼ基質の加水分解法、及び本発明の変異体によるコカイン誘発症状の治療方法も提供する。

（発明の詳細な説明）
本発明は、ヒトの天然のブチリルコリンエステラーゼと比較してコカイン加水分解活性が向上しているブチリルコリンエステラーゼ変異体のポリペプチド、及びそれをコード化している核酸に関する。本発明は、コカイン・ベースのブチリルコリンエステラーゼ基質を加水分解する方法、及びコカイン誘発症状の治療方法にも関する。

コリンエステラーゼは、神経伝達物質アセチルコリン及び種々のエステル含有化合物を加水分解する汎存性で多形性のカルボキシラーゼＢ型酵素である。２種類の主要コリンエステラーゼは、アセチルコリンエステラーゼとブチリルコリンエステラーゼである。ブチリルコリンエステラーゼは以下に示すように様々な種類のコリンの加水分解を触媒する。
ＢＣｈＥ
アセチルコリン ＋ Ｈ_２Ｏ ――――＞ コリン ＋ 対応する酸

ブチリルコリンエステラーゼは、基質としてブチリルコリン及びベンゾイルコリンを優先的に使用する。ブチリルコリンエステラーゼは哺乳類の血漿、肝臓、膵臓、腸の粘膜、及び中枢神経系統の白質の中に存在している。ブチリルコリンエステラーゼをコード化しているヒトの遺伝子は染色体３上にあり、天然に起きるブチリルコリンエステラーゼの遺伝子変異体は３０以上知られている。ブチリルコリンエステラーゼ・ポリペプチドは５７４のアミノ酸を含み、１，７２２の塩基配列によりコード化されている。天然に起きるポリペプタイド変異体は非定型対立遺伝子で、変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、変異体Ｊ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、及び変異体Ｋ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）と呼ばれ、図４に示してある。変異体ＡはＤ７０Ｇ突然変異でまれ（０．５％対立形質頻度）であり、Ｊ変異体はＥ４９７Ｖ突然変異で一家族にしか見出されていない。Ｋ変異体はヌクレオチド１６１５の点突然変異でＡ５３９Ｔ突然変異であり、白人種では対立遺伝子頻度は約１２％である。

天然に起きるヒトのブチリルコリンエステラーゼ変異体の他にも、数多くの種における変異体が知られている。ネコのブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列は、ヒトのブチリルコリンエステラーゼと８８％同じである（図４参照）。異なっている７０のアミノ酸のうち３つは活性部位溝に位置しており、Ａ２２７Ｌ、Ｐ２８５Ｌ、そしてＦ３９８Ｉと呼ばれる。同様に、ウマのブチリルコリンエステラーゼもヒトのブチリルコリンエステラーゼと比べて活性部位の３つのアミノ酸が異なっており、Ａ２２７Ｖ、Ｐ２８５Ｌ、そしてＦ３９８Ｉと呼ばれている（図４を参照）。ラットのブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列活性部位溝に６つの異なるアミノ酸が含まれており、Ａ２２７Ｋ、Ｖ２８０Ｌ、Ｔ２８４Ｓ、Ｐ２８５Ｉ、Ｌ２８６Ｒ、そしてＶ２８８Ｉと呼ばれる（図４参照）。

天然に起きるヒトのブチリルコリンエステラーゼ変異体、他の種の変異体、そして組み換え突然変異体は、キシー（Ｘｉｅ）等、分子薬理学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ） ５５：８３−９１（１９９９）に記述されている。コカイン加水分解活性を増すために試験されたヒトの組み換えブチリルコリンエステラーゼ突然変異体には、次のような１つ又は複数の変更が含まれている：Ｎ６８Ｙ／Ｑ１１９／Ａ２７７Ｗ、Ｑ１１９／Ｖ２８８Ｆ／Ａ３２８Ｙ、Ｑ１１９Ｙ、Ｅ１９７Ｑ、Ｖ２８８Ｆ、Ａ３２８Ｆ、Ａ３２８Ｙ、Ｆ３２９Ａ、及びＦ３２９Ｓ。これらの突然変異体の中で、コカイン加水分解活性の増大を示したブチリルコリンエステラーゼ突然変異体はＡ３２８Ｙ突然変異体だけであり、３２８の位置にアラニン（Ａ）の代わりにチロシン（Ｙ）があり、ヒトのブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性が４倍増大していた（キシー（Ｘｉｅ）等、前出、１９９９）。

本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び５２として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び５２として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの機能的断片を提供する。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を２４倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を１０倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を１６倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を８倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を１００倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を１００倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を９７倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を９１倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を６８倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を４倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を４倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を２倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を３倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を２倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を２倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を１．５倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を２．５倍増大させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を１００倍増大させる。

本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドは、天然に生じる既知の如何なる変異体よりも高率でコカインを加水分解するので、臨床的に重要な意味を持っている。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドが治療上重要な意味を持っているのは、コカイン毒性の致命的症状に他よりもはるかに敏速に反応できるこのコカイン加水分解活性の増大の故である。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドには、コカイン加水分解活性にとって重要であると決定された位置に２つ又はそれ以上のアミノ酸の変更がある。

「ブチリルコリンエステラーゼ」という用語は、本出願で使用される限り、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４として示されている天然に生じるヒトのブチリルコリンエステラーゼ配列を有しているポリペプチドを意味する。

「ブチリルコリンエステラーゼ変異体」という用語は、本出願で使用される限り、構造的にブチリルコリンエステラーゼに似ているが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４として示されているブチリルコリンエステラーゼとはアミノ酸が少なくとも１つ異なっている分子を意味する。ブチリルコリンエステラーゼ変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４として示されているブチリルコリンエステラーゼと構造的に似ているが、優れたコカイン加水分解活性を示す。例えば、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドのコカイン加水分解活性は、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２８、３２、３６、４０、８０、１００倍、あるいはそれ以上増大する場合がある。

ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドは、ブチリルコリンエステラーゼと比べて１、２、３、４、５、あるいはそれ以上のアミノ酸が変更している場合がある。具体的な例として、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの３２８及び３３２の位置にアミノ酸としてそれぞれトリプトファンとメチオニンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及び１と呼ばれる。他の具体的な例としては、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの３２８及び３３２の位置にアミノ酸としてそれぞれトリプトファンとプロリンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及び３と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの３２８及び３３１の位置にアミノ酸としてそれぞれトリプトファンとロイシンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６及び５と本出願で記述されそう呼ばれている。ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの３２８及び３３２の位置にアミノ酸としてそれぞれトリプトファンとセリンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８及び７と本出願で記述されそう呼ばれている：ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの１９９、２２７、２８７、３２８及び３３２の位置にアミノ酸としてそれぞれセリン、アラニン、グリシン、トリプトファンそしてメチオニンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０及び９と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの１９９、２２７、２８７、及び３２８の位置にアミノ酸としてそれぞれセリン、アラニン、グリシン、そしてトリプトファンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２及び１１と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの１９９、２８７、及び３２８の位置にアミノ酸としてそれぞれセリン、グリシン、そしてトリプトファンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４及び１３と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの２２７、２８７、及び３２８の位置にアミ酸としてそれぞれアラニン、グリシン、そしてトリプトファンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６及び１５と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの２２７及び３２８の位置にアミノ酸としてそれぞれアラニンとトリプトファンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８及び１７と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの３３２の位置にアミノ酸としてそれぞれセリンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及び１９と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの３３２の位置にアミノ酸としてそれぞれメチオニンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２及び２１と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの３３２の位置にアミノ酸としてそれぞれプロリンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４及び２３と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの３３１の位置にアミノ酸としてそれぞれロイシンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及び２５と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの２２７の位置にアミノ酸としてそれぞれアラニンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８及び２７と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの２２７の位置にアミノ酸としてそれぞれグリシンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０及び２９と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの２２７の位置にアミノ酸としてそれぞれセリンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２及び３１と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの２２７の位置にアミノ酸としてそれぞれプロリンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４及び３３と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの２２７の位置にアミノ酸としてそれぞれチロシンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６及び３５と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの２２７の位置にアミノ酸としてそれぞれシステインがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８及び３７と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの２２７の位置にアミノ酸としてそれぞれメチオニンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０及び３９と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの１９９の位置にアミノ酸としてそれぞれセリンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２及び４１と本出願で記述されそう呼ばれている；ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの２２７、２８７、３２８、及び３３２の位置にアミノ酸としてそれぞれアラニン、グリシン、トリプトファン、そしてメチオニンがあり、そのアミノ酸配列及びコード化している核酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２及び５１と本出願で記述されそう呼ばれている。

「ポリペプチド」という用語は、本出願で使用される限り、２又はそれ以上のアミノ酸が共有結合したものを意味する。本発明のポリペプチドには、２，３個又は数個のアミノ酸を持つ小さいポリペプチドも数百又はそれ以上のアミノ酸を持つ大きいポリペプチドも含まれる。２つ又はそれ以上のアミノ酸残基の共有結合は、普通、アミド結合である。しかしアミノ酸は、ポリペプチド業界及び化学当業者には周知の他の種々の方法で結合させる事ができる。従ってポリペプチドには、全体的又は部分的に、アミノ酸間にアミド結合のない分子、アミノ酸類似体、そしてミメティックスが含まれる。同様に、環状ペプチドや他の立体配座的に拘束されている構造もこの用語には含まれる。ポリペプチドは天然に生じる方法で修飾する事も可能である。翻訳後の修飾もその中に含まれるが、例えば、リン酸化、脂質化、プレニデーション、硫酸化、ヒドロキシル化、アセチル化、炭水化物の追加、補欠分子族又は補助因子の追加、ジスルフィド結合の形成、蛋白質の加水分解、巨大分子錯体の構成などである。

以下に述べるように、参照ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を持ち、同じようなコカイン加水分解活性を示す限り、本発明のポリペプチドには、例えば、Ｄ立体異性体のような天然に生じるアミノ酸の修飾体、天然には存在しないアミノ酸、アミノ酸類似体、ミメティック等も含まれる。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドには、２つ又はそれ以上のアミノ酸の変更があっても良い。更に、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドには、コカインの加水分解活性には余り影響を与えないが、生物学的安定性の増大のような好ましい特性を付与する修飾が１つ又はそれ以上加わっても良い。

本発明のアミノ酸は、参照アミノ酸配列で規定されているポリペプチドに匹敵する機能及び生物活性を持っている限り、それと類似の配列つまり同一ではない配列であっても良い事は了解済みである。本発明の変異体ポリペプチドには、参照アミノ酸配列と比べて少なくとも約７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、又は８８％、あるいは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％同一の実質的に同じアミノ酸配列も含まれる。あるいは参照ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの生物活性を維持している限り、９５％以上、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸を有していても良い。しかし、スプライス変異体等の故に配列の同一性が上述のレベル以下であるポリペプチド又はコード化核酸、あるいは保存的アミノ酸置換又は変性コドン置換で修飾されているポリペプチド又はコード化核酸も本発明の範囲に含まれている事も了解済みである。

本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の生物活性は、本出願で記述されている限りコカイン加水分解の活性である。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約２４倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｐは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約１０倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ａ３２８Ｗ／Ｖ３３１Ｌは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約１６倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｓは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約７倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ／Ａ１９９Ｓは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約１００倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ａ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ／Ａ１９９Ｓは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約１００倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ａ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ａ１９９Ｓは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約９７倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ａ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約９１倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ａ３２８Ｗ／Ｆ２２７Ａは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約６８倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｙ３３２Ｓは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｙ３３２Ｍは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｙ３３２Ｐは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｖ３３１Ｌは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｆ２２７Ａは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約４倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｆ２２７Ｇは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約４倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｆ２２７Ｓは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約２倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｆ２２７Ｐは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約３倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｆ２２７Ｔは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約２倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｆ２２７Ｃは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約２倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ｆ２２７Ｍは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約１．５倍増大している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体Ａ１９９Ｓは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約２．５倍増大している。そしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２と呼ばれる（本出願ではＡＭＥ−３５９とも呼ばれる）ブチリルコリンエステラーゼ変異体Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａは、コカイン加水分解活性がブチリルコリンエステラーゼと比べて約１００倍増大している。

ブチリルコリンエステラーゼと比較してコカイン加水分解活性が正確にどれだけ増大したかは選択したアッセイ次第であり、それは当業者には良く知られている。従って、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の全てがコカイン加水分解活性を増大させたが、本出願に述べられている値は近似値であり、アッセイの種類が異なれば値も変わってくる場合がある。

一次アミノ酸の僅かな修飾により、配列は類似で同一ではないが、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドに匹敵する機能性又は生物活性を維持するポリペプチドが得られる事は良く知られている。こういう修飾は部位特異的変異のように人為的な場合もあれば、自然突然変異のように偶発的な場合もある。例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの一次構造のほんの一部が、参照ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドのコカイン加水分解活性を有する場合がある。ブチリルコリンエステラーゼ変異体の生物学的機能のうち少なくとも１つが維持されている限り、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの配列の中のそういう機能的断片も本定義に含まれる。本発明のポリペプチドには、他のポリペプチド、炭水化物、脂質、又は化合的修飾のような種々の分子を結合できる事は良く了解されている。

「機能的断片」という用語は、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドとの関連で使用される場合は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの一部を占めるポリペプチド断片を意味し、本出願で記載されているように、参照ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの特徴である生物活性を有するものである。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの機能的断片であるアミノ酸の長さは、約５つのアミノ酸から参照ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの全長である蛋白質配列まで様々である。ある実施例では、アミノ酸の長さは、例えば、少なくとも約１０のアミノ酸、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、あるいはそれ以上のアミノ酸からブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド配列の全体までが含まれる。機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの隣接したアミノ酸配列である場合もあり、その中には、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの基質結合ドメインに対応する隣接したアミノ酸配列も含まれる。機能的活性を示す本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの機能的断片には、例えば、本発明のポリペプチドの少なくとも８、１０、１５、２０、３０、又は４０のアミノ酸、より可能性が高いのは少なくとも５０、７５、１００、２００、３００、４００、あるいはそれ以上のアミノ酸、更にポリペプチドの全長マイナス１つのアミノ酸まで含まれる場合がある。本発明のポリペプチドの機能的断片の適切な長さ及びアミノ酸配列は、機能的断片の使用目的に従って、当業者が決定できる。例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能的断片は、最初のペプチドのコカイン加水分解活性の一部又は全部を維持しているブチリルコリンエステラーゼ変異体の一部であっても良い。

ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの機能的断片は、酵素の触媒活性にとって重要な活性部位残基を含んでいる場合がある。ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの加水分解活性にとって重要な部位は、業界では周知の様々な方法を使って決定又は予測できる。アセチルコリンエステラーゼやカルボキシルエステラーゼのように配列が極めて類似しており、触媒反応が生化学的に類似している関連酵素を通して、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの触媒活性にとって重要な部位の情報を得る事ができる。例えば、構造モデリングにより酵素の活性部位が分かる。それは一次構造では互いに離れているアミノ酸残基が形成する溝、割れ目、裂け目などの三次構造である。従って、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの機能的断片には、コカイン加水分解活性にとって重要なブチリルコリンエステラーゼ酵素の部位を構成するアミノ酸残基、例えば活性部位の溝に沿って存在するアミノ酸残基なども含まれる。

ブチリルコリンエステラーゼ酵素の構造モデリングの他に、生化学的データも、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの機能的断片を調製する際に、コカイン加水分解活性にとって重要なブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの部位を決定又は予測するのに使用できる。この点に関して、コカイン加水分解活性が変化した天然のブチリルコリンエステラーゼ酵素の特徴付けを行なえば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの触媒活性にとって重要な部位の同定に役立つ場合がある。同様に、部位特異的変異の研究も、触媒的に重要なアミノ酸残基に関するデータを提供できる場合がある。この点は、例えば、参照として本出願に編入されているシュバルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）等、Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ６７：２８３−３２２（１９９２）に記載されている。特に、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの機能的断片には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４として示されているブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸位置８２、１１２、１２８、２３１、３２９、３３２、４３０、及び４４０に対応する活性部位の残基も含まれる。従って、機能的断片は、例えば、アミノ酸残基の長さが３６０で、参照ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの残基８０から４４０までを含む場合もある。

従って、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの機能的断片には、コカイン加水分解活性にとって重要であると決定又は予測されるブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の領域又は部位が含まれる。上述したように、構造的方法、生化学的方法、あるいはモデリング方法を使って、コカイン加水分解活性にとって重要な部位を予測又は決定できるが、これは、明確な範囲ではなく概括的な範囲となる。部位には、コカイン加水分解活性にとって重要であると予測されるブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列のうち、２つ乃至それ以上の連続したアミノ酸の位置が含まれる場合もある。本発明の実施に当たり、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの機能的断片として有効なブチリルコリンエステラーゼの部位は、約３０のアミノ酸であって、好ましくは２乃至２０、あるいは５乃至１５の長さであっても良い。

本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片は、参照ブチリルコリンエステラーゼ変異体アミノ酸配列と比較して保存的アミノ酸置換を含む事もできる。コード化されたアミノ酸の保存的置換には、例えば、次のようなグループに属するアミノ酸も含まれる：（１）非極性アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン）、（２）極性中性アミノ酸（システイン、メチオニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、及びグルタミン）、（３）極性酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、（４）極性塩基アミノ酸（リジン、アルギニン、及びヒスチジン）、（５）芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びヒスチジン）。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び５２と同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を持つブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド、又はその機能的断片は、化学的に修飾する事も可能である。但し、そのポリペプチドは、参照ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの生物活性を維持していなければならない。例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの化学的修飾には、アルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨード化等が含まれる。更に、修飾ポリペプチドには、遊離アミノ酸を例えばアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、フォルミル基等を形成するように誘導したペプチドも含まれる。遊離のカルボキシル基の修飾には、塩、メチル及びエチルエステル、又は他のタイプのエステル、あるいはヒドラジドがある。遊離のヒドロキシル基を修飾してＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成する事も可能である。ヒスチジンのイミダゾールの窒素は、誘導してＮ−イム−ベンジルヒスチジンを形成できる。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドに、当業者には良く知られている他の種々の修飾を行う事も可能である。但し、参照ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの生物活性が実質的に同じでなければならない。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び５２と同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を持つ単離されたポリペプチド、又はその機能的断片は、２０の標準アミノ酸の類似体の１つ又はそれ以上で置換する事もできる。例えば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチン、カルボキシグルタミン酸塩等である。そしてペプチド結合していないアミノ酸を含む場合もある。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び５２と同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を持つブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド、又はその機能的断片には、ブチリルコリンエステラーゼ酵素の機能を提供するように官能基を導入するミメティックスも含まれる。従って、ミメティックスには、ポリペプチドの機能を模倣する部分を含む化合物も含まれる。例えば、あるポリペプチドが同じような機能活性を持ち同じような電荷の化学成分を含んでいる場合、ミメティックスは化学的機能を維持するため、同じような電荷の化学成分を同じような空間的方向性と拘束された構造に配置する。ミメティックスは、例えば、ペプチドを模倣する官能基を持っているペプチドミメティックス、ペプトイド、その他ポリβアミノ酸のようなペプチド様ポリマー、非ポリマー化合物等である。

本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドは業界で良く知られている様々な方法を使って調製できる。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体を調製するのに、ランダム変異誘発を利用する事もできる。あるいは、本出願で開示しているように、構造的方法、生化学的方法、及びモデリング方法で得られた情報に基づいて部位特異的変異を行わせ、コカイン加水分解活性にとって重要であると推測されたアミノ酸を標的にする事もできる。例えば、ブチリルコリンエステラーゼの活性部位に於けるコカインの分子モデリングを利用すれば、酵素と基質の適合性に基づいて、より優れた触媒効果を持つアミノ酸の変更が予測できる。本出願に記載されているように、コカイン加水分解活性にとって重要であると推測された残基には、溝にある８つの疎水性残基と３つの触媒性残基が含まれる。更に、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能的構造にとって重要なアミノ酸残基には、分子間鎖ジスルフィド結合に関係するシステイン残基である^６５Ｃｙｓ−^９２Ｃｙｓ、^２５２Ｃｙｓ−^２６３Ｃｙｓ、及び^４００Ｃｙｓ−^５１９Ｃｙｓが含まれる、それらはコカイン加水分解活性を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体の調製の際には一般に変更されない事は了解済みである。

ブチリルコリンエステラーゼの変異誘発又はブチリルコリンエステラーゼ変異体の発現の後、業界で良く知られている方法を使って、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の精製と機能的な特徴付けが行われる。以下に開示するように、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は適切な宿主細胞株を使って発現させ、その後精製し、コカイン加水分解活性の特徴付けを行う。コカイン加水分解活性を有意に増加させると特徴付けられるブチリルコリンエステラーゼ変異体は、その後、コカイン・ベースの基質の加水分解と以下で述べるようにコカイン誘発症状を治療する方法に使用される。

本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体はコカイン加水分解活性を示す。本出願で開示されているように、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼと比較してより高いコカイン加水分解活性を示し、コカイン誘発症状の治療に利用できる。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体と比べて僅かに修飾されたポリペプチドも、同等のコカイン加水分解活性が維持されている限り、本発明の中に含まれる。更に、コカイン加水分解活性の一部又は全体を維持しているブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能的断片も、同様に、本発明に含まれる。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能的断片をコード化している核酸の機能的断片も、同様に、本発明に含まれる。

本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能的断片は組み換えにより調製することが可能であり、ブチリルコリンエステラーゼ変異体又はその機能的断片をコード化している核酸分子を発現させ、それを本出願で記載されている通常の生化学的方法を使って単離するプロセスもこれには関係している。機能的断片は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の全体を酵素的又は化学的に切断しても調製できる事は周知である。酵素的又は化学的な切断方法及び生成したペプチド断片の精製方法は、業界では良く知られている（例えば、次を参照：ドイチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ． １８２、「蛋白質精製の手引き（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）：アメリカン・プレス・インク（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）（１９９０）、参照として本出願に編入）。

更に、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能的断片は化学合成によっても作る事ができる。そういう分子は、Ｄ立体異性体、天然にはないアミノ酸、アミノ酸類似体、及びミメティックスで修飾し、機能活性、安定性、あるいは生物的利用能を最適化させる事もできる。修飾されたアミノ酸及びその使用方法の例は、ソーヤー（Ｓａｗｙｅｒ）、ペプチド・ベースの医薬品デザイン（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）、ＡＣＳ、ワシントン（１９９５）及びグロス・アンド・マイエンホーファー（Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）、ペプチド：分析、合成、生物学（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アカデミック・プレス・インク（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、ニューヨーク（１９８３）に示されており、いずれも参照のため本出願に編入される。

ブチリルコリンエステラーゼ変異体のランダム断片を調製し、本出願に記載されているアッセイで試験する事もできる。本発明の参照ブチリルコリンエステラーゼ変異体のアミノ酸配列と比べて、より好ましい境界や修飾を施した断片を調製する事もできる。あるいは、本出願記載の構造的方法、生化学的方法、及びモデリング方法で得た情報を使って、親異性体のコカイン加水分解活性を維持しているように見えるブチリルコリンエステラーゼ変異体の断片だけを調製する事もできる。本出願に記載されているように、コカイン加水分解活性にとって重要だと推測される残基には、溝にある８つの疎水性残基と３つの触媒的残基も含まれる。更に、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の機能構造には分子鎖間のジスルフィド結合に関係しているシステイン残基である^６５Ｃｙｓ−^９２Ｃｙｓ、^２５２Ｃｙｓ−^２６３Ｃｙｓ、及び^４００Ｃｙｓ−^５１９Ｃｙｓが含まれる。従って、機能的断片は、同等のコカイン加水分解活性を維持するように、コカイン加水分解活性にとって重要な残基の大半あるいは全部あるいは機能構造を持つように設計された参照ブチリルコリンエステラーゼ変異体のトランケート型、部位、又は断片であっても良い。同様に、機能的断片には、構造的又は機能的に重要な参照変異体の残基に似た非ペプチド構造要素を含んでも良い。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体には、ブチリルコリンエステラーゼ変異体又はその機能的断片を治療用蛋白質のような異種の蛋白質に結合する事によって生じる融合蛋白質、及びそういう融合蛋白質をコード化する核酸の融合構造物も含まれる。ブチリルコリンエステラーゼ変異体又はその機能的断片にハイブリダイズできる核酸の断片は、例えば、ハイブリダイゼーション・プローブとして有効であり、本発明の特許請求に含まれている。

従って、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び５２として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含む２１のブチリルコリンエステラーゼ変異体、及びその機能的断片を提供する。本出願に記載されているように、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体はいずれもブチリルコリンエステラーゼよりも優れたコカイン加水分解活性を示す。

本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び５２として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化しているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１，３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、及び５１として示される２１の核酸、及びその断片も提供する。従って、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び５２として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸を提供する。

本発明の核酸分子又はその断片は、中等度にストリンジェントな条件又は極めてストリンジェントな条件下で対象の核酸分子と選択的にハイブリダイズする機能を維持する限り、１つ又はそれ以上の追加、削除、又は置換を参照配列に施す事ができ、その点は了解済みである。中等度にストリンジェントな条件は、４２℃で５０％のホルムアミド、５Ｘデンハーツ溶液、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳの中でフィルタ結合の核酸をハイブリダイズさせ、その後５０℃で０．２Ｘ ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで洗浄するのと同等のハイブリダイゼーション条件を言う。極めてストリンジェントな条件は、４２℃で５０ ％のホルムアミド、５Ｘデンハーツ溶液、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳの中でフィルタ結合の核酸をハイブリダイズさせ、その後６５℃で０．２Ｘ ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで洗浄するのと同等のハイブリダイゼーション条件を言う。他の適切な中等度にストリンジェント又は極めてストリンジェンな緩衝液及び条件は、当業者には良く知られており、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等、分子クローン化：実験室手引書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州プレインビュー（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８９）及びアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等、分子生物学に於ける現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（２０００）等に記載されている。従って、２つの核酸の配列が実質的に相補的であるために同一である必要はない。、特異的なハイブリダイゼーションが可能かあるいは他の同じような配列との間に検出可能な交叉感受性を引き起こすことなく特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば良い。

一般に、参照配列と実質的に同じヌクレオチド配列を持つ核酸分子は、２つの配列の長さを比較した場合、約６０％以上同一であり、例えば参照配列の約６５％以上、７０％、７５％同一で、例えば参照配列の約８０％以上、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％同一である。２つの核酸分子配列の同一性比較は当業者によって、例えばデフォルト・パラメーターを使ったＢＬＡＳＴ ２．０コンピューター・アラインメント等で決定される。ＢＬＡＳＴ ２．０検索は、タティアナ（Ｔａｔｉａｎａ）等、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ Ｌｅｔｔ． １７４：２４７−２５０ （１９９９）に記載されているように、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで入手できる。

本出願で使用される「断片」という用語は、特許請求範囲のポリペプチドをコード化する核酸に関する限り、本発明のポリペプチドをコード化する核酸の一部又はその断片と実質的に同じ配列を持つ核酸を意味する。核酸断片は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸又はブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸に相補的なヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズする十分な長さと配列を有している。従って、断片には、配列決定とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に必要なプライマー、及び核酸ブロットや溶液ハイブリダイゼーションに必要なプローブも含まれるようにする。

同様に、「機能的断片」という用語は、ブチリルコリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸に関する限り、参照変異体ポリペプチドのコカイン加水分解活性の一部又は全部を維持しているブチリルコリンエステラーゼ変異体のうち、その一部をコード化する核酸の一部を意味する。機能活性を示している本発明のポリペプチドの機能的断片には、例えば、そのポリペプチドのアミノ酸残基のうち少なくとも６つの隣接したアミノ酸残基、少なくとも８、１０、１５、２０、３０、又は４０のアミノ酸、更に可能性が高いのは、本発明のポリペプチドの少なくとも５０、７５、１００、２００、３００、４００、あるいはそれ以上のアミノ酸から、全長のポリペプチドから１つのアミノ酸を差し引いた長さまで含まれる。

本出願で使用される「コカイン加水分解活性」という用語は、コカインの加水分解率により測定されるブチリルコリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼ変異体の触媒作用を意味する。

本出願で使用される「有効量」という用語は、コカインの毒性又はコカイン誘発症状の重篤度を和らげる事のできる本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の量を意味する。重篤度の軽減には、例えば、症状、生理学的インジケーター、生化学的マーカー、あるいは代謝インジケーターの休止又は減少が含まれる。コカインの過剰摂取の症状には、例えば、心臓の不整脈、発作、血圧上昇等が含まれる。重篤度の軽減には発症の遅延も含まれる。本出願で使用される「治療」という用語は、コカイン誘発症状の重篤度を軽減させる行為を意味する。

本出願で使用される「コカイン・ベースの基質」という用語は、ブチリルコリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼ変異体で加水分解される（−）コカイン又は（−）コカインと構造的に十分類似の他の分子を意味し、例えば、（＋）コカイン、アセチルコリン、ブチリルチオコリン、ベンゾイルコカイン、ナルコカイン等が含まれる。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される核酸は、図３に示されるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基３２８と３３２をコード化するコドンの位置がそれぞれ異なる。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）では、コドンｇｃｔとｔａｔはアミノ酸位置３２８でアラニン、アミノ酸位置３３２でチロシンをそれぞれコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として示されるＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｔｇｇとａｔｇはアミノ酸位置３２８でトリプトファン、アミノ酸位置３３２でメチオニンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基３２８と３３２をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）では、コドンｇｃｔとｔａｔはアミノ酸位置３２８でアラニン、アミノ酸位置３３２でチロシンをそれぞれコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として示されるＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｐブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｔｇｇとｃｃａはアミノ酸位置３２８でトリプトファン、アミノ酸位置３３２でプロリンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基３２８と３３１をコード化するコドン位置が異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｇｃｔとｇｔｃはアミノ酸位置３２８でアラニン、アミノ酸位置３３１でバリンをそれぞれコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６として示されるＡ３２８Ｗ／Ｖ３３１Ｌブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、対応するコドンはアミノ酸位置３２８でトリプトファン、アミノ酸位置３３１でロイシンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基３２８と３３２をコード化するコドン位置が異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｇｃｔとｔａｔはアミノ酸位置３２８でアラニン、アミノ酸位置３３２でチロシンをそれぞれコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８として示されるＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｓブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｔｇｇとｔｃｇはアミノ酸位置３２８でトリプトファン、アミノ酸位置３３２でセリンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基１９９、２２７、２８７、３３２、及び３２８をコード化するコドン位置が異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｇｃａ、ｔｔｔ、ｔｃａ、ｇｃｔ、そしてｔａｔはアミノ酸位置１９９でアラニン、アミノ酸位置２２７でフェニルアラニン、アミノ酸位置２８７でセリン、アミノ酸位置３２８でアラニン、及びアミノ酸位置３３２でチロシンをそれぞれコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０として示されるＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ／Ａ１９９Ｓブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｔｃａ、ｇｃｇ、ｇｇｔ、ｔｇｇ、そしてａｔｇはアミノ酸位置１９９でセリン、アミノ酸位置２２７でアラニン、アミノ酸位置２８７でグリシン、アミノ酸位置３２８でトリプトファン、及びアミノ酸位置３３２でメチオニンをそれぞれコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基１９９、２２７、２８７、及び３２８をそれぞれコード化するコドン位置が異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｇｃａ、ｔｔｔ、ｔｃａ、そしてｇｃｔはアミノ酸位置１９９でアラニン、アミノ酸位置２２７でフェニルアラニン、アミノ酸位置２８７でセリン、及びアミノ酸位置３２８でアラニンをそれぞれコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２として示されるＡ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ／Ａ１９９Ｓブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｔｃａ、ｇｃｇ、ｇｇｔ、そしてｔｇｇはアミノ酸位置１９９でセリン、アミノ酸位置２２７でアラニン、アミノ酸位置２８７でグリシン、及びアミノ酸位置３２８でトリプトファンをそれぞれコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基１９９、２８７、及び３２８をそれぞれコード化するコドン位置が異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｇｃａ、ｔｃａ、そしてｇｃｔはアミノ酸位置１９９でアラニン、アミノ酸位置２８７でセリン、及びアミノ酸位置３２８でアラニンをそれぞれコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４として示されるＡ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ａ１９９Ｓブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｔｃａ、ｇｇｔ、そしてｔｇｇはアミノ酸位置１９９でセリン、アミノ酸位置２８７でグリシン、及びアミノ酸位置３２８でトリプトファンをそれぞれコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基２２７、２８７、及び３２８をそれぞれコード化するコドン位置が異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｔｔｔ、ｔｃａ、そしてｇｃｔはアミノ酸位置２２７でフェニルアラニン、アミノ酸位置２８７でセリン、及びアミノ酸位置３２８でアラニンをそれぞれコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６として示されるＡ３２８Ｗ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｇｃｇ、ｇｇｔ、そしてｔｇｇはアミノ酸位置２２７でアラニン、アミノ酸位置２８７でグリシン、及びアミノ酸位置３２８でトリプトファンをそれぞれコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基２２７と３２８をコード化するコドンがそれぞれ異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、ヌクレオチドのコドンｔｔｔとｇｃｔはアミノ酸位置２２７でフェニルアラニン、アミノ酸位置３２８でアラニンをそれぞれコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８として示されるＡ３２８Ｗ／Ｆ２２７Ａブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｇｃｇとｔｇｇはアミノ酸位置２２７でアラニン、アミノ酸位置３２８でトリプトファンをそれぞれコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基３３２をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｔａｔはアミノ酸位置３３２でチロシンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０として示されるＹ３３２Ｓブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｔｃｇはアミノ酸位置３３２でセリンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基３３２をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｔａｔはアミノ酸位置３３２でチロシンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２として示されるＹ３３２Ｍブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンａｔｇはアミノ酸位置３３２でメチオニンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基３３２をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｔａｔはアミノ酸位置３３２でチロシンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４として示されるＹ３３２Ｐブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｃｃａはアミノ酸位置３３２でプロリンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基３３１をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｇｔｃはアミノ酸位置３３１でバリンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６として示されるＶ３３１Ｌブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｔｔｇはアミノ酸位置３３１でロイシンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基２２７をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｔｔｔはアミノ酸位置２２７でフェニルアラニンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８として示されるＦ２２７Ａブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｇｃｇはアミノ酸位置２２７でアラニンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基２２７をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｔｔｔはアミノ酸位置２２７でフェニルアラニンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０として示されるＦ２２７Ｇブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｇｇｇはアミノ酸位置２２７でグリシンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基２２７をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｔｔｔはアミノ酸位置２２７でフェニルアラニンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２として示されるＦ２２７Ｓブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンａｇｔはアミノ酸位置２２７でセリンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基２２７をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｔｔｔはアミノ酸位置２２７でフェニルアラニンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４として示されるＦ２２７Ｐブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｃｃｇはアミノ酸位置２２７でプロリンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基２２７をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｔｔｔはアミノ酸位置２２７でフェニルアラニンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６として示されるＦ２２７Ｔブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンａｃｔはアミノ酸位置２２７でトレオニンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基２２７をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｔｔｔはアミノ酸位置２２７でフェニルアラニンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８として示されるＦ２２７Ｃブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｔｇｔはアミノ酸位置２２７でシステインをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基２２７をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｔｔｔはアミノ酸位置２２７でフェニルアラニンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０として示されるＦ２２７Ｍブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンａｔｇはアミノ酸位置２２７でメチオニンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基１９９をコード化するコドンが異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｇｃａはアミノ酸位置１９９でアラニンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２として示されるＡ１９９Ｓブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｔｃａはアミノ酸位置１９９でセリンをコード化する。

本発明は更に核酸を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１で示される核酸又はその断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２として示されるのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する。表１に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２で示される核酸は、図３に示されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸とは、アミノ酸残基２２７、２８７、３３２、及び３２８をそれぞれコード化するコドン位置が異なっている。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）では、コドンｔｔｔ、ｔｃａ、ｇｃｔ、そしてｔａｔはアミノ酸位置１９９でアラニン、アミノ酸位置２２７でフェニルアラニン、アミノ酸位置２８７でセリン、アミノ酸位置３２８でアラニン、及びアミノ酸位置３３２でチロシンをコード化する。それに対して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２として示されるＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸では、コドンｇｃｇ、ｇｇｔ、ｔｇｇ、そしてａｔｇはアミノ酸位置２２７でアラニン、アミノ酸位置２８７でグリシン、アミノ酸位置３２８でトリプトファン、及びアミノ酸位置３３２でメチオニンをそれぞれコード化する。

表１．アミノ酸位置１９９、２２７、２８７、３２８、３３１、及び３３２に対応するヌクレオチド配列。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）と異なるコドン配列が以下に示してある。

ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ライブラリーすなわち分子のコレクションをスクリーニングする事により得られる。ライブラリーには２，３の分子から大量の異なる分子まで含まれており、僅か２分子から１０^１３又はそれ以上の分子に至るまで様々である。従って、ライブラリーのサイズは２から１０、１０から１０^２、１０^２から１０^３、１０^３から１０^５、１０^５から１０^８、１０^８から１０^１０、１０^１０から１０^１３分子まで様々である。ライブラリーを構成している分子は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド等の核酸分子、ペプチド又はポリペプチド（変異体、修飾されたペプチド、１又はそれ以上のアミノ酸類似体などのペプチドも含まれる）等である。更に、ライブラリーを構成している分子は、酵素やその断片のようなペプチドやポリペプチドの活性を模倣するペプチド様分子（本出願ではペプチドミメティックスと呼ぶ）の場合もある。更に、ライブラリーはユーザーの目的及びニーズにより多様な場合又は重複している場合もある。ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドを得るのに適したライブラリーのサイズ及び多様性については、当業者には周知である。

コカイン加水分解活性の増大したブチリルコリンエステラーゼ変異体を十分含めるほどの多様性を持つライブラリーは、業界では周知の種々の方法を使って調製できる。例えば、約５７３のアミノ酸位置のそれぞれに１９のアミノ酸のうち参照ブチリルコリンエステラーゼにはないアミノ酸を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーを作成し、その中からコカイン加水分解活性の増大したものをスクリーニングすれば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体のライブラリーが調製される。

あるいは、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドは、本出願記載のブチリルコリンエステラーゼに関連する構造、生化学、及びモデリングの情報を使って調製したフォーカストライブラリーからも得る事ができる。コカイン加水分解活性にとって重要な残基又は部位の決定又は予測に関する情報、あるいはブチリルコリンエステラーゼの構造的機能に関する情報は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体のフォーカストライブラリーのデザインに当たっては全て有用である事は、了解済みである。従って、コカイン加水分解活性にとって重要であると決定又は予測される部位にあるブチリルコリンエステラーゼ変異体のアミノ酸の変更にフォーカス（集中）できる。コカイン加水分解活性にとって重要であると決定又は予測される部位にあるアミノ酸の変更に的を絞ることにより、ブチリルコリンエステラーゼのフォーカストライブラリーをスクリーニングし、コカイン加水分解活性の増大したブチリルコリンエステラーゼ変異体を同定する。

ブチリルコリンエステラーゼのコカイン加水分解活性にとって重要な部位は、決定又は予測可能である。配列が極めて似ており、生化学的にも触媒作用が類似しているアセチルコリンエステラーゼやカルボキシルエステラーゼのような関連酵素を通して、ブチリルコリンエステラーゼのコカイン加水分解活性にとって重要な部位の情報を得る事ができる。例えば、構造モデリングは酵素の活性部位を明らかにする。それは一次構造では互いに離れているアミノ酸残基が形成する溝、割れ目、裂け目などの三次構造である。従って、コカイン加水分解活性にとって重要なブチリルコリンエステラーゼ酵素の部位を構成するアミノ酸残基には、活性部位の溝に沿って存在する残基も含まれる。ブチリルコリンエステラーゼの構造モデリングに関しては、例えば、参照として本出願に編入されているハレル（Ｈａｒｅｌ）等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０８２７−１０８３１（１９９２）及びソレク（Ｓｏｒｅｑ）等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １７（９）：３５３−３５８（１９９２）に記載されている。

ブチリルコリンエステラーゼの構造モデリング以外にも、コカイン加水分解活性にとって重要なブチリルコリンエステラーゼ酵素の部位を決定又は予測するのに、生化学的データも使用できる。この点に関して、コカイン加水分解活性が変化した天然のブチリルコリンエステラーゼ変異体の特性付けをすれば、ブチリルコリンエステラーゼの触媒活性にとって重要な部位の同定にそれを利用できる。同様に、部位特異的変異の研究も、触媒的に重要なアミノ酸残基に関するデータを提供できる場合がある。この点は、例えば、参照として本出願に編入されているシュバルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）等、Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ６７：２８３−３２２ （１９９２）等に記載されている。

コカイン加水分解活性が増大したブチリルコリンエステラーゼ変異体を調製するに当たり、コカイン加水分解活性にとって重要なブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列又は特定のアミノ酸残基の部位を決定又は予測するのに、各情報を単独で使用する場合も組み合わせて使用する場合も可能である。例えば、コカイン加水分解活性にとって重要なブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の部位又は特定のアミノ酸残基の部位を決定するのに、構造モデリングに基づく情報と生化学的データに基づく情報を組み合わせる事ができる。触媒的に活性な部位を予測するのに、種々の方法で得た情報を組み合わせる事ができるのであるから、その部位は厳密に規定されるものではなく推定である事は、当業者には周知である。従って、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、一般に、コカイン加水分解活性にとって重要であると決定又は予測される部位の外側にアミノ酸の変更が存在する場合もある。同様に、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体にも、コカイン加水分解活性にとって重要であると決定又は予測された部位の外側にアミノ酸の変更が存在する場合もある。更に、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、コカイン加水分解活性を大幅には変更しない他の修飾を行なう場合がある。コカイン加水分解活性にとって重要であると決定又は予測された部位の数は、使用される予測方法により必ずしも一様ではない。

コカイン加水分解にとって重要な部位又は特定のアミノ酸残基の決定に際し、適切な方法でいくつかの部位又は特定の残基が同定されたならば、各部位又は特定の位置をアミノ酸位置の一部又は全体に亘ってランダム化し、各部位の１つ又はそれ以上の位置に於いて、野生型のアミノ酸プラス他の１９の天然アミノ酸の中の１つ又はそれ以上を含む変異体のライブラリーを作成する。表２に要約されているように、コカイン加水分解にとって重要なブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列の部位は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４と呼ばれるヒトのブチリルコリンエステラーゼに対応するアミノ酸残基６８乃至８２、１１０乃至１２１、１９４乃至２０１、２２４乃至２３４、２７７乃至２８９、３２７乃至、３３２、及び４２９乃至４４２である。

ペプチド、ペプトイド、ペプチドミメティックスのような種々のタイプの分子からなる様々な母集団を含むライブラリーを作成する方法は、業界では良く知られている（例えば、エッカー・アンド・クルック（Ｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｃｒｏｏｋｅ）、生物工学（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１３：３５１−３６０（１９９５）、及びブロンデル（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ）等、Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １４：８３−９２（１９９５）、及びそこに引用されている文献を参照。いずれも参照として本出願に編入されている。更に、グッドマン・アンド・ロー（Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｒｏ）、「バーガーの医薬化学及び医薬品の発見（Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）」の医薬品デザインのためのペプチドミメティックス（Ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）、Ｖｏｌ． １（Ｍ．Ｅ．ウルフ（Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆ）版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ） １９９５）、８０３−８６１頁、及びゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）等、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１３８５−１４０１（１９９４）も参照。いずれも参照として本出願に編入されている）。分子がペプチド、蛋白質、あるいはその断片の場合、その分子はインビトロで直接生成する事もできるし、インビトロで生成された核酸から発現させる事も可能である。合成ペプチド化学の方法は、業界では良く知られている。

本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化している核酸発現ライブラリーを作成し、その後それをスクリーニングする事によっても生成できる。そういうライブラリーを作成する方法は、業界では良く知られている（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等、前出、１９８９を参照）。核酸のライブラリーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその類似体で構成しても良い。ＲＮＡ分子を含むライブラリーは、例えば、ＲＮＡ分子を化学的に合成する事によっても作成できる。

ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸は、ユーザーの望む方法で入手できる。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸を得る方法については、当業者には周知である。例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、当業者には周知の方法を使って、ブチリルコリンエステラーゼをコード化する核酸を変異誘発する事により作成できる（分子クローン化：実験室手引書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等、前出、１９８９）。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼの各アミノ酸位置で天然アミノ酸のあらゆる可能性をコード化する核酸を含むようにランダム化し多様性を十分持たせた核酸ライブラリーから得る事ができる。あるいは、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、コカイン加水分解活性にとって重要であると予測又は予め決定された位置に望みのアミノ酸を含むようにした核酸ライブラリーからも得られる。

部位特異的変異などを使って、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸分子に１つ又はそれ以上の突然変異を導入する事により、修飾された核酸分子を作成する事ができる（ウー（Ｗｕ）等、Ｍｅｔｈ． Ｉｎ Ｅｎｚｚｙｍｏｌ、Ｖｏｌ． ２１７、サンディエゴ、アカデミック・プレス（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（１９９３）；ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）、イニス（Ｉｎｎｉｓ）等版の「組み換えＰＣＲ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＰＣＲ）」、ＰＣＲプロトコールス（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、サンディエゴ、アカデミック・プレス（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（１９９０）を参照。いずれも参照として本出願に編入されている）。こういう変異誘発は、目的とする特定のアミノ酸変更を導入するのに利用できる。

オリゴヌクレオチド特異的変異を使ったブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーの効果的な合成方法及び発現は、既に実現されており、ウー（Ｗｕ）等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５：６０３７−６０４２（１９９８）、ウー（Ｗｕ）等、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９４：１５１−１６２（１９９９）、及びクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２：４８８−４９２（１９８５）（ いずれも参照として本出願に編入されている）に記載されている。オリゴヌクレオチド特異的変異は、表現型とは独立に、組織的に突然変異を導入する有効な方法として良く知られており、定向進化法として蛋白質工学には不可欠である。オリゴヌクレオチド特異的変異を行なうには、目的とする突然変異をコード化する核酸ライブラリーを野生型配列のウラシル含有一本鎖テンプレートとハイブリダイズさせる。この方法は柔軟性があり、制限酵素を使わずに正確に突然変異を導入する事ができるし、コドン・ベースの変異誘発を使ってオリゴヌクレオチドを合成するならば、費用も比較的安価である。

コドン・ベースの合成又は誘発変異は、遺伝的重複を避けしかも既知のアミノ酸配列に大量の変更を迅速かつ効果的に与える方法として、あるいは多様なランダム配列の母集団を提供する方法として、業界では良く知られた方法の一つである。この方法は米国特許番号５，２６４，５６３及び５，５２３，３８８の主題であり、グレイサー（Ｇｌａｓｅｒ）等、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４９：３９０３−３９１３（１９９２）にも記載されている。要約すると、例えば、遺伝子コードのアミノ酸を特定する２０の全コドンをランダム化するため、別々の反応容器で結合反応を行なわせる。特定のコドン位置のランダム化は各反応容器の生成物を混合する事により起きる。混合の後、２０の全アミノ酸の等量混合物をコード化しているコドンに対応するランダム反応生成物は、次の位置で各ランダム化コドンの合成を行なうために、別々の反応容器に分けられる。２０のコドンを等量に含む２０の容器を使えば、２０の全アミノ酸の頻度を等しくする事もできる。この方法を使えば、ブチリルコリンエステラーゼの全配列又はコカイン加水分解活性にとって重要であると決定又は予測される部位又は特定の位置のフォーカストライブラリーが作成できる。

上述の合成方法の変形もある。例えば、目的とする位置に予め決められたコドンを合成する方法、あるいはウー（Ｗｕ）等、前出、１９９８が記載しているように、１つ又はそれ以上のコドン位置に予め決められた配列を合成する方法もそれに含まれる。この合成方法には２つの反応容器が使用される。予め決められたコドン又は親コドンは１つの容器で合成され、ランダム・コドン配列は２つ目の容器で合成される。２番目の容器は、完全にランダム化したアミノ酸をある位置で特定するコドン合成のために、上述のように複数の反応容器に分けられる。あるいは、ＮＮＧ／Ｔヌクレオチド又はＮＮＸ／Ｘ（ここでＮは４種類のヌクレオチドの混合物）の結合などにより、縮重コドンの母集団を２番目の反応容器で合成する事もできる。予め決められたコドン又はランダム・コドンの合成の後、２つの反応容器の反応性生物は混合され、次のコドン位置に於ける合成のために、更に２つの容器に分けられる。

多種類の変異体配列を生成するのに利用される上述のコドン・ベース合成の修正方法が、同様に、本出願に記載されているブチリルコリンエステラーゼのライブラリー作成にも利用できる。この修正方法は合成を親配列の方向に偏らせる上述の二容器方法に基づいており、ユーザーはこの方法に基づいて、ランダムなコドン変更を有するコドン位置を特定数含んでいる母集団に変異体を分ける事ができる。

この合成方法は、各コドン位置の合成後、反応容器を新しい２つの容器に分け続ける事により行なわれる。２つの容器に分けた後、連続した２組の反応容器に入っている反応生成物を２番目の容器からまず混合する。この混合により、ランダム変更のコドン位置を同数持つ反応生成物が一つに合わされる。最初と最後の容器の生成物、及び連続した２組の反応容器から得られる新しい混合生成物を２つの容器に分ける事により、合成は進行する。新しい容器の１つでは親コドンが合成され、２番目のコドンではランダム・コドンが合成される。例えば、最初のコドン位置の合成は、１つの反応容器での親コドンの合成と２番目の反応容器でのランダム・コドンの合成を伴う。第２のコドン位置での合成では、最初の２つの反応容器がそれぞれ２つの容器に分けられるので、２組の容器が使われる。各組に於いて、１つの容器で親コドンが合成され、２番目の容器ではランダム・コドンが合成される。直線に並べた場合、第２と第３の容器の反応生成物が混合され、１つのコドン位置にランダム・コドン配列を有する生成物が一つに合わされる。この混合により生成物の母集団は３つに減り、それが次の合成段階の出発母集団となる。同様に、第３、第４、及び残りの位置に関しても、以前の位置の各反応生成物の母集団が２つに分けられ、親コドンとランダム・コドンが合成される。

上述のコドン・ベース合成の修正方法の後、１、２、３、及び４の位置並びにその他の位置にランダム・コドン変更を含む母集団が互いに分離され、個人のニーズに合わせて利用される。更に、親配列合成だけを含む容器も同様にランダム・コドン合成から分離されるので、この合成方法に従えば、ランダム化された配列の方が親配列よりも濃縮される事になる。

コカイン加水分解活性にとって重要であると予測されるブチリルコリンエステラーゼの１つ又はそれ以上の部位にアミノ酸変更を有するブチリルコリンエステラーゼ変異体に関して、それをコード化する核酸のライブラリー合成にこの方法が利用される。

あるいは、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸ライブラリーは、遺伝子シャフリングを使っても作成できる。遺伝子シャフリング又はＤＮＡシャフリングは、組み換えにより多様性を作り出す定向進化法の一方法である（例えば、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１（１９９４）、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ３７０：３８９−３９１（１９９４）。クラメリ（Ｃｒａｍｅｒｉ）等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ３９１：２８８−２９１（１９９８）、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）等、米国特許番号５，８３０，７２１、１９９８年１１月３日提出を参照）。遺伝子シャフリング又はＤＮＡシャフリングは、選択された突然変異遺伝子プールのインビトロ相同組み換えを使った方法である。遺伝子は、例えばＤＮＡ分解酵素を使って無作為に断片化され、ＰＣＲで再構築される。ＤＮＡシャフリングは、多様性を得るため、異なる有機体の相同遺伝子を使って行なう事もできる（クラメリ（Ｃｒａｍｅｒｉ）等、前出、１９９８）。断片化と再構築は複数回行っても良い。再構築されて得られる遺伝子は、本発明の組成及び方法に使用可能なブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーを構成する。

本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び５２として示されているのと同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化しているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１，３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、及び５１として示される２１の核酸、及びその断片も提供する。

本発明の核酸でコード化したブチリルコリンエステラーゼ変異体は、種々の真核細胞で発現可能である。例えば、哺乳類の細胞、昆虫の細胞、植物の細胞、酵母を含まない菌類の細胞などで核酸を発現させる事ができる。本発明の核酸ライブラリーでコード化したブチリルコリンエステラーゼ変異体の発現に有効な哺乳類の細胞株は、例えば、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）、ヒトのＴ２９３、ヒトのＮＩＨ ３Ｔ３細胞株などである。本発明の核酸ライブラリーでコード化したブチリルコリンエステラーゼ変異体の発現は、安定形質移入によっても一過性細胞形質移入によっても達成できる（実施例ＩＩＩ、表３を参照）。

ゲノムの同一部位に変異体の核酸又は異種の核酸を取り込めば、特定の変異体の核酸又は異種核酸の発現だけが異なる同質遺伝子型の細胞株が形成される。単一部位への取り込みは、ｍＲＮＡの転写に影響を及ぼすゲノムの複数部位への組み込みから生じる位置効果、及び細胞当たり複数の核酸を持つ種の複数のコピー又は発現の取り込みから生じる複雑化を最小限に抑える事ができる。変異体の核酸又は異種の核酸をゲノムの特定の場所に挿入するのに使用可能な業界で知られている技術には、例えば、相同組み換え、レトロウイルス標的、リコンビナーゼ媒介標的などがある。

ゲノムの単一部位に変異体の核酸又は異種核酸を挿入する一つの方法はＣreリコンビナーゼの使用であり、真核生物のゲノム、その中でも部位特異的組み換え配列を含む部位に外因性のＤＮＡを挿入する（サウア・アンド・ヘンダーソン（Ｓａｕｅｒ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５１６６−５１７０（１９８８）、フクシゲ・アンド・サウア（Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７９０５−７９０９（１９９２）、べスケ・アンド・サウア（Ｂｅｔｈｋｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ）、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：２８２８−２８３４（１９９７））。ゲノムの特定の部位に外因性ＤＮＡを挿入するには、Ｃreリコンビナーゼの他にＦｌｐリコンビナーゼも使用できる（ディメッキ（Ｄｙｍｅｃｋｉ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：６１９１−６１９６（１９９６））。Ｆｌｐリコンビナーゼの標的部位は、８塩基対のスペーサーで分離された１３塩基対のリピートで構成されている：５’ ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣ［ＴＣＴＡＧＡＡＡ］ＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ３’。本出願に記載されているように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び５２と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼは、Ｆｌｐリコンビナーゼ及びヒトの２９３Ｔ細胞株を使って、ヒトのブチリルコリンエステラーゼの中でも特に表２に掲げられている部位に対応する変異体ライブラリーを哺乳類の細胞に形質移入する事により得られた。本発明の方法では、ゲノムの特定の場所に核酸を挿入するのに、部位特異的リコンビナーゼと対応する組み換え部位を自由に組み合わせて良い事は了解済みである。

適切なリコンビナーゼはベクターにコード化し、それをブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸のベクターと一緒に形質移入する事ができる。あるいは、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸の発現ベクターに、リコンビナーゼの発現要素を取り込む事もできる。リコンビナーゼをコード化する核酸とブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸を同時に形質移入する方法以外にも、リコンビナーゼをコード化するベクターを細胞に形質移入する方法もある。細胞はリコンビナーゼの発現により選択できる。リコンビナーゼを安定的に発現する細胞には、その後、変異体の核酸をコード化する核酸を形質移入する事ができる。

本出願に記載されているように、Ｃreリコンビナーゼを媒介として正確に部位特異的なＤＮＡ組み換えを行なえば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する外因性ＤＮＡの単一コピーが含まれる哺乳類の安定した形質転換株を作成できる。以下の例証の通り、Ｃreリコンビナーゼ媒介の標的事象の頻度は、修正ダブルロックス（ｄｏｕｂｌｅｌｏｘ）戦略を使えば、大幅に増大できる。ダブルロックス（ｄｏｕｂｌｅｌｏｘ）戦略は、ｌｏｘ部位の中心部分にあるヌクレオチドをいくらか変更すると、Ｃreリコンビナーゼ媒介組み換えの部位選択的特異性が変わり、しかも組み換えの効率には殆ど影響がないという観察結果に基づいている（ホウス（Ｈｏｅｓｓ）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：２２８７−２３００（１９８６））。ｌｏｘＰ及び変更ｌｏｘＰ 部位（ｌｏｘ５１１と呼ばれる）を標的ベクターと宿主細胞のゲノムの両方に取り込めば、二重交叉により部位特異的な組み換えが生じる。ダブルロックス（ｄｏｕｂｌｅｌｏｘ）方法を使えば、部位特異的な組み込み体の回収が、単一交叉の挿入組み換えの２０倍に増大し、非正統組み換えの頻度を超えるほどに部位特異的組み換えの絶対頻度が増大する（べスケ・アンド・サウア（Ｂｅｔｈｋｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ）、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：２８２８−２８３４（１９９７））。

ブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーを哺乳類の細胞株で発現させた後、無作為に選択したクローンの配列を決め、コカイン加水分解活性増大のスクリーニングを行なう。選択されたクローンの配列決定法は当業者には良く知られており、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等、前出、１９８９、及びアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等、前出、２０００等に記載されている。ブチリルコリンエステラーゼ変異体のコカイン加水分解活性を測定する適切な方法の選択は、入手可能なブチリルコリンエステラーゼ変異体の量など様々な要因に基づいて決定される。ブチリルコリンエステラーゼ変異体のコカイン加水分解活性は、例えば、分光光度法、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を均一に捕捉するためにポリクローン性抗ブチリルコリンエステラーゼ抗体を使うマイクロタイター・ベースのアッセイ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）等で測定される。

ブチリルコリンエステラーゼと比較したブチリルコリンエステラーゼ変異体のコカイン加水分解活性の増大は、触媒効果の比較により決定できる。コカイン加水分解活性増大を示しブチリルコリンエステラーゼ変異体を発現させるクローンの配列を決め、突然変異の正確な場所と性質を確認する。ブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーが全てスクリーニングされたかどうかを確認するため、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の同一のアミノ酸変更をコード化するクローンが複数回同定されるまで、各ライブラリーのスクリーニングを継続する。

コカイン加水分解活性増大を示しブチリルコリンエステラーゼ変異体を発現させるクローンは、大量のブチリルコリンエステラーゼを精製するのに適した大規模な培養の確立に使用できる。興味のあるブチリルコリンエステラーゼ変異体を発現ベクターにクローン化し、ある細胞株に形質移入を行い、後にその規模を拡大する。当業者には、特定のアプリケーションにどのタイプの発現ベクターが適しているかは周知である。コカイン加水分解活性増大を示すブチリルコリンエステラーゼ変異体は、例えば、特定の化学薬品に抵抗力のある遺伝子を持つ発現ベクターにクローン化すれば、形質移入した細胞を積極的に選択できる。例えば哺乳類の細胞株への形質移入に適した発現ベクターには、哺乳類の細胞で選択されるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのようなプロモーターが含まれる場合もある。本出願に記載されている通り、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は哺乳類の発現ベクターにクローン化し、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）に形質移入される。ブチリルコリンエステラーゼ変異体の発現に適した発現ベクターは業界では良く知られており、市販品が入手可能である。

ブチリルコリンエステラーゼ変異体を発現するクローンを選択し、コカイン加水分解活性の試験を行う。コカイン加水分解活性増大を示すクローンを含む細胞は、通常の細胞培養システムを使って増殖させ、関心のあるブチリルコリンエステラーゼ変異体を大量に生産する。濃縮された組み換えブチリルコリンエステラーゼ変異体は回収され、業界で良く知られている方法で精製を行う。例えば、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）等、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ３６：２２６６−２２７７（１９９７）（参照として本出願に編入）等にその方法が記載されている。

インビトロでコカイン加水分解活性の増大を示すブチリルコリンエステラーゼ変異体は、コカインの毒性及び中毒の治療にインビボで利用できる。コカイン加水分解活性増大を示すブチリルコリンエステラーゼ変異体を使ったコカイン毒性の治療効果は、本出願に記載されている急性過剰投与動物モデル（実施例ＶＩを参照）を使って試験できる。更に、以下に記載するように、強化及び識別の動物モデルを使って、ブチリルコリンエステラーゼ変異体によるコカイン中毒の治療効果を予測する。過剰投与及び強化と識別モデルに適した動物は業界では良く知られており、例えば、げっ歯類や霊長類モデル等もそれに含まれる。１つ又はそれ以上の動物モデルに於いてコカインの毒性又はコカイン中毒のいずれかに効果を示したブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の有効量を個人に投与する事により、コカイン誘発症状の治療に使用できる。

血清半減期が延長したブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の試験又はコカイン誘発症状を示す個人の治療に有効である。ブチリルコリンエステラーゼ変異体の血清半減期を延長させる有効な方法には、例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の四量体への変換、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やデキストラン等の合成ポリマー及び天然のポリマーをトランケートしたブチリルコリンエステラーゼ変異体へ共有結合させる方法、リポソーム形成、Ｉｇ融合蛋白としての酵素の発現等が含まれる。尚、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の四量体への変換は、ＣＯＬＱ遺伝子を宿主細胞に同時形質移入し、ポリＬプロリンを形質移入された細胞の培地に添加すれば達成できる。ブチリルコリンエステラーゼ変異体の血清半減期を延長させる業界で良く知られたこういう方法又は他の方法は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を動物で試験したり、コカイン誘発症状を示す個人で試験したりするのに有効である。

本発明は、コカイン・ベースのブチリルコリンエステラーゼ基質を加水分解する方法も提供しており、それには、コカインを加水分解して代謝産物にする条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び５２として示されているグループから選択されたブチリルコリンエステラーゼ変異体をブチリルコリンエステラーゼ基質に接触させる方法も含まれる。本出願で各変異体について記載している通り、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼと比較しコカイン加水分解活性を増大させる。

更に本発明はコカイン誘発症状を治療する方法も提供しており、それには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、及び５２として示されているグループから選択されたブチリルコリンエステラーゼ変異体の有効量を個人に投与する方法も含まれる。本出願で各変異体について記載している通り、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ブチリルコリンエステラーゼと比較しコカイン加水分解活性を増大させる。

本出願記載の通り、コカイン加水分解活性増大を示すブチリルコリンエステラーゼ変異体は、コカイン・ベースのブチリルコリンエステラーゼ基質をインビトロでもインビボでも加水分解できる。コカイン・ベースのブチリルコリンエステラーゼ基質は、例えば、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリー・クローンの培養物から分離された上澄み液に基質を添加する方法等により、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体とインビトロで接触させる事ができる。あるいは、基質と接触させる前に、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を精製しても良い。コカイン・ベースの基質を本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体に接触させる適切な培地条件は、当業者によって容易に決定される。例えば、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスに入った１００μＭのコカインは、３７℃で、ブチリルコリンエステラーゼ変異体と接触させる事ができる。以下に記載されているように、培養上澄み液から得られるブチリルコリンエステラーゼ変異体は、基質と接触する前に、抗体のような捕捉剤で固定しても良い。そうすれば、培養上澄み液の成分を除去する事ができ、固定された変異体を汚染物のない状態で基質と接触させる事ができる。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体をコカイン・ベースの基質に接触させた後、業界で良く知られた種々の方法及び本出願記載の方法、例えば、高速液体クロマトグラフィやアイソトープ・トレーサー・コカイン加水分解アッセイ等を使って、コカイン加水分解活性を測定する。

本発明は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の治療有効量を投与する事によりコカイン過剰摂取及びコカイン中毒を治療する方法も提供する。コカイン誘発症状の治療には、本発明の方法を予防的に使用するアプリケーションも含まれ、将来のある時点でコカインに接触する事が予測されている個人に本発明の変異体が投与される。予防的な本発明の実施例では、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の治療有効量がコカインと接触する前に投与される。Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）に関して図８及び１２に示されているように、本発明の変異体で予め治療しておけば、コカインの毒性を減少させ、コカイン誘発毒性に伴う発症時間を遅らせる事ができ、治療効果が発揮される。

ブチリルコリンエステラーゼ変異体の有効量は、例えば、急性の過剰摂取の治療なのか慢性の中毒の治療なのか、投与経路及び形態、投与される分子の効力及び生物活性の半減期、個人の体重及び健康状態、以前の療法又は併用療法などの条件により決定される。特定のアプリケーションに関して有効量であると考えられる適切な量は、本出願記載の内容及び手引きを使って、当業者が決定できる。例えば、本出願記載のインビトロ又はインビボによるブチリルコリンエステラーゼ・アッセイからその量を外挿する事が可能である。個人の健康状態は治療期間中ずっとモニターする必要があり、それに従って投与される化合物の量を調節しなければならない事は、当業者は良く認識している。

コカイン過剰摂取に関し、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体の治療有効量は、治療条件次第ではあるが、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重乃至０．１５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．１５ｍｇ／ｋｇ乃至０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ乃至０．５ｍｇ／ｋｇ、より望ましいのは約１ｍｇ／ｋｇ乃至５ｍｇ／ｋｇである。例えば、コカイン過剰摂取の症状を示している個人にブチリルコリンエステラーゼ変異体を投与する場合は、１度だけの多量投与が適切であるが、慢性のコカイン中毒症状を示している個人には少量ずつ１回乃至数回一日あたり、一週あたり、一月あたり、あるいは更に頻度を下げて投与するのが望ましい。同様に、徐放型製剤であれば、慢性のコカイン中毒の治療を受けている個人に、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を少量ずつ継続投与する事が可能である。ブチリルコリンエステラーゼ変異体の用量は、その変異体の触媒活性に基づいて調整しなければならない事は了解済みである。例えば、コカイン加水分解活性が極めて高い変異体の場合は、コカイン加水分解活性の低い変異体に必要な用量よりも少ない量を投与しなければならない。

ブチリルコリンエステラーゼ変異体による治療開始時間は、コカイン・ベースの基質、例えばコカインと接触する前でも良いし、コカイン・ベースの基質に接触した後でも良い。コカイン過剰摂取の治療の場合は、治療効果を最大にするため、接触後できるだけ早急に本発明の変異体を投与するのが望ましい。Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体に関して図９が示しているように、接触後８分に投与された場合はコカイン誘発毒性の治療効果が完全に維持されており、それ以降に投与された場合は、生理学的に不可逆的なコカイン毒性の症状が開始する事によりその効果は減少する。しかしながら、図９が示すように、コカイン誘発毒性に伴う症状が開始した後に投与された場合でも、本発明の変異体による治療は有効である。従って、コカイン誘発毒性の治療に関して、本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は接触以前に投与しても良いし、接触後例えば数秒又は数分以内でも良い。これには、約１分以内後、約２分以内後、約３分以内後、約４分以内後、約５分以内後、約６分以内後、約７分以内後、約８分以内後、約９分以内後、約１０分以内後、約１１分以内後、約１２分以内後、約１３分以内後、約１４分以内後、約１５分以内後、約１６分以内後、約１７分以内後、約１８分以内後、約１９分以内後、約２０分以内後、約２１分以内後、約２２分以内後、約２３分以内後、約２４分以内後、約２５分以内後、約３０分以内後、約３５分以内後、約４０分以内後、約４５分以内後、約５０分以内後、約５５分以内後、約６０分以内後、約９０分以内後、約１２０分以内後も含まれる。

毒性に対する有効治療時間を制限しているのは、生理学的症状の不可逆性とコカイン誘発毒性に伴う損傷だけである事は了解済みである。図９が示すように、特定の症状が始まった時、特に軽い痙攣が最初に起きた時にも治療効果は維持されていたし、更に重篤な症状が発現した時、特に第２の痙攣の時にもその効果は有意に維持されていた。治療効果は一般に接触後の時間に関係しているが、症状の進行にも対応しているので、その点も考慮しなければならない事も更に了解済みである。例えば、接触後の症状の進行を観察し、進行時間よりもむしろ症状の進行に関する観察を基に特定の治療パラメーターを選択するのが良い。

ブチリルコリンエステラーゼ変異体は静脈内又は動脈内のように全身に投与する事ができる。ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、業界の一般技術者に知られている製剤技術を使い、薬学的に受け入れられている製剤として、単離され実質的に精製されたポリペプチド及びポリペプチド断片の形で提供しても良い。こういう製剤は通常の経路で投与しても良い。例えば、局所、経皮、腹腔内、頭内、脳室内、大脳内、膣内、子宮内、経口、直腸内、腸管外（例えば静脈内、髄腔内、皮下、筋肉内）等の経路である。更に、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を生物分解性のポリマーに取り込む事により、コカイン中毒症状を呈している個人の治療に有効な化合物の継続放出が可能となる。生物分解性のポリマー及びその使用方法に関しては、例えば、参照として本出願に編入されているブレム（Ｂｒｅｍ）等、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７４：４４１−４４６（１９９１）に詳細が記載されている。

ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、薬学的に受け入れられている媒体と一緒に、溶液又は懸濁液として投与しても良い。そういう薬学的に受け入れられている媒体は、例えば、水、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、普通の生理食塩水、リンガー液、その他の生理学的な緩衝生理食塩水、又は他の溶媒、あるいはグリコール、グリセロール、オリーブ油などのオイル、注射可能有機エステルなどの賦形剤であっても良い。薬学的に受け入れられている媒体には、これ以外にも、例えばブチリルコリンエステラーゼ変異体を安定させる又は吸収を増大させる生理学的に認められた化合物も含まれる。そういう生理学的に認められた化合物には、例えば、ブドウ糖、ショ糖、デキストラン等の炭水化物、アスコルビン酸やグルタチオン等の抗酸化剤、微生物の膜を破壊するＥＤＴＡ等のキレート剤、カルシウムやマグネシウム等の二価の金属イオン、低分子量蛋白質、脂質やリポソーム、あるいは他の安定剤や賦形剤などが含まれる。

腸管外投与に適した製剤には、上述の薬学的に受け入れられる媒体等の水溶性及び非水溶性の無菌注射剤も含まれる。溶液には、例えば、緩衝液、静菌薬、受容者の血液と製剤を等張にするための溶質等を加えても良い。製剤には、この他にも例えば、懸濁剤や濃化剤などを含んだ水溶性及び非水溶性の無菌懸濁液も含まれる。製剤は、単位用量又は複数用量を例えば封印されたアンプルや小瓶の形で提供し、使用直前に無菌液体の担体の添加を必要とする凍結乾燥状態で保存しておいても良い。即席の注射液又は懸濁液は、以前に述べた種類の無菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製しても良い。

本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、他の治療薬と一緒に併用療法に用いる事もできる。ブチリルコリンエステラーゼ変異体を含む併用療法は、それぞれ安定した形の変異体及び追加の治療薬を含む製剤で構成される。あるいは、併用療法は、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を治療用蛋白質のような異種の蛋白質と結合させる融合蛋白質で構成されていても良い。

本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ペプチド又は変異体をコード化する核酸を個人に投与しても良い。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化する核酸は、ポリペプチドや変異体の治療有効量を投与する方法として業界で良く知られている種々の遺伝子療法と併用すれば有効である。本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、治療有効量を達成するため、本出願記載の内容及び手引きを使って、業界で良く知られた方法として送達及びコード化された配列の発現に利用されているベクターや送達システムに取り込んでも良い。業界で良く知られている適用可能なベクター及び送達システムには、例えば、レトロウイルス・ベクター、アデノウイルス・ベクター、アデノ関連性ウイルス、標的化のためのリガンド結合粒子及び核酸、単離ＤＮＡ及びＲＮＡ、リポソーム、ポリリジン、肝細胞療法を含む細胞療法、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を発現させるように修飾した細胞の移植、その他当業者には周知の遺伝子送達方法及び修飾方法が含まれ、本出願に参照として編入されているシェイ（Ｓｈｅａ）等、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） １７：５５１−５５４（１９９９）等に記載されている。

コード化された核酸配列を発現させる事によりブチリルコリンエステラーゼ変異体の送達を行なう具体的な方法は、業界では良く知られており、例えば、米国特許番号５，３９９，３４６、５，５８０，８５９、５，５８９，４６６、５，４６０，９５９、５，６５６，４６５、５，６４３，５７８、５，６２０，８９６、５，４６０，９５９、５，５０６，１２５、欧州特許出願番号ＥＰ ０ ７７９ ３６５ Ａ２； ＰＣＴ Ｎｏ． ＷＯ ９７／１０３４３； ＰＣＴ Ｎｏ． ＷＯ ９７／０９４４１； ＰＣＴ Ｎｏ． ＷＯ ９７／１０３４３ （いずれも参照として本出願に編入されている）等に記載されている。業界で知られている方法は他にも種々存在し、コード化された核酸配列を発現させる事によりブチリルコリンエステラーゼ変異体の送達を行なう方法として、同様に適用可能である。

ブチリルコリンエステラーゼは、コカイン過剰摂取やコカイン中毒のようなコカイン誘発症状の治療以外にも、コカイン過剰摂取の影響が開始するのを避けるため、コカインが血液中に入る前に予防的に投与しても良い。コカイン加水分解活性の増大を示す本発明のブチリルコリンエステラーゼ変異体は、コカイン誘発物質の存在及び量を効果的に決定する手段として、診断的な価値も有しているのではないかと考えられている。

本発明の種々の実施例の活性に実質的な影響を及ぼさない改良も、本出願記載の本発明の定義の中に含まれる事は了解済みである。従って、以下の実施例はあくまでも例証であり、本発明を制限するものではない。

実施例Ｉ コカイン加水分解アッセイの開発
この実施例は、何百というブチリルコリンエステラーゼ変異体を同時にしかも効果的に分析するためのコカイン加水分解アッセイの開発を記述するものである。

アイソトープ・トレーサーコカイン加水分解アッセイの開発
新しいコカイン加水分解アッセイの正当性を確認するため、まず、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使って、以前記載されているように（キシー（Ｘｉｅ）等、分子薬理学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ） ５５：８３−９１（１９９９））、ブチリルコリンエステラーゼによるコカインの加水分解を測定した。ｐＨ７．４の１０ｍＭトリスに１００μＭのコカインを含む反応液にウマのブチリルコリンエステラーゼ（ＩＣＮ ファーマスーティカルズ・インク（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州コスタメサ（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ， ＣＡ））を添加し、３７℃で２−４時間培養した。培養後、ｐＨを３に調整し、サンプルを濾過した。その後、０．０５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ３．０）とアセトニトリルの８０：２０混合物で予め均衡化したＨｙｐｅｒｓｉｌ逆相カラム（ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）、デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ））にサンプルを注いだ。均一溶出液でコカイン、ベンゾイルエクゴニン、そして安息香酸を溶出し２２０ｎｍで定量化した。エクゴニン・メチルエステル及び安息香酸の形成測定は、反応液中のブチリルコリンエステラーゼの量と反応時間に依存している。

アイソトープ・トレーサー・アッセイの最後に、ｐＨ３．０に於ける生成物と基質の溶解性の違いを利用するため、反応混合物の一部を酸性化した。ｐＨ３では、［３Ｈ］安息香酸（ｐＫａ＝４．２）は２，５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）と［１，４−ビス−２−（４−メチル−５−フェニルオキサゾリル）−ベンゼン］（ＰＯＰＯＰ）で構成されるシンチレーションカクテル（ＰＰＯ−ジメチル−ＰＯＰＯＰ液体シンチレーター、リサーチ・プロダクツ・インターナショナル・コーポレーション（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．）、イリノイ州マウント・プロスペクト（Ｍｔ． Ｐｒｏｓｐｅｃｔ， ＩＬ））に溶解するが、［３Ｈ］コカインは溶解しない。酸性化された反応混合物によって酵素ブランクから発せられるシグナルは、液体シンチレーター中の全ｄｐｍの２％未満であり、コカインがＰＰＯ−ジメチル−ＰＯＰＯＰには溶解しないという結論に一致していた。

アイソトープ・トレーサー・コカイン加水分解アッセイは、既に確立されているＨＰＬＣアッセイと直接比較する事により正当性が確認され、アイソトープ・アッセイの正確性はウマのブチリルコリンエステラーゼのＫ_ｍ値を測定することにより証明された。安息香酸の形成速度を測定する事により決定されるコカインの加水分解率は、様々な量のブチリルコリンエステラーゼを含む反応物のＨＰＬＣ及びアイソトープ・トレーサー・アッセイにより定量化された。［^３Ｈ］安息香酸の形成はアッセイ・インキュベーションの長さと添加されたブチリルコリンエステラーゼの量に依存している。既に確立されたＨＰＬＣアッセイとアイソトープ・トレーサー・アッセイの間の相関関係は、ＨＰＬＣで測定された安息香酸の形成とアイソトープ・アッセイで測定された安息香酸の形成の定量値を図上に記入する事により証明された（図５Ａを参照；ｒ^２＝０．９７９）。アイソトープ・アッセイの正確さと感度を証明するため、図５Ｂに示されるように、ウマのブチリルコリンエステラーゼによるコカイン加水分解をラインウィーバー−ブルク二重逆数プロットを使って測定しＫ_ｍを決定した。速度は、３７℃で２時間インキュベートした後、形成されたｃｐｍ安息香酸ｘ１０^−５として計算された。このデータに基づけば、コカイン加水分解のＫ_ｍは約３７．６μＭ（Ｘ切片＝−１／Ｋ_ｍ）であり、以前に公表されたウマのブチリルコリンエステラーゼの値である３８μＭ（ガトリー（Ｇａｔｌｅｙ）、前出、１９９１）及び４５±５μＭ（キシー（Ｘｉｅ）等、前出、１９９９）に近似していた。

活性ブチリルコリンエステラーゼの固定
ブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーの各クローンから分離された上澄み液には、ブチリルコリンエステラーゼ酵素の濃縮物が含まれている。従って、各ブチリルコリンエステラーゼ変異体から分離された培養上澄み液の等量を測定して得られるコカイン加水分解活性は、発現レベルと酵素活性を反映している。酵素濃縮物の等量を比較し、望ましい活性を持った変異体を迅速に同定するため、抗体のような捕捉剤を使って培養上澄み液のブチリルコリンエステラーゼを固定する。そういう捕捉剤は、以前ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ）等、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５３：３７−４５（１９９７）に記載されているように、低濃度のブチリルコリンエステラーゼで飽和されうる。その結果、希釈サンプルのブチリルコリンエステラーゼは濃縮され、培養上澄み液の最初の濃度に関係なく、異なるブチリルコリンエステラーゼ変異体クローンの均一な量が固定される。その後、アッセイに影響を及ぼす可能性のある結合していないブチリルコリンエステラーゼや他の培養上澄み液成分（無関係な血清や重要なエステラーゼ活性を持つ細胞由来の蛋白質など）は洗浄・除去され、固定されたブチリルコリンエステラーゼの活性が、上述のように安息香酸の形成を測定する事により決定される。

上述のアッセイの効率を評価するため、ヒトのブチリルコリンエステラーゼ及びヒトのブチリルコリンエステラーゼのトランケートされた溶解性単量体の捕捉効率（ブロング（Ｂｌｏｎｇ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２７：７４７−７５７（１９９７））が、市販のラビット抗ヒトコリンエステラーゼ・ポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ、カリフォルニア州カーピンテリア（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ））を使って、マイクロタイター形式で証明された（図６）。ブチリルコリンエステラーゼ捕捉の最適条件を決定するため、マイクロタイター・プレートをラビット抗ヒトコリンエステラーゼを増加させながらコーティングし、ブロックし、様々な量の培養上澄み液と一緒にインキュベートした。捕捉された活性ブチリルコリンエステラーゼの量は、ジチオビスニトロ安息香酸の存在下４０５ｎｍでブチルチオコリン加水分解を測定するアッセイを使って、比色測定法により決定された（キシー（Ｘｉｅ）等、前出、１９９９）。その後、野生型のヒト・ブチリルコリンエステラーゼか単量体のトランケート・タイプのいずれかを発現する細胞の希釈培養上澄み液で捕捉されたブチリルコリンエステラーゼ活性が測定された。ラビット抗ヒトコリンエステラーゼ捕捉抗体は２５μｌの培養上澄み液に存在するブチリルコリンエステラーゼで飽和された。完全野生型の酵素を含む上澄み液の方が、より高いブチリルコリンエステラーゼ活性を示した（図６、黒丸と白丸を比較）。結合しなかった物質はｐＨ７．４の１００ｍＭトリスで洗浄・除去し、捕捉された活性ブチリルコリンエステラーゼの量はブチリルチオコリン加水分解を測定する事により定量化された。ブチリルコリンエステラーゼは、マイクロタイター・プレート上でポリクローン性抗ブチリルコリンエステラーゼ抗体を飽和するのに十分な量が、培養上澄み液中に発現されていた。。更に、捕捉された酵素が活性である事は、ブチリルチオコリンの加水分解により証明された。

アイソトープ・トレーサー・アッセイ及び固定されたブチリルコリンエステラーゼによるコカイン加水分解の測定
マイクロタイター形式でコカイン加水分解活性を測定するため、活性ブチリルコリンエステラーゼ固定の最適条件とコカイン・アイソトープ・トレーサー・アッセイが用いられた。上述のように、アッセイの特徴はコカイン加水分解活性のＫ_ｍを決定する事である。アッセイの感度又はアッセイ・シグナルを高めるため、少なくとも３つの方法が用いられた。

まず、アッセイ培養時間を長くする事により、使用されるシグナルが正比例的に増大する。第２に、放射性元素で標識化したコカイン基質の比活性を増大させる事により、アッセイの感度は高められる。第３に、以前同定されたコカイン加水分解の効率が４倍高いブチリルコリンエステラーゼ突然変異体を使用する事である（キシー（Ｘｉｅ）等、前出、１９９９）。アッセイ培養時間を２倍にし、コカインの比活性を１０倍にすれば、シグナルは約８０倍増大できる。

実施例ＩＩ ブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーの合成及び特長付け
この実施例は、哺乳類の細胞で発現されるブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーの合成と特徴付けを説明する。

ブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーの合成を促進するため、ＤＮＡコード化した野生型ヒト・ブチリルコリンエステラーゼ、酵素的に活性でトランケートされたヒト・ブチリルコリンエステラーゼの単量体、そしてコカイン加水分解活性が４倍向上しているＡ３２８Ｙ突然変異体のユニークな制限部位を使って、修飾されたダブルロックス（ｄｏｕｂｌｅｌｏｘ）標的ベクターにクローン化する。予備アッセイでは、野生型のヒト・ブチリルコリンエステラーゼがより効率的に捕捉されたので、ブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリー合成の最初のＤＮＡテンプレートとして選ばれる。

コドン・ベース変異誘発によるブチリルコリンエステラーゼ変異体フォーカストライブラリーの合成
様々な情報を使って、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の最初のライブラリーを個別の部位にフォーカス（集中）する。例えば、ブチリルコリンエステラーゼとシビレエイアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は高いレベルの類似体である（５３％同一）。更に、シビレエイ ＡＣｈＥの４から５３４までの残基は、ブチリルコリンエステラーゼの２から５３２までの残基と整合しており、削除も挿入もない。触媒的な３つの残基（ブチリルコリンエステラーゼ残基Ｓｅｒ１９８、Ｇｌｕ３２５、及びＨｉｓ４３８）と分子間鎖のジスルフィド結合は全て同じ位置にある。これらの蛋白質の類似性が高いので、シビレエイ ＡＣｈＥの２．８ÅＸ線精密構造（サスマン（Ｓｕｓｓｍａｎ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２５３：８７２−８７９（１９９１））が、ブチリルコリンエステラーゼ構造をモデル化するのに使われている（ハレル（Ｈａｒｅｌ）等、前出、１９９２）。

コリンエステラーゼの研究は、触媒的な３つの残基及びリガンド結合に関係している他の残基が、疎水性残基の多い深くて狭い活性部位の溝に位置している事を明らかにした（ソレク（Ｓｏｒｅｑ）等、Ｔｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １７：３５３−３５８（１９９２）による総説がある）。活性部位の溝（図２で疎水性の活性部位溝の残基には影を付けてある）に沿って並んでいると決定されたアミノ酸を含むため、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の７つのフォーカストライブラリー部位が選択された（図２、下線部残基）。

ブチリルコリンエステラーゼの構造モデルに加えて、ブチリルコリンエステラーゼの生化学的データもライブラリー・デザイン・プロセスに統合された。例えば、変更されたコカイン加水分解活性を持つ天然のブチリルコリンエステラーゼの特徴付けや部位特異的変異の研究が、コカイン加水分解活性にとって重要なアミノ酸の位置及び区域に関する情報を提供する（シュバルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）等、Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ６７：２８３−３２２（１９９５）で検討された）。更に、異なる種から得られるブチリルコリンエステラーゼの配列及びコカイン加水分解データの比較も、そういうブチリルコリンエステラーゼのコカイン加水分解活性の比較に基づいて、コカイン加水分解活性にとって重要な部位に関する情報を提供する。以前同定されたＡ３２８Ｙ突然変異体も部位６に対応するライブラリーに含まれており、ライブラリー合成及び哺乳類の細胞での発現の質、並びにマイクロタイター・ベースのコカイン加水分解アッセイの感度を証明するためのコントロールとして使用される。

表２．触媒効率にとって重要であると予測されるブチリルコリンエステラーゼの部位

フォーカストライブラリー合成用に選択されたブチリルコリンエステラーゼの７つの部位は８つの芳香族活性部位溝の残基（Ｗ８２、Ｗ１１２、Ｙ１２８、Ｗ２３１、Ｆ３２９、Ｙ３３２、Ｗ４３０、及びＹ４４０）及び３つの触媒的残基のうちの２つを含む残基が含まれている。^６５Ｃｙｓ−^９２Ｃｙｓ、^２５２Ｃｙｓ−^２６３Ｃｙｓ、及び^４００Ｃｙｓ−^５１９Ｃｙｓの間にある分子鎖間のジスルフィド結合の統合は、ブチリルコリンエステラーゼの機能構造のため維持される。更に、残基１７、５７、１０６、２４１、２５６、３４１、４５５、４８１、４８５、及び４８６に位置している推定上のグリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）もライブラリー合成には避けられる。合計すると、７つのフォーカストライブラリーには７９の残基があり、ブチリルコリンエステラーゼの直線配列の約１４％を占めており、約１５００のブチリルコリンエステラーゼ変異体の発現を行なう。

突然変異の対象となるヒト・ブチリルコリンエステラーゼの７つの部位に対応する核酸ライブラリーは、上述のように、そして図７に図示されているように、コドン・ベースの変異誘発によって合成される。要約すると、複数のＤＮＡ合成カラムが、以前（グレイサー（Ｇｌａｓｅｒ）等、前出、１９９２）によって記載されているように、βシアノエチル・ホスホラミダイト化学によってオリゴヌクレオチド合成に使用される。第１段階では、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸をコード化しているトリヌクレオチドが１つのカラムで合成され、第２のカラムはトリヌクレオチドＮＮ（Ｇ／Ｔ）の合成に使用される。ここでＮはｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、及びｄＴシアノエチル・ホスホラミダイトの混合物である。トリヌクレオチドＮＮ（Ｇ／Ｔ）を使えば、変性をほとんど伴わずに徹底した変異誘発を行なう事ができるが、これはあらゆる位置で２０の全アミノ酸の発現を組織的に行なう事により実現される。

最初のコドンの合成の後、２つのカラムの樹脂は混合され、分けられ、４つのカラムに置き換えられる。コドン毎に追加の合成カラムを加え、図７に示されている方法でカラムの樹脂を混合する事により、変異誘発の程度に従って、変性したオリゴヌクレオチドが分離される。コドン・ベース変異誘発の樹脂混合方式は、複数のオリゴヌクレオチドの合成を不要にするので、プロセスは迅速化され、割安になる。現在の研究では、単一のアミノ酸の突然変異をコード化するオリゴヌクレオチドのプールが、ブチリルコリンエステラーゼのフォーカストライブラリーの合成に使われる。

オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、前出、１９８５）を使って、単一のアミノ酸突然変異を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化しているオリゴヌクレオチドが、ダブルロックス（ｄｏｕｂｌｅｌｏｘ）標的ベクターにクローン化される。変異誘発の効率を高め、野生型ブチリルコリンエステラーゼを発現するクローン数を減らすため、ライブラリーは２段階プロセスで合成される。第１段階では、各ライブラリー部位に対応するブチリルコリンエステラーゼのＤＮＡ配列をハイブリダイゼーション変異誘発により欠失させる。第２段階では、各欠失突然変異体（１つの欠失突然変異体が各ライブラリーに対応）用に、ウラシル含有一本鎖ＤＮＡが分離され、オリゴヌクレオチド特異的変異によるライブラリー合成のテンプレートとして使われる。この方法は抗体ライブラリーの合成に良く使われており、変異誘発性オリゴヌクレオチドの異なるＤＮＡ配列から生じやすいアニーリングの偏りを排除する事により、均一な変異誘発をもたらす。更に、２段階プロセスにより、ライブラリーの変異体と比べ野生型配列の頻度が少なくなり、その結果、野生型ブチリルコリンエステラーゼをコード化するクローンの反復スクリーニングが不要になるので、ライブラリーのスクリーニング効率が上昇する。

ライブラリーの質及び変異誘発の効率は、各ライブラリーで無作為に選択される約２０のクローンからＤＮＡ配列が得られる所に特徴がある。変異誘発は各ライブラリーの複数の位置で起きている事、そして複数のアミノ酸が各位置で発現している事をＤＮＡ配列が証明している。更に、ライブラリーには様々なクローンが含まれており、僅かな数のクローンにより独占されてはいない事を無作為に選択されたクローンのＤＮＡ配列が証明している。

部位特異的組み込みのための形質移入パラメーターの最適化
Ｃreリコンビナーゼ媒介の部位特異的組み込みのための形質移入パラメーターの最適化は、モデル・システムとしてブレオマイシン耐性蛋白（ＢＲＰ）ＤＮＡを使って実現された。

Ｃreリコンビナーゼは、バクテリオファージＰ１の配列特異的な組み換えにとって必要かつ十分な３８−ｋＤａリコンビナーゼであり、良く知られている（アブレムスキ（Ａｂｒｅｍｓｋｉ）等、細胞（Ｃｅｌｌ） ３２：１３０１−１３１１（１９８３））。組み換えは２つの３４塩基対ｌｏｘＰ配列間で起き、それぞれ中心部位の周りに位置する２つの逆１３塩基対リコンビナーゼ認識配列で構成される（スターンバーグ・アンド・ハミルトン（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：４６７−４８６（１９８１ａ）；スターンバーグ・アンド・ハミルトン（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：４８７−５０７（１９８１ｂ））。ＤＮＡ開裂及び鎖交換は、中心部位の端の鎖の上又は下で起きる。Ｃreリコンビナーゼは真核生物で部位特異的な組み換えの触媒も行なう。これには、酵母（サウア（Ｓａｕｅｒ）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：２０８７−２０９６（１９８７））及び哺乳類の細胞（サウア・アンド・ヘンダーソン（Ｓａｕｅｒ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５１６６−５１７０（１９８８）、フクシゲ・アンド・サウア（Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７９０５−７９０９（１９９２）、べスケ・アンド・サウア（Ｂｅｔｈｋｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ）、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：２８２８−２８３４（１９９７））も含まれる。

リン酸カルシウムによる１３−１細胞の形質移入は、プレートの生存可能細胞の１％で行なわれる（標的取り込み）事が以前証明されている（べスケ・アンド・サウア（Ｂｅｔｈｋｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ）、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：２８２８−２８３４（１９９７））。従って、リン酸カルシウムを使って、１３−１細胞に４μｇｐＢＳ１８５及び１０、２０、３０、又は４０μｇのｐＢＳ３９７−ｆｌ（＋）／ＢＲＰを形質移入する研究がまず行なわれた。形質移入当たりのＤＮＡの総合値は、無関係のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ ＤＮＡ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ））を使って一定に保たれ、形質転換株は４００μｇ／ｍｌのジェネティシンを含む培地にプレートを置き換える事により４８時間後に選択された。コロニーは標的取り込みの効率を決定するため１０日後に数えられた。最適な標的取り込みは、普通、３０μｇの標的ベクターと４μｇのＣreリコンビナーゼ・ベクターｐＢＳ１８５を使った時に観察され、これは以前の報告（、べスケ・アンド・サウア（Ｂｅｔｈｋｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ）、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：２８２８−２８３４（１９９７））の２０μｇの標的ベクターと５μｇのｐＢＳ１８５と一致している。観察された標的取り込みの頻度は一般に１％未満であった。リン酸カルシウムを使う方法は使用されるＤＮＡ量と緩衝液のｐＨに敏感ではあるが、それでも観察された標的取り込みの効率は蛋白質ライブラリーの発現に十分であった。

表３に示されるように、いくつかの細胞株と他の形質移入方法が特徴付けられている。本出願で開示されているように、そしてディメッキ（Ｄｙｍｅｃｋｉ）、前出、１９９６に記載されているように、Ｆｌｐリコンビナーゼもゲノムの特定の部位に外因性のＤＮＡを挿入する方法として利用できる。Ｆｌｐの標的部位は、８塩基対のスペーサーで分離された１３塩基対のリピートで構成されている：５’ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣ［ＴＣＴＡＧＡＡＡ］ＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ３’。ブチリルコリンエステラーゼの３２７から３３２までのアミノ酸（表２の部位６）の部位に対応する変異体ライブラリーが、Ｆｌｐリコンビナーゼ及び２９３Ｔ細胞株を使って哺乳類の細胞に形質移入された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、４、及び８と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体が、Ｆｌｐリコンビナーゼ及び２９３Ｔヒト細胞株を使った本出願に記載されている方法により同定され、特徴付けが行われた。

一般に、脂質媒介の形質移入の方が、リン酸カルシウムやＤＥＡＥデキストラン形質移入のように化学的な環境を変える方法よりも効率が良い。更に、脂質媒介の形質移入の方が、ＤＮＡ調製の際の汚染物、塩濃度、そしてｐＨの影響を受けにくいので、一般により再現性のある結果を提供する（フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７））。従って、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ形質移入剤（ジーン・セラピー・システムズ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ））と呼ばれる中性脂質のジオレオイル・ホスファチジルエタノールアミンとカチオン性脂質が、代替形質移入方法として評価されている。内毒素を含まないＤＮＡが、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ））を使って、標的ベクターｐＢＳ３９７−ｆｌ（＋）／ＢＲＰ及びＣreリコンビナーゼ・ベクターｐＢＳ１８５のために調製された。次に、５μｇのｐＢＳ１８５と様々な量のｐＢＳ３９７−ｆｌ（＋）／ＢＲＰを血清フリーの培地で希釈し、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ形質移入剤と混合した。次にＤＮＡ脂質混合物は、約５ｘ１０^５細胞／１００ｍｍ皿で構成される１３−１細胞の６０−７０％融合性単層に添加され、３７℃で培養された。５時間後牛胎児血清が１０％まで添加され、翌日形質移入培地は除去され、新しい培地で置き換えられた。

様々な量の標的ベクターで細胞に形質移入した場合、標的組み込み効率は０．１％乃至１．０％であり、標的組み込み効率の最適化は、標的ベクターとＣreリコンビナーゼ・ベクターをそれぞれ５μｇ使用した時観察された。最適条件下で１３−１宿主細胞に脂質ベースの形質移入をした場合の標的組み込み効率は０．５％で、この結果は一貫して観察された。０．５％標的組み込みは以前の報告にある１．０％効率（べスケ・アンド・サウア（Ｂｅｔｈｋｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ）、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：２８２８−２８３４（１９９７））を僅かに下回るだけで、大量の蛋白質ライブラリーの発現には十分であり、哺乳類の細胞で蛋白質変異体を発現させる事ができる。

表３ 安定形質移入又は一過性細胞形質移入のいずれかを使って、細胞当たり単一のブチリルコリンエステラーゼ変異体を発現

これらの結果は、ＮＩＨ３１３ １３−１細胞への形質移入条件の最適化を示している。少量のＤＮＡを必要とし、再現性のある標的効率が５％である脂質ベースの簡単な形質移入方法の条件がここに確立された。

哺乳類細胞に於けるブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーの発現
ブチリルコリンエステラーゼ変異体の７つのライブラリーは、ダブルロックス（ｄｏｕｂｌｅｌｏｘ）標的ベクターと上述の形質移入のための最適条件を使って、それぞれ哺乳類の宿主細胞株に形質転換される。Ｃreリコンビナーゼ媒介の形質転換の後、クローンを分離するため、限界希釈法により、宿主細胞を９６ウェルの培養器で培養する。クレ／ｌｏｘ標的部位に組み込まれたブチリルコリンエステラーゼ変異体を持つ細胞は、ジェネティシンで選別される。その後、各ライブラリーから無作為に選別された２０−３０のクローンから、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化するＤＮＡの配列を決定し、上述のように分析する。総細胞ＤＮＡは、Ｄｎｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ））を使って、関心のある各クローンの約１０^４の細胞から分離される。次に、ブチリルコリンエステラーゼの遺伝子は、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ））を使って増幅され、ＰＣＲ生成物の一部は、ネスティッド・オリゴヌクレオチド・プライマーを使って、蛍光ジデオキシヌクレオチド・ターミネーション法（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、コネチカット州ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ））により無作為に選択されたクローンから、ブチリルコリンエステラーゼ変異体をコード化するＤＮＡの配列決定に使用される。

前に記述したように、配列決定によりライブラリーの均一な導入が証明される。哺乳類の形質転換株の多様性は、バクテリアの形質転換後のダブルロックス（ｄｏｕｂｌｅｌｏｘ）標的ベクターに於けるライブラリーの多様性に類似している。
表４．コカイン加水分解酵素活性の増大したブチリルコリンエステラーゼ変異体（ＷＴ＝１）の相対活性、及び対応するコドン変更

本出願記載の通り、ブチリルコリンエステラーゼの部位５に対応するライブラリーが発現し、各変異体はマイクロタイター・アッセイを使って［^３Ｈ］コカインの加水分解を測定する事によりスクリーニングされた。活性の向上した変異体の触媒効果（Ｖ_ｍａｘ／Ｋ_ｍ）はマイクロタイター・アッセイを使って特徴付けされ、相対Ｋ_ｍ及びＶ_ｍａｘが決定された。コカイン加水分解酵素活性が増大した２１のブチリルコリンエステラーゼ変異体が次のように同定された：

実施例ＩＩＩ コカイン加水分解活性増大を示すブチリルコリンエステラーゼ変異体の特徴付け
この実施例は、以下に記載するマイクロタイター・アッセイでコカイン加水分解活性を増大したブチリルコリンエステラーゼ変異体の分子特徴づけを記載する。マイクロタイター・アッセイで測定されたコカイン加水分解活性は、関心のあるブチリルコリンエステラーゼ変異体を大量に使用する事により更に確認された。マイクロタイター・アッセイ以外にも、生成物の溶液相をＨＰＬＣアッセイで測定する事によってもそれは証明され、ブチリルコリンエステラーゼ変異体のコカイン加水分解活性の増大、及び加水分解の増大がベンゾイルエステル基で起きている事も確認された。

野生型ブチリルコリンエステラーゼと最高の変異体の運動定数が決定され、変異体の触媒効果を野生型ブチリルコリンエステラーゼの触媒効果と比較するのに利用される。（−）コカインのＫ_ｍ値は３７℃で決定される。Ｋ_ｍ値はシグマ・プロット（Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔ）（ヤンデル・サイエンティフィック（Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カリフォルニア州サンラファエル（Ｓａｎ Ｒａｆａｅｌ， ＣＡ））を使って計算される。ブチリルコリンエステラーゼの活性部位の数は、以前マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）等、生物化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ３６：２２６６−２２７７（１９９７）で記載されているように、点滴液としてヨウ化エコチオパート又はジイソプロピル・フルオロリン酸塩を使って、残基活性法により決定される。あるいは、ブチリルコリンエステラーゼの活性部位の数は、ＥＬＩＳＡを使って培養上澄み液に存在するブチリルコリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼ変異体を定量する事により推定される。ＥＬＩＳＡ定量アッセイには、精製されたヒトのブチリルコリンエステラーゼが使用される。触媒速度定数Ｋ_ｃａｔはＶ_ｍａｘを活性部位の濃度で割る事により計算される。最後に、各ブチリルコリンエステラーゼ変異体に関してＫ_ｃａｔ／Ｋ_ｍを決定する事により、最高の変異体の触媒効果と野生型ブチリルコリンエステラーゼのそれを比較する。

コカイン加水分解活性増大のブチリルコリンエステラーゼ変異体を発現させる全クローンを更に特徴付けるため、変異体をコード化しているＤＮＡの配列が決定される。ＤＮＡ配列決定により突然変異の正確な場所及び特徴が明らかとなり、同定されたブチリルコリンエステラーゼ変異体の総数が算出される。各ライブラリーのスクリーニングは、同一のブチリルコリンエステラーゼ突然変異体をコード化しているクローンが複数回同定される時、つまりライブラリーが全てスクリーニングされた時完了する。

実施例ＩＶ 組み合わせブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーの合成及び特徴付け

この実施例は、哺乳類の細胞で発現するブチリルコリンエステラーゼ変異体の組み合わせライブラリーの合成及び特徴付けを説明する。

単一アミノ酸の突然変異を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ライブラリーをスクリーニングする事により同定される有益な突然変異は、ブチリルコリンエステラーゼのコカイン加水分解活性を更に改善するため、インビトロで組み合わされる。生化学的相加効果と称される有益な突然変異のこの有益な組み合わせは、多数観察されている。例えば、有益な突然変異の蓄積とその後の組み合わせを通して段階的に抗体親和性を高める反復プロセスにより、２，５００種未満の変異体を含む変異体ライブラリーを使って、親和性が５００倍増大した抗体が同定されている。しかし、生化学的相加効果の原理は抗体親和性の改善だけに限定されるものではない。熱安定性、触媒効率、殺虫剤への抵抗力の増大など他の物理学的特性の改善にも利用されている。

ブチリルコリンエステラーゼの７つのフォーカストライブラリーをスクリーニングして最高の突然変異を同定し、それを使って組み合わせライブラリーを合成する。組み合わせライブラリーの変異体の数は僅かであると予測される。通常、最初のライブラリーから得られる変異体のほんの一部である。例えば、８つの部位に於ける単一突然変異の組み合わせ分析には、２^８つまり２５６のユニークな変異体を含むライブラリーが必要である。組み合わせライブラリーはオリゴヌクレオチド特異的変異により合成され、特徴付けられ、哺乳類の宿主細胞株で発現する。変異体はスクリーニングされ、上述のように特徴付けられ、ＤＮＡの配列決定により相加的突然変異が明らかとなる。

実施例Ｖ ブチリルコリンエステラーゼ変異体の発現及び精製
この実施例は、哺乳類の細胞株での発現、及びその後のブチリルコリンエステラーゼ変異体の精製を説明する。

触媒的に最も活性なブチリルコリンエステラーゼ変異体及び野生型ブチリルコリンエステラーゼを発現するクローンを使って、大量培養を確立する。インビボ研究に必要な大量の酵素を精製するためである。以下に記載するように、インビボでラットの毒性及び中毒研究を完了するには、野生型ブチリルコリンエステラーゼ及び最上の変異体がそれぞれ約１００ｍｇずつ必要であると推測される。

関心のあるブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ユニークな制限部位を使って、ｐＣＭＶ／Ｚｅｏベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ））へクローン化される。変異体のクローン化は、制限マッピング及びＤＮＡ配列決定を使って確認される。その後、変異体は形質移入されたチャイニーズハムスターの卵巣細胞ＣＨＯ ＫＩ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）で発現させる。ＣＨＯ細胞が発現に選ばれた理由は、ブチリルコリンエステラーゼが糖蛋白質であり、こういう細胞が以前ヒトの治療用組み換え糖蛋白質の発現（グーチー（Ｇｏｏｃｈｅｅ）等、生物工学（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） ９：１３４７−１３５５（１９９１）、ジェンキンス・アンド・カーリング（Ｊｅｎｋｉｎｓ ａｎｄ Ｃｕｒｌｉｎｇ）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １６：３５４−３６４（１９９４））や活性を失うことなく組み換えブチリルコリンエステラーゼ（マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）等、前出、１９９７）を発現することができたからである。まず、ＣＨＯ細胞を全てのブチリルコリンエステラーゼ変異体で一過性的に形質移入し、機能的ブチリルコリンエステラーゼの発現を確認する。その後、細胞は安定的に形質移入され、抗体ゼオシン（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ））を使って、ブチリルコリンエステラーゼ変異体を発現するクローンを選別する。コロニーは無菌綿棒で採取し、２４ウェル・プレートへ移す。ブチリルコリンエステラーゼの発現が測定され、最高の活性を示すコロニーはさらに増殖させる。ブチリルコリンエステラーゼ変異体の反応速度定数を決定し、ＣＨＯ細胞の発現がＮＩＨ３Ｔ３細胞で発現するブチリルコリンエステラーゼ変異体と比べて酵素活性を落としていない事を確認する。

細胞はＴ７１５フラスコで増殖させ、約５ｘ１０^８の細胞が得られるまで複数の３Ｌスピナーフラスコで更に増殖させる。その後、細胞株はＣＥＬＬ−ＰＨＡＲＭ Ｓｙｓｔｅｍ ２０００ホローファイバー細胞培養システム（ユニシン・テクノロジーズ（Ｕｎｉｓｙｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マサチューセッツ州ホプキントン（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ））へ移し、ブチリルコリンエステラーゼの生産と回収を継続する。ホローファイバーは高密度の細胞を提供し、そこから毎日６０−１２０ｍｌの濃縮ブチリルコリンエステラーゼが採収される。追加評価に必要な量のブチリルコリンエステラーゼを生産するには１ヶ月かかると予測される。

ホローファイバー・システムで得られた濃縮組み換えブチリルコリンエステラーゼは、実質的に以前記載されている方法（マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）等、前出、１９９７）で精製される。血清フリーの培地は遠心分離して粒子を除去し、イオン強度は２倍の水で希釈する事により減少させ、その後サンプルはプロカインアミド・セファロース・アフィニティーカラムへ移す。ブチリルコリンエステラーゼはプロカインアミドで溶出し、イオン交換クロマトグラフィで更に精製してから濃縮する。ＣＨＯ細胞で発現した組み換えブチリルコリンエステラーゼ突然変異体は、この精製法を使って以前９９％まで精製され、５０％の収率を達成している（ロックリッジ（Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ）等、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ３６：７８６−７９５（１９９７））。酵素は０．２２μｍの膜でフィルター殺菌し、４℃で保存する。この条件下で、１８ヶ月後、ブチリルコリンエステラーゼは最初の活性の９０％を保持している（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）等、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏ． ５５：８３−９１（１９９９））。

実施例ＶＩ 野生型ブチリルコリンエステラーゼ及びブチリルコリンエステラーゼ変異体の評価
インビトロでコカイン加水分解活性の増大を示すブチリルコリンエステラーゼ変異体は、インビボで更に強力なコカイン毒性及び中毒の治療効果を示す。インビボに於けるブチリルコリンエステラーゼ変異体の特徴付けを行うため、急性過剰摂取のモデルが使用され、毒性に対するブチリルコリンエステラーゼ変異体の効果が測定される。一方、強化及び識別モデルは、ブチリルコリンエステラーゼ変異体の中毒治療効果を予測するのに使用される。ヒトのブチリルコリンエステラーゼ変異体の薬物動態学にこのモデルが最適だとは期待できないけれども、ラットのコカイン・モデルの特徴付けは十分行なわれており、精製ブチリルコリンエステラーゼの量は、霊長類のモデルよりもはるかに少量で足りる。野生型のブチリルコリンエステラーゼもコカイン加水分解活性を増大したブチリルコリンエステラーゼ変異体も、用量依存の反応を示す事が予想される。更に、コカイン加水分解活性を最適化したブチリルコリンエステラーゼ変異体は、野生型のブチリルコリンエステラーゼよりもはるかに少量で効果を上げる事ができる。

コカイン毒性の改善
ブチリルコリンエステラーゼ変異体のコカインへの効果は、メッツ（Ｍｅｔｓ）等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１０１７６−１０１８１（１９９８）により過剰摂取ラットモデルを使って以前記載され、評価が行なわれている。このモデルはカテコールアミンの同時注入法を使う。様々なレベルの内因性カテコールアミンがコカイン毒性に影響を及ぼす事が証明されているからである（メッツ（Ｍｅｔｓ）等、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５９：２０２１−２０３１（１９９６））。カテコールアミンのレベルを標準化した場合、コカイン１ｍｇ／ｋｇ／分の注入は、ＬＤ_５０＝１０ｍｇ／ｋｇ及びＬＤ_９０＝１６ｍｇ／ｋｇを示す。

この研究では、１グループ６匹のラットを含む６つのグループが使用された。ラットはスプラグ−ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）の雄で、明暗を１２時間周期で維持している飼育器に入れた時点では体重２５０〜２７５ｇである。ラットは食事も水もいつでも自由に摂取できる。治療前に、ラットには大腿動脈及び静脈カテーテルを付け、回復期間を与えた。その後、カテコールアミンとコカイン（１ｍｇ／ｋｇ／分）の同時注入の１５分前に、様々な量のブチリルコリンエステラーゼ変異体（０．３５、１．７６、又は１１．８ｍｇ／ｋｇ）又は等量の生理食塩水でラットを処理する。ラットが早く死んでしまう場合は別であるが、ＬＤ_９０のコカインの注入には１６分かける。野生型ブチリルコリンエステラーゼと以前記載した触媒的抗体（メッツ（Ｍｅｔｓ）等、前出、１９９８）の相対触媒効果に基づけば、ブチリルコリンエステラーゼの用量を増やせば、対照の生理食塩水の場合と比べて生存率が増大する事、及びブチリルコリンエステラーゼの最高用量（１１．８ｍｇ／ｋｇ）は全てのラットを保護できる事が予想される。インビトロで１０倍効果的にコカインを加水分解するブチリルコリンエステラーゼ変異体は、更に低い用量（例えば１ｍｇ／ｋｇ）で全ラットを保護できる事が予想される。

コカイン乱用の改善
コカインの識別的及び強化的薬理学効果は、麻薬の乱用を代表するコカインの作用を最も正確に反映すると思われる。従って、ブチリルコリンエステラーゼ変異体は、ラットのコカイン強化モデルとコカイン識別モデルの両方で評価される。

コカイン強化効果のラットモデルは、コカインの他の治療方法を評価するのに広範に用いられている（クーブ（Ｋｏｏｂ）等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． ７９：３１５−３２０（１９８７）、ハブナー・アンド・モレトン（Ｈｕｂｎｅｒ ａｎｄ Ｍｏｒｅｔｏｎ）、精神薬理学（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ） １０５：１５１−１５６（１９９１）、ケイン・アンド・クーブ（Ｃａｉｎｅ ａｎｄ Ｋｏｏｂ）、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２７０：２０９−２１８（１９９４）、リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）等、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ６１９：１５−２１（１９９３））。

スプラグ−ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットの雄は上述のように維持される。照明、引っ込み式レバー、ジッパー・メカニズム、赤と黄色と緑の刺激光、そして薬物送達用の空気式シリンジ・ポンプ装置（ＩＩＴＣ ライフ・サイエンシス・インク（ＩＩＴＣ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州ウッドランドヒルズ（Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｈｉｌｌｓ， ＣＡ））を備えた６つのオペラントチャンバーをインプット及びアウトプット・カード（メド・アソシエーツ・インク（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．）、バーモント州セントアルバンス（Ｓｔ． Ａｌｂａｎｓ， ＶＴ））を使ってＩＢＭ互換性のコンピューターに接続する。チャンバーは空調と音量調節装置を備えた部屋に格納する（メド・アソシエーツ（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）。オペラントチャンバー内の予定の状況及び刺激アレイをコントロールするカスタム化された自己投与プログラムは、ＤＯＳ用のＭｅｄ−ＰＣプログラミング言語を使って記述する。

コカインの強化効果は、静脈内投与がラットの反応に基づいて行なわれる条件の下に、ラットが得る注入の数を測定するモデルを使って評価される（メッツ（Ｍｅｔｓ）等、前出、１９９８）。ラットは、オペラント条件付けチャンバーで、レバーを押して０．５ｍｌの加糖ミルク溶液を得るように訓練される。定率１（ＦＲ１）スケジュール強化でレバープレス反応を獲得した後は、反応要求を連続的にＦＲ５スケジュールへ増大させる。このスケジュールで３日連続安定したミルク維持反応率を示すようになったならば（１時間セッションで強化刺激送達の変動が１０％未満）、左の頸静脈内にカテーテルを導入する手術を行い、ラットには最低２日間の回復期間が与えられる。

手術後の最初のオペラント訓練セッションに於いて、１時間のセッションで、ミルクとコカインの静脈内ボーラス（０．１２５ｍｇ／ｋｇ／注入）を５秒間同時に得るためのレバーにラットを反応させる。次にミルクをチャンバーから除き、次の３日間、６時間継続の自己投与セッションに於いて、ラットにはコカインの３つの用量（０．１２５、０．２５、又は０．５ｍｇ／ｋｇ／注入）のうち１つへのアクセスが許される。従って、ラットはセッション当たり各用量に２回ずつアクセスでき、用量は少量から多量へ増加し、それが反復される（すなわち０．１２５、０．２５、０．５、０．１２５、０．２５、０．５ｍｇ／ｋｇ／注入）。１時間毎の用量期間中、１０秒間のタイムアウトを伴う最初のＦＲ５は維持される。更に、各１時間セッションの持ち越し効果を最小限にするため、各用量期間の後１０分間のタイムアウト期間が設けられる。

ラットが３日間連続で一貫してコカイン自己投与を示すようになったならば（６時間のセッション当たり１６０以上の注入で１５％未満の変動）、より少量のコカインと生理食塩水が入手可能な１日のセッションのスケジュールに移行させる。各セッションは２つの期間に分けられ、各期間で生理食塩水と３用量のコカインを入手可能とする。各セッションの最初の期間には、一連の低用量（０〜０．０６２５ｍｇ／ｋｇ／注入）へのアクセスが可能であり、第２の期間ではより広範な用量（０．０５ｍｇ／ｋｇ／注入）へのアクセスが可能である。

コカインの自己投与率が安定化した後、ラットは６つのグループに分けられ、１日の自己投与セッションが始まる３０分前に、０．３５、１．７６、１１．８ｍｇ／ｋｇの野生型ブチリルコリンエステラーゼか最適化されたブチリルコリンエステラーゼ変異体、あるいは等量の生理食塩水が、各グループ（ｎ＝６ラット）に投与される。ラットのコカイン自己投与行動が基準線に戻るまで、前処理の効果を数日間モニターする。

定率（ＦＲ）スケジュールを使った場合、注入回数はセッション期間によって限定されているだけであるので、それは最適化されたブチリルコリンエステラーゼ変異体の効力と野生型ブチリルコリンエステラーゼのそれとを比較する従属変数として使用される。様々な濃度の野生型ブチリルコリンエステラーゼ又は最適化されたブチリルコリンエステラーゼ変異体を投与した後、用量応答曲線を混合因子ＭＡＮＯＶＡを使って分析する。ブチリルコリンエステラーゼ濃度（０．３５、１．７６、１１．８ｍｇ／ｋｇ）は対象個体間因子として与えられ、コカインの用量（０、０．０１５、０．０３、０．０６、０．１２５、０．２５、０．５ｍｇ／ｋｇ／注入）は対象固体内因子として与えられる。各コカイン用量に於けるブチリルコリンエステラーゼ処理グループ全体の比較には、Ｔｕｋｅｙ ＨＳＤ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ処置（グラベッター（Ｇｒａｖｅｔｔｅｒ）， Ｆ． Ｊ． 及びウォールノウ（Ｗａｌｌｎａｕ）， Ｌ． Ｂ．、行動科学のための統計（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（第５版、２０００、ワズワース出版（Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌ．）、カリフォルニア州ベルモント（Ｂｅｌｍｏｎｔ， ＣＡ）を参照）が使われ、統計的有意性の基準はｐ＜０．０５に設定される。ブチリルコリンエステラーゼの用量が多い場合（１１．８ｍｇ／ｋｇ）は、ラットが得る注入回数は未処置（生理食塩水）の対照グループよりも少ない事が予想される。更に、コカイン加水分解活性増加を示すブチリルコリンエステラーゼ変異体で処理されたラットは、野生型ブチリルコリンエステラーゼで処理されたラットよりも少ない用量（０．３５ｍｇ／ｋｇ）で注入回数が減少する事が予想される。

医薬品識別は臨床におけるコカインの自覚効果に関係しており、前処理後のコカイン識別への拮抗は治療効果の可能性の明白な証拠であると考えられる（ホルツマン（Ｈｏｌｚｍａｎ）、薬物学の近代的方法、薬物乱用の試験及び評価（Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ａｂｕｓｅ）、ワイリー・リス・インク（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．）、ニューヨーク（１９９０）、スピールマン（Ｓｐｅａｌｍａｎ）、ＮＩＤＡ Ｒｅｓ． Ｍｏｎ． １１９：１７５−１７９（１９９２））。薬物の識別刺激効果を確立・評価するのに最も良く使われている方法は、コントロールされたオペラント処置に於いて、注入された薬物を刺激物として使い、２つのレバーへの反応の分布をコントロールするように動物を訓練する方法である。「薬物関連」レバーへの反応の分布を薬物の用量の関数として示す用量効果曲線は、容易に作成できる。こういうコカイン用量効果曲線は、拮抗剤の投与により変更できる。曲線を変更させる量及び動物が最初のコカイン感受性に戻る時間は、野生型ブチリルコリンエステラーゼ及び最適化された変異体が治療に使用可能であるかどうかを評価するに当たり、有益なデータとなる。ラットモデルに於けるコカインの識別刺激効果は、ドーパミン再摂取阻害剤の治療可能性及びドーパミン受容体の作用薬及び拮抗薬を評価するのに使われている（ウィトキン（Ｗｉｔｋｉｎ）等、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２５７：７０６−７１３（１９８９）、カンタク（Ｋａｎｔａｋ）等、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２７４：６５７−６６５（１９９５）、バレット・アンド・アペル（Ｂａｒｒｅｔ ａｎｄ Ａｐｐｅｌ）、精神薬理学（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ） ９９：１３−１６（１９８９）、カラハン（Ｃａｌｌａｈａｎ）等、精神薬理学（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ） １０３：５０−５５（１９９１））。

訓練し識別刺激としてコカインを試験する多重試験方式は、バータルミオ（Ｂｅｒｔａｌｍｉｏ）等、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｍｅｈｔｏｄｓ ７：２８９−２９９（１９８２）及びシェクター（Ｓｃｈｅｃｔｅｒ）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３２６：１１３−１１８（１９９７）に以前記載されているように、ブチリルコリンエステラーゼのラットへの効果を評価するのに使用される。コカインの用量反応曲線は、ブチリルコリンエステラーゼ又は最適化されたブチリルコリンエステラーゼ変異体の存在の下に、単一のセッションで入手される。その後、ラットが最初のコカイン感受性に戻る様子を週２回ずつ追跡し、ブチリルコリンエステラーゼ作用の持続期間を評価する。

食物強化オペラント処置で訓練するため、自由に食事を摂っていた実験の最初の体重の８０％までラットの食事を制限する。２つの光刺激物と２つの引き込み式レバー（それぞれミルク送達システムの両サイドに配置）を備えたオペラント条件付けチャンバーに各ラットを配置し、レバーの１つを押して０．５ｍｌの加糖濃縮ミルクにアクセスできるように訓練する。ラットがそのレバーに反応するのを学習したら、多重試験方法を開始する。各セッションは６つの試験で構成され、それぞれ１５分継続する。最初の１０分はブラックアウトで光も反応も全くない。この１０分期間により、その後の試験段階に於いて薬物吸収が可能となる。最後の５分はミルク強化期間（ＦＲ５）である。ラットがこの５分反応期間（シグナル期間）に一貫して敏速に反応するようになったら、その時点でコカインを導入する。

まず、６週間のセッションのうち３週間の開始１０分前に、１０ｍｇ／ｋｇのコカインが投与される。このセッション期間中、以前突き出ていた「コカインなし」（生理食塩水）のレバーが引っ込められ、他の「コカイン関連」のレバーがミルク送達コップの反対側に突き出される。コカインがセッション前に投与されているならば、この第２のレバーへの反応（最初は単一の反応、最終的には５回の反応）ではミルクが提供される。ラットは、投与されたコカインの内受容効果を検知したならば、この第２のレバーに応答するように訓練されつつある。コカインの内受容効果は３０分を超えるとは考えられないので、コカイン投与後のセッションは１５分の試みが２回だけである。この時点で、ラットはその週の３日間コカインの注入を受けない。そういう日は、シグナル期間の６回の試み中、入手可能なコカインなしのレバーに反応する事によりミルク（ＦＲ５）で強化される。その週の残りの３日間、ラットにはセッションが始まる前に１０ ｍｇ／ｋｇのコカインが投与され、シグナル期間の各２回の試み中、入手可能なコカイン・レバーに反応する事により強化が行なわれる。

その後、毎日のセッションはコカインの投与なしに１乃至４回の試みで開始され、その後１０ｍｇ／ｋｇのコカインの投与が行なわれる。従って、各セッションは、食物を得るのにコカイン専用のレバーに応答する必要がある２回の試みで終了する。この段階では、「正しい」レバーだけが出ているけれども、ラットが一日のセッション内にコカインなしのレバーからコカインのレバーにスイッチする事を学んだら直ぐ、両方のレバーがセッション期間中ずっと入手可能になるという重要なステップが取られる。その後、各セッションは１０分のブラックアウトで始まり、それから両レバーが５分間提供される。１日のセッションのうち最初の１乃至４回の試み中コカインは与えられず、この５分間はコカインなしのレバーに５回連続して応答すると食物が与えられる。ラットが１つのレバーからもう１つのレバーにスイッチした場合、あるいは間違ったレバーに応答したら、強化は受けられず、レバーは両方とも１０秒間引っ込められる。１０秒後レバーは再び提供され試験が再開される。第２、第３、第４の試みの始めに、１０ｍｇ／ｋｇのコカインが与えられ、ラットは試験用の箱に戻される。電気がつき次の２回の試み用にレバーが提供されると、ミルクを得るにはコカインのレバーに５回連続して反応する必要がある。これは、コカインの内受容効果をレバーが正しいと告げる合図として用いる事により、コカインなしのレバーからコカインレバーへ反応をスイッチするのをラットが学んでいる事を証明する事になる。

ラットが３回の連続セッションで８０％正しいレバーを選択する基準を満たしたならば、コカイン用量効果曲線が得られる。試験セッションの最初の試みには生理食塩水が与えられる。それ以降の試みでは、各試みの始めの１０分間のブラックアウトの最初に、０．１、０．３、１．０、３．２、そして１０ｍｇ／ｋｇのコカインが投与される。これらの試みの間、いずれのレバーに５回連続反応してもミルクが提供されるが、ＦＲが完了する前に１つのレバーからもう１つのレバーにスイッチすれば、レバーは１０秒間引っ込められる。ラットはセッションの始めはコカインなしに反応するが、次第にコカインのレバーに反応する割合が増加し、最終的には全ての反応がそのレバーに集中するようになる事が予想される。従って、レバー選択の用量反応曲線対投与されるコカインの用量は、各試験セッション中に確立される。

コカインが識別刺激として確立したならば、ラットは異なるグループに分けられ（グループ当たりｎ＝６）、野生型ブチリルコリンエステラーゼか最適化変異体を０．３５、１．７６、又は１１．８ｍｇ／ｋｇ摂取する。コカインの識別刺激効果は、酵素投与の３０分後及びその後毎日決定され、これはコカインへの感受性が再確立されるまで続けられる。ブチリルコリンエステラーゼ投与後の最初の試験セッションに於いて、少量の用量を投与してもコカイン・レバーの選択がない場合は、より多くのコカインが投与される。１０又は３２ｍｇ／ｋｇのコカインを投与してもラットがコカイン専用のレバーを選択しないならば、１００ｍｇ／ｋｇのコカインが投与される。コカインの用量反応曲線は１回のセッションで得られるので、コカインの識別刺激効力を減少させる２つのタイプのブチリルコリンエステラーゼの相対能力に関する情報がこれで提供される。インビトロでコカイン加水分解活性を増大させるブチリルコリンエステラーゼ変異体の方が、優れた効力を示す。

実施例ＶＩＩ コカイン毒性に関するブチリルコリンエステラーゼ変異体による治療効果のインビボでの確認
この実施例は、本発明が提供するブチリルコリンエステラーゼ変異体がコカイン毒性に及ぼす治療効果をインビボで確証する内容を記述する。

イソフラン麻酔薬（最大２０分）の下、３５０ｍｇのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（登録商標）ＳＤ（登録商標）ラットの雄（ハーラン・スプラグ・ドーレイ社（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ， Ｉｎｃ．）に一側性／両側性頸静脈カニュレー挿入が行なわれた。ラットには、試験を行う前に２４時間の回復期間が与えられた。Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）と呼ばれるブチリルコリンエステラーゼ変異体がコカイン毒性に及ぼす治療効果をインビボで確認するため、野生型ＢＣｈＥ （１０−５０ｍｇ／ｋｇ）又はＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ（０．１−０．５ ｍｇ／ｋｇ）を静脈注射し、２００ｍｌの生理食塩水で洗浄した。１分後、カニューレを注入ポンプ（ハーバード・アパレイタス（Ｈａｒｖｅｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ））に接続し、コカイン（塩酸塩）を６ｍｌ／時間（２ ｍｇ／ｋｇ／分）の速度で１５分、合計用量３０ ｍｇ／ｋｇ注入した。軽い痙攣、強い痙攣、そして死亡を記録した。パイロット試験では、コカインの致死量は約２５ ｍｇ／ｋｇと決定された。第２シリーズの研究では、３０ ｍｇ／ｋｇのコカインの注入後、０．５ ｍｇ／ｋｇのＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ変異体が様々な時間に投与され、観察結果が記録された。図８はＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ変異体（黒丸）又は野生型ＢＣｈＥ（白丸）で前処理した効果を示しているが、それによると、Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ変異体はコカインに対して統計的に有意な保護を示している（カイ二乗検定、ｐ＜０．００１）。

図９は更にコカイン誘発毒性に対する変異体の治療効果を証明しており、Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ変異体はコカイン注入の８分目（すなわち最初の軽い痙攣起きた後）に投与すれば完全な保護を提供し、それより以後に投与すれば保護能力が減少する事を示している。

薬物動態学の研究として、カニューレを挿入されたラットに１ｍｇ／ｋｇの野生型ＢＣｈＥ及びＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ変異体を注入し、指定された時間に血漿が集められた。血漿はブチリルチオコリンを基質として使い、ＢＣｈＥの標準アッセイ法を基に、ＢＣｈＥの分析に用いられた。別の研究では、１０ｍｇ／ｋｇのコカイン静脈内ボーラス、そしてその後直ぐにＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ変異体（０．０１、０．０２、又は０．５ｍｇ／ｋｇ）が投与され、指定された時間に血漿が集められた。これらサンプルの血液内のコカインレベルは、ＥＬＩＳＡ（イミュナリシス（Ｉｍｍｕｎａｌｙｓｉｓ）、カリフォルニア州ポモナ（Ｐｏｍｏｎａ， ＣＡ））で決定された。図１０は、１ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス投与の結果であり、野生型ＢＣｈＥ及びＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ変異体の血漿レベルを示している。野生型ＢＣｈＥプールＩ及びプールＩＩはそれぞれ白の四角と白丸で示してあり、Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ変異体プールＩ及びプールＩＩは黒の四角と黒丸で示してある。ＢＣｈＥの活性は、ブチリルチオコリンを基質として使った酵素アッセイにより決定された。

図１１は、静脈ボーラスを投与されたコカインのＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ変異体処置後の血漿レベルを示している。コカインは１０ｍｇ／ｋｇ投与され（白丸）、Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ変異体は即座に０．０１ｍｇ／ｋｇ及び０．０５ｍｇ／ｋｇ（それぞれ黒丸及び黒の四角）が投与された。血漿サンプルは指定された時間に集められ、ＥＬＩＳＡによってコカイン・レベルの分析に用いられた。

図１２は、Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ変異体が軽い痙攣が起きる時間に与える影響を示している。３０ｍｇ／ｋｇのコカインの注入（２ｍｇ／ｋｇ／分で１５分間）の１分前に、所定の量の変異体が投与された。図１２のデータは平均値±ｓｅｍ． ＊ｐ＜０．００１対コントロール、０．１ｍｇ／ｋｇ又は０．２ｍｇ／ｋｇ；分散分析（ＡＮＯＶＡ）とその後のボンフェロニ事後試験として示されている。

この実施例は、Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）が、コカインの前処理及び事後処理として、コカインの毒性に治療効果のある事を証明している。

本出願を通して、種々の出版物が参照されている。本発明が属している最新技術を更に詳しく記述するため、こういう出版物の開示内容は全て参照として本出願に編入されている。

本発明は開示された実施例に関連して記述されているが、具体的な実験は本発明の例証に過ぎない事は当業者には周知である。本発明の精神から逸脱する事なく種々の改良を行うことができる事は理解されるべきである。従って、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。

図１は、ヒトのブチリルコリンエステラーゼの各部位を変更した全てのブチリルコリンエステラーゼ変異体において変更された各部位ののアミノ酸及び核酸配列を示している。 図２は、ヒトのブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）を示している。 図３は、ヒトのブチリルコリンエステラーゼの核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）を示している。 図４は、ヒトのブチリルコリンエステラーゼ野生型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、ヒトの変異体Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、ヒトの変異体Ｊ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ヒトの変異体Ｋ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）、ウマの変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、ネコの変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、及びラットの変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）のアミノ酸配列を示している。 図５の（Ａ）はＨＰＬＣアッセイ及びアイソトープ・トレーサー・アッセイ間の相関関係を示したもので、両方法により形成される安息香酸の量を表示したものであり、（Ｂ）はラインウィーバー−ブルク二重逆数プロットを使って測定したウマ・ブチリルコリンエステラーゼのコカイン加水分解活性Ｋ_ｍである。 図６は、コカイン加水分解の活性測定に必要な野生型（黒丸）及びトランケート型（白丸）の固体相固定化を示している。 図７は、フォーカストライブラリー合成用の多重合成カラムの使用及びコドン・ベースの変異誘発を示している。 図８は、コカイン誘発の毒性に対してＡＭＥ−３５９（黒丸）又は野生型（白丸）で前処理した場合の効果を示している。ＡＭＥ−３５９はコカインに対して統計的に有意な保護を提供した（χ二乗検定；ｐ＜０．００１）。 図９は、コカイン誘発の毒性に対してＡＭＥ−３５９で治療した場合の効果を示している。ＡＭＥ−３５９はコカインの注入から８分以内（特に最初の軽度の痙攣時）に投与した場合に完全な保護を提供したが、それ以降に投与した場合は保護能力が減少した事を示している。 図１０は、１ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス投与の結果であり、野生型ＢＣｈＥ及びＡＭＥ−３５９の血漿レベルを示している。野生型ＢＣｈＥプールＩ及びプールＩＩはそれぞれ白の四角と白丸で示してあり、ＡＭＥ−３５９プールＩ及びプールＩＩは黒の四角と黒丸で示してある。ＢＣｈＥの活性は、ブチリルチオコリンを基質として使った酵素アッセイにより決定された。 図１１は、静脈内ボーラス投与されたコカインのＡＭＥ−３５９処置後の血漿レベルを示している。コカインは１０ｍｇ／ｋｇ投与され（白丸）、ＡＭＥ−３５９は即座に０．０１ｍｇ／ｋｇ及び０．０５ｍｇ／ｋｇ（それぞれ黒丸及び黒の四角）が投与された。 図１２は、コカイン誘発の痙攣に対してＡ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｍ／Ｓ２８７Ｇ／Ｆ２２７Ａと名付けられたブチリルコリンエステラーゼの予防効果を示している。３０ｍｇ／ｋｇのコカインの注入（２ｍｇ／ｋｇ／分で１５分間）の１分前に、所定の量の変異体が投与された。データは平均値±ｓｅｍ．＊ｐ＜０．００１対コントロール、０．１ｍｇ／ｋｇ又は０．２ｍｇ／ｋｇ；分散分析（ＡＮＯＶＡ）とその後のボンフェロニ事後試験として示されている。

【配列表】

Claims (12)

1. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２として示されるアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片。
2. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２として示されるアミノ酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドをコード化する核酸。
3. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１として示される核酸配列を含むブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドをコード化する核酸。
4. コカイン誘発症状を治療する方法であって、請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドの有効量を個人に投与する方法を含む方法。
5. 前記コカイン・ベースの物質はコカインである、請求項４に記載の方法、。
6. 前記個人はコカイン過剰摂取の症状を呈している、請求項５に記載の方法。
7. 前記個人はコカイン中毒の症状を呈している、請求項５に記載の方法。
8. コカイン・ベースのブチリルコリンエステラーゼ基質を加水分解する方法であって、コカインを代謝物へ加水分解する条件で、前記ブチリルコリンエステラーゼ基質を請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドと接触させる方法を含み、前記ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドは、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を１００倍又はそれ以上増大している方法。
9. コカイン誘発症状を治療する方法であって、請求項１に記載のブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチド又はその機能的断片の有効量を個人に投与する方法を含み、前記ブチリルコリンエステラーゼ変異体ポリペプチドは、ブチリルコリンエステラーゼと比べてコカイン加水分解活性を１００倍又はそれ以上増大している方法。
10. 前記コカイン・ベースの物質はコカインである、請求項９に記載の方法。
11. 前記個人はコカイン過剰摂取の症状を呈している、請求項１０に記載の方法。
12. 前記個人はコカイン中毒の症状を呈している、請求項１０に記載の方法。
    

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